ES2679127T3 - Composición vacunal contra el cáncer - Google Patents

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Abstract

Un péptido parcial, una composición que contiene dicho péptido parcial, o una vacuna contra el cáncer que comprende un ADN o ARN que codifica un péptido parcial, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es el péptido WT1187: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), el péptido WT1126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), el péptido WT1187P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1187P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1187P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1126P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1126P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1126P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).

Description

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DESCRIPCION
Composición vacunal contra el cáncer Campo de la técnica
La presente invención se refiere a una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al antígeno leucocitario humano (HLA)-A*0206, que comprende un producto proteico del gen supresor tumoral del tumor 1 de Wilms (WT1) (de aquí en adelante abreviado a veces como WT1 proteico) o un péptido parcial del mismo (de aquí en adelante abreviado a veces como WT1 peptídico). La presente invención también se refiere a una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, que comprende un ADN o ARN que codifica el WT1 proteico o WT1 peptídico mencionado anteriormente, un método para inducir CTL específicos de WT1, un método para la inducción de células dendríticas que presentan un antígeno del cáncer, y un método para el diagnóstico de personas positivas a HLA-A*0206, y un método de tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206.
La presente invención se refiere adicionalmente a una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201, que comprende un péptido modificado del WT1 peptídico.
Técnica antecedente
El gen WT1 del tumor de Wilm se aisló como un gen asociado con tumorigénesis en el tumor de Wilms, que es un tumor renal pediátrico (véase la bibliografía no patente 1). Este gen codifica un factor de transcripción en dedos de zinc asociado con el mecanismo regulador del crecimiento y diferenciación celular, y la apoptosis y el desarrollo tisular.
El gen WT1 se clasificó originalmente como un gen supresor tumoral. Sin embargo, basándose en pruebas recientes que se muestran en (i) a (iii) siguientes:
(i) alta expresión del gen WT1 de tipo silvestre en distintos tumores malignos y cánceres sólidos humanos incluyendo tumores hematopoyéticos malignos tales como la leucemia y síndromes mielodisplásicos (MDS),
(ii) inhibición del crecimiento de las células de leucemia human y células de un cáncer sólido tratadas con oligonucleótidos WT1 antisentido, y
(iii) promoción del crecimiento e inhibición de diferenciación en células mieloides precursoras de ratón por la expresión constitutiva del gen WT1 de tipo silvestre,
se ha sugerido que el gen WT1 de tipo silvestre presenta un efecto oncogénico más que un efecto supresor tumoral en distintas enfermedades malignas (véase la bibliografía de patente 1).
También se sabe de la alta expresión del gen WT1 en cánceres sólidos, tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer de cuello de útero y cáncer ovárico (véase la bibliografía de patente 2).
En general, el sistema inmunitario para eliminar sustancias ajenas comprende la inmunidad humoral, en la cual están implicados los macrófagos, que reconocen un antígeno y sirven como células presentadoras de antígeno, células T auxiliares, que reconocen el antígeno presentado por los macrófagos y producen distintas linfocinas para activar otras células T, y linfocito B, que se diferencian en células productoras de anticuerpo mediante acciones de las linfocinas; e inmunidad mediada por células, en la que los linfocitos T citotóxicos (CTL), que se producen mediante diferenciación en respuesta a la presentación de antígenos, atacan y destruyen las células diana.
Actualmente, se ha considerado que la inmunidad del cáncer se basa principalmente en inmunidad mediada por células en la que están implicados los CTL. En la inmunidad del cáncer basada en CTL, los precursores de células T reconocen un antígeno del cáncer presentado en forma de un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y el antígeno del cáncer, y por esto se diferencian y crecen como CTL, que atacan y destruyen las células del cáncer. En este caso, la célula del cáncer presenta, en su superficie celular, un antígeno del MHC clase I y el antígeno del cáncer, que es el objetivo de los CTL (véase las bibliografías no patentes 2 a 5). El MHC se denomina como antígeno leucocitario humano (HLA) en los seres humanos.
Se considera que el antígeno del cáncer mencionado anteriormente, que se presenta por un antígeno del MHC de clase I en las superficies de las células del cáncer, es decir, las células diana, es un péptido de aproximadamente 8 a 12 aminoácidos producido mediante un procesamiento mediado por proteasa intracelular de un antígeno proteico sintetizado en las células cancerosas (véase las bibliografías no patentes 2 a 5). Actualmente, la búsqueda de antígenos proteicos de distintos cánceres está en proceso, pero solo se han identificado unas pocas proteínas como antígenos específicos del cáncer.
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El presente inventor sintetizó polipéptidos que consistía cada uno en 7 a 30 aminoácidos contiguos basándose en la secuencia de aminoácidos del producto de expresión del gen WT1 y cada uno contenía al menos un aminoácido que presumiblemente sirve como un aminoácido de anclaje para la unión con el HLA-A*2402 o HLA-A*0201 confirmó que estos péptidos se unían con el HLA-A*2402 o HLA-A*0201 (estos péptidos estaban restringidos a HLA-A*2402 o HlA-A*0201), y descubrió que la unión de los péptidos con HlA-A*2402 o HLA-A*0201 inducía los CTL, dando como resultado una respuesta citotóxica contra las células diana (de aquí en adelante abreviada como respuesta de CTL). A partir de este hecho, estos péptidos se identificaron como epítopos de CTL a partir del producto de expresión del gen WT1 (proteína WT1).
En este punto, se identificaron los epítopos de CTL específicos de WT1 solo para HLA-A*2402 o HLA-A*0201 (véase la bibliografía de patente 3), HLA-A*3303 (véase la bibliografía de patente 4) o HLA-A*1101 (véase la bibliografía de patente 5). Se confirmó que las respuestas de CTL inducidas por los polipéptidos desvelados por las bibliografías anteriores están restringidos por HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303 y HLA-A*1101.
Esto indica la posibilidad de que el producto proteico del gen supresor tumoral WT1 es un antígeno de rechazo tumoral prometedor, también llamado como antígeno asociado a un tumor (TAA). De hecho, no se observaban altos niveles de CTL específicos de WT1 o un alto título de anticuerpos anti-WT1 en sangre periférica de donantes de sangre sanos, pero sí en los pacientes de cáncer.
Sin embargo, los tipos de HLA son suficientemente diversos para servir como marcadores para la identificación de individuos. En los HLA, los antígenos del MHC de clase I se clasifican en HLA-A, HLA-B, HLA-C, y los antígenos del MHC de clase II se clasifican en HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR. Cada clase tiene varios tipos de antígeno. El sitio de unión de cada HLA tiene un polimorfismo genético. Por ejemplo, se sabe que HLA-A, HLA-B y HLA-C tiene 27 o más, 59 o más, y 10 o más tipos de polimorfismos (alelos), respectivamente.
Por lo tanto, habiendo el deseo de identificar un antígeno del cáncer que se una a otros tipos de HLA distintos de HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303 y HLA-A*1101 e inducir una respuesta de CTL, y para de esta manera aplicar una inmunoterapia a un intervalo más amplio de sujetos.
Entre tanto, se informó de los siguientes tres WT1 peptídicos modificados en dos documentos: el péptido WT1wP1Y (YLGEQQYSV; SEQ ID NO: 12), el péptido WT1126P1Y (YMFPNAPYL; SEQ ID NO: 35) (véase la bibliografía de patente 6 para los dos péptidos anteriores), y el péptido WT1-I26P9M (RMFPNAPYM; SEQ ID NO: 52) (véase la bibliografía de patente 7).
Además, se informó de los siguientes dos péptidos en la exposición escrita para el examen de la patente europea N.° 1127068:
el péptido WT1126P2L (RLFPNAPYL; SEQ ID NO: 39) y el péptido WT1-I26P2L&P9V (RLFPNAPYV; SEQ ID NO: 75) (véase la bibliografía no patente 7).
Sin embargo, no se ha informado nunca de si estos WT1 peptídicos modificados sirven como un antígeno del cáncer que se una a otros tipos de HLA distintos de HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303 y HLA-A*1101 y que induzca una respuesta de CTL.
Bibliografía de patente 1: JP-A 9-104629 Bibliografía de patente 2: JP-A 11-035484 Bibliografía de patente 3: WO 00/06602 Folleto
Bibliografía de patente 4: Solicitud de patente japonesa N.° 2006-045287 Bibliografía de patente 5: Solicitud de patente japonesa N.° 2006-355356 Bibliografía de patente 6: Folleto WO 2005/053618 Bibliografía de patente 7: Folleto WO 2007/016466
Bibliografía no patente 1: Gessler, M. et al., Nature, vol. 343, pp. 774-778, 1990 Bibliografía no patente 2: Cur. Opin. Immunol., vol. 5, p. 709, 1993 Bibliografía no patente 3: Cur. Opin. Immunol., vol. 5, p. 719, 1993 Bibliografía no patente 4: Cell, vol. 82, p. 13, 1995 Bibliografía no patente 5: Immunol. Rev., vol. 146, p. 167, 1995 Bibliografía no patente 6: Mol. Cell. Biol., vol. 11, p. 1707, 1991
Bibliografía no patente 7: La exposición escrita para el examen de la patente europea N.° 1127068 Sumario de la invención Problema que resolver por la invención
Un objetivo de la presente invención es aplicar, adicionalmente para personas positivas a HLA-A*0206, un método de tratamiento y/o prevención del cáncer para pacientes con tumores malignos incluyendo la leucemia, estando basado el método en un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 (WT1 proteico) o un péptido parcial del mismo (WT1 peptídico).
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Medio para resolver el problema
El presente inventor llevó a cabo estudios intensivos para conseguir el objetivo mencionado anteriormente. Como resultado, descubrió que el péptido WT1w (SLGEQQYSV) y el péptido WT1126 (RMFPNAPYL) que derivaban del WT1 proteico humano, que se sabía que inducía solo los CTL restringidos a HLA-A*0201, sorprendentemente también inducía los CTL restringidos al HLA-A*0206. En circunstancias en las que solo los péptidos descritos en el folleto WO 00/06602 se conocían como los WT1 peptídicos que inducían CtL restringidos a HLA-A*0201, el presente inventor descubrió que un péptido modificado del WT1w peptídico (al que también se hace referencia como WT1187 peptídico modificado) y un péptido modificado del WT1126 peptídico (al que también se hace referencia como WT1126 peptídico modificado) también se unen a una molécula del HLA-A*0201. Basándose en estos hallazgos, el presente inventor llevó a cabo estudios intensivos adicionales y completó la presente invención. A saber, la presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por lo tanto, se refiere a los siguientes artículos:
1. Un péptido parcial, una composición que contiene dicho péptido parcial, o una vacuna contra el cáncer que comprende un ADN o ARN que codifican un péptido parcial, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es
el péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), el péptido WT1126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), el péptido WT1187P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1187P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1187P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1126P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1126P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1126P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46), o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
2. El péptido parcial o la composición de acuerdo con el artículo 1 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en una persona positiva al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es
el péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), el péptido WT1126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), el péptido WT1187P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1187P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1187P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1126P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1126P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1126P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46), o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
3. El péptido parcial o composición de acuerdo con el artículo 2 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es
el WT1126 péptido: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3)
4. Las composiciones de acuerdo con uno cualquiera de los artículos 1 a 3 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, que comprende adicionalmente un adyuvante.
5. El uso de un péptido parcial, una composición que contiene dicho péptido parcial, o una vacuna contra el cáncer que comprende un ADN o ARN que codifica un péptido parcial, donde dicho péptido parcial es un péptido como se define en el artículo 1, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206.
6. El uso de un péptido parcial o composición de acuerdo con el artículo 5 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al hLA-A*0206, donde el péptido parcial es
el péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), el péptido WT1126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), el péptido WT1187P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1187P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1187P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1126P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1126P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1126P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46), o
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el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
7. El uso de un péptido parcial o composición de acuerdo con el artículo 6 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al hLA-A*0206, donde el péptido parcial es
el péptido WT1126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3).
8. El uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de los artículos 5 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, que comprende adicionalmente un adyuvante.
9. Un método ex vivo para la inducción de CTL específicos de WT1, que comprende el cultivo, en presencia de un péptido parcial de acuerdo con el artículo 1, de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) derivadas de la persona positiva a HLA-A*0206, para obtener los CTL específicos de WT1 inducidos a partir de ellas.
10. Un método ex vivo para la inducción de células dendríticas que presenten el péptido parcial de acuerdo con el artículo 1, que comprende el cultivo, en presencia del péptido parcial del mismo, células dendríticas inmaduras derivadas de una persona positiva a HLA-A*0206, para obtener células dendríticas inducidas a partir de las mismas que presenten al péptido parcial del mismo.
11. Un método in vitro de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, que comprende
i) una etapa de detección o cuantificación de un péptido parcial de acuerdo con el artículo 1, un anticuerpo contra este o CTL específicos de WT1 inducidos por un método de acuerdo con el artículo 9 en una muestra de una persona positiva al HLA-A*0206, y una etapa de comparación de la cantidad de dicho péptido parcial del mismo, dicho anticuerpo contra este o dichos CTL específicos de WT1, con el caso en el que el cáncer no se ha desarrollado, o
ii) una etapa de la determinación de la posición o región de CTL específicos de WT1 o células dendríticas en el sujeto positivo al HLA-A*0206 al que se habían administrado dichos CTL específicos de WT1 inducidos por el método de acuerdo con el artículo 9 o dichas células dendríticas inducidas por el método de acuerdo con el artículo 10.
12. Una composición vacunal para personas positivas al HLA-A*0201, que comprende el siguiente péptido:
el péptido WT1wP1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1wP2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1wP3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1-I26P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1-I26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1-I26P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46), o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
13. El uso de una composición de acuerdo con el artículo 12 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0201.
14. la composición de acuerdo con el artículo 12 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0201.
Además, en el contexto de la presente invención, se desvelan los siguientes (1) a (17).
(1) Una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al antígeno leucocitario humano (HLA)- A*0206 que comprende un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo.
(2) La composición de acuerdo con el (1) anterior, donde el producto proteico del gen supresor tumoral WT1 es la proteína de los siguientes (a) o (b):
(a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o
(b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende una eliminación, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de (a), cualquiera de las cuales es inmunogénica para las personas positivas al HLA-A*0206.
(3) La composición de acuerdo con el (1) anterior, donde el péptido parcial es el péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2),
el péptido WT1-I26: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), el péptido WT1wP1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1wP2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16),
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el péptido WT1187P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1126P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1126P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1126P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46), o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
(4) La composición de acuerdo con el (1) a (3) anteriores, que comprende adicionalmente un adyuvante.
(5) Una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas la HLA-A*0206, que comprende un ADN que codifica un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo.
(6) Una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, que comprende un ARN que codifica un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo.
(7) Un método para inducir CTL específicos de WT1, que comprende el cultivo, en presencia de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206, para obtener CTL específicos, para obtener CTL específicos de WT1 inducidos a partir de ellas.
(8) Un método para la inducción de células dendríticas que presenten un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo, que comprende el cultivo, en presencia del producto proteico o un péptido parcial del mismo, células dendríticas inmaduras derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206, para obtener células dendríticas inducidas a partir de ellas que presenten el producto proteico o un péptido parcial del mismo.
(9) Un método de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, que comprende
i) una etapa de detección o cuantificación de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial, un anticuerpo contra este o CTL específicos de WT1 en una muestra de una persona positiva al HLA- A*0206, y una etapa de comparación de la cantidad de la proteína o un péptido parcial del mismo, un anticuerpo contra este o los cTl específicos de WT1, con el caso en el que el cáncer no se ha desarrollado, o
ii) una etapa de administración a un sujeto positivo al HLA-A*0206 de CTL específicos de WT1 inducidos por el método mencionado en el (7) anterior o células dendríticas que inducidas por el método mencionado en el (8) anterior, y una etapa de determinación de la posición o región de los CTL específicos de WT1 o células dendríticas en el sujeto positivo al HLA-A*0206.
(10) Una composición vacunal para personas positivas al HLA-A*0201, que comprende el siguiente péptido:
un péptido modificado del péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) o el péptido WT1 126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1, siendo el péptido modificado inmunogénico para personas positivas al HLA-A*0201.
(11) La composición de acuerdo con el (10) anterior, donde el péptido modificado es
el péptido WT1187P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1187P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1187P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1126P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1126P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1126P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46), o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
(12) Un método de tratamiento o prevención del cáncer, que comprende la administración a una persona positiva al HLA-A*0206 de una composición que contiene un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo.
(13) Un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206.
(14) Un método de tratamiento o prevención del cáncer, que comprende la administración a una persona positiva al HLA-A*0201 de una composición que contienen el siguiente péptido:
un péptido modificado del péptido Wt1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) o el péptido WT1 126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1, siendo el péptido modificado inmunogénico para personas positivas al HLA-A*0201.
(15) El siguiente péptido:
un péptido modificado del péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) o el péptido WT1 126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1, siendo el péptido modificado inmunogénico para personas positivas al HLA-A*0201, para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA- A*0201.
(16) Un método de tratamiento o prevención del cáncer, que comprende la introducción de un ARN que codifica
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un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo en células dendríticas de una persona positiva al HLA-A*0206.
(17) Un ARN que codifica un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206.
También se desglosa el uso de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo para la producción de una composición vacunal utilizada para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas el HLA-A*0206.
La presente invención también se refiere al uso del siguiente péptido:
un péptido modificado del péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) o el péptido WT1 126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1, siendo el péptido modificado inmunogénico para personas positivas al HLA-A*0201, para la producción de una composición vacunal utilizada para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0201.
La “composición vacunal contra el cáncer” como se utiliza en el presente documento se refiere a un medicamento utilizado para la prevención o tratamiento del cáncer mediante su inoculación o administración a un animal incluyendo un ser humano. El “tratamiento” se refiere a, además de curar completamente el estado de enfermedad, parar la progresión del estado de enfermedad inhibiendo la progresión y/o agravamiento de los síntomas hasta cierto grado incluso aunque falle a corto plazo en la cura completa; o mejorar todo o parte del estado de enfermedad en una dirección hacia la cura. La “prevención” se refiere a evitar, inhibir o retrasar el desarrollo de la enfermedad.
Las siguientes expresiones: células mononucleares de sangre periférica, células dendríticas inmaduras, CTL específicos de WT1, muestras, etc. derivadas de personas positivas a HLA-A*0206 o positivas a HLA-A*0201 se refieren a células mononucleares de sangre periférica, células dendríticas inmaduras, CTL específicos de WT1, especímenes biológicos, etc., tal como sangre, que se aísla o recolecta de personas positivas a HLA-A*0206 o positivas a HLA-A*0201, respectivamente. Los cTl específicos de WT1 derivados de personas positivas a HLA- A*0206 o positivas a HLA-A*0201 también incluyen los CTL inducidos a partir de células mononucleares de sangre periférica, células dendríticas inmaduras o especímenes biológicos tales como la sangre, que se aíslan o recolectan de personas positivas a HLA-A*0206 o positivas a HLA-A*0201.
Efectos de la invención
La presente invención hace posible la inducción in vivo e in vitro de CTL específicos de WT1 en sujetos positivos al HLA-A*0206. Aunque los sujetos de inmunoterapia utilizan una vacuna que comprende el WT1 proteico o el WT1 peptídico se habían limitado convencionalmente a los pacientes positivos a HLA-A*0201 y pacientes positivos al HLA-A*2402, la presente invención puede ampliar el intervalo de sujetos a los pacientes positivos al HLA-A*0206. El HLA-A2, que es un serotipo de los antígenos del HLA clase I, es el más frecuente en la raza blanca (aproximadamente un 50%), y la gran mayoría tiene el HLA-A*0201, mientras que aproximadamente el 4% de individuos de raza blanca tienen el HLA-A*0206. Por otra parte, el HLA-A24 es el serotipo más frecuente en la población japonesa (aproximadamente el 58 %), y la Gram mayoría tiene el HLA-A*2402. Aproximadamente el 42 % de la población japonesa tiene el HLA-A2. Entre ellos, solo aproximadamente el 43 % tiene el HLA-A*0201, y los otros tienen el HLA-A*0206 o HLA-A*0207. En otras palabras, aproximadamente el 18 % de la población japonesa tiene el HLA-A*0201, y aproximadamente el 17 % de la población japonesa tiene el HLA-A*0206. Por lo tanto, el hecho de que se identificó al menos un epítopo de CTL restringido a HLA-A*0206 en la población japonesa, así como un epítopo de CTL restringido al HLA-A*0201 es significativamente útil para aumentar los sujetos de inmunoterapia contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206. Como el 14 % de la población china y el 9 % de la población surcoreana tienen este alelo, es posible aplicar la composición vacunal contra el cáncer de la presente invención a un intervalo más amplio de sujetos.
La composición vacunal contra el cáncer de la presente invención es útil para el tratamiento de cánceres que expresan el WT1 tales como tumores hematopoyéticos y cánceres sólidos en personas positivas al HLA-A*0206. La composición vacunal contra el cáncer de la presente invención también es útil para la prevención del desarrollo del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra la actividad citotóxica de CTL específicos del péptido WT1187 inducidos a partir de PBMC de un donante de sangre sano positivo a HLA-A*0206. La Fig. 1a muestra la actividad citotóxica contra B-LCL marcados con 51Cr. La Fig. 1b muestra que la actividad citotóxica contra B-LCL autólogos marcados con 51Cr aumenta en paralelo con la concentración del péptido WT1187 utilizado para pulsar las PBMC.
La Fig. 2 muestra la actividad citotóxica de CTL específicos del péptido WT1187 inducidos a partir de PBMC de un donante de sangre sano positivo al HLA-A*0206. Las Fig. 2a y 2b muestran las actividades citotóxicas respectivas, contra B-LCL marcados con 51Cr, de CTL obtenidos por separado de dos donantes de sangre sanos
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La Fig. 3a muestra la actividad citotóxica de CTL específicos del péptido WT1w contra B-LCL transformadas con el gen WT1, o B-LCL transformadas con un vector falso. La Fig. 3b muestra la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1w contra las células 0206K562, células K562, KH562, células KH88 o células JY.
La Fig. 4 muestra la inhibición de la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1w por anticuerpos contra el HLA clase I y/o clase II.
La Fig. 5 muestra la actividad citotóxica contra B-LCL marcadas con 51Cr de los CTL específicos del péptido WT1 126 inducidas a partir de PBMC de un donante de sangre sano positivo al HLA-A*0206.
Las Fig. 6a y 6b muestran las actividades citotóxicas respectivas de los CTL específicos del péptido WT1126 inducidas por separado a partir de dos donantes diferentes, contra las células 0206K562, células K562, KH562, células KH88 o células JY.
la Fig. 7 muestra los resultados de los análisis de citometría de flujo de los CTL teñidos con el tetrámero HLA unido al péptido WT1126 y el anticuerpo anti-CD8. Los CTL se habían inducido por estimulación de las PBMC del donante 1 positivo al HLA-A*0201 con los péptidos modificados.
La Fig. 8 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 1 positivo al HLA-A*0201 con el péptido WT1126P1F.
La Fig. 9 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 1 positivo al HLA-A*0201 con el péptido WT1126P2L.
La Fig. 10 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de los CTL teñidos con el tetrámero HLA unido al péptido WT1126 y el anticuerpo anti-CD8. Los CTL se habían inducido por estimulación de las PBMC del donante 2 positivo al HlA-A*0201 con el péptido WT1126P2L.
La Fig. 11 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 2 con el péptido WT1126P2L.
La Fig. 12 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 3 positivo al HLA-A*0206 con péptidos WT1126 modificados.
La Fig. 13 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 3 positivo al HLA-A*0206 con el péptido WT1126P9V.
La Fig. 14 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 4 positivo al HLA-A*0206 con péptidos WT1126 modificados.
La Fig. 15 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 3 positivo al HLA-A*0206 con péptidos WT1126 modificados.
La Fig. 16 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante positivo al HLA-A*0201 con péptidos WT1w modificados.
La Fig. 17 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante positivo al HLA-A*0206 con el péptido WT1wP1F.
La Fig. 18 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 3 positivo al HLA-A*0206 con el péptido WT1wP2M.
La Fig. 19 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1187 modificados sobre la actividad de
La Fig. 20 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1187 modificados sobre la actividad de
La Fig. 21 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1187 modificados sobre la actividad de
La Fig. 22 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1187 modificados sobre la actividad de
La Fig. 23 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1126 modificados sobre la actividad de
La Fig. 24 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1126 modificados sobre la actividad de
La Fig. 25 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1126 modificados sobre la actividad de
La Fig. 26 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1126 modificados sobre la actividad de
La Fig. 27 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1126 modificados sobre la actividad de
La Fig. 28 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1187 modificados sobre la actividad de
La Fig. 29 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1187 modificados sobre la actividad de
La Fig. 30 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1126 modificados sobre la actividad de
La Fig. 31 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
de péptidos WT1126 modificados sobre la actividad de
La Fig. 32 muestra los resultados de la evaluación inducción de inmunidad mediada por células específica.
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Mejor modo para llevar a cabo la invención
De aquí en adelante, la presente invención se ilustrará.
Se utilizan los siguientes códigos cuando se abrevian los restos de aminoácidos en la presente descripción y los dibujos.
Ala o A: resto de Alanina Arg o R: resto de Arginina Asn o N: resto de Asparagina Asp o D: resto de ácido Aspártico Cys o C: resto de Cisteína Gln o Q: resto de Glutamina Glu o E: resto de ácido Glutámico Gly o G: resto de Glicina His o H: resto de Histidina Ile o I: resto de Isoleucina Leu o L: resto de Leucina Lys o K: resto de Lisina Met o M: resto Metionina de Phe o F: resto de Fenilalanina Pro o P: resto de Prolina Ser o S: resto de Serina Thr o T: resto de Treonina Trp o W: resto de Triptófano Tyr o Y: resto de Tirosina Val o V: resto de Valina
El WT1 proteico como se desvela en el presente documento puede ser un producto genético de un factor de transcripción tipo dedos de zinc aislado como gen causante del tumor de Wilms, siendo el producto genético capaz de unirse a una molécula del HLA-A*0206 y de esta manera sirviendo de antígeno diana de tumores malignos. Más específicamente el WT1 proteico desvelado en el presente documento es preferentemente el WT1 proteico humano que consiste en 449 aminoácidos (Listado de secuencia: SEQ ID NO: 1) o una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos que comprende la eliminación, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos (preferentemente aproximadamente 2 a 6 aminoácidos) en la secuencia de aminoácidos del WT1 proteico humano, y que es inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0206. El aminoácido utilizado para la adición o sustitución puede eser un aminoácido no natural además de los 20 aminoácidos codificados genéticamente.
El péptido parcial del WT1 proteico (WT1 peptídico) se refiere a un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos que constituye el WT1 proteico. El WT1 peptídico puede ser un péptido que consiste en 8 a 12 aminoácidos, preferentemente 8 a 9 aminoácidos derivados del WT1 proteico y que se une a una molécula del HLA-A*0206 y de esta manera induce células T citotóxica. Es particularmente preferido el péptido WT1w (Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val; SEQ ID NO: 2) o el péptido WT1-I26 (Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu; SeQ ID NO: 3), ambos descritos en el folleto WO 00/06602.
También se puede utilizar un péptido modificado que comprende una eliminación, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos del WT1 peptídico como WT1 peptídico como se desvela en el presente documento a condición de que sea inmunogénico para personas positivas al HLA-A*0206. Ejemplos de dicho péptido modificado incluye un péptido WT1-I87 modificado y un péptido WT1126 modificado.
El péptido WT1187 modificado es preferentemente un péptido que comprende los mismos restos de aminoácidos (EQQYS) en las posiciones 4 a 8 desde el extremo N que el péptido WT1w en las posiciones correspondientes, y más preferentemente un péptido que comprende los mismos restos de aminoácidos (EQQYSV) en las posiciones 4 a 9 del extremo N que el péptido WT1w en las posiciones correspondientes. Dicho péptido WT1w modificado es preferentemente un péptido que consiste en cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4 a 26 y 54 a 62.
péptido WT1wP1G (GLGEQQYSV; SEQ ID NO: 4) péptido WT1wP1A(ALGEQQYSV; SEQ ID NO: 5) péptido WT1wP1V (VLGEQQYSV; SEQ ID NO: 6) péptido WT1wP1L(U_GEQQYSV; SEQ ID NO: 7) péptido WT1wP1I (ILGEQQYSV; SEQ ID NO: 8) péptido WT1wP1M (MLGEQQYSV; SEQ ID NO: 9) péptido WT1wP1W (WLGEQQYSV; SEQ ID NO: 10) péptido WT1wP1F (FLGEQQYSV; SEQ ID NO: 11) péptido WT1wP1Y (YLGEQQYSV; SEQ ID NO: 12) péptido WT1wP2V (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13)
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péptido WT1187P2Q (SQGEQQYSV; SEQ ID NO: 14) péptido WT1i87P2I (SIGEQQYSV; SEQ ID NO: 15) péptido WTI187P2M (SMGEQQYSV; SEQ ID NO: 16) péptido WT1187P3L (SLLEQQYSV; SEQ ID NO: 17) péptido WT1wP3A(SLAEQQYSV; SEQ ID NO: 18) péptido WT1wP3V (SLVEQQYSV; SEQ ID NO: 19) péptido WT1wP3M (SLMEQQYSV; SEQ ID NO: 20) péptido WT1wP3P (SLPEQQYSV; SEQ ID NO: 21) péptido WT1wP3W (SLWEQQYSV; SEQ ID NO: 22) péptido WT1wP3F (SLFEQQYSV; SEQ ID NO: 23) péptido WT1wP3Y (SLYEQQYSV; SEQ ID NO: 24) péptido WT1wP3S (SLSEQQYSV; SEQ ID NO: 25) péptido WT1wP3I (SLIEQQYSV; SEQ ID NO: 26) péptido WT1wP9L (SLGEQQYSL; SEQ ID NO: 53) péptido WT1187P1D (DLGEQQYSV; SEQ ID NO: 54) péptido WT1187P1E (ELGEQQYSV; SEQ ID NO: 55) péptido WT1187P1H (HLGEQQYSV; SEQ ID NO: 56) péptido WT1wP1K(KLGEQQYSV; SEQ ID NO: 57) péptido WT1187P1N (NLGEQQYSV; SEQ ID NO: 58) péptido WT1187P1P (PLGEQQYSV; SEQ ID NO: 59) péptido WT1wP1Q (QLGEQQYSV; SEQ ID NO: 60) péptido WT1187P1R (RLGEQQYSV; SEQ ID NO: 61) péptido WT1wP1T (TLGEQQYSV; SEQ ID NO: 62)
El péptido WT1-I26 modificado es preferentemente un péptido que comprende los mismos restos de aminoácidos (PNAPY) en las posiciones 4 a 8 desde el extremo N que el péptido WT1-I26 en las posiciones correspondientes. Dicho péptido WT1-I26 modificado es preferentemente un péptido que consiste de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácido de las SEQ ID NO: 27 a 52 y 63 a 75.
péptido WT1126P1G (GMFPNAPYL; SEQ ID NO: 27) péptido WT1126P1A (AMFPNAPYL; SEQ ID NO: 28) péptido WT1126P1V (VMFPNAPYL; SEQ ID NO: 29) péptido WT1-I26P1L (LMFPNAPYL; SEQ ID NO: 30) péptido WT1126P1I (IMFPNAPYL; SEQ ID NO: 31) péptido WT1126P1M (MMFPNAPYL; SEQ ID NO: 32) péptido WT1126P1W (WMFPNAPYL; SEQ ID NO: 33) péptido WT1126P1F (FMFPNAPYL; SEQ ID NO: 34) péptido WT1126P1Y (YMFPNAPYL; SEQ ID NO: 35) péptido WT1126P2V (RVFPNAPYL; SEQ ID NO: 36) péptido WT1126P2Q (RQFPNAPYL; SEQ ID NO: 37) péptido WT1126P2A (RAFPNAPYL; SEQ ID NO: 38) péptido WT1126P2L (RLFPNAPYL; SEQ ID NO: 39) péptido WT1126P2I (RIFPNAPYL; SEQ ID NO: 40) péptido WT1126P3I (RMIPNAPYL; SEQ ID NO: 41) péptido WT1126P3L (RMLPNAPYL; SEQ ID NO: 42) péptido WT1126P3G (RMGPNAPYL; SEQ ID NO: 43) péptido WT1126P3A (RMAPNAPYL; SEQ ID NO: 44) péptido WT1126P3V (RMVPNAPYL; SEQ ID NO: 45) péptido WT1126P3M (RMMPNAPYL; SEQ ID NO: 46) péptido WT1126P3P (RMPPNAPYL; SEQ ID NO: 47) péptido WT1126P3W (RMWPNAPYL; SEQ ID NO: 48) péptido WT1126P9V (RMFPNAPYV; SEQ ID NO: 49) péptido WT1-I26P9A (RMFPNAPYA; SEQ ID NO: 50) péptido WT1126P9I (RMFPNAPYI; SEQ ID NO: 51) péptido WT1126P9M (RMFPNAPYM; SEQ ID NO: 52) péptido WT1126P1D (DMFPNAPYL; SEQ ID NO: 63) péptido WT1126P1E (EMFPNAPYL; SEQ ID NO: 64)
Inter alia, el péptido WT1w modificado es preferentemente el péptido WT1wP1F (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1wP2M (SeQ ID NO: 16) o el péptido WT1wP3M (SEQ ID nO: 20), más preferentemente el péptido WT1wP1F o el péptido WT1wP2M, y más preferentemente el péptido WT1wP2M. El péptido WH126 modificado es preferentemente el péptido WT1126P1F (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1-I26P2L (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1-I26P3M (SEQ ID NO: 46) o el péptido WT1-I26P9V (SEQ ID NO: 49), más preferentemente el péptido WT1-I26P2L, el péptido WT1-I26P3M o el péptido WT1126P9V, y más preferentemente el péptido WT1-I26P9V.
El WT1 peptídico en la composición vacunal contra el cáncer de la presente invención es preferentemente el péptido
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WT1i87, el péptido WTI126, el péptido WTI187PIF, el péptido WT1wP2M, el péptido WT1i87P3M, el péptido WTI126PIF, el péptido WT1i26P2L, el péptido WT1i26P3M o el péptido WT1i26P9V. Más preferentemente el péptido WT1i87, el péptido WT1126, el péptido WT1187P1F, el péptido WT1wP2M, el péptido WT1126P2L, el péptido WT 1i26P3M o el péptido WT1i26P9V. Incluso se prefiere el péptido WTiw, el péptido WT1i26, el péptido WT1187P2M o el péptido WT1i26P9V. Particularmente se prefiere el péptido WTiw o el péptido WT1i26.
También se puede utilizar un derivado del WT1 peptídico como WT1 peptídico. Por ejemplo, el derivado del péptido WT1i87 o el péptido WT1i26 puede estar formado por una secuencia de aminoácidos de los 9 aminoácidos contiguos anteriores y distintas sustancias unidas al extremo N y/o C del mismo. Las distintas sustancias pueden ser, por ejemplo, aminoácidos, péptidos, análogos de los mismos, etc. Dicha sustancia unida al péptido WTiw, al péptido WT1i26 o un péptido modificado de los mismos se somete, por ejemplo, a un tratamiento enzimático in vivo mediante un procesamiento intracelular, etc., y finalmente se produce un péptido que consiste en los 9 aminoácidos mencionados anteriormente y se presenta como un complejo con una molécula del HLA-A*0206 sobre la superficie molecular. Por lo tanto, se puede inducir una respuesta de CTL específico del WT1 en pacientes con HLA-A*0206.
El WT1 peptídico se puede preparar por un método utilizado habitualmente en el campo de la técnica, tal como un método de síntesis de péptidos descrito en Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. 1985; the Sequel to Development of Pharmaceuticals, Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa Publishing Company, 1991; etc.
Como un método para la exploración del WT1 peptídico y un péptido modificado del mismo, por ejemplo, se prefiere un método que lleva a cabo el ensayo de IFNy con una única estimulación de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) con un péptido, de algunos pacientes que tienen el HLA-A*0206, y entonces se selecciona un péptido que presenta una buena respuesta, debido a su simplicidad.
En la presente invención, también se pueden utilizar polinucleótidos, tales como ADN que codifican el WT1 proteico o el WT1 inmunogénico mencionado anteriormente, inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0206, como ingrediente activo de la composición vacunal contra el cáncer. A saber, insertando un polinucleótido que codifica el WT1 proteico o WT1 peptídico en un vector adecuado, preferentemente un vector de expresión, y entonces se administra el vector en animales incluyendo seres humanos, se puede producir una inmunidad contra el cáncer en el cuerpo vivo. Ejemplos de polinucleótidos incluyen el ADN, ARN y similares, y se prefieren el ADN o el ARN. La secuencia de bases del polinucleótido se puede determinar basándose en la secuencia de aminoácidos del WT1 proteico o el WT1 peptídico inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0206. El polinucleótido se puede preparar por un método de síntesis de ADN o ARN conocido, el método PCR, etc. Dicha composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, que comprende un ADN que codifica el WT1 proteico o WT1 peptídico también es un aspecto de la presente invención. El WT1 proteico o WT1 peptídico es preferentemente un WT 1 peptídico, más preferentemente el péptido WTiw. el péptido WT1i26 o un péptido modificado de los mismos, y más preferentemente el péptido WTiw o el péptido WT1i26. El vector de expresión que se utiliza para insertar el ADN mencionado anteriormente no está limitado particularmente. El ARN no se tiene que insertar en un vector y se puede utilizar como tal como principio activo de la composición.
La composición vacunal contra el cáncer de la presente invención puede comprender un adyuvante. El adyuvante no está limitado a condición de que, después de administrarse junto con o separadamente del WT1 proteico o WT1 peptídico utilizados como antígeno, aumente inespecíficamente las respuestas inmunitarias al antígeno. Ejemplos del adyuvante incluyen hidróxido sódico, hidróxido de aluminio, fosfato cálcico, fosfato de aluminio, alúmina, PEPES y polímeros de carboxivinilo. Un adyuvante oleosos preferible es uno que pueda firmar micelas de manera que el aceite encierra la solución acuosa del antígeno. Ejemplos específicos del mismo incluye parafina líquida, lanolina, de Freund, Montanide ISA-763AVG, Montanide ISA-51, adyuvante incompleto de Freund y adyuvante completo de Freund. Estos adyuvantes se pueden utilizar como una mezcla de dos o más tipos de los mismos. Se prefiere un adyuvante oleoso.
La cantidad del adyuvante en la composición vacunal contra el cáncer de la presente invención no está particularmente limitada a condición de que las respuestas inmunológicas a los antígenos se pueden aumentar inespecíficamente. La cantidad del mismo puede seleccionarse adecuadamente dependiendo del tipo de adyuvante, etc.
La composición vacunal contra el cáncer de la presente invención se puede administrar por vía oral o parenteral (por ejemplo, intraperitoneal, subcutánea, intercutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal, etc.). En el caso de la administración parenteral, el principio activo, es decir el WT1 proteico o el WT1 peptídico, también se puede absorber por vía percutánea aplicando la composición vacunal en la piel, o pegando a la piel un parche que contiene la composición vacunal. La composición vacunal de la presente invención se puede administrar también mediante inhalación, etc. La composición vacunal de la presente invención se administra preferentemente por vía parenteral, y más preferentemente intracutánea o subcutánea. La parte del cuerpo para la administración intracutánea o subcutánea es preferentemente, por ejemplo, la parte superior del brazo, etc.
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La composición vacunal contra el cáncer de la presente invención puede estar en distintas formas de dosificación dependiendo de su vía de administración, y las formas de dosificación ejemplares de las mismas incluyen una preparación sólida y una preparación líquida. La composición vacunal contra el cáncer puede estar, por ejemplo, en forma de una preparación sólida o líquida para utilizarse internamente para la administración oral, una inyección para la administración parenteral, o similares.
Ejemplos de la preparación sólida que se va a utilizar internamente por administración parenteral incluyen comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos y gránulos.
Para la preparación de la preparación sólida que se va a utilizar internamente, el WT1 proteico o el WT1 peptídico sin tratar, se mezcla con un aditivo o granulado (de acuerdo con, por ejemplo, la granulación por agitado, granulación en lecho fluidificado, granulación seca, granulación en lecho fluidificado con agitado rodante, etc.) y entonces se somete a un método habitual. Por ejemplo, las cápsulas se pueden preparar por encapsulación et. y los comprimidos se puede preparar por compresión, etc. Un tipo o dos o más de aditivos se puede incorporar apropiadamente a la preparación sólida. Ejemplos de los aditivos incluye excipientes tales como la lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina y almidón de maíz; aglutinantes tales como hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, y aluminometasilicato de magnesio; agentes dispersantes tales como el almidón de maíz; desintegrantes tale como la carboximetil celulosa cálcica; lubricantes tales como el estearato de magnesio; agentes solubilizantes tales como el ácido glutámico y el ácido aspártico; estabilizantes; polímeros hidrosolubles que incluyen celulosas tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y metilcelulosa, y polímeros sintéticos tales como polietilenglicol, polivinilpirrolidona y alcohol polivinílico; y edulcorantes tales como el azúcar blanco, azúcar en polvo, sacarosa, fructosa, glucosa, lactosa, jarabe azucarado de malta reducida (jarabe de maltitol), polvo de jarabe azucarado de malta reducida (polvo de jarabe de maltitol), jarabe de maíz alto en glucosa, jarabe de maíz alto en fructosa, miel, sorbitol, maltitol, manitol, xilitol, eritritol, aspartamo, sacarina y sacarina sódica.
Los gránulos o tabletas se pueden cubrir con un agente de revestimiento, etc., si fuera necesario, y se pueden cubrir con dos o más capas del mismo. Ejemplos de un agente de revestimiento incluyen el azúcar blanco, gelatina, hidroxipropilcelulosa y ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Las cápsulas se pueden preparar mezclando el principio activo con hidrato de pranlikast y un excipiente seleccionado apropiadamente de entre los excipientes anteriores, granulando opcionalmente la mezcla, y opcionalmente cubriendo los gránulos resultantes con un agente de revestimiento, seguido por el llenado de la cápsula. De manera alternativa, las cápsulas se pueden preparar añadiendo glicerol, sorbitol, etc. a una base de cápsula apropiada (gelatina, etc.) para aumentar su plasticidad, y se encapsula el principio activo con la base resultante. Se puede añadir a la base de la cápsula un colorante o conservante (dióxido de azufre; y parabenos tales como parahidroxibenzoato de metilo, parahidroxibenzoato de etilo y parahidroxibenzoato de propilo) si fuera necesario. Las cápsulas incluyen las cápsulas duras y las cápsulas blandas.
Ejemplos de la preparación líquida que se va a utilizar internamente mediante administración oral incluye, agua, suspensiones/emulsiones, jarabes, preparación para que se disuelvan antes de su uso como jarabes secos, y elixires. Para la preparación de la preparación líquida que se va a utilizar internamente, el WT1 proteico o el WT1 peptídico se disuelve, suspende o emulsiona en un diluyente utilizado en general para las preparaciones liquidas que se van a utilizar internamente. Ejemplos del diluyente incluyen agua purificada, etanol y una mezcla de los mismos. La preparación líquida puede contener adicionalmente un agente humectante, un agente de suspensión, un emulsionante, un edulcorante, un saborizante, un aroma, un conservante o un agente tapón. Los jarabes secos se pueden preparar, por ejemplo, mezclando el principio activo con hidrato de pranlikast y un ingrediente adicional tal como azúcar blanco, azúcar en polvo, sacarosa, fructosa, glucosa y lactosa. Los jarabes secos también se pueden utilizar en gránulos de manera habitual.
Ejemplos de la forma de dosificación para la administración parenteral incluye inyecciones, ungüentos, geles, cremas, parches, aerosoles y pulverizadores. Se prefieren las inyecciones. Por ejemplo, la inyección contiene preferentemente un vehículo convencional con el WT1 proteico o el WT1 peptídico.
La inyección para la administración parenteral puede ser una inyección acuosa o una inyección oleosa. La inyección acuosa se puede preparar de acuerdo con un método conocido, por ejemplo, añadiendo apropiadamente un aditivo farmacéuticamente adecuado a un disolvente acuoso (agua para inyección, agua purificada, etc.) para hacer una solución, mezclando el WT1 proteico o WT1 peptídico con la solución, esterilizando por filtración la mezcla resultante con un filtro, etc., y después llenando un envase aséptico con el filtrado resultante. Ejemplos del aditivo farmacéuticamente aceptable incluye los adyuvantes mencionados anteriormente; agentes de isotonicidad tal como cloruro sódico, cloruro potásico, glicerol, manitol, sorbitol, ácido bórico, bórax, glucosa y propilenglicol; agentes tampón tales como solución tampón de fosfato, solución tampón de acetato, solución tampón de borato, solución tampón de carbonato, solución tampón de ctirato, solución de tampón Tris, solución tampón de glutamato y solución épsilon-aminocaproato; conservantes tales como parahidroxibenzoato de metilo, parahidroxibenzoato de etilo, para hidroxibenzoato de propilo, parahidroxibenzoato de butilo, clorobutanol, alcohol bencílico, cloruro de benzalconio, dihidroacetato sódico, edetato sódico, ácido bórico y bórax; espesantes tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, alcohol polivinílico y polietilenglicol; estabilizantes tales como sulfito hidrógeno sódico, tiosulfato sódico, edetato sódico, citrato sódico, ácido ascórbico y dibutil hidroxitolueno; y ajustadores del pH tales
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como ácido clorhídrico, hidróxido sódico, ácido fosfórico y ácido acético. La inyección puede contener adicionalmente un agente solubilizante apropiado, y ejemplos de los mismos incluyen alcoholes tales como etanol, polialcoholes tales como el propilenglicol y polietilenglicol; y tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 80, aceite de ricino hidrogenado polioxetileno 50, lisolecitina y polioles plurónicos. También pueden estar contenidos en la inyección proteínas tales como albúmina sérica bovina y hemocianina de lapa californiana; polisacáridos tales como el aminodextrano; etc. Para la preparación de la inyección oleosa, por ejemplo, se utiliza aceite de sésamo o aceite de soja como disolvente oleoso, y se puede mezclar con benzoato de bencilo o alcohol bencílico como agente solubilizante. Las preparaciones liofilizadas se vuelven listas para su uso re-disolviéndolos en agua destilada para inyección, etc. que se añade antes de su uso.
Otra forma de dosificación de la composición vacunal contra el cáncer de la presente invención puede ser un liposoma que contiene el WT1 proteico o WT1 peptídico y, si es necesario, se pueden mezclar con polisacáridos y/u otros ingredientes en la composición vacunal contra el cáncer.
La dosis de la composición vacunal de la presente invención varía con el tipo de WT1 proteico, WT1 peptídico o ADN que se va a utilizar, la edad y peso corporal del paciente, la enfermedad que se va a tratar, etc. Por ejemplo, en el caso de la composición vacunal que comprende el WT1 peptídico, por ejemplo, el péptido WT1w o el péptido WT1 126, la dosis diaria es preferentemente aproximadamente 0,1 pg/kg pc a 1 mg/kg pc como cantidad del WT1 peptídico. La dosis del WT1 peptídico es habitualmente de 0,001 mg a 1000 mg, preferentemente 0,01 mg a 1000 mg, y más preferentemente 0,1 mg a 10 mg. Esta cantidad se administra preferentemente una vez en varios días a varios meses.
La composición vacunal contra el cáncer de la presente invención es una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206. El tipo HLA, que es una medida de selección de personas positivas al HLA- A*0206, se puede determinar, por ejemplo, de la sangre periférica de donantes. Ejemplos del método de determinación del tipo HLA incluye métodos conocidos tales como el método de tipaje de ADN, por ejemplo, el método SBT (Tipaje basado en secuenciación) o el método SSP, y el método de tipaje de HLA. En el método SBT, la secuencia de bases de un ADN amplificado por PCR se compara con los datos de secuencia de bases de alelos conocidos para identificar con precisión el tipo de gen HLA. En el método SSP, después de la amplificación por PCR utilizando una variedad de cebadores específicos para los alelos de HLA respectivos, se lleva a cabo la electroforesis posterior para comprobar una banda positiva. De esta manera, se puede identificar el tipo de gen HLA.
Cuando la composición vacunal contra el cáncer de la presente invención se administra a una persona positiva a HLA-A*0206, el WT1 proteico o el WT1 peptídico restringido al HLA-A*0206 de la composición vacunal, o el WT1 proteico o WT1 peptídico expresado a partir del ADN o ARN de la composición vacunal se une a una molécula de HLA-A*0206 en la superficie de una célula presentadora de antígenos (célula dendrítica) de la persona positiva al HLA-A*0206. Esto induce una inmunidad antitumoral específica, es decir, los CTL específicos de WT1, que destruye las células cancerosas en el sujeto (persona positiva al HLA-A*0206). Dicha inmunidad antitumoral se puede comprobar, por ejemplo, mediante la respuesta de CTL específicos de WT1, el ensayo citotóxico contra las células cancerosas (por ejemplo, ensayo de citotoxicidad por liberación de 51Cr), etc. Por ejemplo, el péptido WT1w y el péptido WT1126 restringidos a HLA-A*0201 que consiste cada uno en 9 aminoácidos derivados del WT1 proteico, que se ha informado que es capaz de inducir una respuesta de CTL específico de WT1, puede inducir una respuesta restringida a HLA-A*0206. Aproximadamente un 17 % de la población japonesa es positiva a HLA-A*0206, mientras que casi la misma proporción es positiva a HLA-A*0201. En los siguientes ejemplos 1 a 5, se prepararon CTL específicos de WT1w a partir de PBMC de tres donantes de sangre positivos a HLA-A*0206. Los CTL inducidos presentaban el efecto citotóxico en células de leucemia positivas a HLA-A*0206 que expresaban WT1. Como la actividad de CTL específico para el péptido WT1w y el péptido WT1126 se puede inhibir por un anticuerpo anti-HLA Clase I, se descubrió que la actividad la van a presentar los CTL restringidos al HLA de clase I. El WT1 proteico o WT1 peptídico incluyendo el péptido WT1w y/o el péptido WT1126, o un péptido modificado del mismo puede ser una vacuna para pacientes de cáncer positivos al HlA-A*0206 así como para pacientes positivos al HLA-A*0201. Por lo tanto, la inmunoterapia basada en el WT1 proteico o el WT1 peptídico para pacientes con tumores malignos, tales como tumores hematopoyéticos o cánceres sólidos, se pueden aplicar adicionalmente a pacientes de cáncer positivos al HLA-A*0206. También se desvela el método de tratamiento y/o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206 que comprende la administración de la composición vacunal de la presente invención en una persona positiva al HLA-A*0206.
En personas positivas al HLA-A*0206, la composición vacunal contra el cáncer de la presente invención se puede utilizar para el tratamiento y/o prevención de cánceres acompañados por el aumento de la expresión del gen WT1: por ejemplo, tumores hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno; y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer de cuello de útero y cáncer ovárico.
Un método de administración ejemplar de la composición vacunal contra el cáncer como se desvela en el presente documento es un método que comprende la recolección de PBMC de la sangre periférica de un paciente positivo al HLA-A*0206, la extracción de células dendríticas de las PBMC, el pulsado de las células dendríticas con un péptido,
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por ejemplo, el péptido WTI187 o el péptido WTI126, o un polinucleótido, por ejemplo, ADN o ARN, contenidos como principio activo en la composición vacunal contra el cáncer de la presente invención, y devolviendo las células dendríticas al paciente mediante la administración subcutánea, etc. Las condiciones del pulsado de células dendríticas con el WT1 peptídico, etc. no están limitadas particularmente a condición de que se consiga el efecto de la presente invención, y pueden ser condiciones habituales.
En el caso en el que el ARN que codifica el WT1 proteico o el WT1 peptídico se utiliza en la composición vacunal contra el cáncer, es preferible que la composición se administra de manera que ese introduce el ARN en las células dendríticas de una persona positiva al HLA-A*0206. Un método ejemplar para la introducción del ARN en células dendríticas de una persona positiva al HLA-A*0206 es un método que comprende la recolección de células dendríticas de una persona positiva al HLA-A*0206 de la misma manera que se ha mencionado anteriormente, y la introducción del ARN en las células dendríticas con un pulso eléctrico. El WT1 proteico o WT1 peptídico que se expresa a partir del ARN introducido en las células dendríticas se permite que se presente en la superficie de las mismas. Devolviendo las células dendríticas pulsadas con el ARN en la persona positiva al HLA-A*0206, se puede producir rápidamente la inmunidad contra el cáncer en el cuerpo vivo. También se desvela dicho método de tratamiento o prevención del cáncer, que comprende la introducción de ARN que codifica un WT1 proteico o WT1 peptídico en células dendríticas de una persona positiva al HLA-A*0206.
Otra realización de la presente invención se refiere a un método ex vivo para la inducción de CTL específicos de WT1, cultivando, en presencia del WT1 proteico o WT1 peptídico, las PBMc derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206, para obtener CTL específicos de WT1 inducidos a partir de ellas. El sujeto del cual se derivan los PBMC no se limita particularmente a condición de que el sujeto es positivo al HLA-A*0206. Ejemplos del WT1 proteico o WT1 peptídico incluye el péptido WT1w, el péptido WT1-I26 y un péptido modificado del mismo, y preferentemente el péptido WT1w y el péptido WT1-I26. Por ejemplo, se pueden inducir los CTL específicos del WT1 a partir de células precursoras de CTL entre las PBMC cultivando las PBMC derivadas de una persona positiva al hLA-A*0206 en presencia del péptido WT1w (o el péptido WT1-I26). Las condiciones de cultivo para las PBMC derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206 no están limitadas particularmente, y pueden ser condiciones habituales. Los CTL obtenidos de esta manera reconocen un complejo del péptido WT1w (o el péptido WT1-I26) y una molécula HLA-A*0206. Por lo tanto, mediante el uso de CTL específicos de WT1 inducidos de acuerdo con la presente invención, se pueden destruir específicamente las células tumorales que expresan altamente WT1 en una persona positiva al HLA-A*0206, y de esta manera se pueden tratar y/o prevenir los tumores hematopoyéticos y cánceres sólidos del sujeto, es decir, la persona positiva al HLA-A*0206. El método de administración de dichos CTL específicos de WT1 en un sujeto positivo al HLA-A*0206 no está limitado particularmente, y, por ejemplo, puede ser el mismo que el método de administración de la composición vacunal contra el cáncer mencionado anteriormente. También se desvela un kit para inducir CTL específicos de WT1, que comprende el WT1 proteico o WT1 peptídico restringido a HLA-A*0206 como constituyente esencial. Preferentemente, el kit se utiliza para el método mencionado anteriormente para inducir CTL específicos de WT1 derivados de una persona positiva al HLA-A*0206, Dicho kit puede comprender, por ejemplo, un medio de recolección las PBMC, un adyuvante y un recipiente de reacción además del WT1 proteico o WT1 peptídico restringido al HLA-A*0206. Por el uso del kit, se pueden inducir los CTL específicos de WT1 que reconocen un complejo de un antígeno del cáncer, tal como el péptido WT1w y el péptido WT1-I26, y una molécula del HLA-A*0206.
Otra realización de la presente invención se refiere a un método ex vivo para inducir células dendríticas que presentan el WT1 proteico o WT1 peptídico, cultivando, en presencia del WT1 proteico o WT1 peptídico, células dendríticas inmaduras derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206, para obtener células dendríticas inducidas a partir de ellas que presenten el WT1 proteico o WT1 peptídico. Ejemplos del WT1 proteico o WT1 peptídico incluye el péptido WT1-I87, el péptido WT1-I26 y un péptido modificado del mismo, y preferentemente el péptido WT1w y el péptido WT1-I26. El sujeto del que se derivan las células dendríticas inmaduras no se limita particularmente a condición de que el sujeto sea positivo al HLA-A*0206. Como las células dendríticas inmaduras se presentan entre las PBMC, etc., también se pueden cultivar PBMC en presencia del péptido WT1w o el péptido WT1-I26, por ejemplo. Por la administración de las células dendríticas así obtenidas a una persona positiva al HLA-A*0206, se inducen eficazmente los CTL específicos de WT1 mencionados anteriormente, y de esta manera se pueden tratar y/o prevenir tumores hematopoyéticos y cánceres sólidos en el sujeto. El método para la administración de dichas células dendríticas en un sujeto positivo al HLA-A*0206 no se limita particularmente, y, por ejemplo, puede ser el mismo que el método de administración de la composición vacunal contra el cáncer.
También se desvela un kit para inducir células dendríticas que presentan el WT1 proteico o WT1 peptídico, que comprenden el WT1 proteico o WT1 peptídico restringidos al HLA-A*0206 como constituyente esencial. Preferentemente, se utiliza el kit para el método mencionado anteriormente para inducir células dendríticas. Dicho kit puede comprender, por ejemplo, un medio para recolectar células dendríticas inmaduras y PBMC, un adyuvante y un recipiente de reacción además del WT1 proteico o WT1 peptídico restringidos al HLA-A*0206. Por el uso del kit, se pueden inducir eficazmente células dendríticas que presentan el WT1 proteico o el WT1 peptídico mediante una molécula del HLA-A*0206.
Los cánceres de personas positivas al HLA-A*0206 se pueden diagnosticar por el uso de
(1) el WT1 proteico o WT1 peptídico, los CTL específicos de WT1 inducidos por el método mencionado
anteriormente, o las células dendríticas inducidas por el método mencionado anteriormente, o
(2) un anticuerpo contra lo siguiente: el WT1 proteico o WT1 peptídico, los CTL específicos de WT1 inducidos por
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el método mencionado anteriormente, o las células dendríticas inducidas por el método mencionado anteriormente.
Dicho método in vitro del diagnóstico del cáncer es también un aspecto de la presente invención. En el (1) anterior, el diagnóstico del cáncer se lleva preferentemente utilizando CTL específicos del WT1 inducidos por el método mencionado anteriormente. Ejemplos del WT1 proteico o WT1 peptídico incluye el péptido WT1w, el péptido WT1-I26 y un péptido modificado de los mismos, y preferentemente el péptido WT1w y el péptido WT1-I26.
De acuerdo con la presente invención, un método ejemplar in vitro de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206 comprende una etapa de detección o cuantificación del WT1 proteico o WT1 peptídico, un anticuerpo contra ellos o CTL específicos del WT1 en una muestra de una persona positiva al HLA-A*0206, y una etapa de comparación de la cantidad de la proteína o un péptido parcial de la misma y un anticuerpo contra ellos o los CTL específicos del WT1, con la del caso en el que no se desarrolló el cáncer.
En una muestra del paciente de cáncer (por ejemplo, sangre), está presente el WT1 peptídico y/o WT1 proteico liberado por las células cancerosas, y la respuesta inmunológica contra un antígeno del cáncer está aumentada. Es decir, la muestra del paciente de cáncer tiene una mayor cantidad de un anticuerpo contra el WT1 peptídico o WT1 proteico, CTL específicos del WT1, etc. Por esta razón, cuando aumenta la cantidad del WT1 peptídico o WT1 proteico, un anticuerpo contra ellos o los CTL específicos de WT1 en comparación con la del caso en el que no se desarrolló el cáncer, se puede haber desarrollado el cáncer. La cantidad del anticuerpo puede medirse por el método ELISA, por ejemplo. Los CTL específicos del WT1 se pueden detectar por un método que utiliza multímeros del WT1 tales como los tetrámeros del mHc descritos posteriormente.
De manera alternativa, el diagnóstico del cáncer también se puede llevar a cabo incubando los CTL mencionados anteriormente, células dendríticas o anticuerpos junto con una muestra de un sujeto positivo al HLA-A*0206, o administrando los CTL, células dendríticas o anticuerpo mencionado anteriormente a un sujeto positivo al HLA- A*0206; y después determinar la posición, región, cantidad, etc. de los CTL, células dendríticas o anticuerpo. Como los CTL y células dendríticas tienen una propiedad de unirse alrededor de las células cancerosas, se puede llevar a cabo el diagnóstico del cáncer administrando los CTL o células dendríticas al sujeto, y examinando la posición o región de los mismos. También se desvela en el presente documento un método de diagnóstico del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206 comprende una etapa de administración de CTL específicos de WT1 o células dendríticas inducidas por el método mencionado anteriormente en un sujeto positivo al HLA-A*0206, y una etapa de determinar la posición o región de los CTL o células dendríticas en el sujeto positivo al HLA-A*0206.
El diagnóstico del cáncer se puede llevar a cabo también incubando los CTL o las células dendríticas junto con una muestra de un sujeto positivo al HLA-A*0206 que les permita reaccionar, añadiendo un anticuerpo contra los CTL o las células dendríticas, continuar la incubación, y detectar o cuantificar un complejo de unión del anticuerpo a las células cancerosas y los CTL, la unión de anticuerpo a las células dendríticas, etc. mediante un marcador, etc. unido al anticuerpo. Cuando la cantidad del complejo de unión del anticuerpo a la célula cancerosa y los CTL o la unión del anticuerpo a células dendríticas está aumentada en comparación con el caso en el que no se desarrolló el cáncer, puede que se haya desarrollado el cáncer. Los CTL, células dendríticas o anticuerpos mencionados anteriormente pueden estar marcados. el marcado hace posible que se lleve a cabo eficazmente el diagnóstico. Ejemplos de la muestra del sujeto positivo a HLA-A*0206 incluye los especímenes biológicos obtenidos de las personas positivas al HLA-A*0206, tal como orina, sangre, fluido de extractos tisulares, saliva, lágrimas, y otros fluidos, y es preferible la sangre.
Ejemplos del método de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206 que utilizan el WT1 proteico o WT1 peptídico mencionado anteriormente incluye el ensayo de MHC tetramérico, el ensayo de MHC pentamérico y el ensayo del MHC dextramérico, cada uno de los cuales utilizan el WT1 peptídico como antígeno. Por ejemplo, en el ensayo del MHC tetramérico o el ensayo del MHC pentamérico utilizando el péptido WT1w o el péptido WT1-I26 como antigénico peptídico, los CTL específicos de WT1 de personas positivas al HLA-A*0206 se pueden detectar utilizando un complejo MHC/péptido WT1w o un complejo del MHC/péptido WT1-I26 como sonda. Como los pacientes de cáncer presentan una alta expresión de cTl específicos de WT1, se puede diagnosticar el cáncer midiendo la expresión de CTL específicos de WT1 en personas positivas al HLA-A*0206. Como los pacientes de cáncer manifiestan una repuesta inmunológica aumentada contra los antígenos del cáncer, también se puede diagnosticar el cáncer examinando la respuesta inmunológica contra el WT1 proteico o WT1 peptídico en personas positivas al HLA-A*0206. Ejemplos del método de examen de la respuesta inmunológica incluye un método que implica la medición de un anticuerpo contra el WT1 proteico o WT1 peptídico mediante ELISA. Dicho método de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206 utilizando un producto del gen supresor tumoral WT1 o un péptido parcial del mismo es también un aspecto de la presente invención. El ensayo del MHC tetramérico y el ensayo del MHC pentamérico se puede llevar a cabo por un método conocido utilizando un kit disponible en el mercado, por ejemplo, "WT1 tetramer" (Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd.).
El diagnóstico del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206 también se puede llevar a cabo por un método que comprende una etapa de hacer reaccionar una muestra de un sujeto positivo al HLA-A*0206 con un anticuerpo contra los siguientes: el WT1 proteico o el WT1 péptido, CTL específicos de WT1 inducidos por el método mencionado anteriormente o las células dendríticas inducidas por el método descrito anteriormente, y una etapa de
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detección o cuantificación de un complejo del anticuerpo con el WT1 proteico o el WT1 peptídico, o un complejo del anticuerpo con los CTL específicos de WT1 o células dendríticas. Cuando la cantidad del complejo del anticuerpo con el WT1 proteico o el WT1 peptídico, o el complejo del anticuerpo con los CTL específicos de WT1 o células dendríticas está aumentada en comparación con la del caso en el que no se desarrolló el cáncer, puede haberse desarrollado un cáncer.
Ejemplos del anticuerpo contra las células dendríticas incluyen un anticuerpo que reconoce un complejo péptido Wt1/HLA-A*0206. Como dicho anticuerpo puede reconocer el péptido WT1 y una molécula del HLA-A*0206, el anticuerpo puede reconocer las células dendríticas que tiene el WT1 péptido presente mediante el HLA de clase I.
Un anticuerpo que reconoce un complejo del WT1 peptídico/HLA-A*0206/TCR (receptor antigénico de célula T) de los CTL también se puede utilizar como anticuerpo contra células dendríticas. Dicho anticuerpo puede reconocer un complejo de una célula dendrítica y un CTL, y un complejo de una célula cancerosa y un CTL.
El diagnóstico del cáncer se puede llevar a cabo incubando dicho anticuerpo junto con una muestra de un sujeto positivo al HLA-A*0206 para permitirle que forme un complejo, y detectar o cuantificar un complejo de unión al anticuerpo de la célula cancerosa y los CTL, el anticuerpo unido a las células dendríticas que presentan el WT1 peptídico o similares, mediante la fluorescencia emitida por el anticuerpo. Cuando la cantidad del complejo de unión del anticuerpo a la célula cancerosa y CTL, el anticuerpo unido a las células que presentan el WT1 peptídico, o similares está aumentado en comparación con el del caso en el que no se desarrolló el cáncer, se puede haber desarrollado un cáncer.
También se desvela en el presente documento un método de tratamiento o prevención del cáncer, que comprende la administración de una composición que contiene el WT1 proteico o el WT1 péptido en una persona positiva al HLA- A*0206. La composición que comprende el WT1 proteico o el WT1 peptídico y las realizaciones preferidas del mismo son las mismas que se han descrito con respecto a la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente.
El uso del WT1 proteico o WT1 peptídico para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA- A*0206, y el uso de los mismos para la producción de una composición vacunal contra el cáncer que se utiliza para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206 también es un aspecto de la presente invención. El WT1 proteico o WT1 peptídico y las realizaciones preferidas del mismo son las mismas que se han descrito con respecto a la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente.
También se desvela en el presente documento una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201, que comprende un péptido modificado del péptido WT1w (SEQ ID NO: 2) o el péptido WT1126 (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1, siendo el péptido modificado inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201.
Ejemplos de un péptido WT1w modificado o un péptido WT1126 modificado incluye péptidos que comprenden una eliminación, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos del péptido WT1w o el péptido WT1126 mencionados anteriormente. El péptido WT1w modificado es preferentemente un péptido que comprende los mismos restos de aminoácidos en las posiciones 4 a 8 desde el extremo N que tiene el péptido WT1w en las posiciones correspondientes. Como dicho péptido modificado, se prefieren los péptidos mencionados anteriormente de las SEQ ID NO: 4 a 12, 15 y 16, 18 a 20 y 22 a 25. También se prefiere el péptido WT1wP9L (SLGEQQYSL; SEQ ID NO: 53). El péptido WT1 126 modificado es preferentemente un péptido que comprende los mismos restos de aminoácidos en las posiciones 4 a 8 desde el extremo N que tiene el péptido WT1126 en las posiciones correspondientes. Por ejemplo, se prefieren los péptidos mencionados anteriormente de SEQ ID NO: 27 a 37 y 39 a 52.
También se desvela que los péptidos mencionados anteriormente de SEQ ID NO: 4 a 26 y 53 a 62 se pueden utilizar como un péptido WT1w modificado, y los péptidos mencionados anteriormente de las SEQ ID NO: 27 a 52 y 63 a 75 se pueden utilizar como péptido WT1126 modificado. Entre los péptidos modificados de SEQ ID NO: 4 a 75, se prefieren los péptidos excepto el péptido WT1wP1D, el péptido WT1wP1E, el péptido WT1wP1H, el péptido WT1wP1P y el péptido WT1wP2Q; y el péptido WT1126P1D, el péptido WT1126P1E, el péptido WT1126P1P, el péptido WT1126P2A y el péptido WT1126P2Q.
Inter alia, el péptido WT1w modificado es preferentemente el péptido WT1wP1F, el péptido WT1wP2M o el péptido WT1wP3M, y más preferentemente el péptido WT1wP1F o el péptido WT1wP2m. El péptido WT1126 modificado es preferentemente el péptido WT1126P1F, el péptido WT1126P2L, el péptido WT1126P3M o el péptido WT1126P9V, y más preferentemente el péptido WT1126P1F o el péptido WT1126P2L.
La cantidad para el uso del péptido WT1w o el péptido WT1126 modificados que son inmunogénicos en personas positivas al HLA-A*0201 es la misma que la del WT1 peptídico en la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente para personas positivas al hLA-A*0206. Los demás ingredientes de la composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201 y las realizaciones preferidas de la misma son los mismos que los de la composición vacunal mencionada anteriormente para personas positivas al HLA-A*0206.
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El ADN y ARN que codifica el péptido WT1w o péptido WTI126 modificados que se mencionan anteriormente que son inmunogénicos en personas positivas al HLA-A*0201 también se pueden utilizar como un principio activo de la composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201. Dicha composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201 también se desvela en el presente documento.
Los demás ingredientes distintos del ADN y ARN en la composición vacunal contra el cáncer para las personas positivas al HLA-A*0201 y realizaciones preferidas de los mismos son los mismos que los de la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente para personas positivas al HLA-A*0206.
Los CTL específicos de WT1 se pueden inducir a partir de PBMC derivadas de una persona positiva al HLA-A*0201 cultivando las PBMC en presencia de un péptido WT1w o un péptido WT1126 modificado que sea inmunogénica para la persona positiva al HLA-A*0201 mencionada anteriormente. Dicho método de inducción de CTL específicos del WT1 también se desvela en el presente documento.
Ejemplos preferidos del péptido WT1w o el péptido WT1126 modificados que sean inmunogénicos en personas positivas al HLA-A*0201 son los mismos que se utilizan para la composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201.
Las células dendríticas que presentan el péptido WT1w o el péptido WT1-I26 modificados pueden inducirse a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de una persona positiva al HLA-A*0201 cultivando las células dendríticas inmaduras en presencia del péptido modificado que es inmunogénica en la persona positiva al HLA-A*0201 mencionada anteriormente. Dicho método para la inducción de células dendríticas que presentan el péptido WT1w o el péptido WT1-I26 modificados también se desvela en el presente documento. Los ejemplos preferidos del péptido modificado son los mismo que se utilizan para la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente para las personas positivas al HLA-A*0201.
Los cánceres en las personas positivas al HLA-A*0201 se pueden diagnosticar mediante el uso del péptido WT1w modificado o el péptido WT1-I26 modificado mencionados anteriormente inmunogénicos para personas positivas al HLA-A*0201, un anticuerpo contra ellos, CTL específicos de WT1 inducidos por el péptido modificado o las células dendríticas inducidas por el péptido modificado. Dicho método de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0201 también se desvela en el presente documento.
El método de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0201 y las realizaciones preferidas del mismo son los mismos que el método mencionado anteriormente para el diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206 y las realizaciones preferidas del mismo.
Ejemplos del método de diagnóstico para personas positivas al HLA-A*0201 incluyen el ensayo del MHC tetramérico, el ensayo del MHC pentamérico y el ensayo del MHC dextramérico, cada uno de los cuales utilizan el péptido WT1-I87 modificado o el péptido WT1-I26 modificado inmunogénicos en personas positivas al HLA-A*0201 como antígeno. Ejemplos preferidos del péptido modificado son los mismos que se utilizaron para la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente para personas positivas al HLA-A*0201.
Los cánceres en las personas positivas al HLA-A*0201 se pueden diagnosticar mediante el uso de un anticuerpo contra los siguientes: el péptido WT1w modificado o el péptido WT1-I26 modificado mencionados anteriormente inmunogénicos en personas positivas al HLA-A*0201, los CTL específicos de WT1 inducidos por el péptido modificado o las células dendríticas inducidas por el péptido modificado. Dicho método de diagnóstico del cáncer en personas positivas al HLA-A*0201 también se desvela en el presente documento.
Ejemplos preferidos del péptido modificado son los mismos que se han utilizado en la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente para las personas positivas al HLA-A*0201. El método de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0201 y las realizaciones preferidas del mismo son las mismas que el método mencionado anteriormente de diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206 y las realizaciones preferidas del mismo.
También se desvela en el presente documento un método para el tratamiento o prevención del cáncer, que comprende la administración a una persona positiva al HLA-A*0201 de una composición vacunal que contiene el siguiente péptido:
un péptido modificado del péptido WT1w (SEQ ID NO: 2) o el péptido WT1-I26 (SEQ ID NO: 3), que cualquiera de ellos es un péptido parcial de un producto proteico del gen supresor tumoral WT1, siendo el péptido modificado inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201.
Ejemplos preferidos del péptido modificado son los mismos que se han utilizado para la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente para personas positivas al HLA-A*0201. La composición vacunal contra el cáncer y las realizaciones preferidas del mismo como se describen con respecto a la composición vacunal mencionada anteriormente para las personas positivas al HLA-A*0201.
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Se desvela también el uso del siguiente péptido:
un péptido modificado del péptido WT1w (SEQ ID NO: 2) o el péptido WTI126 (SEQ ID NO: 3), que cualquiera de los cuales es un péptido parcial del producto proteico del gen supresor tumoral WT1, siendo el péptido modificado inmunogénica en una persona positiva al HLA-A*0201,
para el tratamiento o prevención en personas positivas al HLA-A*0201, y el uso de los mismos para la producción de una composición vacunal contra el cáncer utilizada para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0201.
Ejemplos preferidos del péptido modificado son los mismos que se utilizan en la composición vacunal contra el cáncer mencionada anteriormente para las personas positivas al HLA-A*0201. La composición vacunal contra el cáncer y las realizaciones preferidas de la misma son los mismos que se han descrito respecto a la composición vacunal mencionada anteriormente para las personas positivas al HLA-A*0201.
Ejemplos
De aquí en adelante, la presente invención se ilustrará con más detalle por medio de ejemplos, pero no se limita a estos. Las abreviaturas de los Ejemplos indican los siguientes significados. Los péptidos sintéticos se adquirieron en SIGMA GENOSYS JAPAN.
DCs: Células dendríticas
PBMC: Células mononucleares de sangre periférica
CD: Agrupamiento de diferenciación (antígeno de diferenciación de leucocitos)
GM-CSF: Factor estimulante de colonias de monocitos granulocitos IL: Interleucina
TNFa: Factor de necrosis tumoral-a PGE: Prostaglandina Gy: Gray
B-LCL: Línea celular linfoblastoide-B EB virus: virus de Epstein-Barr tBu: t-butilo Trt: Trifenilmetilo Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
Ejemplo 1 (predicción de moléculas del HLA capaces de unirse con el WT1 peptídico)
Las moléculas de HLA capaces de unirse con el péptido WT1w (SEQ ID NO: 2) se predijeron utilizando el programa de predicción NetMHC2.0 Server.
Como resultado, el péptido WT1w restringido al HLA-A*0201 capaz de inducir CTL específicos del WT1 se clasificó como alto en términos de afinidad de unión a una molécula del HLA-A*0206 con el programa de predicción NetMHC2.0 Server (
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-2.0/).
Ejemplo 2 (preparación de CTL específicos del péptido WT1187 a partir de PBMC de donantes de sangre sanos positivos al HLA-A*0206, y ensayo de citotoxicidad de los CTL)
(1) Separación de las PBMC de donantes de sangre sanos positivos al HLA-A*0206, y preparación de las CD
Primero, se aislaron las PBMC a partir de la sangre periférica de cada uno de los donantes de sangre sanos positivos al HLA-A*0206 (tres personas) por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Después, se seleccionaron las células positivas al CD14 de entre las PBMC utilizando partículas-DM magnéticas anti-CD14 humano (fabricadas por Becton, Dickinson y compañía (BD)). En este caso, se consideró que estaba presente un gran número de células positivas a CD14 en la población de monocitos. Las células positivas a CD14 seleccionadas se cultivaron en un medio X-VIVO 15 (fabricado por BioWhittaker, Walkersville, MD) suplementado con un 1 % v/v de suero AB humano, 800 UI/ml de GM-CSF (fabricado por Pepro Tech INC, Rocky Hill, NJ) y 1000 UI/ml de IL-4 (fabricada por Pepro Tech INC) para preparar las CD.
(2) Inducción de CD maduras autólogas
Las CD preparadas en el (1) anterior se cultivaron a 37 °C durante 1 día, y después se añadió un coctel de maduración de citocinas que contenía 10 ng/ml de TNFa (factor de necrosis tumoral-a; Pepro Tech INC, Rocky Hill, NJ), 10 ng/ml de IL-p, 100 UI/ml de IL-6 y 1 pg/ml de PGE2 a los pocillos de cultivo que contenían las CD. Después del cultivo de 24 h a 37 °C, se obtuvieron las CD maduras autólogas.
(3) Inducción de CTL específicos del péptido WT1w
Las CD maduras autólogas se pulsaron con el péptido WT1w, se irradiaron con 30 Gy de radiación, y se co
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cultivaron con PBMC enriquecidas en células T positivas a CD8 obtenidas del donante de sangre sano positivo al HLA-A*0206. La pulsión de las CD con el péptido WT1w se llevó a cabo cultivando las CD en presencia de 10 pg/ml del péptido WTI187 a 37 °C durante 30 minutos. Las células T positivas a CD8 se enriquecieron a partir de las PBMC del donante de sangre sano positivo al HLA-A*0206 utilizando las microperlas CD8 y columna Ms (fabricadas por Miltenyi Biotec GmbH).
A partir de la segunda estimulación, se utilizaron las PBMC autólogas que se habían pulsado con el péptido y después irradiado con radiación como células estimulantes selectivas. Dos días después de la segunda estimulación, se añadieron una IL-2 recombínate (proporcionada por Shionogi & Co., Ltd.) y una IL-7 (fabricada por Pepro Tech INC) al medio de cultivo a concentraciones de 10 Ul/ml y 10 ng/ml, respectivamente. Después de la 4a estimulación, se cultivaron las células durante 10 días a 37 °C y después se recolectaron las células resultantes (CTL) por centrifugación utilizando una centrífuga. La actividad citotóxica de estas células (CTL) contra las células diana se examinó por un ensayo de citotoxicidad por liberación de 51Cr.
(4) Ensayo de citotoxicidad
El ensayo de citotoxicidad se llevó a cabo por un ensayo de citotoxicidad por liberación de 51Cr. El ensayo de citotoxicidad por liberación de 51Cr se llevó a cabo de la siguiente manera. Primero, las células diana (1 x 107 células/ml) se incubaron en presencia de 100 pl de 51Cr (actividad específica: 1 mCi/ml) en RPMI1640 (fabricado por NIHON PHARMACEUTICAL CO., LTD.) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino a 37 °C durante 1,5 horas para marcar las células diana con 51Cr. Después, las células diana marcadas con 51Cr se añadieron a los pocillos de placas de 96 pocillos de fondo redondeado que contenían distinto número de CTL obtenidos en el (3) anterior (suspendidos en 100 pl de medio de ensayo), se mezclaron con los CTL y después se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Estas células se mezclaron de manera que la relación E/T (relación de número de células) era 1.1, 5:1,20:1 o 25:1, con la condición de que los CTL y las células diana marcadas con 51Cr se expresan como “E” y “T”, respectivamente. Después de terminar la incubación, se recolectaron 100 pl del sobrenadante de cada pocillo. Se determinó la cantidad de 51Cr liberado de las células marcadas, y se calculó la lisis específica (%) basada en la liberación de 51Cr. La lisis específica (%) se calculó de la siguiente manera.
Lisis específica (%) = (liberación de la muestra de ensayo - liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea) x 100
En la fórmula, la cantidad de liberación espontánea se refiere a la cantidad de fluorescencia del sobrenadante del cultivo en los pocillos que contienen solo las células diana, y la liberación máxima se refiere a la cantidad de fluorescencia del medio de cultivo en el que las células diana se han lisado completamente por tratamiento con un 1 % en peso de Triton X-100.
Las células diana que se utilizaron eran B-LCL, células K562, célula JY, y células KH88, que se describirán con detalle posteriormente. Las células KH88 eran las mismas que las células KH88OF8 utilizadas en el Ejemplo 9 posterior.
Las células B-LCL, que se establecieron por transformación mediada por virus EB de linfocitos B de sangre periférica obtenidos de un donante de sangre positivo al HLA-A*0206, no expresaban el WT1.
Las células K562, que se establecieron a partir de un paciente con leucemia mielógena crónica en crisis blástica, son una línea celular que expresa WT1, que no se expresa en un HLA clase I. El presente inventor no fue capaz de obtener una línea celular de leucemia de tipo silvestre positiva a HLA-A*0206 que expresara un WT1. Por esta razón, se utilizaron también células 0206K562, que se prepararon por transformación de células K562 con genes HLA-A*0206. El análisis FACS utilizando un anticuerpo anti-HLA-A2 (clon BB7.2; fabricado por BD Biosciences Pharmingen) demostraba que las células 0206K562 transformadas con genes HLA-A*0206 expresan moléculas de HLA-A*0206 en su superficie celular.
El análisis de transferencia de western demostraba que las células B-LCL transformadas con el gen WT1 expresaba WT1. Las células B-LCL transformadas con un falso vector se utilizaron como control.
Las células JY no expresan WT1 La línea celular B negativa a HLA-A*0206 se estableció por transformación mediada por virus EB.
Las células KH88 es una línea celular de leucemia negativa al HLA-A*0206 que expresa WT1.
Cada línea celular se cultivó en un medio de cultivo RPMI1640 suplementado con un 10 % v/v de suero fetal bovino inactivado por calor, 50 Ul/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina.
(5) Análisis de anticuerpo y citometría de flujo
Se adquirieron los mAb anti-CD14, CD86, CD80, CD83 y HLA-DR humanos en BD. La concentración y maduración
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10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de las CD se confirmaron por análisis de antígenos de superficie celular utilizando los anticuerpos monoclonales (mAb) enumerados anteriormente. Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo (FACS Calibur; fabricado por BD) utilizando el software CellQest.
(6) Resultados
Se examinó si se podían preparar los CTL específicos del péptido WT1w a partir de las PBMC de donantes de sangre positivos a HLA-A*0206. Se examinó la actividad citotóxica específica del péptido WT1w utilizando los CTL obtenidos por estimulación repetida de PBMC enriquecidas en células T positivas a CD8 a partir de un donante de sangre sano positivo al HLA-A*0206 con CD o PBMC autólogas pulsadas con el péptido WT1w. Los CTL presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCl autólogas pulsadas con el péptido WT1w que contra las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1w (Fig. 1a). En la Fig. 1a, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de TL obtenidos por la estimulación del péptido (efector:E) con respecto a las células diana (diana:T) (relación E/T). El triángulo cerrado representa las células pulsadas con 10 pg/ml del péptido WT1w, y el cuadrado cerrado representa las células no pulsadas con el péptido WT1 187. La misma actividad citotóxica anterior se demostró también por los CTL preparados de manera similar a partir de las PBMC aisladas de los dos sonantes de sangre sanos positivos a HLA-A*0206 diferentes (Fig. 2a y 2b). En la Fig. 2, el triángulo cerrado representa las células pulsadas con 10 pg/ml del péptido WT1w, y el cuadrado cerrado representa las células no pulsadas con el péptido WT1w. Estos resultados muestran que cada actividad citotóxica es específica para el péptido WT1w.
La actividad citotóxica de los CTL aumentaba en paralelo con la concentración del péptido WT1w utilizado para pulsar las CD o PBMC, y alcanzaban la meseta con la concentración de péptido de 0,1 pg/ml (Fig. 1b). La concentración media máxima del péptido WT1w para la lisis específica (valor de lisis medio máximo) era aproximadamente 5 x 10"5 pg/ml. Esto demuestra que la afinidad de los TCR (receptores antigénicos de células T) de los CTL contra un complejo péptido WT1w/ HLA-A*0206 era relativamente alto. Este resultado sugiere fuertemente que los CTL inducidos con el péptido WT1w pueden reconocer el péptido WT1187.
De la misma manera que anteriormente, se examinó la actividad citotóxica contra distintas células diana que expresaban endógenamente WT1 utilizando los CTL obtenidos estimulando las PBMC enriquecidas en células T positivas al CD8 del donante de sangre positivo a HLA-A*0206 con CD o PBMC pulsadas con el péptido WT1w. los resultados se muestran en las Fig. 3a y 3b. Las actividades citotóxicas respectivas para las células diana que se muestran en las Fig. 3a y 3b se determinaron al mismo tiempo. La Fig. 3a muestra la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1w contra las B-LCL transformadas con el gen WT1 (positivas al HLA-A*0206, que expresan WT1; triángulo cerrado), o las B-LCL transformadas con el vector falso (positivas a HLA-A*0206, que no expresan WT1; cuadrado cerrado). La Fig. 3b muestra que la actividad específica de los CTL específicos del péptido WT1 187 contra las células 0206K625 (positivas al HLA-A*0206, que expresan el WT1, cuadrado cerrado), células K562 (negativas al HLA-A*0206, que expresan WT1; cuadrado abierto), células KH88 (negativas al HLA-A*0206, que expresan WT1, círculo cerrado), o las células JY (negativas al HLA-A*0206, que no expresan WT1; triángulo cerrado).
Los CTL presentaban una citotoxicidad más fuerte contra las B-LCL transformadas con WT1 (positivas al HLA- A*0206, que expresan WT1) que contra las B-LCL transformadas con el vector falso (positivas al HLA-A*0206, que no expresan WT1) (Fig. 3a). Además, como se muestra en la Fig. 3b, los CTL presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K625 transformadas con el HLA-A*0206 (positivas al HLA-A*0206, que expresan WT1) que contra las células K562 (negativas al HLA-A*0206, que expresan WT1), las células KH88 (negativas al HLA-A*0206, que expresan WT1), o las células JY (negativas al HLA-A*0206, que no expresan WT1). En otras palabras, los CTL presentaban una actividad citotóxica significativa contra las células de leucemia diana positivas al HLA-A*0206 que expresan WT1, pero no actividad citotóxica contra las células negativas al HLA-A*0206 y/o que no expresan WT1. Este resultado demuestra que los CTL específicos del péptido WT1w preparados in vitro muestran una actividad citotóxica contra las células tumorales que expresan WT1 como las células de leucemia y que son positivas al HLA-A*0206. El resultado en la Fig. 3b sugiere fuertemente que la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1w estaban restringidos a la HLA-A de clase I. Esto se basa en el hecho de que se observaba una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K625 que contra las células K562.
Los resultados anteriores demuestran que los CTL cultivados mencionados anteriormente son CTL específicos del péptido WT1187.
Los resultados de cada figura son los datos típicos, y básicamente reproducibles con algunas variaciones.
Ejemplo 3 (confirmación de la clase de HLA por la que los CTL específicos del péptido WTI187 están restringidos)
Se examinó si la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1w obtenidos en el Ejemplo 2 estaban restringidos por el HLA de clase I. Se llevó a cabo el ensayo de citotoxicidad por liberación de 51Cr en presencia o ausencia de mAb contra HLA de clase I o HLA de clase II. Se utilizaron células B-LCL autólogas como células diana.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En este experimento la relación E/T era de 5:1.
Los resultados se muestran en la Fig. 4. La Fig. 4a muestra los resultados del ensayo que se llevó a cabo utilizando B-LCL (positivas al HLA-A*0206, que no expresan WT1w) como célula diana en ausencia de los mAb contra HLA clase I (mAb anti-HLA clase I) y mAb contra HLA clase II (mAb anti-HLA clase II). La Fig. 4b muestra los resultados del ensayo que se llevó a cabo utilizando B-LCL pulsadas con el péptido WT1w (positivas al HLA-A*0206, que expresan WT1w) como célula diana en ausencia de mAb anti-HLA clase I y en presencia de mAb anti-HLA clase II. La fig. 4c muestra los resultados del ensayo que se llevó a cabo utilizando B-LCL pulsadas con el péptido WT1w (positivas la HLA-A*0206, que expresan WT1w) como célula diana en presencia de mAb anti-HLA clase I y ausencia de mAb anti-HLA clase II. La Fig. 4d muestra los resultados del ensayo que se llevó a cabo utilizando B- LCL pulsadas con el péptido WT1w (positivas a HLA-A*0206, que expresan WT1w) como célula diana en ausencia de mAb anti-HLA clase I y mAb anti-HLA clase II.
Como se muestra en la Fig. 4, la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1w se inhibía completamente por la acción de un anticuerpo anti-HLA clase I, no con un anticuerpo anti-HLA clase II. Los resultados demuestran que la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1w estaba restringida por el HLA clase I como se esperaba.
Ejemplo 4 (ensayo de toxicidad contra células tumorales)
El ensayo de toxicidad contra las células tumorales positivas al HLA-A*0206 que expresan WT1 se llevó a cabo in vitro utilizando CTL específicos del péptido WT1w obtenidos en el Ejemplo 2. El ensayo de citotoxicidad se llevó a cabo de acuerdo con el ensayo de citotoxicidad por liberación de 51Cr descrito en el Ejemplo 2. Como resultado, los CTL específicos del péptido WT1w presentaban la actividad de citotoxicidad contra las células tumorales que expresaban WT1 (datos no mostrados).
Ejemplo 5 (preparación de los CTL específicos del péptido WT1126, y ensayo de toxicidad de los CTL)
Los CTL específicos del péptido WT1-I26 se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 2 (3) excepto que se utilizó el péptido WT1-I26 (SEQ ID NO: 3) en vez del péptido WT1w. El ensayo de citotoxicidad se llevó a cabo utilizando estos CTL de la misma manera que en el Ejemplo 2, para determinar la actividad citotóxica específica contra el péptido WT1-I26. La Fig. 5 muestra la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1-I26 inducidos a partir de las PBMC del mismo donante de sangre sano positivas al HLA-A*0206 que en la Fig. 2b. En la Fig. 5, el triángulo cerrado representa las células pulsadas con 10 pg/ml del péptido WTI126, y el cuadrado cerrado representa las células no pulsadas con el péptido WTI126. Los CTL presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas con el péptido WT1126 que contra las células B-LCL no pulsadas con el péptido WT1126 (Fig. 5). Este resultado demuestra que la actividad citotóxica de los CTL es específica del péptido WT1126.
De la misma manera que en el Ejemplo 2, se examinó la actividad citotóxica contra distintas células diana que expresaban WT1 endógenamente utilizando los CTL preparados estimulando las PBMC enriquecidas en células T positivas al CD8 de donantes de sangre positivos al HLA-A*0206 con CD o PBMC pulsadas con el péptido WT1126. La actividad citotóxica contra cada célula dina se muestra en las Fig. 6a y 6b. Las células diana de las Fig. 6a y 6b son las células 0206K625 (positivas al HLA-A*0206, que expresan WT1; cuadrado cerrado), K562 (negativas al HlA- A*0206, que expresan WT1; cuadrado abierto), células KH88 (negativas al HLA-A*0206 que expresan WT1; círculo cerrado), y células JY (negativas al HLA-A*0206, que no expresan WT1; triángulo cerrado). La Fig. 6a muestra la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1126 inducidos a partir de PBMC del mismo donante de sangre sano positivo al HLA-A*0206 que en la Fig. 2a. La Fig. 6b muestra la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1126 inducidos a partir de PBMC de mismo donante de sangre sano positivo al HLA- A*0206 que en la Fig. 2b.
Como los CTL específicos del péptido WT1w, los CTL específicos del péptido WT1126 presentaban una actividad citotóxica significativa contra las células de leucemia diana positivas al HLA-A*0206, que expresaban WT1, pero no una actividad citotóxica contra células negativas al HLA-A*0206 y/o que no expresaban WT1. Este resultado demuestra que los CTL específicos del péptido WT1126 preparados in vitro presentan actividad citotóxica contra células tumorales que expresan WT1 endógenamente como las células de leucemia y que sean positivas al HLA- A*0206. Los resultados de las Fig. 6a y 6b sugiere fuertemente que la actividad citotóxica de los CTL específicos del péptido WT1126 estaba restringida por el HLA-A de clase I. Esto se basa en el hecho de que se observaba una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K625 que contra las células K562.
Los resultados anteriores demuestran que los CTL obtenidos son CTL específicos del péptido WT1126.
Los resultados de cada figura son datos típicos, y básicamente reproducibles con algunas variaciones.
Ejemplo 6 (preparación de composiciones vacunales)
5
10
15
20
25
30
35
Se prepararon las siguientes composiciones vacunales 1 a 8. Estas son solo ejemplos de la composición vacunal contra el cáncer de la presente invención.

Composición vacunal contra el cáncer 1 Péptido WT1w 3 mg

Montanide ISA-51 400 mg

5 % glucosa en agua 400 mg
Los ingredientes mencionados anteriormente se mezclaron y la vacuna se llamó composición vacunal contra el cáncer 1.

Composición vacunal contra el cáncer 2 Péptido WT1w 1 mg

Montanide ISA-51 400 mg

5 % glucosa en agua 400 mg
Los ingredientes mencionados anteriormente se mezclaron y la vacuna se llamó composición vacunal contra el cáncer 2.
Composición vacunal contra el cáncer 3 Péptido WT1w 0,001 mg
Montanide ISA-51 400 mg
5 % glucosa en agua 400 mg
Los ingredientes mencionados anteriormente se mezclaron y la vacuna se llamó composición vacunal contra el cáncer 3.
Composición vacunal contra el cáncer 4 Péptido WT1w 10 mg
Montanide ISA-51 400 mg
5 % glucosa en agua 400 mg
Los ingredientes mencionados anteriormente se mezclaron y la vacuna se llamó composición vacunal contra el cáncer 4.
Composiciones vacunales contra el cáncer 5 a 8
Las composiciones vacunales contra el cáncer 5 a 8 se prepararon de la misma manera que en las composiciones vacunales contra el cáncer 1 a 4 mencionadas anteriormente excepto en que se utilizó el péptido WT1-I26 en vez del péptido WT1-I87.
Ejemplo 7 (afinidad de péptidos modificados a las moléculas de HLA-A*0206)
Como con el péptido WT1w, el péptido WT1-I26 y los péptidos modificados que comprende la sustitución de un resto de aminoácido en la posición 1, 2, 3 o 9 desde el extremo N del péptido WT1w o el péptido WT1-I26, se analizó la afinidad para las moléculas del HLA-A*0206 mediante el uso del programa de predicción NetMHC2.0 Server. Los resultados del análisis de los péptidos WT1w modificados y los péptidos WT1-I26 modificados se muestran en las Tablas 1 y 2, respectivamente. El valor menor (el péptido tiene capacidad de unión a una concentración menor) indica una alta afinidad.
Tabla 1
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración prevista Afinidad (nM) Fuerza de unión
WT1187
SLGEQQYSV 2 0,776 11 Unión fuerte (SB)
WT1wP1G
GLGEQQYSV 4 0,756 13 SB
WT1wP1A
ALGEQQYSV 5 0,812 7 SB
WT1wP1V
VLGEQQYSV 6 0,755 14 SB
WT1wP1L
LLGEQQYSV 7 0,810 7 SB
WT1187P1I
ILGEQQYSV 8 0,782 10 SB
WT1wP1M
MLGEQQYSV 9 0,877 3 SB
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración prevista Afinidad (nM) Fuerza de unión
WT1187P1W
WLGEQQYSV 10 0,876 3 SB
WT1187P1F
FLGEQQYSV 11 0,926 2 SB
WT1187P1Y
YLGEQQYSV 12 0,896 3 SB
WT1187P2V
SVGEQQYSV 13 0,722 20 SB
WT1187P2Q
SQGEQQYSV 14 0,824 6 SB
WT1187P2I
SIGEQQYSV 15 0,734 17 SB
WT1187P2M
SMGEQQYSV 16 0,798 8 SB
WT1187P3L
SLLEQQYSV 17 0,865 4 SB
WT1187P3A
SLAEQQYSV 18 0,844 5 SB
WT1187P3V
SLVEQQYSV 19 0,869 4 SB
WT1187P3M
SLMEQQYSV 20 0,896 3 SB
WT1187P3P
SLPEQQYSV 21 0,791 9 SB
WT1187P3W
SLWEQQYSV 22 0,883 3 SB
WT1187P3F
SLFEQQYSV 23 0,864 4 SB
WT1187P3Y
SLYEQQYSV 24 0,857 4 SB
WT1187P3S
SLSEQQYSV 25 0,801 8 SB
WT1187P3I
SLIEQQYSV 26 0,880 3 SB
WT1187P9L
SLGEQQYSL 53 0,586 88 Unión débil
Tabla 2
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración prevista Afinidad (nM) Fuerza de unión
WT1126
RMFPNAPYL 3 0,83 6 SB
WT1126P1G
GMFPNAPYL 27 0,76 14 SB
WT1126P1A
AMFPNAPYL 28 0,80 8 SB
WT1126P1V
VMFPNAPYL 29 0,75 15 SB
WT1126P1L
LMFPNAPYL 30 0,80 8 SB
WT1126P1I
IMFPNAPYL 31 0,77 11 SB
WT1126P1M
MMFPNAPYL 32 0,86 4 SB
WT1126P1W
WMFPNAPYL 33 0,88 3 SB
WT1126P1F
FMFPNAPYL 34 0,91 2 SB
WT1126P1Y
YMFPNAPYL 35 0,88 3 SB
WT1126P2V
RVFPNAPYL 36 0,78 11 SB
WT1126P2Q
RQFPNAPYL 37 0,85 4 SB
WT1126P2A
RAFPNAPYL 38 0,67 35 SB
WT1126P2L
RLFPNAPYL 39 0,80 8 SB
WT1126P2I
RIFPNAPYL 40 0,78 10 SB
WT1126P3I
RMIPNAPYL 41 0,84 5 SB
WT1126P3L
RMLPNAPYL 42 0,83 6 SB
WT1126P3G
RMGPNAPYL 43 0,71 23 SB
WT1126P3A
RMAPNAPYL 44 0,79 9 SB
WT1126P3V
RMVPNAPYL 45 0,82 6 SB
WT1126P3M
RMMPNAPYL 46 0,86 4 SB
WT1126P3P
RMPPNAPYL 47 0,72 21 SB
WT1126P3W
RMWPNAPYL 48 0,85 5 SB
WT1126P9V
RMFPNAPYV 49 0,91 2 SB
WT1126P9A
RMFPNAPYA 50 0,77 12 SB
WT1126P9I
RMFPNAPYI 51 0,81 7 SB
WT1126P9M
RMFPNAPYM 52 0,65 42 SB
5 Ejemplo 8 (afinidad de péptidos modificados a moléculas del HLA-A*0201)
Como para el péptido WTI187, el péptido WTI126, y los péptidos modificados comprenden la sustitución de un resto de aminoácido en la posición 1, 2, 3 o 9 desde el extremo N del péptido WT1w o el péptido WT1126. se analizó la afinidad por las moléculas del HLA-A*0201 mediante el uso del programa de predicción NetMHC2.0 Server. Los 10 resultados de los análisis de los péptidos WT1w modificados y los péptidos WT1126 modificados se muestran en las Tablas 3 y 4, respectivamente. El valor menor indica la mayor afinidad.
5
Tabla 3
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración prevista Afinidad (nM) Fuerza de unión
WT1187
SLGEQQYSV 2 0,721 20 SB
WT1wP1G
GLGEQQYSV 4 0,672 34 SB
WTI187PIA
ALGEQQYSV 5 0,648 44 SB
WTI187PIV
VLGEQQYSV 6 0,705 24 SB
WTI187PIL
LLGEQQYSV 7 0,658 40 SB
WTI187PII
ILGEQQYSV 8 0,698 26 SB
WT1wP1M
MLGEQQYSV 9 0,717 21 SB
WTI187PIW
WLGEQQYSV 10 0,628 55 SB
WTI187PIF
FLGEQQYSV 11 0,824 6 SB
WTI167PIY
YLGEQQYSV 12 0,809 7 SB
WTI187P2I
SIGEQQYSV 15 0,556 121 SB
WT1wP2M
SMGEQQYSV 16 0,740 16 SB
WT1187P3A
SLAEQQYSV 18 0,811 7 SB
WT1187P3V
SLVEQQYSV 19 0,766 12 SB
WT1187P3M
SLMEQQYSV 20 0,876 3 SB
WT1187P3W
SLWEQQYSV 22 0,863 4 SB
WT1wP3F
SLFEQQYSV 23 0,852 4 SB
WT1187P3Y
SLYEQQYSV 24 0,854 4 SB
WT1187P3S
SLSEQQYSV 25 0,793 9 SB
WT1187P9L
SLGEQQYSL 53 0,640 49 SB
Tabla 4
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración prevista Afinidad (nM) Fuerza de unión
WT1126P1G
GMFPNAPYL 27 0,80 9 SB
WT1126P1A
AMFPNAPYL 28 0,81 7 SB
WT1126P1V
VMFPNAPYL 29 0,81 8 SB
WT1126P1L
LMFPNAPYL 30 0,82 7 SB
WT1126P1I
IMFPNAPYL 31 0,81 8 SB
WT1126P1M
MMFPNAPYL 32 0,85 4 SB
WT1126P1W
WMFPNAPYL 33 0,80 8 SB
WT1126P1F
FMFPNAPYL 34 0,91 2 SB
WT1126P1Y
YMFPNAPYL 35 0,90 2 SB
WT1126P2V
RVFPNAPYL 36 0,55 127 SB
WT1126P2Q
RQFPNAPYL 37 0,49 262 SB
WT1126P2L
RLFPNAPYL 39 0,78 10 SB
WT1126P2I
RIFPNAPYL 40 0,64 48 SB
WT1126P3I
RMIPNAPYL 41 0,74 16 SB
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración prevista Afinidad (nM) Fuerza de unión
WT1126P3L
RMLPNAPYL 42 0,78 10 SB
WT1126P3G
RMGPNAPYL 43 0,60 73 SB
WT1126P3A
RMAPNAPYL 44 0,73 17 SB
WT1126P3V
RMVPNAPYL 45 0,68 31 SB
WT1126P3M
RMMPNAPYL 46 0,83 6 SB
WT1126P3P
RMPPNAPYL 47 0,61 66 SB
WT1126P3W
RMWPNAPYL 48 0,83 6 SB
WT1126P9V
RMFPNAPYV 49 0,84 5 SB
WT1126P9A
RMFPNAPYA 50 0,73 18 SB
WT1126P9I
RMFPNAPYI 51 0,79 9 SB
WT1126P9M
RMFPNAPYM 52 0,69 29 SB
Ejemplo 9 (comparación de CTL restringidos al HLA-A*0201 inducidos por distintos péptidos WTI126 modificados)
(1) Propósito
En vista de los resultados del Ejemplo 8, se seleccionaron el péptido WTI126PIF (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1126P2L (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1126P3M (SEQ ID NO: 46) y el péptido WT1126P9V (SEQ ID NO: 49) como péptidos WT1126 modificados a ensayar, y se llevaron a cabo los siguientes experimentos para explorar os péptidos WT1126 modificados capaces de inducir CTL que tengan una alta actividad citotóxica. Los reactivos, medios, métodos experimentales, etc. utilizados en los Ejemplos 9 a 12 eran los mismos que en el Ejemplo 1, a menos de que se especifique otra cosa. En los Ejemplos 9 a 12, se llevó el cultivo a 37 °C, a menos de que es especifique otra cosa.
(2) Materiales y métodos
A partir de un donante humano sano que mostraba la expresión de moléculas del HLA-A*0201 (donantes de sangre sanos positivos al HLA-A*0201), se aislaron PBMC, y se separaron de las PBMC las células positivas a CD14 mediante el uso de partículas magnéticas DM anti-CD14 humano. Se preparó un medio de cultivo añadiendo 800 UI/ml de GM-CSF y 1000 UI/ml de IL-4 a un medio X-VIVO 15 suplementado con un 1 % v/v de suero AB humano, y se cultivaron las células positivas a CD14 en el medio de cultivo durante 1 día.
Al cultivo anterior, se añadió un coctel de maduración de citocinas que contenía 10 ng/ml de TNFa, 10 ng/ml de IL-p, 1000 UI/ml de IL-6 y 1 pg/ml de PGE2. Después de un día de cultivo adicional, se obtuvieron las CD maduras autólogas.
Las CD maduras autólogas se pulsaron con 10 pg/ml de un péptido WT1-I26 modificado obtenido en el Ejemplo 13 (el péptido WT1-I26P1F, el péptido WT1-I26P2L, el péptido WT1-I26P3M o el péptido WT1-I26P9V), cultivado durante 4 horas, e irradiadas con 35 Gy de radiación. Las células obtenidas de esta manera se utilizaron como células estimulantes para la inducción de CTL.
Las PBMC (2 x 106 células/pocillo) servían como células de respuesta y las CD mencionadas anteriormente (2 x 105 células/pocillo) se co-cultivaron en una placa de 24 pocillos. Una semana más tarde, se dio la re-estimulación por adición de células T2 que se habían pulsado con el péptido y se irradiaron con 75 Gy de radiación. Tres días después de la re-estimulación, se añadieron 20 UI/ml de IL-2. La misma re-estimulación se repitió otras 3 veces por adición del péptido pulsado, células T2 irradiadas, y después se enriquecieron las células positivas a CD8 en las células de respuesta.
Como para las células T positivas al CD8, la reactividad de un HLA-A*0201 tetramérico unido al péptido WT1-I26 se analizó por citometría de flujo, y se examinó la actividad de citotoxicidad contra distintas células diana.
Las células diana que se utilizaron eran células K562, células 0206K625, células JY, células KH88OF8, células TF-1, y células THP-1, que se muestran en la Tabla 5. Las características de estas células se muestran en la Tabla 5. La línea celular linfoblastoide B (B-LCL) establecida por infección vírica con el EB de la sangre de un donante positivo al HLA-A*0201 también se utilizó como célula diana.
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Tabla 5
Célula diana
HLA-A*0201 HLA-A*0206 WT1
K562
negativo negativo expresado
0206K562
negativo positivo expresado
JY
positivo negativo no expresado
KH88OF8
negativo negativo expresado
TF-1
positivo negativo expresado
THP-1
positivo negativo expresado
(3) Resultados
La Fig. 7 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de las PBMC del donante 1 positivo a HLA-A*0201 que se estimularon con diferentes péptidos WT1126 modificados y después se tiñeron con un HLA-A*0201 tetramérico marcado con PE (ficoeritrina) unido al péptido WT1-I26: (Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd.), y un anticuerpo anti-CD8 marcado con Cy7-APC (APC-Cy7: Aloficocianina-Cianina-7). Cuando las PBMC se teñían con el tetrámero y el anticuerpo anti-CD8 mencionados anteriormente, los CTL inducidos por estimulación con el péptido modificado se unían al tetrámero y al anticuerpo anti-CD8, y de esta manera, la fluorescencia emitida por el tetrámero y la fluorescencia emitida por el anticuerpo anti-CD8 se podía detectar, respectivamente. En las Fig. 7a a 7e, el eje vertical representa la intensidad de fluorescencia emitida por el HLA-A*0201 tetramérico, y el eje horizontal representa la intensidad de fluoresceína emitida por el anticuerpo anti-CD8. Cada cuadro de las Fig. 7a a 7e muestra la frecuencia (%) de CTL restringidos al HLA-A*0201 capaces de reconocer el péptido WT1-I26. La Fig. 7a muestra el resultado del análisis de las PBMC que no se estimularon con ningún péptido WT1126 modificado y teñidas con el tetrámero mencionado anteriormente y anticuerpo anti-CD8 (fondo). La Fig. 7b muestra el resultado del análisis de PBMC que se estimularon con el péptido WT1126P1F y se tiñeron. La Fig. 7c muestra el análisis de las PBMC muestra el resultado del análisis de las PBMC se estimularon con el péptido WT1126P2L y se tiñeron. La Fig. 7d muestra el resultado del análisis de las PBMC que se estimularon con el péptido WT1126P3M y se tiñeron. La Fig. 7e muestra el resultado del análisis de las PBMC que se estimularon con el péptido WT1126P9V y se tiñeron.
La frecuencia de los CTL mencionados anteriormente inducidos por estimulación de PBMC con el péptido WT1126P1F era del 0,14% (Fig. 7b). La frecuencia de los CTL mencionados anteriormente inducidos por estimulación de PBMC con el péptido WT1126P2L era del 0,37% (Fig. 7c). Los CTL inducidos por separado con estos péptidos eran positivos al HLA tetramérico, positivos a CDS y capaces de unirse al HLA-A*0201 tetramérico unido al péptido WT1126. Estos resultados demuestran que la estimulación de PBMC con el péptido WT1126 modificado inducía CTL que pueden reconocer el péptido de tipo silvestre (péptido WT1126).
La Fig. 8 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de PBMC del donante 1 con el péptido WT1126P1F. En la Fig. 8, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de células T positivas a CDS obtenidas por estimulación peptídica (efector:E) con respecto a las células diana (diana: T) (relación E/T). El rombo cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células JY como célula diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células Jy pulsadas con el péptido WT1126P1F se utilizaron como una célula diana.
Las células JY son positivas al HLA-A*0201 y negativas a WT1. Los CTL que presentan una actividad citotóxica más fuerte contra las células JY pulsadas con el péptido WT1126P1F que contra células JY no pulsadas con el péptido WT1126P1F. Este resultado muestra que se inducían CTL que eran específicos para el péptido utilizado por la estimulación mencionada anteriormente y estaban restringidos por el HLA-A*0201.
La Fig. 9 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por la estimulación de las PBMC del donante 1 con el péptido WT1126P2L. En la Fig. 9 el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de células T positivas a CD8 obtenidas por estimulación peptídica (efector: E) con respecto a las células diana (diana: T) (relación E/T). En la Fig. 9a, el rombo cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células JY como una célula diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células JY pulsadas con el péptido WT1126P2L se utilizaron como células diana. En la Fig. 9b, el rombo cerrado representa el grupo en el que las células TF-1 se utilizaron como una célula diana, el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células THP-1 se utilizaron como una célula diana, el triángulo cerrado representa el grupo en el que las células KH88OF8 se utilizaron como células diana, y la cruz representa el grupo en el que las células B-LCL se utilizaron como células diana.
Los CTL inducidos presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células JY pulsadas con el péptido WT1126P2L que contra las células JY pulsadas no con el péptido WT1126P2L (Fig. 9a). Los CTL inducidos
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presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células TF-1 y células THP-1, las cuales son positivas a HLA-A*0201 y positivas a WT1, que contra las células KH88OF8, que son negativas a HLA-A*0201 y positivas a WT1, y las células B-LCL que son positivas al HLA-A*0201 y negativos a WT1 (Fig. 9b). Como está claro por los resultados, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126P2L están restringidos por HLA-A*0201, y capaces de destruir células cancerosas que expresan WT1 endógenamente.
La Fig. 10 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de las PBMC del donante 2 positivo al HLA- A*0201 que se estimularon con el péptido WT1126P2L y después teñidas con el HLA-A*0201 tetramérico marcado con PE unido al péptido WT1126, y el anticuerpo anti-CD8 marcado con APC-Cy7. A saber, la Fig. 10 muestra los resultados de la citometría de flujo de los CTL inducidos que se tiñeron con el HLA tetramérico unido al péptido WT1 126, y el anticuerpo anti-CD8. El ejem vertical representa la intensidad de fluorescencia emitida por el HLA- A*0201 tetramérico, y el eje horizontal representa la intensidad de fluorescencia emitida por el anticuerpo anti-CD8.
Las células del área derecha superior de la Fig. 10 son CTL inducidos que están restringidos al HLA-A*0201 y pueden reconocer el péptido WT1126. El 5,43 % de los linfocitos de las PBMC estimuladas con el péptido WT1126P2L eran CTL positivos al CD8, positivos al HLA tetramérico, que eran capaces de unirse al HLA-A*0201 tetramérico unido al péptido WT1126. Este resultado demuestra que la estimulación de las PBMC con el péptido modificado inducía CTL positivos a CD8 que pueden reconocer el péptido de tipo silvestre.
La Fig. 11 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 2 con el péptido WT1126P2L. En las Fig. 11a y 11b, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de células T positivas al CD8 obtenidas mediante la estimulación peptídica (efector:E) con respecto a las células diana (diana:T) (relación E/T). En la Fig. 11a, el rombo cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células JY como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células JY pulsadas con el péptido WT1-I26 se utilizaron como células diana. En la Fig. 11b, el rombo cerrado representa el grupo en el que las células JY se utilizaron como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células JY pulsadas con el péptido WT1-I26P2L se utilizaron como células diana.
Los CTL inducidos presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células JY pulsadas con el péptido WT1 126 que contra las células JY no pulsadas con el péptido WT1126 (Fig. 11a). Los CTL inducidos también presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células JY pulsadas con el péptido WT1126P2L que contra las células JY no pulsadas con el péptido WT1126P2L (Fig. 11b). Como está claro por los resultados, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126P2L pueden reconocer tanto el péptido WT1126P2L como el péptido WT1 126. de tipo silvestre.
Ejemplo 10 (comparación de CTL restringidos al HLA-A*0206 inducidos por distintos péptidos WTI126- modificados
(1) Propósito
En vista de los resultados del Ejemplo 7, el péptido WT1126P1F, el péptido WT1126P2L, el péptido WT1126P3M y el péptido WT1126P9V se seleccionaron como los péptidos WT1126 modificados a ensayar, y se llevaron a cabo los siguientes experimentos para explorar los péptidos WT1126 modificados capaces de inducir los CTL que tienen una alta actividad citotóxica.
(2) Materiales y métodos
Se aislaron las PBMC de un donante humano sano que presentaba la expresión de moléculas HLA-A*0206 (donante de sangre sano positivo al HLA-A*0206) y se separaron las células positivas al CD14 de las PBMC por el uso de Partículas Magnéticas DM anti-CD14 humano. Se preparó un medio de cultivo añadiendo 800 UI/ml de GM-CSF y 1000 UI/ml de IL-4 a un medio X-VIVO 15 suplementado con un 1 % v/v de suero AB humano, y se cultivaron las células positivas al CD14 en el medio de cultivo durante 1 día.
Al cultivo anterior, se añadió un coctel de maduración de citocinas que contenía 10 ng/ml de TNFa, 10 ng/ml de IL-p, 1000 UI/ml de IL-6 y 1 pg/ml de PGE2. Después de un día adicional de cultivo, se obtuvieron las CD autólogas maduras.
Las CD autólogas maduras se pulsaron con 10 pg/ml de un péptido WT1126 modificado obtenido en el Ejemplo 13 (el péptido WT1126P1F, el péptido WT1126P2L, el péptido WT1126P3M o el péptido WT1126P9V), se cultivaron durante 4 horas, y se irradiaron con 35 Gy de radiación. Las células obtenidas de esta manera se utilizaron como células estimuladoras para la inducción de CTL.
Las PBMC enriquecidas en células T positivas a CD8 (2 x 106 células/pocillo) y las CD mencionadas anteriormente (1 x 105 células/pocillo) se co-cultivaron en una placa de 24 pocillos. Diez días más tarde se dio una re-estimulación por la adición de PBMC que se habían pulsado con el péptido e irradiado con 35 Gy de radiación. Dos días después de la re-estimulación, se añadieron 10 UI/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-7. Después de la repetición de la misma re
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estimulación otras 4 veces, se enriquecieron las células T positivas a CD8. Las células T positivas al CD8 se examinaron en cuanto a su actividad citotóxica contra distintas células diana.
Las células diana que se utilizaron eran las B-LCL establecidas por infección vírica con EB de la sangre de un donante positivo al HlA-A*0206, células K562 y células 0206K562.
(3) Resultados
La Fig. 12 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 3 positivo al HLA-A*0206 con diferentes péptidos. La Fig. 12a muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P2L. La Fig. 12b muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126P3M. La Fig. 12c muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126P9V. En las Fig. 12a a 12c, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de células T positivas a CD8 obtenidas por estimulación peptídica (efector: E) con respecto a las células diana (diana:T) (relación E/T). El rombo cerrado representa el grupo en el que las células B-LCL autólogas se utilizaron como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células B-LCL autólogas se pulsaron con el mismo péptido WT1-I26 modificado que se utilizó en la estimulación mencionada anteriormente, se utilizaron como células diana.
Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P2L presentaban una actividad citotóxica contra las células B-LCL autólogas pulsadas con el péptido WT1-I26P2L, que son positivas al HLA-A*0206 y negativas al WT1, que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas con el péptido WT1126P2L (Fig. 12a). Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P3M presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas con el péptido WT1-I26P3M, que son positivas a HLA-A*0206 y negativas al WT1, que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas con el péptido WT1-I26P3M (Fig. 12b). Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P9V presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas con el péptido WT1-I26P9V, que son positivas la HLA-A*0206 y negativas al WT1, que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas con el péptido WT1126P9V (Fig. 12c).
Estos resultados demuestran que los CTL que se inducían son específicos del péptido utilizado para la estimulación mencionada anteriormente y están restringidos por el HLA-A*0206.
La Fig. 13 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 3 positivo al HLA-A*0206 con el péptido WT1-I26P9V. En la Fig. 13, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de células T positivas a CD8 obtenidas por estimulación peptídica (efector: E) con respecto a las células diana (diana:T) (relación E/T). El rombo cerrado representa el grupo en el que las células B-LCL autólogas se utilizaron como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células B-LCL autólogas transfectadas con el gen WT1, se utilizaron como células diana.
En la Fig. 13, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P9V presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas producidas para ser positivas al WT1 por transfección del gen WT1 en las células B-LCL, que eran originalmente positivas al HLA-A*0206 y negativas a WT1, que contra las células B-LCL autólogas no transfectadas con el gen WT1 (Fig. 12c). Como está claro por el resultado, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P9V están restringidos por el HLA-A*0206, y presentan la actividad citotóxica reconociendo el péptido WT1-I26 de tipo silvestre presentado endógenamente.
La Fig. 14 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 4 positivo al HLA-A*0206 con diferentes péptidos. La Fig. 14a muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P2L. La Fig. 14b muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126P3M. La Fig. 14c muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P9V. En las Fig. 14a a 14c, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de células T positivas a CD8 obtenidas por estimulación peptídica (efector: E) con respecto a las células diana (diana:T) (relación E/T). El rombo cerrado representa el grupo en el que las células B-LCL autólogas se utilizaron como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células B-LCL autólogas se pulsaron con el mismo péptido WT1-I26 modificado que se utilizó en la estimulación mencionada anteriormente, se utilizaron como células diana.
Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P2L presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas con el péptido WT1-I26P2L, que son positivas al HLA-A*0206 y negativas al WT1, que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas con el WT1-I26P2L (Fig. 14a). Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P3M presentaba una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas con el péptido WT1-I26P3M, que son positivas al HLA-A*0206 y negativas al WT1 que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas con el péptido WT1-I26P3M (Fig. 14b). Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P9V presentaba una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas con el péptido WT1-I26P9V, que son positivas la HLA-A*0206 y negativas al WT1, que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas con el péptido WT1-I26P9V (Fig. 14c). Estos resultados muestran que los CTL
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que se inducían, son específicos para el péptido utilizado para la estimulación mencionada anteriormente y están restringidos al HLA-A*0206.
La Fig. 15 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante 4 positivo a HLA-A*0206 con diferentes péptidos. La Fig. 14a muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126P2L. La Fig. 14b muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126P3M. La Fig. 14c muestra la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126P9V. En las Fig. 14a a 14c, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de células T positivas a CDS obtenidas por estimulación peptídica (efector: E) con respecto a las células diana (diana:T) (relación E/T). El rombo cerrado representa el grupo en el que las células K562 se utilizaron como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células 0206K562, es decir las células K562 producidas para presentar endógenamente el antígeno WT1 peptídico por transfección del gen HLA-A*0206 en ellas, se utilizaron como células diana.
En las Fig. 15a a 15c, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1-I26P2L, el péptido WT1-I26P3M o el péptido WT1-I26P9V presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K562 que contra las células K562, encada caso. Como está claro por los resultados, los CTL inducidos por estimulación con cualquiera de estos péptidos modificados están restringidos por el HLA-A*0206, y presentan la actividad citotóxica reconociendo el péptido WT1-I26 de tipo silvestre presentado endógenamente.
Ejemplo 11 (comparación de los CTL restringidos al HLA-A*0201 inducidos por distintos péptidos WTI187 modificados)
(1) Propósito
En vista de los resultados del Ejemplo 8, se seleccionaron el péptido WT1wP1F (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1wP2M (SEQ ID NO: 16) y el péptido WT1wP3M (SEQ ID NO: 20) como péptidos WT1w modificados a ensayar, y se llevaron a cabo los siguientes experimentos para explorar los péptidos WT1187 modificados capaces de inducir cTl que tengan una alta actividad de citotoxicidad.
(2) Materiales y métodos
Se aislaron las PBMC de un donante humano sano que presentaba expresión de moléculas del HLA-A*0201 (donante de sangre sano positivo al HLA-A*0201), y se separaron las células positivas al CD14 de las PBMC utilizando partículas magnéticas DM anti-CD14 humano. Se preparó un medio de cultivo añadiendo 800 UI/ml de GM-CSF y 1000 UI/ml de IL-4 a un medio X-VIVO 15 suplementado con un 1 % v/v de suero AB humano, y se cultivaron las células positivas al CD14 en el medio de cultivo durante 1 día.
Al cultivo anterior, se añadió un coctel de maduración de citocinas que contenía 10 ng/ml de TNFa, 10 ng/ml de IL-p, 1000 UI/ml de IL-6 y 1 pg/ml de PGE2. Después de un día adicional de cultivo, se obtuvieron las CD autólogas maduras.
Las CD autólogas maduras se pulsaron con 10 pg/ml de un péptido WT1w modificado obtenido en el Ejemplo 13 (el péptido WT1wP1F, el péptido WT1wP2M o el péptido WT1wP3M), se cultivaron durante 4 horas, y se irradiaron con 35 Gy de radiación. Las células obtenidas de esta manera se utilizaron como células estimuladoras para la inducción de los CTL.
Las PBMC (2 x 106 células/pocillo) servían como células respondedoras y las CD mencionadas anteriormente (2 x 105 células/pocillo) se co-cultivaron en una placa de 24 pocillos. Una semana más tarde, se dio una re-estimulación por adición de células T2 que se habían pulsado con el péptido e irradiado con 75 Gy de radiación. Tres días después de la re-estimulación se añadieron 20 UI/ml de IL-2. Se repitió la misma re-estimulación otras 3 veces por adición de las células T2 pulsadas con el péptido e irradiadas, y después se enriquecieron las células positivas a CD8 en las células respondedoras. Las células T positivas a CD8 se examinaron en cuanto a la actividad citotóxica contra las células diana, es decir, aquí las células JY.
(3) Resultados
La Fig. 16 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante positivo al HLA-A*0201 con el péptido WT1wP1F (Fig. 16a) o el péptido WT1wP2M (Fig. 16b). En las Fig. 16a y 16b, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de célula T positivas a CD8 obtenidas por estimulación peptídica (efector: E) con respecto a las células diana (diana: T) (relación E:T). El rombo cerrado representa el grupo en el que las células JY se utilizaron como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que se pulsaron las células JY con el péptido WT1w modificado (péptido WT1187P1F) que se utilizó para la estimulación mencionada anteriormente se utilizaron como células diana. Las células JY son positivas al HLA-A*0201 y negativas al WT1.
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Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1wP1F presentaban una actividad citotóxica igual contra las células JY pulsadas con el péptido WT1w que contra las células JY pulsadas con el péptido WT1wP1F, y la actividad era más fuerte que contra las células JY no pulsadas con un péptido (Fig. 16a). Los CTL inducidos por la estimulación con el péptido WT1wP2M presentaban una actividad citotóxica igual contra las células JY pulsadas con el péptido WT1w que contra las células JY pulsadas con el péptido WT1wP2M, y la actividad era más fuerte que contra las células JY no pulsadas con un péptido (Fig. 16b). Como está claro por los resultados, los CTL inducidos por estimulación con el péptido modificado pueden reconocer tanto el péptido modificado como el péptido WT1 187 de tipo silvestre.
Ejemplo 12 (comparación de los CTL restringidos por HLA-A*0206 inducidos por distintos péptidos WTI187 modificados)
(1) Propósito
En vista de los resultados del Ejemplo 7, se seleccionaron el péptido WT1wP1F, el péptido WT1wP2M y el péptido WT1wP3M como péptidos WT1w modificados a ensayar, y se llevaron a cabo los siguientes experimentos para seleccionar los péptidos WT1187 modificado capaces de inducir CTL que tienen una alta actividad citotóxica.
(2) Materiales y métodos
Se aislaron las PBMC de un donante humano sano que presentaba la expresión de moléculas del HLA-A*0206 (donante de sangre sano positivo al HLA-A*0206), y se separaron células positivas al CD14 de las PBMC utilizando partículas magnéticas DM anti-CD14 humano. Se preparó un medio de cultivo añadiendo 800 UI/ml de GM-CSF y 1000 UI/ml de IL-4 a un medio X-VIVO 15 suplementado con un 1 % v/v de suero AB humano, y se cultivaron las células positivas al CD14 en el medio de cultivo durante 1 día.
Al cultivo anterior, se añadió un coctel de maduración de citocinas que contenía 10 ng/ml de TNFa, 10 ng/ml de IL-p, 1000 UI/ml de IL-6 y 1 pg/ml de PGE2. Después de un día adicional de cultivo, se obtuvieron las CD autólogas maduras.
Las CD autólogas maduras se pulsaron con un péptido WT1w modificado obtenido en el Ejemplo 13 (el péptido WT1wP1F, el péptido WT1wP2M o el péptido WT1wP3M), se cultivaron durante 4 horas, y se irradiaron con 35 Gy de radiación. Las células obtenidas de esta manera se utilizaron como células estimuladoras para la inducción de los CTL.
Las PBMC enriquecidas en células T positivas a CD8 (2 x 106 células/pocillo) y las CD mencionadas anteriormente (1 x 105 células/pocillo) se co-cultivaron en una placa de 24 pocillos. Diez días más tarde, se hizo la re-estimulación por adición de PBMC que se habían pulsado con el péptido e irradiado con 35 Gy de radiación. Dos días después de la re-estimulación, se añadieron 10 UI/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-7. Después de que se repitiera la misma reestimulación otras 4 veces, se enriquecieron las células T positivas al CD8. Las células T positivas al CD8 se examinaron en cuanto a la actividad citotóxica contra distintas células diana.
Las células diana que se utilizaron eran B-LCL establecidas por infección vírica con el EB a partir de la sangre de un donante positivo al HLA-A*0206, células K562 y células 0206K562.
(3) Resultados
La Fig. 17 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC de un donante positivo al HLA-A*0206 con el péptido WT1wP1F. En la fig. 17, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el ejem horizontal representa la relación de células T positivas al CD8 obtenidas por estimulación peptídica (efector: E) con respecto a las células diana (diana: T) (relación E/T). En la Fig. 17a, el rombo cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células B-LCL como células diana, el cuadrado cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1w como células diana, y el triángulo cerrado representa el grupo en el que las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1wP1F se utilizaron como células diana. En la Fig. 17b, el rombo cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células K562 como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que las células 0206K562, es decir, las células K562 producidas para presentar los antígenos WT1 peptídicos endógenamente por transfección del gen HLA- A*0206 en ellas, se utilizaron como células diana.
Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1wP1F presentaba una actividad citotóxica igual contra las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1w y las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1wP1F, y la actividad era más fuerte que contra las células B-LCL no pulsadas con un péptido (Fig. 17a). Cuando las células K562 negativas a HLA-A*0206, positivas a WT1, y las células K562 producidas para que presenten péptidos antígenos WT1 peptídicos por transfección con el gen HLA-A*0206 en ellas (células 0206K562) se utilizaron como células diana, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1wP1F presentaba una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K562 que contra las células K562 (Fig. 17b). Como está claro por los resultados, los CTL
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inducidos por estimulación con el péptido WT1wP1F pueden reconocer tanto el péptido WT1wP1F y el péptido WT1 187 de tipo silvestre. De manera similar, se descubrió que los CTL están restringidos por el HLA-A*0206, y presentan la actividad citotóxica reconociendo el péptido WT1w de tipo silvestre presentado endógenamente.
La Fig. 18 muestra los resultados de la medición de la actividad citotóxica de los CTL inducidos por estimulación de las PBMC del donante positivo al HLA-A*0206 con el péptido WT1wP2M. En la Fig. 18, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la relación de células T positivas a CD8 obtenidos por la estimulación peptídica (efector: E) con respecto a las células diana (diana: T) (relación E/T). En la Fig. 18a, el rombo cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células B-LCL como células diana, el cuadrado cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1wP2M como células diana. En la Fig. 18b, el rombo cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células K562 como células diana, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el que se utilizaron las células 0206K562, es decir, las células K562 producidas para presentar endógenamente los péptidos WT1 antigénicos por transfección del gen HLA-A*0206 en ellas, como células diana.
Los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1wP2M presentaban una actividad citotóxica igual contra las células B-LCL pulsadas con el péptido Wt1w y las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1wP2M, y la actividad era más fuerte que contra las células B-LCL no pulsadas con un péptido (Fig. 18a). Cuando las células K562 negativas a HLA-A*0206 positivas a WT1, y las células K562 producidas para presentar endógenamente los péptidos WT1 antigénicos por transfección del gen HLA-A*0206 en ellas (células 0206K562) se utilizaron como células diana, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1wP2M presentaban una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K562 que contra las células K562 (Fig. 18b). Como está claro por los resultados, los TL inducidos por estimulación con el péptido WT1wP2M pueden reconocer tanto el péptido WT1 wP2M como el péptido WT1187 de tipo silvestre. De manera similar, se descubrió que los CTL están restringidos por el HLA-A*0206, y presentan actividad citotóxica reconociendo el péptido WT1w de tipo silvestre presentado endógenamente.
Como está claro por los resultados de los Ejemplos 9 a 12, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126 modificado, es decir, el péptido WT1126P1F, el péptido WT1126P2L, el péptido WT1126P3M o el péptido WT1126P9V, están restringidos por el HLA-A*0206, y presentan actividad citotóxica reconociendo el péptido WT1126 de tipo silvestre presentado endógenamente. Inter alia el péptido WT1126P9V, el péptido WT1126P2L y el péptido WT1126P3M eran altamente eficaces.
Como está claro por los resultados anteriores, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1187 modificado, es decir el péptido WT1wP1F, el péptido WT1wP2M, o el péptido WT1wP3M, están restringidos por el HLA- A*0206, y presentan la actividad citotóxica reconociendo el péptido WT1w de tipo silvestre presentado endógenamente. Inter alia, el péptido WT1 wP2M y el péptido WT1wP1F eran altamente eficaces.
Por lo tanto, se demostró que estos péptidos modificados son eficaces en el tratamiento y prevención de cánceres acompañados por el aumento de la expresión del gen WT1 en personas positivas al HLA-A*0206.
Como está claro por los resultados anteriores, los CTL inducidos por estimulación con el péptido WT1126 modificado, es decir, el péptido WT1126P1F, el péptido WT1126P2L, el péptido WT1126P3M o el péptido WT1126P9V, están restringidos por el HLA-A*0201, y presentan actividad citotóxica reconociendo el péptido WT1126 de tipo silvestre presentado endógenamente. Inter alia, el péptido WT1126P1F y el péptido WT1126P2L eran altamente eficaces.
Como está claro por los resultados anteriores, los CTL inducidos por la estimulación con el péptido WT1w modificado, es decir, el péptido WT1wP1F, el péptido WT1wP2M, o el péptido WT1wP3M, están restringidos por el HLA-A*0201, y presentan actividad citotóxica reconociendo el péptido WT1w de tipo silvestre presentado endógenamente. Inter alia, el péptido WT1wP2M y el péptido WT1wP1F eran altamente eficaces. Por lo tanto, se demostró que estos péptidos modificados son eficaces en el tratamiento y prevención de cánceres acompañados por el aumento de expresión del gen WT1 en personas positivas al HLA-A*0201.
Ejemplo 13
Síntesis del péptido WT1wP2V (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH)
1. Síntesis de la resina de péptido protegida (resina H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Se r(tBu)-Val-Alko)
Se colocaron 0,4 g de una resina Fmoc-Val-Alko (Alko es alcohol p-alcoxibencílico) (fabricado por WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD; 0,80 mmol/g) en el recipiente de reacción del sintetizador en fase sólida ACT496 fabricado por Advanced ChemTech, lavado con DMF (N,N'-dimetilformamida) (Etapa 1), tratado con un 25% de solución de piperidina en DMF (5 minutos x 1 vez, y 30 minutos x 1 vez) para retirar el grupo Fmoc (Etapa 2), y se lavó de nuevo con DMF (Etapa 3) para dar lugar a una resina H-Val-Alko. A este recipiente de reacción se añadieron 0,7 ml de NMP (N-metilpirrolidona) y una solución de 121 mg (0,96 mmol) de DIPCI (N,N'-diisopropilcarbodiimida) en 0,9 ml de NMP, y después una solución de 368 mg (0,96 mmol) de Fmoc-Ser(tBu)-OH y 147 mg (0,96 mmol) de
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HOBT (1-hidroxibenzotriazol) monohidrato en 1,8 ml de NMP. Se llevó a cabo la reacción de acoplamiento a temperatura ambiente durante 60 minutos (Etapa 4). Se llevó a cabo una reacción de acoplamiento adicional utilizando las mismas cantidades de Fmoc-Ser(tBu)-OH, HOBT monohidrato y DIPCI que anteriormente (Etapa 5). La resina resultante se lavó con DMF (Etapa 6), se desprotegió (Etapa 7) y se lavó de nuevo (Etapa 8) para dar una resina H-Ser(tBu)-Val-Alko. Después se llevaron a cabo sucesivamente los a acoplamientos repitiendo las Etapas 4 a 8 utilizando Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc- Val-OH y Fmoc-Ser(tBu)-OH. La resina peptídica resultante se recolectó del recipiente de reacción, se lavó con éter y luego se secó al vacío para dar 980 mg de una resina H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser (tBu)-Val-Alko. El resumen del procedimiento de síntesis mencionado anteriormente se muestra en la Tabla 6.
<Procedimiento de síntesis>
Tabla 6
Etapa
Reactivo Repetición (tiempo) Duración (min)
1) lavado
DMF 3 ml 5 0,3
2) desprotección
25 % piperidina DMF 3 ml 1 1 O LO co
3) lavado
DMF 3 ml 5 0,3
4) acoplamiento
Cada Fmoc-aminoácidos (3 Eq), HOBT(3 Eq), DIPCI(3 Eq) /NMP 3,4 ml 1 60
5) acoplamiento
Cada Fmoc-aminoácidos (3 Eq), HOBT(3 Eq), DIPCI(3 Eq) /NMP 3,4 ml 1 60
6) lavado
DMF 3 ml 5 0,3
7) desprotección
25 % piperidina/DMF 3 ml 1 1 O LO co
8) lavado
DMF 3 ml 5 0,3
2. Desprotección de la resina peptídica protegida
A 980 mg de resina (H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Se r(tBu)-Val-Alko se añadieron 5 ml de una solución mixta de ácido trifluoroacético/agua/triisopropilsilano (95/2,5/2,5 (relación de volumen)). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. La resina se filtró y el filtrado resultante se añadió a éter dietílico enfriado en hielo. El precipitado resultante se recolectó con un filtro de cristal. El residuo se lavó con éter dietílico y se secó al vacío para dar 268 mg de péptido en bruto.
3. Purificación del péptido en bruto
Se disolvieron los 268 mg del péptido en bruto obtenido en una solución acuosa de ácido acético al 20 %, y se purificó por cromatografía líquida de fase inversa.
Bomba: : Shimadzu LC-8A
Columna: YMC-Pack Pro C18 AS12S11-2530WT 3 cmO x 25 cm Eluyente 1: H2O/0,1 % TFA
Eluyente 2 (el segundo eluyente): CH3CNf0,1 % TFA Caudal: 10 ml/min Detección: UV220 nm
Después de equilibrarla con el segundo eluyente a una concentración del 1 %, la columna se cargó con la solución del péptido en bruto. Después de esto, se permitió que la concentración del segundo eluyente aumentara al 8 % durante 30 minutos y posteriormente al 14 % durante 120 minutos. Las fracciones que contenían el compuesto objetivo se recolectaron, se evaporó el acetonitrilo al vacío y entonces se secó el residuo por congelación. Así, se obtuvieron 105 mg del péptido objetivo WT1wP2V (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr- Ser-Val-OH).
Las condiciones utilizadas para la HPLC y la espectrometría de masas del péptido purificado son las siguientes: Análisis HPLC (Shimadzu Lc-10Avp)
Columna: YMC-Pack Pro C18 AS-302 4,6 mmO x 150 mm Eluyente 1: H2O/0,1 % TFA Eluyente 2: CHaCN/0,1 % TFA
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Gradiente: Se permitió que la concentración de eluyente 2 aumentas del 10 % al 40 % durante 30 minutos.
Caudal: 1 ml/min Detección: UV 220 nm
Pureza: 97,4 %, tiempo de Retención: 11,22 minutos
Análisis de aminoácidos (Analizador de aminoácidos Hitachi L-8500) Hidrolisis: 1 % fenol/solución acuosa de ácido clorhídrico 6 N, 110 °C, 24 horas Método de análisis: Método de Ninhidrina
Ser: 1,78(2) Glx:3,26(3) *Gly:(1) Val: 2,04(2) Tyr: 1,06(1) *) Gly = aminoácido convencional, el número entre paréntesis es un valor teórico.
Espectrometría de masas (espectrómetro de masas API 150EX de Applied Biosystems) m/z = 996,9 [M + 1]+ (valor teórico = 996,5)
Análisis de secuencia de aminoácidos (secuenciador proteico 491 de Applied Biosystems)
La secuencia de aminoácidos se comprobó secuencialmente para la Ser del extremo N a la Val del extremo C.
Los péptidos que se muestran en las Tabla 7 y 8 se sintetizaron de la misma manera que anteriormente.
Tabla 7
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Cantidad de péptido en bruto obtenido (mg) Cantidad de péptido purificado obtenido (mg) HPLC pureza (%) HPLC tiempo de retención (min) Espectrometría de masas (m/z)
WT1wP2Q
SQGEQQYSV 14 251 88 98,2 9,21 1026,0
WT1wP2I
SIGEQQYSV 15 244 91 97,6 12,98 1010,7
WT1wP2M
SMGEQQYSV 16 260 22 96,9 11,91 1029,1
WT1wP3L
SLLEQQYSV 17 238 176 96,8 18,24 1066,9
WT1wP3A
SLAEQQYSV 18 268 172 99,1 13,67 1024,8
WT1wP3V
SLVEQQYSV 19 267 182 98,7 15,26 1052,8
WT1wP3M
SLMEQQYSV 20 280 63 94,8 16,12 1084,8
WT1wP3P
SLPEQQYSV 21 227 132 98,1 14,02 1050,8
WT1wP3W
SLWEQQYSV 22 248 40 (de péptido en bruto 100 mg) 99,4 20,00 1139,5
WT1wP3F
SLFEQQYSV 23 224 110 98,3 19,44 1100,8
WT1wP3Y
SLYEQQYSV 24 236 114 98,5 15,76 1116,7
WT1wP3S
SLSEQQYSV 25 261 130 99,1 13,33 1040,8
WT1wP3I
SLIEQQYSV 26 270 162 97,3 17,51 1066,9
Tabla 8
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Cantidad de péptido en bruto obtenido (mg) Cantidad de péptido purificado obtenido (mg) HPLC pureza (%) HPLC tiempo de retención (min) Espectrometría de masas (m/z)
WT1126P2V
RVFPNAPYL 36 253 130 96,5 20,65 1077,1
WT1126P2Q
RQFPNAPYL 37 274 87 98,7 18,43 1106,1
WT1126P2A
RAFPNAPYL 38 240 63 99,0 19,03 1049,1
WT1126P9A
RMFPNAPYA 50 262 139 94,3 16,59 1066,8
WT1126 P9M
RMFPNAPYM 52 295 167 95,7 19,75 1126,8
Los péptidos que se muestran en las Tablas 9 a 12 se sintetizaron de manera similar, pero las condiciones utilizadas para el análisis HPLC y espectrometría de masas son las siguientes.
5 Análisis HPLC (Agilent HP1100 o Thermo Fisher Scientific Surveyor)
Columna: Thermo Fischer Scientific BioBasic-18 3 mmO x 250 mm Eluyente 1: H2O/0,1 % TFA Eluyente 2: CHaCN/0,1 % TFA
10 Gradiente: Se permitió que la concentración del eluyente 2 cambiara a la concentración mostrada en la tabla durante 20 minutos.
Caudal: 0,4 ml/min Detección: 215 nm Espectrometría de masas
15 Espectrómetro de masas Thermo Bioanalysis Dynamo (MALDI-TOF)
Tabla 9
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO HPLC (%) Pureza de HPLC tiempo de retención (mm) HPLC gradiente Espectrometría de masas (m/z)
WT1wP1G
GLGEQQYSV 4 100 12,72 5-60 % 980,7
WT1wP1A
ALGEQQYSV 5 98,9 12,00 10-50 % 993,0
WT1wP1V
VLGEQQYSV 6 98,9 14,98 5-50 % 1022,3
WT1wP1L
LLGEQQYSV 7 97,6 12,75 10-65 % 1037,6
WT1wP1I
ILGEQQYSV 8 98,8 13,46 5-60 % 1037,2
WT1wP1M
MLGEQQYSV 9 95,5 14,15 5-60 % 1054,0
WT1wP1W
WLGEQQYSV 10 98,9 15,60 5-60 % 1109,9
WT1wP1F
FLGEQQYSV 11 95,8 13,14 10-65 % 1070,8
WTIwP9L
SLGEQQYSL 53 95,4 12,49 10-55 % 1024,6
20
Tabla 10
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO HPLC (%) Pureza de HPLC tiempo de retención (mm) HPLC gradiente Espectrometría de masas (m/z)
WT1126P1G
GMFPNAPYL 27 99,6 15,39 10-70 % 1009,5
WT1126P1A
AMFPNAPYL 28 98,8 13,79 10-85 % 1023,3
WT1126P1V
VMFPNAPYL 29 98,4 14,00 10-85 % 1052,2
WT1126P1L
LMFPNAPYL 30 98,9 14,91 10-80 % 1066,3
WT1126P1I
IMFPNAPYL 31 99,2 13,93 10-80 % 1065,4
WT1125P1M
MMFPNAPYL 32 100 13,77 10-80 % 1083,5
WT1126P1W
WMFPNAPYL 33 97,5 15,64 10-80 % 1139,3
WT1126P1F
FMFPNAPYL 34 98,8 14,78 10-85 % 1099,7
WT1126P2L
RLFPNAPYL 39 98,6 13,11 10-80 % 1090,9
WT1126P2I
RIFPNAPYL 40 100 13,74 10-70 % 1090,1
WT1126P3I
RMIPNAPYL 41 97,4 14,17 10-70 % 1076,7
WT1126P3L
RMLPNAPYL 42 100 13,88 10-65 % 1076,4
WT1126P3G
RMGPNAPYL 43 96,7 12,63 10-65 % 1020,9
WT1126P3A
RMAPNAPYL 44 95,2 13,95 10-60 % 1034,9
WT1-M6P3V
RMVPNAPYL 45 92,9 14,67 10-60 % 1062,7
WT1126P3M
RMMPNAPYL 46 91,8 14,87 10-60 % 1094,8
WT1126P3P
RMPPNAPYL 47 95,8 13,56 10-65 % 1058,8
WT1126P3W
RMWPNAPYL 48 99,6 15,21 10-70 % 1149,7
WT1126P9V
RMFPNAPYV 49 99,2 13,86 10-60 % 1096,5
WT1126P9I
RMFPNAPYI 51 99,4 14,00 10-65 % 1110,7
Tabla 11
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO HPLC (%) Pureza de HPLC tiempo de retención (mm) HPLC gradiente Espectrometría de masas (m/z)
WT1wP1D
DLGEQQYSV 54 96,6 13,43 5-60 % 1038,2
5
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20
25
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO HPLC (%) Pureza de HPLC tiempo de retención (mm) HPLC gradiente Espectrometría de masas (m/z)
WT1wP1E
ELGEQQYSV 55 96,4 11,83 10-60 % 1052,2
WT1wP1H
HLGEQQYSV 56 98,0 15,79 5-40 % 1060,2
WT1wP1K
KLGEQQYSV 57 99,0 13,77 5-45 % 1052,2
WT1wP1N
NLGEQQYSV 58 95,8 14,34 5-50 % 1037,0
WT1wP1P
PLGEQQYSV 59 95,9 14,68 5-50 % 1020,0
WT1wP1Q
QLGEQQYSV 60 96,8 13,28 5-60 % 1051,3
WT1wP1R
RLGEQQYSV 61 100 13,27 5-60 % 1079,6
WT1wP1T
TLGEQQYSV 62 96,7 14,40 5-50 % 1025,0
Tabla 12
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO HPLC (%) Pureza de HPLC tiempo de retención (mm) HPLC gradiente Espectrometría de masas (m/z)
WT1126P1D
DMFPNAPYL 63 99,2 14,72 10-75 % 1067,3
WT1126P1E
EMFPNAPYL 64 99,1 15,20 5-70 % 1082,1
WT1126P1H
HMFPNAPYL 65 96,7 14,52 10-70 % 1089,9
WT1126P1K
KMFPNAPYL 66 95,9 13,96 10-75 % 1080,0
WT1126P1N
NMFPNAPYL 67 99,8 14,69 10-75 % 1066,3
WT1126P1P
PMFPNAPYL 68 96,9 14,26 10-80 % 1049,3
WT1126P1Q
QMFPNAPYL 69 95,1 14,94 10-70 % 1080,3
WT1126P1S
SMFPNAPYL 70 99,8 14,28 10-80 % 1040,8
WT1126P1T
TMFPNAPYL 71 98,8 13,72 10-85 % 1053,5
WT1126P2I&P9I
RIFPNAPYI 72 97,0 14,23 10-65 % 1089,5
WT1126P2I&P9V
RIFPNAPYV 73 100 12,23 10-80 % 1077,0
WT1126P2L&P9I
RLFPNAPYI 74 97,7 13,43 10-75 % 1090,8
WT1126P2L&P9V
RLFPNAPYV 75 97,0 12,83 10-75 % 1076,9
Ejemplo 14
(Evaluación de los péptidos modificados respecto a la actividad de inducción de células inmunitarias específicas utilizando ratones transgénicos que expresan HLA-A*0201, y confirmación de la reacción cruzada de células inmunitarias específicas inducidas con el péptido de tipo silvestre)
<Métodos>
(1) Péptidos modificados candidatos
Como para el péptido WT1w, el péptido WT1126, y los péptidos modificados de los mismos (péptidos que comprende una sustitución de uno o dos restos de aminoácidos en la posición 1, 2, 3 y/o 9 desde el extremo N del péptido WT1187 o el péptido WT1126), se analizó la afinidad contra las moléculas de HLA-A*0201 utilizando el método conocido en el campo de la técnica, es decir, el método mediado por las siguientes cuatro bases de datos de computadora: BIMAS (
http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html), SYFPEITHI (
http://www.mpNb-
berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html), RaNlPEP (
http://immunax.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html), y NetMHC3.0 (
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/). Los resultados de los análisis del péptido WT1w y sus péptidos modificados se muestran en las Tablas 13 a 16 y 21. Los resultados de los análisis del péptido WT1-I26 y sus péptidos modificados se muestran en las Tablas 17 a 20 y 22 a 23. La afinidad prevista se muestra en las valoraciones.
Tabla 13
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187
SLGEQQYSV 2 285 27 96/64,43 % 0,721
WT1wP1A
ALGEQQYSV 5 285 27 95/63,76 % 0,720
-WT11187P1F
FLGEQQYSV 11 1312 26 82/55,03 % 0,862
WT1wP1G
GLGEQQYSV 4 285 26 86/57,72 % 0,672
WT11187P1I
ILGEQQYSV 8 485 27 90/60,40 % 0,698
WT1wP1L
LLGEQQYSV 7 485 27 89/59,73 % 0,719
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1wP1M
MLGEQQYSV 9 485 25 92/61,74 % 0,770
WT1wP1V
VLGEQQYSV 6 485 26 92/61,74 % 0,705
WT1187P1W
WLGEQQYSV 10 1312 25 71/47,65 % 0,693
Tabla 14
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187
SLGEQQYSV 2 285 27 96/64,43 % 0,721
WT1wP2I
SIGEQQYSV 15 39 25 85/57,05 % 0,556
WT1wP2M
SMGEQQYSV 16 206 25 84/56,38 % 0,740
WT1wP2Q
SQGEQQYSV 14 29 17 52/34,90 % 0,455
WT1wP2V
SVGEQQYSV 13 25 21 78/52,35 % 0,461
5
Tabla 15
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187
SLGEQQYSV 2 285 27 96/64,43 % 0,721
WT1wP3A
SLAEQQYSV 18 285 29 110/73,83 % 0,811
WT1wP3F
SLFEQQYSV 23 1055 28 114/76,51 % 0,852
WT1wP3I
SLIEQQYSV 26 285 29 115/77,18 % 0,817
WT1wP3L
SLLEQQYSV 17 1055 29 116/77,85 % 0,839
WT1wP3M
SLMEQQYSV 20 1055 28 114/76,51 % 0,876
WT1wP3P
SLPEQQYSV 21 285 27 95/63,76 % 0,748
WT1wP3S
SLSEQQYSV 25 285 27 110/73,83 % 0,793
WT1wP3V
SLVEQQYSV 19 285 27 113/75,84 % 0,766
WT1wP3W
SLWEQQYSV 22 2367 28 98/65,77 % 0,863
WT1wP3Y
SLYEQQYSV 24 913 28 111/74,50 % 0,854
Tabla 16
10
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187
SLGEQQYSV 2 285 27 96/64,43 % 0,721
WT1wP9L
SLGEQQYSL 53 88 27 89/59,73 % 0,640
Tabla 17
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126
RMFPNAPYL 3 314 22 70/46,98 % 0,802
WT1126P1A
AMFPNAPYL 28 314 24 77/51,68 % 0,808
WT1126P1F
FMFPNAPYL 34 1444 23 64/42,95 % 0,909
WT1126P1G
GMFPNAPYL 27 314 23 68/45,64 % 0,795
WT1126P1I
IMFPNAPYL 31 534 24 72/48,32 % 0,802
WT1126P1L
LMFPNAPYL 30 534 24 71/47,65 % 0,819
WT1126P1M
MMFPNAPYL 32 534 22 74/49,66 % 0,852
WT1126P1V
VMFPNAPYL 29 534 23 74/49,66 % 0,804
WT1126P1W
WMFPNAPYL 33 1444 22 53/35,57 % 0,799
Tabla 18
Péptido
Secuencia de SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
aminoácidos
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126
RMFPNAPYL 3 314 22 70/46,98 % 0,802
WT1126P2A
RAFPNAPYL 38 6 18 47/31,54 % 0,376
WT1126P2I
RIFPNAPYL 40 60 22 71/47,65 % 0,640
WT1126P2L
RLFPNAPYL 39 435 24 82/55,03 % 0,784
WT11126P2Q
RQFPNAPYL 37 44 14 38/25,50 % 0,485
WT1126P2V
RVFPNAPYL 36 38 18 64/42,95 % 0,552
Tabla 19
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126
RMFPNAPYL 3 314 22 70/46,98 % 0,802
WT1126 P3A
RMAPNAPYL 44 85 23 66/44,30 % 0,734
WT1126P3G
RMGPNAPYL 43 85 21 52/34,90 % 0,602
WT1126P3I
RMIPNAPYL 41 85 23 71/47,65 % 0,741
WT1126P3L
RMLPNAPYL 42 314 23 72/48,32 % 0,781
WT1126P3M
RMMPNAPYL 46 314 22 70/46,98 % 0,834
WT1126P3P
RMPPNAPYL 47 85 21 51/34,23 % 0,613
WT1126P3V
RMVPNAPYL 45 85 21 69/46,31 % 0,680
WT1126P3W
RMWPNAPYL 48 2293 22 61/40,94 % 0,867
5 Tabla 20
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126
RMFPNAPYL 3 314 22 70/46,98 % 0,802
WT1126P9A
RMFPNAPYA 50 73 16 53/35,57 % 0,731
WT1126P9I
RMFPNAPYI 51 153 20 74/49,66 % 0,790
WT1126P9M
RMFPNAPYM 52 73 16 65/43,62 % 0,686
WT1126P9V
RMFPNAPYV 49 1022 22 77/51,68 % 0,838
Tabla 21
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187
SLGEQQYSV 2 285 27 96/64,43 % 0,721
WT1wP1D
DLGEQQYSV 54 21 24 81/54,36 % 0,252
WT1wP1E
ELGEQQYSV 55 21 22 85/57,05 % 0,366
WT1wP1H
HLGEQQYSV 56 10 25 83/55,70 % 0,610
WT1wP1K
KLGEQQYSV 57 998 26 89/59,73 % 0,745
WT1wP1N
NLGEQQYSV 58 285 25 90/60,40 % 0,613
WT1187P1P
PLGEQQYSV 59 6 22 78/52,35 % 0,287
WT1187P1Q
QLGEQQYSV 60 285 25 87/58,39 % 0,630
WT1i87P1R
RLGEQQYSV 61 285 25 88/59,06 % 0,690
WT1wP1T
TLGEQQYSV 62 285 25 93/62,42 % 0,669
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 22
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126
RMFPNAPYL 3 314 22 70/46,98 % 0,802
WT1126P1D
DMFPNAPYL 63 24 21 63/42,28 % 0,353
WT1126P1E
EMFPNAPYL 64 24 19 67/44,97 % 0,501
WT1126P1H
HMFPNAPYL 65 11 22 65/43,62 % 0,747
WT1126P1K
KMFPNAPYL 66 1099 23 71/47,65 % 0,841
WT1126P1N
NMFPNAPYL 67 314 22 72/48,32 % 0,734
WT1126P1P
PMFPNAPYL 68 7 19 60/40,27 % 0,802
WT1126P1Q
QMFPNAPYL 69 314 22 69/46,31 % 0,757
WT1126P1S
SMFPNAPYL 70 314 24 78/52,35 % 0,819
WT1126P1T
TMFPNAPYL 71 314 22 75/50,34 % 0,779
Tabla 23
Péptido
Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO Valoración de unión a HLA-A*0201
BIMAS
SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126
RMFPNAPYL 3 314 22 70/46,98 % 0,802
WT1126P2I&P9I
RIFPNAPYI 72 29 20 75/50,34 % 0,617
WT1126P2I&P9V
RIFPNAPYV 73 195 22 78/52,35 % 0,722
WT1126P2L&P9I
RLFPNAPYI 74 212 22 86/57,72 % 0,780
WT1126P2L&P9V
RLFPNAPYV 75 1415 24 89/59,73 % 0,818
Se seleccionó un péptido modificado que se predijo que tenía una afinidad igual o mayor en comparación con el péptido tipo silvestre (el péptido WT1w o el péptido WT1126) en al menos una de las bases de datos como muestra para ensayar en los siguientes (2) a (4), además de los péptidos de tipo silvestre.
(2) Preparación y administración de preparaciones peptídicas
Se preparó un péptido sintetizado y secado por congelación en el Ejemplo 13 a la concentración de 50 mg/ml en DMSO (fabricado por Nacalai Tesque, Inc.). Después de eso, se mezclaron 32,5 pl de la solución del péptido en DMSO con 540 pl de agua destilada para inyección (fabricada por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). A continuación, se mezclaron 550 pl de la mezcla con 700 pl de adyuvante incompleto de Freund (Montanide ISA-51) utilizando una jeringa de cristal para preparar una emulsión de agua en aceite. Se inmunizó un ratón transgénico que expresa HLA-A*0201 (nombre de estirpe: HLA-A2+HLA-DR1+/Iap° P2m, EMMA número de ID EM: 01783) por administración subcutánea de 300 pl de la preparación (emulsión de agua en aceite) en la base de la cola. La evaluación de cada péptido se llevó a cabo utilizando 2 o 3 ratones.
(3) Preparación de las células esplénicas
El bazo se aisló 7 días después de la inmunización. Se machacó el bazo frotando contra la parte esmerilada de un portaobjetos de cristal y entonces se sometió a un tratamiento de hemólisis con el Tampón de Lisis ACK (fabricado por Lonza Co.) para preparar las células esplénicas. En este experimento, se utilizó medio CTM (medio completo de células T : RPMI-1640 (fabricado por Invitrogen Corporation) suplementado con un 10 % de FBS, 10 mM de HEPES, 20 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 1 mM de MEM aminoácidos no esenciales, un 1 % de MEM vitaminas y 55 pM de 2-mercaptoetanol con la condición de que estas concentraciones eran concentraciones finales) como medio para las células esplénicas, y se preparó la suspensión celular a la concentración de 5 x 106 células/ml.
(4) Método ELISPOT
Se examinó si el péptido administrado tenía la actividad de inducción de células inmunitarias específicas de WT1 por el método ELISPOT utilizando IFNy como índice. El método se llevó a cabo de acuerdo con el manual adjunto. Después de añadir el CTM en un volumen de 50 pl/pocillo en placas para ELISPOT (fabricadas por BD Japan, N.° de catálogo 551083), se colocó en las placas la suspensión celular esplénica en un volumen de 100 pl (5 x 105 células/pocillo). Adicionalmente, se añadió el péptido administrado o el péptido de tipo silvestre a la misma en un volumen de 50 pl/pocillo (concentración final de péptido: 2 pg/ml). Este método de ensayo se conoce como uno de los métodos sustitutos que hacen posible la predicción de la actividad citotóxica (J. Immunological Methods, 1995, 181, 45-54).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<Resultados>
Los resultados de la evaluación de la actividad de inducción de inmunidad específica basada en células se muestran en las Fig. 19 a 22 y 28 a 29 para los péptidos WT1w modificados, y en las Fig. 23 a 27 y 30 a 32 para los péptidos WT1 126 modificados. En cada una de las Fig. 19 a 32, el eje vertical representa el número de células de respuesta específicas del péptido antigénico en 5 x 105 células esplénicas (manchas/5 x 105 células), y el eje horizontal representa el ratón individual (2 o 3 ratones) utilizado en la evaluación. La barra blanca representa el número de células inmunitarias específicas que responden bajo no estimulación con péptidos antigénicos. La barra gris representa el número de células inmunitarias específicas que responden a la estimulación con el péptido de tipo silvestre. La barra negra representa el número de células inmunitarias específicas que responden a la estimulación con el péptido administrado (modificado).
Las fig. 19 a 32 muestra las actividades respectivas de inducción de inmunidad específica mediada por células con respecto a los siguientes péptidos.
La Fig. 19 a: péptido wT1wP1A, b: péptido WT1wP1F, c: péptido WT1wP1G, d: péptido WT1-I87P1I, e: péptido WT1wP1L, f: péptido WT1wP1M.
La Fig. 20 a: péptido WT1wP1V, b: péptido WT1wP1W, c: péptido WT1wP2I, d: péptido WT1wP2M, e: péptido WT1wP2Q, f: péptido WT1wP2V.
La Fig. 21 a: péptido WT1wP3A, b: péptido WTwP3F, c: péptido WT1wP3I, d: péptido WT1wP3L, e: péptido WT1wP3M, f: péptido WT1w P3P.
La Fig. 22 a: péptido WT1wP3S, b: péptido WT1wP3V, c: péptido WT1wP3W, d: péptido WT1wP3Y, e: péptido WT1wP9L.
La Fig. 23 a: péptido WT1-I26P1A, b: péptido WT1-I26P1F, c: péptido WT1-I26P1G, d: péptido WT1-I26P1I, e: péptido WT1126P1L, f: péptido WT1-I26P1M.
La Fig. 24 a: péptido WT1-I26P1V, b: péptido WT1-I26P1W, c: péptido WT1-I26P2A, d: péptido WT1-I26P2I, e: péptido WT1126P2L, f: péptido WT1-I26P2Q.
La Fig. 25 a: péptido WT1-I26P2V, b: péptido WT1-I26P3A, c: péptido WT1-I26P3G, d: péptido WT1-I26P3I, e: péptido WTI126P3L, f: péptido WT1-I26P3M.
La Fig. 26 a: péptido WT1-I26P3P, b: péptido WT1-I26P3V, c: péptido WT1-I26P3W, d: péptido WT1-I26P9A, e: péptido WT1126P9I, f: péptido WT1-I26P9M.
La Fig. 27: péptido WT1126P9V.
La Fig. 28 a: péptido WT1137P1D, b: péptido WT1wP1E, c: péptido WT1wP1H, d: péptido WT1wPlK.
La Fig. 29 a: péptido WT1wP1N, b: péptido WT1wP1P, c: péptido WT1wP1Q, d: péptido WT1wP1R, e: péptido WT1187P1T.
La Fig. 30 a: péptido WT1126P1D, b: péptido WT1126P1E, c: péptido WT1126P1H, d: péptido WTI126P1K, e: péptido WT1126P1N, f: péptido WT1126P1P.
La Fig. 31 a: péptido WT1126P1Q, b: péptido WT1126P1S, c: péptido WT1126P1T, d: péptido WT1126P2I&P9I, e: péptido WT1126P2I&P9V, f: péptido WT1-I26P2L&P9I.
La Fig. 32: péptido WT1-I26P2L&P9V.
Como se muestra en estos resultados, cuando se administraron los péptidos modificados excepto el péptido WT1wP1D, el péptido WT1wP1E, el péptido WT1wP1H, el péptido WT1wP1P y el péptido WT1187P2Q; el péptido WT1-I26P1D, el péptido WT1126P1E, el péptido WT1126P1P, el péptido WT1-I26P2A y el péptido WT1126P2Q en los ratones, se inducían notablemente células inmunitarias específicas de una manera eficaz.
A continuación, se analizaron las células inmunitarias específicas inducidas por estimulación con el péptido modificado en cuanto a la reactividad cruzada con el péptido de tipo silvestre (Tablas 24 a 25). Los resultados muestran que particularmente el péptido WT1wP1A, el péptido WT1wP1I, el péptido WT1wP1L, el péptido WT1wP1M, el péptido WT1wP1N, el péptido WT1wP1Q, el péptido WT1wP1T, el péptido WT1wP1V, el péptido WT1wP2V, el péptido WT1wP2M, el péptido WT1wP2I, el péptido WT1wP3A, el péptido WT1wP3F, el péptido WT1w P3P, el péptido WT1wP3S, el péptido WT1wP3V y el péptido WT1wP9L entre los péptidos wT1w modificados; y el péptido WT1-I26P1S, el péptido WT1-I26P2I, el péptido WT1126P2L, el péptido WT1126P2V, el péptido WT1-I26P3W, el péptido WT1126P9I, el péptido WT1126P9M y el péptido WT1-I26P9V entre los péptidos WT1126 modificados, pueden inducir células inmunitarias específicas que pueden reconocer eficazmente tanto el péptido modificado como el péptido de tipo silvestre.
Tabla 24
Reactividad cruzada (%)
Péptido WT1187 modificado
Modificado en la posición 1
Modificado en la posición 2 Modificado en la posición 3 Modificado en la posición 9
80-100
WT1187P1A WT1187P1N WT1187P1Q WT1187P1T WT1187P1V WT1187P2V WT1187P2M WT1187P2I WT1187P3A WT1187P3P WT1187P3S WT1187P9L
60-80
WT1187P1I WT1187P1L WT1187P1M WT1187P3F WT1187P3V
40-60
WT1187P1R WT1187P3Y
20-40
WT1187P1F WT1187P1W WT1187P3L
0-20
WT1187P1G WT1187P1K WT1187P3I WT1187P3M WT1wP3W
ND*
WT1187P1D WT1187P1E WT1187P1H WT1187P1P WT1187P2Q
5
Tabla 25
Reactividad cruzada (%)
Péptido WT11216 modificado
Modificado en la posición 1
Modificado en la posición 2 Modificado en la posición 3 Modificado en la posición 9 Modificado en las posiciones 2 y 9
80-100
WT1126P2L WT1126P2V WT1126P3W WT1126P9M WT1126P9I
60-80
WT1126P1S WT1126P2I WT1126P9V
40-60
WT1126P1A WT1126P1H WT1126P1K WT1126P1M WT1126P1N
20-40
WT1126P1G WT1126P1I WT1126P1Q WT1126P1W WT1126P9A
0-20
WT1126P1F WT1126P1L WT1126P1T WT1126P1V WT1126P3A WT1126P3G WT1126P3I WT1126P3L WT1126P3M WT1126P3P WT1126P3V WT1126P2I&P9I WT1126P2I&P9V WT1126P2L&P9I WT1126P2L&P9V
ND*
WT1126P1D WT1126P1E WT1126P1P WT1126P2Q WT1126P2A
ND*: no medible debido a que no presenta actividad
Aplicabilidad industrial
La composición vacunal contra el cáncer de la presente invención es útil como medicamento utilizado para el 10 tratamiento y prevención de cánceres que expresan WT1 en personas positivas al HLA-A*0206. La composición vacunal contra el cáncer de la presente invención también es útil como un medicamento utilizado para el tratamiento y prevención de cánceres que expresan WT1 en personas positivas al HLA-A*0201.
LISTADO DE SECUENCIAS 15
<110> International Institute of Cáncer Immunology, Inc.
<120> Composición vacunal contra el cáncer para positivos al HLA-A*0206
5 <130> G06F2975
<150> JP2007-314552 <151>
10 <160> 75
<170> PatentIn versión 3.1 <210> 1
15 <211 > 449
<212> PRT <213> Humana
<400> 1
20
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Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un péptido parcial, una composición que contiene dicho péptido parcial, o una vacuna contra el cáncer que comprende un ADN o ARN que codifica un péptido parcial, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es
    el péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), el péptido WT1-I26: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), el péptido WT1wP1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1wP2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1wP3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1-I26P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1-I26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1-I26P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
  2. 2. El péptido parcial o composición de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es
    el péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), el péptido WT1-I26: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), el péptido WT1wP1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1wP2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1wP3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1-I26P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1-I26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1-I26P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
  3. 3. El péptido parcial o composición de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es
    el péptido WT1-I26: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3).
  4. 4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, que comprende adicionalmente un adyuvante.
  5. 5. El uso de un péptido parcial, una composición que contenga dicho péptido parcial, o una vacuna contra el cáncer que comprende un ADN o ARN que codifica un péptido parcial, donde dicho péptido parcial es un péptido como se define en la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206.
  6. 6. El uso de un péptido parcial o una composición de acuerdo con la reivindicación 5 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es
    el péptido WT1w: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), el péptido WT1-I26: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3),

    el péptido WT1wP1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11),

    el péptido WT1wP2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16),

    el péptido WT1wP3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20),
    el péptido WT1-I26P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1-I26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1-I26P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
  7. 7. El uso de un péptido parcial o composición de acuerdo con la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, donde el péptido parcial es
    el péptido WT1-I26: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3).
  8. 8. El uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, que comprende adicionalmente un adyuvante.
  9. 9. Un método ex vivo para la inducción de CTL específicos del WT1, que comprende el cultivo, en presencia de un péptido parcial de acuerdo con la reivindicación 1, de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206, para obtener CTL específicos de WT1 inducidos a partir de ellas.
  10. 10. Un método ex vivo para la inducción de células dendríticas que presentan un péptido parcial de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el cultivo, en presencia del péptido parcial, de las células dendríticas inmaduras derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206, para obtener células dendríticas inducidas a partir de ellas que presentan el péptido parcial.
  11. 11. Un método de diagnóstico del cáncer in vitro para personas positivas al HLA-A*0206, que comprende
    i) una etapa de detección o cuantificación de un péptido parcial de acuerdo con la reivindicación 1, un anticuerpo contra él o CTL específicos del WT1 inducidos por un método de acuerdo con la reivindicación 9 en una muestra de una persona positiva al HLA-A*0206, y una etapa de comparación de la cantidad de dicho péptido parcial, dicho anticuerpo contra él o dichos CTL específicos del WT1, con el caso en el que el cáncer no se ha desarrollado, o
    ii) una etapa de determinación de la posición o región de los CTL específicos de WT1 o células dendríticas en el sujeto positivo al HLA-A*0206 al cual se han administrado dichos cTl específicos de WT1 que se han inducido por el método de acuerdo con la reivindicación 9 o dichas células dendríticas que se han inducido de acuerdo con la reivindicación 10.
  12. 12. Una composición vacunal contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201, que comprenden el siguiente péptido:
    el péptido WT1wP1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1wP2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido WT1wP3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido WT1-I26P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1-I26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1-I26P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o el péptido WT1126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).
  13. 13. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 12 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0201.
  14. 14. La composición de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0201.
    imagen1
    a b
    imagen2
    imagen3
    Fig. 4
    imagen4
    imagen5
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    en
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    CD8
    b c
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    H*
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    d e
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    células JY pulsadas con WT11261F
    Lisis especifica
    Relación E/T
    TF*1
    ce u as JY
    THP-1
    células JY pulsadas con WT1i262L
    B-LCL
    I
    Lisis específica (%)
    Lisis especifica (%)
    Relación E/T
    Re ación E/T
    imagen10
    WT1126 tetramérico
    CD8
    Flg. 11
    células JY
    células JY
    células JY pulsadas con WT1i262L
    células JY pulsadas con WT1126
    120
    Lisis especifica (%)
    Lisis específica
    Relación E/T
    Relación E/T
    imagen11
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas
    pulsadas con WT11262L
    pulsadas con WT 11260M
    pulsadas con WT 1 i2e9v
    Lisis
    Lisis
    Lisis
    especificar •
    especificar'
    especificar)
    Relación E/T
    Relación E/T
    Relación E/T
    Fig- 13
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas transfectadas
    con el gen WT 1 (que expresan WT 1)
    Lisis especifica (%)
    Relación E.T
    imagen12
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autologas
    células B-LCL autólogas
    células B-LCL autologas
    pulsadas con VvTli263M
    pulsadas con wT11269V
    pulsadas con WT1 i2e2L
    JQ
    Lisis
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    Lisis 2®
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    Relación E/T
    Relación E/T
    Relación E/T
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    Lisis
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    Relación E/T
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    JY
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    Relación E/T
    Lisis ^0 específica (%)
    6
    Fig
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    Lisis
    I U
    especifica
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    Lisis 3
    Lisis
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    Relación E/T
    Relación E/T
    Relación
    E/T
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006034334A2 (en) 2004-09-21 2006-03-30 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptide analogs capable of enhancing stimulation of a glioma-specific ctl response
EP2565201B1 (en) 2005-10-17 2014-11-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research WT1 HLA class II-binding peptides and compositions and methods comprising same
EP3834836A1 (en) 2006-04-10 2021-06-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic wt-1 peptides and uses thereof
AU2008332278C1 (en) * 2007-12-05 2013-10-03 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Cancer vaccine composition
EP2608799B1 (en) 2010-08-24 2018-12-12 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Interleukin-13 receptor alpha 2 peptide-based brain cancer vaccines
EA201391159A1 (ru) * 2011-02-11 2014-02-28 Мемориал Слоан-Кеттеринг Кэнсер Сентер Hla-рестриктированные пептидоспецифические антигенсвязывающие белки
KR20140039318A (ko) * 2011-06-28 2014-04-01 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 펩티드 암 항원 특이적 ｔ 세포의 리셉터 유전자
CA2846479A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for measuring anti-wt1 antibody
CA2852633C (en) * 2011-10-28 2021-08-03 Oncotherapy Science, Inc. Topk peptides and vaccines including the same
CA2861206C (en) 2012-01-13 2021-07-06 Richard J. O'reilly Immunogenic wt-1 peptides and methods of use thereof
EP2868325B1 (en) * 2012-07-02 2017-11-01 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Transdermal cancer antigen peptide preparation
EP2896693A4 (en) * 2012-09-12 2016-10-12 Int Inst Cancer Immunology Inc ANTIGEN SPECIFIC HELPER T CELL RECEPTOR GENES
KR20230038607A (ko) * 2012-12-13 2023-03-20 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Ｗｔ１ 백신
US10815273B2 (en) 2013-01-15 2020-10-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof
CN105377291B (zh) 2013-01-15 2019-04-02 纪念斯隆凯特林癌症中心 免疫原性wt-1肽和其使用方法
US10071051B2 (en) 2013-02-05 2018-09-11 Nitto Denko Corporation WT1 peptide cancer vaccine composition for transdermal administration
CN103961702B (zh) * 2013-02-05 2019-04-09 日东电工株式会社 粘膜给予用wt1肽癌症疫苗组合物
KR20140100419A (ko) * 2013-02-05 2014-08-14 닛토덴코 가부시키가이샤 경피 투여용 ｗｔ1 펩티드 암 백신 조성물
CA2841014A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-05 Nitto Denko Corporation Tape preparation of wt1 peptide cancer vaccine for transdermal administration
US9663563B2 (en) 2013-03-12 2017-05-30 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Aqueous liquid composition
WO2014157704A1 (ja) 2013-03-29 2014-10-02 大日本住友製薬株式会社 Ｅｒａｐ１によるトリミング機能をきっかけとしたコンジュゲートワクチン
CN105308063B (zh) * 2013-03-29 2019-11-08 大日本住友制药株式会社 Wt1抗原肽缀合物疫苗
EP2998740B1 (en) * 2013-05-13 2023-07-05 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Method for predicting clinical effect of immunotherapy
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
WO2015085147A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
KR20230076867A (ko) 2013-12-20 2023-05-31 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신생항원 백신과의 병용 요법
WO2015129790A1 (ja) * 2014-02-26 2015-09-03 株式会社バイオイミュランス Ｗｔ１抗原性ポリペプチド、及び該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤
CA2970236A1 (en) * 2014-12-11 2016-06-16 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Compositions comprising wt1 peptide for immunotherapy of angiogenic disease
WO2016100977A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Methods for profiling the t-cel- receptor repertoire
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
JP6028253B2 (ja) * 2015-01-28 2016-11-16 学校法人北里研究所 癌細胞の検出方法及び癌細胞検出キット
WO2016154071A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 The Trustees Of The University Of Isg15 and its use as an adjuvant
CN116327902A (zh) 2015-11-20 2023-06-27 纪念斯隆凯特林癌症中心 用于治疗癌症的方法和组合物
WO2017122131A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Dixon Janette Methods for determining tumour phenotypes
EP3549957A4 (en) 2016-11-30 2020-08-05 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. WT1-HELPER PEPTIDE AND COMBINATION OF THE SAYING PEPTIDE AND A CANCER ANTIGEN PEPTIDE CONJUGATE
TW202027777A (zh) 2018-10-05 2020-08-01 日商癌免疫研究所股份有限公司 良性腫瘤之預防或治療藥
TW202045528A (zh) 2019-02-28 2020-12-16 日商大日本住友製藥股份有限公司 選擇可期待用於治療或預防癌之醫藥組合物之效果之對象之方法
KR102215578B1 (ko) * 2019-03-28 2021-02-15 한국과학기술연구원 인간 백혈구 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
AU2020417800A1 (en) 2019-12-31 2022-07-14 Elixirgen Therapeutics, Inc. Temperature-based transient delivery of nucleic acids and proteins to cells and tissues
EP4151227A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating cancer

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3904260B2 (ja) 1995-06-01 2007-04-11 岸本 忠三 ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤
JP4789095B2 (ja) 1997-07-16 2011-10-05 治夫 杉山 ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対する発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍治療剤
US6664232B1 (en) * 1998-07-28 2003-12-16 Kyogo Itoh HLA-A2 restraint tumor antigen peptide originating in SART-1
JP4422903B2 (ja) * 1998-07-31 2010-03-03 株式会社癌免疫研究所 癌抑制遺伝子ｗｔ１の産物に基づく癌抗原
US7115272B1 (en) * 1998-09-30 2006-10-03 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
AU6407899A (en) * 1998-09-30 2000-04-17 Corixa Corporation Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
GB9823897D0 (en) * 1998-11-02 1998-12-30 Imp College Innovations Ltd Immunotherapeutic methods and molecules
US20040097703A1 (en) 2001-03-22 2004-05-20 Haruo Sugiyama Wt1 modified peptide
JP4365784B2 (ja) 2002-06-12 2009-11-18 株式会社癌免疫研究所 Ｈｌａ−ａ２４拘束性癌抗原ペプチド
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
KR101292971B1 (ko) 2003-06-27 2013-08-12 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 Ｗｔ1 백신 적응 환자의 선택 방법
WO2005053618A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthetic hla binding peptide analogues and uses thereof
JP2006045287A (ja) 2004-08-02 2006-02-16 Inax Corp 弾性接着剤及びタイル張り壁面
WO2007016466A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single wall nanotube constructs and uses therefor
AU2008332278C1 (en) * 2007-12-05 2013-10-03 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Cancer vaccine composition

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