KR20200114443A - 인간 백혈구 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
인간 백혈구 항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
암 세포의 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 암의 예방 또는 치료제, 및 암의 진단용 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 암 세포의 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 면역원성이 높으므로 이를 활용하면 상기 HLA를 발현하는 암 조직에 대한 세포성 면역반응을 유도할 수 있어 암 치료용 백신으로 활용할 수 있다. 따라서 일 양상에 따른 펩타이드는 궁극적으로는 암을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 활용될 수 있다. 또한, 일 양상에 따른 펩타이드는 암세포에 특이적으로 결합이 가능하여, 암의 진단이 가능하다.
Description
암 세포의 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 암의 예방 또는 치료제, 및 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
암은 정상 세포에 비하여 세포 성장이 조절되지 않고, 근접한 조직으로 침입이 가능하며, 때로는 전이가 되는 특성을 가지고 있다. 암은 기본적으로 조직의 성장 조절에 관련되어 있는 질병으로, 정상 세포가 암 세포로 형질전환이 되면 세포 성장과 분열을 조절하는 유전자의 발현이 변화한다 (Croce., The New England Journal of Medicine, 358(5): 502-511, 2008).
항암 치료는 물리적으로 암 조직을 제거하거나, 또는 방사선 조사나 항암제 투여를 통해 암 유전자 (oncogene)를 비롯하여 항-세포 사멸 분자 (anti-apoptotic molecule), 텔로머라제 (telomerase), 성장인자 수용체 유전자 (growth factor receptor gene), 신호전달 분자 (signaling molecule) 등과 같이 암 세포의 생존에 필요한 유전자의 발현을 저해시키거나 세포 사멸을 유도하는 방식으로 수행된다 (Knudson AG, Nature reviews. Cancer 1(2): 157-162, 2001). 그러나 이와 같은 치료 과정에서 암 세포뿐만 아니라 정상 세포도 영향을 받을 수 있어 부작용이 나타나는 문제점이 있다.
이에, 대안적으로 암을 치료하는 방법으로 암 치료 백신에 대한 필요성이 대두되고 있다. 암 치료 백신접종은 감염원을 예방하는 전통적인 예방접종과는 방법이 다르며, 특히 암 백신은 비자기-항원보다는 자기-항원에 대하여 면역반응을 유도하여야 한다. 또한, 상기 백신은 암이 형성된 후 투여하였을 때 작용하여야 하고 면역억제 효과를 발휘하여야 하며, 환자 사이의 이종 암 항원 발현에 대하여 감수성이 없어야 한다.
많은 암 항원은 자기항원으로서 면역 허용원이므로, 특정한 면역 반응을 유도하는 것은 어려우며 특히 많은 암에서 공통적으로 작용할 수 있는 항원을 찾아내는 것은 용이하지 않다. 다만, 암 세포에 대해 특이적인 면역 반응을 유발하는 항원 펩타이드를 이용하면 상기 항원을 발현하는 암세포를 특이적으로 제거하는 면역치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이나, 현재까지 이에 대해 전혀 알려진바 없다.
일 양상은 암 세포의 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
일 양상은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료제를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 암 세포의 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료제를 제공한다.
상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
일 양상에 따른 암 세포의 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 면역원성이 높으므로 이를 활용하면 상기 HLA를 발현하는 암 조직에 대한 세포성 면역반응을 유도할 수 있어 암 치료용 백신으로 활용할 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 펩타이드는 궁극적으로는 암을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 활용될 수 있다. 또한, 일 양상에 따른 펩타이드는 암세포에 특이적으로 결합이 가능하여, 암의 진단이 가능하다.
도 1은 암환자의 암 조직으로부터 보편적으로 발현하는 인간 백혈구 항원에 높은 친화도를 갖는 펩타이드를 수득하는 방법을 간단하게 모식화한 도이다.
도 2는 A11:01 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 최종 암 항원 펩타이드 후보군을 말초혈액 단핵세포에 처리하여 나타난 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 PBMC 세포에 선별된 후보군 암 항원 펩타이드 중 2종의 펩타이드에 대한 면역원성을 확인한 결과(도 3A) 및 후보군 펩타이드 20종에 대한 면역원성을 확인한 이미지를 펩타이드 별 면역원성 정도를 정량적 그래프로 나타낸 결과(도 3B)에 나타낸 도이다.
도 4는 A11:01 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 4종의 펩타이드로 최종적으로 선별된 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1에 대한 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 A11:01 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 최종 암 항원 펩타이드 후보군을 말초혈액 단핵세포에 처리하여 나타난 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 PBMC 세포에 선별된 후보군 암 항원 펩타이드 중 2종의 펩타이드에 대한 면역원성을 확인한 결과(도 3A) 및 후보군 펩타이드 20종에 대한 면역원성을 확인한 이미지를 펩타이드 별 면역원성 정도를 정량적 그래프로 나타낸 결과(도 3B)에 나타낸 도이다.
도 4는 A11:01 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 4종의 펩타이드로 최종적으로 선별된 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1에 대한 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
일 양상은 암 세포의 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
용어 “인간 백혈구 항원(HLA)는 인간의 주요 조직 적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex: MHC) 단백질을 코딩하는 유전자 복합체로, 조직적합성 항원을 지배하는 유전자를 함유한 염색체부위를 의미한다. 인간 백혈구 항원(HLA)이라고 하며 MHC 복합체라고 약기한다. 본 명세서 내에서 사용하는 용어 HLA는 주요 조직 적합성 복합체와 동일한 의미로 기재하고 있으며, MHC와 HLA는 본 명세서 내에서 혼용하여 사용이 가능하다.
명세서에서 사용된 용어 "암" 은 포유동물에서 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 생리적 상태를 의미하거나 그러한 생리적 상태를 설명하는 것으로 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하는 악성 종양을 제한 없이 포함할 수 있다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양 등이 있으나 이것으로 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특별한 예로는 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암 등의 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양, 및 삼중음성유방암(Triple negative breast cancer) 뿐만이 아니라 두경부암 등이 있다.
일 양상에 따른 펩타이드는 암 공통 항원(Tumor Associated self-antigen: TAA) 또는 신생항원(Neoantigen)일 수 있다. 암 세포의 성장은 비자기(non-self)로 식별하여 이를 제거하는 면역체계에 결함이 있을 때 발생하는 것으로 알려져 있는데, 상기 TAA는 암세포에서 발견되는 항원으로 정상세포에서는 발견되지 않는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 TAA는 발암물질에 의한 DNA 돌연변이의 결과로 나타나거나 발암성 DNA 바이러스 혹은 RNA 바이러스에 의한 유전물질의 발현 결과로 나타나는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일 양상에 따른 펩타이드는 암세포의 표면에 존재하면서 면역세포가 암세포를 제거할 수 있도록 돕는 HLA와 결합하여 암 세포에 대한 면역계의 반응, 즉 면역학적 감시(immunologic surveillance)를 유도하여 암 세포를 제거할 수 있다.
또한 상기 신생항원은 네오항원이라고 불리며, 상기 신생항원은 암조직 체세포 돌연변이에 의해 나타난 돌연변이 기반 펩타이드 서열을 의미한다. 상기 신생항원은 바이러스 단백질, 번역-후변형 또는 점 돌연변이(point mutation), 삽입-결실, 또는 오픈리딩 프레임(open reading frame)의 변화와 같은 체세포 돌연변이에서 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기 신생항원은 공통된 신생항원으로서 정상적인 게놈에서는 발견되지 않으나 특정 암 유형 또는 환자 사이에 공통적으로 나타나는 공통 신생항원(Shared neoantigen) 및 개개인의 암환자에 따라 돌연변이 위치나 정보가 달라져 나타나는 개인화된 신생항원(personalized neoantigen) 2개의 하위 그룹을 가지며, 일 양상에 있어서 상기 신생항원은 상기 공통 신생항원과 개인화된 신생항원을 포함할 수 있다.
상기 HLA는 클래스 1 또는 클래스 2일 수 있으며, 상기 HLA의 클래스 1은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C를 포함할 수 있으며, 또한 상기 HLA 클래스 2는 HLA-DR 및 HLA-DQ를 포함할 수 있다. 일 양상의 구체예에서는 삼중 음성 유방암 환자에서 가장 보편적으로 발현하는 HLA 클래스 1 중 A11:01 대립유전자(allele)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 확인하였다.
일 양상에 따른 펩타이드는 5 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 8 내지 15개의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 이루어질 수 있으나, 암 세포의 A11:01에 특이적으로 결합하면서 T세포의 면역원성을 높일 수 있는 펩타이드라면 제한 없이 포함 가능하다.
일 양상에 따른 펩타이드는 HLA에 대한 친화도가 500nM이하일 수 있으며, 또한 상기 펩타이드는 T세포 특이적인 면역원성이 나타나는 것 일 수 있다.
일 양상의 구체예에서는 HLA 클래스 1 중 A11:01 대립유전자(allele)에 특이적으로 결합하는 4종의 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1 펩타이드를 확인하였다.
일 양상의 구체예에서는 암 조직을 파쇄하고, 이를 용해액으로 용해시켜 암 조직에서 발현하는 HLA-항체-레진과 이와 결합하는 펩티돔을 통한 면역 침강반응(Immunoprecipitation)을 수행하여 tC18 레진을 이용하여, 정제하고 정제된 펩타이드를 효소 특이도(enzyme specificity)를 unspecific으로, false discovery rate를 0.01로, 펩타이드 길이를 8~15로, 최대 펩타이드 질량을 1,500로, 최대 전하를 3으로 하여 1차 암 공통 항원 펩타이드를 선별하였다.
이후 구체예에서는 NetMHC (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) 프로그램을 이용하여 각 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도를 분석하고, IEDB Analysis Resource (http://tools.iedb.org/immunogenicity/) 프로그램으로 수득한 1차 암 공통 항원 펩타이드의 면역원성을 분석하여 상위 50개의 펩타이드를 선별하였고, 최종적인 항원 펩타이드를 선별하기 위하여, 세포 내 착색(intracellular staining) 방법을 이용하여 세포 내 INF-γ마커 검출을 위한 대용량 초고속 이미징화 기반의 실험을 수행하여 손쉽게 CD8+ 세포 매개 면역원성 스크리닝을 수행할 수 있으므로, 암세포 조직 내 HLA에 특이적으로 결합하면서 동시에 면역원성까지 높은 일 양상에 따른 4종의 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1 펩타이드를 확인하였다.
일 양상은 상기 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 백신 조성물은 부가적으로 완충제, 등장화제, 보존제, 안정화제 및 용해보조제를 포함할 수 있다. 완충제로는 예를 들면 인산염, 초산염, 인산암모늄, 탄산암모늄, 구연산염 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 백신 조성물은 아쥬반트(adjuvant) 및 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 백신은 항원에 특이적인 체액성 면역반응뿐만 아니라 높은 세포성 면역반응을 유도할 수 있다.
상기 백신은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하고 있으므로, 암세포의 표면에 존재하면서 면역세포가 암세포를 제거할 수 있도록 돕는 펩타이드가 HLA와 결합하여 암 세포에 대한 면역계의 반응, 즉 면역학적 감시(immunologic surveillance)를 유도하므로 효율적으로 암을 예방할 수 있는 백신으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 암세포에 보편적으로 발현되는 A11:01 HLA에 특이적으로 결합하면서 T 세포의 면역원성이 높아 면역세포의 면역반응을 유도할 수 있어, 암이 형성된 후 투여하였을 때 작용하면서, 환자 사이의 이종 암 항원 발현에 대하여 감수성이 없어 암의 예방을 위한 백신으로 효과적으로 활용될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료제를 제공한다.
일 양상에 따른 암의 예방 또는 치료제는 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하고 있으므로, 암세포의 표면에 존재하면서 면역세포가 암세포를 제거할 수 있도록 돕는 펩타이드가 HLA와 결합하여 면역세포의 암 세포에 대한 면역계의 반응, 즉 면역학적 감시(immunologic surveillance)를 유도하므로 효율적으로 암 치료에 높은 효과를 기대할 수 있다.
상기 펩타이드가 암의 예방 또는 치료제로 포함되어 제조되는 경우, 상기 암의 예방 또는 치료제는 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 예방 또는 치료제에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 암의 예방 또는 치료제는 상기 성분들 이외에 예를 들면 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 예를 들면, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 예를 들면 0.001-100 ㎎/kg 범위 내일 수 있다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 암으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 암의 예방 또는 치료제는 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 암을 치료, 예방 또는 처리하는데 통상적으로 사용되어온 치료법과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 조성물은 치료법과 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료법과는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
통상적 치료법의 예는 외과수술, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법 및 면역요법을 포함하되 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 암의 예방 또는 치료제는 암과 관련된 질병이나 장애의 예방 또는 치료하기 위하여 이용될 수 있는데, 그러한 치료, 또는 예방이 필요한 환자에게 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양의 특정 약물 또는 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 수화물, 입체 이성질체, 포접물 또는 이들의 프로드럭을 투여하는 것을 포함한다. 상기 암의 예방 또는 치료제는 은 다른 약물("2차 약물") 또는 암을 치료, 처리 또는 예방하는 방법과 병용하여 투여된 다. 2차 약물은 그 종류를 제한하지 않으며, 단백질, 항체, 소분자 약물, 리포좀, 나노입자, 줄기세포 등일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
사용된 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 명세서 내에서의 진단은 암의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.
상기 일 양상의 펩타이드는 영상을 통하여 암을 진단하기 위하여 분자 영상용 형광체와 결합할 수 있다.
상기 분자 영상용 형광체는 형광을 발생시키는 모든 물질을 말하며, 예를 들면 적색이나 근적외선(near-infrared)의 형광을 발광하는 것일 수 있고, 양자 수득량(quantum yield)이 높은 형광체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 분자 영상용 형광체는 상기 A11:01 HLA에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 결합할 수 있는 형광체는 예를 들면, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 형광체는 예를 들면, 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODYPY), 테트라메틸로드아민(Tertramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 또는 이들의 유도체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 형광 단백질은 예를 들면, Dronpa 단백질, 형광 발색 유전자(EGFP), 적색 형광 프로테인(red fluorescent protein, DsRFP), 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5 또는 기타 형광 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 기타 영상용 물질은 예를 들면 산화철, 방사성 동위원소 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, MR, PET과 같은 영상 장비에 응용될 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 암세포 발현 HLA에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 정제 및 분석
공통 암 항원을 확인하기 위하여 암 조직에서 발현하는 인간 백혈구 항원(HLA)와 결합하는 펩티돔을 펩티돔-MHC간 면역침강반응 (Immunoprecipitation: IP)을 통하여 수득한 펩타이드를 분석하였다. 동결된 삼중 음성 유방암(Triple negative breast cancer : TNBC) 환자의 조직 41 mg을 파쇄기(CP02 cryoPREP Automated Dry Pulverizer)로 파쇄하고 600 μL의 융해액(1% 옥틸 글루코시드(octyl glucoside), 0.25% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 1 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 1 mM 페닐메탄슬포릴 플루오리드(PMSF), 0.2 mM 요오드아세트아미드 (iodoacetamide), 프로테아제 인히비터 칵테일(protease inhibitor cocktail) 및 인산완충식염수(PBS))을 넣고 1시간 동안 정치한 후, 15,000 rpm으로 4°C에서 20분간 원심분리를 실시하였다. 이후 상등액을 분리하여 50 μL의 A11:01 HLA-항체-레진(resin)과 4°C에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 150 mM의 NaCl 및 20 mM의 Tris-HCl로 이루어진 세척용액 A (pH 8.0), 400 mM의 NaCl 및 20 mM의 Tris-HCl로 이루어진 세척용액 B(pH 8.0) 및 20 mM Tris-HCl의 세척용액 C (pH 8.0) 순으로 용액을 300 μL씩 3 회 레진에 처리하여 세척하였다. 이후 100 μL의 0.1 M 아세트산(acetic acid) 용액으로 8회 용출시키고, 용출하여 얻은 용액을 tC18 레진을 이용하여 정제하였다. 이후 최종적으로 정제하여 수득한 펩타이드를 30% 아세토나이트릴(acetonitrile) 및 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액으로 용출하여 건조한 후, 0.1% 포름산(formic acid) 용액에 녹여 LTQ-Orbitrap 질량분석기로 분석하였으며, 수득한 질량분석 데이터를 MaxQuant 프로그램을 이용하여 분석하여 HLA에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 동정하였다. 펩타이드의 분석조건을 효소 특이도(enzyme specificity)를 unspecific으로, false discovery rate를 0.01로, 펩타이드 길이를 8~15로, 최대 펩타이드 질량을 1,500로, 최대 전하를 3으로 하였다.
상기 펩티돔-MHC간 면역침강반응이후 수득한 펩티돔 분석을 통하여 총 1000여종의 후보군 펩타이드를 결정하였다.
실시예 2. 공통 암 항원 후보군 펩타이드의 선별
실시예 1에서 수득한 1000여종의 1차 후보군 펩타이드 중 공통 암 항원 후보 펩타이드를 선별하기 위한 실험을 수행하였다. 동정된 펩타이드는 NetMHC (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) 프로그램을 이용하여 각 A11:01 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도를 분석하였다. 또한 각 펩타이드에 대하여 IEDB Analysis Resource (http://tools.iedb.org/immunogenicity/) 프로그램으로 상기 실시예 1에서 수득한 1000여종의 펩타이드의 면역원성을 분석하였다. 상기 분석된 내용을 바탕으로 암 조직 유래된 펩타이드 중 면역원성이 높은 순으로 후보를 선별하였다. 최종적으로 선별한 후보 펩타이드를 바이오인포매틱스 분석을 기반으로 하여, A11:01 에 대한 친화도가 500 nM 이하인 상위 50개의 펩타이드를 선별하였다.
실시예 3. 최종적인 공통 암 항원 펩타이드의 선별 및 이에 대한 검증
상기 실시예 2에서 선별된 50개의 펩타이드를 면역원성 스크리닝 시스템을 활용하여 공통 암 항원 펩타이드를 결정하기 위한 스크리닝 실험을 수행하였다. 실시예 2에서 선별한 펩타이드의 처리 조건은 다음과 같다: 384 웰을 이용하여, 각 웰당 5 X 104 PBMC 세포를 50 μl 씩 접종 한 후, 5회 반복으로 선별된 20 ug/ml의 펩타이드를 세포에 접촉시켰다. 이후, 세포 배양액에 20 ng/ml의 IL-7를 넣고 배양하였다. 이때, 면역원성에 대한 양성군에는 CD3/CD28 비드(B:C = 1:2) (Stem cell, USA)를 처리하여 T 세포를 활성화 시켰으며, 반면 음성 대조군에는 펩타이드가 포함되지 않은 PBS 버퍼만 처리하였다. 펩타이드를 접촉시킨 PBMC 세포를 100 U 의 IL-2를 포함하는 배지에 배양시켰으며, 3일마다 ½ 씩 새로운 배지로 교체하여 1주일 정도 배양하였다.
이후 CD8+ 세포 매개 면역 원성 스크리닝을 세포 내 착색(intracellular staining) 방법을 이용하여 세포 내 INF-γ마커 검출을 위한 이미징화 실험을 수행하였다. 양성군에서 세포 내 INF-γ 배출을 증가시키기 위하여 세포 내 착색을 수행하기 직전, 최종 농도 20 ng/ml의 PMA 및 최종 농도 1 μg/ml의 이오노마이신(Ionomycin)를 세포에 처리하였다. INF-γ 이외 세포 밖으로 분비되는 사이토카인을 억제하기 위하여, 1:000 배율로 희석한 BFA(Biolegend)를 8시간 가량 세포에 처리 후, 4% PFA/PERM buffer (BD, USA)로 세포 고정시켰다. 이후, 세포막을 구멍을 낸 후, 세포 내 착색 방법을 진행하였다. 세포 내 착색 마커인 CD8A, INF-γ 및 CD4을 검출하기 위하여, CD8a-alexa 488 (BD), INF-γ-APC (Biolegend), 및 CD4-alexa549 항체를 1:50 배율로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 후, PBS 로 3번 워싱하였다. 워싱 후, 60 nM 의 DAPI가 첨가된 PBS 를 20 μl씩 처리하고, Operetta (Perkin Elmer) 이미징 시스템 장비를 사용하여 이미징화하였으며, 이미징화하여 확인한 INF-γ 검출 결과를 도 2에 나타내었다. CD8+ T 세포를 녹색으로, INF-γ를 분비하는 세포는 적색으로 라벨링하였다.
도 2에서 확인한 바와 같이, 녹색 및 적색으로 염색된 PBMC 세포를 통하여 후보군 펩타이드를 처리한 경우의 세포의 발현 차이에 의하여 공통항원을 효율적으로 선별할 수 있음을 확인하였다. 특히, 양성 군에서는 INF-γ의 검출이 많은 반면, 음성대조군에서는 INF-γ검출이 거의 없는 것을 확인하였다. 따라서, 상기와 같은 발현 차이의 분석을 통하면 후보군 펩타이드가 효과적으로 면역원성을 나타내는 것인지를 효과적으로 확인할 수 있어, 암 조직 내 공통적으로 발현되는 A11:01 HLA에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. A11:01에 특이적으로 결합하는 공통 암항원 펩타이드에 대한 면역원성 검증
공통 암 항원을 찾아내기 위하여, TNBC 환자의 조직에서 보편적으로 과발현되는 A11:01에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 대한 면역 원성을 검증하기 위한 실험을 실시하였다. A11:01을 발현하는 3명의 기증자로부터 유래한 PBMC 세포를 이용하고, 실시예 1 내지 3에서 개시하고 있는 실험방법을 수행하였다. 면역원성에 대한 세포 내 착색에서 CD8+ T 세포를 녹색으로, INF-γ를 분비하는 세포는 적색, CD4를 가진 세포를 보라색으로 라벨링하였다. 3명의 기증자로부터 유래된 PBMC 세포에 선별된 후보군 암항원 펩타이드 중 2종의 펩타이드에 대한 면역원성을 확인한 결과를 도 3A에, 후보군 펩타이드 20종에 대한 면역원성을 확인한 이미지를 펩타이드 별 면역원성 정도를 정량적 그래프로 나타낸 결과를 도 3B에 나타내었다. 총 50종의 펩타이드 후보군 중 최종적으로 A11:01에 특이적으로 결합되는 펩타이드 중 가장 면역원성이 높은 4종의 펩타이드로 최종적으로 선별된 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1에 대한 면역원성을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 3A에서 확인한 바와 같이, 선별된 후보군 펩타이드를 A11:01을 가진 PBMC 세포에 처리한 경우에 처리된 각각의 펩타이드 별 발현되는 INF-γ 을 검출함으로써, 상기 TCP1 및 CTNNB1의 펩타이드가 면역원성을 나타내는 공통 암항원 펩타이드가 될 수 있음을 확인하였다. 도 3B에서 확인한 바와 같이, 20종의 후보군 펩타이드 중 P12가 각기 다른 유래의 PBMC에서 모두에서 높은 정도의 면역원성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 도 3A 및 3B과정으로 확인한 후보군 펩타이드 중 보편적으로 면역원성이 높은 펩타이드에 대한 선별과정을 거쳐서 최종적으로 선별된 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1가 음성대조군 대비 높은 정도의 면역원성을 나타내는 것을 도 4에서 확인하였다. 따라서, 보편적인 암조직에서 과발현되는 A11:01 HLA에 특이적으로 결합하는 4종의 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1 펩타이드를 선별할 수 있음을 확인하였고, 상기 펩타이드는 암세포의 표면에 존재하면서 특이적으로 A11:01 HLA와 결합하여 면역세포가 암세포를 제거할 수 있도록 도와 면역세포의 암 세포에 대한 면역계의 반응을 유도하면서 동시에, T세포의 면역원성을 높일 수 있으므로, 효과적으로 암 세포를 제거할 수 있음을 확인하였다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
Korea University Research and Business Foundation
<120> Human leukocyte antigen specific binding peptides and uses
thereof
<130> PN126044
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Amino acid sequence of CDC5L
<400> 1
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<223> Amino acid sequence of TCP1
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Amino acid sequence of CTNNB1
<400> 4
Gln Val Ala Asp Lys Asp Gly Gln Tyr
1 5
Claims (11)
- 암 세포의 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 암 공통 항원 또는 신생항원인 것인 펩타이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 HLA는 클래스 1 또는 클래스 2인 것인 펩타이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 HLA는 A11:01 대립유전자인 것인 펩타이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 펩타이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 HLA에 대한 친화도가 500nM이하인 것인 펩타이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 T세포 특이적인 면역원성이 나타나는 것인 펩타이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 암은 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암 등의 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양, 및 삼중음성유방암(Triple negative breast cancer) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인 펩타이드.
- 청구항 1 내지 8항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
- 청구항 1 내지 8항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료제.
- 청구항 1 내지 8항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Journal of Biological Chemistry, Vol. 287, No. 40, pp. 33401-33411(2012.09.28.)* * |
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| KR102215578B1 (ko) | 2021-02-15 |
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