KR101213015B1

KR101213015B1 - Ｗｔ１ 로부터 유도된 ｈｌａ-ｄｒ 결합성 항원 펩티드

Info

Publication number: KR101213015B1
Application number: KR1020067010568A
Authority: KR
Inventors: 하루오 스기야마
Original assignee: 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2012-12-26
Also published as: EP2071028A3; KR20060123756A; PT2071028E; CN100513563C; KR20130062368A; CY1112585T1; CN1902313A; KR20120067374A; CA2544214A1; EP1696027A1; EP1696027A4; CN101580538B; US10124046B2; EP2071028A2; ATE540111T1; EP2071028B1; CA2544214C; US20180207254A1; CN101580538A; KR101522079B1

Abstract

WT1 유래의 HLA-DRB1^*0405 결합성 항원 펩티드, 당해 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이들 펩티드나 폴리뉴클레오티드를 함유하는 헬퍼 T 세포의 유도제 등을 제공한다. 서열번호: 1 에 기재된 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드, 당해 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 펩티드나 폴리뉴클레오티드를 함유하는 헬퍼 T 세포의 유도제 등에 관한 것이다.

Description

ＷＴ１ 로부터 유도된 ＨＬＡ-ＤＲ 결합성 항원 펩티드{HLA-DR-BINDING ANTIGEN PEPTIDE DERIVED FROM WT1}

본 발명은, WT1 유래의 HLA-DRB1^*0405 결합성 항원 펩티드에 관한 것이다.

WT1 유전자 (Wilms' tumor gene 1) 는, 소아의 신장 종양인 Wilms 종양의 원인 유전자의 하나로 동정되었다 (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990). WT1 유전자는, 세포의 증식ㆍ분화ㆍ세포자멸사 및 장기의 형성 등에 관한 중요한 기능을 하는 전사인자 WT1 를 코딩하고 있다 (Int. Rev. Cytol. 181: 151, 1998). 당초, WT1 유전자는 암 억제 유전자로 위치지어져 있었지만, 그 후의 연구에 의해 백혈병 및 폐암이나 유방암을 포함하는 각종 고형암에서 발현이 확인되어, 오히려 WT1 유전자는 암의 증식을 촉진하는 암 유전자로서의 작용을 갖는 것으로 나타났다. 또한, WT1 유래의 펩티드에 의해 HLA-A^*0201 양성 또는 HLA-A^*2402 양성인 말초혈 단핵구를 시험관내 자극함으로써 펩티드 특이적인 세포 상해성 T 세포 (CTL) 가 유도되고, 이들 CTL 은 내인성으로 WT1 를 발현하는 백혈병이나 고형암의 암 세포를 상해하는 것으로 나타났다. 이들 결과로부터, WT1 는 암 면역 요법 (암 백신 요법) 의 유망한 표적 분자임이 개시되었다 (Int. J. Hematol 76: 127, 2002).

CTL 이 유효하게 유도되기 위해서는, 암 항원에 특이적인 헬퍼 T 세포의 존재가 중요하다는 것이 보고되어 있다 (Cancer. Res. 62: 6438, 2002).

헬퍼 T 세포 (CD4 양성 T 세포) 는, 항원 제시 세포의 MHC 클래스 II 분자와 항원 펩티드와의 복합체를 인식하여 유도 (증식) 및 활성화된다. 활성화된 헬퍼 T 세포는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, 또는 인터페론 등의 사이토카인을 생성하여, B 세포의 증식, 분화, 성숙을 돕는다. 또한 활성화 헬퍼 T 세포는, T 세포의 다른 서브세트, 예컨대 Tc, TD 세포 등의 증식, 분화, 성숙을 촉진하는 기능을 갖는다. 이와 같이 활성화 헬퍼 T 세포는 B 세포, T 세포의 증식 및 활성화를 촉진함으로써 면역계를 활성화하는 기능을 갖는다. 따라서, 암 면역 요법 (암 백신 요법) 에 있어서, MHC 클래스 II 결합성의 항원 펩티드 (헬퍼 펩티드라고도 한다) 의 작용을 받아 헬퍼 T 세포의 기능을 증강시켜, 암 백신의 효과를 증강하는 것은 유용한 것으로 제안되었다 (J. Immunother., 24:195, 2001).

WT1 유도성 펩티드에 관해서는, MHC 클래스 II 분자의 서브타입, 즉 HLA-DRB1^*0401 에 결합하는 오직 1종류의 항원 펩티드에 관한 보고 (Cancer. Immunol. Immunother. 51:271, 2002) 가 있다. 그 이외의 서브타입에 결합하는 것으로 보고된 WT1 유도성 펩티드에 관해서는 보고되어 있지 않다.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명의 목적은, WT1 유래의 HLA-DRB1^*0405 결합성 항원 펩티드, 및 당해 펩티드의 암 백신 효능 증강제로서의 용도를 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자는, 암 면역 요법에 있어서 암 백신의 작용을 증강시킬 수 있는, WT1 유래의 MHC 클래스 II 결합성 항원 펩티드 (헬퍼 펩티드) 에 관하여 예의 검토하였다. 그 결과, WT1 에는, 다수 존재하는 MHC 클래스 II 서브클래스 중 HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 작용을 갖는 항원 펩티드 부분이 존재하고 있다는 것을 처음으로 발견하였다. 그리고 이 지견에 의해, HLA-DRB1^*0405 양성인 암 환자에게 대하여 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도ㆍ증강시킬 수 있는 새로운 치료법이 가능해졌다.

그런데 최근의 보고에 따르면, 하나의 헬퍼 펩티드가 복수의 HLA-class II 분자에 결합하여 헬퍼 CD4 양성 T 세포를 유도할 수 있는 것, 즉 무차별적 헬퍼 펩티드 의 존재가 밝혀져 있다 (British J. cancer, 85(10), p1527-1534 (2001), J. Immunol., 169, p557-565 (2002)). 그래서 본 발명자는, 상기 HLA-DRB1^*0405 결합성 항원 펩티드 (헬퍼 펩티드) 의 하나로서 발견한 WT1₃₃₂ _-347 이 무차별적 헬퍼 펩티드 일 가능성에 관해서 검토한 결과, WT1₃₃₂ _-347 은 HLA-DRB1^*0405 분자뿐만 아니라, HLA-DRB1^*1502 에도 결합하는 무차별적 헬퍼 펩티드 인 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 헬퍼 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 은, HLA-DRB1^*0405 를 갖는 환자뿐만 아니라, HLA-DRB1^*1502 를 갖는 환자에 대해서도 적용가능한 헬퍼 펩티드이다. 더불어서, WT1 에는, 다수 존재하는 MHC 클래스 II 서브클래스 중 HLA-DRB1^*1502 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 작용을 갖는 항원 펩티드 부분이 존재하고 있다는 사실을 처음으로 발견하였다.

본 발명은 이러한 지견에 기초하여 완성하기에 이른 것이다. 즉 본 발명은,

(1) 서열번호: 1 에 기재된 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드,

(2) 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (1) 에 기재된 펩티드,

(3) 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (2) 에 기재된 펩티드,

(4) 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 제 1 위, 제 4 위, 제 6 위 및/또는 제 9 위의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드,

(5) 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 제 1 위, 제 4 위, 제 6 위 및/또는 제 9 위의 아미노산 잔기가 각각 다음 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (4) 에 기재된 펩티드:

제 1 위: 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌,

제 4 위: 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 아스파르트산, 글루탐산,

제 6 위: 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 글루타민, 라이신, 아스파르트산,

제 9 위: 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민,

(6) 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열의 제 3 위, 제 6 위, 제 8 위 및/또는 제 11 위의 아미노산 잔기가 각각 다음 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (5) 에 기재된 펩티드:

제 3 위: 페닐알라닌, 트립토판, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌,

제 6 위: 발린, 이소류신, 메티오닌, 아스파르트산, 글루탐산,

제 8 위: 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 글루타민, 라이신, 아스파르트산,

제 11 위: 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민,

(7) 서열번호: 1 에 기재된 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드로서, HLA-DRB1^*1502 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드,

(8) 서열번호: 46～서열번호: 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (7) 에 기재된 펩티드,

(9) 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (7) 에 기재된 펩티드,

(10) 상기 (1)～(9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드와 암 항원 펩티드를 함유하는 펩티드,

(11) 상기 (1)～(10) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(12) 상기 (11) 에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터,

(13) 상기 (12) 에 기재된 발현 벡터를 함유하는 세포,

(14) 상기 (13) 에 기재된 세포를, 펩티드가 발현가능한 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1)～(10) 중 어느 하나에 기재된 펩티드의 제조방법,

(15) 상기 (1)～(9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체,

(16) 상기 (1)～(10) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, 상기 (12) 에 기재된 발현 벡터 또는 상기 (13) 에 기재된 세포와, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물,

(17) 암의 치료제 또는 예방제인, 상기 (16) 에 기재된 의약 조성물,

(18) 상기 (1)～(9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, 상기 (1)～(9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 관련된 상기 (12) 에 기재된 발현 벡터, 또는 상기 (1)～(9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 관련된 상기 (13) 에 기재된 세포와, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는, 헬퍼 T 세포 유도제인, 상기 (16) 에 기재된 의약 조성물,

(19) 상기 (1)～(9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, 상기 (1)～(9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 관련된 상기 (12) 에 기재된 발현 벡터, 또는 상기 (1)～(9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 관련된 상기 (13) 에 기재된 세포와, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는, 암 백신의 효능 증강제인, 상기 (16) 에 기재된 의약 조성물,

(20) 상기 (10) 에 기재된 펩티드, 상기 (10) 에 기재된 펩티드에 관련된 상기 (12) 에 기재된 발현 벡터, 또는 상기 (10) 에 기재된 펩티드에 관련된 상기 (13) 에 기재된 세포와, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는, 암의 치료제 또는 예방제인, 상기 (16) 에 의약 조성물,

(21) 상기 (1)～(10) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, 상기 (12) 에 기재된 발현 벡터, 또는 상기 (13) 에 기재된 세포의, 암의 치료 또는 예방제의 제조에 있어서의 용도,

(22) 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 (1)～ (10) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, 상기 (12) 에 기재된 발현 벡터, 또는 상기 (13) 에 기재된 세포를, 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법,

(23) 암 항원 펩티드와 조합된 상기 (1)～ (9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드로 이루어지는 의약 조성물,

(24) 암을 치료 또는 예방하기 위한, 상기 (23) 에 기재된 의약 조성물,

(25) 상기 (1)～ (9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물과, 암 항원 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물을 함유하는, 암의 치료 또는 예방을 위한 키트,

(26) 상기 (1)～ (9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드와 암 항원 펩티드와의 조합의, 암의 치료 또는 예방제의 제조에 있어서의 용도, 그리고

(27) 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 암 항원 펩티드와 조합된 상기 (1)～ (9) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

발명의 효과

본 발명에 의해, WT1 유래의 HLA-DRB1^*0405 결합성 항원 펩티드, 당해 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이들 펩티드나 폴리뉴클레오티드를 함유하는 헬퍼 T 세포의 유도제 등이 제공된다. 본 발명의 헬퍼 T 세포의 유도제는 암 백신의 효능 증강제로서 유용하다. 본 발명의 암 백신의 효능 증강제는 다수의 HLA-DRB1^*0405 양성인 암 환자에게 적용이 가능하며, 특히 WT1 백신의 효능 증강제로서 유용하다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 에 의해 자극한 CD4 양성 T 세포 (헬퍼 T 세포) 와 각종 수상 세포와의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "무처리"는 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포와의 반응성을, "PHA"는 수상 세포 대신에 PHA 로 처리한 CD4 양성 T 세포의 결과를, "WT1₁₇₂ _-186 펄스"는 WT1₁₇₂ _-186 펩티드를 펄스한 수상 세포와의 반응성을, "WT1₂₂₅ _-243 펄스"는 WT1₂₂₅ _-243 펩티드를 펄스한 수상 세포와의 반응성을, "WT1₃₃₂ _-347 펄스"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 수상 세포와의 반응성을 각각 나타낸다. 또한 종축은 CD4 양성 T 세포에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다.

도 2 는 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스한 수상 세포에 대한 G2 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "무처리"는 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포를 사용한 결과를, "WT1₃₃₂ _-347 펄스"는 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스한 수상 세포를 사용한 결과를 나타낸다. 또한 종축은 G2 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다.

도 3 은 WT1 유전자를 발현하는 B-LCL(+) 세포에 대한 G2 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "B-LCL(-)"는 WT1 유전자를 발현하지 않고 있는 B-LCL(-) 세포를 사용한 결과를, "B-LCL(+)"는 WT1 유전자를 발현하는 B-LCL(+) 세포를 사용한 결과를, 또한 "B-LCL(+)＋항 HLA-DR 항체"는 항 HLA-DR 항체로 처리한 B-LCL(+) 를 사용한 결과를 나타낸다. 또한 종축은 G2 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다.

도 4 는 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스한 수상 세포에 대한 E04.1 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "-"는 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포를 사용한 결과를 나타내고, "332"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 수상 세포를 사용한 결과를 나타낸다. 종축은 E04.1 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다.

도 5 는 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스하여 자극한 세포를 각종 HLA 저해 항체로 처리한 경우의 E04.1 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 자극 세포에는 실시예 3 에 있어서 HLA-DRB1^*0405 양성인 건강한 일반인 자원자 혈액으로부터 확립한 B 세포주 B-LCL(-) 세포를 사용하였다. 도면 중, "-"는 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포를 사용한 결과를 나타내고, "332"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스하여 자극한 세포를 사용한 결과를 나타낸다. "332＋α-class I"은 WT1_332-347 펩티드와 항 HLA-class I 항체로 처리한 자극 세포, "332＋α-DR"은 WT1_332-347 펩티드와 항 HLA-DR 항체로 처리한 자극 세포, "332＋α-DQ"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드와 항 HLA-DQ 항체로 처리한 자극 세포를 사용한 결과를 나타낸다. 또, "332＋mIgG"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드와 저해 항체의 음성 대조군로서 항 마우스 IgG 항체로 처리한 자극 세포를 사용한 결과를 나타낸다. 종축은 E04.1 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다.

도 6 은 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스한 HLA-DRB1^*0405 양성 또는 음성인 PBMC 에 대한 E04.1 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "-"는 펩티드를 펄스하지 않은 PBMC 를 사용한 결과를, "332"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 PBMC 를 사용한 결과를 나타낸다. 공여자 의 HLA-DRB1 의 유전형은, 공여자 1 (HLA-DRB1^*0405/0803), 공여자 2 (HLA-DRB1^*0405/0101), 공여자3 (HLA-DRB1^*0101/1001) 및 공여자 4 (HLA-DRB1^*1201/0802) 이다. 종축은 E04.1 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다.

도 7 은 WT1 유전자를 발현하는 B-LCL(+) 세포에 대한 E04.1 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "B-LCL(-)"는 WT1 유전자를 발현하지 않고 있는 B-LCL(-) 세포를 자극 세포로 사용한 결과를, "B-LCL(+)"는 WT1 유전자를 발현하는 B-LCL(+) 세포를 자극 세포로 사용한 결과를 나타낸다. 종축은 E04.1 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다.

도 8 은 세포자멸사를 유도한 B-LCL(+) 세포를 펄스한 수상 세포에 대한 E04.1 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "세포자멸성 B-LCL(+)"는 WT1₃₃₂ _-347 유전자를 발현하는 B-LCL(+) 세포에 세포자멸사를 유도 후, 수상 세포에 펄스하는 경우를 나타낸다. "세포자멸성 B-LCL(-)"는 WT1 유전자를 발현하지 않은 B-LCL(-) 세포에 세포자멸사를 유도 후, 수상 세포에 펄스하는 경우를 나타낸다. 도면 중, "E04.1+"는 E04.1 세포를 수상 세포와 혼합 배양한 경우를, "E04.1-"는 E04.1 세포를 혼합 배양하지 않은 경우를 나타낸다. 종축은 E04.1 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다.

도 9 는 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스한 수상 세포에 대한 E04.1 세포주의 사이토카인 생성에 관해서 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "-"는 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포를 사용한 결과를, "332"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 수상 세포를 사용한 결과를 나타낸다. 종축은 IL-4 (백막대) 또는 IFN-γ (흑막대) 의 생성이 확인된 E04.1 세포의 비율을 나타낸다.

도 10 은 E04.1 세포주를 항 CD4 항체 및 항 CXCR3 항체로 염색하여 유세포분석기로 해석한 결과를 나타낸다. 도면 중, 횡축은 CD4 양성 세포를, 종축은 CXCR3 양성 세포를 나타낸다. CD4 양성이면서 CXCR3 양성인 세포의 비율은 90.1% 였다.

도 11 은 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 가 WT1 특이적 CTL 의 유도에 미치는 영향을 검토한 결과를 나타낸다. 건강한 일반인 자원자 (HLA-A^*2402/1101, DRB1^*0405/0803) 유래 PBMC 를, WT1₂₃₅ _-243 펩티드 (A), WT1₂₃₅ _-243＋WT1₃₃₂ _-347 펩티드 (B), WT1₂₃₅ _-243＋E04.1 세포 (C) 및 WT1₂₃₅ _-243펩티드＋WT1₃₃₂ _-347 펩티드＋E04.1 세포 (D) 의 자극 조건으로 7일간 배양하였다. 그 후, 회수한 세포의 절반량을 사용하여, WT1₃₃₂ _-347 특이적 CTL 전구체의 비율을 유세포분석기에 의해 해석하였다. 횡축은 CD8 양성 세포를 나타내고, 종축은 WT1₂₃₅ _-243 펩티드/HLA-A^*2402 양성 세포를 나타낸다.

도 12 는 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 가 WT1 특이적 CTL 의 활성화에 미치는 영향을 검토한 결과를 나타낸다. 상기 도 11 에 나타내는 실험에 있어서 회수한 나머지 절반량의 세포를 WT1₂₃₅ _-243 펩티드에 의해 6시간 자극한 후에, 세포내 IFN-γ 를 염색하였다. 종축은 세포내 IFN-γ 양성 세포, 횡축은 항 마우스 IgG 항체 양성 세포를 나타낸다. 도면 중, E 는 WT1₂₃₅ _-243 펩티드, F 는 WT1₂₃₅ _-243＋WT1_332-347 펩티드, G 는 WT1₂₃₅ _-243＋E04.1 세포, H 는 WT1₂₃₅ _-243펩티드＋WT1₃₃₂ _-347 펩티드＋E04.1 세포에 의한 자극의 결과를 나타낸다.

도 13 은 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 로 자극한 CD4 양성 T 세포와 각종 수상 세포와의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "-"는 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포와의 반응성을, "332"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 수상 세포와의 반응성을, "172"는 WT1₁₇₂ _-186 펩티드를 펄스한 수상 세포와의 반응성을, "225"는 WT1_225-243 펩티드를 펄스한 수상 세포와의 반응성을 각각 나타낸다. 종축은 CD4 양성 T 세포에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다. 실험군 사이에서 통계적인 유의차가 인정된 경우에는 "**", 유의차가 인정되지 않은 경우에는 "n.s." 로 표시하였다.

도 14 는 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 로 자극한 CD4 양성 T 세포의 TCR 레퍼토리 해석 결과를 나타낸다. TCR 의 각종 Vβ 쇄 특이적인 항체로 세포를 염색하여, 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다. 위의 도면에서는 4분할한 영역의 오른쪽 아래의 세포 집단이 Vβ3 양성 세포를 나타낸다. 또한, 밑의 도면에서는 4분할한 영역의 오른쪽 아래의 세포 집단이 Vβ20 양성 세포를 나타낸다.

도 15 는 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스한 자가 PBMC 에 대한 E15.1 세포주 또는 E15.2 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "-"는 펩티드를 펄스하지 않은 자가 PBMC 를 사용한 결과를 나타내고, "332"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 자가 PBMC 를 사용한 결과를 나타낸다. 종축은 분리한 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다. A) 는 E15.1 세포주를 사용한 경우, B) 는 E15.2 세포주를 사용한 경우의 결과를 나타낸다. 도면 중 "**" 는 실험군 사이에서 통계적인 유의차가 인정된 것을 나타낸다.

도 16 은 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스한 자가 PBMC 에 대한 E15.2 세포주의 사이토카인 생성에 관해서 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "-"는 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포를 사용한 결과를, "332"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 자가 PBMC 를 사용한 결과를 나타낸다. 종축은 IL-4 (백막대) 또는 IFN-γ (흑막대) 의 생성이 확인된 E15.2 세포의 비율 (%) 을 나타낸다.

도 17 은 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 의 자가 PBMC 에 대한 펄스 농도와 E15.2 세포주의 반응성에 관해서 조사한 결과를 나타낸다. 종축은, E15.1 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다. 횡축은 자가 PBMC 에 대한 WT1_332-347 펩티드의 펄스 농도를 나타낸다.

도 18 은 WT1 유래의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 을 펄스한 HLA-DRB1^*1502 양성 또는 음성인 PBMC 에 대한 E15.2 세포주의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다. 도면 중, "-"는 펩티드를 펄스하지 않은 PBMC 를 사용한 결과를, "332"는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 PBMC 를 사용한 결과를 나타낸다. A) 는 HLA-DRB1^*1502 양성인 건강한 일반인 유래의 PBMC 를 사용한 경우, B 는 HLA-DRB1^*1502 음성인 건강한 일반인 유래의 PBMC 를 사용한 경우를 나타낸다. 종축은 E15.2 세포주에 취입된 [³H]-티미딘량 (cpm) 을 나타낸다. 실험군 사이에서 통계적인 유의차가 인정된 경우에는 "**", 유의차가 인정되지 않은 경우에는 "n.s." 로 표시하였다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은, 서열번호: 1 에 기재된 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드는, 그 N 말단 아미노산 잔기 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기가 수식되어 있어도 되고, 또한 특정 아미노산 잔기가 개변되어 있어도 된다.

이하 "헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드 (CD4 양성 T 세포를 유도하는 펩티드)"를 "헬퍼 펩티드"라고 부르는 경우도 있다.

서열번호: 1 에 기재된 인간 WT1 의 아미노산 서열은, Cell, 60:509, 1990, NCBI 데이터 베이스 접근 번호 XP_034418 및 접근 번호 P19544 에 기재되어 있는 공지된 서열이다.

본 발명의 펩티드는, 서열번호: 1 에 기재된 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드이다. 여기서 "10～25 아미노산"이란 정의는, MHC 클래스 II 결합성 펩티드가 일반적으로 10～25 아미노산으로 이루어지는 것에 근거한다 (Immunogenetics, 41, 178-228 (1995), Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85-101 (1996), Immunology, 96, 1-9 (1999), Peptides, Vo1.19, 179-198 (1998), Immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001)). 바람직하게는, 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 13～17 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다.

본 발명의 펩티드는, 서열번호: 1 에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드 (후보 펩티드) 를 합성해서, 그 펩티드가 HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도할 수 있는지 아닌지를 검정함으로써, 동정할 수 있다.

여기서, 펩티드의 합성에 관해서는 통상적인 펩티드 화학에 있어서 사용되는 방법에 준하여 합성할 수 있다. 그 합성방법으로는, 문헌 (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol.2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩티드 합성, 마루젠(주), 1975; 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주), 1985; 의약품의 개발 속 제14권ㆍ펩티드 합성, 히로카와서점, 1991) 등에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.

후보 펩티드가 HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 것은, 예를 들어 Cancer. Immunol. Immunother. 51:271 (2002) 에 기재된 방법이나 실시예에 기재된 방법, 또한 이하에 기재된 방법 등에 의해 조사할 수 있다.

우선, HLA-DRB1^*0405 양성인 인간으로부터 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 회수하여, 부유 세포를 제거함으로써 수상 세포 (부착 세포) 를 조제한다. 또한 별도로, 동일한 HLA-DRB1^*0405 양성인 인간으로부터 Ficoll-Paque 의 밀도 구배 원심법 등에 의해 헬퍼 T 세포 (CD4 양성 T 세포) 를 조제한다.

다음으로, 상기 수상 세포에 대하여 후보 펩티드를 첨가해서 배양한 후, 이 수상 세포와 상기 헬퍼 T 세포를 혼합 배양한다. 그 후 헬퍼 T 세포를 회수하여, 이것을 후보 펩티드를 펄스한 수상 세포에 의해 동일하게 몇회 자극한다. 펩티드 자극에 반응하여 헬퍼 T 세포가 유도 (활성화) 된 것은, 예를 들어 (1) 당해 헬퍼 T 세포의 증식 활성이나, (2) 헬퍼 T 세포에 의한 사이토카인 생성 활성을 측정함으로써 조사할 수 있다. 여기서 (1) 의 증식 활성으로는, 구체적으로는 헬퍼 T 세포내에 취입(取入)된 [³H]-티미딘량을 측정함으로써 조사할 수 있다. 또한 (2) 의 사이토카인 생성 활성은, 활성화 헬퍼 T 세포가 생성하는 IFN-γ 등의 사이토카인의 양을 효소 면역 측정법 (ELISA) 등에 의해 측정함으로써 조사할 수 있다.

MHC 클래스 I 분자나 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 제시되는 항원 펩티드의 서열에는 규칙성 (결합 모티브) 이 존재하고 있다. MHC 클래스 I 분자와 결합하는 펩티드의 양단에는 MHC 분자와 결합하기 위해서 중요한 아미노산 잔기가 존재하지만, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 양단에는 그와 같은 것이 존재하지 않아, 이 말단 아미노산 부분은 MHC 클래스 II 분자와는 결합하고 있지 않다. 그러나, 펩티드는 MHC 클래스 II 분자의 펩티드 수용 홈을 따라서 가늘고 길게 박혀, 고정된다. 펩티드가 펩티드 수용 홈 안에 고정되는 것은, 펩티드 수용 홈에 펩티드 상의 아미노산 잔기의 측쇄가 결합하는 것과, 모든 MHC 클래스 II 분자의 펩티드 수용 홈에 잘 보존된 아미노산 잔기의 측쇄와 펩티드 주쇄가 결합하는 것에 의한 것이다. 펩티드 수용 홈은 MHC 클래스 II 분자마다, 펩티드 수용 홈에 있는 크고 작은 포트를 구성하는 아미노산 잔기에 다형성이 있다.

지금까지의 X 선 결정 구조 해석으로부터는, 최소의 MHC 클래스 II 결합성 펩티드의 제 1, 4, 6, 9번째 아미노산 잔기의 측쇄가 이들 결합 포켓에 박혀 있는 것이 나타나 있다.

상이한 대립 유전자 유래의 MHC 클래스 II 분자 각각에 대해서 결합하는 펩티드에 공통되는 아미노산 잔기의 패턴을 해석함으로써, MHC 클래스 II 분자의 펩티드 수용 홈의 포켓 부분에 결합하는 펩티드의 아미노산 잔기의 모티브를 추정할 수 있다. 결합 모티브를 가진 약 9개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드가 펩티드 수용 홈 안에 결합하고, 펩티드의 양단은 홈의 양단으로부터 불거져 나와도 되기 때문에, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 펩티드의 길이에는 원칙적으로 제한이 없는 것으로 생각되고 있다. 그러나 많은 경우, 긴 펩티드는 펩티다아제에 의해 절단되어, 13～17개의 아미노산의 길이로 되어 있는 경우가 많다 (Immunobiology, 5 th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001)).

HLA-DRB1^*0405 에 결합성을 갖는 펩티드에 관해서는, 9 아미노산으로 이루어지는 HLA (MHC) 결합 부분 중의 제 1, 4, 6, 9번째 아미노산 잔기가 다음에 나타내는 규칙성 (모티브) 을 갖는 것이 예측되고 있다 (Immunogenetics, 41, 178-228 (1995), Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85-101 (1996) 참조).

제 1 위: 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W), 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M),

제 4 위: 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E),

제 6 위: 아스파라긴 (N), 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루타민 (Q), 라이신 (K), 아스파르트산 (D),

제 9 위: 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q).

최근, 이들의 규칙성에 기초하여, MHC 클래스 II 항원에 결합가능한 것으로 예상되는 펩티드 서열을 인터넷 상에서 MHC 클래스 II 결합 서열 예측 프로그램 ProPred (Bioinformatics 17: 1236, 2001) 를 사용함으로써 검색할 수 있다.

본 발명은, WT1 (서열번호: 1) 가 HLA-DRB1^*0405 (MHC 클래스 II 의 1종) 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 항원 펩티드 부분을 가지고 있음을 처음으로 발견한 것에 근거한다. 당해 WT1 의 아미노산 서열 중, HLA-DRB1^*0405 에 결합성을 갖는 것으로 예측되는 상기 9 아미노산 부분으로는, 예를 들어 서열번호: 2～23 에 기재된 WT1 의 9 아미노산 부분을 들 수 있다. 즉 본 발명의 펩티드의 구체예로는, 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 함유하면서, 또한 HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 들 수 있다.

당해 펩티드는, 서열번호: 2～23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 WT1 의 부분 펩티드이며, 또한 HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 활성을 갖는 한, 그 길이는 특별히 한정되지 않는다. 전술한 바와 같이, 당해 결합 모티브 구조를 갖는 약 9개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드가 펩티드 수용 홈 안에 결합하고, 펩티드의 양단이 홈의 양단으로부터 불거져 나올 수 있기 때문에, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 펩티드의 길이에는 원칙적으로는 제한이 없다. 그러나 긴 펩티드는 펩티다아제에 의해 절단되기 때문에, 현재까지 보고되어 있는 MHC 클래스 II 결합성 펩티드는 10～25 아미노산 정도의 길이를 갖고 있다 (Immunogenetics, 41, 178-228 (1995), Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85-101 (1996), Immunology, 96, 1-9 (1999), Peptides, Vol.19, 179-198 (1998), Immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001)). 이것과 마찬가지로, 본 발명의 펩티드는 10～25 아미노산 정도의 길이인 것이 바람직하고, 13～17 아미노산 정도의 길이인 것이 보다 바람직하다.

따라서, 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 펩티드의 바람직한 형태로는, 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산 (바람직하게는 13～17 아미노산) 으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 활성을 갖는 펩티드를 들 수 있다.

보다 바람직한 형태로는, 서열번호: 12 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산 (바람직하게는 13～17 아미노산) 으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 활성을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 더욱 바람직한 형태로는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 16～25 아미노산 (바람직하게는 16～17 아미노산) 으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 활성을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 또, 여기서 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열은, 서열번호: 12 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 16 아미노산으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드이다.

더욱 바람직한 형태로는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다.

본 발명의 펩티드는, 활성을 유지하는 범위 내에서 적절히 개변되어 있어도 된다. 여기서 아미노산 잔기의 "개변"이란, 아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 부가 (펩티드의 N 말단, C 말단에 대한 아미노산의 부가도 포함한다) 를 의미한다. 바람직하게는 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있다. 아미노산 잔기의 치환에 관련된 개변의 경우, 치환되는 아미노산 잔기의 수 및 위치는 헬퍼 펩티드로서의 활성이 유지되는 한 임의적이다. 그러나, 상기한 바와 같이 통상적으로 HLA 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 길이가 10～25 아미노산 정도인 점에서 1개 내지 수 개의 범위가 바람직하다.

당해 치환에 관련된 아미노산 잔기의 개변에 있어서는, HLA-DRB1^*0405 에 대한 결합 모티브 구조를 갖는 9개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 중, 제 1 위, 제 4 위, 제 6 위 및/또는 제 9 위의 아미노산 잔기의 치환이 바람직하다.

이러한 본 발명의 치환에 관련된 펩티드의 구체적인 양태로는, 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 제 1 위, 제 4 위, 제 6 위 및/또는 제 9 위의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 들 수 있다.

바람직하게는, 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 제 1 위, 제 4 위, 제 6 위 및/또는 제 9 위의 아미노산 잔기가,

제 9 위: 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민,

중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 들 수 있다.

당해 제 1 위, 제 4 위, 제 6 위 및/또는 제 9 위의 아미노산 잔기의 치환은, 예를 들어 상기에 나타낸 WT1 의 부분 서열로 이루어지는 본 발명의 천연형 헬퍼 펩티드에 있어서, 그 HLA-DRB1^*0405 에 대한 결합성을 높이거나, 혹은 활성을 증강할 목적에서 실시할 수 있다. 치환을 실시한 제 1 위, 제 4 위, 제 6 위 및/또는 제 9 위 이외의 부분은 천연형의 서열 그대로 (즉 WT1 의 부분 서열 그대로) 여도 되고, 또한 활성을 유지하는 한 추가적으로 개변을 실시해도 된다.

보다 바람직하게는, 서열번호: 12 에 기재된 아미노산 서열의 제 1 위, 제 4 위, 제 6 위 및/또는 제 9 위의 아미노산 잔기가,

제 1 위: 페닐알라닌, 트립토판, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌,

제 4 위: 발린, 이소류신, 메티오닌, 아스파르트산, 글루탐산,

제 9 위: 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민,

더욱 바람직하게는, 서열번호: 12 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 16 아미노산으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드 (서열번호: 24) 에 있어서, 그 제 3 위, 제 6 위, 제 8 위 및/또는 제 11 위의 아미노산 잔기가,

제 11 위: 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민,

중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 예시할 수 있다. 또한 당해 서열번호: 24 의 치환 아미노산 서열을 포함하는 16～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드여도 된다.

본 발명은 또한, 상기 본 발명의 헬퍼 펩티드 (천연형 펩티드, 개변 펩티드) 와 암 항원 펩티드를 함유하는 펩티드 (소위 "에피토프 펩티드") 를 제공한다.

최근, 암 항원 펩티드 (CTL 에피토프라고도 한다) 와 헬퍼 펩티드 (헬퍼 에피토프라고도 한다) 를 연결시킨 에피토프 펩티드에 의해 효율적으로 CTL 이 유도되는 것이 보고되어 있다. 즉, 헬퍼 펩티드에 의해 활성화된 헬퍼 T 세포 (CD4 양성 T 세포) 는, CTL 의 분화 유도나 유지, 및 매크로파지 등의 이펙터 세포의 활성화 작용을 발휘하기 때문에, 암 항원에 의한 CTL 의 유도를 보다 증강시키는 것으로 생각되고 있다. 이러한 헬퍼 펩티드와 암 항원 펩티드를 연결시킨 펩티드의 구체예로서, 예를 들어 Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925 에는, HBV 유래 HLA-A2 구속성 항원 펩티드 6종류, HLA-A11 구속성 항원 펩티드 3종류, 및 헬퍼 펩티드로 구성되는 에피토프 펩티드를 코딩하는 DNA (미니진) 가, 생체내 각각의 에피토프에 대한 CTL 을 효과적으로 유도한 것이 기재되어 있다. 또한 실제로, CTL 에피토프 (멜라노마 항원 gp100 의 제 280 위～288 위로 이루어지는 암 항원 펩티드) 와 헬퍼 에피토프 (파상풍 독소 유래 T 헬퍼 에피토프) 를 연결한 펩티드가 임상 시험에 제공되고 있다 (Clinical Cancer Res., 2001, 7: 3012-3024).

이러한 본 발명의 헬퍼 펩티드와 암 항원 펩티드를 함유하는 에피토프 펩티드도 본 발명의 펩티드의 구체예로서 예시할 수 있다.

여기서 암 항원 펩티드로는 종래 공지된 어떠한 암 항원 펩티드도 사용할 수 있는데, 바람직하게는 WT1 유래의 암 항원 펩티드 (천연형 펩티드, 개변 펩티드) 를 들 수 있다. 구체적으로는 WT1 유래의 HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602 등에 구속성인 암 항원 펩티드를 들 수 있다.

당해 WT1 유래의 암 항원 펩티드로는, 예를 들어 국제 공개 제2000/18795호 팜플렛의 Table II-Table XLVI 에 열거된 펩티드 및 그 개변 펩티드 중 암 항원 펩티드로서의 활성 (HLA 항원에 결합하여 CTL 을 유도하는 활성) 을 갖는 펩티드를 들 수 있다.

보다 구체예로는, 예를 들어 다음의 암 항원 펩티드가 예시된다:

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 27)

Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 28)

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열번호: 29)

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열번호: 30)

Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 31)

Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 32)

Abu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 33)

Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 34)

Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 35)

Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열번호: 36)

Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열번호: 37)

Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열번호: 38)

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열번호: 39)

Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열번호: 40)

Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe (서열번호: 41)

Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe (서열번호: 42)

Arg Tyr Pro Ser Abu Gln Lys Lys Phe (서열번호: 43)

Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (서열번호: 44)

Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (서열번호: 45)

(여기서 Abu 는 α-아미노부티르산이다)

이 중 서열번호: 27 및 서열번호: 29 에 기재된 펩티드는 HLA-A24 항원 및 HLA-A2 항원에 결합성인 펩티드이고, 서열번호: 44 및 서열번호: 45 에 기재된 펩티드는 HLA-A2 항원에 결합성인 펩티드이다. 또한 그 이외의 펩티드는 HLA-A24 항원에 결합성인 펩티드이다.

바람직하게는, 상기 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 44 또는 서열번호: 45 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 들 수 있다.

본 발명의 에피토프 펩티드로서, 보다 구체적으로는, 예를 들어 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 헬퍼 펩티드와, 상기 서열번호: 27～45 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 함유하는 에피토프 펩티드를 들 수 있다.

바람직하게는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 헬퍼 펩티드와, 서열번호: 27～45 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 함유하는 에피토프 펩티드를 들 수 있다.

보다 바람직하게는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 헬퍼 펩티드와, 서열번호: 27～30, 44, 45 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 함유하는 에피토프 펩티드를 들 수 있다.

이러한 에피토프 펩티드는, 전술한 바와 같이 일반적인 펩티드 합성법에 의해서 제조할 수 있다. 또한 이들 복수의 에피토프를 연결시킨 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 정보에 기초하여, 통상적인 DNA 합성 및 유전자 공학적 수법을 사용하여 제조할 수도 있다. 즉, 당해 폴리뉴클레오티드를 주지의 발현 벡터에 삽입하고, 얻어진 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환해서 제작된 형질 전환체를 배양하고, 배양물로부터 목적으로 하는 복수의 에피토프를 연결시킨 에피토프 펩티드를 회수함으로써 제조할 수 있다. 이들 수법은, 전술한 바와 같이 문헌에 기재된 방법 (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) 이나 후술하는 방법 등에 준하여 실시할 수 있다.

당해 에피토프 펩티드가 헬퍼 펩티드로서의 활성을 갖는 것은, 전술한 방법에 의해 확인할 수 있다. 또한 상기 에피토프 펩티드가 암 항원 펩티드로서의 활성을 갖는 것은, 예를 들어 W002/47474호 및 Int J. Cancer:100, 565-570 (2002) 에 기술된 인간 모델 동물에 공급하는 것 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 에피토프 펩티드는, 당해 에피토프 펩티드에 함유된 헬퍼 펩티드 부분에 의해 활성화되는 헬퍼 T 세포 (CD4 양성 T 세포) 가 CTL 의 분화 유도나 유지 및 매크로파지 등의 이펙터 세포의 활성화 작용을 발휘하기 때문에, 당해 에피토프 펩티드에 함유되는 암 항원 펩티드에 의한 CTL 의 유도를 보다 증강시키고, 따라서 보다 효율적인 암의 치료 또는 예방에 사용할 수 있는 것으로 생각된다.

이상에서 나타낸 본 발명의 펩티드 (천연형 펩티드, 개변 펩티드 및 에피토프 펩티드) 의 N 말단 아미노산의 아미노기, 또는 C 말단 아미노산의 카르복실기는 수식되어 있어도 된다. 즉, 당해 N 말단의 아미노산 잔기 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기가 수식된 펩티드도 본 발명의 펩티드의 범주에 포함된다.

여기서 N 말단 아미노산의 아미노기의 수식기로는, 예를 들어 1～3개의 C₁ _-6 알킬기, 페닐기, 시클로알킬기, 아실기를 들 수 있고, 아실기의 구체예로는 C₁ _-6 알카노일기, 페닐기로 치환된 C₁ _-6 알카노일기, C₅ _-7 시클로알킬기로 치환된 카르보닐기, C₁ _-6 알킬술포닐기, 페닐술포닐기, C₂ _- ₆ 의 알콕시카르보닐기, 페닐기로 치환된 알콕시카르보닐기, C₅ _-7 시클로알콕시로 치환된 카르보닐기, 페녹시카르보닐기 등을 들 수 있다.

C 말단 아미노산의 카르복실기를 수식한 펩티드로는 예를 들어 에스테르체 및 아미드체를 들 수 있으며, 에스테르체의 구체예로는, C₁ _-6 알킬에스테르, 페닐기로 치환된 C₀ _-6 알킬에스테르, C₅ _-7 시클로알킬에스테르 등을 들 수 있고, 아미드체의 구체예로는, 아미드, C₁ _-6 알킬기의 1개 또는 2개로 치환된 아미드, 페닐기로 치환된 C₀ _-6 알킬기의 1개 또는 2개로 치환된 아미드, 아미드기의 질소원자를 함유하고 5 내지 7원환의 아자시클로알칸을 형성하는 아미드 등을 들 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 본 발명의 펩티드 (천연형 펩티드, 개변 펩티드 또는 에피토프 펩티드) 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태여도 되고 RNA 형태여도 된다. 이들 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열 정보 및 그것에 의하여 코딩되는 DNA 의 서열 정보에 기초하여 용이하게 제조할 수 있다. 구체적으로는, 통상적인 DNA 합성이나 PCR 에 의한 증폭 등에 의해 제조할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들어 상기 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 헬퍼 펩티드와, 상기 서열번호: 27～45 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 함유하는 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

바람직하게는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 헬퍼 펩티드와, 서열번호: 27～45 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 함유하는 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

보다 바람직하게는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 헬퍼 펩티드와, 서열번호: 27～30, 44, 45 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 함유하는 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에는, 당해 폴리뉴클레오티드의 상보 서열과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서 본 발명의 펩티드와 동등한 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 여기에, "엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈한다"에 관해서, 여기서 사용되는 하이브리다이제이션은, 예를 들어, [Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T. 저, (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 등에 기재된 통상적인 방법에 준하여 실시할 수 있다. 또한 "엄격한 조건 하"란, 예를 들어, 6×SSC (1.5M NaCl, 0.15M 시트르산3나트륨을 함유하는 용액을 10×SSC 로 한다), 50% 포름아미드를 함유하는 용액 중에서 45℃ 에서 하이브리드를 형성시킨 후, 2×SSC 로 50℃ 에서 세정하는 조건 (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6) 등을 들 수 있다.

상기에서 제작된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 삽입시켜, 본 발명의 펩티드를 발현시키기 위한 재조합 발현 벡터를 제작할 수 있다.

여기서 사용하는 발현 벡터로는 사용하는 숙주나 목적 등에 따라서 적절히 선택할 수 있고, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

예를 들어, 숙주가 대장균인 경우, 벡터로는 pUC118, pUC119, pBR322, pCR3 등의 플라스미드 벡터, λZAPII, λgt11 등의 파지 벡터를 들 수 있다. 숙주가 효모인 경우, 벡터로는 pYES2, pYEUra3 등을 들 수 있다. 숙주가 곤충 세포인 경우에는 pAcSGHisNT-A 등을 들 수 있다. 숙주가 동물 세포인 경우에는 pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV, pRc/CMV 등의 플라스미드 벡터나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 들 수 있다.

상기 벡터는, 발현 유도가능한 프로모터, 시그널 서열을 코딩하는 유전자, 선택용 마커 유전자, 터미네이터 등의 인자를 적절히 갖고 있어도 된다.

또한, 단리 정제가 용이해지도록, 티오레독신, His 태그, 또는 GST (글루타티온 S-트랜스페라아제) 등과의 융합 단백질로서 발현하는 서열이 부가되어 있어도 된다. 이 경우, 숙주 세포내에서 기능하는 적절한 프로모터 (lac, tac, trc, trp, CMV, SV40 초기 프로모터 등) 를 갖는 GST 융합 단백 벡터 (pGEX4T 등) 나, Myc, His 등의 태그 서열을 갖는 벡터 (pcDNA3.1/Myc-His 등), 또는 티오레독신 및 His 태그와의 융합 단백질을 발현하는 벡터 (pET32a) 등을 사용할 수 있다.

상기에서 제작된 발현 벡터에 의해 숙주를 형질 전환함으로써, 당해 발현 벡터를 함유하는 형질 전환 세포를 제작할 수 있다.

여기서 사용되는 숙주로는, 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등을 들 수 있다. 대장균으로는, E. coli K-12 계통의 HB101 주, C600 주, JM109 주, DH5α 주, AD494(DE3) 주 등을 들 수 있다. 또한 효모로는 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces serevisiae) 등을 들 수 있다. 동물 세포로는 L929 세포, BALB/c3T3 세포, C127 세포, CHO 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포 등을 들 수 있다. 곤충 세포로는 sf9 등을 들 수 있다.

숙주 세포에 대한 발현 벡터의 도입방법으로는, 상기 숙주 세포에 적합한 통상적인 도입방법을 사용하면 된다. 구체적으로는 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법, 일렉트로코포레이션법, 유전자 도입용 리피드 (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL 사) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 도입 후, 선택 마커를 함유하는 통상의 배지에서 배양함으로써, 상기 발현 벡터가 숙주 세포 중에 도입된 형질 전환 세포를 선택할 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어진 형질 전환 세포를 바람직한 조건 (펩티드가 발현될 수 있는 조건) 하에서 계속해서 배양시킴으로써 본 발명의 펩티드를 제조할 수 있다. 얻어진 펩티드는, 일반적인 생화학적 정제 수단에 의해 다시 단리ㆍ정제할 수 있다. 여기서 정제 수단으로는, 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 친화성-크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 전술한 티오레독신이나 His 태그, GST 등과의 융합 단백질로서 발현시킨 경우에는, 이들 융합 단백질이나 태그의 성질을 이용한 정제법에 의해 단리ㆍ정제할 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는, 그 형태에 특별히 제한은 없고, 본 발명의 펩티드를 면역원로 하는 폴리클로날 항체여도 되고, 또 모노클로날 항체여도 된다.

본 발명의 항체는 상기한 바와 같이 본 발명의 펩티드에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는, 서열번호: 2～서열번호: 23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 헬퍼 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 들 수 있다. 바람직하게는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 헬퍼 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 들 수 있다.

이들 항체의 제조방법은 이미 공지되어 있으며, 본 발명의 항체도 이들의 통상적인 방법에 따라서 제조할 수 있다 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. 외 편, Cold Spring Harber Laboratory Press 출판 New York 1989).

구체적으로는, 본 발명의 펩티드를 면역원로서 사용하여 집토끼 등의 비인간 동물을 면역시키고, 그 면역 동물의 혈청으로부터 통상적인 방법에 따라서 얻을 수 있다. 한편, 모노클로날 항체의 경우에는, 본 발명의 펩티드를 마우스 등의 비인간 동물에게 면역시켜서, 얻어진 비장 세포와 골수종 세포를 세포 융합시켜 조제한 하이브리도마 세포 중에서 얻을 수 있다 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11).

본 발명의 펩티드에 대한 항체는, 숙주에 따라서 각종 아쥬반트를 사용하여 면역학적 반응을 높이는 것에 의해서도 제작할 수 있다. 그와 같은 아쥬반트에는, 프로인트 아쥬반트, 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔, 그리고 리솔레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 유유제 (油乳劑), 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀과 같은 표면 활성 물질, BCG (Bacille de Calmette-Guerin) 나 코리네박테리움-파붐 (Corynebacterium-parvum) 등의 인간 아쥬반트 등이 있다.

이상과 같이 본 발명의 펩티드를 사용하여 통상적인 방법에 의해 적절히 동물을 면역시킴으로써, 펩티드를 인식하는 항체, 또 그 활성을 중화하는 항체를 용이하게 제작할 수 있다. 항체의 용도로는, 친화성-크로마토그래피, 면역학적 진단 등을 들 수 있다. 면역학적 진단은, 면역블롯법, 방사 면역 측정법 (RIA), 효소 면역 측정법 (ELISA), 형광 또는 발광 측정법 등에서 적절히 선택할 수 있다. 이러한 면역학적 진단은, WT1 유전자가 발현되어 있는 암, 즉 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배(胚)세포암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등의 진단에 있어서 유효하다.

본 발명은, 본 발명의 펩티드 (천연형 펩티드, 개변 펩티드, 에피토프 펩티드), 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터, 또는 본 발명의 발현 벡터를 함유하는 세포와, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 당해 의약 조성물은, 헬퍼 T 세포의 유도제, 암 백신의 효능 증강제로서 유효하게 사용할 수 있다. 이하 구체적으로 설명한다.

(1) 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 하는 헬퍼 T 세포의 유도제 (암 백신의 효능 증강제)

본 발명의 펩티드는 헬퍼 T 세포의 유도능을 갖는 것으로, 유도된 헬퍼 T 세포는, CTL 의 분화 유도나 유지, 및 매크로파지 등의 이펙터 세포의 활성화 작용을 통해서 암 백신의 작용인 CTL 유도 활성을 더욱 증강시킬 수 있다. 즉 본 발명은, 본 발명의 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 암 백신의 효능 증강제 (암 백신의 효능 증강제로서의 의약 조성물) 를 제공한다. 본 발명의 효능 증강제를 HLA-DRB1^*0405 양성 또한 WT1 양성인 환자에게 투여하면, 항원 제시 세포의 HLA-DRB1^*0405 항원에 본 발명의 펩티드가 제시되고, 펩티드와 HLA-DRB1^*0405 항원과의 복합체를 인식하는 특이적 헬퍼 T 세포 (CD4 양성 T 세포) 가 유도 및 활성화되어서 CTL 의 분화 유도나 유지, 및 매크로파지 등의 이펙터 세포의 활성화 작용을 발휘할 수 있다. 이러한 방식으로, 암 백신의 작용인 CTL 의 유도 및 활성화를 증강시킬 수 있다.

본 발명의 암 백신 효능 증강제는, WT1 유전자의 발현 레벨 상승을 동반하는 암, 예를 들어 백혈병, 골수 이(異)형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 림프종 등의 혈액성 암이나, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등과 같은 고형암의 예방 또는 치료에 있어서 사용할 수 있다.

본 발명의 암 백신의 효능 증강제는 암 백신과 동시에 투여할 수도 있고, 암 백신 투여 전 또는 암 백신 투여 후에 투여하는 것도 가능하다.

본 발명의 펩티드를 유효성분으로 하는 암 백신 효능 증강제는, 단일 헬퍼 펩티드를 유효성분으로 하는 것이어도 되고, 또한 암 항원 펩티드 (CTL 에피토프) 와 연결한 에피토프 펩티드를 유효성분으로 하는 것이어도 된다. 전술한 바와 같이 최근, 암 항원 펩티드 (CTL 에피토프) 와 헬퍼 펩티드 (헬퍼 에피토프) 를 연결시킨 에피토프 펩티드에 의해 효율적으로 CTL 이 유도되는 것이 나타나 있다. 이러한 에피토프 펩티드의 형태로 투여한 경우, 항원 제시 세포 내에 취입되고, 그 후, 세포내 분해에 의해 생긴 개개의 항원 펩티드 중 헬퍼 펩티드는 MHC 클래스 II 항원 (HLA-DRB1^*0405) 과, 또한 암 항원 펩티드는 MHC 클래스 I 항원과 결합해서 복합체를 형성하고, 그 복합체가 항원 제시 세포 표면에 고밀도로 제시된다. HLA-DRB1^*0405 항원과 헬퍼 펩티드의 복합체를 헬퍼 T 세포가 인식하여 CTL 의 분화 유도나 유지, 및 매크로파지 등의 이펙터 세포의 활성화 작용을 통해 암 백신의 작용인 CTL 유도 활성을 더욱 증강시킨다. 한편, 암 항원 펩티드와 MHC 클래스 I 항원과의 복합체를 CTL 이 인식해서 증식되고, 암 세포를 파괴한다. 따라서, 본 발명의 에피토프 펩티드를 유효성분으로 하는 의약 조성물은, 암 백신의 효능 증강제로서 사용됨과 함께 암 백신 그 자체로서 사용된다.

본 발명의 펩티드를 유효성분으로 하는 암 백신의 효능 증강제는, 세포성 면역이 효과적으로 성립하도록 의약으로서 허용되는 담체, 예를 들어 적당한 아쥬반트와 함께 투여하거나, 입자상의 제형으로 해서 투여할 수 있다. 아쥬반트로는, 문헌 (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) 에 기재된 것 등을 응용할 수 있다. 구체적 예시는, 균체 유래 성분, 사이토카인, 식물 유래 성분, 해양 생물 유래 성분, 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리솔레시틴 및 Pluronic

폴리올과 같은 계면활성제, 폴리아니온, 펩티드, 또는 유유탁액 (에멀전 제제) 등을 들 수 있다. 또한 리포솜제제, 직경 수 ㎛ 의 비드에 결합시킨 입자상 제제, 리피드를 결합시킨 제제 등도 있다.

투여방법으로는 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여 등을 들 수 있다. 제제 중의 본 발명의 펩티드의 투여량은 치료 목적의 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적절히 조정할 수 있는데, 통상 0.0001㎎ 내지 1000㎎, 바람직하게는 0.001㎎ 내지 1000㎎, 보다 바람직하게는 0.1㎎ 내지 10㎎ 이고, 이것을 수 일 내지 수 월에 1회 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또, 본 발명의 펩티드와 암 항원 펩티드를 조합하여 이루어지는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 조합에 의해 암 항원 펩티드가 갖는 암 백신으로서의 작용 (CTL 의 유도 및 활성화 작용)이 본 발명의 펩티드에 의해 증강되어, 암의 치료 또는 예방을 보다 효과적으로 달성할 수 있다.

"조합"이란, 본 발명의 펩티드 및 암 항원 펩티드의 양자를 혼합한 형태로 투여하는 것, 및 따로 따로 투여하는 형태로 투여하는 것을 포함한다.

혼합한 형태로 투여하는 경우, 미리 혼합하여 제제화된 것을 사용할 수도 있고, 각각 제제화된 것을 필요할 때 혼합하여 사용할 수도 있다.

한편, 각개 형태로 투여하는 경우에는, 각각 제제화된 것을 시간차를 두고 각개로 투여할 수도 있고, 동시에 투여할 수도 있다. 시간차를 두고 투여하는 경우, 본 발명의 펩티드 (암 백신의 효능 증강제) 를 투여한 후에 암 항원 펩티드 (암 백신) 를 투여해도 되고, 또한 암 항원 펩티드 (암 백신) 를 투여한 후에 본 발명의 펩티드 (암 백신의 효능 증강제) 를 투여해도 된다.

본 발명에 관련된 본 발명 펩티드와 암 항원 펩티드와의 조합의 1 양태로서 키트를 예시할 수 있다.

본 발명의 펩티드와 조합하여 사용되는 암 항원 펩티드로는 종래 공지된 어떠한 암 항원 펩티드도 사용할 수 있으며, 바람직하게는 WT1 유래의 암 항원 펩티드 (천연형 펩티드, 개변 펩티드) 를 들 수 있다. 구체적으로는, 서열번호: 27～45 에 기재된 암 항원 펩티드를 들 수 있고, 바람직하게는 서열번호: 27～30, 44, 45 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 들 수 있다.

(2) 본 발명의 발현 벡터를 유효성분으로 하는 헬퍼 T 세포의 유도제 (암 백신의 효능 증강제)

상기 본 발명의 펩티드뿐만 아니라, 당해 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터도 역시 헬퍼 T 세포 유도 활성을 가져, 암 백신의 효능 증강제의 유효성분으로 할 수 있다. 즉 본 발명은, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 유효성분으로서 함유하는 암 백신의 효능 증강제 (암 백신의 효능 증강제로서의 의약 조성물) 를 제공한다.

최근, 암 항원 펩티드 (CTL 에피토프) 와 헬퍼 펩티드 (헬퍼 에피토프) 를 연결시킨 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 생체 내에서 효율적으로 CTL 유도 활성을 갖는 것이 개시되어 있다. 예를 들어 [Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925] 에는, HBV 유래 HLA-A2 구속성 항원 펩티드 6종류, HLA-A11 구속성 항원 펩티드 3종류, 및 헬퍼 에피토프를 연결한 에피토프 펩티드를 코딩하는 DNA (미니진) 가 생체내 각각의 에피토프에 대한 CTL 을 효과적으로 유도한 사실이 기재되어 있다.

따라서, 상기 본 발명의 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 발현 벡터에 편입시킴으로써, 암 백신 효능 증강제의 유효성분으로 할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 암 백신 효능 증강제의 유효성분으로서 적용할 때에는 이하의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 세포내에 도입하는 방법으로서, 바이러스 벡터에 의한 방법 및 그 밖의 방법 (닛께이사이언스, 1994년 4월호, 20-45페이지, 월간약사, 36(1), 23-48 (1994), 실험의학 증간, 12(15), (1994), 및 이들의 인용문헌 등) 중 어떠한 방법도 적용 가능하다.

바이러스 벡터에 의한 방법으로는, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 수두바이러스, 폴리오바이러스, 심비스바이러스 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 본 발명의 DNA 를 편입시켜 도입하는 방법을 들 수 있다. 이들 중, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아바이러스 등을 사용한 방법이 특히 바람직하다.

그 밖의 방법으로서는, 발현 벡터를 직접 근육내에 투여하는 방법 (DNA 백신법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다. 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.

본 발명의 발현 벡터를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해서는, 당해 발현 벡터를 직접 체내에 도입하는 생체 내 (in vivo) 법, 및 인간으로부터 어느 한 종류의 세포를 채집하여 체외에서 발현 벡터를 그 세포에 도입하고 그 세포를 체내로 되돌리는 생체 외 (ex vivo) 법이 있다 (닛께이사이언스, 1994년 4월호, 20-45페이지, 월간약사, 36(1), 23-48 (1994), 실험의학 증간, 12(15), (1994), 및 이들의 인용문헌 등). 생체내 법이 보다 바람직하다.

생체내 법에 의해 투여하는 경우에는, 치료 목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육내 등에 투여할 수 있다. 생체내 법에 의해 투여하는 경우에는, 예를 들어, 액제 등의 제제형태를 취할 수 있으며, 일반적으로는 유효성분인 본 발명의 발현 벡터를 함유하는 주사제 등으로 하고, 필요에 따라서 관용되는 담체를 첨가해도 된다. 또, 본 발명의 발현 벡터를 함유하는 리포솜 또는 막융합 리포솜 (센다이 바이러스 (HVJ)-리포솜 등) 에 있어서는, 현탁제, 동결제, 원심분리 농축 동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.

제제 중의 본 발명의 발현 벡터의 함량은 치료 목적의 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적절히 조정할 수 있는데, 통상 0.0001㎎ 내지 100㎎, 바람직하게는 0.001㎎ 내지 10㎎ 의 본 발명의 발현 벡터를 수 일 내지 수 월에 1회 투여하는 것이 바람직하다.

이상과 같은 본 발명의 발현 벡터를 HLA-DRB1^*0405 양성 또한 WT1 양성인 환자에게 투여하면, 항원 제시 세포의 HLA-DRB1^*0405 항원에 본 발명의 펩티드가 제시되어 펩티드와 HLA-DRB1^*0405 항원과의 복합체를 인식하는 특이적 헬퍼 T 세포 (CD4 양성 T 세포) 가 유도 및 활성화되어서 CTL 의 분화 유도나 유지, 및 매크로파지 등의 이펙터 세포의 활성화 작용을 발휘할 수 있고, 따라서, 암 백신의 작용인 CTL 유도 활성을 증강시킬 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 유효성분으로 하는 암 백신 효능 증강제는, WT1 유전자의 발현 레벨 상승을 동반하는 암, 예를 들어 백혈병, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 림프종 등의 혈액성 암이나, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등과 같은 고형암의 예방 또는 치료를 위해 사용할 수 있다.

상기에 있어서 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 투여한 경우, 항원 제시 세포내에 취입되고, 그 후, 세포내 분해에 의해 생긴 개개의 항원 펩티드 중 헬퍼 펩티드는 MHC 클래스 II 항원 (HLA-DRB1^*0405) 과결합하고, 암 항원 펩티드는 MHC 클래스 I 항원과 결합하여 복합체를 형성하고, 그 복합체가 항원 제시 세포 표면에 고밀도로 제시된다. HLA-DRB1^*0405 항원과 헬퍼 펩티드와의 복합체를 헬퍼 T 세포가 인식하여 CTL 의 분화 유도나 유지, 및 매크로파지 등의 이펙터 세포의 활성화 작용을 통해 암 백신의 작용인 CTL 유도 활성을 더욱 증강시킨다. 한편, 암 항원 펩티드와 MHC 클래스 I 항원과의 복합체를 CTL 이 인식해서 증식되고, 암 세포를 파괴한다. 따라서, 본 발명의 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 유효성분으로 하는 의약 조성물은, 암 백신의 효능 증강제로서 사용됨과 함께 암 백신 그 자체로서 사용된다.

그리고 본 발명은, 서열번호: 1 에 기재된 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 펩티드로서, HLA-DRB1^*1502 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 HLA-DRB1^*1502 결합성 항원 펩티드는, 그 N 말단 아미노산 잔기 및/또는 C 말단 아미노산 잔기가 수식되어 있어도 되고, 또한 특정 아미노산 잔기가 개변되어 있어도 된다.

본 발명의 HLA-DRB1^*1502 결합성 항원 펩티드의 합성 및 활성 측정은, 상기 본 발명의 HLA-DRB1^*0405 결합성 항원 펩티드와 동일한 수법에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 HLA-DRB1^*1502 결합성 항원 펩티드는, 서열번호: 1 에 기재된 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 10～25 아미노산으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드이다. 바람직하게는, 인간 WT1 의 아미노산 서열에 있어서의 연속하는 13～17 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다.

본 발명은, 인간 WT1 이 HLA-DRB1^*1502 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 항원 펩티드 부분을 가지고 있음을 발견한 것에 근거를 둔다. MHC 클래스 II 결합 서열 예측 프로그램 ProPred (Bioinformatics 17: 1236, 2001) 를 사용하여 검색함으로써, HLA-DRB1^*1502 에 결합성을 갖는 것으로 예측되는 9 아미노산 부분 (MHC 클래스 II 분자의 펩티드 수용 홈 안에 결합할 수 있는 9 아미노산 부분) 을 검색했다. WT1 의 식별된 9-아미노산 부분의 예시는 서열번호: 46～서열번호: 56 에 나타냈다. 즉 본 발명의 HLA-DRB1^*1502 결합성 항원 펩티드의 구체예로는, 서열번호: 46～서열번호: 56 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 함유하고, 또한 HLA-DRB1^*1502 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 들 수 있다.

당해 펩티드는, 10～25 아미노산 정도의 길이인 것이 바람직하고, 13～17 아미노산 정도의 길이인 것이 보다 바람직하다. 보다 바람직한 형태로는, 서열번호: 50 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 10～25 아미노산 (바람직하게는 13～17 아미노산) 으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*1502 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 활성을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 더욱 바람직한 형태로는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 16～25 아미노산 (바람직하게는 16～17 아미노산) 으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드로서, HLA-DRB1^*1502 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 활성을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 또, 여기서 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열은, 서열번호: 50 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 16 아미노산으로 이루어지는 WT1 의 부분 펩티드이다.

더욱 바람직한 형태로는, 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 들 수 있다.

당해 WT1₃₃₂ _-347 펩티드는, 상기한 바와 같이, HLA-DRB1^*0405 분자뿐만 아니라 HLA-DRB1^*1502 에도 결합하는 무차별적 헬퍼 펩티드 (promiscuous helper peptide) 이다. 따라서 WT1₃₃₂ _-347 은, HLA-DRB1^*0405 를 갖는 환자뿐만 아니라 HLA-DRB1^*1502 를 갖는 환자에 대해서도 적용가능한 헬퍼 펩티드로, 환자의 적용 범위가 넓다는 관점에서 유용하다.

본 발명의 HLA-DRB1^*1502 결합성 항원 펩티드에 관한 에피토프 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체, 및 의약 조성물에 대해서는, 상기 본 발명의 HLA-DRB1^*0405 결합성 항원 펩티드의 경우와 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 하등 한정되지 않는다.

실시예 1

1. 수상 세포의 조제

HLA-DRB1^*0405 양성인 건강한 일반인 자원자로부터 채취한 혈액에서 Ficoll- Paque 의 밀도 구배 원심법에 의해 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 회수하였다. 얻어진 8×10⁶개의 PBMC 를 1% 의 AB 혈청을 함유하는 X-VIVO 15^TM 배양액 (Camblex 사) 2㎖ 에 현탁하여, 6웰 배양 플레이트에 파종하여 2시간 배양하였다. 배양 후, 부유 세포를 제거하고 Hanks 액으로 부착 세포를 세정했다. 부착 세포는, 1% 의 AB 혈청, 1000U/㎖ 의 IL-4 및 1000U/㎖ 의 GM-CSF 를 함유하는 X-VIVO 15^TM 배양액을 사용하여 배양하였다. 2일째와 4일째에 배양액의 절반량을 제거하고, 새로운 배양액을 첨가하였다. 6일째에 100U/㎖ 가 되도록 TNF-α 를 첨가하였다. 7일째의 세포를 수상 세포로서 실험에 사용하였다.

2. CD4 양성 T 세포 (헬퍼 T 세포) 의 조제

상기 (1) 과 동일한 일반인 자원자로부터 채취한 혈액을 사용하였다. RPMI 배양액에 의해 2배로 희석한 혈액 약 100㎖ 에 CD4 양성 T 세포 분리용 항체 칵테일의 로젯트셉 (RosetteSep: Stemcell 사) 을 첨가하여 실온에서 20분간 방치하였다. 그 후, Ficoll-Paque 의 밀도 구배 원심법에 의해 CD4 양성 T 세포를 회수하였다.

3. WT1 펩티드에 특이적인 CD4 양성 T 세포의 유도

WT1 단백질의 아미노산 서열 (NCBI 데이터 베이스 접근 번호 P19544, XP_034418, 서열번호: 1) 로부터 HLA-DRB1^*0405 에 결합할 가능성이 있는 펩티드를 예측 프로그램 ProPred (Bioinformatics 17: 1236, 2001) 를 사용하여 3종류 선택하고, 합성하였다. 그들의 서열은, WT1 아미노산 서열의 하기 위치에 존재하는 바와 같다:

제 172 위로부터 186 위의 PNHSFKHEDPMGQQG (WT1₁₇₂ _-186, 서열번호: 25),

제 225 위로부터 243 위의 NLYQMTSQLECMTWNQMNL (WT1₂₂₅ _-243, 서열번호: 26),

제 332 위로부터 제 347 위의 KRYFKLSHLQMHSRKH (WT1₃₃₂ _-347, 서열번호: 24).

상기 (1) 에서 조제한 수상 세포를 24웰 배양 플레이트에 1웰 당 3×10⁵개 파종하고, 서열번호: 24 의 펩티드를 50㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 4시간 배양 후, 25Gy 의 X 선을 조사하여 세포의 증식을 중지시켰다. 다음으로 (2) 에서 조제한 CD4 양성 세포를 1웰 당 3×10⁶개 첨가하여 수상 세포와 혼합 배양하였다. 배양액은, 1% 의 AB 혈청을 함유하는 X-VIVO 15^TM 배양액을 사용하였다. 배양 개시로부터 2일 걸러 한번씩 배양액을 절반량 교환하는 것과 함께 20U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시로부터 7일째, 14일째에 T 세포를 회수하고, 24웰 플레이트에 1웰 당 3×10⁶개로 조정하여 파종해서, 20㎍/㎖ 의 펩티드 (서열번호: 24) 로 펄스한 후 25Gy 의 X 선을 조사한 수상 세포를 3×10⁵개 첨가하여 혼합 배양을 실시하였다. 배양액은 1% 의 AB 혈청, 20U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 X-VIVO 15^TM 배양액을 사용하였다.

3회째 자극한 후의 T 세포를 회수하여, 96 웰 배양 플레이트에 1웰 당 3× 10⁴개 파종하였다. 또 20㎍/㎖ 의 펩티드 (서열번호: 24) 로 펄스한 후 25Gy 의 X 선을 조사한 수상 세포를 3×10⁴개 첨가하여 혼합 배양하였다. 음성 대조로서 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포를 T 세포와 혼합 배양한 군, 양성 대조로서 수상 세포 대신에 0.2% 의 PHA 를 첨가한 군을 설정하였다. 80시간 배양 후, 1웰 당 37kBq 의 [³H]-티미딘을 첨가하여 다시 16시간 배양을 실시했다. 세포에 취입된 [³H]-티미딘을 β-신틸레이션 카운터로 측정하였다. 결과를 도 1 에 나타내었다. WT1 의 제 332 위로부터 347 위의 펩티드 (WT1_332-347, 서열번호: 24) 로 자극한 CD4 양성 T 세포는, WT1₃₃₂ _-347을 펄스한 수상 세포와 혼합 배양하는 것에 의해 증식 반응을 나타내었다. 또한, 이 CD4 양성 T 세포는, 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포, 서열이 상이한 서열번호 25 또는 서열번호 26 의 펩티드를 펄스한 수상 세포와의 혼합 배양에서는 증식 반응이 확인되지 않았다. 이들의 결과로부터, 서열번호 24 의 WT1₃₃₂ _-347 은 항원 펩티드로서 특이적 CD4 양성 T 세포를 유도하는 것이 분명해졌다.

실시예 2

WT1 펩티드에 특이적인 CD4 양성 T 세포주의 확립

실시예 1 에 기재된 방법으로 조제한 수상 세포를 96웰 플레이트에 1웰 당 10⁴개씩 파종하고, 또 서열번호 24 의 펩티드 WT1₃₃₂ _-347 에 의해 유도한 CD4 양성 T 세포를 96웰 플레이트에 1웰 당 10³개씩 파종하였다. 배양액은, 1%의 AB 혈청, 20U/㎖ 의 IL-2, 5㎍/㎖ 의 PHA 를 함유하는 X-VIVO 15^TM 배양액을 사용하였다. 배양을 계속함으로써 CD4 양성 T 세포주를 확립하여, "G2 세포주"로 명명하였다. 펩티드를 펄스한 수상 세포에 대한 G2 세포주의 반응성을 실시예 1 과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다. G2 세포주는, WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 의 펩티드를 펄스한 수상 세포와 혼합 배양하는 것에 의해 증식 반응을 나타내었지만, 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포와의 혼합 배양에서는 증식 반응이 확인되지 않았다.

이들 결과로부터, G2 세포주는 WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 의 펩티드에 특이적인 CD4 양성 T 세포주임이 분명해졌다.

실시예 3

WT1 펩티드의 HLA -DR 분자에 대한 항원 제시

실시예 1 과 동일한 방법으로, HLA-DRB1^*0405 양성인 건강한 일반인 자원자로부터 채취한 혈액에서 Ficoll-Paque 의 밀도 구배 원심법에 의해 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 회수하였다. PBMC 를 24웰 플레이트에 1웰 당 10⁷개 파종하였다. 배양액은, 10%의 FCS, 55 μM 의 2ME 를 함유하는 RPMI 1640 배양액을 사용하였다. 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus : EBV) 를 함유하는 배양액을 첨가하여 4주간 배양해서, EBV 에 의해 트랜스폼된 B 세포주를 확립하여 "B-LCL(-) 세포"로 명명하였다. EBV 는, EBV 를 생성하는 세포주 B95-8 (JCRB 세포은행 No.9123) 의 배양 상청으로부터 조제하였다. B-LCL(-) 세포를 3×10⁷개/㎖ 로 조정하고, WT1 유전자를 발현하는 바이러스를 함유한 배양액을 첨가한 후, 다시 폴리프렌을 최종 농도가 8㎍/㎖ 가 되도록 첨가하여, 24웰 플레이트에 1㎖ 씩 파종하였다. 16시간 배양한 후에 새로운 배양액을 1㎖ 씩 첨가하여 배양을 계속하였다. G418 (네오마이신) 을 0.7㎍/㎖ 로 첨가하여 5～7일간 배양하고, 유전자가 도입된 세포를 선택하였다. 이렇게 해서 선택된 WT1 을 발현하는 B 세포주를 "B-LCL(+) 세포" 로 명명하였다. B-LCL(-) 세포와 B-LCL(+) 세포의 WT1 유전자의 발현량을 문헌 (Blood, 89: 1405, 1997) 에 따라서 RT-PCR 법으로 측정하였다. 양성 대조군인 K562 세포의 발현량을 1 로 환산하였다. 그 결과, B-LCL(-) 세포는 1.6×10^- ⁴ 인 데 대하여, B-LCL(+) 세포는 3.2 로, WT1 유전자가 고발현되어 있는 것이 확인되었다. B-LCL(+) 세포에 대한 G2 세포의 반응성을 실시예 2 와 동일한 방법으로 검토하였다. HLA-DR 구속성을 확인하기 위해서 G2 세포와 혼합하기 전에 B-LCL(+) 를 항 HLA-DR 항체로 처리한 군도 설정하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다. 펩티드 특이적 CD4 양성 T 세포주 G2 는 내인적으로 WT1 유전자를 발현하고 있는 B-LCL(+) 세포와의 혼합 배양에서 증식 반응을 나타내는 것, 또한, 이 반응이 항 HLA-DR 항체에 의해 저해되는 것이 나타났다. 이들 결과로부터, WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 의 펩티드가 세포내에서 WT1 단백질로부터 생성되어, 내인성으로 HLA-DR 분자에 항원 제시되고 있음이 나타났다.

실시예 4

WT1 ₃₃₂ _-347 펩티드 특이적인 CD4 양성 T 세포주 E04 . 1 의 확립

실시예 1 과 동일한 방법으로, HLA-DRB1^*0405 양성인 건강한 일반인 자원자로부터 채취한 혈액을 사용하여 수상 세포를 조제하여, 6일째에 첨가하는 TNF-α 는 최종농도 200IU/㎖ 가 되도록 하였다. CD4 양성 T 세포의 조제는, 수상 세포의 조제에 사용한 동일 일반인 자원자로부터 채취한 혈액을 사용하였다. CD4 양성 T 세포 분리용 RosetteSep (StemCell 사) 의 첨부 문서에 따라서 CD4 양성 T 세포를 분리하였다.

상기 수상 세포와 CD4 양성 T 세포를 사용하여, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해 WT1 펩티드 (서열번호 24: WT1₃₃₂ _-347) 에 특이적인 CD4 양성 T 세포를 유도하였다. 이 WT1₃₃₂ _-347 펩티드 특이적인 CD4 양성 T 세포를 한계 희석법에 의해 배양을 계속해서 CD4 양성 T 세포주 E04.1 을 확립하였다. 또, 한계 희석법에는, 피더 세포로서 실시예 1 에 기재된 방법으로 조제한 PBMC 를 X 선 조사 후에 1웰 당 1×10⁵개씩 파종하였다. 배양액은, 20IU/㎖ 의 IL-2 및 5㎍/㎖ 의 PHA 를 함유하는 X-VIVO 15^TM 배지를 사용하였다.

WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 수상 세포에 대한 E04.1 세포주의 증식 반응을, 실시예 1 과 동일한 방법 (단 [³H]-티미딘 첨가 후 18시간 배양) 에 의해 측정하였 다. 결과를 도 4 에 나타낸다. E04.1 세포는, WT1₃₃₂ _-347펩티드를 펄스한 수상 세포와 혼합 배양하는 것에 의해 증식 응답을 나타내지만, 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포와의 혼합 배양에서는 증식 응답이 확인되지 않음이 나타났다. 이상으로부터, E04.1 세포는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드 특이적인 CD4 양성 T 세포주임이 분명해졌다.

실시예 5

WT1 ₃₃₂ _-347 펩티드의 HLA -DR 에 대한 특이적 결합

실시예 4 에서 확립한 E04.1 세포를 96웰 배양 플레이트의 1웰 당 1×10⁴개씩 파종하였다. 실시예 3 에 있어서 HLA-DRB1^*0405 양성인 건강한 일반인 자원자의 혈액으로부터 확립한 B 세포주 B-LCL(-) 세포에 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 20㎍/㎖ 농도로 펄스한 후 X 선 조사하여, 96웰 배양 플레이트의 1웰 당 3×10⁴개 첨가하여 E04.1 세포와 혼합 배양하였다. 음성 대조군로서, 펩티드 펄스를 실시하지 않은 B-LCL(-) 세포를 E04.1 세포와 혼합 배양한 군도 설정하였다.

HLA-DR 구속성을 확인하기 위해, WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 후에 X 선 조사한 B-LCL(-) 세포를 20㎍/㎖ 의 항 HLA-DR 항체 (G46.6, BD ParMingen 사), 항 HLA-class I 항체 (G46-2.6, BD ParMingen 사), 항 HLA-DQ 항체 (SPVL3, Immunotech 사) 에 의해 30분간 처리한 후 E04.1 세포와 혼합 배양하는 군도 설정 하였다. 또한, 항체 처리의 음성 대조군로서, 항 mouse IgG 항체에 의해 동일하게 처리한 후에 E04.1 세포와 혼합 배양한 군도 설정하였다.

혼합 배양 후, 실시예 4 와 동일한 방법으로 E04.1 세포의 증식을 측정하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다. E04.1 세포는, WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 B-LCL(-) 세포와 혼합 배양하는 것에 의해 증식 반응을 나타내었다. 그러나, WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 B-LCL(-) 세포를 항 HLA-DR 항체로 처리한 경우, 증식이 억제되는 것으로 나타났다. 그리고, E04.1 세포는 다른 항체로 처리한 WT1₃₃₂ _-347 펩티드 펄스 B-LCL(-) 세포에서는 증식 응답을 나타내는 것, 펩티드 펄스하지 않은 B-LCL(-) 세포에서는 증식 응답이 확인되지 않은 것도 나타났다. 이상으로부터, WT1₃₃₂ _-347 펩티드는 HLA 분자 중에서도 HLA-DR 에 특이적으로 결합하여, WT1₃₃₂ _-347 펩티드 특이적 CD4 양성 세포주 E04.1 의 증식을 유도하는 것이 나타났다.

실시예 6

WT1 ₃₃₂ _-347 펩티드의 HLA - DRB1 ^* 0405 에 대한 특이적 결합

HLA-DRB1^*0405 양성 또는 음성인 건강한 일반인 자원자 혈액으로부터, 실시예 4 와 동일한 방법으로 PBMC 를 조제하였다. 이 PBMC 를 20㎍/㎖ 의 WT1₃₃₂ _-347 펩티드로 펄스한 후 X 선 조사하여, 96웰 배양 플레이트 1웰 당 3×10⁴개 파종하였다. 또, E04.1 세포를 96웰 배양 플레이트에 1웰 당 1×10⁴개 파종하여 혼합 배 양하였다. 또한, 음성 대조군로서 펩티드를 펄스하지 않은 PBMC 와 E04.1 세포를 혼합 배양한 군도 설정하였다.

혼합 배양 후, 실시예 4 와 동일한 방법으로 E04.1 세포의 증식을 측정하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다. 공여자 1 (HLA-DRB1^*0405/0803) 및 공여자 2 (HLA-DRB1^*0405/0101) 는 HLA-DRB1^*0405 양성으로, E04.1 세포는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 양 도너 유래의 PBMC 와의 혼합 배양에 의해 증식 응답을 나타내었다. 한편, 공여자3 (HLA-DRB1^*0101/1001) 및 공여자 4 (HLA-DRB1^*1201/0802) 는 HLA-DRB1^*0405 음성으로, WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 양 도너 유래의 PBMC 와의 혼합 배양에 있어서도 증식 응답이 확인되지 않았다. 또한, 펩티드 펄스하지 않은 PBMC 에서는 모두 증식 응답이 확인되지 않았다. 이상으로부터, WT1₃₃₂ _-347 펩티드는 다형(polymorphism)을 나타내는 HLA-DRB1 분자 중에서도 HLA-DRB1^*0405 에 특이적으로 결합하여, WT1₃₃₂ _-347 펩티드 특이적 CD4 양성 세포주 E04.1 의 증식을 유도하는 것이 나타났다.

실시예 7

WT1 ₃₃₂ _-347 펩티드의 HLA - DRB1 ^* 0405 에 대한 항원 제시

실시예 3 에 있어서 HLA-DRB1^*0405 양성인 건강한 일반인 자원자 혈액으로부 터 확립한 B 세포주 B-LCL(-) 와 WT1 발현 B 세포주 B-LCL(+) 를 X 선 조사 후, 96웰 배양 플레이트의 1웰 당 3×10⁴개, E04.1 세포를 1×10⁴개 파종하여 혼합 배양하였다. 그 후, 실시예 4 와 동일한 방법으로 E04.1 세포의 증식을 측정하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다. E04.1 세포는 WT1 발현 B 세포주 B-LCL(+) 와의 혼합 배양에 의해 증식 응답을 나타내고, WT1 을 발현하지 않는 B-LCL(-) 과의 혼합 배양에서는 증식 응답이 확인되지 않았다.

다음으로, 세포자멸사를 유도한 B-LCL(-) 또는 B-LCL(+) 세포 1×10⁵개를 실시예 4 와 동일한 방법에 의해 HLA-DRB1^*0405 양성인 건강한 일반인 자원자 혈액으로부터 유도한 수상 세포 3×10⁴개와 16시간 배양 후, 96웰 배양 플레이트의 1웰에 파종하여, 1×10⁴개의 E04.1 세포와 혼합 배양하였다. 그 후, 실시예 1 과 동일한 방법으로 E04.1 세포의 증식을 측정하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다. E04.1 세포는 세포자멸사시킨 B-LCL(+) 을 펄스한 수상 세포와의 혼합 배양에 의해 증식 응답을 나타내고, 세포자멸사시킨 B-LCL(-) 을 펄스한 수상 세포와의 혼합 배양에서는 증식 응답이 확인되지 않았다. 이상으로부터, WT1_332-347 펩티드는 B 는 B-LCL(+) 세포의 세포내에서 WT1 단백질로부터 분해된 후, HLA-DRB1^*0405 에 제시되어, E04.1 세포의 증식을 유도하는 것이 나타났다.

또, B-LCL(-) 및 B-LCL(+) 세포의 세포자멸사는 침투압 쇼크에 의해 유도하 였다. 1×10⁶개의 세포를 500㎕ 의 고침투압 배지 (0.5M sucrose, 10% w/v polyethylene glycol 1000, 10mM HEPES 를 함유하는 RPMI 배지, pH 7.2) 에 현탁한 후, 37℃ 에서 10분간 정치하였다. 그 후, 미리 37℃ 로 한 저침투압 배지 (60% RPMI, 40% water) 에 의해 30배 희석하여 37℃ 에서 2-3분간 정치하였다. 그 후, 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수해서 세포자멸사 유도 세포로서 사용하였다. 세포자멸사가 유도된 것은, 사(死)세포 염색용 형광 색소 (Propidium Iodide) 및 포스파티딜세린 결합 시약 (Annexin V) 에 의해 확인하였다.

실시예 8

WT1 ₃₃₂ _-347 펩티드에 의한 E04 .1 세포의 활성화

실시예 4 와 동일한 방법으로 HLA-DRB1^*0405 양성인 건강한 일반인 자원자 혈액으로부터 유도한 수상 세포에 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스하고, E04.1 세포와 혼합하여 24시간 배양하였다. 또한, 음성 대조군로서 펩티드를 펄스하지 않은 수상 세포와 E04.1 세포를 혼합하는 군도 설정하였다. 24시간 배양 후, 최종농도 10㎍/㎖ 가 되도록 Brefeldin A 를 첨가하여 E04.1 세포의 엑소사이토시스를 저해하였다. 다시 6시간 배양 후에, CD4 양성 T 세포를 회수하여 2% 포름알데히드를 함유하는 PBS 에 의해 세포를 고정하고, 0.1% 사포닌을 함유하는 permeabilization 용액으로 처리함으로써 항체의 세포막 투과성을 높였다. 그 후, 처리한 세포에 PE 표지 항 IFN-γ 항체 (BD PharMingen 사) 및 FITC 표지 항 IL-4 항체 (BD PharMingen 사) 를 반응시켜 세포 내부를 염색하였다. 유세포분석기를 사용하여 해석한 결과를 도 9 에 나타낸다. E04.1 세포는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 수상 세포와의 혼합 배양에 의해 Th-1 형 사이토카인 IFN-γ 의 생성이 강하게 유도되지만, Th-2 형 사이토카인 IL-4 의 생성은 유도되지 않는 것이 나타났다.

또한, 미자극 상태의 E04.1 세포에 항 CD4 항체 및 항 CXCR3 항체를 반응시켜서 염색한 후, 유세포분석기에 의해 해석하였다. 결과를 도 10 에 나타낸다. E04.1 세포는 90% 이상이 CD4 양성이면서 CXCR3 양성인 Th-1 형 CD4 양성 T 세포인 것이 나타났다. 또, CXCR3 은 케모카인 리셉터로 Th-1 형 면역 세포에 고발현하는 것이 알려져 있다.

이상으로부터, WT1₃₃₂ _-347 펩티드는 WT1₃₃₂ _-347 펩티드 특이적 CD4 양성 세포주 E04.1 세포를 활성화하여, Th-1 형 사이토카인인 IFN-γ 의 생성을 유도하는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터, WT1₃₃₂ _-347 펩티드는, CD4 양성 T 세포를 Th-1 형으로 분화ㆍ활성화시키는 것이 나타났다.

실시예 9

WT1 ₃₃₂ _-347 펩티드에 의한 WT1 특이적 CTL 의 유도 및 활성화의 증강

E04.1 세포를 확립한 동일 일반인 자원자로부터 (HLA-A^*2402/1101, DRB1^*0405/0803) 의 혈액을 사용하여, 실시예 4 와 동일한 방법으로 조제한 PBMC 를 24웰 배양 플레이트의 1웰 당 3×10⁴개 파종하고, WT1₂₃₅ _-243 펩티드 (서열번호: 27, 20㎍/㎖), WT1₂₃₅ _-243 펩티드 (20㎍/㎖)＋WT1₃₃₂ _-347 펩티드 (20㎍/㎖), WT1_235-243 펩티드 (20㎍/㎖)＋E04.1 세포 (1.5×10⁶개/well) 또는 WT1₂₃₅ _-243펩티드 (20㎍/㎖)＋WT1_332-347 펩티드 (20㎍/㎖)＋E04.1 세포 (1.5×10⁶개/well) 가 되도록 펩티드 및 E04.1 세포를 첨가하여 37℃ 에서 7일간 배양하였다. 배지에는 10% AB 혈청을 함유하는 X-VIVO 15^TM 배지를 사용하였다. 또, 여기서 사용한 WT1₂₃₅ _-243 펩티드는, HLA-A^*2402 구속성의 CTL 유도 활성을 갖는 암 항원 펩티드이다 (WO2004/024175호).

배양 7일 후에 세포를 회수하고, 절반량을 항 CD8 항체 (BD PharMingen 사) 및 WT1₂₃₅ _-243 펩티드/HLA-A^*2402 특이적 PE 표지 테라토마를 사용하여 염색하였다. 유세포분석기에 의한 해석 결과를 도 11(A-D) 에 나타낸다. PBMC 를 WT1₂₃₅ _-243 펩티드로 자극한 경우, CD8 양성이면서 WT1₂₃₅ _-243 펩티드/HLA-A^*2402 양성인 WT1₂₃₅ _-243 펩티드 특이적 CTL 전구체가 유도되는 것이 보고되어 있다 (Cancer Immunol Immunother, 51, p614-620 (2002)). PBMC 를 WT1₂₃₅ _-243 펩티드만으로 자극한 결과, WT1₂₃₅ _-243 펩티드 특이적 CTL 전구체의 비율은 0.12% 였다 (도 11-A). WT1₂₃₅ _-243 펩티드 및 WT1₃₃₂ _-347 펩티드로 자극한 결과, WT1₂₃₅ _-243펩티드 특이적 CTL 전구체의 비율은 0.69% 로 상승하였다 (도 11-B). WT1₂₃₅ _-243 펩티드 및 E04.1 세포로 자극한 결과, WT1_235-243펩티드 특이적 CTL 전구체의 비율은 4.51% 로 상승하였다 (도 11-C). WT1_235-243펩티드, WT1₃₃₂ _-347 펩티드 및 E04.1 세포로 자극한 결과, WT1₂₃₅ _-243 펩티드 특이적 CTL 전구체의 비율은 7.12% 로 상승하였다 (도 11-D).

다음으로, 회수한 나머지 세포 3×10⁵개를, WT1₂₃₅ _-243 펩티드로 펄스한 후에 30Gy 의 X 선을 조사한 수상 세포와 6시간 혼합 배양하였다. 배양 1시간 후, Brefeldin A 를 첨가하여 세포의 엑소사이토시스를 저해하였다. 또 5시간 배양 후, 세포를 항 CD8 항체 및 WT1₂₃₅ _-243 펩티드/HLA-A^*2402 특이적 PE 표지 테라토마를 사용하여 염색하였다. 그 후, 실시예 8 과 동일한 방법으로 세포에 고정 처리 및 투과 (permeabilization) 용액에 의한 세포막 투과성 항진 처리를 실시한 후, PE 표지 항 IFN-γ 항체에 의해 세포 내부를 염색하였다. 또 음성 대조군로서 APC-표지 항 마우스 IgG 항체 (BD PharMingen 사) 에 의한 염색도 실시하고, IFN-γ 양성이면서 마우스 IgG 양성인 세포 집단은 비특이적 염색으로서 제외시켰다.

결과를 도 12(A-D) 에 나타낸다. WT1₂₃₅ _-243 펩티드 특이적 CTL 전구체를 WT1₂₃₅ _-243 펩티드로 6시간 자극하면, CD8 양성이면서 WT1₂₃₅ _-243 펩티드/HLA-A^*2402 양 성이면서 또한 IFN-γ 양성인 활성화 WT1₂₃₅ _-243펩티드 특이적 CTL 이 유도된다. WT1₂₃₅ _-243 펩티드만으로 자극한 결과, 활성화 WT1₂₃₅ _-243 펩티드 특이적 CTL 의 비율은 17.0% 였다 (도 12-A). WT1₂₃₅ _-243 펩티드 및 WT1₃₃₂ _-347 펩티드로 자극한 결과, 활성화 WT1₂₃₅ _-243 펩티드 특이적 CTL 의 비율은 23.3% 로 상승하였다 (도 12-B). WT1₂₃₅ _-243펩티드 및 E04.1 세포로 자극한 결과, 활성화 WT1₂₃₅ _-243 펩티드 특이적 CTL 의 비율은 25.7% 로 상승하였다 (도 12-C). WT1₂₃₅ _-243 펩티드, WT1₃₃₂ _-347 펩티드 및 E04.1 세포로 자극한 결과, 활성화 WT1₂₃₅ _-243 펩티드 특이적 CTL 의 비율은 39.0% 로 상승하였다 (도 12-D).

이상의 결과로부터, WT1₃₃₂ _-347 펩티드는 WT1 특이적 CTL 전구체의 유도와 활성화를 증가시키는 헬퍼 펩티드임이 나타났다. 마찬가지로, E04.1 세포는 WT1 특이적 CTL 의 활성화를 증강시키는 헬퍼 T 세포이고, WT1₃₃₂ _-347 펩티드에 의해 그 헬퍼 기능이 대폭 상승하여 WT1 특이적 CTL 의 활성화를 증강시키는 것도 나타났다.

실시예 10

WT1 ₃₃₂ _-347 펩티드의 promiscuous 성 검토

WT1₃₃₂ _-347 펩티드가, 일본인에게 많은 것으로 알려진 HLA-DRB1^*1502 분자에도 결합하여, WT1₃₃₂ _-347 특이적 CD4 양성 T 세포를 유도할 수 있는 무차별적 헬퍼 펩티드 인지 여부를 해석하였다.

1. 실험방법

1) 수상 세포 (DC) 의 제작

건강한 일반인 혈액 제공자 (HLA-DRB1^*1502/1403) 의 말초혈로부터 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 분리하여 1% AB 형 혈청 (Nabi, Miami, FL), X-VIVO 15 배양액 (Cambrex 사) 을 사용해서 6웰 플라스틱 플레이트에 1×10⁷cells/well 파종하여 2시간 배양하였다. 그 후, 부유 세포를 제거하고, 남은 부착 세포를 1000IU/㎖ IL-4 (PeproTech 사), 1000IU/㎖ GM-CSF (PeproTech 사), 1% AB 형 혈청, X-VIVO 15 배양액에 의해 배양하였다. 2일째와 4일째에 배양 교환을 실시하여 IL-4 와 GM-CSF 를 첨가하고, 6일째에 TNF-α 를 100IU/㎖ 첨가하여, 수상 세포를 성숙화시켰다.

2) WT1₃₃₂ _-347 특이적 CD4 양성 T 세포의 유도

동일 혈액 제공자로부터 CD4 양성 T 세포 분리용 RosetteSep (StemCell 사) 을 사용하여 CD4 양성 T 세포를 분리하였다. 24웰 플레이트의 각 웰에 이 CD4 양성 T 세포 (3×10⁶개) 를 넣고, 이것을 WT1₃₃₂ _-347 펩티드 20㎍/㎖ 로 펄스하여 25Gy 의 방사선을 조사한 자기 수상 세포 (3×10⁵개) 에 의해 자극하여, 자극한 다 음 날에 IL-2 를 20IU/㎖ 첨가하였다. 자극된 CD4 양성 T 세포는, 마찬가지로 1주 걸러 한번씩 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 20㎍/㎖ 로 펄스한 수상 세포를 사용하여 자극하였다. 또한, 2회째 자극 이후에는 1일 걸러 한번씩 IL-2 가 함유되어 있는 배지로 배지 교환을 실시하였다. 합계 3회의 자극에 의해 유도된 CD4 양성 T 세포를 실험에 사용하였다.

3) 증식 검정

증식 검정은 [³H]-티미딘 혼입법에 의해 실시하였다. 펩티드에 의해 자극, 유도된 CD4 양성 T 세포 (3×10⁴개; responder) 와, WT1₃₃₂ _-347, WT1₁₇₂ _-186, WT1₂₂₅ _- ₂₄₃ 의 각 펩티드를 각각 펄스하여 방사선 조사한 PBMC (1×10⁵개) 를 자극제로 하여 96웰 플레이트에서 공(共)배양하였다. 또한, 네거티브 대조군로서 펩티드를 펄스하지 않은 DC(-) 를 사용하였다. 공배양하고 80시간 후에 [³H]-티미딘 (Amersham Biosciences 사) 을 37kBq/well 첨가하고, 다시 16시간 인큐베이션하여 β 신틸레이션 카운터에 의해 측정하였다. 단위는 "분 당 계수 (cpm)" 로 나타내고, 모든 분석은 3 벌식으로 (triplicate) 실시하였다.

4) 플로우 사이토메트리에 의한 사이토카인 생성의 해석

증식 검정과 마찬가지로 CD4 양성 T 세포와 자극제를 공배양하고, 2시간 후 Brefeldin A 를 첨가하였다. 그 4시간 후에 세포를 회수해서 고정 및 침투를 실시하고, FITC 표지 항 IL-4항체 (BD Pharmingen 사) 와 PE 표지 항 IFN-γ 항체 (BD Pharmingen 사) 로 염색하여, 플로우 사이토메트리를 실시하였다.

5) ELISA 법

자가 PBMC (6×10⁵개)에 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 것과 하지 않은 것을 준비하여, 이들을 25Gy 로 방사선 조사해서 각각을 WT1₃₃₂ _-347 에 의해 유도한 CD4 양성 T 세포 (6×10⁵개) 와 공배양하였다. 그리고 72시간 배양 후에 상청을 회수하고, ELISA 에 의해 상청 300㎕ 중의 IL-4, IFN-γ 를 측정하였다.

6) TCR 레퍼토리 검정

TCR Vβ repatoire Kit (BECKMAN COULTER 사), FACsort (BECTON DICKINSON 사) 를 사용하여, WT1₃₃₂ _-347 펩티드에 의해 유도한 CD4 양성 T 세포의 T 세포 수용체의 β 쇄의 레퍼토리를 해석하였다.

2. 실험 결과

건강한 일반인 혈액 제공자 (HLA-DRB1^*1502/1403) 로부터 분리한 CD4 양성 T 세포를 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 자기 수상 세포를 사용하여 합계 3회 자극하였다. 이것에 의해 유도된 CD4 양성 T 세포의 펩티드 특이성을 WT1₁₇₂ _-186, WT1₂₂₅ _-243, WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 의 각 펩티드를 사용하여 증식 검정에 의해 검토하였다. 그 결과, WT1₃₃₂ _-347 펩티드에 의해 유도된 CD4 양성 T 세포는, 펩티드가 없는 경우나 WT1₁₇₂ _-186 이나 WT1₂₂₅ _- ₂₄₃ 의 자극에 의해서는 증식하지 않았지만, WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 로 자극하면 약 10배로 증식하였다 (도 13). 이 결과로부터, 유도된 CD4 양성 T 세포는 WT1₃₃₂ _-347 특이성을 갖는 것이 나타났다.

이 WT1₃₃₂ _-347 펩티드에 의해 유도된 CD4 양성 T 세포의 TCR 레퍼토리 검정을 실시하였다. 결과를 도 14 에 나타낸다. Vβ3 을 갖는 것과 Vβ20 을 갖는 것이 각각 전체의 10% 존재하여, 도미넌트로 되어 있었다.

이들 도미넌트로 되어 있는 CD4 양성 T 세포를 소팅에 의해 분리하여, Vβ3 을 갖는 것을 E15.1 서브라인, Vβ20 을 갖는 것을 E15.2 서브라인 (subline) 으로 명명하였다. 이 2개의 세포주 중에서 E15.2 서브라인 쪽이 보다 WT1₃₃₂ _-347 펩티드에 대한 반응성이 높았다 (도 15).

그리고, E15.2 서브라인 을 WT1₃₃₂ _-347 펩티드에 의해 자극하여 분비되는 IL-4 와 IFN-γ 를 세포내 염색법에 의해 측정하였다. 그 결과, Th-2 형 사이토카인인 IL-4 이 아니라, Th-1 형 사이토카인인 IFN-γ 를 현저하게 생성하는 것이 분명해졌다 (도 16). 또한, E15.2 서브라인의 WT1₃₃₂ _-347 특이적인 증식 반응은 WT1_332- ₃₄₇ 의 농도 의존성이었다 (도 17). 이들 결과로부터, E15.2 서브라인은 WT1₃₃₂ _-347 특이적 Th-1 형 CD4 양성 T 세포주인 것이 분명해졌다.

이상과 같이, HLA-DRB1^*1502 분자 양성이면서 HLA-DRB1^*0405 분자 음성인 건 강한 일반인의 CD4 양성 T 세포로부터, WT1₃₃₂ _-347 특이적인 Th-1 형 CD4 양성 T 세포주를 유도할 수 있었다. 이것에 의해, 이 CD4 양성 T 세포가 세포성 면역에 관여하여, 사이토카인을 분비함으로써 CTL 을 활성화할 수 있는 것으로 생각된다. 이와 같이, CTL 을 활성화하는 HLA-class I 구속성 WT1 펩티드 (암 항원 펩티드) 에 WT1₃₃₂ _- ₃₄₇ 를 병용함으로써, 항종양 효과를 더욱 증강시킬 수 있음이 나타났다.

다음으로 HLA-DRB1^*1502 양성인 건강한 일반인 (1502/0901) 1명과, HLA-DRB1^*1502 음성인 건강한 일반인 (1302/0803) 1명의 말초혈 단핵구에 WT1₃₃₂ _-347 펩티드를 펄스한 것을 자극제로 하여 E15.2 서브라인과 공배양하고, WT1₃₃₂ _-347 특이적인 증식을 증식 검정에 의해 조사하였다. 결과를 도 18 에 나타낸다. HLA-DRB1^*1502 양성인 건강한 일반인에서는 WT1₃₃₂ _-347 특이적인 증식이 보였지만, HLA-DRB1^*1502 음성인 건강한 일반인에서는 증식은 보이지 않았다 (도 18). 이러한 점에서, E15.2 서브라인 의 WT1₃₃₂ _-347 특이적인 증식은 HLA-DRB1^*1502 구속성인 것이 나타났다.

이상과 같이, WT1₃₃₂ _-347 펩티드 특이적인 Th-1 형 CD4 양성 T 세포주인 E15.2 서브라인 을 사용한 해석에 의해, WT1₃₃₂ _-347 은 일본인에게 가장 많은 HLA-DRB1^*0405 분자뿐만 아니라, 일본인에게 3번째로 많은 HLA-DRB1^*1502 분자에도 결합하는 무차별적 헬퍼 펩티드 임이 나타났다.

본 발명에 의해, WT1 유래의 HLA-DRB1^*0405 결합성 항원 펩티드, 당해 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이들 펩티드나 폴리뉴클레오티드를 함유하는 헬퍼 T 세포의 유도제 등이 제공된다. 본 발명의 헬퍼 T 세포의 유도제는 암 백신의 효능 증강제로서 유용하다. 본 발명의 암 백신의 효능 증강제는, HLA-DRB1^*0405 양성인 많은 암 환자에게 적용가능하고, 특히 WT1₃₃₂ _-347 백신의 효능 증강제로서 유용하다.

<110> International Institute of Cancer Immunology, Inc. <120> HLA-DR-BINDING ANTIGEN PEPTIDE DERIVED FROM WT1 <130> 664758 <140> 2003-375603 <141> 2003-11-05 <160> 56 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly 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Lys Leu Ser His Leu Gln Met His 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 12 Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 13 Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 14 Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 15 Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 16 Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 17 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 18 Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 19 Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 20 Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 21 Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 22 Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 23 Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 24 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 25 Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly 1 5 10 15 <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 26 Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln 1 5 10 15 Met Asn Leu <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 27 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 28 Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 29 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 30 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 31 Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 32 Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide Xaa at 1 position stands for Abu. <400> 33 Xaa Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 34 Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 35 Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 36 Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 37 Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 38 Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 39 Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 40 Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 41 Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 42 Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide Xaa at 5 position stands for Abu. <400> 43 Arg Tyr Pro Ser Xaa Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 44 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 45 Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 46 Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 47 Leu Val Arg His His Asn Met His Gln 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 48 Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 49 Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 50 Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 51 Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 52 Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 53 Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 54 Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 55 Val Arg His His Asn Met His Gln Arg 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 56 Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser 1 5

Claims

서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 24 에 기재된 아미노산 서열의 제 3 위, 제 6 위, 제 8 위 및 제 11 위의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 아미노산 잔기가 각각 다음 중에서 선택되는 어느 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열으로 이루어지고, HLA-DRB1^*0405 에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드:

제 3 위: 페닐알라닌, 트립토판, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌,

제 6 위: 발린, 이소류신, 메티오닌, 아스파르트산, 글루탐산,

제 8 위: 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 글루타민, 라이신, 아스파르트산,

제 11 위: 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 24에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
제 1 항에 기재된 펩티드와 암 항원 펩티드를 함유하는 펩티드.
제 1 항에 기재된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 3 항에 기재된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 4 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
제 5 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
제 6 항에 기재된 발현 벡터를 함유하는 세포.
제 7 항에 기재된 발현 벡터를 함유하는 세포.
제 8 항에 기재된 세포를, 펩티드가 발현가능한 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항에 기재된 펩티드의 제조방법.
제 9 항에 기재된 세포를, 펩티드가 발현가능한 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 제 3 항에 기재된 펩티드의 제조방법.
제 1 항에 기재된 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
삭제
약학적으로 허용되는 담체와 함께, 제 3 항에 기재된 펩티드, 제 7 항에 기재된 발현 벡터, 또는 제 9 항에 기재된 세포를 함유하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
제 1 항에 기재된 펩티드와 암 항원 펩티드를 조합하여 이루어지는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
제 1 항에 기재된 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물 및 암 항원 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물을 함유하는, 암의 치료 또는 예방을 위한 키트.
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