CZ20011144A3

CZ20011144A3 - Prostředky a způsoby pro WT1 specifickou imunoterapii

Info

Publication number: CZ20011144A3
Application number: CZ20011144A
Authority: CZ
Inventors: Alexander Gaiger; Martin Cheever
Original assignee: Corixa Corporation; Alexander Gaiger
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2002-06-12
Also published as: WO2000018795A2; CN1336935A; MXPA01003344A; DE69938970D1; NO20011613L; CA2349442C; HUP0103598A2; PL201881B1; EP1117687B1; JP4235984B2; NO325839B1; JP4243792B2; NZ510600A; KR100752065B1; JP2008069172A; IL142216A; JP2002525099A; JP2007001984A; AU6407899A; CA2349442A1

Description

Prostředky a způsoby pro WT1 specifickou imunoterapii

Oblast vynálezu

Předkládaný vynález se týká obecně imunoterapie maligních onemocnění, jako jsou leukemie a karcinomy. Přesněji se vynález týká prostředků pro vyvolání nebo zesílení imunitní reakce na WT1 a použití takových prostředků pro prevenci a/nebo léčbu maligních onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Nádory a leukemie jsou významným zdravotním problémem jak ve Spojených Státech Amerických, tak v celém světě. Ačkoliv v detekci a léčbě takových onemocnění byly učiněny významné pokroky, není v současnosti dostupná žádná vakcína ani jiná obecně úspěšná metoda léčby nebo prevence nádorů a leukémií. Léčba takových onemocnění v současnosti spočívá v kombinaci časné diagnosy a agresivní terapie, která zahrnuje chirurgickou léčbu, radioterapii, chemoterapii a hormonální terapii. Léčba pro určitý nádor je vybrána podle různých prognostických parametrů, včetně analýzy specifických nádorových markérů. Nicméně, použití zavedených markérů často vede k výsledku, který je obtížně interpretovatelný a stále je ještě u mnoha pacientů s nádorovým onemocnění pozorována vysoká mortalita.

Imunoterapie má potenciál pro zlepšení léčby nádorů a leukémií a pro zlepšení přežívání. Nová data prokazují, že leukemie může být vyléčena imunoterapii spolu s transplantací kostní dřeně (například infusí lymfocytů od dárce). Taková léčba může obsahovat vyvolání nebo zesílení imunitní odpovědi na antigeny asociované s nádorem (TAA). Nicméně, dosud je známo relativně málo TAA a vyvolání imunitní reakce proti takovým antigenům nepřineslo, až na několik výjimek, žádný terapeutický přínos.

Proto v oboru existuje potřeba zlepšených způsobů pro prevenci a terapii nádorů a leukémií. Předkládaný vynález naplňuje tuto potřebu a dále poskytuje další související výhody.

Podstata vynálezu

Stručně řečeno poskytuje předkládaný vynález prostředky a způsoby pro diagnostiku a terapii onemocnění jako je leukemie a nádory. V jednom aspektu vynález poskytuje polypeptidy obsahující imunogenní část přirozeného WT1, nebo jeho varianty, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena. V některých určitých provedeních polypeptid obsahuje ne více než 16 sousedních aminokyselinových zbytků přirozeného WT1 polypeptidů. V jiných provedeních polypeptid obsahuje imunogenní část aminokyselinových zbytků 1-174 přirozeného WT1 polypeptidů nebo jeho varianty, kde polypeptid obsahuje ne více než 16 následujících aminokyselinových zbytků přítomných v aminokyselinách 175-449 přirozeného WT1 polypeptidů. Imunogenní část se výhodně váže na molekuly MHC třídy I a/nebo II. V některých provedeních polypeptid obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující (a) sekvence citované v jakékoliv z tabulek II - XLVI; (b) varianty výše uvedených sekvencí, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena; a (c) mimetik polypeptidů uvedených výše, která jsou taková, že jejich ···· · · · · · · · • · · * ··· · * schopnost reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena.

V jiných provedeních obsahuje polypeptid sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující (a) ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 34), GATLKGVAA (SEQ ID NO: 88), CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 49 a 258), SCLESQPTI (SEQ ID NO: 199 a 296), SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198), NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147 a 284), ALLPAVSSL (SEQ ID NO: 35 a 255), RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185 a 293); (b) varianty výše uvedených sekvencí, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena; a (c) mimetik polypeptidů uvedených výše, která jsou taková, že jejich schopnost reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena. Mimetika mohou obsahovat aminokyseliny v kombinaci s jedním nebo více mimetiky aminokyselin nebo se může jednat o zcela nepeptidová mimetika.

V dalších aspektech předkládaný vynález poskytuje polypeptidy obsahující variantu imunogenní části WT1 proteinu, kde varianta se liší od imunogenní části substitucemi mezi aminokyselinovými pozicemi 1 a 3 v imunogenní části, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena.

Předkládaný vynález dále poskytuje WT1 polynukleotidy, které kódují WT1 polypeptidy, jak byly popsány výše.

V dalších aspektech poskytuje předkládaný vynález farmaceutické prostředky a vakcíny. Farmaceutické prostředky

• · · · ··· · · · · · · · mohou obsahovat polypeptid nebo mimetikum, jak byly popsány výše, a/nebo jeden nebo více ze skupiny zahrnující: (i) WT1 polynukleotidy; (ii) protilátky nebo jejich vazebné fragmenty pro antigen, které se specificky váží na WT1 polypeptid; (iii) T-lymfocyty, které specificky reagují s WT1 polypeptidem; nebo (iv) buňky prezentující antigen, které exprimují WT1 polypeptid, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo přísadou. Vakcíny obsahují polypeptid jak byl popsán výše, a/nebo jeden nebo více ze skupiny zahrnující: (i) WT1 polynukleotid; (ii) buňky prezentující antigen, které exprimují WT1 polypeptid; nebo (iii) anti-idiotypové protilátky, a nespecifický zesilovač imunitní odpovědi. V některých provedeních je v takových farmaceutických prostředcích a vakcínách použit WT1 polypeptid obsahující méně než 23 sousedních aminokyselinových zbytků, lépe méně než 17 zbytků přirozeného WT1 polypeptidu. Zesilovačem imunitní odpovědi může být adjuvans. Výhodně zesiluje zesilovač imunitní odpovědi reakci T-lymfocytů.

Předkládaný vynález dále poskytuje pro zesílení nebo indukci imunitní reakce u pacienta, při kterém je pacientovi podán farmaceutický prostředek nebo vakcína, jak byly popsány výše. V některých provedeních je pacientem člověk.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob pro inhibici vzniku maligního onemocnění u pacienta, při kterém je pacientovi podán farmaceutický prostředek nebo vakcína, jak byly popsány výše. Mezi maligní onemocnění patří, například, leukemie (například akutní nryeloidní, akutní lymfatická a chronická myeloidní) a nádory (například karcinom prsu, plic, štítné žlázy nebo gastrointestinální traktu nebo melanom). Pacient může - ale nemusí - být postižen maligním onemocněním a podání farmaceutického prostředku nebo vakcíny může inhibovat vznik takového onemocnění, nebo může inhibovat progresi a/nebo metastasování existujícího onemocnění.

Předkládaný vynález dále poskytuje, v jiných aspektech, způsoby pro odstraňování buněk exprimujících WT1 z kostní dřeně a/nebo periferní krve nebo jejích frakcí, který zahrnuje kontaktování kostní dřeně, periferní krve a nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve s T-lymfocyty, které specificky reagují s WT1 polypeptidem, kde krok kontaktování je proveden za podmínek a doby dostatečných pro provedení odstranění WT1 pozitivních buněk, za dosažení méně než 10%, lépe méně než 5%, lépe méně než 1% takových buněk vzhledem k počtu myeloidních nebo lymfatických buněk v kostní dřeni, periferní krvi nebo jejich frakci. Kostní dřeň, periferní krev nebo jejich frakce mohou být získány od pacienta postiženého onemocněním spojeným s expresí WT1, nebo mohou být získány od člověka nebo jiné savce nepostiženého takovým onemocněním.

V příbuzném aspektu vynález poskytuje způsob po inhibici vzniku maligního onemocnění a pacienta, při kterém je pacientovi podána kostní dřeň, periferní krev nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve, jak byly popsány výše. Taková kostní dřeň, periferní krev nebo frakce může být autologní nebo může být získána od příbuzného nepříbuzného člověka nebo jiného savce (například může být syngenní nebo allogenní).

V jiných aspektech vynález poskytuje způsoby pro stimulaci (neboli priming”) a/nebo expandování T-lymfocytů, který zahrnuje kontaktování T-lymfocytů s WT1 polypeptidem za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění stimulace a/nebo expanze T-lymfocytů. Takové T-lymfocyty mohou být autologní, allogenní, syngenní nebo nepříbuzné WT-1 specifické T-lymfocyty, a mohou být stimulovány in vivo nebo in vitro.

Expandované T-lymfocyty mohou být, v některých provedeních, přítomny v kostní dřeni, periferní krvi nebo její frakci a mohou - ale nemusí - být klonální. V některých provedeních mohou být T-lymfocyty během stimulace a/nebo expanze přítomny u savce. WT1-specifické T-lymfocyty mohou být použity, například, v infusi lymfocytů od dárce.

V příbuzném aspektu vynález poskytuje způsob po inhibici vzniku maligního onemocnění a pacienta, při kterém jsou pacientovi podány T-lymfocyty připravené způsobem popsaným výše. Takové T-lymfocyty mohou být, v některých provedeních, autologní, syngenní nebo alogenní.

Předkládaný vynález dále poskytuje, v jiných aspektech, způsoby pro sledování účinnosti imunizace nebo terapie maligních onemocnění spojených s expresí WT1 u pacienta. Takové způsoby jsou založeny na sledování protilátkové, CD4+ T-lymfocytární a/nebo CD8+ T-lymfocytární reakce u pacienta. V některých provedení takové způsoby obsahují kroky: (a) inkubaci prvního biologického vzorku s: (i) WT1 polypeptidem; (ii) polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WT1 polypeptid, kde první biologický vzorek je získán od pacienta před terapií nebo imunizací a kde inkubace je provedena za podmínek a dobu dostatečnou pro tvorbu imunokomplexů; (b) detekci imunokomplexů vytvořených mezi WT1 polypeptidem a protilátkami v biologickém vzorku, které se specificky váží na WT1 polypeptid; (c) opakování kroků (a) a (b) za použití druhého biologického vzorku získaného od stejného pacienta po terapii nebo imunizaci; a (d) srovnání počtu imunokomplexů detekovaných v prvním a druhém biologickém vzorku a podle toho sledování účinnosti terapie nebo imunizace u pacienta.

·· ·· ··· ·· ·· ···

V některých provedeních výše uvedeného způsobu zahrnuje krok detekce (a) inkubaci imunokomplexů s detekčním činidlem, které se váže na imunokomplexy, kde toto detekční činidlo obsahuje reportérovou skupinu; (b) odstranění nenavázaného detekčního činidla; a (c) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti reproterové skupiny. Detekční činidlo může obsahovat, například, druhou protilátku nebo její vazebný fragment pro antigen, která se váže na protilátku, která se specificky váže na WT1 polypeptid nebo molekulu jako je Protein A: V jiných provedeních je reporterová skupina navázána na WT1 polypeptid a krok detekce zahrnuje odstranění nenavázaného WTl polypeptidů a potom detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti reportérové skupiny.

V jiných aspektech, způsoby pro sledování účinnosti imunizace nebo terapie maligních onemocnění spojených s expresí WT1 u pacienta mohou zahrnovat kroky: (a) inkubaci prvního biologického vzorku s jedním nebo více z následující skupiny:

(i) WTl polypeptidem; (ii) polynukleotidem kódujícím WTl polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WTl polypeptid, kde první biologický vzorek obsahuje CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocyty a je získán od pacienta před terapií nebo imunizací a kde inkubace je provedena za podmínek a dobu dostatečnou pro specifickou aktivaci,proliferaci a/nebo lýzu T-lymfocytů; (b) detekci aktivace, proliferace a/nebo lýzy T-lymfocytů; (c) opakování kroků (a) a (b) za použití druhého biologického vzorku obsahujícího CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocyty, kde druhý biologický vzorek je získán od stejného pacienta po terapii nebo imunizaci; a (d) srovnání úrovně aktivace, proliferace a/nebo lýzy T-lymfocytů v prvním a druhém biologickém vzorku a podle toho sledování účinnosti terapie nebo imunizace u pacienta.

• · ·· · ·· ·· • · · · ···· · · · • · · · ··· · ·

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro inhibici vývoje maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta, které zahrnují kroky: (a) inkubaci CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny: (i) WT1 polypeptidem; (ii) polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WT1 polypeptid, tak, že dojde k proliferaci T-lymfocytů; a (b) podání účinného množství proliferovaných T-lymfocytů pacientovi, takže dojde k inhibici vzniku nádorového onemocnění u pacienta. V některých provedeních může být krok inkubace T-lymfocytů opakován jednou nebo vícekrát.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro inhibici vývoje maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta, které zahrnují kroky: (a) inkubaci CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny: (i) WT1 polypeptidem; (ii) polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WT1 polypeptid, tak, že dojde k proliferaci T-lymfocytů; a (b) klonování jedné nebo více proliferujících buněk; a (c) podání účinného množství klonovaných T-lymfocytů pacientovi.

V jiných aspektech vynález poskytuje způsoby pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta, které zahrnují kroky: (a) inkubaci CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny: (i) WT1 polypeptidem; (ii) polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WT1 polypeptid; a (b) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti specifické aktivace T-lymfocytů, z čehož je možno určit přítomnost nebo ·· ·· 4 4444 • · · · 444 4 4 *· • ΦΦΦ · · ·44 nepřítomnost maligního onemocnění spojeného s expresí WT1.

V některých provedeních krok detekce zahrnuje detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti proliferace T-lymfocytů.

V jiných aspektech vynález poskytuje způsoby pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta, které zahrnují kroky: (a) inkubaci biologického vzorku získaného od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny: (i) WT1 polypeptidem; (ii) polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WT1 polypeptid, kde inkubace je provedena za podmínek a dobu dostatečnou pro tvorbu imunokomplexů; (b) detekci imunokomplexů vytvořených mezi WT1 polypeptidem a protilátkami v biologickém vzorku, které se specificky váží na WT1 polypeptid; z čehož je možno určit přítomnost nebo nepřítomnost maligního onemocnění spojeného s expresí WT1.

Tyto a jiné aspekty předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu a připojených výkresů. Všechny citace jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje srovnání sekvence myšího (MO) a lidského (HU) WT1 proteinu (SEQ ID NO: 320 a 319, v příslušném pořadí).

Obr. 2 je westernová hybridizace ilustrující detekci WT1 specifických protilátek u pacienta s hematologickou malignitou (AML). Dráha 1 ukazuje markéry molekulové hmotnosti; dráha 2 ukazuje pozitivní kontrolu (WT1 pozitivní lidská leukemická buněčná linie imunosrážená protilátkou specifickou pro WT1); dráha 3 ukazuje negativní kontrolu (WT1 pozitivní buněčná linie • « · * · · · 9 • · · · · · · ··· ·· ······ ··· ······ 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 99 9 9

• 9

9« •· •· imunosrážená myším sérem); a dráha 4 ukazuje WT1 pozitivní buněčnou linii imunosráženou sérem pacientů s AML. Pro dráhy

2-4 byl imunoprecipitat separován gelovou elektroforesou a byl sondován protilátkou specifickou pro WT1.

Obr. 3 je westernová hybridizace ilustrující detekci WT1 specifické protilátkové odpovědi u B6 myší imunizovaných TRAM-C, WT1 pozitivní nádorovou buněčnou linií. Dráhy 1, 3 a 5 ukazují markéry molekulové hmotnosti, a dráhy 2, 4 a 6 ukazují WT1 specifickou pozitivní kontrolu (N180, Santa Cruz Biotechnology, polypeptid tvořený 180 aminokyselinami N-koncového regionu WT1 proteinu, migrující při westernově peřnosu při 52 kDa). Použitou primární protilátkou byla WT180 v dráze 2, sérum neimunizovaných B6 myší v dráze 4 a sérum imunizovaných B6 myší v dráze 6.

Obr. 4 je westernová hybridizace ilustrující detekci WT1 specifické protilátkové odpovědi u myší imunizovaných representativními WT1 peptidy. Dráhy 1, 3 a 5 ukazují markéry molekulové hmotnosti, a dráhy 2, 4 a 6 ukazují WT1 specifickou pozitivní kontrolu (N180, Santa Cruz Biotechnology, polypeptid tvořený 180 aminokyselinami N-koncového regionu WT1 proteinu, migrující při westernově peřnosu při 52 kDa). Použitou primární protilátkou byla WT180 v dráze 2, sérum neimunizovaných B6 myší v dráze 4 a sérum imunizovaných B6 myší v dráze 6.

Obr. 5A až 5C jsou grafy ilustrující stimulaci proliferativní odpovědi T-lymfocytů u myší imunizovaných representativními WT1 peptidy. Testy inkorporace thymidinu byly provedeny za použití jedné T-lymfocytární linie a dvou různých klonů, jak jsou uvedeny, a výsledky jsou vyjádřeny jako cpm. Kontroly uvedené na ose x jsou: bez antigenu (bez Ag) a B6/medium; použitými antigeny byly p6-22 lidský (pl), pll7-139 (p2) nebo p244-262 • · *· · · ♦ ·· • · · · ···· ··· ···· · · · ·· lidský (p3).

Obr. 6A a 6B jsou histogramy ilustrující stimulaci proliferativní odpovědi T-lymfocytů u myší imunizovaných representativními WT1 peptidy. Tři týdny po třetí imunizaci byly buňky sleziny od myší, které byly očkovány Vakcínou A nebo Vakcínou B, kultivovány za přítomnosti media samotného úmedium) nebo buněk sleziny a media (B6/bez antigenů), B6 buňkami pulsovanými peptidy p6-22 (p6) , pll7-139 (pll7), p224-262 (p244) (Vakcína A, obr. 6A) nebo p287-301 (p287), p299-313 (p299), p421-435 (p421) (vakcína B, obr. 6B) a buňkami sleziny pulsovanými irelevantním kontrolním peptidem (irelevantní peptid) v koncentraci 25 ug/ml a po 96 hodinách byly testovány na proliferaci podle inkorporace ³H-thymidinu. Sloupce představují stimulační index (SI), který je vypočítán jako průměr experimentálních jamek děleno průměrem pro kontrolní jamky (B6 buňky sleziny bez antigenů).

Obr. 7A až 7D jsou histogramy ilustrující generování proliferativních linií a klonů T-lymfocytů specifických pro P117-139 a p6-22. Po in vivo imunizaci byly počáteční in vitro stimulace (IVS) provedeny za použití všech tří peptidů vakcíny A nebo B, v příslušném pořadí. Další IVS byly provedeny jako stimulace jedním peptidem za použití pouze dvou relevantních peptidů pll7-139 a p6-22. Klony byly získány jak z p6-22, tak P117-139 specifických T-lymfocytárních linií, jak je uvedeno. T-lymfocyty byly kultivovány v medium samotném (medium) nebo s buňkami sleziny a mediem (B6/bez antigenů), s B6 buňkami sleziny pulsovanými peptidy p6-22 (p6), pll7-139 (pll7), nebo irelevantním kontrolním peptidem (irelevatní peptid) v koncentraci 25 ug/ml a byly testovány po 96 hodinách proliferace za použití test inkorporace (³H)-thymidinu. Sloupce představují stimulační index (SI), který je vypočítán jako

průměr pro pokusné jamky dělený průměrem pro kontrolní jamky (B6 buňky sleziny bez antigenů).

Obr. 8A a 8B představují výsledky TSITES analýzy lidského WT1 (SEQ ID NO: 319) pro peptidy, které mají potenciál vyvolat Th reakci. Regiony označené jako A jsou AMPHI středy bloků, R označuje zbytky odpovídající Rothbard/Taylorově motivu, D označuje zbytky odpovídající IAd motivu a d označuje zbytky odpovídající IEd motivu.

Obr. 9A a 9B jsou grafy ilustrující vyvolání CTL specifických pro WT1 peptid u myší imunizovaných WT1 peptidy. Obr. 9A ukazuje lýzu cílových buněk alogenními buněčnými liniemi a obr. 9B ukazuje lýzu peptidem potažených buněčných linií. V obou případech je % lýzy (jak je určeno stanardním testem uvolňování chrómu) uvedeno při třech uvedených poměrech efektorové buňky: cíle. Výsledky jsou uvedeny pro lymfomové buňky (LSTRA a E10), stejně jako pro E10+ p235-243 )E10+P235). E10 buňky jsou zde také označovány jako EL-4 buňky.

Obr. 10A a 10D jsou grafy ilustrující vyvolání CTL specifických pro WT1 peptid, které zabíjejí WT1 pozitivní nádorové buněčné linie, ale ne WT1 negativní buněčné linie, po vakcinaci B6 myší WT1 peptidem P117. Obr. 10A ukazuje, že T-lymfocyty neimunizovaných B6 myší nezabíjejí WT1 pozitivní nádorové buněčné linie. Obr. 10B ukazuje lýzu cílových buněk alogenními buněčnými liniemi. Obr. 10C a 10D ukazují lýzu WT1 pozitivních nádorových buněčných linií, ve srovnání s WT1 negativními buněčnými liniemi. Dále, obr. 10C a 10D ukazují lýzu peptidem potažených buněčných linií (WT1 negativní buněčná liie E10 potažená relevantním peptidem P117). Ve všech případech je % lýzy (jak je určeno standardním testem uvolňování chrómu) uvedeno při třech uvedených poměrech efektorové buňky: cíle.

Výsledky jsou uvedeny pro lymfomové buňky (E10), prostatické nádorové buňky (TRAMP-C) , transformovanou fibroblastovou buněčnou linii (BLK-SV40), stejně jako pro E10+pll7.

Obr. 11A a 11B jsou histogramy ilustrující schopnost CTL specifických pro representativní peptid P117-139 lyžovat WT1 pozitivní nádorové buňky. Tři týdny po třetí imunizaci byly buňky sleziny od myší, které byly imunizované peptidy p235-243 nebo pll7-139, stimulovány in vitro relevantním peptidem a byly testovány na lýzu cílů inkubací s WT1 peptidy, stejně jako s WT1 pozitivními a negativními nádorovými buňkami. Sloupce představují průměrnou % specifickou lýzu v testu uvolňování chrómu provedeném třikrát s E:T poměrem 25:1. Obr. 11A ukazuje cytotoxickou aktivitu T-lymfocytární linie specifické pro p235-243 proti WT1 negativní buněčné linii EL-4 (EL-4, WT1 negativní); EL-4 pulsované relevantním (použitým pro stimulaci, stejně jako pro restimulaci) peptidem p235-243 (EL4+p235);

EL-4 pulsované irelevantními peptidy pll7-139 (EL-4+pll7), pl26-134 (EL-4+pl26) nebo pl30-138 (EL-4+pl30) a WT1 pozitivním nádorovým buňkám BLK-SV40 (BLK-SV40, WT1 pozitivní) a TRAMP-C (TRAMP-C, WT1 pozitvní), jak je uvedeno. Obr. 11B ukazuje cytotoxickou aktivitu T-lymfocytární linie specifické pro P117-139 proti EL-4; EL-4 pulsované relevantním peptidem pll7-139 (EL4+pll7); EL-4 pulsované irelevantními peptidy P123-1319 (EL-4+pl23), pl28-136 (EL-4+pl28);BLK-SV40 a TRAMP-C, jak je uvedeno.

Obr. 12A a 12B jsou histogramy ilustrující specificitu lýzy WT1 pozitivních nádorových buněk, jak byla zjištěna inhibicí chladného cíle. Sloupce představují průměrnou % specifickou lýzu v testu uvolňování chrómu provedeném třikrát s E:T poměrem 25:1. Obr. 12A ukazuje cytotoxickou aktivitu T-lymfocytární linie specifické pro pll7-139 proti WT1 negativní buněčné linii • · 99 · ··· • ·« · · · · · > · · · ··«« ··· · » · • · · · » · · «·· »Μ • 9 · · · · · · ·· • · »* »·· Φ* α· ···

EL-4 (EL-4, WT1 negativní); WT1 pozitivní nádorové buněčné linii TRAMP-C (TRAMP-C, WT1 pozitivní); TRAMP-C buňkám inkubovaným s desetinásobkem (ve srovnání s horkým cílem) EL-4 buněk pulsovaných relevantním peptidem pll7-139 (TRAMP-C + pll7 chladný cíl) bez značení ^slCr a TRAMP-C buňkám inkubovaným s EL-4 buňkami pulsovanými irelevantním peptidem bez značení ⁵¹Cr (TRAMP-C + irelevantní chladný cíl), jak je uvedeno. Obr. 12B ukazuje cytotoxickou aktivitu T-lymfocytární linie specifické pro pil7-139 proti WT1 negativní buněčné linii EL-4 (EL-4, WT1 negativní); WT1 pozitivní nádorové buněčné linii BLK-SV40 (BLK-SV40, WT1 pozitivní); BLK-SV40 buňkám inkubovaným s relevantním chladným cílem (BLK-SV40 + pll7 chladný cíl) a BLK-SV40 buňkám inkubovaným s irelevantním chladným cílem (BLK-SV40 + irelevantní chladný cíl), jak je uvedeno.

Obr. 13A - 13C jsou histogramy ukazující hodnocení 9-měrového epitopu v pll7-139, pll7-139 tumor - specifické CTI linie byly testovány proti peptidům mezi aminokyselinami 117-139 obsahujícím nebo neobsahujícím vhodný H-2^ vazebný motiv třídy I a po restimulaci pl26-134 nebo pl30-138. Obr. 13A ukazuje cytotoxickou aktivitu T-lymfocytární linie specifické pro pll7-139 proti WT1 negativní buněčné linii EL-4 (EL-4, WT1 negativní) a EL-4 buňkám pulsovaným peptidy pll7-139 (EL-4 + pl23), pll9-127 (EL-4 + pll9), P120-128 (EL-4+pl20), pl23-131 (EL-4 + pl20), pl26-134 (EL-4 + pl26), pl28-136 (EL-4 + pl28) a pl30-138 (EL-4 + pl30). Obr. 13B ukazuje cytotoxickou aktivitu CTL linie po restimulaci pl26-134 proti WT1 negativní buněčné linii EL-4, EL-4 buňkám pulsovaným P117-139 (EL-4 + pll7), pl26-134 (EL-4 + pl26) a WT1 pozitivní nádorové buněčné linii TRAMP-C. Obr. 13C ukazuje cytotoxickou aktivitu CTL linie po restimulaci pl30-138 proti WT1 negativní buněčné linii EL-4, EL-4 buňkám pulsovaným pll7-139 (EL-4 + pll7), P130-138 (EL-4 + pl30) a WT1 pozitivní nádorové buněčné linii TRAMP-C.

Podrobný popis vynálezu

Jak bylo uvedeno výše, předkládaný vynález se týká prostředků a způsobů pro imunoterapii a diagnostiku maligních onemocnění. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat WT1 polypeptidy, WT1 polynukleotidy, buňky prezentující antigen (APC, například dendritické buňky), které exprimují WT1 polypeptid, činidla, jako jsou protilátky, které se váží na WT1 polypeptid a/nebo buňky imunitního systému (například T-lymfocyty) specifické pro WT1. WT1 polypeptidy podle předkládaného vynálezu obecně obsahují alespoň část produktu genu Wilmsova nádoru (WT1) nebo jeho varianty. Sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu obecně zahrnují DNA nebo RNA sekvence, které kódují část takového polypeptidu, nebo sekvence komplementární k takovým sekvencím. Protilátky jsou obecně proteiny imunitního systému nebo jejich vazebné fragmenty pro antigen, které se mohou vázat na část WT1 polypeptidu. T-lymfocyty, které mohou být použity v takových prostředcích, jsou obecně T-lymfocyty (například CD4- a/nebo CD8+), které jsou specifické pro WT1 polypeptid. Některé metody podle předkládaného vynálezu dále využívají buněk prezentujících antigen, které exprimují WT1 polypeptid podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález je založen na objevu, že imunitní reakce namířená proti produktu genu Wilmsova nádoru (WT) (například WT1) může být profylakticky a/nebo terapeuticky přínosná u pacientů postižených maligním onemocněním charakterizovaným zvýšenou expresí WT1 genu. Mezi taková onemocnění patří, například, leukemie (například akutní myeloidní leukemie (AML), chronická myeloidní leukemie (CML), akutní lymfatická leukemie (ALL) a dětská ALL), stejně jako mnoho nádorů, jako jsou nádory prsu, plic, štítné žlázy, gastrointestinálního traktu a melanomy. WT1 gen byl původně identifikován a izolován cytogeneticky podle delece na chromosomu llpl3 u pacientů s Wilmsovým nádorem (viz Call et al., U.S. Patent č. 5350840). Gen se skládá z 10 exonů a kóduje transkripční faktor s motivem zinkového prstu, a sekvence myších a lidských WT1 proteinů jsou uvedeny na obr. 1 a v SEQ ID NO: 319 a 320.

WT1 polypeptidy

V předkládaném vynálezu je WT1 polypeptid polypeptid, který obsahuje alespoň imunogenní část přirozeného WT1 (t.j. WT1 proteinu exprimovaného organismem, který není geneticky modifikován), nebo jeho varianta, jak je zde popsána. WT1 polypeptid může mít jakoukoliv délku, pod podmínkou, že obsahuje alespoň imunogenní část přirozeného proteinu nebo jeho varianty. Jinými slovy, WT1 polypeptid může být oligopeptid (t.j. může obsahovat relativně má aminokyselinových zbytků, například 8-10 zbytků, vázaných peptidovými vazbami), kompletní WT1 protein (například přítomný v člověku nebo jiném savci, jako je myš) nebo polypeptid střední velikosti. V některých provedeních je výhodné použití WT1 polypeptidu, které obsahují relativně malý počet sousedních aminokyselinových zbytků přirozeného WT1 polypeptidu. Takové polypeptidy jsou výhodné pro některá použití, při kterých je žádoucí vyvolání T-lymfocytární reakce. Například, WT1 polypeptid může obsahovat méně než 23, lépe méně než 18 a nejlépe méně než 15 sousedících aminokyselinových zbytků přirozeného WT1 polypeptidu. Polypeptidy obsahující devět sousedících aminokyselinových zbytků přirozeného WT1 polypeptidu jsou obvykle vhodné pro takové účely. Další sekvence odvozené od přirozeného proteinu a/nebo heterologní sekvence mohou být přítomné ve WT1 polypeptidu a takové sekvence mohou mít (ale nemusí) další imunogení nebo antigenní vlastnosti. Polypeptidy, jak jsou zde poskytnuty, mohou být dále asociovány (kovalentně nebo nekovalentně) s jinou polypeptidovou nebo nepolypeptidovou sloučeninou.

Termín imunogenní část, jak je zde použit, označuje část polypeptidu, která je rozpoznávána (t.j. specificky vázána) povrchovým receptorem pro antigen B-lymfocytů a/nebo T-lymfocytů. Některé výhodné imunogenní části se váží na molekulu MHC třídy I nebo třídy II. Imunogenní část se váže na molekulu MHC třídy I nebo II tehdy, je-li taková vazba detekovatelná za použití jakéhokoliv testu známého v oboru. Například, schopnost polypeptidu vázat se na MHC třídy I může být hodnocena nepřímo sledováním schopnosti navodit inkorporaci ¹²⁵I značeného beta2-mikroglobulinu (beta2m) na MHC třída I/beta2m/peptid heterodimerické komplexy (viz Parker et al., J. Immunol. 152: 163, 1994). Alternativně mohou být použity funkční peptidové kompetitivní testy známé v oboru. Některé imunogenní části mají jednu nebo více sekvencí uvedených v tabulkách II-XIV. Mezi representativní imunogenní části patří, například, RDLNALLPAVPSLGGGG (lidské WT1 zbytky 6-22; SEQ ID NO: 1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (lidské a myší WT1 zbytky 117-139; 2 a 3, v příslušném pořadí), GATLKGVAAGSSSSVKWTE (lidské WT1 zbytky 244-262; 4), GATLKGVAA (lidské WT1 zbytky 244-252; 88), CMTWNQMNL (lidské a myší WT1 zbytky 235-243; 49 a 258, v příslušném pořadí), SCLESQPTI (myší WT1 zbytky 136-144; 296), SCLESQPAI (lidské WT1 zbytky 136-144; SEQ ID NO: 198), NLYQMTSQL (lidské a myší WT1 zbytky 225-233; SEQ ID NO: 147 a 284, v příslušném pořadí), ALLPAVSSL (myší WT1 zbytky 10-18; SEQ ID NO: 255) nebo RMFPNAPYL· (lidské a myší WT1 zbytky 126-134; SEQ ID NO: 185 a 293, v příslušném pořadí). Jsou zde uvedeny i další imunogenní části a jiné části mohou být identifikovány za použití známých technik, jak jsou shrnuty v Paul, Fundamental Immunology 3. vydání, 243-247 (Raven Press, 1993) a odkazech citovaných v uvedené publikaci. Mezi representativní techniky pro identifikaci imunogenních částí patří skríning polypeptidů na schopnost reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony. Imunogenní část přirozeného WT1 polypeptidu je část, která reaguje s takovým antisérem a/nebo T-lymfocyty na úrovni, která není podstatně nižší než reaktivita kompletního WT1 (například v ELISA a/nebo testu na reaktivitu T-lymfocytů). Jinými slovy, imunogenní část může reagovat v takových testech na úrovni, která je podobná nebo vyšší než reaktivita kompletního polypeptidu. Taková vyšetření mohou být provedena za použití metod dobře známých v oboru, jako jsou metody popsané v Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, COld Spring Harbor Laboratory, 1988.

Alternativně mohou být imunogenní části identifikovány za použití počítačové analýzy, jako jsou Tsites programy (viz Rothbard and Taylor, EMBO J., 7: 93-100, 1988; Deavin et al.,

Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996), které vyhledávají peptidové motivy, které mohou vyvolat Th odpovědi. CTL peptidy s motivy vhodnými pro vazbu na myší nebo lidské MHC třídy I nebo II mohou být identifikovány podle BIMAS (Parekr et al., J.

Immunol. 152: 163, 1994) a jiných analýz předpokládané vazby na HLA peptidy. Pro potvrzení imunogenicity může být peptid testován za použití HLA A2 transgenních myší a/nebo ve stimulačním testu in vitro za použití dendritických buněk, fibroblastů nebo buněk periferní krve.

Jak bylo uvedeno výše, prostředky mohou obsahovat variantu přirozeného WT1 proteinu. Varianta polypeptidu je polypeptid, který se liší od přirozeného polypeptidu v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že je zachována imunogenicita polypeptidu (t.j. schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen • ·

a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena ve srovnání s přirozeným polypeptidem). Jinými slovy, schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony může být zesílená nebo nezměněná, ve srovnání s přirozeným polypeptidem, nebo může být snížena o méně než 50%, a výhodně o méně než 20% vzhledem k přirozenému polypeptidů. Takové varianty mohou být identifikovány modifikací jedné z výše uvedených polypeptidových sekvecní a hodnocením reaktivity modifikovaného polypeptidů s antisérem a/nebo T-lymfocyty, které jsou zde popsány. Bylo zjištěno, v kontextu předkládaného vynálezu, že relativně malý počet substitucí (například 1 až 3) v imunogenní části WT1 polypeptidů, může zlepšit schopnost polypeptidů vyvolat imunitní odpověú. Vhodné substituce mohou být identifikovány za použití počítačových programů, jak byly popsány výše, a jejich efekt může být potvrzen na základě reaktivity modifikovaného polypeptidů s antisérem a/nebo T-lymfocyty, jak jsou zde popsány. V souladu s tím v některých výhodných provedeních WT1 polypeptid zahrnuje variantu, ve které jsou 1 až 3 aminokyselinové zbytky v imunogenní části substituovány tak, že schopnost reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony je statisticky vyšší než schopnost nemodifikovaného polypeptidů. Takové substituce jsou výhodně umístěny v MHC vazebném místě polypeptidů, které může být identifikováno způsobem popsaným výše. Výhodné substituce umožňují lepší vazbu na MHC molekuly třídy I nebo II.

Některé varianty obsahují konzervativní substituce. Konzervativní substituce je substituce, ve které je aminokyselina substituována za jinou aminokyselinu, která má podobné vlastnosti, takže lze předpokládat, že sekundární struktura a hydropatický charakter polypeptidů se v podstatě nezmění. Aminokyselinové substituce mohou být provedeny podle podobnosti v polaritě, náboji, rozputnosti, hydrofobnosti, hydrofilnosti a/nebo amfipatickém charakteru zbytků. Například, mezi aminokyseliny s negativním nábojem patří kyselina asparagová a kyselina glutamová; mezi aminokyseliny s pozitivním nábojem patří lysin a arginin; a mezi aminokyseliny s neutrálními polárními skupinami mající podobnou hydrofilnost patří leucin, isoleucin a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; a serin, threonin, fenylalanin a tyrosin. Jiné skupinyaminokyselin, které mohou představovat konzervativní změny, zahrnují: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; a (5) phe, tyr, trp, his. Varianty mohou také, nebo alternativně, obsahovat nekonzervativní změny. Varianty mohou být také, nebo alternativně, modifikovány, například, delecí nebo adicí aminokyselin, které mají minimální vliv na imunogenicitu, sekundární strukturu a hydropatický charakter polypeptidu.

Jak bylo uvedeno výše, WT1 polypeptidy mohou být konjugovány na signální (nebo vedoucí) sekvenci na N-koncové části proteinu, která ko-translačně nebo post-translačně řídí přenos proteinu. Polypeptid může také, nebo alternativně, být konjugovány na spojovací sekvenci pro usnadnění syntézy, přečištění nebo identifikace polypeptidu (například poly-His), nebo pro zesílení vazby polypeptidu na pevný nosič. Například může být polypeptid konjugován na Fc region imunoglobulinu.

WT1 polypeptidy mohou být připraveny za použití jakékoliv z mnoha známých technik. Rekombinantní polypeptidy kódované WT1 polynukleotidem, jak je zde popsán, mohou být snadno připraveny z tohoto polynukleotidu. Obecně, jakýkoliv z mnoha expresních vektorů známých v oboru může být použit pro expresi rekombinantního WT1 polypeptidu. Exprese může být provedena ve vhodné hostitelské buňce, která byla transfektována nebo transformována expresním vektorem obsahujícím DNA molekulu, která kóduje rekombinantní polypeptid. Mezi vhodné hostitelské buňky patří prokaryonty, kvasinky a vyšší eukaryotické buňky. Výhodně jsou použitými hoostitelskými buňkami E. coli, kvasinky nebo savčí buněčné linie jako jsou COS nebo CHO. Supernatanty z vhodných systémů hostitel/vektor, které secernují rekombinantní protein nebo polypeptid do kultivačního media, mohou být nejprve koncentrovány za použití komerčně dostupných filtrů. Koncentrát může být potom aplikován na vhodnou přečiščovací matrici, jako je afinitní matrice nebo iontoměničová pryskyřice. Nakonec může být pro další přečištění rekombinantního polypeptidu použito jeden nbeo několik kroků HPLC s reverzní fází. Takové techniky mohou být použity pro přípravu přirozených polypeptidů nebo jejich variant. Například, polynukleotidy, které kódují variantu přirozeného polypeptidu, mohou být připraveny za použití standardních technik mutagenese, jako je oligonukleotidy řízená místně specifická mutagenese, a části DNA sekvence mohou být odstraněny pro přípravu zkrácených polypeptidů.

Některé části nebo jiné varianty mohou být také připraveny synteticky, za použití technik dobře známých v oboru. Například, mohou být syntetizovány polypeptidy tvořené méně než 500 aminokyselinami, lépe méně než 100 aminokyselinami.

Polypeptidy mohou být syntetizovány za použití komerčně dostupných technik syntézy na pevné fázi, jako je Merrifieldova technika syntézy na pevné fázi, ve které jsou aminokyseliny sekvenčně přidávány k rostoucímu aminokyselinovému řetězci. Viz Merrifield, J. /km. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. Vybavení pro automatizovanou syntézu polypeptidů je komerčně dostupné od ··· ··· ·· *t * ··· ·· ·· dodavatelů jako jsou Applied Biosystems, lne., Foster City, CA, a mohou pracovat podle návodu výrobce.

Obecně, zde popsané polypeptidy a polynukleotidy jsou izolované. Izolovaný polypeptid nebo polynukleotid je takový, který je odstraněn ze svého původního prostředí. Například, přirozený protein je izolován, pokud je separován od veškerého nebo nějakého materiálu současně přítomného v přirozeném systému. Výhodně jsou takové polypeptidy alespoň přibližně 90% čistoty, lépe alespoň 95% čistoty a nejlépe alespoň 99% čistoty. Polynukleotid je považován za izolovaný, pokud je, například, klonovaný do vektoru, který není součástí přirozeného prostředí.

V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje mimetika WT1 polypeptidů. Taková mimetika mohou obsahovat aminokyseliny navázané na jedno nebo více mimetik aminokyselin (t.j. jedna nebo více aminokyselin ve WT1 proteinu může být nahrazena mimetikem aminokyselin) nebo se může jednat o zcela nepeptidová mimetika. Mimetikum aminokyseliny je sloučenina, která je konformačně podobná aminokyselině, takže může být substituována za aminokyselinu ve WT1 polypeptidu bez významného snížení jeho schopnosti reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony. Nepeptidové mimetikum je sloučenina, která neobsahuje aminokyseliny a jejíž celková konformace je podobná WT1 polypeptidu tak, že schopnosti mimetika reagovat s antisérem specifickým pro WT1 a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není snížena vzhledem ke schopnosti WT1 polypeptidu. Takové mimetikum může být navrženo za použití standardních technik (například nukleární magnetické resonance a počítačových technik), které vyhodnocují trojrozměrnou strukturu peptidové sekvence. Mohou být navržena mimetika, ve kterých je jedna nebo více skupin WT1 polypeptidu nahrazena skupinou, která nemusí mít nutně stejnou velikost nebo objem, ale která má podobné chemické a/nebo fyzikální vlastnosti, které vyvolávají stejné biologické odpovědi. Je třeba si uvědomit, že ve zde uvedených provedeních může být mimetikum zaměněno za WTl polypeptid.

WTl polynukleotidy

Jakýkoliv polynukleotid, který kóduje WTl polypeptid, jak je zde popsán, je WTl polynukleotid spadající do rozsahu předkládaného vynálezu. Takové polynukleotidy mohou být jednořetězcové (kódující nebo protismyslné) nebo dvouřetězcové, a může se jednat o DNA (genomové, cDNA nebo syntetické) nebo RNA molekuly. Další kódující nebo nekódující sekvence mohou, ale nemusí, být přítomny v polynukleotidu podle předkládaného vynálezu a polynukleotid může, ale nemusí, být navázán na jiné molekuly a/nebo nosiče.

WTl polynukleotidy mohou kodovat přirozený WTl protein, nebo mohou kodovat WTl, jak je zde popsán. Varianty polynukleotidů mohou obsahovat jednu nebo více substitucí, adicí, delecí a/nebo insercí takových, že imunogenicita kódovaného polypeptidů není snížena ve srovnání s přirozeným WTl polypeptidem. Vliv na imunogenicitu kódovaného polypeptidů může být hodnocen způsobem, který je zde popsán. Výhodné varianty obsahují nukleotidové substituce, delece, inserce a/nebo adice v ne více než 20%, lépe ne více než 10% nukleotidových pozic, které kódují imunogenní část přirozené WTl sekvence. Některé varianty jsou v podstatě homologní s přirozeným genem nebo jeho částí. Takové polynukleotidové varianty jsou schopné hybridizace na středně přísných pdmínek na přirozenou DNA sekvenci kódující WTl polypeptid (nebo komplementární sekvenci). Vhodnými středně přísnými podmínkami • · · · · · ·» · · · ·· ·· jsou předpromytí v roztoku 5xSSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybridizace při 50°C - 65°C, 5xSSC, přes noc; a potom promytí dvakrát při 65 °C po dobu 20 minut 2x, 0,5x a 0,2x SSC obsahujícím 0,1% SDS). Takové hybridizující DNA sekvence spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Je třeba si uvědomit, že v důsledku degenerace genetického kódu existuje mnoho nukleotidových sekvencí, které kódují WT1 polypeptid. Některé z těchto polynukleotidů mají minimální homologii s nukleotidovou sekvencí jakéhokoliv přirozeného genu. Nicméně, polynukleotidy, které se liší podle odlišností ve využití kodonů, jsou součástí předkládaného vynálezu.

Po identifikaci imunogenní části WT1, jak byla popsána výše, může být WT1 polynukleotid připraven různými technikami. Například, WT1 polynukleotid může být amplifikován z cDNA připravené z buněk, které exprimují WT1. Takové polynukleotidy mohou být amplifikovány polymerasovou řetězovou reakcí (PCR). V tomto přístupu mohou být primery specifické pro sekvenci navrženy podle sekvence imunogenní části a mohou být zakoupeny nebo syntetizovány. Například, vhodné primery pro PCR amplifikaci lidského WT1 genu jsou: první krok - P118: 1434-1414: 5'-GAG AGT CAG ACT TGA AAG GAGT3' (SEQ ID NO: 5) a P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3' (SEQ ID NO: 6); druhý krok - P136: 5' GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3' (SEQ ID NO: 7) a P137: 5' GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3’(SEQ ID NO: 8). Primery pro amplifikaci myšího WT1 genu jsou: první krok - P138: 5' TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3’ (SEQ ID NO: 9) a P139: 5' GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3' (SEQ ID NO: 10), druhý krok - P140: 5' GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3' (SEQ ID NO: 11) a P141: 5' GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3’ (SEQ ID NO: 12) .

Amplifikovaná část může být potom použita pro izolaci kompletního genu z knihovny genomové DNA nebo z vhodné cDNA knihovny, za použití dobře známých technik. Alternativně může být kompletní gen konstruován z více PCR fragmentů. WT1 polynukleotidy mohou být také připraveny syntetizováním oligonukleotidových složek a ligací složek dohromady za zisku kompletního polynukleotidu.

WT1 polynukleotidy mohou být syntetizovány také jakoukoliv jinou metodou známou v oboru, včetně chemické syntézy (t.j. fosforoamiditové chemické syntézy na pevné fázi). Modifikace polynukleotidové sekvence mohou být připraveny standardními technikami mutagenese, jako je oligonukleotidy řízená místně specifická mutagenese (viz Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Alternativně mohou být RNA molekuly připraveny in vitro nebo in vivo transkripcí DNA sekvencí kódujících WT1 polypeptid, s podmínkou, že DNA je inkorporována do vektoru s vhodným RNA polymerasovým promtorem (jako je T7 nebo SP6). Některé části mohou být použity pro přípravu kódovaného polypeptidu, jak je zde popsán. Kromě toho, nebo alternativně, část může být podána pacientovi atk, že takový kódovaný polypeptid je generován in vivo (například transfekcí buněk prezentujících antigen, jako jsou dendritické buňky, cDNA konstruktem kódujícím WT1 polypeptid, a podáním transfektovaných buněk pacientovi.

Polynukleotidy, které kódují WT1 polypeptid, mohou být použity pro produkci polypeptidu, in vivo nebo in vitro. WT1 polynukleotidy, které jsou komplementární ke kódující sekvenci (t.j. protismyslné polynukleotidy) mohou být také použity jako sondy nebo pro inhibici exprese WT1. cDNA konstrukty, které mohou být transkribovány do protismyslné RNA, mohou být také vloženy do buněk nebo tkání pro usnadnění produkce protismyslné RNA.

• · • · · · · • * · · ·

Jakýkoliv polynukleotid může být dále modifikován pro zvýšení stability in vivo. Mezi možné modifikace patří, například, adice sousedních sekvencí na 5’ a/nebo 3' konce; použití fosforothioatu nebo 2’ O-methylových místo fosfodiesterasových vazeb ve skeletu; a/nebo použití netradičních baží, jako je inosin, quenosin a wybutosin, stejně jako acetyl-, methy-, thio- a jinak modifikovaných forem adeninu, cytidinu,guaninu, tyhmidinu a uridinu.

Nukleotídové sekvence, jak jsou zde popsány, mohou být navázány na různé jiné nukleotídové sekvence za použití zavedených technik rekombinantní DNA. Například, polynukleotid může být klonován do různých klonovacích vektorů, včetně plasmidů, fagemidů, derivátů fágu lambda a kosmidů. Zejména významnými vektory jsou expresní vektory, replikační vektory, vektory pro vytváření sond a sekvenační vektory. Obecně vektor obsahuje sekvenci rozpoznávající počátek replikace funkční alespoň v jednom organismu, běžná místa pro restrikční endonukleasy a jeden nebo více selektovatelných markérů. Další elementy závisí na požadovaném použití a budou jasné odborníkům v oboru.

V některých provedeních mohou být polynukleotidy připraveny tak, že je možný jejich vstup do buněk savce a exprese v těchto buňkách. Takové prostředky jsou zejména vhodné pro terapeutické použití, jak je popsáno dále. Odborníkům v oboru bude jasné, že existuje mnoho způsobů pro dosažení exprese polynukleotidu v cílových buňkách a může být použita jakákoliv vhodná metoda. Například, polynukleotid může být inkorporován do virového vektoru, jako je, například, adenovirus, adeno-asociovaný virus, retrovirus nebo virus vakcinie nebo jiný pox virus (například ptačí pox virus). Techniky pro inkorporaci DNA do takových vektorů jsou dobře známé odborníkům v oboru.

• ·

Retrovirový vektor může dále přenášet nebo inkorporovat gen pro selektovatelný markér (pro umožnění identifikace nebo pro selekci transdukovaných buněk) a/nebo zaměřovači skupinu, jako je gen kódující ligand pro receptor na specifické cílové buňce, který činí vektor specifickým pro cíl. Zacílení může být také provedeno pomocí protilátky, za použití metod známých odborníkům v oboru. cDNA konstrukty v takovém vektoru mohou být použity, například, pro transfekci lidských nebo zvířecích buněčných linií pro použití v zavedených WT1 pozitivních nádorových modelech, které mohou být použity pro pokusy s ochranou před nádory a adoptivní imunoterapií za účelem demonstrování inhibice růstu nádorů nebo leukémií nebo lýzy takových buněk.

Dalšími terapeutickými přípravky pro polynukleotidy jsou koloidní disperzní systémy, jako jsou makromolekulové komplexy, nanokapsle, mikrosféry, korálky a systémy na bázi lipidů včetně emulsí olej ve vodě, micel, směsných micel a liposomů. Výhodným koloidním systémem pro použití jako přenosové vehikulum in vitro a in vivo je liposom (t.j. artificiální membránová vesikula). Příprava a použití takových systémů jsou dobře známé v oboru.

Protilátky a jejich fragmenty

Předkládaný vynález dále poskytuje vazebná činidla, jako jsou protilátky a jejich vazebné fragmenty pro antigen, které se specificky váží na WT1 polypeptid. Činidlo se specificky váže na WT1 polypeptid, pokud raguje na detekovatelné úrovni (například v ELISA testu) s WT1 polypeptidem, a nereaguje detekovatelné s nepříbuznými proteiny za podobných podmínek. Termín vazba, jak je zde použit, označuje nekovalentní asociaci dvou samostatných molekul, při které se vytváří

komplex. Schopnost může být hodnocena, například, určením vazebné konstanty pro tvorbu komplexů. Vazebná konstanta je hodnota získaná vydělením koncentrace komplexu koncentracemi složek. Obecně, v předkládaném vynálezu se dvě sloučeniny váží, pokud je vazebná konstanta pro tvorbu komplexů vyšší než přibližně 10³ 1/mol. Vazebná konstanta může být stanovena za použití metod dobře známých v oboru.

Jakékoliv činidlo splňující výše uvedené požadavky může být vazebným činidlem. Ve výhodném provedení je vazebným činidlem protilátka nebo její vazebný fragment pro antigen. Některé protilátky jsou komerčně dostupné, například od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Alternativně mohou být protilátky připraveny jakoukoliv z mnoha technik známých v oboru. Viz například Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Obecně, protilátky mohou být produkovány technikami buněčných kultur, včetně přípravy monoklonálních protilátek, jak je zde popsána, nebo transfekcí genů pro protilátky do vhodných bakteriálních nebo savčích hostitelských buněk, pro produkci rekombinantnich protilátek. V jedné technice je imunogen obsahující polypeptid nejprve injikován různým savcům (například myším, krysám, králíkům, ovcím nebo kozám). V tomto kroku mohou být polypeptidy podle předkládaného vynálezu použity jako imunogeny bez další modifikace. Alternativně, zejména pro relativně krátké polypeptidy, může být lepší imunitní odpověď vyvolána tehdy, je-li polypeptid navázán na proteinový nosič, jako je hovězí sérový albumin nebo přílipkový hemokyanin. Imunogen je injikován zvířecímu hostiteli, výhodně podle předem určeného protokolu obsahujícího jednu nebo více dosycovacích imunizací, a zvířeti se periodicky odebírá krev. Polyklonální protilátky specifické pro polypeptid mohou být potom přečištěny z antiséra, například pomocí afinitní chromatografie za použití • · • · • «

polypeptidů navázaného na vhodný proteinový nosič.

Monoklonální protilátky specifické pro antigenní polypeptid mohou být připraveny, například, technikou podle Kohlera a Milsteina, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, a jejích zlepšení. Stručně, tato metoda zahrnuje přípravu imortalizovaných buněčných linií schopných produkce protilátek s požadovanou specificitou (t.j. reaktivitou s daným polypeptidem). Takové buněčné linie mohou být produkovány, například, z buněk sleziny získaných od zvířat imunizovaných způsobem popsaným výše. Buňky sleziny jsou potom imortalizovány, například, fúsí s myelomovými fúsními partnery, výhodně takovými, které jsou syngenní s imunizovaným zvířetem. Mohou být použity různé fúsní techniky. Například, buňky sleziny a myelomové buňky mohou být kombinovány s neiontovým detergenčním činidlem na dobu několika minut a potom mohou být přeneseny v nízké hustotě na plotny se selektivním mediem, které podporuje růst hybridních buněk, ale ne myelomových buněk. Výhodná selekční technika využívá HAT (hypoxantin, aminopterin, thymidin) selekci. Po dostatečně dlouhé době, například přibližně 1 až 2 týdnů, se pozorují kolonie hybridů, vyberou se ejdnotlivé kolonie a supematanty jejich kultur se testují na vazebnou aktivitu proti polypeptidů. Výhodné jsou hybridomy mající vysokou reaktivitu a specificitu.

Monoklonální protilátky mohou být izolovány ze supernatantů kultivovaných kolonií hybridomů. Dále, různé techniky mohou být použity pro zvýšení výnosu, jako je injekce hybridomní buněčné linie do peritoneální dutiny vhodné obratlovce, jako je myš. Monoklonální protilátky mohou být potom získány z ascitu nebo z krve. Konatminanty mohou být odstraněny z protilátek běžnými technikami, jako je chromatografie, gelová filtrace, srážení a extrakce. Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být použity při přečišúování, například při afinitní chromatografii.

V některých provedeních je výhodné použití vazebných fragmentů pro antigen protilátek. Mezi takové fragmenty patří Fab fragmenty, které mohou být připraveny za použití standardních technik. Stručně, imunoglobuliny mohou být přečištěny z králičího séra afinitní chromatografií na kolonách s korálky Proteinu A ( Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) a mohou být tráveny papainem za zisku Fab a Fc fragmentů. Fab a Fc fragmenty mohou být přečištěny afinitní chromatografií na kolonách s korálky Proteinu A.

Monoklonální protilátky a jejich fragmenty mohou být navázány na jedno nebo více terapeutických činidel. Vhodnými činidly jsou radioaktivní sloučeniny a chemoterapeutická činidla, která mohou být použita, například, pro přečištění autologní kostní dřeně in vitro. Příklady terapeutických činidel jsou radionuklidy, induktory diferenciace, léky, toxiny a jejich deriváty. Výhodnými radionuklidy jsou ^9OY, ^X23I, ^X25I, ^X3XI, ^xesRe, ^xeeRe, ^2XXAt a ^2x2Bi. Výhodnými léky jsou methothrexat a analogy pyrimidinu a purinu. Výhodnými induktory diferenciace jsou estery forbolu a kyseliny máselné. Výhodnými toxiny jsou ricin, abrin, difterický toxin, choleratoxin, gelonin, Pseudomonadové exotoxiny, Shigella toxin a antivirový potein líčidla amerického. Pro diagnostické účely může být navázání radioaktivního čindila použito pro vyhledávání metastas nebo pro určení lokalizace WT1-pozitivních nádorů.

Terapeutické činidlo může být navázáno (například kovalentně navázáno) na vhodou monoklonální protilátku bud' přímo, nebo

«9 · • · <

* · · • · · ·· *· nepřímo (prostřednictvím spojovací skupiny). Přímá reakce mezi činidlem a protilátkou je možná tehdy, pokud každá složka obsahuje substituent schopný reakce s druhým substituentem. Například, nukelofilní skupina, jako je amino nebo sulfhydrylová skupina, může reagovat se skupinou obsahující karbonyl, jako je anhydrid nebo halogenid kyseliny, nebo s alkylovou skupinou obsahující snadno odštěpitelnou skupinu (například halogenid).

Alternativně může být žádoucí navázání terapeutického činidla a protilátky prostřednictvím spojovací skupiny. Spojovací skupina může působit jako skupina oddělující protilátku od činidla a bránící tak interferenci vazebných schopností. Spojovací skupina může také sloužit pro zvýšení chemické reaktivity substituentu na činidle nebo protilátce, což vede ke zvýšení vazebné účinnosti. Zvýšení chemické reaktivity může také usnadnit použití činidel, nebo funkčních skupin na činidlech, jejichž použití by jinak nebylo možné.

Odborníkům v oboru bude jasné, že jako spojovací skupiny mohou být použita různá bifunkční nebo polyfunkční činidla, jak homo-, tak heterofunkční (jako jsou činidla popsaná v katalogu Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Vazba může být provedena, například, prostřednictvím amino skupin, karboxylových skupin, sulfhydrylových skupin nebo oxidovaných karbohydrátových zbytků. Existuje mnoho odkazů popisujících takové způsoby, například US Patent č. 4671958 (Rodwell et al.).

Pokud je terapeutické činidlo účinnější, když není navázané na protilátkovou část imunokonjugátu podle předkládaného vynálezu, může být vhodné použití spojovací skupiny, která je odštěpitelná po internalizaci do buněk. Bylo popsáno mnoho různých odštěpitelných spojovacích skupin. Mechanismy pro intracelulární uvolnění činidel z těchto spojovacích skupin zahrnují redukci

• · · • · ·· ·· · disulfidové vazby (například US patent č. 4489710, Spiter), ozáření fotolabilní vazby (například US patent č.4625014, Senter et al.), hydrolýza derivátizovaných vedlejších řetězců aminokyselin (například US patent č.4638045, Kohn et al.), hydrolýza zprostředkovaná sérovým komplementem (například US patent č. 4671958, Rodwell et al.) a hydrolýza katalyzovaná kyselinou (například US4569789, Blatter et al.).

Může být vhodné navázání více než jednoho činidla na protilátku. V jednom provedení je více molekul činidla navázáno na jednu molekulu protilátky. V jiném provedení je více činidel navázáno na jednu protilátku. Bez ohledu na konkrétní provedení mohou být imunokonjugáty s jedním nebo více činidly připraveny různými způsoby. Například, jedno nebo více činidel může být navázáno přímo na molekulu protilátky, nebo mohou být použity spojovací skupiny dodávající více míst pro navázání. Alternativně může být použit nosič. Nosič může nést činidla různými způsoby, včetně přímé kovalentní vazby nebo prostřednictvím spojovací skupiny. Vhodnými nosiči jsou proteiny, jako jsou albuminy (například US Patent 4507234, Kato et al.), peptidy a polysacharidy (například US Patent 4699784, Shih et al.). Nosič může také nést činidlo pomocí nekovalentní vazby nebo pomocí enkapsulace, jak je tomu například v liposomech (například US Patenty č. 4429008 a 4873088) . Mezi nosiče vhodné pro radionuklidová činidla patří radiohalogenované malé molekuly a chelatační sloučeniny. Například, U.S. Patent č. 4735792 popisuje representativní radiohalogenované malé molekuly a jejich syntézu. Chelát radionuklidu může být připraven chelatací sloučenin, které obsahují atomy dusíku nebo síry jako donorové atomy pro vazbu kovu, nebo oxidu kovu nebo radionuklidu. Například, U.S. patent č. 4673562, Davison et al., popisuje representativní chelatační sloučeniny a jejich syntézu.

Mohou být použity různé způsoby podání protilátek a imunokonjugátů. Obvykle je podání intravenosní, intramuskulární, podkožní nebo do lůžka resekovaného nádoru. Je jasné, že přesná dávka protilátky/imunokonjugátu bude záviset na použité protilátce, hustotě antigenu v nádoru a na rychlosti eliminace protilátky.

Vynález také poskytuje anti-idiotypové protilátky, které napodobují imunogenní část WT1. Takové protilátky mohou být namířeny proti protilátce nebo jejímu vazebnému fragmentu pro antigen, která se specificky váže na imunogenní část WT1, za použití dobře známých technik. Anti-idiotypové protilátky, které napodobují imunogenní část WT1, jsou ty protilátky, které se specificky váží na imunogenní část WT1, jak je zde popsána.

T-lymfocyty

Imunoterapeutické prostředky mohou také, nebo alternativně, obsahovat T-lymfocyty specifické pro WT1. Takové buňky mohou být připraveny in vitro nebo ex vivo, za použití standardních technik. Například, T-lymfocyty mohou být přítomny v (nebo izolovány z) kostní dřeně, periferní krve nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve savce, jako je pacient, za použití komerčně dostupných systémů pro separaci buněk, jako je CEPRATE™ systém dostupný od CellPro lne., Bothell WA (viz též US Patent č. 5240856; US Patent č. 5215926; WO 89/06280; WO 91/16116 a WO 92/07243). Alternativně mohou být T-lymfocyty získány od příbuzných nebo nepříbuzných lidí, jiných savců, z buněčných linií nebo kultur.

T-lymfocyty mohou být stimulovány WT1 polypeptidem, polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid a/nebo buňkami prezentujícími antigen (APC), které exprimují WT1 polypeptid.

• · • · :

• ·

Taková stimulace je provedena za podmínek a po dobu dostatečnou pro generování T-lymfocytů, které jsou specifické pro WT1 polypeptid. Výhodně je WT1 polypeptid nebo polynukleotid prezentován v přepravním vehikulu, jako je mikrosféra, pro usnadnění generování T-lymfocytů specifických pro antigen. Stručně, T-lymfocyty, které mohou být izolovány od pacienta nebo od příbuzného či nepříbuzného dárce pomocí běžných technik (jako je Ficoll/Hypopaque gradientově odstředění lymfocytů periferní krve), se inkubují s WT1 polypeptidem. Například mohou být T-lymfocyty inkubovány in vitro po dobu 2-9 dnů (obvykle 4 dnů) při 37 °C s WT1 polypeptidem (například 5 až 25 ug/ml) nebo s buňkami syntetizujícími odpovídající množství WT1 polypeptidu. Pro kontrolu může být vhodné inkubovat samostatný podíl T-lymfocytů za nepřítomnosti WT1 polypeptidu.

T-lymfocyty jsou považovány za specifické pro WT1 polypeptid, pokud zabíjejí cílové buňky potažené WT1 polypeptidem nebo exprimující gen kódující takový polypeptid. Specificita T-lymfocytů může být hodnocena za použití různých standardních technik. Například, v testu uvolňování chrómu nebo v proliferačním testu ukazuje stimulační index dvakrát vyšší v lýze a/nebo proliferaci - ve srovnání s negativními kontrolami - specificitu T-lymfocytů. Takové testy mohou být provedeny, například, způsobem popsaným v Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070, 1994. Alternativně může být detekce proliferace T-lymfocytů provedena různými známými technikami. Například, proliferace T-lymfocytů může být detekována měřením zvýšené syntézy DNA )například pomocí pulsního značení kultur T-lymfocytů tritiovaným thymidinem a měřením množství tritiovaného thimidinu inkorporovaného do DNA). Jiné způsoby pro detekci proliferace T-lymfocytů zahrnují měření zvýšení produkce interleukinu 2 (IL-2), toku Ca²* nebo vychytávání barviva, jako je 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium. Alternativně může být měřena syntéza • · lymfokinů (jako je interferon-gamma) nebo relativní počet T-lymfocytů, které mohou odpovídat na WTl polypeptid. Kontakt s WTl polypeptidem (200 ng/ml - 100 ug/ml, výhodně 100 ng/ml - 25 ug/ml) po dobu 3-7 dnů může vést ke 2-násobnému zvýšení proliferace T-lymfocytů a/nebo může konkat popsaný výše trvající 2-3 hodiny vést k aktivaci T-lymfocytů, jak je měřena pomocí standardních cytokinových testů, ve kterých 2-násobné zvýšení uvolňování cytokinů (například TNF nebo iFN-gamma) ukazuje na aktivaci T-lymfocytů (viz Coligan et al., Current Protocols in Immunology, svazek I, Wiley Interscience (Greene 1998). T-lymfocyty specifické pro WTl mohou být expandovány za použití standardních technik. Ve výhodných provedeních jsou T-lymfocyty získány od pacienta nebo od příbuzného nebo nepříbuzného dárce a jsou podány pacientovi po stimulaci a expanzi.

T-lymfocyty, které byly aktivovány v reakci na WTl polypeptid, polynukleotid nebo APC exprimující WTl, mohou být CD4+ a/nebo CD8+. Specifická aktivace CD4+ nebo CD8+ T-lymfocytů může být detekována různými způsoby. Způsoby pro detekci aktivace T-lymfocytů zahrnují detekci proliferace T-lymfocytů, produkce cytokinů například lymfokinů), nebo vzniku cytolytické aktivity (t.j. detekci vzniku cytotoxických T-lymfocytů specifických pro WTl). Pro CD4+ T-lymfocyty je vhodnou metodou pro detekci aktivace specifických T-lymfocytů detekce proliferace T-lymfocytů. Pro CD8+ T-lymfocyty je vhodnou metodou pro detekci aktivace specifických T-lymfocytů detekce vzniku cytolytické aktivity.

Pro terapeutické účely mohou být CD4+ nebo CD8+ T-lymfocyty, které proliferovaly v reakci na WTl polypeptid, polynukleotid nebo APC, expandovány in viro nebo in vivo. Proliferace takových T-lymfocytů in vitro může být provedena různými způsoby. Například mohou být T-lymfocyty opět vystaveny působení WTl polypeptidů, s nebo bez přidání růstových faktorů pro T-lymfocyty, jako je

• · interleukin 2, a/nebo stimulačních buněk, které syntetizují WT1 polypeptid. Přidání stimuačních buněk je výhodné pro přípravě reakce CD8+ T-lymfocytů. T-lymfocyty mohou být expandovány na velký počet in vitro za zachování specificity odpovědi na intermitentní stimulaci WT1 polypeptidem. Stručně, pro primární stimulaci in vitro (IVS) může být velký počet lymfocytů (t.j. více než 4 x 10^v) umístěn do nádoby s mediem obsahujícím lidské sérum. WT1 polypeptid (například peptid v koncentraci 10 ug/ml) může být přidán přímo, spolu s tetanickým toxoidem (například 5 ug/ml). Nádoba může být potom inkubována (například 37 °C po dobu 7 dn§). Pro druhou IVS jsou buňky odebrány a umístěny do nové kultivační nádoby s 2-3 x 10^v ozářených mononukleárních buněk periferní krve. WT1 polypeptid. WT1 polypeptid (například 10 ug/ml) se přidá přímo. Nádoby se inkubují při 37 °C po dobu 7 dnů. V den 2 a 4 po druhé IVS se může přidat 2-5 jednotek interleukinu 2 (IL-2). Pro třetí IVS se T-lymfocyty mohou umístit do jamek a mohou se stimulovat vlastními B-lymfocyty jedince transformovanými EBV, které jsou potaženy peptidem. IL-2 může být přidán ve dny 2 a 4 každého cyklu, jakmile se ověří, že vznikly specifické cytotoxické T-lymfocyty, mohou být expandovány za použití 10-denního stimulačního cyklu s vyššími dávkami IL-2 (20 jednotek) ve dny 2, 4 a 6.

Alternatině může být jeden nebo více T-lymfocytů, které proliferují za přítomnosti WT1 polypeptidu, expandovány klonováním. Způsoby pro klonování buněk jsou dobře známé v oboru a patří mezi ně limitní ředění. Reaktivní T-lymfocyty mohou být přečištěny z periferní krve sensibilizovaného pacienta odstředěním v gradientu hustoty a rozetováním ovčími erythrocyty a mohou být kultivovány se stimulací s nominálním antigenem za přítomnosti ozářených autologních filler cells. Pro přípravu CD4+ T-lymfocytárních linií je WT1 polypeptid použit jako antigenní podnět a autologní lymfocyty periferní krve (PBL) nebo lymfoblastové buněčné linie (LCL imortalizované infekcí virem Epstein-Barrové jsou použity jako buňky prezentující antigen. Pro generování CD8+ T-lymfocytárních linií mohou být jako stimulační buňky použity autologní buňky prezentující antigen transfektované expresním vektorem produkujícím WT1 polypeptid. Získané T-lymfocytární linie mohou být klonovány 2-4 dny po stimulaci antigenem umístěním stimulovaných T-lymfocytů ve frekvenci 0,5 buněk na jamku do 96-jamkových ploten s plochým dnem společně s 1 χ 10⁶ ozářených PBL nebo LCL buněk a rekombinantním interleukinem 2 (rIL2) (50 U/ml). Buňky s klonálním růstem mohou být identifikovány přibližně za 2-3 týdny po umístění na plotnu a mohou být restimulovány vhodným antigenem za přítomnosti autologních buněk prezentujících antigen a potom mohou být, za 2-3 dny po stimulaci antigenem, expandovány přidáním nízkých dávek rIL2 10 U/ml). Klony T-lymfocytů mohou být udržovány ve

24-jamkových plotnách periodickou restimulací antigenem a rIL2, která se provádí přibližně v intervalu 2 týdnů.

V některých provedeních mohou být alogenní T-lymfocyty aktivovány (t.j. senzibilizovány na WT1) in vivo a/nebo in vitro. Taková aktivace může být provedena kontaktováním T-lymfocytů s WT1 polypeptidem, polynukleotidem kódujícím takový polypeptid nebo buňkami produkujícími takový polypeptid za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění aktivace T-lymfocytů. Obecně, T-lymfocyty jsou považovány za aktivované, pokud vede jejich kontakt s WT1 polypeptidem k proliferaci a /nebo aktivaci těchto T-lymfocytů, jak je měřena standardními testy proliferace, uvolňování chrómu a/nebo cytokinů. Stimulační index vyšší než dvojnásobný v proliferaci nebo lýze, a více než trojnásobné zvýšení koncentrací cytokinů, ve srovnání s negativními kontrolami, ukazuje na specificitu T-lymfocytů.Buňky aktivované in vitro mohou být použity, například, při transplantaci kostní dřeně nebo jako infuse dárcovských lymfocytů.

polypeptidy, polynukleotidy,

Farmaceutické prostředky a vakcíny

V některých aspektech mohou být protilátky a/nebo T-lymfocyty zpracovány do farmaceutických prostředků nebo vakcín. Alternativně mohou farmaceutické prostředky obsahovat buňky prezentující antigen (například dendritické buňky) transfektováné WT1 polynukleotidem tak, že exprimují WT1 polypeptid. Farmaceutické prostředky obsahují jednu nebo více takových sloučenin nebo buněk a fyziologicky přijatelný nosič nebo přísadu. Některé vakcíny mohou obsahovat jednu nebo více takových buněk nebo sloučenin a nespecifický zesilovač imunitní reakce, jako je adjuvans nebo liposom (do kterého je sloučenina zapracována). Farmaceutické prostředky nebo vakcíny mohou dále obsahovat přepravní systém, jako jsou například biodegradovatelné mikrosféry, které jsou popsány, například, v US Patentech č. 4897268 a 5075109. Farmaceutické prostředky a vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat jiné sloučeniny, které mohou být biologicky aktivní nebo inaktivní.

V některých provedeních jsou farmaceutické prostředky a vakcíny navrženy tak, aby vyvolávaly reakci T-lymfocytů specifickou pro WT1 polypeptid u pacienta, jako je člověk. Obecně, reakce T-lymfocytů může být vyvolána za použití relativně krátkých polypeptidů (například tvořených 23 sousedními aminokyselinovými zbytky přirozenéhpo WT1 polypeptidů, lépe 4-16 sousedními zbytky, ještě lépe 8-16 sousedními zbytky a nejlépe 8-10 sousedními zbytky). Alternativně, nebo kromě toho, může vakcína obsahovat nespecifický zesilovač imunitní odpovědi, který přednostně zesiluje reakci T-lymfocytů. Jinými slovy, zesilovač imunitní reakce může zesilovat úroveň reakce T-lymfocytů na WT1 polypeptid více než úroveň protilátkové reakce. Například, ve srovnání se standardními adjuvans na bázi olejů, jako je CFA, může zesilovač imunitní reakce přednostně zesilující reakci T-lymfocytů zvyšovat • · · · · • · · · · · · • · · · · ·

.......

···· ·· proliferativní odpověď T-lymfocytů více než dvakrát, lytickou odpověď alespoň o 10% a/nebo aktivaci T-lymfocytů alespoň dvakrát ve srovnání s WT1-negativními buněčnými liniemi, a zároveň nezesiluje protilátkovou reakci. Úroveň zesílení T-lymfocytární nebo protilátkové reakce na WT1 polypeptid může být určena za použití technik v oboru známých, které jsou zde popsány.

Farmaceutický prostředek nebo vakcína může obsahovat DNA kódující jeden nebo více polypeptidů podle předkládaného vynálezu tak, že polypeptid je vytvářen in šitu. Jak bylo uvedeno výše, DNA může být přítomna v různých přenosových systémech známých odborníkům v oboru, jako jsou nukleokyselinové expresní systémy, bakteriální a virové expresní systémy a savčí expresní systémy, Vhodný systém pro expresi nukleové kyseliny obsahuje nutné DNA, cDNA nebo RNA sekvence pro expresi u pacienta (jako je vhodný promotor a terminační signál). Bakteriální přenosové systémy vyžadují podání bakterie (jako je Bacillus Calmette-Guerrin), která exprimuje imunogenní část polypeptidu na svém povrchu. Ve výhodném provedení může být DNA vložena pomocí virového expresního systému (například viru vakcinie nebo jiného pox viru, retroviru nebo adenoviru), což zahrnuje použití nepatogeních (defektních) virů schopných replikace. Techniky pro vkládání DNA do takových expresních systémů jsou dobře známé odborníkům v oboru. DNA může být naked, jak je popsáno, například, v Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993 a v Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. Vychytávání naked DNA může být zvýšeno potažením DNA na biodegradovatelné korálky, které jsou účinně transportovány do buněk.

Jak bylo uvedeno výše, farmaceutický prostředek nebo vakcína může obsahovat buňku prezentující antigen, která exprimuje WT1 polypeptid. Pro terapeutické účely, jak jsou zde popsány, je buňka prezentující antigen výhodně autologní dendritická buňka. Taková ·* · ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · • *

buňka může být připravena a transfektována za použití standardních technik, jako jsou techniky popsané v Reeves et al., Cancer Res. 56: 5672-5677, 1996; Tuting et al., J. Immunol. 160: 1139-1147, 1998; a Nair et al., Nátuře Biotechnol. 16: 364-369, 1998). Expree WT1 polypeptidu na povrchu buněk prezentujících antigen může být potvrzena stimulací in vitro a standardními proliferačními testy, stejně jako testem uvolňování chrómu, jak jsou zde popsány.

Jakýkoliv farmaceuticky přijatelný nosič známý v oboru může být použit ve farmaceutickém prostředku podle předkládaného vynálezu a typ nosiče velmi závisí na způsobu podání. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny pro jakýkoliv vhodný způsob podání, včetně, například, lokálního, orálního, nasálního, intravenosního, intrakraniálního, intraperitoneálního, podkožního nebo intramuskulárního podání. Pro parenterální podání, jako je podkožní injekce, je nosičem výhodně voda, salinický roztok, alkohol, tuk, vosk nebo pufr. Pro orální podání může být použit jakýkoliv z výše uvedených nosičů nebo pevný nosič, jako je manitol, laktosa, škrob, stearan hořečnatý, sacharin sodný, talek, celulosa, glukosa, sacharosa a uhličitan hořečnatý. Jako nosiče pro farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být také použity biodegradovatelné mikrosféry (například polylaktat polyglykolat). Pro některé lokální aplikace jsou vhodné přípravky jako jsou krémy nebo plěfové vody, připravené ze známých složek.

Takové prostředky mohou také obsahovat pufry (například neutrální pufrovaný salinický roztok nebo fosfátem pufrovaný salinický roztok), karbohydráty (například glukosu, mannosu, sacharosu nebo dextrany), manitol, proteiny, polypeptidy a aminokyseliny jako je glycin, antioxidační činidla, chelatační činidla jako je EDTA nebo glutathion, adjuvans (například hydroxid hlinitý) a/nebo konzervační činidla. Alternativně může být prostředek podle předkládaného vynálezu připraven jako lyofilizat. Sloučeniny mohou být také enkapsulovány v liposomech, za použití dobře známých technik.

Ve vakcínách podle předkládaného vynálezu může být použit jakýkoliv z mnoha nespecifických zesilovačů imunitní odpovědi. Většina adjuvans obsahuje substanci určenou pro chránění antigenů před rychlým katabolismem, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej, a stimulátor imunitní reakce, jako je lipid A, proteiny z Bordetella pertussis nebo Mycobacterium tuberculosis. Vhodnými nespecifickými zesilovači imunitní odpovědi jsou adjuvans na bázi kamence (například Alhydrogel, Rehydragel, fosforečnan hlinitý, Algammulin, hydroxid hlinitý); adjuvans na bázi oleje (Freundovo adjuvans (FA), Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA50 nebo Seppic MONTANIDE ISA720); cytokiny (například GM-CSF nebo Fiat3-ligand); mikrosféry; neionická bloková kopolymerová adjuvans; adjuvans na bázi dimethyldioktadecylammoniumbromidu (DDA) AS-1, AS-2 (SmithKline Beecham); adjuvans na bázi Ribi systému; QS21 (Aquila); adjuvans na bázi saponinu (surový saponin, saponin Quil A); adjuvans na bázi muramyl dipeptidu (MDP), jako je SAF (Syntex adjuvans v mikrofluidizované formě (SAF-m)); dimethyldioktadecylammoniumbromid (DDA); adjuvans na bázi lidského komplementu m. vaccae a deriváty; adjuvans na bázi imunostimulačních komplexů (iscom); inaktivované toxiny; a atenuovaná infekční agens (jako je M. tuberculosis).

Jak bylo uvedeno výše, v některých provedeních jsou zesilovače imunitní reakce vybrány podle své schopnosti přednostně vyvolávat nebo zesilovat odpověď T-lymfocytů (například CD4+ a/nebo CD8+) na WT1 polypeptid. Takové zesilovače imunitní reakce jsou dobře známé v oboru a patří • ·

mezi ně, například, Montanide ISA50, Seppic MONTANIDE ISA720; cytokiny (například GM-CSF nebo Flat3-ligand); mikrosféry; adjuvans na bázi dimethyldioktadecylammoniumbromidu (DDA) AS-1 (SmithKline Beecham), AS-2 (SmithKline Beecham); adjuvans na bázi Ribi systému; QS21 (Aquila); adjuvans na bázi saponinu (surový saponin, saponin Quil A); Syntex adjuvans v mikrofluidizované formě (SAF-m); MV, ddMV (Genesis); imunostimulační komplexy (iscom) a inaktivované toxiny.

Prostředky a vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou být podány jako část prostředku se zpomaleným uvolňováním (t.j. prostředku jako je kapsle nebo poresní materiál, který pomalu uvolňuje sloučeninu po podání). Takové prostředky mohou být připraveny známými technikami a mohou být podány, například, orálně, rektálně nebo podkožní implantací v požadovaném cílovém místě. Prostředky se zpomaleným uvolňováním mohou obsahovat polypeptid, polynukleotid, protilátku nebo buňky dispergované v matrici nosiče a/nebo obsažené v zásobníku obklopeném membránou kontrolující rychlost uvolňování. Nosiče pro použití v takových prostředcích jsou biologicky kompatibilní a mohou být také biologicky degradovatelné; výhodně má prostředek relativně konstantní rychlost uvolňování aktivní složky. Množství aktivní sloučeniny obsažené v prostředku se zpomaleným uvolňováním závisí na místě implantace, rychlosti a předpokládaném trvání uvolňování a charakteru léčeného stavu.

Terapie maligních onemocnění

V dalším aspektu předkládaného vynálezu mohou být prostředky a vakcíny podle předkládaného vynálezu použity pro inhibici vzniku maligních onemocnění (například progrese nebo metastazování nebo onemocnění charakterizovaných malým objemem nádoru, jako je minimální zbytková nemoc). Obecně mohou být

takové způsoby použity pro prevenci, oddálení nebo léčbu onemocnění apojeného s expresí WT1. Jinými slovy, terapeutické způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčbu existujícího onemocnění asociovaného s WT1, nebo mohou být použity pro prevenci nebo oddálení vzniku takového onemocnění u pacienta, který je bez onemocnění nebo který je postižen onemocněním, které ještě není spojeno s expresí WT1.

Onemocnění je spojeno s expresí WT1 tehdy, pokud nemocné buňky (například nádorové buňky) někdy v průběhu onemocnění vytvářejí detekovatelně vyšší koncentrace WT1 polypeptidu než normální buňky ve stejné tkáni. Asociace WT1 exprese s maligním onemocněním nevyžaduje, aby byl WT1 přítomen na nádoru. Například, nadměrná exprese WT1 může být přítomna v době iniciace nádoru, ale exprese proteinu může být později ztracena. Alternativně, maligní onemocnění, které není charakterizováno zvýšením exprese WT1 se může, později, vyvinout v onemocnění, které je charakterizované zvýšenou expresí WT1. Proto je jakékoliv maligní onemocnění, kde buňky dříve, nyní nebo v budoucnu exprimují WT1 považováno za onemocnění asociované s expresí WT1.

Imunoterapie může být provedena za použití různých technik, ve kterých sloučeniny nebo buňky podle předkládaného vynálezu odstraňují buňky exprimující WT1 od pacienta. Takové odstranění může probíhat jako důsledek zesílení nebo indukce imunitní reakce specifické pro WT1 nebo buňky exprimující WT1 u pacienta. Alternativně mohou být buňky exprimující WT1 odstraněny ex vivo (například při zpracování autologní kostní dřeně, periferní krve nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve). Frakce kostní dřeně nebo periferní krve mohou být získány za použití standardních technik známých v oboru.

• · · · · ·· · · ···· ···« ··· ···· ··· · · • · ·· · · · ♦· ··

V takových způsobech mohou být farmaceutické prostředky nebo vakcíny podány pacientovi. Termín pacient, jak je zde použit, označuje jakéhokoliv teplokrevného živočicha, výhodně člověka. V souladu s tím mohou být farmaceutické prostředky a vakcíny použity pro prevenci vzniku onemocnění (t.j. profylakticky) nebo pro léčbu pacientů postižených onemocněním (například pro prevenci nebo oddálení progrese a/nebo metastasování existujícího onemocnění). Pacient postižený onemocněním může mít minimální zbytkové onemocnění (například při leukémiích v kompletní nebo parciální remisi nebo u pacientů s nádory po redukci tumoru po chirurgickém výkonu, radioterapii a/nebo chemoterapii). Takový pacient může být imunizován pro inhibici relapsu (t.j. pro prevenci nebo oddálení relapsu, nebo pro snížení závažnosti relapsu). V některých výhodných provedeních je pacient postižen leukémií (například AML, CML, ALL nebo dětskou ALL), myelodysplastickým syndromem (MDS) nebo nádorem (například gastrointestinálním, nádorem plic, štítné žlázy, prsu nebo melanomem), kde nádor nebo leukemie je WT1 pozitivní {t.j. reaguje detekovatelně s anti-WTl protilátkou, jak je zde poskytnuta, nebo exprimuje WT1 mRNA v detekovatelném množství podle RT-PCR, jak je zde popsáno) nebo trpí autoimunitním onemocněním namířeným proti buňkám exprimujícím WT1.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity samostatně nebo v kombinaci s běžnými terapeutickými režimy, jako je chirurgie, ozařování, chemoterapie a/nebo transplantace kostní dřeně (autologní, syngenní, allogenní nebo od nepříbuzného dárce). Jak je podrobněji uvedeno dále, vazebná činidla a T-lymfocyty podle předkládaného vynálezu mohou být použita pro přečištění autologních kmenových buněk. Takové přečištění může být výhodné před, například, transplantací kostní dřeně nebo transfusí krve nebo jejích složek. Vazebná činidla, T-lymfocyty, buňky prezetující antigen (APC) a ·· ·♦ · ·· · · ···· ··*· · t · prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být dále použity pro expanzi a stimulaci (aktivaci) autologních, allogenních, syngenních nebo nepříbuzných T-lymfocytů specifických pro WT1 in vitro a/nebo in vivo. Takové WT1 specifické T-lymfocyty mohou být použity, například, v infusích lymfocytů od dárce.

Způsoby a frekvence podání, stejně jako dávkování, se velmi liší mezi jedinci a mohou být určeny za použití standardních technik. Obecně, farmaceutické prostředky a vakcíny mohou být podány injekčně (například intrakutáně, intramuskulárně, intravenosně nebo subkutáně), intranasálně (například aspirací) nebo orálně. U některých nádorů mohou být farmaceutické prostředky a vakcíny podány lokálně (například kolonoskopicky, gastroskopicky, při videoendoskopii, angiografii nebo za použití jiných metod známých v oboru). Výhodně je 1 až 10 dávek podáno během 52 týdnů. Lépe se podává 6 dávek, v intervalu 1 měsíce, a potom se periodicky mohou podávat dosycovací vakcinace. Pro jiné pacienty mohou být vhodné jiné protokoly. Vhodná dávka je takové množství sloučeniny, které - při podání popsaném výše - navodí protinádorovou imunitní reakci, která je o alespoň 10-50% vyšší než bazální (t.j. neléčená) reakce. Takové reakce mohou být sledovány měřením protinádorových protilátek u pacienta nebo měřením vakcínou indukované tvorby cytolytických efektorových buněk schopných zabíjet nádorové buňky od pacienta in vitro. Takové vakcíny by také měly být schopné způsobit imunitní reakce, které vedou ke zlepšenému klinickému výsledku (například k častějším kompletním nebo parciálním remisím, nebo k delšímu intervalu bez onemocnění a/nebo celkovému přežívání) u vakcinovaných pacientů ve srovnání s nevakcinovanými pacienty. Obecně, pro farmaceutické prostředky a vakcíny obsahující jeden nebo více polypeptidů je dávka každého přítomného polypeptidu v rozmezí od přibližně 100 ug do 5 mg. Vhodné velikosti dávky se liší podle velikosti • ·

pacienta, ale jsou obvykle v rozmezí od přibližně 0,1 ml do přibližně 5 ml.

Obecně, vhodný dávkový a léčebný protokol dodává aktivní sloučeninu v množství dostatečném pro dosažení terapeutického a/nebo profylaktického účinku. Takový účinek může být sledován podle zlepšeného klinického výsledku (například k častějších kompletních nebo parciálních remisí, nebo k delšího intervalu bez onemocnění a/nebo celkového přežívání) u vakcinovaných pacientů ve srovnání s nevakcinovanými pacienty. Zesílení preexistující imunintní odpovědi na WT1 obvykle koreluje se zlepšeným klinickým výsledkem. Takové imunitní reakce mohou být sledovány za použití standardních testů na proliferaci, cytotoxicitu a nebo cytokiny, které mohou být provedeny na vzorcích od pacienta získaných před a po léčbě.

V dalším aspektu metody pro inhibici vývoje maligního onemocnění charakterizovaného expresí WT1 obsahují podání autologních T-lymfocytů, které byly aktivovány reakcí na WT1 polypeptid, nebo APC exprimujících WT1, jak byly popsány výše. Takové T-lymfocyty mohou být CD4+ a/nebo CD8+ a mohou být proliferovány způsobem popsaným výše. T-lymfocyty mohou být podány jedinci v množství účinném pro inhibici vývoje maligního onemocnění. Obvykle je 1 x 10® až 1 x 10¹¹ T-lymfocytů/M²podáno intravenosně, intrakavitárně nebo do lůžka resekovaného nádoru. Odborníkům v oboru bude jasné, že počet buněk a frekvence podávání budou záviset na odpovědi pacienta.

V některých provedeních mohou být T-lymfocyty stimulovány před autologní transplantací kostní dřeně. Taková stimulace může proběhnout in vivo nebo in vitro. Pro stimulaci in vitro může být kostní dřeň a/nebo periferní krev (nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve) získaná od pacienta kontaktovaná s

WT1 polypeptidem, polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid a/nebo APC exprimujícími WT1 polypeptid, za podmínek a po dobu dostatečnou pro stimulaci T-lymfocytů, jak bylo popsáno výše. Kostní dřeň, kmenové buňky periferní krve a/nebo WT1 specifické T-lymfocyty mohou být podány pacientovi za použití standardních technik.

V příbuzných provedeních mohou být T-lymfocyty příbuzného nebo nepříbuzného dárce stimulovány před syngenní nebo allogení (příbuzenskou nebo nepříbuzenskou) transplantací kostní dřeně. Taková stimulace může být provedena in vivo nebo in vitro. Pro stimulaci in vitro může být kostní dřeň a/nebo periferní krev (nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve) získaná od příbuzného nebo nepříbuzného dárce kontaktována s WT1 polypeptidem, WT1 polynukleotidem a/nebo APC exprimujícími WT1 polypeptid, za podmínek a po dobu dostatečnou pro stimulaci T-lymfocytů, jak bylo popsáno výše. Kostní dřeň, kmenové buňky periferní krve a/nebo WT1 specifické T-lymfocyty mohou být potom podány pacientovi za použití standardních technik.

V jiných provedeních mohou být WT1-specifické T-lymfocyty, jak jsou zde popsány, použity pro odstranění buněk exprimujících WT1 z autologní kostní dřeně, periferní krve nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve (například periferní krve obohacené o CD34+) před jejím podáním pacientovi. Takové způsoby mohou být provedeny kontaktováním kostní dřeně nebo PB s takovými T-lymfocyty za podmínek a po dobu dostatečnou pro to, aby se buňky exprimující WT1 redukovaly na méně než 10%, lépe na méně než 5% a nejlépe na méně než 1% celkového počtu myeloidních nebo lymfatických buněk v kostní dřeni nebo v periferní krvi. Rozsah, ve kterém byly takové buňky odstraněny, může být snadno určen standardními metodami, jako je, například, kvalitativní a kvantitativní PCR analýza, morfologická, imunohistochemická a FACS analýza. Kostní dřeň nebo periferní krev (nebo jejich frakce) mohou být potom podány pacientovi za použití standardních technik.

Diagnostické metody

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro detekci maligního onemocněního spojeného s expresí WT1 a pro sledování účinnosti imunizace nebo terapie takového onemocnění. Takové metody jsou založeny na objevu podle předkládaného vynálezu, že imunitní odpověď specifická pro WT1 protein může být detekována u pacientů postižených takovým onemocněním, a že způsoby, které zesilují takové imunitní reakce, mohou být terapeutickým přínosem.

Pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 může být pacent testován na hladinu T-lymfocytů specifických pro WT1. V některých způsobech je biologický vzorek obsahující CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocyty izolované od pacienta inkubován s WT1 polypeptidem, polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid a/nebo APC exprimujícím WT1 polypeptid, a detekuje se přítomnost neb o nepřítomnost specifické aktivace T-lymfocytů, jak je zde popsáno. Vhodným biologickým vzorkem jsou, například, izolované T-lymfocyty. T-lymfocyty mohou být izolovány od pacienta za použití běžných technik (jako je Ficoll/Hypaque gradientově odstředění lymfocytů periferní krve). T-lymfocyty mohou být inkubovány in vitro po dobu 2-9 dnů (obvykle 4 dnů) při 37 °C s WT1 polypeptidem (například 5 až 25 ug/ml). Pro kontrolu může být vhodné inkubovat samostatný podíl T-lymfocytů za nepřítomnosti WT1 polypeptidu. Pro CD4+ T-lymfocyty je aktivace výhodně detekována hodnocením proliferace T-lymfocytů. Pro CD8+ T-lymfocyty je aktivace výhodně detekována hodnocením • ·

• · · · · · · · · · · · · · cytolytické aktivity. Hladina proliferace, která je alespoň dvakrát vyšší a/nebo cytolytické aktivity, která je alespoň o 20% vyšší než u pacientů bez onemocnění ukazuje na přítomnost maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1. Další korelace může být provedena, například, za použití metod dobře zámých v oboru, mezi úrovní proliferace aúnebo cytolytické aktivity a předpokládanou odpovědí na terapii. Konkrétně, pacienti mající vyšší protilátkovou, proliferativní a/nebo lytickou odpověď, budou mít patrně vyšší odpověď na terapii.

V jiných metodách je biologický vzorek získaný od pacienta testován na hladinu protilátek specifických pro WT1. Biologický vzorek je inkubován s WT1 polypeptidem, polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid a/nebo APC exprimujícími WT1 polypeptid, za podmínek a po dobu dostatečnou pro vytvoření imunokomplexů. Potom se detekují imunokomplexy vytvořené mezi WT1 polypeptidem a protilátkami v biologickém vzorku, které se specificky váží na WT1 polypeptid. Biologickým vzorkem pro použití v takových způsobech může být jakýkoliv vzorek získaný od pacienta, který by mohl obsahovat protilátky. Vhodnými biologickými vzorky jsou krev, sérum, ascites, kostní dřeň, pleurální výpotky a mozkomíšní mok.

Biologický vzorek se inkubuje s WT1 polypeptidem v reakční směsi za podmínek a po dobu dostatečnou pro vytvoření imunokomplexů mezi WT1 polypeptidem a protilátkami v biologickém vzorku, které se specificky váží na WT1 polypeptid. Například, biologický vzorek a WT1 polypeptid mohou být inkubovány při 4 °C po dobu 24-48 hodin.

Po inkubaci se reakční směs testuje na přítomnost imunokomplexů. Detekce imunokomplexů vytvořených mezi WT1 polypeptidem a protilátkami přítomnými v biologickém vzorku může být provedena různými známými technikami, jako je radioimunotest (RIA) a enzymový imunosorbentní test (ELISA). Vhodné testy jsou dobře známé v oboru a jsou popsány v odborné a patentové literatuře (např. Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Testy, které mohou být použity, jsou například sandwichový imunotest využívající dvě monoklonální protilátky (david et al., US Patent č. 4376110); sandwichové testy využívající monoklonální - polyklonální protilátky (Wide et al., v Kirkham and Hunter, ed., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburg, 1970) ; westernová hybridizace podle Gordno et al. (US Patent 4452901); imunoprecipitace značeného ligandů (Brown et al., J. Biol. Chem. 255: 4980-4983, 1980); enzymový imunosorbentní test, jak je popsán, například, v Raines and Ross (J. Biol. chem 257: 5154-5160, 1982); imunocytochemické techniky, včetně technik využívajících fluorochromů (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39: 477, 1980); a neutralizace akltivity (Bowen-Pope et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 2396-2400, 1984). Mezi další imunotesty patří testy popsané v US Patentech č. 3817827; 3850752; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; a 4098876.

Za účelem detekce může být WT1 polypeptid značený nebo neznačený. Neznačený WT1 polypeptid může být použit v aglutinačních testech nebo v kombinaci se značenými detekčními činidly, která se váží na imunokomplexy (například anti-imunoglobulinem, proteinem G, proteinem A nebo lektinem a sekundárními protilátkami nebo jejich vazebnými fragmenty pro antigen, které se váží na protilátky, které se váží specificky na WT1 polypeptid). Pokud je WT1 polypeptid značený, může být reportérovou skupinou jakákoliv skupina známá v oboru, včetně radioizotopů, fluorescenčních skupin, luminiscenčních skupi, enzymů, biotinu a barviv.

V některých testech je neznačený WT1 polypeptid imobilizován na pevném nosiči. Pevný nosič může být materiál známý odborníkům v oboru, na který může být polypeptid navázán. Například, pevným nosičem může být testovací jamka na mikrotitrační plotně nebo nitrocelulosová nebo jiná vhodná membrána. Alternativně může být nosičem korálek nebo disk, například skleněný, ze skelných vláken, latexový nebo z plastu, jako je polystyren nebo polyvinylchlorid. Nosičem může být také magnetická částice nebo sensor optického vlákna, jak je popsáno, například, v US Patentu č. 5359681. Polypeptid může být imobilizován na pevném nosiči za použití různých technik známých v oboru, které jsou popsány v patentové a odborné literatuře. V předkládaném vynálezu označuje termín imobilizace jak nekovalentní asociaci, jako je adsorpce, tak kovalentní navázání (které může být přímo mezi antigenem a funkčními skupinami na nosiči nebo prostřednictvím zesilovacího činidla). Výhodná je imobilizace adsorpcí na jamku mikrotitrační plotny nebo na mebránu. V takových případech může být absorpce provedena kontaktováním WT1 polypeptidu, ve vhodném pufru, se solidním nosičem po vhodnou dobu. Doba kontaktu se liší podle teploty, ale obvykle je 1 hodina až 1 den. Obecně, kontaktování jamky plastové mikrotitrační plotny (jako je polystyrénová nebo polyvinylchloridová plotna) s množstvím polypeptidu od 10 ng do 10 ug, lépe od 100 ng do 1 ug, dostatečné pro imobilizaci adekvátního množství peptidů.

Po imobilizaci se zbývající vazebná místa pro protein na nosiči obvykle blokují. Může být použito jakékoliv vhodné blokovací činidlo známé odborníkům v oboru, jako je hovězí sérový albumin, Tween 20™ (Sigma Chemical Company, ST. Louis, MO), teplem inaktivované normální kozí sérum (NGS), nebo BLOTTO (pufrovaný roztok odtučněného sušeného mléka obsahující také konzervační činidlo, soli a protipěnivé činidlo). Nosič se «« · 4 · · Γ · * • » « · ···· ··· ···· · · · ·· potom inkubuje s biologickým vzorkem, o kterém se předpokládá, že obsahuje specifickou protilátku. Vzorek se potom aplikuje jako takový, nebo častěji naředěný, obvykle v pufrovaném roztoku, který také obsahuje malé množství (0,1% - 5,0% hmotnostních) proteinu, jako je SBA, NGS nebo BLOTTO. obecně, vhodná doba kontaktu (t.j. inkubační doba) je doba, která je dostatečná pro detekci přítomnosti protilátky, která se specificky váže na WT1, ve vzorku obsahujícím takovou protilátku. Výhodně je doba kontaktu dostatečná pro dosažení vazby, která je alespoň 95% vzhledem k vazbě dosažené při rovnováze mezi navázanou a nenavázanou protilátkou. Odborníkům v oboru bude jasné, že doba nutná pro dosažení rovnováhy může být snadno určena testováním úrovně vazby v závislosti na čase. Při pokojové teplotě je obvykle dostatečná inkubační doba přibližně 30 minut.

Nenavázaný vzorek může být potom odstraněn promytím pevného nosiče vhodným pufrem, jako je PBS obsahující 0,1% Tween 20™. Potom se může přidat detekční činidlo, které se váže imunokomplexy a které obsahuje reportérovou skupinu. Detekční činidlo se potom inkubuje s imunokomplexy po dobu dostatečnou pro detekci navázané protilátky. Vhodná doba může určena testování závislosti vazby na času. Nenavázané detekční činidlo se potom odstraní a navázané detekční činidlo se detekuje pomocí reportérové skupiny. Způsob použitý pro detekci reportérové skupiny závisí na charakteru reportérové skupiny. Pro radioaktivní skupiny jsou vhodné scintilační a autoradiografické metody. Spektroskopické metody mohou být použity pro detekci barviv, luminiscentních skupin a fluorescentních skupin. Biotin může být detekován pomocí avidinu, navázaného na různé reportérové skupiny (obvykle radioaktivní nebo fluorescentní skupinu nebo enzym). Enzymové reportérové skupiny (například křenová peroxidasa, · φφ · ** ··> « * « 4 ··· · · · · · ·»·* · 4 · 9 υ · • »9 4 9 4 » ··· 9 € beta-galaktosidasa, alkalická fosfatasa a glukosaoxidasa) mohou být detekovány přidáním substrátu (obvykle na určitou dobu), a potom následuje spektroskopická nebo jiná analýza produktů reakce. Bez ohledu na použitou metodu ukazuje detekce vazby reakčního činidla alespoň dvakrát vyšší než základní vazba (t.j. vazba získaná pro biologický vzorek získaný od pacienta bez onemocnění) na přítomnost maligního onemocnění.

Obecně, způsoby pro sledování účinnosti nebo terapie obsahují monitorování změn v koncentraci protilátek specifických pro WT1 u pacienta. Způsoby, kterými jsou sledovány koncentrace protilátek, mohou zahrnovat kroky: (a) inkubaci prvního biologického vzorku WT1 polypeptidem, kde inkubace je provedena za podmínek a dobu dostatečnou pro tvorbu imunokomplexů; (b) detekci imunokomplexů vytvořených mezi WT1 polypeptidem a protilátkami v biologickém vzorku, které se specificky váží na WT1 polypeptid; (c) opakování kroků (a) a (b) za použití druhého biologického vzorku získaného od stejného pacienta po terapii nebo imunizaci; a (d) srovnání počtu imunokomplexů detekovaných v prvním a druhém biologickém vzorku. Alternativně může být místo WT1 polypeptidů použito polynukleotidu kódujícího WT1 polypeptid nebo APC exprimující WTl polypeptid. V takových způsobech se detekují imunokomplexy mezi WTl polypeptidem kódovaným polynukleotidem nebo exprimovaným APC, a protilátkami v biologickém vzorku.

Způsoby, ve kterých se sleduje aktivace a/nebo počet T-lymfocytů specifických pro WTl, se monitorují za použití kroků: (a) inkubaci prvního biologického vzorku obsahujícího CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocyty (například kostní dřeně, periferní krve nebo jejich frakcí) získaného od pacienta před terapií nebo imunizací, s WTl polypeptidem, kde inkubace je provedena za podmínek a dobu dostatečnou pro specifickou aktivaci, • ·· · ··· · · · · ···· · · · · · proliferaci a/nebo lýzu T-lymfocytů; (b) detekci aktivace, proliferace a/nebo lýzy T-lymfocytů; (c) opakování kroků (a) a (b) za použití druhého biologického vzorku obsahujícího CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocyty, kde druhý biologický vzorek je získán od stejného pacienta po terapii nebo imunizaci; a (d) srovnání úrovně aktivace, proliferace a/nebo lýzy T-lymfocytů v prvním a druhém biologickém vzorku. Alternativně může být místo WTl polypeptidů použito polynukleotidu kódujícího WTl polypeptid nebo APC exprimující WTl polypeptid.

Biologickým vzorkem pro použití v takových způsobech může být jakýkoliv vzorek získaný od pacienta, který by mohl obsahovat protilátky, CD4+ T-lymfocyty a/nebo CD8+ T-lymfocyty. Vhodnými biologickými vzorky jsou krev, sérum, ascites, kostní dřeň, pleurální výpotky a mozkomíšní mok. První biologický vzorek může být získán před zahájením terapie nebo imunizace nebo během terapie nebo vakcinace. Druhý biologický vzorek by měl být získán podobným způsobem, ale po další terapii nebo imunizaci. Druhý biologický vzorek může být získán po dokončení nebo během terapie nebo imunizace, pod podmínkou, že mezi izolací prvního a druhé biologického vzorku proběhne alespoň část terapie nebo imunizace.

Inkubace a detekce pro oba vzorky mohou být provedeny způsobem popsaným výše. Statisticky významné zvýšení počtu imunokomplexů ve druhém vzorku vzhledem k prvnímu vzorku ukazuje na úspěšnou terapii nebo imunizaci.

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezuj í předkládaný vynález.

• · ·· · ·· * · ···· · · · · · ♦ ···· ··· ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Identifikace imunitní reakce na WT1 u pacientů s hematologickými malignitami

Tento příklad ilustruje identifikaci existující imunitní reakce u pacientů s hematologickými malignitami.

Pro hodnocení přítomnosti preexistující WT1 specifické protilátkové odpovědi u pacientů byla séra od pacientů s AML, ALL, CML a těžkou aplastickou anemií analyzována za použití westernová přenosu. Séra byla testována na schopnost imunosrážet WT1 z lidské leukemické buněčné linie K562 (Američan Type Culture Collection, Manassas, VA). V každém případě byly imunosraženiny separovány gelovou elektroforesou, byly přeneseny na membrány a byly sondovány anti-WTl protilátkou WT180 (Santa Cruz Biotechnology, lne., Santa Cruz, CA). Tento westernův přenos identifikoval potenciální WT1 specifické protilátky u pacientů s hematologickou malignitou. Representativní westernův přenos ukazující výsledky pro pacienta s AML je uveden na obr. 2. 52 kDa protein v imunoprecipitátu vytvořeném za použití séra od pacienta byl rozpoznán WT1 specifickou protilátkou. 52 kDa protein migroval při stejné velikosti jako pozitivní kontrola.

Příklad 2: Indukce protilátek k WT1 u myší imunizovaných buněčnými liniemi exprimujícími WT1

Tento příklad ilustruje použití buněk exprimujících WT1 pro indukci WT1 specifické protilátkové odpovědi in vivo.

Detekce existujících protilátek k WT1 u pacientů s leukémií naznačuje, že je možná imunizace WT1 proteinem pro vyvolání « · • · · o • · · ·· · ♦ · imunity k WT1. Pro testování toho, zda může být imunita k WT1 vyvolána vakcinací, byla myším injikována TRAMP-C, WT1 pozitivní nádorová buněčná linie pocházející z B6. Stručně, samci B6 myší byli imunizováni 5 χ 10⁶ TRAMP-C buňkami podkožně a dvakrát v intervalu 3 týdnů bylo provedeno dosycení 5 x 10^ebuňkami. Tři týdny po poslední imunizaci bylo získáno sérum a jednobuněčné suspenze slezin se připravily v RPMI 1640 mediu (GIBCO) s 25 uM beta-2-merkaptoethanolu, 200 jednotkami penicilinu na ml, 10 mM L-glutaminu a 10% fetálním hovězím sérem.

Po imunizaci TRAMP-C byla detekovatelné WT1 specifická protilátková odpověď u imunizovaných zvířat. Representativní westernový přenos je uveden na obr. 3. Tyto výsledky ukazují, že imunizace WT1 proteinem může vyvolat imunitní reakci namířenou proti WT1 proteinu.

Příklad 3: Indukce Th a protilátkové odpovědi u myší imunizovaných WT1 peptidy

Tento příklad ilustruje schopnost imunizace WT1 peptidy vyvolat imunitní reakci specifickou pro WT1.

EMBO J. , 7: 93-100, 1988; Deavin et al.,

Peptidy vhodné pro vyvolání Ab a proliferativní T-lymfocytární reakce byly identifikovány podle Tsites programu (Rothbard and Taylor,

Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996), který vyhledává peptidové motivy, které mejí potenciál pro vyvolání Th reakce. Peptidy uvedené v tabulce I byly syntetizovány a sekvencovány.

• « • · · • · <ι • · ·

Tabulka I: WT1 peptidy

peptid------	sekvence -------------------	Komentár ------- (
Myší p6-22	RDLNALLPAVSSLGGGG (SEQ ID NO: 13)	1 chybný pár vzhledem o k lidské WT1 sekvenci
Lidský^1: p6-22	RDLNALLPAVPSLGGGG (SEQ ID NO: 1)
Lidský/myší:: P117-139	PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (SEQ ID NOs: 2 and 3)
Myší- p244-262	GATLKGMAAGSSSSVKWTE (SEQ ID NO: 14)	1 chybný pár'vzhledra ’^ k lidské WT1 sekvenci
Lidský: p244-262	GATLKGVAAGSSSSVKWTE (SEQIDNO:4)
Lidský/myší_;	RIHTHGVFRGIQDVR
p287-301	(SEQ ID NOs: 15 and 16)
i Myší: p299-313	VRRVSGVAPTLVRS (SEQ ID NO: 17)	1 chybný pár vzhledem < » k lidské WT1 sekvenci (
Lidský/myší : p421-435	CQKKFARSDELVRHH (SEQ ID NOs: 19 and 20)

Pro imunizaci byly peptidy rozděleny do skupin následujícím způsobem:

Skupina A: p6-22 lidský: 10,9 mg v 1 ml (10 ul = 10 ug) pll7-139 lidský/myší: 7,6 mg v 1 ml (14 ul = 100 ug) p244-262 lidský: 4,6 mg v 1 ml (22 ul = 100 ug)

Skupina B:

p287-301 lidský/myší: 7,2 mg v 1 ml (14 ul = 100 ug) p299-313 myší: 6,6 mg v 1 ml (15 ul = 100 ug) p421-435 lidský/myší: 3,3 mg v 1 ml (30 ul = 100 ug)

Kontrola: (FBL peptid 100 ug) + CFA/IFA

Kontrola: (CD45 peptid 100 ug) + CFA/IFA

Skupina A obsahovala peptidy v amino- koncové části WT1 (exon 1) a skupina B obsahovala peptidy přítomné v karboxy konci, který obsahuje čtyři motivy zinkových prstů s homologii sekvence s jinými vazebnými proteiny pro DNA. Ve skupině B jsou p287-301 a p299-313 odvozeny od exonu 7, zinkového prstu 1, a p421-435 je odvozen z exonu 10, zinkového prstu IV.

B6 myši byly imunizované skupinou WT1 peptidů nebo kontrolním peptidem. peptidy byly rozpuštěny v 1 ml sterilní vody pro injekce a B6 myši byly imunizované třikrát v intervalu tří týdnů. Použitými adjuvans byly CFA/IFA, GM-CSF a Montinide. Přítomnost protilátek specifických pro WT1 byla potom určena způsobem popsaným v příkladech 1 a 2 a proliferativní reakce T-lymfocytů byla hodnocena standardním testem inkorporace thymidinu, ve kterém jsou buňky kultivovány za přítomnosti antigenu a proliferace se hodnotí měřením inkorporované radioaktivity (Chen et al., Cancer Res. 54. 1065-1070, 1994). Konkrétně, lymfocyty byly kultivovány v 96-jamkových plotnách v hustotě 2 x 10^s buněk na jamku s 4 x 10⁵ ozářených (3000 rad) syngenních buněk sleziny a uvedeným peptidem.

Imunizace myší skupinou peptidů označenou jako skupina A vyvolala protilátkovou odpověď k WT1 (obr. 4). Žádné protilátky nebyly detekovány po imunizaci vakcínou B, což je v souladu s chyběním odpovědi pomocných T-lymfocytů na imunizaci vakcínou B. pll7-139 vyvolal proliferativní odpovědi T-lymfocytů (obr. 5A-5C). Stimulační indexy (SI) byly mezi 8 a 72. Další peptidy (p6-22 a p299-313) také vyvolaly proliferativní reakci T-lymfocytů. Imunizace p6-22 vedla ke stimulačnímu indexu (SI)

2,3 a imunizace p299-313 vedla k SI 3,3. Pozitivními kontrolami byly T-lymfocyty stimulované ConA, stejně jako T-lymfocyty stimulované známými antigeny, jako je CD45 a FBL, a allogenní T-lymfocytární linie (De Bruijn et al., Eur. J. Immunol 21:

proliferativní odpovědi pozorované pro vakcíně A (obr. 6A) a vakcíně B (obr.

proferativní odpověď T-lymfocytů na se stimulačními indexy • Ψ • «· • ·· · · · ♦ ·

2963-2970, 1991).

Obr. 6A a 6B ukazují každý ze tří peptidů ve

6B). Vakcína A vyvolala imunizační peptidy p6-22 a pll7-139, (SI) mezi 3 a 8 (tlusté čáry). Nebyla detekována žádná proliferativní odpověď na p244-262 (obr. 6A).

Další stimulace in vitro byly provedeny jako stimulace jedním peptidem za použití pouze p6-22 a pll7-139. Stimulace T-lymfocytární buněčné linie specifické pro vakcínu A pll7-139 vedla k proliferaci na pll7-139 bez odpovědi na p6-22 (obr. 7A). Klony získané z linie byly specifické pro pll7-139 (obr. 7B). naopak, stimulace T-lymfocytární linie specifické pro vakcínu B p6-22 vedla k proliferaci na p6-22 bez odpovědi na P117-139 (obr. 7C). Klony získané z této linie byly specifické pro p6-22 (obr. 7D).

Tyto výsledky ukazují, že vakcinace protilátkové odpovědi na WT1 protein a v reakci na imunizační peptidy.

Příklad 4: Indukce CTL odpovědí u myší peptidy

WT1 peptidy může vyvolat proliferaci T-lymfocytů imunizovaných WT1

Tento příklad ilustruje schopnost WT1 peptidů vyvolat CTL imunitu.

Peptidy (9-mery) s motivy vhodnými pro vazbu na MHC I byly identifikovány za použití BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA (Parker et al., J. Immunol. 152: 163, 1994). Peptidy identifikované takovými analýzami jsou uvedeny v tabulkách II 60 • ·

XLIV. V každé z těchto tabulek ukazuje skóre teoretickou vazebnou afinitu (poločas disociace) peptidu na uvedenou MHC molekulu.

Peptidy identifikované za použití Tsites programů (viz Rothbard and Taylor, EMBO J., 7: 93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996), které vyhledávají peptidové motivy, které mohou vyvolat Th odpovědi, jsou dále uvedeny na obr. 8A a 8B a v tabulce XLV.

Tabulka II

Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA Al

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly
obsahující tuto	subsekvenci
1	137	CLESQPAIR (SEQ ID NO:47)	18,000
2	80	GAEPHEEQC (SEQ IDNO:87)	9,000
3	40	FAPPGASAY (SEQ IDNO:74)	5,000
4	354	QCDFKDCER (SEQ ID NO: 162)	5,000
5	2	GSDVRDLNA (SEQ IDNO:101)	3,750
6	152	VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244)	2,500
7	260	WTEGQSNHS (SEQ ID NO:247)	2,250
8	409	TSEKPFSCR (SEQ ID NO:232)	1,350

• · · · · · ♦ • ·· · ··* · · ···· ··· ·

..........

V -U A · · · ···«

9	73	KQEPSWGGA (SEQ ID NO: 125)	' 1,350
10	386	KTCQRKFSR (SEQ ID NO: 128)	1,250
11	37	VLDFAPPGA (SEQ IDNO:241)	1,000
12	325	CA YPGCNKR (SEQ IDNO:44)	1,000
13	232	QLECMTWNQ (SEQ ID NO: 167)	0,900
14	272	ESDNHTTPI (SEQ ID NO:71)	0,750
15	366	RSDQLKRHQ (SEQ ID NO: 193)	0,750
16	222	SSDNLYQMT (SEQ IDNO:217)	0,750
17	427	RSDELVRHH (SEQ ID NO: 191)	0,750
18	394	RSDHLKTHT (SEQ ID NO: 192)	0,750
19	317	TSEKRPFMC (SEQ IDNO:233)	0,675
20	213	QALLLRTPY (SEQ ID NO: 160)	0,500

Tabulka III: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA A0201

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	313,968
2	187	SLGEQQYSV (SEQ IDNO:214)	285,163
3	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	181,794
4	242	NLGATLKGV (SEQ IDNO:146)	159,970
5	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	68,360
6	292	GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103)	51,790

7	191 _:	QQYSVPPPV (SEQ IDNO.T71)	22,566
8	280	ILCGAQYRI (SEQ ID NO:116)	17,736
9	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO-.49)	15,428
10	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	15,428
11	7	DLNALLPAV (SEQ IDNO:58)	11,998
12	227	YQMTSQLEC (SEQ IDNO:251)	8,573
13	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	8,014
14	309	TLVRSASET (SEQ ID NO:226)	7,452
15	408	KTSEKPFSC (SEQ IĎ NO: 129)	5,743
16	340	LQMHSRKHT (SEQ ID NO: 139)	4,752
17	228	QMTSQLECM (SEQ ID NO: 169)	4,044
18	93	TVHFSGQFT (SEQ ID NO:235)	3,586
19	37	VLDFAPPGA (SEQ IDNO.-241)	3,378
20	86	EQCLSAFTV (SEQ ID NO:69)	3,068

Tabulka IV: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA A0205

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	10	ÁLLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	42,000
2	292	GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103)	24,000
3	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	21,000
4	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	21,000

5	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	16,800
6	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	14,000
7	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	7,000
S	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO:49)	7,000
9	187	SLGEQQYSV (SEQ ID NO:214)	6,000
10	191	QQYSVPPPV (SEQ ID NO: 171)	4,800
11	340	LQMHSRKHT (SEQ ID NO: 139)	4,080
12	242	NLGATLKGV (SEQ ID NO: 146)	4,000
13	227	YQMTSQLEC (SEQ ID NO:251)	3,600
14	194	SVPPPVYGC (SEQ ID NO:218)	2,000
15	93	TVHFSGQFT (SEQ ID NO:235)	2,000
16	280	ILCGAQYRI (SEQ ID NO: 116)	1,700
17	98	GQFTGTAGA (SEQ ID NO:99)	1,200
18	309	TLVRSASET (SEQ ID NO:226)	1,000
19	81	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30)	0,980
20	73	KQEPSWGGA (SEQ IDNO:125)	0/960

Tabulka V: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA A24

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	16,800
2	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194)	12,000

3	356	DFKDCERRF (SEQ IDNO:55)	12,000
4	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	9,600
5	326	AYPGCNKRY (SEQ IDNO:42)	7,500
6	270	GYESDNHT (SEQ ID NO:106)T	7,500
Ί	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	7,200
8	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	7,200
9	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	7,200
10	329	GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90)	6,600
11	417	RWPSCQKKF (SEQ ID NO: 196)	6,600
12	47	AYGSLGGPA (SEQ IDNO:41)	6,000
13	180	DPMGQQGSL (SEQ ID NO:59)	6,000
14	4	DVRDLNALL (SEQ IDNO.-62)	5,760
15	285	QYRIHTHGV (SEQ IDNO:175)	5,000
16	192	QYSVPPPVY (SEQ ID NO: 176)	5,000
17	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	O o 00
18	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	4,800
19	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	4,000
20	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO-.49)	4,000

Tabulka VI: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA A3

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	436	NMHQRNMTK (SEQ ID NO; 148)	40,000
2	240	QMNLGATLK (SEQ ID NO: 168)	20,000
3	88	CLSAFTVHF (SEQ ID NO:48)	6,000
4	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	4,500
5	169	AQFPNHSFK (SEQ IDNO:36)	4,500
6	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	4,050
7	137	CLESQPAIR (SEQ ID NO:47)	4,000
8	225	NLYQMTSQL (SEQ IDNO:147)	3,000
9	32	AQWAPVLDF (SEQ IDNO.-37)	2,700
10	280	ILCGAQYRI (SEQ ID NO: 116)	2,700
11	386	KTCQRKFSR (SEQ ID NO: 128)	1,800
12	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO.-49)	1,200
13	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	1,200
14	152	VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244)	1,000
15	187	SLGEQQYSV (SEQ IDNO-.214)	0,900
16	383	FQCKTCQRK (SEQ IDNO:80)	0,600
17	292	GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103)	0,450
18	194	SVPPPVYGC (SEQ ID NO:218)	0,405
19	287	RIHTHGVFR (SEQ ID	0,400

		NO: 182)
20	263	GQSNHSTGY (SEQ ID NO: 100)	0,360

Tabulka VII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA A68.1

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	100	FTGTAGACR (SEQ IDNO:84)	100,000
2	386	KTCQRKFSR (SEQ ID NO: 128)	50,000
3	368	DQLKRHQRR (SEQ IDNO:60)	30,000
4	312	RSASETSEK (SEQ ID NO: 190)	18,000
5	337	LSHLQMHSR (SEQ ID NO:141)	15,000
6	364	FSRSDQLKR (SEQ ID NO:83)	15,000
7	409	TSEKPFSCR (SEQ ID NO:232)	15,000
8	299	DVRRVPGVA (SEQ IDNO:63)	12,000
9	4	DVRDLNALL (SEQ IDNO:62)	12,000
10	118	SQASSGQAR (SEQ IDNO:216)	10,.000
11	343	HSRKHTGEK (SEQ IDNO:111)	9,000
12	169	AQFPNHSFK (SEQ IDNO:36)	9,000
13	292	GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103)	8,000
14	325	CAYPGCNKR (SEQ IDNO:44)	7,500
15	425	FARSDELVR (SEQ IDNO:75)	7,500
16	354	QCDFKDCER (SEQ ID NO: 162)	7,500
17	324	MCAYPGCNK (SEQ	6/)00

• · ·

		ID NO: 142)
18	251	AAGSSSSVK (SEQ ID NO:28)	6,000
19	379	GVKPFQCKT (SEQ ID NO: 104)	6,000
20	137	CLESQPAIR (SEQ ID NO:47)	5,000

Tabulka VIII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WTl peptidů na lidský HLA A1101

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	386	KTCQRKFSR (SEQ ID NO: 128)	1,800
2	169 :	AQFPNHSFK (SEQ IDNO:36)	1,200
3	436	NMHQRNMTK (SEQ ID NO: 148)	0,800
4	391	KFSRSDHLK (SEQ ID NO: 120)	0,600
5	373	HQRRHTGVK (SEQ ID NO: 109)	0,600
6	383	FQCKTCQRK (SEQ ID NO:80)	0,600
7	363	RFSRSDQLK (SEQ ID NO: 178)	0,600
8	240	QMNLGATLK (SEQ ID NO: 168)	0,400
9	287	RIHTHGVFR (SEQ ID NO: 182)	0,240
10	100	FTGTAGACR (SEQ ID NO:84)	0,200
11	324	MCAYPGCNK (SEQ ID NO: 142)	0,200
12	251	AAGSSSSVK (SEQ IDNO:28)	0,200
13	^- 415	SCRWPSCQK (SEQ ID NO:201)	0,200
14	118	SQASSGQAR (SEQ IDNO:216)	0,120
15	292	GVFRGIQDV (SEQ	0,120

		ID NO: 103)
16	137	CLESQPAIR (SEQ ID NO:47)	0,080
17	425	FARSDELVR (SEQ ID NO:75)	0,080
18	325	CAYPGCNKR (SEQ IDNO:44)	0,080
19	312	RSASETSEK (SEQ ID NO: 190)	0,060
20	65	PPPPHSFI (SEQ ID NO:156)K	0,060

Tabulka IX: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA A3101

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	386	KTCQRKFSR (SEQ ID NO: 128)	9,000
2	287	RIHTHGVFR (SEQ ID NO: 182)	6,000
3	137	CLESQPAIR (SEQ ID NO:47)	2,000
4	118	SQASSGQAR (SEQ IDNO:216)	2,000
5	368	DQLKRHQRR (SEQ ID NO:60)	1,200
6	100	FTGTAGACR (SEQ IDNO:84)	1,000
7	293	VFRGIQDVR (SEQ ID NO:238)	0,600
8	325	CAYPGCNKR (SEQ ID NO:44)	0,600
9	169	AQFPNHSFK (SEQ IDNO:36)	0,600
10	279	PILCGAQYR (SEQ ID NO:155)	0,400
11	436	NMHQRNMTK (SEQ IDNO:148)	0,400
12	425	FARSDELVR (SEQ IDNO:75)	0,400
13	32	AQWAPVLDF (SEQ	0/240

» 00 ·* • · · · 0 ·0 « · • 0 0 · • · 0 0 • 0 00

0 0 0 0 • Μ « 0 0

		ID NO:37)
14	240	QMNLGATLK (SEQ ID NO: 168)	0,200
15	354	QCDFKDCER (SEQ ID NO: 162)	0,200
16	373	HQRRHTGVK (SEQ ID NO: 109)	0,200
17	383	FQCKTCQRK (SEQ ID NO:80)	0,200
18	313	SASETSEKR (SEQ ID NO:197)	0,200
19	358	KDCERRFSR (SEQ ID NO: 118)	0,180
20	391	KFSRSDHLK (SEQ IDNO:120)	0,180

Tabulka X: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA A3302

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako \| poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	337	LSHLQMHSR (SEQ IDNO:141)	15,000
2	409	TSEKPFSCR (SEQ ID NO:232)	15,000
3	364	FSRSDQLKR (SEQ ID NO:83)	15,000
4	137	CLESQPAIR (SEQ ID NO:47)	9,000
5	368	DQLKRHQRR (SEQ IDNO:60)	9,000
6	287	RIHTHGVFR (SEQ ID NO: 182)	4,500
7	210	TGSQALLLR (SEQ ID NO:223)	3,000
8	425	FARSDELVR (SEQ IDNO:75)	3,000
9	313	SASETSEKR (SEQ ID NO: 197)	3,000
10	293	VFRGIQDVR (SEQ ID NO:238)	3,000
11	354	QCDFKDCER (SEQ	3,000

		ID NO: 162)
12	100	FTGTAGACR (SEQ IDNO:84)	3,000
13	118	SQASSGQAR (SEQ IDNO:216)	3,000
14	325	CAYPGCNKR (SEQ IDNO:44)	3,000
15	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	1,500
16	139	ESQPAIRNQ (SEQ ID NO:72)	1,500
17	299	DVRRVPGVA (SEQ IDNO:63)	1,500
18	419	PSCQKKFAR (SEQ IDNO:159)	1,500
19	272	ESDNHTTPI (SEQ ID NO:71)	1,500
20	4	DVRDLNALL (SEQ IDNO-.62)	1,500

Tabulka XI: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B14

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	362	RRFSRSDQL (SEQ ID NO: 187)	1000,000
2	332	KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 127)	300,000
3	423	KKFARSDEL (SEQ ID NO: 122)	150,000
4	390	RKFSRSDHL (SEQ ID NO:183)	150,000
5	439	QRNMTKLQL (SEQ ID NO: 173)	20,000
6	329	GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90)	10,000
7	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	10,000
8	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	9,000
9	301	RRVPGVAPT (SEQ	6,000

«· ·· · ·· *» · · · * ·· · · ···· • · 9· · · · · · · • · · · · ·· ··· · · ···· · · · · * · ·· »« ··« ♦ * * ·· ·

		ID NO: 189)
10	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	5,000
11	371	KRHQRRHTG (SEQ ID NO: 126)	5_?000
12	225	NLYQMTSQL (SEQ IDNO:147)	5_;000
13	144	IRNQGYSTV (SEQ ID NO: 117)	4,000
14	429	DELVRHHNM (SEQ IDNO:53)	3,000
15	437	MHQRNMTKL (SEQ ID NO: 143)	3,000
16	125	ARMFPNAPY (SEQ ID NO:38)	3,000
17	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO-.151)	3,000
18	286	YRIHTHGVF (SEQ ID NO:252)	3,000
19	174	HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 110)	3,000
20	372	RHQRRHTGV (SEQ IDNO:181)	3,000

Tabulka XII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B40

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	81	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30)	40,000
2	429	DELVRHHNM (SEQ IDNO:53)	24,000
3	410	SEKPFSCRW (SEQ IDNO:207)	20,000
4	318	SEKRPFMCA (SEQ IDNO:208)	15,000
5	233	LECMTWNQM (SEQ IDNO:131)	12,000
6	3	SDVRDLNAL (SEQ ID NO:206)	10,000
7	349	GEKPYQCDF (SEQ	8,000

		ID NO:91)
8	6	RDLNALLPA (SEQ ID NO: 177)	5,000
9	85	EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65)	4,000
10	315	SETSEKRPF (SEQ ID NO:209)	4,000
11	261	TEGQSNHST (SEQ ID NO:221)	4,000
12	23	GCALPVSGA (SEQ IDNO:89)	3,000
13	38	LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 130)	3,000
14	273	SDNHTTPIL (SEQ ID NO:204)	2,500
15	206	TDSCTGSQA (SEQ IDNO:220)	2,500
16	24	CALPVSGAA (SEQ IDNO:43)	2,000
17	98	GQFTGTAGA (SEQ IDNO:99)	2,000
18	30	GAAQWAPVL (SEQ IDNO:86)	2,000
19	84	HEEQCLSAF (SEQ ID NO:107)	2,000
20	26	LPVSGAAQW (SEQ IDNO:138)	2,000

Tabulka XIII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WTl peptidů na lidský HLA B60

	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	81	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30)	160,000
2	3	SDVRDLNAL (SEQ IDNO:206)	40,000
3	429	DELVRHHNM (SEQ IDNO:53)	40,000
4	233	LECMTWNQM (SEQ IDNO:131)	22,000
5	273	SDNHTTPIL (SEQ ID	20,000

· · · · • —* · · · ·

I **

		ΝΘ.-204)
6	209	CTGSQALLL (SEQ ID NO:52)	8,000
7	30	GAAQWAPVL (SEQ IDNO-.86)	8,000
8	318	SEKRPFMCA (SEQ IDNO:208)	8,000
9	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	8,000
10	138	LESQPAIRN (SEQ ID NO: 132)	5,280
11	239	NQMNLGATL (SEQ ID NO:151)	4,400
12	329	GCNKRYFKL (SEQ IDNO:90)	4,400
13	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	4,400
14	85	EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65)	4,400
15	208	SCTGSQALL (SEQ ID NO:202)	4,000
16	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	4,000
17	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO:194)	4,000
18	261	TEGQSNHST (SEQ ID. NO:221) .	4,000
19	18	LGGGGGCAL (SEQ ID NO: 134)	4,000
20	221	YSSDNLYQM (SEQ ID NO:253)	2,200

Tabulka XIV: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B61

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků ' subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	318	SEKRPFMCA (SEQ ID NO:208)	20,000
2	429	DELVRHHNM (SEQ IDNO.-53)	16,000
3	298	QDVRRVPGV (SEQ	10,000

		ID NO: 164)
4	81	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30)	8,000
5 I	233	LECMTWNQM (SEQ IDNO:131)	8,000
6	6	RDLNALLPA (SEQ ID NO: 177)	5,500
7	85	EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65)	4,000
8	261	TEGQSNHST (SEQ ID NO:221)	4,000
9	206	TDSCTGSQA (SEQ IDNO:220)	2,500
10	295	RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179)	2,200
11	3	SDVRDLNAL (SEQ IDNO:206)	2,000
12	250	VAAGSSSSV (SEQ IDNO-.236)	2,000
13	29	SGAAQWAPV (SEQ IDNO:211)	2,000
14	315	SETSEKRPF (SEQ ID NO:209)	1,600
15	138	LESQPAIRN (SEQ ID NO: 132)	1,200
16	244	GATLKGVAA (SEQ IDNO:88)	1,100
1 17	20	GGGGCALPV (SEQ IDNO:92)	1,100
18	440	RNMTKLQLA (SEQ ID NO: 186)	1,100
19	23	GCALPVSGA (SEQ IDNO.-89)	1,100
20	191	QQYSVPPPV (SEQ IDNO-.171)	l_?000

Tabulka XV: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B62

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	146	NQGYSTVTF (SEQ	211,200

		ID NO: 150)
2	32	AQWAPVLDF (SEQ IDNO:37)	96,000
3	263	GQSNHSTGY (SEQ ID NO: 100)	96,000
4	88	CLSAFTVHF (SEQ ID NO:48)	96,000
5	17	SLGGGGGCA (SEQ IDNO:215)	9,600
6	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	8,800
7	191	QQYSVPPPV (SEQ ID NO:171)	8,000
8	98	GQFTGTAGA (SEQ IDNO:99)	8,000
9	384	QCKTCQRKF (SEQ ID NO: 163)	6,000
10	40	FAPPGASAY (SEQ IDNO.-74)	4,800
11	227	YQMTSQLEC (SEQ IDNO:251)	4,800
12	187	SLGEQQYSV (SEQ IDNO:214)	4,400
13	86	EQCLSAFTV (SEQ ID NO:69)	4,400
14	152	VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244)	4,400
15	101	TGTAGACRY (SEQ IDNO:224)	4,000
16	242	NLGATLKGV (SEQ IDNO-.146)	4,000
17	92	FTVHFSGQF (SEQ ID NO:85)	4,000
18	7	DLNALLPAV (SEQ ID NO:58)	4,000
19	123	GQARMFPNA (SEQ ID NO:98)	4,000
20	280	ILCGAQYRI (SEQ ID NO: 116)	3,120

Tabulka XVI: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidu na lidský HLA B7

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahuiicl tuto subsekvenci
1	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO.59)	240,000
2	4	DVRDLNALL (SEQ ID NO:62)	200,000
3	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	20,000
4	30	GAAQWAPVL (SEQ ID NO:86)	12,000
5	239	NQMNLGATL (SEQ ID NO: 151)	12,000
6	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	12,000
7	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	12,000
8	299	DVRRVPGVA (SEQ IDNO:63)	5,000
9	208	SCTGSQALL (SEQ ID NO.-202)	4,000
10	303	VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242)	4,000
11	18	LGGGGGCAL (SEQ ID NO: 134)	4,000
12	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194)	4,000
13	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	4,000
14	209	CTGSQALLL (SEQ ID NO:52)	4,000
15	329	GCNKRYFKL (SEQ IDNO:90)	4,000
16	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO:49)	4,000
17	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	4,000
18	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	4,000
19	225	NLYQMTSQL (SEQ	4,000

		ID NO: 147)
20..	143	AIRNQGYST (SEQ ID NO:33)	3,000

Tabulka XVII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B8

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci.
1	329	GCNKRYFKL (SEQ IDNO:90)	16,000
2	4	DVRDLNALL (SEQ IDNO:62)	12,000
3	316	ETSEKRPFM (SEQ ID NO:73)	3,000
4	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	1,600
5	208	SCTGSQALL(SEQ ID NO:202)	0,800
6	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	0,800
7	244	GATLKGVAA (SEQ IDNO:88)	0,800
8	30	GAAQWAPVL (SEQ IDNO:86)	0,800
9	299	DVRRVPGVA (SEQ IDNO:63)	0,400
10	420	SCQKKFARS (SEQ IDNO:200)	0,400
11	387	TCQRKFSRS (SEQ ID NO:219)	0,400
12	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	0,400
13	141	QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170)	0,400
14	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	0,400
15	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	0,400
16	384	QCKTCQRKF (SEQ ID NO: 163)	0,400
17	136	SCLESQPAI (SEQ ID	0,300

• ·

		NO: 198)
18	347	HTGEKPYQC (SEQ ID NO: 112)	0,300
19	401	HTRTHTGKT (SEQ ID NO: 114)	0,200
20	332	KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 127)	0,200

Tabulka XVIII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidu na lidsky HLA B2702

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	332	KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 127)	900,000
2	362	RRFSRSDQL (SEQ ID NO: 187)	900,000
3	286	YRIHTHGVF (SEQ ID NO:252)	200,000
4	125	ARMFPNAPY (SEQ IDNO:38)	200,000
-5	375	RRHTGVKPF (SEQ ID NO: 188)	180,000
6	32	AQWAPVLDF (SEQ IDNO:37)	100,000
7	301	RRVPGVAPT (SEQ ID NO: 189)	60,000
8	439	QRNMTKLQL (SEQ ID NO: 173)	60,000
9	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	22,500
10	426	ARSDELVRH (SEQ ID NO;39)	20,000
11	146	NQGYSTVTF (SEQ ID NO: 150)	20,000
12	144	IRNQGYSTV (SEQ ID NO:117)	20,000
13	389	QRKFSRSDH (SEQ ID NO: 172)	20,000
14	263	GQSNHSTGY (SEQ ID NO: 100)	20,000
15	416	CRWPSCQKK (SEQ	20,000

		ID NO:50)
16	191	QQYSVPPPV (SEQ IDNO:171)	10,000
17	217	LRTPYSSDN (SEQ ID NO: 140)	10,000
18	107	CRYGPFGPP (SEQ ID NO:51)	io_zooo
19	98	GQFTGTAGA (SEQ IDNO:99)	10/000
20	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	6,000

Tabulka XIX: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B2705

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	332	KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 127)	30000,000
2	362	RRFSRSDQL (SEQ ID NO: 187)	30000,000
3	416	CRWPSCQKK (SEQ IDNO:50)	10000,000
4	439	QRNMTKLQL (SEQ ID NO: 173)	2000,000
5	286	YRIHTHGVF (SEQ ID NO:252)	1000,000
6	125	ARMFPNAPY (SEQ . . IDNO:38)	1000,000
7	294	FRGIQDVRR (SEQ ID NO:81)	1000/000
8	432	VRHHNMHQR (SEQ IDNO:243)	1000,000
9	169	AQFPNHSFK (SEQ IDNO:36)	1000,000
10	375	RRHTGVKPF (SEQ ID NO: 188)	900,000
1 ¹¹	• 126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	750,000
12	144	IRNQGYSTV (SEQ ID NO: 117)	600,000
13	301	RRVPGVAPT (SEQ	600,000

		ID NO: 189)
14	32	AQWAPVLDF (SEQ IDNO:37)	500,000
15	191	QQYSVPPPV (SEQ IDNO:171)	300,000
16	373	HQRRHTGVK (SEQ ID NO: 109)	200,000
17	426	ARSDELVRH (SEQ IDNO:39)	200,000
18	383	FQCKTCQRK (SEQ IDNO:80)	200,000
19	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO-.151)	200,000
20	389	QRKFSRSDH (SEQ ID NO: 172)	200,000

Tabulka XX: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA 3501

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jakó poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	278	TPILCGAQY (SEQ ID NO:227)	40,000
2	141	QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170)	40,000
3	219	TPYSSDNLY (SEQ ID NO:231)	40,000
4	327	YPGCNKRYF (SEQ IDNO:250)	20,000
5	163	TPSHHAAQF (SEQ ID NO:228)	20,000
6	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	20,000
7	221	YSSDNLYQM (SEQ IDNO:253)	20,000
8	26	LPVSGAAQW (SEQ ID NO: 138)	10,000
9	174	HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 110)	10,000
10	82	EPHEEQCLS (SEQ ID NO:68)	6,000
11	213	QALLLRTPY (SEQ ID	6,000

·· ·· · ·· · · • · * · ···· · · · ···· · · · · ♦ ···· · · · · t · «· ·· ··· ·· ·· ···

		NO: 160)
12	119	QASSGQARM (SEQ IDNO:161)	6,000
13	4	DVRDLNALL (SEQ ID NO:62)	6,000
14	40	FAPPGASAY (SEQ IDNO:74)	6,000
15	120	ASSGQARMF (SEQ IDNO:40)	5,000
16	207	DSCTGSQAL (SEQ ID NO:61)	5,000
17	303	VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242)	4,000
18	316	ETSEKRPFM (SEQ ID NO:73)	4,000
19	152	VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244)	4,000
20	412	KPFSCRWPS (SEQ ID NO: 123).	4,000

Tabulka XXI: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WTl peptidů na lidský HLA B3701

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	3	SDVRDLNAL (SEQ IDNO:206)	40,000
.2	273	SDNHTTPIL (SEQ ID NO:204)	40,000
3	81	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30)	10,000
4	298	QDVRRVPGV (SEQ ID NO:164)	8,000
5	428	SDELVRHHN (SEQ IDNO:203)	6,000
6	85	EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65)	5,000
7	208	SCTGSQALL (SEQ ID NO:202)	5,000
8	4	DVRDLNALL (SEQ IDNO:62)	5,000
9	209	CTGSQALLL (SEQ ID	5,000

		NO:52)
10.	38	LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 130)	4,000
11	223	SDNLYQMTS (SEQ ID NO:205)	4,000
12	179	EDPMGQQGS (SEQ ID NO:64)	4,000
13	206	TDSCTGSQA (SEQ ID NO:220)	4,000
14	6	RDLNALLPA (SEQ ID NO: 177)	4,000
15	84	HEEQCLSAF (SEQ ID NO: 107)	2,000
16	233	LECMTWNQM (SEQ IDNO:131)	2,000
17	429	DELVRHHNM (SEQ IDNO:53)	2,000
18	315	SETSEKRPF (SEQ ID NO:209)	2,000
19	349	GEKPYQCDF (SEQ ID NO:91)	2,000
20	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	1,500

Tabulka XXII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B3801

	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	437	MHQRNMTKL (SEQ ID NO: 143)	36,000
2	434	HHNMHQRNM (SEQ ID NO: 108)	6,000
3	372	RHQRRHTGV (SEQ IDNO:181)	6,000
4	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	4,000
5	433	RHHNMHQRN (SEQ ID NO: 180)	3,900
6	165	SHHAAQFPN (SEQ IDNO:213)	3,900
7	202	CHTPTDSCT (SEQ ID	3,000

Λ * ♦

		NO:45)
8..	396	DHLKTHTRT (SEQ ID NO:57)	3,000
9	161	GHTPSHHAA (SEQ ID NO:94)	3,000
10	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	2,600
11	417	RWPSCQKKF (SEQ ID NO: 196)	2/400
12	327	YPGCNKRYF (SEQ IDNO:250)	2/400
13	208	SCTGSQALL (SEQ ID NO:202)	2,000
14	163	TPSHHAAQF (SEQ IDNO:228)	2,000
15	120	ASSGQARMF (SEQ ID NO:40)	2,000
16	18	LGGGGGCAL (SEQ ID NO: 134)	2,000
17	177	KHEDPMGQQ (SEQ IDNO:121)	1/800
18	83	PHEEQCLSA (SEQ ID NO: 154)	1,800
19	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	1,300
20	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	1,300

Tabulka XXIII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B3901

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly
obsahující tuto	subsekvenci
1	437	MHQRNMTKL (SEQ ID NO: 143)	135,000
2	332	KRYFKLSHL (SEQ IDNO:127)	45,000
3	434	HHNMHQRNM (SEQ IDNO:108)	30,000
4	362	RRFSRSDQL (SEQ ID NO: 187)	30,000
5	372	RHQRRHTGV (SEQ	30,000

		IĎ NO:181)
6	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	9,000
7	439	QRNMTKLQL (SEQ ID NO: 173)	7,500
8	390	RKFSRSDHL (SEQ ID NO:183)	6,000
9	396	DHLKTHTRT (SEQ IDNO:57)	6,000
10	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	6,000
11	423	KKFARSDEL (SEQ ID NO:122)	6,000
12	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	6,000
13	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	6,000
14	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	6,000
15	144	IRNQGYSTV (SEQ ID NO: 117)	5,000
16	136	SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198)	4,000
17	292	GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103)	3,000
18	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	3,000
19	208	SCTGSQALL (SEQ ID NO:202)	3,000
20	207	DSCTGSQAL (SEQ ID NO:61)	3,000

Tabulka XXIV: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B3902

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	24,000
2	390	RKFSRSDHL (SEQ ID NO: 183)	20,000
3	423	KKFARSDEL (SEQ	20j000

• · · • ·

		ID NO: 122)
4	321	AQWAPVLDF (SEQ IDNO:37)	5,000
5	146	NQGYSTVTF (SEQ ID NO: 150)	5,000
6	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO:144)	2,400
7	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	2,400
8	30	GAAQWAPVL (SEQ IDNO:86)	2,400
9	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	2,400
10	302	RVPGVAPTL (SEQ IDNO:195)	2,400
11	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	2,000
12	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO:194)	2,000
13	209	CTGSQALLL (SEQ ID NO:52)	2,000
14	332	KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 127)	2,000
15	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	2,000
16	437	MHQRNMTKL (SEQ ID NO: 143)	2,000
17	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	2,000
18	208	SCTGSQALL (SEQ ID NO:202)	2,000
19	329	GCNKRYFKL (SEQ IDNO:90)	2,000
20	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	2,000

Tabulka XXV: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B4403

č.	Počáteční	Seznam zbytků	Skóre (hodnoceno jako
	pozice	subsekvence	poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	315	SETSEKRPF (SEQ ID	80,000

• ·

		NO-.209)
2	349	GEKPYQCDF (SEQ IDNO:91)	80,000
3	84	HEEQCLSAF (SEQ ID NO: 107)	60,000
4	410	SEKPFSCRW (SEQ IDNO:207)	48,000
5	429	DELVRHHNM (SEQ IDNO:53)	24_;000
6	278	TPILCGAQY (SEQ ID NO:227)	15,000
7	141	QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170)	9,000
8	40	FAPPGASAY (SEQ IDNO-.74)	9,000
9	213	QALLLRTPY (SEQ ID NO: 160)	9,000
10	318	SEKRPFMCA (SEQ IDNO:208)	8,000
11	81 -	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30)	8,000
12	152	VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244)	4,500
13	101	TGTAGACRY (SEQ IDNO:224)	4,500
14	120	ASSGQARMF (SEQ IDNO:40)	4,500
15	261	TEGQSNHST (SEQ ID NO:221)	4,000
16	85	EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65)	4,000
17	233	LECMTWNQM (SEQ ID NO: 131)	4,000
18	104	AGACRYGPF (SEQ IDNO:31)	4,000
19	3	SDVRDLNAL (SEQ IDNO:206)	3,000
20	185	QGSLGEQQY (SEQ ID NO: 166)	3,000

Tabulka XXVI: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B5101

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	303	VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242)	314,600
2	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	242,000
3	250	VAAGSSSSV (SEQ IDNO:236)	157,300
4	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	50,000
5	30	GAAQWAPVL (SEQ IDNO:86)	50,000
6	20	GGGGCALPV (SEQ IDNO:92)	44,000
7	64 -	PPPPPHSFI (SEQ ID NO: 157)	40,000
8	29	SGAAQWAPV (SEQ ID NO:211)	40,000
9	18	LGGGGGCAL (SEQ ID NO: 134)	31,460
10	295	RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179)	22,000
Π .	119	QASSGQARM (SEQ IDNO:161)	18,150
12	418	WPSCQKKFA (SEQ IDNO:246)	12,100
13	82	EPHEEQCLS (SEQ ID NO:68)	12,100
14	110	GPFGPPPPS (SEQ ID NO:96)	11,000
15	272	ESDNHTTPI (SEQ ID NO:71)	8,000
16	306	VAPTLVRSA (SEQ IDNO:237)	7,150
17	280	ILCGAQYRI (SEQ ID NO: 116)	6,921
18	219	TPYSSDNLY (SEQ ID NO:231)	6,600
19	128	FPNAPYLPS (SEQ ID	6,500

• «

		NO:79)
20	204	TPTDSCTGS (SEQ ID NO:230)	6,050

Tabulka XXVII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B 5102

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	295	RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179)	290,400
2	303	VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242)	200,000
3	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO.-59)	133,100
4	250	VAAGSSSSV (SEQ IDNO:236)	110,000
5	30	GAAQWAPVL (SEQ IDNO:86)	55,000
6	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	50,000
7	20	GGGGCALPV (SEQ IDNO:92)	44,000
8	29	SGAAQWAPV (SEQ IDNO:211)	44,000
9	64	PPPPPHSFI (SEQ ID NO: 157)	40,000
¹⁰	119	QASSGQARM (SEQ ID NO: 161)	36,300
11	110	GPFGPPPPS (SEQ ID NO:96)	27,500
12	412	KPFSCRWPS (SEQ ID NO: 123)	25,000
13	18	LGGGGGCAL (SEQ ID NO: 134)	24,200
14	24	CALPVSGAA (SEQ IDNO:43)	16,500
15	• 219	TPYSSDNLY (SEQ ID NO:231)	15,000
16	292	GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103)	14,641
17	136	SCLESQPAI (SEQ ID	14,520

		NO: 198)
18	418	WPSCQKKFA (SEQ IDNO:246)	12,100
19	269	TGYESDNHT (SEQ IDNO:225)	11,000
20	351	KPYQCDFKD (SEQ ID NO: 124)	lljOOO

Tabulka XXVIII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidu na lidský HLA B 5201

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	T------------------------------------a-- --!-* ..... C________1 Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	191	QQYSVPPPV (SEQ ID NO: 171)	100,000
2	....··· 32	AQWAPVLDF (SEQ IDNO:37)	30,000
3	243	LGATLKGVA (SEQ IDNO:133)	16,500
4	303	VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242)	13,500
5	86	EQCLSAFTV (SEQ ID NO:69)	12,000
6	295	RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179)	10_;000
7	98	GQFTGTAGA (SEQ ID NO:99)	8,250
8	292	GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103)	8,250
9	29	SGAAQWAPV (SEQ IDNO:211)	6,000
10	146	NQGYSTVTF (SEQ ID NO: 150)	5,500
11	20	GGGGCALPV (SEQ ID NO:92)	5,000
12	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	4,000
13	64	PPPPPHSFI (SEQ ID NO: 157)	3,600
14	273	SDNHTTPIL (SEQ ID NO:204)	3,300
15	286	YRIHTHGVF (SEQ ID	3,000

• ·

		NO:252)
16	269	TGYESDNHT (SEQ IDNO-.225)	3,000
17	406	TGK.TSEKPF (SEQ ID NO:222)	2,750
18	327	YPGCNKRYF (SEQ IDNO:250)	2,750
19	7	DLNALLPAV (SEQ IDNO:58)	2,640
20	104	AGACRYGPF (SEQ IDNO:31)	2,500

Tabulka XXIX: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA B 5801

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	230	TSQLECMTW (SEQ IDNO:234)	96,800
2	92	FTVHFSGQF (SEQ ID NO:85)	60,000
3	120	ASSGQARMF (SEQ IDNO:40)	40,000
4	168	AAQFPNHSF (SEQ IDNO:29)	20,000
5	408	KTSEKPFSC (SEQ ID NO: 129)	12,000
6	394	RSDHLKTHT (SEQ ID NO: 192)	9,900
7	276	HTTPILCGA (SEQ ID NO:115)	7,200
8	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194)	6,600
9	152	VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244)	6,000
10	40	FAPPGASAY (SEQ ID NO:74)	6,000
11	213	QALLLRTPY (SEQ ID NO: 160)	4,500
12	347	HTGEKPYQC (SEQ ID NO: 112)	4,400
13	252	AGSSSSVKW (SEQ	4,400

• ·

		IDNO:32)
14	211	GSQALLLRT (SEQ ID NO: 102)	4,356
15	174	HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 110)	4,000
16	317	TSEKRPFMC (SEQ IDNO:233)	4/)00
17	26	LPVSGAAQW (SEQ IDNO:138)	4,000
18	289	HTHGVFRGI (SEQ ID NO: 113)	3,600
19	222	SSDNLYQMT (SEQ IDNO:217)	3,300
20	96	FSGQFTGTA (SEQ ID NO:82)	3,300

Tabulka XXX: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA CW 0301

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	100,000
2	332	KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 127)	48,000
3	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	36,000
4	3	SDVRDLNAL (SEQ IDNO:206)	30,000
5	239	NQMNLGATL (SEQ ID NO: 151)	24,000
6	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	24,000
7	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO-.59)	20,000
8	362	RRFSRSDQL (SEQ ID NO: 187)	12,000
9	. 329	GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90)	10,000
10	286	YRIHTHGVF (SEQ ID NO:252)	10,000
11	301	RRVPGVAPT (SEQ	10,000

		ID NO: 189)
12	24	CALPVSGAA (SEQ IDNO:43)	10,000
13	136	SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198)	7,500
14	437	MHQRNMTKL (SEQ ID NO: 143)	7,200
15	390	RKFSRSDHL (SEQ ID NO: 183)	6,000
16	423	KKFARSDEL (SEQ ID NO: 122)	6,000
17	92	FTVHFSGQF (SEQ ID NO:85)	5,000
18	429	DELVRHHNM (SEQ IDNO:53)	5,000
19	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	4,800
20	30	GAAQWAPVL (SEQ IDNO:86)	4,000

Tabulka XXXI: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA CW 0401

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	356	DFKDCERRF (SEQ IDNO:55)	120,000
2	334	YFKLSHLQM (SEQ IDNO1248)	100,000
3	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	88,000
4	163	TPSHHAAQF (SEQ IDNO:228)	52,800
5	327	YPGCNKRYF (SEQ IDNO:250)	40,000
6	285	QYRIHTHGV (SEQ ID NO: 175)	27,500
7	424	KFARSDELV (SEQ IDNO:119)	25,000
8	326	AYPGCNKRY (SEQ IDNO:42)	25,000
9	192	QYSVPPPVY (SEQ	25,000

		ID NO: 176)
10	417	RWPSCQKKF (SEQ ID NO: 196)	22,000
11	278	TPILCGAQY (SEQ ID NO:227)	12,000
12	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	11,616
13	141	QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170)	11,000
14	303	VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242)	11,000
15	219	TPYSSDNLY (SEQ ID NO:231)	10,000
16	39	DFAPPGASA (SEQ IDNO.-54)	7,920
17	99	QFTGTAGAC (SEQ ID NO: 165)	6,000
18	4	DVRDLNALL (SEQ IDNO:62)	5,760
19	70	SFIKQEPSW (SEQ ID NO:210)	5,500
20	63	PPPPPPHSF (SEQ ID NO: 158)	5,280

Tabulka XXXII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby pepriau na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na lidský HLA CW 0602

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly
obsahující tuto	subsekvenci
1	332	KRYFKLSHL (SEQ IDNO:127)	9,680
2	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	6,600
3	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	6,600
4	7	DLNALLPAV (SEQ IDNO:58)	6,000
5	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	6,000
6	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	6,000
7	4	DVRDLNALL (SEQ	6,000

		IDNO:62)
8	3	SDVRDLNAL (SEQ IDNO:206)	4,400
9	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	4,000
10	213	QALLLRTPY (SEQ ID NO: 160)	3,300
11	319	EKRPFMCAY (SEQ IDNO:67)	3,000
12	30	GAAQWAPVL (SEQ ID NO:86)	2,200
13	242	NLGATLKGV (SEQ ID NO: 146)	2,200
14	292	GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103)	2,200
15	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	2,200
16	362	RRFSRSDQL (SEQ ID NO: 187)	2,200
17	439	QRNMTKLQL (SEQ ID NO: 173)	2,200
18	295	RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179)	2,200
19	423	KKFARSDEL (SEQ ID NO: 122)	2,200
20	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	2,200

Tabulka XXXIII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WTl peptidů na lidský HLA CW 0702

č.	Počáteční pozice	^{1 1 1} Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	319	EKRPFMCAY (SEQ ID NO:67)	26,880
2	326	AYPGCNKRY (SEQ ID NO:42)	24,000
3	40	FAPPGASAY (SEQ IDNO:74)	14,784
4	192	QYSVPPPVY (SEQ ID NO: 176)	12,000
5	278	TPILCGAQY (SEQ ID	12,000

• ·

		NO:227)
6	219	TPYSSDNLY (SEQ ID NO:231)	12,000
7	213	QALLLRTPY (SEQ ID NO: 160)	8,800
8	125	ARMFPNAPY (SEQ IDNO:38)	8,000
9	327	YPGCNKRYF (SEQ IDNO:250)	6,600
10	152	VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244)	5,600
11	141	QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170)	4,800
12	345	RKHTGEKPY (SEQ ID NO: 184)	4,000
13	185	QGSLGEQQY (SEQ ID NO: 166)	4,000
14	101	TGTAGACRY (SEQ IDNO:224)	4,000
15	375	RRHTGVKPF (SEQ ID NO: 188)	4,000
16	263	GQSNHSTGY (SEQ ID NO: 100)	4,000
17	163	TPSHHAAQF (SEQ IDNO:228)	3,000
18	33	QWAPVLDFA (SEQ ID NO: 174)	2,688
19	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	2,640
20	84	HEEQCLSAF (SEQ ID NO: 107)	2,400

Tabulka XXXIV: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na myší MHC třídy I Db

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenqi
1	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO:49)	5255,712
2	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	1990,800

3	221	YSSDNLYQM (SEQ ID NÓ:253)	930,000
4	228	QMTSQLECM (SEQ ID NO: 169)	33,701
5	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:151)	21,470
6	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	19,908
7	437	MHQRNMTKL (SEQ ID NO: 143)	19,837
8	136	SCLESQPAI (SEQ ID NO; 198)	11,177
9	174	HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 110)	10,800
10	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	10,088
11	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	8,400
12	10	ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)	5,988
13	208	SCTGSQALL (SEQ ID NO:202)	4,435
14	209	CTGSQALLL (SEQ ID NO:52)	3,548
15	238	WNQMNLGAT (SEQ IDNO:245)	3,300
16	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194)	3,185
17	24	ČALPVSGAA (SEQ IDNO:43)	2,851
18	18	LGGGGGCAL (SEQ IDNO:134)	2,177
19	142	PAIRNQGYS (SEQ ID NO: 152)	2,160
20	30	GAAQWAPVL (SEQ ID NO:86)	1,680

Tabulka XXXV: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na myší MHC třídy I Dd

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	112	FGPPPPSQA (SEQ ID NO:76)	48,000
2	122	SGQARMFPN (SEQ IDNO.212)	36,000
3	104	AGACRYGPF (SEQ IDNO:31)	30,000
4	218	ŘTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194)	28,800
5	130	ŇAPYLPSCL (SEQ ID NO:144)	20,000
6	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	20,000
7	18	LGGGGGCAL (SEQ ID NO: 134)	20,000
8	81	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30)	10,000
9	29	SGAAQWAPV (SEQ IDNO:2U)	7,200
10	423	KKFARSDEL (SEQ ID NO: 122)	7,200
11	295	RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179)	7,200
12	390	RKFSRSDHL (SEQ ID NO: 183)	6,000
13	332	KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 127)	6,000
14	362	RRFSRSDQL (SEQ ID NO: 187)	6,000
15	417	RWPSCQKKF (SEQ IDNO:196)	6,000
16	160	YGHTPSHHA (SEQ IDNO:249)	6,000
17	20	GGGGCALPV (SEQ IDNO:92)	6,000
18	329	GCNKRYFKL (SEQ IDNO:90)	5,000
19	372	RHQRRHTGV (SEQ	4,500

		ID NO:181)
20	52	GGPAPPPAP (SEQ ID NO:93)	4,000

Tabulka XXXVI: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na myší MHC třídy I Kb

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	329	GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90)	24,000
2	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147)	10,000
3	420	SCQKKFARS (SEQ ID NO:200)	3,960
4	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194)	3,630
5	437	MHQRNMTKL (SEQ IDNO:143)	3,600
6	387	TCQRKFSRS (SEQ ID NO:219)	3,600
7	302	RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195)	3,300
8	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144)	3,000
9	289	HTHGVFRGI (SEQ ID NO: 113)	3,000
10	43	PGASAYGSL (SEQ IDNO:153)	2,400
11	155	DGTPSYGHT (SEQ ID NO:56)	2,400
12	273	SDNHTTPIL (SEQ ID NO:204)	2,200
13	126	RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185)	2,200
14	128	FPNAPYLPS (SEQ ID NO:79)	2,000
15	3	SDVRDLNAL (SEQ ID NO:206)	1,584
16	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	1,584
17	332	KRYFKLSHL (SEQ	l_f500

		ID NO: 127)
18	18	LGGGGGCAL (SEQ ID NO: 134)	1,320
19	233	LECMTWNQM (SEQ IDNO:131)	1,320
20	441	NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149)	1,200

• ·

Tabulka XXXVII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na

HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na myší MHC třídy I Kd

100

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	285	QYRIHTHGV (SEQ ID NO: 175)	600,000
2	424	KFARSDELV (SEQ IDNO:119)	288,000
3	334	YFKLSHLQM (SEQ IDNO:248)	120,000
4	136	SCLESQPTI (SEQ ID NO: 199)	115,200
5	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO.151)	115,200
6	10	ALLPAVSSL (SEQ ID NO:35)	115,200
7	47	AYGSLGGPA (SEQ IDNO.-41)	86,400 .
8	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	80,000
9	270	GYESDNHTA (SEQ ID NO: 105)	72,000
10	326	AYPGCNKRY (SEQ IDNO:42)	60,000
11	192	QYSVPPP.VY (SEQ ID NO: 176)	60,000
12	272	ESDNHTAPI (SEQ ID NO:70)	57,600
13	289	HTHGVFRGI (SEQ ID NO: 113)	57^600
14	126	DVRDLNALL (SEQ IDNO:62)	57,600
15	4	CTGSQALLL (SEQ ID NO:52)	57,600
16	208	SCTGSQALL (SEQ ID NO:202)	48,000
17	441	NMTKLQLAL (SEQ IDNO:149)	48^000
18	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61)	48,000
19	130	NAPYLPSCL (SEQ ID	48,000

• · • · * ·

101

		NO: 144)
20	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO:49)	48,000

Tabulka XXXVIII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na myší MHC třídy I Kk

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	81	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30)	40,000
2	85	EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65)	40,000
3	429	DELVRHHNM (SEQ IDNO:53)	20,000
4	315	SETSEKRPF (SEQ ID NO:209)	20,000
5	261	TEGQSNHST (SEQ ID NO:221)	20,000
6	410	SEKPFSCRW (SEQ IDNO:207)	10,000
7	272	ESDNHTTPI (SEQ ID NO:71)	10,000
8	318	SEKRPFMCA (SEQ ID NO:208)	10,000
9	138	LESQPAIRN (SEQ ID NO: 132)	10,000
10	233	LECMTWNQM (SEQ IDNO:131)	10,000
11	298	QDVRRVPGV (SEQ ID NO: 164)	10,000
12	84	HEEQCLSAF (SEQ ID NO: 107)	10,000
13	349	GEKPYQCDF (SEQ IDNO:91)	10,000
14	289	HTHGVFRGI (SEQ ID NO:113)	10,000
15	179	EDPMGQQGS (SEQ ID NO:64)	8,000
16	136	SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198)	5,000
17	280	ILCGAQYRI (SEQ ID	5,000

φ ·

102

		NO:116)
18	273	SDNHTTPIL (SEQ ID NO:204)	4,000
19	428	SDELVRHHN (SEQ IDNO:203)	4,000
20	3	SDVRDLNAL (SEQ ID NO:206)	4,000

Tabulka XXXIX: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WTl peptidu na myši MHC třídy I Ld

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	163	TPSHHAAQF (SEQ IDNO:228)	360,000
2	327	YPGCNKRYF (SEQ IDNO:250)	300,000
3	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59)	150,000
4	26	LPVSGAAQW (SEQ IDNO:138)	93,600
5	278	TPILCGAQY (SEQ ID NO:227)	72,000
6	141	QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170)	60,000
7	219	TPYSSDNLY (SEQ ID NO:231)	60,000
8	303	VPGVAPTLV (SEQ ID NO:242)	60,000
9	120	ASSGQARMF (SEQ IDNO:40)	50,000
10	63	PPPPPPHSF (SEQ ID NO: 158)	45,000
11	113	GPPPPSQAS (SEQ ID NO:97)	45,000
12	157	TPSYGHTPS (SEQ ID NO:229)	39,000
13	207	DSCTGSQAL (SEQ ID NO:61)	32,500
14	110	GPFGPPPPS (SEQ ID NO:96)	30,000
15	82	EPHEEQCLS (SEQ ID	30,000

r ·

103

		NO:68)
16	412	KPFSCRWPS (SEQ ID NO:123)	30,000
17	418	WPSCQKKFA (SEQ IDNO-.246)	30,000
18	221	YSSDNLYQM (SEQ IDNO:253)	30,000
19	204	TPTDSCTGS (SEQ ID NO:230)	30,000
20	128	FPNAPYLPS (SEQ ID NO:79)	30,000

Tabulka XL: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na kočičí HLA A20

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	350	EKPYQCDFK (SEQ IDNO:66)	1000,00
2	319	EKRPFMCAY (SEQ IDNO:67)	500,000
3	423	KKFARSDEL (SEQ ID NO: 122)	500,000
4	345	RKHTGEKPY (SEQ ID NO: 184)	500,000
5	390	RKFSRSDHL (SEQ ID NO:183)	500,000
6	137	CLESQPAIR (SEQ ID NO:47)	120,000
7	380	VKPFQCKTC (SEQ IDNO:239)	100,000
8	407	GKTSEKPFS (SEQ ID NO:95)	100,000
9	335	FKLSHLQMH (SEQ ID NO:78)	100,000
10	247	LKGVAAGSS (SEQ IDNO:135)	100,000
11	370	LKRHQRRHT (SEQ ID NO: 136)	100^00
12	258	VKWTEGQSN (SEQ IDNO:240)	íoojodo
13	398	LKTHTRTHT (SEQ	100/000

104

		ID NO: 137)
14	331	NKRYFKLSH (SEQ ID NO: 145)	100,000
15	357	FKDCERRFS (SEQ ID NO:77)	100,000
16	385	CKTCQRKFS (SEQ ID NO:46)	100,000
17	294	FRGIQDVRR (SEQ ID NO:81)	80,000
18	368	DQLKRHQRR (SEQ ID NO:60)	80,000
19	432	VRHHNMHQR (SEQ ID NO:243)	80_z000
20	118	SQASSGQAR (SEQ IDNO:216)	80,000

Tabulka XLI: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na myší MHC třídy I A0201

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahuiicí tuto subsekvenci
1	126	RMFPNAPYL (SEQ IDNO:293)	313,968
2	187	SLGEQQYSV (SEQ IDNO:299)	285,163
3	10	ALLPAVSSL (SEQ ID NO:255)	181,794
4	225	NLYQMTSQL (SEQ IDNO:284)	68,360
5	292	GVFRGIQDV (SEQ IDNO-.270)	51,790 '
6	93	TLHFSGQFT (SEQ ID NO:302)	40,986
7	191	QQYSVPPPV (SEQ ID NO-.290)	22,566
8	280	ILCGAQYRI (SEQ ID NO:274)	17,736
9	441	NMTKLHVAL (SEQ IDNO:285)	15,428
10	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO:258)	15,428
11	7	DLNALLPAV (SEQ	11,998

105

		ID NO:261)
12	242	NLGATLKGM (SEQ ID NO:283)	11,426
13	227	YQMTSQLEC (SEQ IDNO:307)	8,573
14	239	NQMNLGATL (SEQ IDNO:286)	8,014
15	309	TLVRSASET (SEQ ID NO:303)	7,452
16	408	KTSEKPFSC (SEQ ID NO:277)	5,743
17	340	LQMHSRKHT (SEQ ID NO:280)	4,752
18	228	QMTSQLECM (SEQ ID NO:289)	4,044
19	37	VLDFAPPGA (SEQ IDNO:304)	3,378
20	302	RVSGVAPTL (SEQ IDNO:295)	1,869

Tabulka XLII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WTl peptidů na myší MHC třídy I Db

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	221	YSSDNLYQM (SEQ IDNO:308)	312,000
2	126	RMFPNAPYL (SEQ IDNO:293)	260,000
3	235	CMTWNQMNL (SEQ IDNO:258)	260,000
4	437	MHQRNMTKL (SEQ IDNO:281)	200,000
5	238	WNQMNLGAT (SEQ ID NO:305)	12,000
6	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO:282)	8,580
7	3	SDVRDLNAL (SEQ IDNO:298)	7,920
8	136	SCLESQPTI (SEQ ID NO:296)	7,920

• · • ·

9	81	AEPHEEQCL (SEQ ID NO:254)	6,600
10	10	ALLPAVSSL (SEQ ID NO:255)	6,600
11	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO:294)	6,000
12	441	NMTKLHVAL (SEQ IDNO:285)	3,432
13	228	QMTSQLECM (SEQ IDNO:289)	3,120
14	174	HSFKHEDPM (SEQ IDNO:272)	3,120
15	242	NLGATLKGM (SEQ IDNO:283)	2,640
16	261	TEGQSNHGI (SEQ ID NO:301)	2,640
17	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO:284)	2,640
18	207	DSCTGSQAL (SEQ ID NO:263)	2,600
19	119	QASSGQARM (SEQ IDNO:288)	2,600
20	18	LGGGGGCGL (SEQ ID NO:279)	2,600

Tabulka XLIII: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidu na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na myší MHC třídy I Kb

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahující tuto subsekvenci
1	329	GCNKRYFKL (SEQ IDNO:268)	24,000
2	225	NLYQMTSQL (SEQ IDNO:284)	10,000
3	420	SCQKKFARS (SEQ IDNO:297)	3,960
4	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO-.294)	3,630
5	437	MHQRNMTKL (SEQ IDNO:281)	3,600
6	387	TCQRKFSRS (SEQ ID	3,600

107

		NO:300)
7	289	HTHGVFRGI (SEQ ID NO:273)	3,000
8	130	NAPYLPSCL (SEQ ID NO:282)	3,000
9	43	PGASAYGSL (SEQ IDNO:287)	2,400
10	155	DGAPSYGHT (SEQ IDNO:260)	2,400
11	126	RMFPNAPYL (SEQ IDNO:293)	2,200
12	128	FPNAPYLPS (SEQ ID NO:267)	2,000
13	207	DSCTGSQAL (SEQ IDNO:263)	1,584
14	3	SDVRDLNAL (SEQ IDNO:298)	1,584 . i
15	332	KRYFKLSHL (SEQ ID NO:276)	1,500
16	233	LECMTWNQM (SEQ IDNO:278)	1,320
17	18	LGGGGGCGL (SEQ IDNO:279)	1,320
18	242	NLGATLKGM (SEQ IDNO:283)	1,200
19	123	GQARMFPN (SEQ ID NO:269)A	1,200
20	441	NMTKLHVAL (SEQ IDNO:285)	1,200

Tabulka XLIV: Výsledky BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na HLA pro vazbu lidských WT1 peptidů na myší MHC třídy I Kd

č.	Počáteční pozice	Seznam zbytků subsekvence	Skóre (hodnoceno jako poločas dissociace molekuly obsahuj ici^ tuto .subsekvenci ,
1	285	QYRIHTHGV (SEQ IDNO:291)	600,000
2	424	KFARSDELV (SEQ IDNO:275)	288,000
3	334	YFKLSHLQM (SEQ IDNO:306)	120'000

108 ·· ··________9 99 9 9________9 9 9 9 9

4	136	SCLESQPTI (SEQ ID NO:296)	115,200
5	239	NQMNLGATL (SEQ ID NO:286)	115,200
6	10	ALLPAVSSL (SEQ ID NO:255)	115,200
7	47	AYGSLGGPA (SEQ IDNO:256)	86,400
8	180	DPMGQQGSL (SEQ IDNO:262)	80,000
9	270	GYESDNHTA (SEQ IDNO:271)	72,000
10	192	QYSVPPPVY (SEQ IDNO:292)	60,000
11	326	AYPGCNKRY (SEQ ID NO:257)	60,000
12	289	HTHGVFRGI (SEQ ID NO:273)	57,600
13	4	DVRDLNALL (SEQ IDNO:264) ^:	57,600
14	126	RMFPNAPYL (SEQ IDNO:293)	57,600
15	209	CTGSQALLL (SEQ ID NO:259)	48,000
16	86	EQCLSAFTL (SEQ ID NO:265)	48,000
17	,··- 302	RVSGVAPTL (SEQ IDNO:295)	48,000
18	218	RTPYSSDNL (SEQ ID NO:294)	48,000
19	272	ESDNHTAPI (SEQ ID NO:266)	48,000
20	225	NLYQMTSQL (SEQ ID NO:284)	48,000

Tabulka XLV: Výsledky predikční analýzy vazby peptidu na místa

T-lymfocytů pro lidské WT1 peptidy schopné vyvolat odpověď pomocných T-lymfocytů

Peptid Sekvence
p6-23	RDLNALLPAVPSLGGGG (SEQ ID NO: 1)
p30-35	GAAQWA (SEQ ID NO:309)
p45-56	ASAYGSLGGPAP (SEQ ID NO:310)

109

p91-105	AFTVHFSGQFTGTAG (SEQ ID N0:311)
pl17-139	PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (SEQ ID NO:2)
P167-171	HAAQF (SEQ ID NO:312)
p202-233	CHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQL (SEQ ID NO:313)
p244-262	GATLKGVAAGSSSSVKWTE (SEQIDNO:4)
p287-318	RIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETS (SEQ ID NO:314)
p333-336	RYFK (SEQ ID NO:315)
p361-374	ERRFSRSDQLKRHQ (SEQIDNO:316)
p389-410	QRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTS (SEQ ID NO:317)
p421-441	CQKKFARSDELVRHHNMHQRN (SEQ ID NO:318)

Některé CTL peptidy (uvedené v tabulce XLVI) byly vybrány pro další analýzu, pro každý peptid v tabulce XLVI jsou uvedeny skóre získané za použití BIMAS predikční analýzy vazby peptidů na HLA.

Tabulka XLVI: Sekvence WT1 peptidů a predikce vazby peptidů na HLA

Peptid Sekvence Komentář

p329-337	GCNKRYFKL	Skóre 24000
(SEQ ID NO: a 268)	90
p225-233	NLYQMTSQL (SEQ ID NO: a 284)	147	váže se také na třídu II a HLA A2, Kd, skóre 10000
p235-243	CMTWNQMNL (SEQ ID NO: a 258)	49	váže se také na HLA A2, skóre 5255712
Ρ126-134	RMFPNAPYL		váže se také na Kd, třídu II a
	(SEQ ID NO: a 293)	185	HLA A2, skóre 1990800

• ·

110

p221-229	YSSDNLYQM (SEQ ID NO: a 308)	253	váže	se také na Ld,	skóre 312000
p228-236	QMTSQLECM		skóre	3120
	(SEQ ID NO:	169
	a 289)
p239-247	NQMNLGATL		váže	se také na HLA	A 0201, Kd,
	(SEQ ID NO:	151	skóre	8015
	a 286)
myší pl36-	SCLESQPTI		váže	se také na Kd,	1 odlišnost
144	(SEQ ID NO:	296)	vzhledem k lidskému
Lidský pl36-	SCLESQPAI		skóre	7920
144	(SEQ ID NO:	198)
myší plO-	ALLPAVSSL		váže	se také na Kd,	HLA A2,
18	(SEQ ID NO:	255)	1 odlišnost vzhledem k lidskému
Lidský plO-	ALLPAVPSL		skóre	6600
18	(SEQ ID NO:	34)

Vazba peptidu na C57B1/6 myší MHC byla potvrzena za použití leukemické buněčné linie RMA-S, jak je popsána v Ljunggren et al., Nátuře 346: 476-480, 1990. Stručně, RMA-S buňky byly kultivovány po dobu 7 hodin při 26 °C v kompletním mediu doplněném 1% FCS. Celkem 10^s RMA-S buněk bylo přidáno do každé jamky 24-jamkové plotny a byly inkubovány buď samostatně, nebo za přítomnosti uvedeného peptidu (25 ug/ml) po dobu 16 hodin při 26 °C a dalších 3 hodin při 37 °C v kompletním mediu. Buňky

111

byly potom promyty třikrát a byly barveny anti D^to nebo anti-K^toprotilátkami konjugovanými s fluoresceinem isothiokyanatanem (PharMingen, San Dlego, CA). Značené buňky se dvakrát promyly, resuspendovaly se a fixovaly se v 500 ul PBS s 1% paraformaldehydem a analyzovaly se na intenzitu fluorescence v průtokové cytometru (Becton-Dickinson FASCalibur^R). Procento zvýšení nebo K^to molekul na povrchu RMA-S buněk bylo měřeno podle zvýšení průměrné intenzity fluorescence buněk inkubovaných s peptidem ve srovnání se zvýšení u buněk inkubovaných v mediu samotném.

Myši byly imunizované peptidy schopnými vazby na myší MHC třídy I. Po imunizaci byly buňky sleziny stimulovány in vitro a byly testovány na schponost lyžovat cílé inkubované s WT1 peptidy. CTL byly hodnoceny standardním testem uvolňování chrómu (Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070). 10® cílových buněk se inkubovalo při 37 °C s 150 uCi sodné soli ^5:rCr po dobu 90 minut, za přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických peptidů. Buňky se potom třikrát promyly a resuspendovaly se v RPMi s 5% fetálním hovězím sérem. Pro test se 10⁴ cílovýchbuněk značených ⁵¹Cr inkubovalo s různými koncentracemi efektorových buněk v konečném objemu 200 ul v 96-jamkových plotnách s U-dnem. Supernatanty se odebraly po 4 až 7 hodinách při 37 °C a procento specifické lýzy se určilo podle vzorce:

% specifické lýzy = 100 x (uvolnění v pokusu - spontánní uvolnění)/ maximální uvolnění - spontání uvolnění)

Výsledky, uvedené v tabulce XLVII, ukazují, že některé WT1 peptidy se mohou vázat na MHC molekuly třídy I, což je zásadní pro vyvolání CTL. Kromě toho, několik peptidů mohlo vyvolat tvorbu CTL specifických pro peptid (obr. 9A a 9B), jak bylo určeno testem uvolňování chrómu. Po imunizaci k CTL peptidům • · • · • ·

112 plO-18 lidský, pl36-144 lidský, pl36-144 myší a p235-243 byly získány CTL linie specifické pro peptid a byly připraveny klony. Tyto výsledky ukazují, že CTL specifické pro peptid mohou zabíjet maligní buňky exprimující WT1.

Tabulka XLVII: Vazba WT1 CTL peptidů na antigeny třídy I B6 myší

Peptid	vazebná afinita k myším MHC třídy I
pozitivní kontrola	91%
negativní kontrola	0,5-1,3%
p235-243	33,6%
pl36-144 myší	27,9%
pl36-144 lidský	52%
plO-18 lidský	2,2%
p225-233	5,8%
P329-337	1,2%
P126-134	0,9%
p221-229	0,8%
p228-236	1,2%
p239-247	1%

Příklad 5: Použití WT1 polypeptidu pro indukci WT1 specifických CTL u myší

Tento příklad ilustruje schopnost representativního WT1 polypeptidu indukovat CTL imunitu schopnou zabíjet WT1 pozitivní nádorové buněčné linie.

P117-139, peptid s motivy vhodnými pro vazbu na MHC třídy I a II, byl identifikován pomocí TSITES a BIMAS predikčních

113 analýz pro vazbu peptidu na HLA. Myši byly imunizované způsobem popsaným v příkladu 3. Po imunizaci byly buňky sleziny stimulovány in vitro a byly testovány na schopnost lyžovat cíle inkubované s WT1 peptidy, stejně jako WT1 pozitivní a negativní nádorové buňky. CTL byly hodnoceny ve standardním testu uvolňování chrómu. Výsledky, uvedené na obr. 10A-10D, ukazují, že P117 může indukovat WT1 specifické CTL schopné zabíjet WT1 pozitivní nádorové buňky, zatímco nebylo pozorováno žádné zabíjení WT1 negativních buněk. Tyto výsledky demonstrují, že CTL specifické pro peptid skutečně zabíjejí maligní buňky exprimující WT1 a že vakcinace a terapie T-lymfocyty jsou účinné proti malignitám exprimujícím WT1.

Podobné imunizace byly provedeny za použití 9-měrových peptidů s vazbou na MHC třídy I pl36-144, p225-233, p235-243 a 23-merového peptidu pll7-139. Po imunizaci byly buňky sleziny stimulovány in vitro a byly testovány na schopnost lyžovat cíle inkubované s WT1 peptidy. Byly indukovány CTL specifické pro P136-144, p235-243 a pll7-139, ael ne pro p225-233. CTL data pro p235-243 a pll7-i39 jsou uvedena na obr. 11A a 11B. data pro peptidy pl36-144 a p225-233 nejsou uvedena.

CTL lýza vyžaduje, aby byly WT1 peptidy endogenně zpracovány a prezentovány v asociaci s MHC molekulami třídy I nádorových buněk. Výše uvedené CTL specifické pro WT1 peptid byly testovány na schopnost lyžovat WT1 pozitivní versus WT1 negativní nádorové buněčné linie. CTL specifické pro p235-243 lyžovaly cíle inkubované s p235-243 peptidy, ale nelyžovaly buněčné linie, které exprimovaly WT1 proteiny (obr. 11A). naopak, CTL specifické pro pll7-139 lyžovaly cíle inkubované s pll7-139 peptidy a také lyžovaly maligní buňky exprimující WT1 (obr. 11B). Jako negativní kontrola CTL specifické pro P117-139 nelyžovaly WT1 negativní EL-4 (též označované jako • · ·

114

E10) .

Specificita WT1 specifické lýzy byla potvrzena inhibicí studeného cíle (obr. 12A-12B). Efektorové buňky byly umístěny v různých poměrech efektor:cíl v 96-jamkových plotnách s U-dnem. Přidal se 10-násobek (ve srovnání s horkým cílem) uvedených cílů potažených peptidem bez značení ^5XCr. nakonec se přidalo 10⁴cílových buněk značených ^sxCr a plotny se inkubovaly při 37 °C po dobu 4 hodin. Celkový objem na jamku byl 200 ul.

Lýza TRAMP-C pll7-139 specifickými CTL byla blokována v rozmezí od 58% do 36% EL-4 inkubovanými s relevantním peptidem P117-139, ale ne EL-4 inkubovanými s irelevantním peptidem (obr. 12A). Podobně, lýza BLK-SV40 byla blokována v rozmezí od 18% do 0% EL-4 inkubovanými s relevantním peptidem pll7-139 (obr. 12B). Výsledky potvrzují, že WT1 specifické CTL specificky zabíjejí maligní buňky prostřednictvím rozpoznání zpracovaného WT1.

V pll7-139 je obsaženo několik segmentů domnělých CTL motivů. Pro stanovení přesné sekvence CTL epitopů byly syntetizovány všechny potenciální 9-měrové peptidy v pll7-139 (tabulka XLVIII). Dva z těchto peptidů (pl26-134 a pl30-138) se vázaly na H-2^to molekuly třídy I (Tabulka XLVIII). CTL generované imunizací pll7-139 lyžovaly cíle inkubované s P126-134 a pl30-138, ale ne s jinými 9-merovými peptidy v P117-139 (obr. 13A).

P117-139 specifická CTL linie byla restimulována buď P126-134 nebo pl30-138. Po restimulaci pl26-134 nebo pl30-138 demonstrovaly obě T-lymfocytámí linie lýzu specifickou pro peptid, ale pouze CTL specifická pro pl030-138 vykazovala lýzu WT1 pozitivní nádorové buněčné linie (obr. 13B a 13C). Proto se

115 ·· · · · · · ·· · · ··· zdá být pl30-138 přirozeně zpracovávaným epitopem.

Tabulka XLVIII: Vazba WT1 CTL 9-merových peptidů v pll7-139 na antigeny třídy I B6 myší

Peptid	Vazebná afinita na myší MHC třídy I ;s I
Pl17-125 PSQASSGQA (SEQ ID NO:221)	2%
Pl 18-126 SQASSGQAR (SEQ ID NO:216)	2%
Pl 19-127 QASSGQARM (SEQ ID NOs: 161 a 288)	2%
P120-128 ASSGQARMF (SEQ ID NO:40	1%
P121-129 SSGQARMFP (SEQ ID NO:222)	1%
P122-130 SGQARMFPN (SEQ ID NO:212)	1%
P123-131 GQARMFPNA (SEQ ID NOs: 98 a 269)	1%
P124-132 QARMFPNAP (SEQ ID NO:223)	1%
P125-133 ARMFPNAPY (SEQ ID	1%
NO:38)
P126-134 RMFPNAPYL (SEQ ID NOs: 185 a 293)	79%
P127-135 MFPNAPYLP (SEQ ID NO:224)	2%
P128-136 FPNAPYLPS (SEQ ID NOs: 79 a 267)	1%
P129-137 PNAPYLPSC (SEQ ID NO:225)	1%
P130-138 NAPYLPSCL (SEQ ID NOs: 144 a 282)	79%
P131-139 APYLPSCLE (SEQ ID NO:226)	1%

116

• · · · · · · · · ·· · · ·

Příklad 6: Identifikace WT1 specifické mRNA v myších nádorových buněčných liniích

Tento příklad ilustruje použití RT-PCR pro detekci WT1 specifické mRNA v buňkách a buněčných liniích.

Mononukleární buňky se izolovaly odstřděním podle gradientu density a ihned se zmrazily a uskladnily při -80 °C do analýzy RT-PCR na přítomnost WT1 specifické mRNA. RT-PCR byla provedenazpůsobem popsaným ve Fraizer et al., Blood 86: 4704-4706, 1995. Celková RNA byla extrahována z 10^Ύ buněk za použití běžných technik. RNA pelety byly resuspendovány ve 25 ul vody zpracované diethylpyrokarbonatem a byly použity přímo pro reversní transkripci. Regiony zinkových prstů (exony 7 až 10) byly amplifikovány PCR jako 330 bp myší cDNA. Aplifikace byla provedena na termocyklovači během jednoho nebo dvou kol PCR. Použla se AmpliTaq DNA polymerasa (perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 2,5 mM MgCl₂ a 20 pmol každého primeru v celkovém reakčním objemu 50 ul. 20 ul podíly PCR produktů se zpracovaly elektroforesou na 2% garosových gelech barvených ethidiumbromidem. Gely se fotografovaly za použití Polaroid filmu (Polaroid 667, Polaroid Ltd, Hertfordshire, England). Prevence zkřížené kontaminace se provedla podle doporučení Kwok a Higuchi, nátuře 339: 237-238, 1989. Negativními kontrolami byly směsi cDNA a PCR činidel s vodou místo cDNA v každém pokusu. Pro vyloučení falešné negativity byla přítomnost intaktní RNA a adekvátní tvorby cDNA hodnocena pro každý vzorek kontrolní PCR za použití beta-aktinových primerů. Vzorky, které nebyly amplifikovány těmito primery, byly vyloučeny z analýzy.

Primery pro amplifikaci WT1 v myších buněčných liniích byly:

P115: 1458-1478: 5' CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3' (kódující primer, SEQ ID NO: 21); a P116: 1767-1787; 5'ATG TTG TGA TGG • · • ·

117

CGG ACC AAT 3' (reversní primer, SEQ ID NO: 22) (viz Inoue et al., Blood 88: 2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood, 86: 4704-4706, 1995).

Beta aktinové primery použité v kontrolních reakcích byly: 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3' (kódující primer, SEQ ID NO: 236), a 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3' (protismyslný primer, SEQ ID NO: 24).

Primery použité v amplifikaci lidského WT1 byly: P117954-974: 5'GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3' (SEQ ID NO: 25), a P118: 1434-1414: 5'-GAG AGT CAG ACT TGA AAG GAGT3' (SEQ ID NO: 5). Pro nested RT-PCR mohou být primery: P119: 1023-1043: 5'GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3' (SEQ ID NO: 26), a P120: 1345-1365: 5' TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3' (SEQ ID NO: 27).

Tabulka XLIX ukazuje výsledky WT1 PCR analýzy myších nádorových buněčných linií. V tabulce XLIX (+++) ukazuje silný WT1 PCR amplifikační produkt v prvním kroku RT-PCR, (++) ukazuje WT1 amplifikační produkt detekovatelný v prvním kroku WT1 RT PCR, (+) ukazuje produkt, který je detekovatelný pouze ve druhém kroku WT1 RT PCR a (-) ukazuje WT1 PCR negativní výsledek.

Tabulka XLIX: Detekce WT1 mRNA v myších nádorových buněčných liniích

Buněčná linie WT1 mRNA

K562 (lidská leukemická, ATCC): pozitivní kontrola; +++ (Lozzio and Lozzio, Blood 45: 321-324, 1975) • *· · · • · · · · · ·

118

TRAMC (SV40 transformovaná prostatická, B6), Foster +++ et al., Cancer Res. 57: 3325-3330, 1997

BLK-SV40 HD2 (SV40-transformované fibroblasty, B6,++

ATCC), Nátuře 276: 510-511, 1978

CTLL (T-lymfocyty, B6, ATCC), Gillis, Nátuře 268:+

154-156, 1977

FM (FBL-3 sublinie, leukemická, B6); Glynn and Fefer, + Cancer Res. 28: 434-439, 1968

BALB 3T3 (ATCC); Aaroston and Todaro, J. Cell Physiol.+

72: 141-148, 1968

S49.1 (lymfomová, podobná T-lymfocytům, B/C, ATCC),+

Horibata and Harris, Exp. Cell. Res. 60: 61, 1970

BNL CL.2 (embryonální jaterní, B/C, ATCC), Nátuře 276:+

510-511, 1978

MethA (sarkomová, B/C), Old et al., Am. NY Acad. Sci. 101: 80-106, 1962

P3.6.2.8.1 (myelomová, B/C, ATCC), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 66: 344, 1970

P2N (leukemická, DBA/2, ATCC), Melling et al., J. Immunol. 117: 1267-1274, 1976

BCL1 (lymfomová, B/C, ATCC), Slavin and Strober,

Nátuře 272: 624-626, 1977

119

LSTRA (lymfomová, B/C), Glynn et al., Cancer Res.

28: 434-439, 1968

E10/EL-4 (lymfomová, B6), Glynn et al., Cancer Res.

28: 434-439, 1968

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv byla popsána specifická provedení předkládaného vynálezu, existují různé modifikace těchto provedení spadající do rozsahu předkládaného vynálezu. Vynález je tedy omezen pouze připojenými patentovými nároky.

120 « *4 t ·· ·· · t 4 « · · · » 4 · · · · · ·4 4 4 4 ··· • 4« 4· 44 444 · ·

4444 »<4 44 ·

44 444 4* 44 *44

PK &W - Z/í^

Seznam sekvencí <110> Gaiger, Alexander

Cheever, Martin A.

<120> Prostředky a způsoby pro WT1 specifickou imunoterapii <130> 210121.465C1 <140> US <141> 1999-03-25 <160> 326 <170> FastSEQ pro Windows verze 3.0 <400> 1

Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly 15 10 15

Gly

	<210>	2
	<211>	23
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien
	<400>	2
Pro	Ser Gin	Ala	Ser	Ser	Gly
1			5
Tyr	Leu Pro	Ser	Cys	Leu	Glu
		20
	<210>	3
	<211>	23
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	3
Pro	Ser Gin	Ala	Ser	Ser	Gly
1			5
Tyr	Leu Pro	Ser	Cys	Leu	Glu
		20
	<210>	4
	<211>	19
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	4
Gly	Ala Thr	Leu	Lys	Gly	Val
1			5
Trp	Thr Glu
	<210>	5

Gin

Ala

Arg

Gly

Met

Ser

Phe

Ser

Pro

Ser

Asn

Ser

Ala

Val

Pro

Lys

121 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 5 gagagtcaga cttgaaagca gt

<210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapien

<400> 6

ctgagcctca gcaaatgggc

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 7

gagcatgcat gggctccgac gtgcggg

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 8

ggggtaccca ctgaacggtc cccga

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 9

tccgagccgc acctcatg

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 10

gcctgggatg ctggactg

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 11

gagcatgcga tgggttccga cgtgcgg

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 12

ggggtacctc aaagcgccac gtggagttt • ·

122 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13

Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly
1	5	10	15
Gly

	<210>	14
	<211>	19
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	14
Gly	Ala Thr	Leu	Lys Gly Met	Ala Ala Gly Ser Ser Ser	Ser Val Lys
1			5	10	15

Trp Thr Glu <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 15

Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gin Asp Val Arg 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16

Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gin Asp Val Arg 15 10 15 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17

Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 18

Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser 15 10 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 19

Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His

10 15

123

<210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20

Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His 15 10 15 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 cccaggctgc aataagagat a <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 atgttgtgat ggcggaccaa t <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 23 gtggggcgcc ccaggcacca <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 24 gtccttaatg ctacgcacga tttc <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 25 ggcatctgag accagtgaga a <210> 26 <2112> 21 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 26 gctgtcccac ttacagatgc a

124

<210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 27 tcaaagcgcc agctggagtt t

	<210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo	sapien
	<400>	28
Ala	Ala Gly	Ser	Ser Ser	Ser	Val	Lys
1			5
	<210>	29
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	29
Ala	Ala Gin	Phe	Pro Asn	His	Ser	Phe.
1			5
	<210>	30
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	30
Ala	Glu Pro	His i	Glu Glu	Gin	Cys	Leu
1			5
	<210>	31
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	31
Ala	Gly Ala	Cys Arg Tyr	Gly	Pro	Phe
1			5
	<210>	32
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	32
Ala	Gly Ser	Ser	Ser Ser	Val	Lys	Trp
1			5
	<210>	33
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	33
Ala	Ile Arg	Asn	Gin Gly	Tyr	Ser	Thr
1			5

125

	<210>	34
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	34
Ala	Leu Leu	Pro Ala Val	Pro	Ser	Leu
1		5
	<210>	35
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	35
Ala	Leu Leu	Pro Ala Val	Ser	Ser	Leu
1		5
	<210>	36
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	36
Ala	Gin Phe	Pro Asn His	Ser	Phe	Lys
1		5
	<210>	37
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	37
Ala	Gin Trp	Ala Pro Val	Leu	Asp	Phe
1		5
	<210>	38
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	38
Ala	Arg Met	Phe Pro Asn	Ala	Pro	Tyr
1		5
	<210>	39
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	39
Ala	Arg Ser	Asp Glu Leu	Val	Arg	His
1		5
	<210>	40
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	40
Ala	Ser Ser	Gly Gin Ala	Arg	Met	Phe
1		5

• · • ·

126

	<210>	41
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	41
Ala	Tyr Gly	Ser Leu Gly	Gly	Pro	Ala
1		5
	<210>	42
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	42
Ala	Tyr Pro	Gly Cys Asn	Lys	Arg	Tyr
1		5
	<210>	43
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	43
Cys	Ala Leu	Pro Val Ser	Gly	Ala	Ala
1		5
	<210>	44
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	44
Cys	Ala Tyr	Pro Gly Cys	Asn	Lys	Arg
1		5
	<210>	45
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	45
Cys	His Thr	Pro Thr Asp	Ser	Cys	Thr
1		5
	<210>	46
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	46
Cys	Lys Thr	Cys Gin Arg	Lys	Phe	Ser
1		5
	<210>	47
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

<400> 47

Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala Ile Arg

127

1	<210>	48	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	48
Cys	Leu Ser	Ala :	Phe Thr	Val	His	Phe
1	<210>	49	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	49
Cys	Met Thr	Trp Asn Gin	Met	Asn	Leu
1	<210>	50	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	50
Cys	Arg Trp	Pro ;	Ser Cys	Gin	Lys	Lys
1	<210>	51	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	51
Cys	Arg Tyr	Gly i	Pro Phe	Gly	Pro	Pro
1	<210>	52	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	52
Cys	Thr Gly	Ser 1	31n Ala	Leu	Leu	Leu
1		5
	<210>	53
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	53
Asp	Glu Leu	Val Arg His	His	Asn	Met
1	<210>	54	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien

<400> 54 • ·

128

Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala
1	5
	<210>	55
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	55
Asp	Phe Lys	Asp	Cys Glu	Arg	Arg	Phe
1			5
	<210>	56
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	56
Asp	Gly Thr	Pro	Ser Tyr	Gly	His	Thr
1			5
	<210>	57
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	57
Asp	His Leu	Lys	Thr His	Thr	Arg	Thr
1			5
	<210>	58
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	58
Asp	Leu Asn	Ala	Leu Leu	Pro	Ala	Val
1			5
	<210>	59
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	59
Asp	Pro Met	Gly	Gin Gin	Gly	Ser	Leu
1			5
	<210>	60
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	60
Asp	Gin Leu	Lys	Arg His	Gin	Arg	Arg
1			5
	<210>	61
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	i sapien

• ·

129

<400> 61	Gin Ala Leu
Asp Ser Cys 1	Thr	Gly Ser 5
	<210>	62
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	62
Asp	Val Arg	Asp	Leu Asn	Ala	Leu	Leu
1			5
	<210>	63
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	63
Asp	Val Arg	Arg	Val Pro	Gly	Val	Ala
1			5
	<210>	64
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	64
Glu	Asp Pro	Met	Gly Gin	Gin	Gly	Ser
1			5
	<210>	65
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	65
Glu	Glu Gin	Cys	Leu Ser	Ala	Phe	Thr
1			5
	<210>	66
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	' sapien
	<400>	66
Glu	Lys Pro	Tyr	Gin Cys	Asp	Phe	Lys
1			5
	<210>	67
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	67
Glu	Lys Arg	Pro	Phe Met	Cys	Ala	Tyr
1			5
	<210>	68
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

130

	<400>	68
Glu	Pro His	Glu	Glu Gin	Cys	Leu	Ser
1	<210>	69	5

	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	i sapien
	<400>	69
Glu	Gin Cys	Leu	Ser Ala	Phe	Thr	Val
1	<210>	70	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	70
Glu	Ser Asp	Asn	His Thr	Ala	Pro	Ile
1	<210>	71	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	71
Glu	Ser Asp	Asn	His Thr	Thr	Pro	Ile
1	<210>	72	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	72
Glu	Ser Gin	Pro .	Ala Ile	Arg	Asn	Gin
1	<210>	73	5

	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	73
Glu	Thr Ser	Glu Lys Arg	Pro	Phe	Met

5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien <400>. 74

Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
1	5
<210>	75
<211>	9
<212>	PRT

• · · «

131

	<213>	Homo	sapien
	<400>	75
Phe	Ala Arg	Ser .	Asp Glu	Leu	Val	Arg
1			5
	<210>	76
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	76
Phe	Gly Pro	Pro	Pro Pro	Ser	Gin	Ala
1			5
	<210>	77
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	77
Phe	Lys Asp	Cys	Glu Arg	Arg	Phe	Ser
1			5
	<210>	78
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	78
Phe	Lys Leu	Ser	His Leu	Gin	Met	His
1			5
	<210>	79
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	79
Phe	Pro Asn	Ala	Pro Tyr	Leu	Pro	Ser
1			5
	<210>	80
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	80
Phe	Gin Cys	Lys	Thr Cys	Gin	Arg	Lys
1			5
	<210>	81
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	> sapien
	<400>	81
Phe	Arg Gly	Ile	Gin Asp	Val	Arg	Arg
1			5
	<210>	82
	<211>	9

132

	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	82
Phe	Ser Gly	Gin Phe Thr	Gly	Thr	Ala
1		5
	<210>	83
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	83
Phe	Ser Arg	Ser Asp Gin	Leu	Lys	Arg
1		5
	<210>	84
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	84
Phe	Thr Gly	Thr Ala Gly	Ala	Cys	Arg
1		5
	<210>	85
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	85
Phe	Thr Val	His Phe Ser	Gly	Gin	Phe
1		5
	<210>	86
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	86
Gly	Ala Ala	Gin Trp Ala	Pro	Val	Leu
1		5
	<210>	87
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	87
Gly	Ala Glu	Pro His Glu	Glu	Gin	Cys
1		5
	<210>	88
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	88
Gly	Ala Thr	Leu Lys Gly	Val	Ala	Ala
1		5

<210> 89 • «·

333 <211> 9 <212> PRT

	<213>	Homo	sapien
	<400>	89
Gly	Cys Ala	Leu :	Pro Val	Ser	Gly	Ala
1			5
	<210>	90
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	90
Gly	Cys Asn	Lys .	Arg Tyr	Phe	Lys	Leu
1			5
	<210>	91
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	91
Gly	Glu Lys	Pro '	Tyr Gin	Cys	Asp	Phe
1			5
	<210>	92
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	92
Gly	Gly Gly	Gly Cys Ala	Leu	Pro	Val
1			5
	<210>	93
	<211>	9
	<212>	PRT	*
	<213>	Homo	sapien
	<400>	93
Gly	Gly Pro	Ala	Pro Pro	Pro	Ala	Pro
1			5
	<210>	94
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	94
Gly	His Thr	Pro	Ser His	His	Ala	Ala
1			5
	<210>	95
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien
	<400>	95
Gly	Lys Thr	Ser	Glu Lys	Pro	Phe	Ser

5

134

	<210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien
	<400>	96
Gly	Pro Phe	Gly	Pro Pro	Pro	Pro	Ser
1			5
	<210>	97
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	97
Gly	Pro Pro	Pro	Pro Ser	Gin	Ala	Ser
1			5
	<210>	98
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	98
Gly	Gin Ala	Arg	Met Phe	Pro	Asn	Ala
1			5
	<210>	99
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	99
Gly	Gin Phe	Thr	Gly Thr	Ala	Gly	Ala
1			5
	<210>	100
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	> sapien
	<400>	100
Gly	Gin Ser	Asn	His Ser	Thr	Gly	Tyr
1			5
	<210>	101
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	101
Gly	Ser Asp	Val	Arg Asp	Leu	Asn	Ala
1			5
	<210>	102
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	102
Gly	Ser Gin	Ala	Leu Leu	Leu	Arg	Thr
1			5

'..135

	<210>	103
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	103
Gly	Val Phe	Arg Gly Ile	Gin	Asp	Val
1		5
	<210>	104
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	104
Gly	Val Lys	Pro Phe Gin	Cys	Lys	Thr
1		5
	<210>	105
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	105
Gly	Tyr Glu	Ser Asp Asn	His	Thr	Ala
1		5
	<210>	106
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	106
Gly	Tyr Glu	Ser Asp Asn	His	Thr	Thr
1		5
	<210>	107
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	107
His	Glu Glu	Gin Cys Leu	Ser	Ala	Phe
1		5
	<210>	108
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	108
His	His Asn	Met His Gin	Arg	Asn	Met
1		5
	<210>	109
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

<400> 109

His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys

6 <210> 110 <211> 9 <212> PRT

	<213>	Homo	sapien
	<400>	110
His	Ser Phe	Lys	His Glu	Asp	Pro	Met
1			5
	<210>	111
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	111
His	Ser Arg	Lys	His Thr	Gly	Glu	Lys
1			5
	<210>	112
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	112
His	Thr Gly	Glu	Lys Pro	Tyr	Gin	Cys
1			5
	<210>	113
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	113
His	Thr His	Gly	Val Phe	Arg	Gly	Ile
1			5
	<210>	114
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	114
His	Thr Arg	Thr	His Thr	Gly	Lys	Thr
1			5.
	<210>	115
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	115
His	Thr Thr	Pro	Ile Leu	Cys	Gly	Ala
1			5
	<210>	116
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien

<400> 116

I • ·

137

Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg Ile
1	5
	<210>	117
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	117
Ile	Arg Asn	Gin	Gly Tyr	Ser	Thr	Val
1			5
	<210>	118
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	118
Lys	Asp Cys	Glu	Arg Arg	Phe	Ser	Arg
1			5
	<210>	119
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	119
Lys	Phe Ala	Arg	Ser Asp	Glu	Leu	Val
1			5
	<210>	120
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	120
Lys	Phe Ser	Arg	Ser Asp	His	Leu	Lys
1			5
	<210>	121
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	’ sapien
	<400>	121
Lys	His Glu	Asp	Pro Met	Gly	Gin	Gin
1			5
	<210>	122
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien
	<400>	122
Lys	Lys Phe	Ala	Arg Ser	Asp	Glu	Leu
1	•		5
	<210>	123
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien

138

Lys 1	<400> 123 Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser 5
	<210>	124
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	124
Lys	Pro Tyr	Gin Cys Asp	Phe	Lys	Asp
1		5
	<210>	125
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	125
Lys	Gin Glu	Pro Ser Trp	Gly	Gly	Ala
1		5
	<210>	126
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	126
Lys	Arg His	Gin Arg Arg	His	Thr	Gly
1		5
	<210>	127
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	127
Lys	Arg Tyr	Phe Lys Leu	Ser	His	Leu
1		5
	<210>	128
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	128
Lys	Thr Cys	Gin Arg Lys	Phe	Ser	Arg
1		5
	<210>	129
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	129
Lys	Thr Ser	Glu Lys Pro	Phe	Ser	Cys
1		5
	<210>	130
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

139 <400> 130

Leu Asp Phe Ala 1	Pro Pro Gly Ala Ser 5
	<210>	131
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	131
Leu	Glu Cys	Met	Thr Trp	Asn	Gin	Met
1			5
	<210>	132
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	132
Leu	Glu Ser	Gin	Pro Ala	Ile	Arg	Asn
1			5
	<210>	133
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	133
Leu	Gly Ala	Thr	Leu Lys	Gly	Val	Ala
1			5
	<210>	134
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	134
Leu	Gly Gly	Gly Gly Gly	Cys	Ala	Leu
1			5
	<210>	135
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	135
Leu	Lys Gly	Val	Ala Ala	Gly	Ser	Ser
1			5
	<210>	136
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	i sapien
	<400>	136
Leu	Lys Arg	His	Gin Arg	Arg	His	Thr

5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT

140

	<213>	Homo	sapien
	<400>	137
Leu	Lys Thr	His	Thr Arg	Thr	His
1			5
	<210>	138
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	138
Leu	Pro Val	Ser	Gly Ala	Ala	Gin
1			5
	<210>	139
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	139
Leu	Gin Met	His	Ser Arg	Lys	His
1			5
	<210>	140
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	140
Leu	Arg Thr	Pro	Tyr Ser	Ser	Asp
1			5
	<210>	141
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	i sapien
	<400>	141
Leu	Ser His	Leu	Gin Met	His	Ser
1			5
	<210>	142
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien
	<400>	142
Met	Cys Ala	Tyr	Pro Gly	Cys	Asn
1			5
	<210>	143
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	143
Met	His Gin	Arg	Asn Met	Thr	Lys
1			5
	<210>	144
	<211>	9

Thr

Trp

Thr

Asn

Arg

Lys

Leu

141 <212> PRT <213> Homo sapien

	<400>	144
Asn	Ala Pro	Tyr Leu Pro	Ser	Cys	Leu
1		5
	<210>	145
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	145
Asn	Lys Arg	Tyr Phe Lys	Leu	Ser	His
1		5
	<210>	146
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	146
Asn	Leu Gly	Ala Thr Leu	Lys	Gly	Val
1		5
	<210>	147
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	147
Asn	Leu Tyr	Gin Met Thr	Ser	Gin	Leu
1		5
	<210>	148
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	148
Asn	Met His	Gin Arg Asn	Met	Thr	Lys
1		5
	<210>	149
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	149
Asn	Met Thr	Lys Leu Gin	Leu	Ala	Leu
1		5
	<210>	150
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	150
Asn	Gin Gly	Tyr Ser Thr	Val	Thr	Phe
1		5
	<210>	151

• ·

142

<211> 9 <212> PRT

	<213>	Homo	sapien
	<400>	151
Asn	Gin Met	Asn :	Leu Gly	Ala	Thr	Leu
1			5
	<210>	152
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	152
Pro	Ala Ile	Arg Asn Gin	Gly	Tyr	Ser
1			5
	<210>	153
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	153
Pro	Gly Ala	Ser .	Ala Tyr	Gly	Ser	Leu
1			5
	<210>	154
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	154
Pro	His Glu	Glu ¹	Gin Cys	Leu	Ser	Ala
1			5
	<210>	155
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	155
Pro	Ile Leu	Cys	Gly Ala	Gin	Tyr	Arg
1			5
	<210>	156
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	156
Pro	Pro Pro	Pro	His Ser	Phe	Ile	Lys
1			5
	<210>	157
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	i sapien
	<400>	157
Pro	Pro Pro	Pro	Pro His	Ser	Phe	Ile
1			5

• ·

143

	<210>	158
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	158
Pro	Pro Pro	Pro Pro Pro	His	Ser	Phe
1		5
	<210>	159
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	159
Pro	Ser Cys	Gin Lys Lys	Phe	Ala	Arg
1		5
	<210>	160
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	160
Gin	Ala Leu	Leu Leu Arg	Thr	Pro	Tyr
1		5
	<210>	161
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	161
Gin	Ala Ser	Ser Gly Gin	Ala	Arg	Met
1		5
	<210>	162
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	162
Gin	Cys Asp	Phe Lys Asp	Cys	Glu	Arg
1		5
	<210>	163
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	163
Gin	Cys Lys	Thr Cys Gin	Arg	Lys	Phe
1		5
	<210>	164
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	164
Gin	Asp Val	Arg Arg Val	Pro	Gly	Val
1		5

-|144

-L 1 vZ

	<210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien
	<400>	165
Gin	Phe Thr	Gly Thr Ala	Gly	Ala	Cys
1		5
	<210>	166
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	166
Gin	Gly Ser	Leu Gly Glu	Gin	Gin	Tyr
1		5
	<210>	167
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	167
Gin	Leu Glu	Cys Met Thr	Trp	Asn	Gin
1		5
	<210>	168
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	168
Gin	Met Asn	Leu Gly Ala	Thr	Leu	Lys
1		5
	<210>	169
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	169
Gin	Met Thr	Ser Gin Leu	Glu	Cys	Met
1		5
	<210>	170
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	170
Gin	Pro Ala	Ile Arg Asn	Gin	Gly	Tyr
1		5
	<210>	171
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

<400> 171

Gin Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val • · • · • ·

145

	<210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien
	<400>	172
Gin	Arg Lys	Phe	Ser Arg
1			5
	<210>	173
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	173
Gin	Arg Asn	Met	Thr Lys
1			5
	<210>	174
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	174
Gin	Trp Ala	Pro	Val Leu
1			5
	<210>	175
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	175
Gin	Tyr Arg	Ile	His Thr
1			5
	<210>	176
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	176
Gin	Tyr Ser	Val	Pro Pro
1			5
	<210>	177
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	177
Arg	Asp Leu	Asn	Ala Leu
1			5
	<210>	178
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	i sapien

Ser

Leu

Asp

His

Pro

Leu <400> 178

Asp

His

Gin

Phe

Gly

Val

Pro

Leu

Ala

Val

Tyr

Ala

146 ♦ ·

Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys
1	5
	<210>	179
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	179
Arg	Gly Ile	Gin Asp Val	Arg	Arg	Val
1		5
	<210>	180
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	180
Arg	His His	Asn Met His	Gin	Arg	Asn
1		5
	<210>	181
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	181
Arg	His Gin	Arg Arg His	Thr	Gly	Val
1		5
	<210>	182
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	182
Arg	Ile His	Thr His Gly	Val	Phe	Arg
1		5
	<210>	183
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	183
Arg	Lys Phe	Ser Arg Ser	Asp	His	Leu
1		5
	<210>	184
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	184
Arg	Lys His	Thr Gly Glu	Lys	Pro	Tyr
1		5
	<210>	185
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

• ·

147

	<400>	185
Arg	Met Phe	Pro Asn Ala	Pro	Tyr	Leu
1		5
	<210>	186
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	186
Arg	Asn Met	Thr Lys Leu	Gin	Leu	Ala
1		5
	<210>	187
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	187
Arg	Arg Phe	Ser Arg Ser	Asp	Gin	Leu
1		5
	<210>	188
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	188
Arg	Arg His	Thr Gly Val	Lys	Pro	Phe
1		5
	<210>	189
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	189
Arg	Arg Val	Pro Gly Val	Ala	Pro	Thr
1		5
	<210>	190
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	190
Arg	Ser Ala	Ser Glu Thr	Ser	Glu	Lys
1		5
	<210>	191
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	191
Arg	Ser Asp	Glu Leu Val	Arg	His	His
1		5
	<210>	192
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

• ·

148

	<400>	192
Arg	Ser Asp	hís :	Leu Lys	Thr	His	Thr
1			5
	<210>	193
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	193
Arg	Ser Asp	Gin	Leu Lys	Arg	His	Gin
1			5
	<210>	194
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	194
Arg	Thr Pro	Tyr	Ser Ser	Asp	Asn	Leu
1			5
	<210>	195
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	195
Arg	Val Pro	Gly	Val Ala	Pro	Thr	Leu
1			5
	<210>	196
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	196
Arg	Trp Pro	Ser	Cys Gin	Lys	Lys	Phe
1			5
	<210>	197
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	197
Ser	Ala Ser	Glu	Thr Ser	Glu	Lys	Arg
1			5
	<210>	198
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien
	<400>	198
Ser	Cys Leu	Glu	Ser Gin	Pro	Ala	Ile
1			5
	<210>	199
	<211>	9
	<212>	PRT

• · • · ·

149

	<213>	Homo	sapien
	<400>	199
Ser	Cys Leu	Glu	Ser Gin	Pro	Thr	Ile
1			5
	<210>	200
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	200
Ser	Cys Gin	Lys	Lys Phe	Ala	Arg	Ser
1			5
	<210>	201
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	201
Ser	Cys Arg	Trp	Pro Ser	Cys	Gin	Lys
1			5
	<210>	202
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	202
Ser	Cys Thr	Gly	Ser Gin	Alá	Leu	Leu
1			5
	<210>	203
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	203
Ser	Asp Glu	Leu	Val Arg	His	His	Asn
1			5
	<210>	204
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	i sapien
	<400>	204
Ser	Asp Asn	His	Thr Thr	Pro	Ile	Leu
1			5
	<210>	205
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	205
Ser	Asp Asn	Leu	Tyr Gin	Met	Thr	Ser

5 <210> 206 <211> 9

	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	206
Ser	Asp Val	Arg Asp Leu	Asn	Ala	Leu
1		5
	<210>	207
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	207
Ser	Glu Lys	Pro Phe Ser	Cys	Arg	Trp
1		5
	<210>	208
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	208
Ser	Glu Lys	Arg Pro Phe	Met	Cys	Ala
1		5
	<210>	209
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	209
Ser	Glu Thr	Ser Glu Lys	Arg	Pro	Phe
1		5
	<210>	210
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	210
Ser	Phe Ile	Lys Gin Glu	Pro	Ser	Trp
1		5
	<210>	211
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	211
Ser	Gly Ala	Ala Gin Trp	Ala	Pro	Val
1		5
	<210>	212
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	212
Ser	Gly Gin	Ala Arg Met	Phe	Pro	Asn

5 <210> 213

150

	<211> 9 <212> PRT <213> Homo	sapien
	<400>	213
Ser	His His	Ala	Ala Gin	Phe	Pro	Asn
1			5
	<210>	214
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	214
Ser	Leu Gly	Glu	Gin Gin	Tyr	Ser	Val
1			5
	<210>	215
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	215
Ser	Leu Gly	Gly	Gly Gly	Gly	Cys	Ala
1			5
	<210>	216
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	216
Ser	Gin Ala	Ser	Ser Gly	Gin	Ala	Arg
1			5
	<210>	217
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	217
Ser	Ser Asp	Asn	Leu Tyr	Gin	Met	Thr
1			5
	<210>	218
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	218
Ser	Val Pro	Pro	Pro Val	Tyr	Gly	Cys
1			5
	<210>	219
	<211>	9
	<212?	PRT
	<213>	Homo	- sapien
	<400>	219
Thr	Cys Gin	Arg	Lys Phe	Ser	Arg	Ser
1			5

151

	<210>	220
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	220
Thr	Asp Ser	Cys Thr Gly	Ser	Gin	Ala
1		5
	<210>	221
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	221
Thr	Glu Gly	Gin Ser Asn	His	Ser	Thr
1		5
	<210>	222
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	222
Thr	Gly Lys	Thr Ser Glu	Lys	Pro	Phe
1		5
	<210>	223
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	223
Thr	Gly Ser	Gin Ala Leu	Leu	Leu	Arg
1		5
	<210>	224
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	224
Thr	Gly Thr	Ala Gly Ala	Cys	Arg	Tyr
1		5
	<210>	225
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	225
Thr	Gly Tyr	Glu Ser Asp	Asn	His	Thr
1		5
	<210>	226
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	226
Thr	Leu Val	Arg Ser Ala	Ser	Glu	Thr
1		5

152

	<210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Homo	sapien
	<400>	227
Thr	Pro Ile	Leu	Cys Gly	Ala	Gin	Tyr
1			5
	<210>	228
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	228
Thr	Pro Ser	His	His Ala	Ala	Gin	Phe
1			5
	<210>	229
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	229
Thr	Pro Ser	Tyr	Gly His	Thr	Pro	Ser
1			5
	<210>	230
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	230
Thr	Pro Thr	Asp	Ser Cys	Thr	Gly	Ser
1			5
	<210>	231
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	231
Thr	Pro Tyr	Ser	Ser Asp	Asn	Leu	Tyr
1			5
	<210>	232
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	• sapien
	<400>	232
Thr	Ser Glu	Lys	Pro Phe	Ser	Cys	Arg
1			5
	<210>	233
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien

<400> 233

Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys

153

5

	<210> 234 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien
	<400>	234
Thr	Ser Gin	Leu Glu Cys	Met	Thr	Trp
1		5
	<210>	235
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	235
Thr	Val His	Phe Ser Gly	Gin	Phe	Thr
1		5
	<210>	236
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	236
Val	Ala Ala	Gly Ser Ser	Ser	Ser	Val
1		5
	<210>	237
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	237
Val	Ala Pro	Thr Leu Val	Arg	Ser	Ala
1		5
	<210>	238
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	238
Val	Phe Arg	Gly Ile Gin	Asp	Val	Arg
1		5
	<210>	239
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	239
Val	Lys Pro	Phe Gin Cys	Lys	Thr	Cys
1		5
	<210>	240
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

<400> 240

154

Val Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn
1	5
	<210>	241
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	241
Val	Leu Asp	Phe Ala Pro	Pro	Gly	Ala
1		5
	<210>	242
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	242
Val	Pro Gly	Val Ala Pro	Thr	Leu	Val
1		5
	<210>	243
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	243
Val	Arg His	His Asn Met	His	Gin	Arg
1		5
	<210>	244
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	244
Val	Thr Phe	Asp Gly Thr	Pro	Ser	Tyr
1		5
	<210>	245
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	245
Trp	Asn Gin	Met Ašn Leu	Gly	Ala	Thr
1		5
	<210>	246
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien
	<400>	246
Trp	Pro Ser	Cys Gin Lys	Lys	Phe	Ala

5 <210> 247 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien • ·

155

<400> 247 Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser
1	5
	<210>	248
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	248
Tyr	Phe Lys	Leu	Ser His	Leu	Gin	Met
1			5
	<210>	249
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	249
Tyr	Gly His	Thr	Pro Ser	His	His	Ala
1			5
	<210>	250
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	250
Tyr	Pro Gly	Cys	Asn Lys	Arg	Tyr	Phe
1			5
	<210>	251
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	251
Tyr	Gin Met	Thr	Ser Gin	Leu	Glu	Cys
1			5
	<210>	252
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	252
Tyr	Arg Ile	His	Thr His	Gly	Val	Phe
1			5
	<210>	253
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien
	<400>	253
Tyr	Ser Ser	Asp	Asn Leu	Tyr	Gin	Met
1			5
	<210>	254
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus

• ·

156

Ala 1	<400> 254 Glu Pro His	Glu Glu Gin Cys Leu 5
	<210>	255
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	255
Ala	Leu Leu	Pro	Ala Val Ser	Ser	Leu
1			5
	<210>	256
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	256
Ala	Tyr Gly	Ser	Leu Gly Gly	Pro	Ala
1			5
	<210>	257
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	257
Ala	Tyr Pro	Gly	Cys Asn Lys	Arg	Tyr
1			5
	<210>	258
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	258
Cys	Met Thr	Trp	Asn Gin Met	Asn	Leu
1			5
	<210>	259
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	259
Cys	Thr Gly	Ser	Gin Ala Leu	Leu	Leu
1			5
	<210>	260
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	260
Asp	Gly Ala	Pro	Ser Tyr Gly	His	Thr
1			5
	<210>	261
	<211>	9
	<212>	PRT

• · • · ·

1157

	<213>	Mus	musculus
	<400>	261
Asp	Leu Asn	Ala	Leu Leu Pro	Ala	Val
1			5
	<210>	262
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	262
Asp	Pro Met	Gly	Gin Gin Gly	Ser	Leu
1			5
	<210>	263
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	263
Asp	Ser Cys	Thr	Gly Ser Gin	Ala	Leu
1			5
	<210>	264
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	264
Asp	Val Arg	Asp	Leu Asn Ala	Leu	Leu
1			5
	<210>	265
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	265
Glu	Gin Cys	Leu	Ser Ala Phe	Thr	Leu
1			5
	<210>	266
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	266
Glu	Ser Asp	Asn	His Thr Ala	Pro	Ile
1			5
	<210>	267
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	267
Phe	Pro Asn	Ala	Pro Tyr Leu	Pro	Ser
1			5

<210> 268 <211> 9

158

	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	268
Gly	Cys Asn	Lys	Arg Tyr Phe	Lys	Leu
1			5
	<210>	269
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	269
Gly	Gin Ala	Arg	Met Phe Pro	Asn	Ala
1			5
	<210>	270
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	270
Gly	Val Phe	Arg	Gly Ile Gin	Asp	Val
1			5
	<210>	271
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	271
Gly	Tyr Glu	Ser	Asp Asn His	Thr	Ala
1			5
	<210>	272
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	272
His	Ser Phe	Lys	His Glu Asp	Pro	Met
1			5
	<210>	273
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	273
His	Thr His	Gly	Val Phe Arg	Gly	Ile
1			5
	<210>	274
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	274
Ile	Leu Cys	Gly	Ala Gin Tyr	Arg	Ile
1			5

<210> 275 • ·

159

	<211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus
	<400>	275
Lys	Phe Ala	Arg	Ser Asp Glu	Leu	Val
1			5
	<210>	276
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	276
Lys	Arg Tyr	Phe	Lys Leu Ser	His	Leu
1			5
	<210>	277
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	277
Lys	Thr Ser	Glu	Lys Pro Phe	Ser	Cys
1			5
	<210>	278
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	278
Leu	Glu Cys	Met	Thr Trp Asn	Gin	Met
1			5
	<210>	279
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	279
Leu	Gly Gly	Gly	Gly Gly Cys	Gly	Leu
1			5
	<210>	280
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	280
Leu	Gin Met	His	Ser Arg Lys	His	Thr
1			5
	<210>	281
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	281
Met	His Gin	Arg	Asn Met Thr	Lys	Leu
1			5

160

	<210> 282 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus
	<400>	282
Asn	Ala Pro	Tyr	Leu Pro Ser	Cys	Leu
1			5
	<210>	283
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	283
Asn	Leu Gly	Ala	Thr Leu Lys	Gly	Met
1			5
	<210>	284
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	284
Asn	Leu Tyr	Gin	Met Thr Ser	Gin	Leu
1			5
	<210>	285
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	285
Asn	Met Thr	Lys	Leu His Val	Ala	Leu
1			5
	<210>	286
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	286
Asn	Gin Met	Asn	Leu Gly Ala	Thr	Leu
1			5
	<210>	287
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	287
Pro	Gly Ala	Ser	Ala Tyr Gly	Ser	Leu
1			5
	<210>	288
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	288
Gin	Ala Ser	Ser	Gly Gin Ala	Arg	Met
1			5

• ·· • · ·« • ·· • ♦ · ♦

161

	<210>	289
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	289
Gin	Met Thr	Ser	Gin Leu Glu	Cys	Met
1			5
	<210>	290
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	290
Gin	Gin Tyr	Ser	Val Pro Pro	Pro	Val
1			5
	<210>	291
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	291
Gin	Tyr Arg	Ile	His Thr His	Gly	Val
1			5
	<210>	292
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	292
Gin	Tyr Ser	Val	Pro Pro Pro	Val	Tyr
1			5
	<210>	293
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	293
Arg	Met Phe	Pro	Asn Ala Pro	Tyr	Leu
1			5
	<210>	294
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	294
Arg	Thr Pro	Tyr	Ser Ser Asp	Asn	Leu
1			5

<210> 295 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 295

Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu

162 -

1			5
	<210>	296
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	296
Ser	Cys Leu	Glu	Ser Gin Pro	Thr	Ile
1			5
	<210>	297
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	297
Ser	Cys Gin	Lys	Lys Phe Ala	Arg	Ser
1			5
	<210>	298
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	298
Ser	Asp Val	Arg	Asp Leu Asn	Ala	Leu
1			5
	<210>	299
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	299
Ser	Leu Gly	Glu	Gin Gin Tyr	Ser	Val
1			5
	<210>	300
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	300
Thr	Cys Gin	Arg	Lys Phe Ser	Arg	Ser
1			5
	<210>	301
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	301
Thr	Glu Gly	Gin	Ser Asn His	Gly	Ile
1			5
	<210>	302
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus

<400> 302

163

Thr	Leu His	Phe	Ser Gly Gin	Phe	Thr
1			5
	<210>	303
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	303
Thr	Leu Val	Arg	Ser Ala Ser	Glu	Thr
1			5
	<210>	304
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	304
Val	Leu Asp	Phe	Ala Pro Pro	Gly	Ala
1			5
	<210>	305
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	305
Trp	Asn Gin	Met	Asn Leu Gly	Ala	Thr
1			5
	<210>	306
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	306
Tyr	Phe Lys	Leu	Ser His Leu	Gin	Met
1			5
	<210>	307
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	307
Tyr	Gin Met	Thr	Ser Gin Leu	Glu	Cys
1			5
	<210>	308
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	308
Tyr	Ser Ser	Asp	Asn Leu Tyr	Gin	Met
1			5
	<210>	309
	<211>	6
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapien

164 *· « · · · · ···· · · · · ·«· «·«· < · · · · » · · a « · a « · • · «*· «· ·« »* ·

	<400>	309
Gly	Ala Ala	Gin	Trp Ala
1			5
	<210>	310
	<211>	12
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	310
Ala	Ser Ala	Tyr	Gly Ser	Leu	Gly
1			5
	<210>	311
	<211>	15
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	311
Ala	Phe Thr	Val	His Phe	Ser	Gly
1			5
	<210>	312
	<211>	5
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	312
His	Ala Ala	Gin	Phe
1			5
	<210>	313
	<211>	32
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	313
Cys	His Thr	Pro	Thr Asp	Ser	Cys
1			5
Arg	Thr Pro	Tyr	Ser Ser	Asp	Asn
		20
	<210>	314
	<211>	32
	<212>	PRT
	<213>	Homc	> sapien
	<400>	314
Arg	Ile His	Thr	His Gly	Val	Phe
1			5
Val	Pro Gly	Val	Ala Pro	Thr	Leu
		20
	<210>	315
	<211>	4
	<212>	• PRT

<213> Homo sapien

Pro Ala Pro

Phe Thr Gly Thr Ala Gly

15

Gly	Ser Gin	Ala	Leu Leu	Leu
10					15
Tyr	Gin	Met	Thr	Ser 30	Gin	Leu

Gly	Ile Gin	Asp Val	Arg	Arg
10					15
Arg	Ser	Ala	Ser	Glu 30	Thr	Ser

<400> 315

Arg Tyr Phe Lys 1 • ·

165 <210> 316 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 316

Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu 15 10

Lys

Arg His

Gin <210> 317 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 317

Gin

Arg Lys

Phe

Ser Arg

Ser

Asp

His

Leu

Lys

Thr

His

Thr

Arg

Thr

1

5

10

15

His

Thr Gly

Lys

Thr

Ser

20

<210>

318

<211>

21

<212>

PRT

<213>

Homc

> sapien

<400>

318

Cys

Gin Lys

Lys

Phe

Ala

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

Arg

His

Asn

1

5

10

15

Met

His Gin

Arg

Asn

20

<210>

319

<211>

449

<212>

PRT

<213>

Homo sapien

<400>

319

Met

Gly Ser

Asp

Val

Arg

Asp

Leu

Asn

Ala

Leu

Pro

Ala

Val

Pro

1

5

10

15

Ser

Leu Gly

Gly

Cys

Ala

Leu

Pro

Val

Ser

Gly

Ala

20

25

30

Gin

Trp Ala

Pro

Val

Leu

Asp

Phe

Ala

Pro

Gly

Ala

Ser

Ala

Tyr

35

40

45

Gly

Ser Leu

Gly

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

50

55

60

Pro

Pro Pro

Pro

His

Ser

Phe

Ile

Lys

Gin

Glu

Pro

Ser

Trp

Gly

65

70

75

80

Ala

Glu Pro

His

Glu

Gin

Cys

Leu

Ser

Ala

Phe

Thr

Val

His

Phe

85

90

95

Ser

Gly Gin

Phe

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Ala

Cys

Are

Tyr

Gly

Pro

Phe

100

105

110

Gly

Pro Pro

Pro

Ser

Gin

Ala

Ser

Gly

Gin

Ala

Arg

Met

Phe

115

120

125

Pro

Asn Ala

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Cys

Leu

Glu

Ser

Gin

Pro

Ala

Ile

130

135

140

Arg

Asn Gin

Gly

Tyr

Ser

Thr

Val

Thr

Phe

Asp

Gly

Thr

Pro

Ser

Tyr

145

150

155

160

Gly

His Thr

Pro

Ser

His

Ala

Gin

Phe

Pro

Asn

His

Ser

Phe

165

170

175

Lys

His Glu

Asp

Pro

Met

Gly

Gin

Gly

Ser

Leu

Gly

Glu

Gin

180

185

190

Tyr

Ser Val

Pro

Val

Tyr

Gly

Cys

His

Thr

Pro

Thr

Asp

Ser

• ·

Λ

166

195

200

205

Cys

Thr

Gly

Ser

Gin

Ala

Leu

Arg

Thr

Pro

Tyr

Ser

Asp

210

215

220

Asn

Leu

Tyr

Gin

Met

Thr

Ser

Gin

Leu

Glu

Cys

Met

Thr

Trp

Asn

Gin

225

230

235

240

Met

Asn

Leu

Gly

Ala

Thr

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gly

Ser

245

250

255

Ser

Val

Lys

Trp

Thr

Glu

Gly

Gin

Ser

Asn

His

Ser

Thr

Gly

Tyr

Glu

260

265

270

Ser

Asp

Asn

His

Thr

Pro

Ile

Leu

Cys

Gly

Ala

Gin

Tyr

Arg

Ile

275

280

285

His

Thr

His

Gly

Val

Phe

Arg

Gly

Ile

Gin

Asp

Val

Arg

Val

Pro

290

295

300

Gly

Val

Ala

Pro

Thr

Leu

Val

Arg

Ser

Ala

Ser

Glu

Thr

Ser

Glu

Lys

305

310

315

320

Arg

Pro

Phe

Met

Cys

Ala

Tyr

Pro

Gly

Cys

Asn

Lys

Arg

Tyr

Phe

Lys

325

330

335

Leu

Ser

His

Leu

Gin

Met

His

Ser

Arg

Lys

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

340

345

350

Tyr

Gin

Cys

Asp

Phe

Lys

Asp

Cys

Glu

Arg

Phe

Ser

Arg

Ser

Asp

355

360

365

Gin

Leu

Lys

Arg

His

Gin

Arg

His

Thr

Gly

Val

Lys

Pro

Phe

Gin

370

375

380

Cys

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Asp

His

Leu

Lys

Thr

385

390

395

400

His

Thr

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Lys

Thr

Ser

Glu

Lys

Pro

Phe

Ser

Cys

405

410

415

Arg

Trp

Pro

Ser

Cys

Gin

Lys

Phe

Ala

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

420

425

430

Arg

His

Asn

Met

His

Gin

Arg

Asn

Met

Thr

Lys

Leu

Gin

Leu

Ala

435

440

445

Leu

<210> 320 <211> 449 <212> PRT

<213>

Mus

musculus

<400>

320

Met

Gly

Ser

Asp

Val

Arg

Asp

Leu

Asn

Ala

Leu

Pro

Ala

Val

Ser

1

5

10

15

Ser

Leu

Gly

Cys

Gly

Leu

Pro

Val

Ser

Gly

Ala

20

25

30

Gin

Trp

Ala

Pro

Val

Leu

Asp

Phe

Ala

Pro

Gly

Ala

Ser

Ala

Tyr

35

40

45

Gly

Ser

Leu

Gly

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

50

55

60

Pro

His

Ser

Phe

Ile

Lys

Gin

Glu

Pro

Ser

Trp

Gly

65

70

75

80

Ala

Glu

Pro

His

Glu

Gin

Cys

Leu

Ser

Ala

Phe

Thr

Leu

His

Phe

85

90

95

Ser

Gly

Gin

Phe

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Ala

Cys

Arg

Tyr

Gly

Pro

Phe

100

105

110

Gly

Pro

Ser

Gin

Ala

Ser

Gly

Gin

Ala

Arg

Met

Phe

115

120

125

Pro

Asn

Ala

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Cys

Leu

Glu

Ser

Gin

Pro

Thr

Ile

130

135

140

Arg

Asn

Gin

Gly

Tyr

Ser

Thr

Val

Thr

Phe

Asp

Gly

Ala

Pro

Ser

Tyr

145

150

155

160

Gly

His

Thr

Pro

Ser

His

Ala

Gin

Phe

Pro

Asn

His

Ser

Phe

165 170 175 • ·

167

Lys

His

Glu

Asp

Pro

Met

Gly

Gin

Gly

Ser

Leu

Gly

Glu

Gin

180

185

190

Tyr

Ser

Val

Pro

Val

Tyr

Gly

Cys

His

Thr

Pro

Thr

Asp

Ser

195

200

205

Cys

Thr

Gly

Ser

Gin

Ala

Leu

Arg

Thr

Pro

Tyr

Ser

Asp

210

215

220

Asn

Leu

Tyr

Gin

Met

Thr

Ser

Gin

Leu

Glu

Cys

Met

Thr

Trp

Asn

Gin

225

230

235

240

Met

Asn

Leu

Gly

Ala

Thr

Leu

Lys

Gly

Met

Ala

Gly

Ser

245

250

255

Ser

Val

Lys

Trp

Thr

Glu

Gly

Gin

Ser

Asn

His

Gly

Ile

Gly

Tyr

Glu

260

265

270

Ser

Asp

Asn

His

Thr

Ala

Pro

Ile

Leu

Cys

Gly

Ala

Gin

Tyr

Arg

Ile

275

280

285

His

Thr

His

Gly

Val

Phe

Arg

Gly

Ile

Gin

Asp

Val

Arg

Val

Ser

290

295

300

Gly

Val

Ala

Pro

Thr

Leu

Val

Arg

Ser

Ala

Ser

Glu

Thr

Ser

Glu

Lys

305

310

315

320

Arg

Pro

Phe

Met

Cys

Ala

Tyr

Pro

Gly

Cys

Asn

Lys

Arg

Tyr

Phe

Lys

325

330

335

Leu

Ser

His

Leu

Gin

Met

His

Ser

Arg

Lys

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

340

345

350

Tyr

Gin

Cys

Asp

Phe

Lys

Asp

Cys

Glu

Arg

Phe

Ser

Arg

Ser

Asp

355

360

365

Gin

Leu

Lys

Arg

His

Gin

Arg

His

Thr

Gly

Val

Lys

Pro

Phe

Gin

370

375

380

Cys

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Asp

His

Leu

Lys

Thr

385

390

395

400

His

Thr

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Lys

Thr

Ser

Glu

Lys

Pro

Phe

Ser

Cys

405

410

415

Arg

Trp

His

Ser

Cys

Gin

Lys

Phe

Ala

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

420

425

430

Arg

His

Asn

Met

His

Gin

Arg

Asn

Met

Thr

Lys

Leu

His

Val

Ala

435

440

445

Leu

<210> 321 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien a Mus musculus <400> 321

Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala

5 <210> 322 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien a i Mus musculus <400> 322

Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro

5 <210> 323 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien a Mus musculus <400> 323

Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro

168

5

	<210> 324 <211> 9 <212> PRT
<213>	Homo	sapien a	Mus musculus
	<400>	324
Met	Phe Pro	Asn	Ala Pro	Tyr	Leu	Pro
1			5
	<210>	325
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien	ai	Mus	musculus
	<400>	325
Pro	Asn Ala	Pro	Tyr Leu	Pro	Ser	Cys
1			5
	<210>	326
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien	ar	Mus	musculus
	<400>	326
Ala	Pro Tyr	Leu	Pro Ser	Cys	Leu	Glu

jUDr. Petr KšlensW advokát

Claims

1. Polypeptid obsahující imunogenní část přirozeného WT1, nebo jeho varianta, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro WT1 a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena, kde polypeptid obsahuje ne více než 16 sousedních aminokyselinových zbytků přirozeného WT1 polypeptidu.

2. Polypeptid podle nároku 1, kde se imunogenní část váže na MHC molekulu třídy I.

3. Polypeptid podle nároku 1, kde se imunogenní část váže na MHC molekulu třídy II.

4. Polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

(a) sekvence uvedené v jakékoliv z tabulek II - XLVI;

(b) varianty uvedených sekvencí, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena; a (c) mimetika uvedených sekvencí, kde schopnost mimetika reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena.

5. Polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

(a) ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 34), GATLKGVAA (SEQ ID NO: 88), CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 49 a 258), SCLESQPTI (SEQ ID NO: 199 a 296), SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198), NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147 ·· · · · ·· ·· ···· ···· »· ···« ··· · ·

170 a 284), ALLPAVSSL (SEQ ID NO: 35 a 255), RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185 a 293);

6. Polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid obsahuje 4-16 sousedních aminokyselin přirozeného WT1 polypeptidu.

7. Polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid obsahuje 8-10 sousedních aminokyselin přirozeného WT1 polypeptidu.

8. Polypeptid obsahující imunogenní část aminokyselinových zbytků 1-174 přirozeného WT1 polypeptidu, nebo jeho varianta, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro WT1 není významně snížena, kde polypeptid obsahuje ne více než 16 sousedních aminokyselinových zbytků přítomných v aminokyselinách 175 až 449 přirozeného WT1 polypeptidu.

9. Polypeptid obsahující imunogenní část WT1, který se liší v substitucích v 1 až 3 aminokyselinových pozicích v imunogenní části, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro WT1 je zvýšena vzhledem k přirozenému WT1.

10. Mimetikum imunogenní části WT1 polypeptidu, ve kterém je • · «· ···· · * 4 • · · · · · ·

171 •· •· «· •· • · alespoň jeden aminokyselinový zbytek nahrazen sloučeninou, která není aminokyselina, tak, že schopnost mimetika reagovat s antisérem a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není snížena.

11. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo přísadou.

12. Farmaceutický prostředek podle nároku 11 vyznačující se tím, že polypeptid obsahuje 4-16 sousedících aminokyselin přirozeného WT1 polypeptidu.

13. Farmaceutický prostředek podle nároku 11 vyznačující se tím, že polypeptid obsahuje 8-16 sousedících aminokyselin přirozeného WT1 polypeptidu.

14. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 8, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo přísadou.

15. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1, v kombinaci s nespecifickým zesilovačem imunitní reakce.

16. Vakcína podle nároku 15 vyznačující se tím, že polypeptid obsahuje 4-16 sousedících aminokyselin přirozeného WT1 polypeptidu.

17. Vakcína podle nároku 15 vyznačující se tím, že polypeptid obsahuje 8-10 sousedících aminokyselin přirozeného WT1 polypeptidu.

172

18. Vakcína podle nároku 15 vyznačující se tím, že zesilovačem imunitní reakce je adjuvans.

19. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 8, v kombinaci s nespecifickým zesilovačem imunitní reakce.

20. Vakcína podle nároku 19 vyznačující se tím, že zesilovačem imunitní reakce je adjuvans.

21. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) WT1 polypeptid, kde polypeptid obsahuje imunogenní část přirozeného WT1 nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a (b) nespecifický zesilovač imunitní reakce, který přednostně zesiluje reakci T-lymfocytů u pacienta.

22. Vakcína podle nároku 21 vyznačující se tím, že nespecifický zesilovač imunitní reakce je vybrán ze skupiny zahrnující: Montanide ISA50, Seppic MONTANIDE ISA720; cytokiny (například GM-CSF, Flat3-ligand); mikrosféry; adjuvans na bázi dimethyldioktadecylammoniumbromidu (DDA) AS-1, AS-2; adjuvans na bázi Ribi systému; QS21; adjuvans na bázi saponinu ; Syntex adjuvans v mikrofluidizované formě; MV, ddMV; adjuvans na bázi imunostimulačních komplexů (iscom) a inaktivované toxiny.

23. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje mimetikum podle nároku 10, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo přísadou.

173

24. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje mimetikum podle nároku 10, v kombinaci s nespecifickým zesilovačem imunitní reakce.

25. Polynukleotid kódující polypeptid podle nároku 1 nebo 8.

26. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) polynukleotid kódující WT1 polypeptid, kde polypeptid obsahuje imunogenní část přirozeného WT1 nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat a protilátkami a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a (b) farmaceuticky přijatelný nosič nebo přísadu.

27. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) protilátku nebo její vazebný fragment pro antigen, která se specificky váže na WT1 polypeptid; a (b) farmaceuticky přijatelný nosič nebo přísadu.

28. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) T-lymfocyty, které se specificky reagují s WT1 polypeptidem; a (b) farmaceuticky přijatelný nosič nebo přísadu.

29. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) buňku prezentující antigen, která exprimuje WT1 polypeptid, kde polypeptid obsahuje imunogenní část přirozeného

WT1 nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více

174 ···· · · · ·· · ♦ · · · · · · 9 9 9 9 9 9 9 substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat a protilátkami a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a (b) farmaceuticky přijatelný nosič nebo přísadu.

30. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) polynukleotid kódující WT1 polypeptid, kde polypeptid obsahuje imunogenní část přirozeného WT1 nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat a protilátkami a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a (b) nespecifický zesilovač imunitní reakce.

31. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) buňku prezentující antigen, která exprimuje WT1 polypeptid, kde polypeptid obsahuje imunogenní část přirozeného WT1 nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat a protilátkami a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a (b) nespecifický zesilovač imunitní reakce.

32. Vakcína vyznačující setím, že obsahuje:

(a) anti-idiotypovou protilátku nebo její vazebný fragment pro antigen, která se specificky váže na protilátku, která se specificky váže na imunogenní část WT1; a (b) nespecifický zesilovač imunitní reakce.

33. Vakcína podle jakéhokoliv z nároků 30-32 vyznačující se tím, že zesilovačem imunitní • · · · ···· · · · • · · · ··· · ·

175 reakce j e adj uvans.

34. Vakcína podle jakéhokoliv z nároků 30-32 vyznačující se tím, že zesilovač imunitní reakce přednostně zesiluje reakci T-lymfocytů u pacienta.

35. Způsob pro zesílení nebo indukci imunitní reakce u lidského pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podání farmaceutického prostředku pacientovi, kde farmaceutický prostředek obsahuje:

(a) WTl polypeptid, který obsahuje imunogenní část přirozeného WTl nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s protilátkami a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a (b) fyziologicky přijatelný nosič nebo přísadu;

a tím dosažení zesílení nebo indukce imunitní reakce specifické pro WTl nebo buňky exprimující WTl u lidského pacienta.

36. Způsob pro zesílení nebo indukci imunitní reakce u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podání farmaceutického prostředku podle jakéhokoliv z nároků 11, 14, 23 nebo 26-29 pacientovi.

37. Způsob pro zesílení nebo indukci imunitní reakce u lidského pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podání vakcíny pacientovi, kde vakcína obsahuje:

(a) WTl polypeptid, který obsahuje imunogenní část přirozeného WTl nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s protilátkami a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a

176 (b) nespecifický zesilovač imunitní reakce;

a tím dosažení zesílení nebo indukce imunitní reakce specifické pro WT1 nebo buňky exprimující WT1 u lidského pacienta.

38. Způsob pro zesílení nebo indukci imunitní reakce u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podání vakcíny podle jakéhokoliv z nároků 15, 19, 21, 24 nebo 30-32 pacientovi a tím dosažení zesílení nebo indukce imunitní reakce specifické pro WT1 nebo buňky exprimující WT1 u lidského pacienta.

39. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u lidského pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podání farmaceutického prostředku pacientovi, kde farmaceutický prostředek obsahuje:

(a) WT1 polypeptid, který obsahuje imunogenní část přirozeného WT1 nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s protilátkami a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a (b) fyziologicky přijatelný nosič nebo přísadu;

a tím dosažení inhibice vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u lidského pacienta.

40. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u pacienta vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje podání farmaceutického prostředku podle jakéhokoliv z nároků 11, 14, 23 nebo 26-29 pacientovi a tím dosažení inhibice vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u lidského pacienta.

177

41. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u pacienta vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje podání vakciny pacientovi, kde vakcína obsahuje:

(a) WT1 polypeptid, který obsahuje imunogenní část přirozeného WT1 nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s protilátkami a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena; a (b) nespecifický zesilovač imunitní reakce;

a tím dosažení inhibice vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u pacienta.

42. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u pacienta vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje podání vakciny podle jakéhokoliv z nároků 15, 19, 21, 24 nebo 30-32 pacientovi a tím dosažení inhibice vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u pacienta.

43. Způsob podle nároku 39 nebo nároku 41 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je leukemie.

44. Způsob podle nároku 43 vyznačující se tím, že leukémií je akutní myeloidní leukemie, akutní lymfatická leukemie nebo chronická myeloidní leukemie.

45. Způsob podle nároku 39 nebo nároku 41 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor.

178

46. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že zhoubným nádorem je zhoubný nádor prsu, plic, štítné žlázy nebo gastrointestinálního traktu nebo melanom.

47. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je leukemie.

48. Způsob podle nároku 47 vyznačující se tím, že leukémií je akutní myeloidní leukemie, akutní lymfatická leukemie nebo chronická myeloidní leukemie.

49. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor.

50. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že zhoubným nádorem je zhoubný nádor prsu, plic, štítné žlázy nebo gastrointestinálního traktu nebo melanom.

51. Způsob podle nároku 42 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je leukemie.

52. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že leukémií je akutní myeloidní leukemie, akutní lymfatická leukemie nebo chronická myeloidní leukemie.

53. Způsob podle nároku 42 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor.

54. Způsob podle nároku 53 vyznačující se tím, že zhoubným nádorem je zhoubný nádor prsu, plic, štítné žlázy nebo gastrointestinálního traktu nebo melanom.

55. Způsob podle nároku 39 vyznačující se tím, • * · · · · · · · • · · · > » * · · · · ···· · · · « ·

179 *·· ··· tt · · ·· ·· ··· · · ·· · *· že farmaceutický prostředek obsahuje WT1 polypeptid, který obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv z tabulek II - XLVI a varianty uvedených sekvencí, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena.

56. Způsob podle nároku 39 vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek obsahuje WT1 polypeptid, který obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 34), GATLKGVAA (SEQ ID NO: 88), CMTWNQMNL (SEQ ID NO:

49 a 258), SCLESQPTI (SEQ ID NO: 199 a 296), SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198), NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147 a 284), ALLPAVSSL (SEQ ID NO: 35 a 255), RMFPNAPYL (SEQ ID NO:185 a 293) a varianty uvedených sekvencí, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena.

57. Způsob podle nároku 41 vyznačující se tím, že vakcina obsahuje WT1 polypeptid, který obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené v jakékoliv z tabulek II - XLVI a varianty uvedených sekvencí, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony specifickými pro antigen není významně snížena.

58. Způsob podle nároku 41 vyznačující se tím, že vakcina obsahuje WT1 polypeptid, který obsahuje sekvenci

180 vybranou ze skupiny zahrnující ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 34),

GATLKGVAA (SEQ ID NO: 88), CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 49 a 258),

SCLESQPTI (SEQ ID NO: 199 a 296), SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198),

NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147 a 284), ALLPAVSSL (SEQ ID NO: 35 a 255), RMFPNAPYL (SEQ ID NO:185 a 293) a varianty uvedených sekvencí, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo insercích, které jsou takové, že schopnost varianty reagovat s antisérem specifickým pro antigen a/nebo T-lymfocytárními liniemi nebo klony není významně snížena.

59. Způsob pro odstranění buněk exprimujících WT1 z kostní dřeně, periferní krve nebo frakcí kostní dřeně nebo periferní krve, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování kostní dřeně, periferní krve a nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve s T-lymfocyty, které specificky reagují s WT1 polypeptidem, kde krok kontaktování je proveden za podmínek a doby dostatečných pro provedení odstranění WT1 pozitivních buněk na méně než 10% vzhledem k počtu myeloidních nebo lymfatických buněk v kostní dřeni, periferní krvi nebo frakci kostní dřeně nebo periferní krve.

60. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u pacienta vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje podání kostní dřeně, periferní krve nebo frakcí kostní dřeně nebo periferní krve připravených způsobem podle nároku 59, pacientovi.

61. Způsob podle nároku 60 vyznačující se tím, že kostní dřeň, periferní krev nebo frakce je autologní.

62. Způsob podle nároku 60vyznačující se tím, že kostní dřeň, periferní krev nebo frakce je syngenní nebo

181 allogení.

63. Způsob pro stimulaci a/nebo expandování T-lymfocytů vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování T-lymfocytů s WT1 polypeptidem, polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid a/nebo buňkami prezentujícími antigen exprimujícími WT1 polypeptid, za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění stimulace a/nebo expanze T-lymfocytů.

64. Způsob podle nároku 63 vyznačující se tím, že T-lymfocyty jsou přítomny v kostní dřeni, periferní krvi nebo frakci kostní dřeně nebo periferní krve.

65. Způsob podle nároku 63 vyznačuj ící se tím, že kostní dřeň, periferní krev nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve je získána od pacienta postiženého maligním onemocněním spojeným s expresí WT1.

66. Způsob podle nároku 63 vyznačující se tím, že kostní dřeň, periferní krev nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve je získána od savce nepostiženého maligním onemocněním spojeným s expresí WT1.

67. Způsob podle nároku 63 vyznačující se tím, že T-lymfocyty jsou klonovány před expansí.

68. Způsob pro stimulaci a/nebo expandování T-lymfocytů v savci vyznačující se tím, že zahrnuje podání farmaceutického prostředku savci, kde uvedený prostředek obsahuje:

(a) jeden nebo více z:

(i) WT1 polypeptid;

(ii) polynukleotid kódující WT1 polypeptid;

182 (iii) buňku prezentující antigen exprimující WT1 polypeptid; a (b) fyziologicky přijatelný nosič nebo přísadu;

a tak stimulaci a/nebo expansi T-lymfocytů v savci.

69. Způsob pro stimulaci a/nebo expandování T-lymfocytů v savci vyznačující se tím, že zahrnuje podání vakciny savci, kde uvedená vakcína obsahuje:

(a) jeden nebo více z:

(i) WT1 polypeptid;

(ii) polynukleotid kódující WT1 polypeptid;

(iii) buňku prezentující antigen exprimující WT1 polypeptid; a (b) nespecifický zeslivač imunitní reakce;

a tak stimulaci a/nebo expansi T-lymfocytů v savci.

70. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění asociovaného s expresí WT1 u pacienta vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje podání T-lymfocytů připravených způsobem podle nároku 63 pacientovi.

71. Způsob podle nároku 70 vyznačující se tím, že kostní dřeň, periferní krev nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve je získána od pacienta postiženého maligním onemocněním spojeným s expresí WT1.

72. Způsob podle nároku 70 vyznačuj ící se tím, že kostní dřeň, periferní krev nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve je získána od savce nepostiženého maligním onemocněním spojeným s expresí WT1.

72. Způsob pro sledování účinnosti imunizace nebo terapie maligních onemocnění spojených s expresí WT1 u pacienta ·· ·· · · · · · ··«· · · · · ··· ·««· · · · ··

183 vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) inkubaci prvního biologického vzorku s jedním nebo více ze skupiny zahrnující:

(i) WT1 polypeptid;

(ii) polynukleotid kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňky prezentující antigen, které exprimují WT1 polypeptid;

kde první biologický vzorek je získán od pacienta před terapií nebo imunizací a kde inkubace je provedena za podmínek a dobu dostatečnou pro tvorbu imunokomplexů;

(b) detekci imunokomplexů vytvořených mezi WT1 polypeptidem a protilátkami v biologickém vzorku, které se specificky váží na WT1 polypeptid;

(c) opakování kroků (a) a (b) za použití druhého biologického vzorku získaného od stejného pacienta po terapii nebo imunizaci; a (d) srovnání počtu imunokomplexů detekovaných v prvním a druhém biologickém vzorku a podle toho sledování účinnosti terapie nebo imunizace u pacienta.

74. Způsob podle nároku 73 vyznačuj ící se tím, že krok detekce zahrnuje (a) inkubaci imunokomplexů s detekčním činidlem, které se váže na imunokomplexy, kde toto detekční činidlo obsahuje reportérovou skupinu; (b) odstranění nenavázaného detekčního činidla; a (c) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti reproterové skupiny.

75. Způsob podle nároku 74 vyznačuj ící se tím, že detekční činidlo obsahuje druhou protilátku nebo její vazebný fragment pro antigen, která se váže na protilátku, která se specificky váže na WT1 polypeptid.

76. Způsob podle nároku 74 vyznačující se tím, • · ·· · · · · · ··«· ···· ·· ···· ··· ··

184 že detekční činidlo obsahuje Protein A.

77. Způsob podle nároku 74 vyznačující se tím, že reporterová skupina je vybrána ze skupiny zahrnující radioizotopy, fluorescenční skupiny, luminiscenční skupiny, enzymy, biotin a barviva.

78. Způsob podle nároku 73 vyznačující se tím, že reporterová skupina je navázaná na WT1 polypeptid a kde krok detekce zahrnuje odstranění nenavázaného WT polypeptidu a potom detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti reportérové skupiny.

79. Způsob pro sledování účinnosti imunizace nebo terapie maligních onemocnění spojených s expresí WT1 u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(i) WT1 polypeptid;

(ii) polynukleotid kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňky prezentující antigen, které exprimuj! WT1 polypeptid;

kde biologický vzorek obsahuje CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocyty a je získán od pacienta před terapií nebo imunizací a kde inkubace je provedena za podmínek a dobu dostatečnou pro specifickou aktivaci, proliferaci a/nebo lýzu T-lymfocytů;

(b) detekci úrovně aktivace, proliferace a/nebo lýzy T-lymfocytů;

(c) opakování kroků (a) a (b) za použití druhého biologického vzorku obsahujícího CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocyty, kde druhý biologický vzorek je získán od stejného pacienta po terapii nebo imunizaci; a (d) srovnání úrovně aktivace, proliferace a/nebo lýzy T-lymfocytů v prvním a druhém biologickém vzorku a podle toho

185 sledování účinnosti terapie nebo imunizace u pacienta.

80. Způsob podle nároku 73 nebo nároku 79 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor nebo leukemie.

81. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) inkubaci CD4 + a/nebo CD8+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny:

(i) WT1 polypeptidem;

(ii) polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WT1 polypeptid;

tak, že dojde k proliferaci T-lymfocytů; a (b) podání účinného množství proliferovaných T-lymfocytů pacientovi, takže dojde k inhibici vzniku nádorového onemocnění u pacienta.

82. Způsob podle nároku 81 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor nebo leukemie.

83. Způsob podle nároku 81 vyznačující se tím, že krok inkubace T-lymfocytů se opakuje jednou nebo vícekrát.

84. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) inkubaci CD4+ a/nebo CD8+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny:

(i) WT1 polypeptidem;

(ii) polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid; nebo * · • ·

186 (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WT1 polypeptid;

tak, že dojde k proliferaci T-lymfocytů;

(b) klonování jedné nebo více buněk proliferujících v přítomnosti WT1 polypeptidu; a (c) podání účinného množství klonovaných T-lymfocytů pacientovi.

85. Způsob podle nároku 84 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor nebo leukemie.

86. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) inkubaci CD8+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny:

(i) WT1 polypeptidem;

tak, že dojde k proliferaci T-lymfocytů; a (b) podání účinného množství proliterovaných T-lymfocytů pacientovi, takže dojde k inhibici vzniku nádorového onemocnění u pacienta.

87. Způsob podle nároku 86 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor nebo leukemie.

88. Způsob podle nároku 86 vyznačující se tím, že krok inkubace T-lymfocytů se opakuje jednou nebo vícekrát.

89. Způsob pro inhibici vývoje maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta vyznačující se tím, že

187 zahrnuje kroky:

(i) WTl polypeptidem;

(ii) polynukleotidem kódujícím WTl polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WTl polypeptid;

tak, že dojde k proliferaci T-lymfocytů;

(b) klonování jedné nebo více buněk prolíferujících v přítomnosti WTl polypeptidů; a (c) podání účinného množství klonovaných T-lymfocytů pacientovi.

90. Způsob podle nároku 89 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor nebo leukemie.

91. Způsob pro určení přítomnosti nebo nepřítomnosti maligního onemocnění spojeného s expresí WTl u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) inkubaci CD4+ T-lymfocytů izolovaných od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny:

(i) WTl polypeptidem;

(ii) polynukleotidem kódujícím WTl polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WTl polypeptid; a (b) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti specifické aktivace T-lymfocytů, z čehož lze stanovit přítomnost nebo nepřítomnost maligního onemocnění spojeného s expresí WTl u pacienta.

92. Způsob podle nároku 91 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor nebo leukemie.

188

93. Způsob podle nároku 91 vyznačuj ící se tím, že krok detekce zahrnuje detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti proliferace T-lymfocytů.

94. Způsob pro určení přítomnosti nebo nepřítomnosti maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(i) WT1 polypept idem;

(ii) polynukleotidem kódujícím WT1 polypeptid; nebo (iii) buňkami prezentujícími antigen, které exprimují WT1 polypeptid; a (b) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti specifické aktivace T-lymfocytů, z čehož lze stanovit přítomnost nebo nepřítomnost maligního onemocnění spojeného s expresí WT1.

95. Způsob podle nároku 94 vyznačuj ící se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor nebo leukemie.

96. Způsob podle nároku 94 vyznačuj ící se tím, že krok detekce zahrnuje detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti vzniku cytolytické aktivity.

97. Způsob pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti maligního onemocnění spojeného s expresí WT1 u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) inkubaci biologického vzorku získaného od pacienta s jedním nebo více z následující skupiny:

(i) WT1 polypeptidem;

189 kde inkubace je provedena za podmínek a dobu dostatečnou pro tvorbu imunokomplexů;

(b) detekci imunokomplexů vytvořených mezi WT1 polypeptidem a protilátkami v biologickém vzorku, které se specificky váží na WT1 polypeptid; z čehož je možno určit přítomnost nebo nepřítomnost maligního onemocnění spojeného s expresí WT1.

98. Způsob podle nároku 97 vyznačující se tím, že maligním onemocněním je zhoubný nádor nebo leukemie.

99. Způsob podle nároku 97 vyznačující se tím, že krok detekce zahrnuje (a) inkubaci imunokomplexů s detekčním činidlem, které se váže na imunokomplexy, kde toto detekční činidlo obsahuje reportérovou skupinu; (b) odstranění nenavázaného detekčního činidla; a (c) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti reproterové skupiny.

100. Způsob podle nároku 99 vyznačující se tím, že detekční činidlo obsahuje druhou protilátku nebo její vazebný fragment pro antigen, která se váže na protilátku, která se specificky váže na WT1 polypeptid.

101. Způsob podle nároku 99 vyznačující se tím, že detekční činidlo obsahuje Protein A.

102. Způsob podle nároku 99 vyznačuj ící se tím, že reporterová skupina je vybrána ze skupiny zahrnující radioizotopy, fluorescenční skupiny, luminiscenční skupiny, enzymy, biotin a barviva.

103. Způsob podle nároku 97 vyznačující se tím, že reporterová skupina je navázaná na WT1 polypeptid a kde krok detekce zahrnuje odstranění nenavázaného WT polypeptidu a potom

190 detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti reportérové skupiny.

104. Polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1-9 pro použití jako aktivní terapeutická substance.

105. Polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1-9 pro použití ve výrobě léku pro zesílení nebo indukci imunitní reakce u pacienta.