KR20230044133A - 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드 및 리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트를 포함하는 항암 백신 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드 및 리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트를 포함하는 항암 백신 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 [종양 연관 항원(TAA) 유래 펩타이드] 및 [리포펩타이드와 면역활성물질로 구성된 아쥬번트]를 포함하는 항암 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명의 종양 연관 항원 유래 펩타이드는 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen: HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드이고, 상기 특징을 가진 펩타이드 조합을 상기 아쥬번트와 최적의 비율로 혼합하여 백신 조성물을 제조하고, 이를 암의 예방 또는 치료에 사용하는 것이다.
Description
본 발명은 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드 및 리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트를 포함하는 항암 백신 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen: HLA)에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 상기 펩타이드와 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 포함하는 암 치료용 백신, 상기 암 치료용 백신을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 암의 예방 또는 치료제로서의 용도에 관한 것이다.
암은 정상 세포에 비하여 세포 성장이 조절되지 않고, 근접한 조직으로 침입이 가능하며, 때로는 떨어져 있는 다른 조직으로 전이가 되는 특성을 가지고 있다. 현대에 들어서 과학 의료기술의 발달로 많은 질병들이 치료가 가능하게 되었고 치료가 불가능한 질병은 거의 없어졌지만, 암은 다른 질병들과 달리 매우 복잡하고 힘든 치료가 요구되고 있고 그 치료조차 완벽하게 효과적이지 않다.
항암 치료는 물리적으로 암 조직을 제거하거나, 또는 방사선 조사나 항암제 투여를 통해 항-세포 사멸 분자 (anti-apoptotic molecule), 텔로머라제 (telomerase), 성장인자 수용체 유전자 (growth factor receptor gene), 신호전달 분자 (signaling molecule) 등과 같이 암 세포의 생존에 필요한 유전자의 발현을 저해시키거나 세포 사멸을 유도하는 방식으로 수행된다 (Knudson AG, Nature reviews. Cancer 1(2): 157-162, 2001).
그러나 이와 같은 치료 과정에서 암 세포뿐만 아니라 정상 세포도 영향을 받을 수 있어 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 이에, 대안적으로 암을 치료하는 방법으로 항암 백신에 대한 필요성이 대두되고 있다.
항암 백신은 인체 면역체계에 암 세포 특유의 항원을 기억시켜 암세포를 공격할 수 있도록 교육시키는 백신으로 다양한 형태의 항원과 항원 전달 방법이 있다(예: 펩타이드. DNA. RNA. 수지상세포). 암 치료용 백신은 외부에서 침입하는 바이러스나 박테리아 감염을 예방하는 전통적인 예방 백신과는 달리 비자기-항원보다는 자기-항원에 대하여 면역반응을 유도하여야 한다. 또한, 상기 백신은 암이 형성된 후 투여하였을 때 작용하여야 하고 암을 억제하는 면역 효과를 발휘하여야 하며, 같은 암종을 가지고 있는 환자라 할지라도 각 암 항원의 발현율이 다르기 때문에 최대한 다양한 종류의 암 항원을 함께 제시해야 한다.
사실 많은 종류의 종양 연관 항원은 자기 항원으로서 면역 허용원(immune tolerogen)이므로, 특정한 면역 반응을 유도하는 것이 어렵다. 이러한 한계들은 많은 암 종에서 공통적으로 발현하는 항원, 또는 하나의 암 종에서 많이 발현하는 항원들에 대한 면역반응을 유도함으로써 극복할 수 있다. 최근 다양한 암 종에서 공통적으로 작용할 수 있는 항원과 하나의 암 종에서 많이 발현하는 항원들에 대하여 보고가 되고 있다.
항암백신에서 타겟(target)이 되는 종양 연관 항원(tumor-associated antigen, TAA)에 대하여 다음과 같이 분류하고 있다. A) 암-고환 항원(Cancer-testis antigen): 이 군에 속한 항원들은 정상조직에서는 고환의 정모 세포/정원 세포를 제외하고는 발현하지 않으나 암 조직에서는 높은 발현률을 보이는 항원이기 때문에 최초에 암-고환(CT) 항원이라고 불렸다. 고환 세포가 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해서는 인식될 수 없으며 따라서 면역학적으로 종양-특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 구성원 및 NY-ESO-1이 있다. B) 분화 항원(Differentiation antigen): 이러한 TAA는 특정한 조직의 세포가 분화하는데 있어서 발현되는 단백질이 종양과 종양이 발생한 정상 세포 사이에 공유되고 있는 항원이다. 분화 항원의 대표적인 예는 흑색종과 정상 멜라닌 세포에서 발견되는 Melan-A/MART-1으로 이러한 멜라닌 세포 계통-연관 단백질은 멜라닌의 생합성과 관련되어 있으며 종양 특이적은 아니지만 암 면역 치료에 널리 사용된다. 또 다른 예로는, 흑색종을 위한 티로시나아제 또는 전립선암을 위한 PSA(prostate-specific antigen)가 있다. C) 과발현된(Overexpressed) TAA: 일반적으로 정상 조직에서는 낮은 발현 수준을 보이고 다른 유형의 종양에서는 널리 발현되는 TAA이다. 정상 조직 내에서 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에서 처리(processed)되고 잠재적으로 제시(presentation)되는 많은 펩타이드 에피톱은 T 세포 인식의 임계치 수준보다 낮을 수 있기에 정상세포에는 면역반응을 유도하지 않으나, 종양 세포에서의 과발현은 이전에 확립된 내성을 중단시켜 항암 반응을 개시할 수 있다. 이 군의 TAA의 유력한 예로는 Her-2/neu, 서바이빈(Survivin), 텔로머라제(Telomerase), 또는 WT-1(Wilms' tumor 1)이 있다. D) 종양 특이적 항원(Tumor-specific antigen): 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 변이로써 발생한다(β-카테닌, CDK4, EGFRvIII 등). 이러한 분자 변경의 일부는 종양 변이 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자가 면역 반응 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 종양 특이적 항원은 일반적으로 많은 개별 암에서는 공유되지 않고 특정한 암에서만 발현한다. E) 비정상 번역 후 변형(abnormal post-translational modification)에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 특이적이 아니고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활동적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 있고 아닐 수도 있는 분해 과정 동안 단백질 스플라이싱(splicing)과 같은 이벤트 또는 MUC-1(Mucin 1)의 경우 종양의 새로운 에피톱(epitope)으로 이끄는 변화된 당화 패턴에서 발생한다.
항암 백신의 항원형태로서 종양 세포 용해물(tumor cell lysate), 단백질, DNA/RNA, 플라스미드(plasmid) 그리고 T 세포 에피톱인 펩타이드를 사용하는 방법이 존재한다. 그 중에서도 펩타이드 에피톱은 항원 특이적인 T 세포를 활성화시켜 암세포를 죽이거나 암세포의 성장을 억제하는데 가장 효과적인 물질이다. 또한 펩타이드 자체의 안전성이 높고, 가격이 저렴하며, 생산이 용이하고, 다양한 항원의 조합이 가능하다는 장점이 있다.
항암 백신은 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 에피톱을 표적으로 하며, 이는 주조직적합 복합체(Major histocompatibility complex, MHC)의 분자에 의해 제시된다. 사람의 경우 MHC 분자는 HLA(human leucocyte antigen)라고 명시한다. MHC-분자에는 두 클래스가 있으며, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II이다. MHC 클래스 I 분자는 α 사슬과 베타-2-저분자글로불린(β2-microglobulin) 사슬로 구성되어 있고, MHC 클래스 II 분자는 α 사슬과 β 사슬로 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩타이드와의 비공유결합에 사용된다.
MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포(nucleated cell)에서 나타나며, 내인 단백질, 결손 리보솜 생성물(defective ribosomal product, DRIP)과 큰 펩타이드의 단백질분해성 절단으로 인해 생성된 펩타이드를 제시한다. 그러나 엔도솜(endosome) 구획이나 외생(exogenous) 출처로부터 유래된 펩타이드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차-제시(cross-presentation) 라고 칭한다(Brossart and Bevan, Blood, 1997).
MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원제시세포(APC)에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 주로 항원제시세포에 의해 섭취된 외인(foreign) 또는 막횡단(transmembrane) 단백질의 펩타이드를 제시한다. 펩타이드와 MHC 클래스 I 분자의 복합물은 적당한 T 세포 수용체(T-Cell Receptor, TCR)를 갖는 CD8-양성(CD8+) T 세포에 의해서 인식이 되는 반면, 펩타이드와 MHC 클래스 II 분자의 복합물은 적당한 TCR을 갖는 CD4-양성 조력 T 세포(CD4+ helper T cell)에 의해 인식이 된다. CD4-양성 보조 T 세포는 CD8-양성 세포 독성 T 세포의 반응을 효과적으로 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다. 따라서 종양 연관 항원에서 유도된 CD4-양성 T 세포 에피톱은 항-종양 면역 반응을 일으키는 의약품의 개발에 아주 중요하다(Gnjatic et al., PNAS, 2003).
보조 T 세포는 종양 부위에서 세포독성 T 세포 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) 친화적 사이토카인(cytokine)을 통해 주위 환경을 지원하고 이펙터세포(effector cell), 예를 들면 CTL, 자연살해세포, 대식세포, 과립구를 유치한다(Tay et al., Cancer Gene Therapy, 2020). MHC 클래스 II에 의해 활성화된 조력 T 세포는 항-종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8-양성 킬러 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양 연관 펩타이드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런식으로 종양-관련 조력 T 세포 펩타이드 에피톱은 따로 또는 다른 종양 연관 펩타이드와 함께 항-종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 원료로 사용될 수 있다. 예를 들면, 생쥐 같은 포유류 동물 모델에서는 심지어 CD8-양성 T 림프구의 부재 하에서도, CD4-양성 T 세포가 인터페론-감마(Interferon gamma, IFN-g)의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통해 종양을 억제한다고 알려져 있다(Beatty and Paterson, Immunologic Research, 2001; Mumberg et al., PNAS, 1999).
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 함께 상승작용에 의해 항종양 효과에 기여함으로써, CD8+ T 세포(리간드: MHC 클래스 I 분자 + 펩타이드 에피톱) 또는 CD4-양성 조력 T 세포(리간드: MHC 클래스 II 분자 + 펩타이드 에피톱)에 의해 인식되는 종양 연관 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다. 따라서 본 발명에서는 MHC 클래스 I 분자를 인식하는 펩타이드 에피톱과 MHC 클래스 II 분자를 인식하는 펩타이드 에피톱을 함께 사용했다.
기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 모든 펩타이드는 T 세포 에피톱으로서 기능할 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응을 유도하는 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없어야 한다.
종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 치료에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없거나 최소화되어야 하므로 이러한 항원의 에피톱의 개개의 소집단만이 그런 응용에 적합하기 때문이다. 따라서, T 세포의 면역 내성을 최소화하고 기능과 증식을 최대화할 수 있으면서 MHC 분자와 관련이 있게 나타나는 과발현된 또는 선택적으로 발현된 펩타이드만 선택하는 것이 중요하다.
그러나 MHC는 대립유전자의 수가 너무 많기 때문에 모든 대립 유전자들에 대한 후보 펩타이드를 제작하여 직접 실험함으로써 강하게 안정적으로 결합하는 펩타이드를 선정하는 것은 현실적으로 매우 비효율적이다. 대신 인실리코(in sillico) 알고리즘 프로그램 혹은 데이터베이스(database)를 이용하여 다양한 MHC 분자에 존재하는 3차원 형태의 결합 홈에 강하게 결합할 수 있는 펩타이드들을 효과적으로 예측할 수 있다.
이들 데이터 베이스는 MHC와 펩타이드의 결합에 연관된 펩타이드 모티프 (motif)에 대한 정보 그리고 각 MHC 분자에 결합한 펩타이드를 용출 시킨후 질량 분석기(mass spectrometer) 등에서 얻은 데이터베이스를 이용하여 특정 단백질 시퀀스에서 다양한 펩타이드 에피톱을 예측하여 찾아낼 수 있다.
대표적인 데이터베이스로는 SYFPEITHI, MHCPEP, NetMHCpan-4.1EL, NetMHCIIpan-4.0EL이 있다. 하지만 결합력에 의해 예측된 펩타이드가 모두 효과적으로 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) T cell 반응을 유도하지 않는다. 컴퓨터 프로그램에서 예측된 결합력은 높았지만 실제 시험관 내 또는 생체내에서는 충분한 면역원성을 유도하지 않을 경우도 있고 오히려 면역 내성을 유도할 수도 있다.
따라서, 이렇게 예측된 펩타이드들이 항암백신으로 사용되려면 시험관 내에서 또는 생체내에서 효과적인 면역원성을 일으키는지 그리고 면역내성을 유도하지는 않는지 실제적인 실험을 통해 가장 효과적이고 안전한 펩타이드를 선택하는 과정이 필요한데, 이 실험을 수행하는 데는 경제적, 물질적, 시간적으로 많은 노력이 요구된다. 이에, 본 발명에서는 다양한 암 항원에서 MHC class I과 II 분자와 연관성이 있고, T 세포의 기능과 증식을 최대화할 수 있다고 알려져 있으며, 이미 앞선 다양한 임상 시험에서 안전성이 확보된 펩타이드를 우선적으로 선택하였다.
종양 연관 항원에 대한 T 세포의 활성화와 기능을 높이기 위해서 TCR과 펩타이드의 결합이 일차적으로 중요하지만 실제 펩타이드를 백신으로 사용한 이전의 임상시험의 결과들은 예상한 만큼의 효과를 보여주지 못했다. 가장 큰 이유는 펩타이드만으로는 충분한 면역원성(Immunogenicity)을 유도하지 못했기 때문이다. 효과적인 면역원성을 위해서는 항원 제시 세포에 의한 상호 자극적 신호전달(costimulatory signal)과 적합한 사이토카인의 도움이 필요하고 그렇지 않을 경우 T 세포가 무력화(anergic)되어 면역내성이 유도될 수 있다. 따라서 적합하고 충분한 T 세포의 활성화를 유도하고 이를 통한 항암 면역반응을 이끌어내기 위해서 아쥬번트(adjuvant)가 필수적이다.
본 발명은 항암백신의 조성물로 리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트를 사용한다. 이 아쥬번트는 체액성 및 세포성 면역반응을 우수하게 유도하며 특히 항암 반응에 중요한 Th1 타입의 면역반응을 증가시킨다. 따라서 본 발명자들은 리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트가 펩타이드에 의한 암 항원 특이적인 T 세포 활성화를 도와 더 효과적으로 종양 연관 항원 특이적인 면역반응을 유도함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드]를 포함하는 항암 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드] 및 [리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트]를 포함하는 항암 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항암 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항암 백신 조성물과 화학 항암제, 표적 항암제, 면역관문 억제제 및 방사선 요법으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 치료와 병용하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 [hTERT, MAGE-A3, MUC-1, Survivin 및 WT-1으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드]를 포함하는, 항암 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 [hTERT, MAGE-A3, MUC-1, Survivin 및 WT-1으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드] 및 [리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트]를 포함하는, 항암 백신 조성물을 제공한다.
상기 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드]는 하기의 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함한다.
i) hTERT로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호1의 펩타이드(서열번호1: ILAKFLHWL),
ii) hTERT로부터 유래되고 HLA-A24(MHC Class I) 타입인 서열번호2의 펩타이드(서열번호2: VYAETKHFL),
iii) hTERT로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 서열번호3의 펩타이드(서열번호3: EARPALLTSRLRFIPK),
iv) hTERT로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 서열번호4의 펩타이드(서열번호4: RPGLLGASVLGLDDI),
v) Survivin으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호5의 펩타이드(서열번호5: ELTLGEFLKL),
vi) Mage-A3로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호8의 펩타이드(서열번호8: KVAELVHFL),
vii) Mage-A3로부터 유래되고 HLA-A24(MHC Class I) 타입인 서열번호9의 펩타이드(서열번호9: IMPKAGLLI),
viii) MUC-1으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호12의 펩타이드(서열번호12: TAPPVHNV),
ix) WT-1으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호15의 펩타이드(서열번호15: RMFPNAPYL) 및
x) WT-1으로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 서열번호16의 펩타이드(서열번호16: KRYFKLSHLQMHSRKH).
상기 아쥬번트는 리포펩타이드와 면역활성물질을 혼합하여 제조된다
상기 아쥬번트는 리포펩타이드가 표면에 삽입된 리포좀과 면역활성물질을 포함한다.
상기 리포좀은 지질로 구성된다.
상기 면역활성물질은 폴리(I:C), QS21, MPLA, CpG 및 플라겔린으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이다.
또한, 본 발명은 상기 항암 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항암 백신 조성물을 화학 항암제, 표적 항암제, 면역관문 억제제 및 방사선 요법으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 치료와 병용하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 암 종양 연관 항원 유래 펩타이드는 항암 면역작용을 효과적으로 유도할 수 있으며, 종양 연관 항원 유래 펩타이드와 리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트를 포함하는 항암 백신 조성물은 다양한 암종에 대한 항암 면역작용을 효과적으로 유도할 수 있으며, 기전이 다른 화학 항암제, 면역관문억제제 및 방사선 요법 등과 같은 기존의 항암치료와 병용하여 항암 효과를 현저히 증진시킴으로써 암을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원 유래 단독 펩타이드에 대한 면역원성을 ELISPOT 분석을 이용하여 확인한 결과이다.
도 2은 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원 유래 펩타이드를 각 항원별로 조합했을 때의 면역원성을 ELISPOT 분석을 이용하여 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원 유래 펩타이드를 펩타이드 수에 따라 조합했을 때의 면역원성을 ELISPOT 분석을 이용하여 확인한 결과이다.
도 4a는 사량체 결합 분석(Tetramer binding assay)을 이용하여 CHA-2(IL-2 20U/ml) 펩타이드의 단독(5ug/ml 또는 50ug/ml), 10개의 펩타이드 조합(50ug/ml), 펩타이드 조합 (50ug/ml) 및 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 처리한 그룹의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)를 비교한 그래프이다.
도 4b는 도 4a의 사량체 결합 분석을 통해 CHA-2 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 4c는 사량체 결합 분석을 이용하여 CHA-8(IL-2 20U/ml) 펩타이드의 단독(5ug/ml 또는 50ug/ml), 10개의 펩타이드 조합(50ug/ml), 펩타이드 조합 (50ug/ml) 및 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 처리한 그룹의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)를 비교한 그래프이다.
도 4d는 도 4c의 사량체 결합 분석을 통해 CHA-8 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 4e는 사량체 결합 분석을 이용하여 CHA-9(IL-2 20U/ml) 펩타이드의 단독(5ug/ml 또는 50ug/ml), 10개의 펩타이드 조합(50ug/ml), 펩타이드 조합 (50ug/ml) 및 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 처리한 그룹의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)를 비교한 그래프이다.
도 4f는 도 4e의 사량체 결합 분석을 통해 CHA-9 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 4g는 사량체 결합 분석을 이용하여 CHA-15(IL-2 20U/ml) 펩타이드의 단독(5ug/ml 또는 50ug/ml), 10개의 펩타이드 조합(50ug/ml), 펩타이드 조합 (50ug/ml) 및 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 처리한 그룹의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)를 비교한 그래프이다.
도 4h는 도 4g의 사량체 결합 분석을 통해 CHA-15 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 5a는 대장암 세포주 SW620에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과를 확인한 그래프이다.
도 5b는 도 5a의 결과를 3명의 건강한 사람의 PBMC별(Donor 8,9,10)로 나타낸 그래프이다.
도 5c는 전립선암 세포주 PC-3에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과를 확인한 그래프이다.
도 5d는 도 5C의 결과를 3명의 건강한 사람의 PBMC별(Donor 8,9,10)로 나타낸 그래프이다.
도 5e는 유방암 세포주 MCF-7에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과를 확인한 그래프이다.
도 5f는 도 5e의 결과를 3명의 건강한 사람의 PBMC별(Donor 8,9,10)로 나타낸 그래프이다.
도 5g는 난소암 세포주 OVCAR-3에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과(CTL 활성)를 확인한 그래프이다.
도 5h는 도 5g의 결과를 3명의 건강한 사람의 PBMC별(Donor 8,9,10)로 나타낸 그래프이다.
도 6는 SW620, PC-3, MCF-7, OVCAR-3 세포주에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 Granzyme B 분비 수준을 비교한 그래프이다.
도 7a는 Donor 8에서 대장암 세포주 SW620에 대한 Survivin+MAGE-A3 펩타이드 조합 (S+M 펩타이드), hTERT+WT-1 펩타이드 (H+W 펩타이드) 조합, 10개의 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과(CTL 활성)를 비교한 그래프이다(#P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs 무자극 그룹, $P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs H+W 그룹, &P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs S+M 그룹).
도 7b는 Donor 9에서 대장암 세포주 SW620에 대한 Survivin+MAGE-A3 펩타이드 조합 (S+M 펩타이드), hTERT+WT-1 펩타이드 (H+W 펩타이드) 조합, 10개의 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과(CTL 활성)를 비교한 그래프이다(#P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs 무자극 그룹, $P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs H+W 그룹, &P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs S+M 그룹).
도 7c는 Donor 10에서 대장암 세포주 SW620에 대한 Survivin+MAGE-A3 펩타이드 조합 (S+M 펩타이드), hTERT+WT-1 펩타이드 (H+W 펩타이드) 조합, 10개의 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과(CTL 활성)를 비교한 그래프이다(#P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs 무자극 그룹, $P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs H+W 그룹, &P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs S+M 그룹).
도 7d는 대장암 세포주 SW620에서 Survivin+MAGE-A3 펩타이드 조합 (S+M 펩타이드), hTERT+WT-1 펩타이드 (H+W 펩타이드) 조합, 10개의 펩타이드 조합에 의한 Granzyme B 분비 수준을 비교한 그래프이다(n은 펩타이드의 수, Donor 8-10).
도 8a는 마우스 모델에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합과 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트 또는 타 TLR 아쥬번트로 제조된 시험 백신의 IFN-γ 생산 세포 수를 비교한 그래프이다[왼쪽부터, PBS-음성대조군, 펩타이드 처리군, 펩타이드 + TLR2 리간드 처리군, 펩타이드 + TLR3 리간드 처리군, 펩타이드 + TLR7/8(Imiquimod) 리간드 처리군, 펩타이드 + TLR9 리간드 처리군(CpG), 펩타이드 + L-pampo 처리군].
도 8b는 도 8a에서 펩타이드 특이적인 IFN-γ 분비 수준을 비교한 그래프이다.
도 9는 마우스 모델에서 본 발명에서 제공된 10개의 펩타이드 조합 단독, 10개의 펩타이드 조합과 L-pampo 및 10개의 펩타이드 조합과 Lipo-pam 로 제조된 시험 백신의 IFN-γ 생산 세포 수를 비교한 그래프이다.
도 2은 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원 유래 펩타이드를 각 항원별로 조합했을 때의 면역원성을 ELISPOT 분석을 이용하여 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원 유래 펩타이드를 펩타이드 수에 따라 조합했을 때의 면역원성을 ELISPOT 분석을 이용하여 확인한 결과이다.
도 4a는 사량체 결합 분석(Tetramer binding assay)을 이용하여 CHA-2(IL-2 20U/ml) 펩타이드의 단독(5ug/ml 또는 50ug/ml), 10개의 펩타이드 조합(50ug/ml), 펩타이드 조합 (50ug/ml) 및 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 처리한 그룹의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)를 비교한 그래프이다.
도 4b는 도 4a의 사량체 결합 분석을 통해 CHA-2 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 4c는 사량체 결합 분석을 이용하여 CHA-8(IL-2 20U/ml) 펩타이드의 단독(5ug/ml 또는 50ug/ml), 10개의 펩타이드 조합(50ug/ml), 펩타이드 조합 (50ug/ml) 및 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 처리한 그룹의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)를 비교한 그래프이다.
도 4d는 도 4c의 사량체 결합 분석을 통해 CHA-8 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 4e는 사량체 결합 분석을 이용하여 CHA-9(IL-2 20U/ml) 펩타이드의 단독(5ug/ml 또는 50ug/ml), 10개의 펩타이드 조합(50ug/ml), 펩타이드 조합 (50ug/ml) 및 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 처리한 그룹의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)를 비교한 그래프이다.
도 4f는 도 4e의 사량체 결합 분석을 통해 CHA-9 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 4g는 사량체 결합 분석을 이용하여 CHA-15(IL-2 20U/ml) 펩타이드의 단독(5ug/ml 또는 50ug/ml), 10개의 펩타이드 조합(50ug/ml), 펩타이드 조합 (50ug/ml) 및 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 처리한 그룹의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)를 비교한 그래프이다.
도 4h는 도 4g의 사량체 결합 분석을 통해 CHA-15 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 5a는 대장암 세포주 SW620에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과를 확인한 그래프이다.
도 5b는 도 5a의 결과를 3명의 건강한 사람의 PBMC별(Donor 8,9,10)로 나타낸 그래프이다.
도 5c는 전립선암 세포주 PC-3에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과를 확인한 그래프이다.
도 5d는 도 5C의 결과를 3명의 건강한 사람의 PBMC별(Donor 8,9,10)로 나타낸 그래프이다.
도 5e는 유방암 세포주 MCF-7에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과를 확인한 그래프이다.
도 5f는 도 5e의 결과를 3명의 건강한 사람의 PBMC별(Donor 8,9,10)로 나타낸 그래프이다.
도 5g는 난소암 세포주 OVCAR-3에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과(CTL 활성)를 확인한 그래프이다.
도 5h는 도 5g의 결과를 3명의 건강한 사람의 PBMC별(Donor 8,9,10)로 나타낸 그래프이다.
도 6는 SW620, PC-3, MCF-7, OVCAR-3 세포주에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합에 의한 Granzyme B 분비 수준을 비교한 그래프이다.
도 7a는 Donor 8에서 대장암 세포주 SW620에 대한 Survivin+MAGE-A3 펩타이드 조합 (S+M 펩타이드), hTERT+WT-1 펩타이드 (H+W 펩타이드) 조합, 10개의 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과(CTL 활성)를 비교한 그래프이다(#P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs 무자극 그룹, $P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs H+W 그룹, &P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs S+M 그룹).
도 7b는 Donor 9에서 대장암 세포주 SW620에 대한 Survivin+MAGE-A3 펩타이드 조합 (S+M 펩타이드), hTERT+WT-1 펩타이드 (H+W 펩타이드) 조합, 10개의 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과(CTL 활성)를 비교한 그래프이다(#P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs 무자극 그룹, $P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs H+W 그룹, &P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs S+M 그룹).
도 7c는 Donor 10에서 대장암 세포주 SW620에 대한 Survivin+MAGE-A3 펩타이드 조합 (S+M 펩타이드), hTERT+WT-1 펩타이드 (H+W 펩타이드) 조합, 10개의 펩타이드 조합에 의한 세포독성효과(CTL 활성)를 비교한 그래프이다(#P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs 무자극 그룹, $P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs H+W 그룹, &P<0.05 10개의 펩타이드 조합 그룹 vs S+M 그룹).
도 7d는 대장암 세포주 SW620에서 Survivin+MAGE-A3 펩타이드 조합 (S+M 펩타이드), hTERT+WT-1 펩타이드 (H+W 펩타이드) 조합, 10개의 펩타이드 조합에 의한 Granzyme B 분비 수준을 비교한 그래프이다(n은 펩타이드의 수, Donor 8-10).
도 8a는 마우스 모델에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합과 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트 또는 타 TLR 아쥬번트로 제조된 시험 백신의 IFN-γ 생산 세포 수를 비교한 그래프이다[왼쪽부터, PBS-음성대조군, 펩타이드 처리군, 펩타이드 + TLR2 리간드 처리군, 펩타이드 + TLR3 리간드 처리군, 펩타이드 + TLR7/8(Imiquimod) 리간드 처리군, 펩타이드 + TLR9 리간드 처리군(CpG), 펩타이드 + L-pampo 처리군].
도 8b는 도 8a에서 펩타이드 특이적인 IFN-γ 분비 수준을 비교한 그래프이다.
도 9는 마우스 모델에서 본 발명에서 제공된 10개의 펩타이드 조합 단독, 10개의 펩타이드 조합과 L-pampo 및 10개의 펩타이드 조합과 Lipo-pam 로 제조된 시험 백신의 IFN-γ 생산 세포 수를 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드]를 포함하는 항암 백신 조성물을 제공한다.
상기 종양 연관 항원(tumor associated antigen, TAA)은 암 또는 종양 세포에서 발현되는 단백질이다. TAA의 예는 새로운 항원(종양 형성 동안 발현되고 정상 또는 건강한 세포의 유사한 단백질(analogous protein)로부터 변경되는 신생 항원), 종양 유전자 및 종양 억제 유전자의 생성물, 과발현되거나 비정상적으로 발현된 세포 단백질(예, HER2, MUC-1), 발암성 바이러스에 의해 생성되는 항원(예, EBV, HPV, HCV, HBV, HTLV), 암 고환 항원(CTA, 예, MAGE 패밀리, NY-ESO) 및 세포 유형 특이적 분화 항원(예, MART-1). TAA 서열은 실험적으로 찾거나 또는 출판된 과학 논문, 또는 Ludwig Institute for Cancer Research(www.cta.lncc.br/) 데이터베이스, Cancer Immunity 데이터베이스(cancerimmunity.org/peptide) 및 TANTIGEN Tumor T cell antigen 데이터베이스(cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)와 같은 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스를 통해 찾을 수 있다.
한편, 종양 특이적 항원(tumor specific antigen, TSA)는 종양이 발생한 조직의 정상 세포에는 나타나지 않는 특정 유형의 종양에 의해 생성된 항원이다. TSA는 공유항원, 신생항원, 및 고유항원이 포함된다. 종양 특이적 펩타이드는 정상 건강한 세포 또는 조직에서 발현되지 않거나 최소로 발현되지만, 특정 암의 유형 또는 조직으로부터 유래된 암 또는 암의 유형과 같은 특정 질환 또는 상태를 갖는 높은 비율(높은 빈도)의 대상에서(세포 또는 조직에서) 발현된다. 대안적으로, 종양 특이적 펩타이드는 정상적인 건강한 세포에서 낮은 수준으로 발현될 수 있지만, 질병(예, 암)에 걸린 세포 또는 질병 또는 상태를 갖는 대상에서 높은 수준으로 발현될 수 있다.
상기 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드]는 hTERT로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호1의 펩타이드(서열번호1: ILAKFLHWL), hTERT로부터 유래되고 HLA-A24(MHC Class I) 타입인 서열번호2의 펩타이드(서열번호2: VYAETKHFL), hTERT로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 서열번호3의 펩타이드(서열번호3: EARPALLTSRLRFIPK), hTERT로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 서열번호4의 펩타이드(서열번호4: RPGLLGASVLGLDDI), Survivin으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호5의 펩타이드(서열번호5: ELTLGEFLKL), Mage-A3로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호8의 펩타이드(서열번호8: KVAELVHFL), Mage-A3로부터 유래되고 HLA-A24(MHC Class I) 타입인 서열번호9의 펩타이드(서열번호9: IMPKAGLLI), MUC-1으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호12의 펩타이드(서열번호12: STAPPVHNV), WT-1으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 서열번호15의 펩타이드(서열번호15: RMFPNAPYL) 및 WT-1으로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 서열번호16의 펩타이드(서열번호16: KRYFKLSHLQMHSRKH)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
건강한 사람에게서 얻은 PBMC에 각각 처리했을 때 각각의 펩타이드의 면역원성은 펩타이드를 처리하지 않은 컨트롤 군보다는 높았지만 그 정도는 달랐다(도 1). 이 결과를 토대로 우리는 일관성 있게 가장 낮은 면역원성을 보여주는 CHA-6, CHA-10, 그리고 CHA-11을 제외하였다. 낮은 면역원성을 보여주는 펩타이드를 제거한 이유는 이러한 펩타이드를 같이 넣어 주었을 경우 면역내성이 유도될 수 있기 때문이다. 따라서 13개의 펩타이드 중 면역원성에 의한 결과를 바탕으로 최종적으로 10개의 펩타이드(서열번호 1-5, 8, 9, 12, 15 및 16)를 확정하였다(표 1).
이후 확정된 10개의 펩타이드를 대상으로 다양한 종양 연관 항원에 대한 가장 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 펩타이드 조합을 선정하기 위하여 먼저 5가지의 각 항원에 해당되는 펩타이드를 섞어서 6명의 건강한 사람의 PBMC에 처리한 후 ELISPOT 실험방법을 통해 면역원성의 증감을 분석하였다. 실험 결과 5가지 항원을 각각 섞어 보았을 때 hTERT와 WT-1 조합 그리고 MAGE-A3와 Survivin에 해당하는 펩타이드를 섞은 조합에서 면역원성이 효과적으로 증강됨을 확인하였다(도 2).
펩타이드 수의 조합에 따라 면역원성이 증가되는지를 살펴보기 위하여 다양한 조건으로 펩타이드를 조합해서 3명의 건강한 사람의 PBMC에 처리했고 펩타이드 수에 따른 ELISPOT 결과를 도면으로 표시하였다(도 3). 실험 결과 10개의 펩타이드 조합을 처리한 군에서 다른 조합을 처리한 군 보다 높은 면역원성을 보였고 특별히 hTERT+WT-1 조합 그리고 Survivin+MAGE-A3 조합보다도 더 면역원성이 증강되는 결과를 확인하였다(도 3).
이는 10개의 펩타이드 조합, 즉 CHA-1, CHA-2, CHA-3, CHA-4, CHA-5, CHA-8, CHA-9, CHA-12, CHA-15 및 CHA-16의 조합은 다양한 암 항원(hTERT, Survivin, MAGE-A3, MUC1 및 WT-1)에서 유도된 펩타이드로 구성되어 있어 다양한 암 항원에 대한 항암 면역반응을 유도할 수 있고, 항암 면역반응에 중요한 CD8과 CD4 T cell을 함께 활성화시킬 수 있는 MHC Class I과 II에 대한 펩타이드를 포함하고 있으며, 가장 증진된 면역원성을 보여주고 있기 때문에 다양한 암종에 대한 치료 및 예방 백신의 가장 효과적인 펩타이드 에피톱 조합임을 확인하였다.
상기 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드] 및 이들의 조합은 MHC Class I, MHC Class II 또는 두가지 모두를 인식한다.
또한, 본 발명은 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드] 및 [리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트]를 포함하는 항암 백신 조성물을 제공한다.
상기 리포펩타이드는 글리세롤 분자에 결합된 지방산과 여러 아미노산으로 구성될 수 있다. 상기 글리세롤 분자 내의 지방산이나 리포펩타이드를 구성하는 아미노산의 수는 하나이거나 그 이상일 수 있다. 이때, 지방산과 아미노산은 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 상기 리포펩타이드는 그람 양성이나 그람 음성인 박테리아나 마이코플라즈마로부터 유래한 분자 일부이거나 분자 전체 형태로 된 지질 단백질일 수 있다.
상기 리포펩타이드는 Pam3Cys-SKKKK, Pam3-CSKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, Pam-CSKKKK, Dhc-SKKKK 및 FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 면역활성물질은 폴리(I:C), QS21, MPLA(Monophosphoryl Lipid A), CpG 및 플라겔린(Flagellin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 폴리(I:C)는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구에서 타입 1 인터페론의 강력한 유도체로 사용되어왔다. 더욱이 폴리(I:C)는 포유류에서 가장 강력한 항원 제시 세포인 수지상세포를 안정적이고 성숙하게 형성하는 것으로 알려졌다(Rous, R. et al., International Immunol., 2004). 이러한 기존보고에 따르면 폴리(I:C)는 강력한 IL-12 유도물질이며, IL-12는 면역반응을 Th1이 발달하도록 추진하여 세포성 면역반응과 IgG2a 또는 IgG2b 항체 형성을 유도하는 중요한 면역활성물질이다.
상기 폴리(I:C)는 그 길이가 50 내지 5,000 bp일 수 있다. 상기 폴리(I:C)는 10 내지 150, 10 내지 90, 10 내지 50, 10 내지 30, 30 내지 60, 30 내지 90, 30 내지 150, 30 내지 50, 10 내지 1500, 10 내지 900, 10 내지 500, 10 내지 300, 30 내지 600, 30 내지 900, 30 내지 1500 또는 30 내지 500 ㎍/dose 농도로 아쥬번트에 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 QS21은 남아메리카의 Quillaja saponaria Molina 나무 껍질에서 추출한 분자량 1990.14 Da의 트리테르펜 글루코시드(triterpene glucoside)라는 사포닌 물질의 분획이다. QS21은 MPLA(monophosphoryl lipid A)나 콜레스테롤과 같은 지질과 함께 사용하면 대식세포나 수지상세포와 같은 항원 제시 세포에서 Th1 타입의 사이토카인을 분비함으로써 체액성 및 세포성 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있다.
상기 QS21은 1 내지 150, 1 내지 90, 1 내지 50, 1 내지 30, 3 내지 60, 3 내지 90, 3 내지 150, 3 내지 50, 1 내지 1500, 1 내지 900, 1 내지 500, 1 내지 300, 3 내지 600, 3 내지 900, 3 내지 1500 또는 3 내지 500 ㎍/dose 농도로 아쥬반트에 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
CD8+ T 세포의 증식을 확인하기 위하여 사량체결합분석을 수행하였다. Tetramer 합성이 가능한 CHA-2, CHA-8 및 CHA-9, 그리고 CHA-15 펩타이드에 대해서 실험을 수행하였을 때 각각 단독으로 처리한 경우보다 10개의 펩타이드 조합을 같이 넣어준 그룹에서 각 펩타이드에 특이적인 CD8+ T 세포의 수와 빈도(%)가 증가하였고 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트에 의해서 각 펩타이드에 대한 CD8+ T 세포의 수와 빈도가 증가했음을 확인하였다(도 4).
이와 같은 결과는 CD8+ T 세포를 활성화시켜줄 수 있는 하나의 펩타이드보다 선정된 10개의 펩타이드 조합이 더 효과적으로 CD8+ T 세포를 증가시켜 줄 수 있으며 무엇보다 10개의 펩타이드 조합에 아쥬번트를 같이 투여한 경우 더 큰 상승적인 효과가 있음을 보여준다. 이는 특별히 10개의 펩타이드 조합에서 MHC 클래스 II에 결합할 수 있는 펩타이드(CHA-3, CHA-4, CHA-16)에 의해서 CD4+ T 세포가 활성화가 되고 그에 따라 활성화된 CD4+ T 세포의 도움으로 펩타이드 특이적인 CD8+ T 세포가 더 많이 증식될 수 있기 때문이다. 또한 이와 같은 CD8+ T 세포의 증식은 이미 알려져 있는 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트에 유도된 Th1 반응으로 인해 그 상승적 효과가 극대화되었다고 볼 수 있다(도 4a 내지 4 h).
다양한 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드 조합에 의해 증식되고 기능이 활성화 된 T 세포가 세포 독성 T 세포로서 암세포를 인식하고 죽일 수 있는지를 확인하기 위하여 CTLs 즉, 이펙터세포와 암세포를 같이 배양한 후에 CTL에 의해 죽은 암세포의 빈도를 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.
실험 결과, 3명의 건강한 사람 PBMC에 펩타이드 조합을 처리하여 활성화된 e이펙터세포가 대장암 세포주 SW620, 전립선암 세포주 PC-3, 유방암 세포주 MCF-7 또는 난소암 세포주 OVCAR-3에 대해 펩타이드를 넣지 않고 배양한 이펙터세포 보다 더 많은 암세포를 죽였음을 확인하였다. 그리고 이와 같은 결과는 이펙터세포 수가 더 많을수록 더 많은 암세포가 죽는 것으로 보아 세포 특이적 세포 독성효과임을 알 수 있었다(도 5a 내지 도 5h).
추가적으로 다양한 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드 조합에 의해 증식되고 기능이 활성화 된 T 세포가 다양한 암세포에 대한 활성을 확인하기 위해 이펙터세포와 암세포를 같이 배양한 배양액에서 ELISA를 이용하여 Granzyme B 분비를 확인하였다. Granzyme B는 CD8 T 세포 특별히 CTL에서 분비되는 효소로 암세포를 직접적으로 죽이는데 중요한 역할을 한다.
실험 결과, 6명의 건강한 사람 PBMC에 펩타이드 조합을 처리하여 활성화된 이펙터세포와 대장암 세포주 SW620, 전립선암 세포주 PC-3, 유방암 세포주 MCF-7 또는 난소암 세포주 OVCAR-3을 같이 배양한 배양액에서 펩타이드를 넣지 않은 이펙터세포와 암세포를 같이 배양한 배양액보다 월등히 높은 Granzyme B가 측정됨을 확인하였다. 이를 통해 CTL이 암세포를 인식하고 Granzyme B를 분비함으로서 암세포의 사멸을 유도함을 알 수 있었다(도 6).
이와 같은 결과는 펩타이드 조합에 의해 증식되고 기능이 활성화 된 종양 항원 특이적인 T 세포가 세포 독성 T 세포로서 암세포를 인식하고 Granzyme B를 분비하여 직접적으로 암세포를 죽일 수 있음을 보여준다.
다음으로는 상기 도3, 도4, 도5를 통해 우수한 면역원성을 나타냄을 확인한 10개의 펩타이드 조합이 상기 도2 에서 높은 면역원성을 보여준 Survivin+MAGE-A3 또는 hTERT+WT-1 펩타이드 조합보다 더 높은 CTL 활성 효능을 나타내는지 비교하였다.
대장암 세포주 SW620을 대상으로 cytotoxicity 와 Granzyme B의 분비를 분석하였을 때 3명의 건강한 사람 PBMC에 10개의 펩타이드 조합을 처리하여 활성화된 이펙터세포가 Survivin+MAGE-A3 또는 hTERT+WT-1 펩타이드 조합을 처리하여 활성화된 이펙터세포 보다 월등히 높은 Granzyme B 분비와 더 많은 암세포를 죽일 수 있음을 확인하였다(도 7a 내지 도 7d).
이는 선정된 10개의 펩타이드 조합이 다양 종양 연관 항원(hTERT, Survivin, MAGE-A3, MUC-1 및 WT-1)에서 유도된 펩타이드로 구성되어 있어 다양한 암 항원에 대한 항암 면역반응을 유도할 수 있고, 항암 면역반응에 중요한 CD8과 CD4 T 세포를 함께 활성화시킬 수 있기 때문에 암세포에 대한 면역반응이 높게 유도되고 활성화된 CTL에 의해 더 많은 암세포를 죽일 수 있음을 보여준다.
마지막으로 마우스 모델에서 10개의 펩타이드 조합과 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트가 포함되도록 제조된 시험 백신과 10개의 펩타이드 조합과 타 TLR 아쥬번트가 포함되도록 제조된 시험 백신들에 의해 유도된 세포성 면역반응을 비교하였다. 실험군은 PBS 음성 대조군, 10개의 펩타이드 조합, 10개의 펩타이드와 TLR2 리간드, 10개의 펩타이드와 TLR3 리간드, 10개의 펩타이드와 TLR7/8 리간드(Imiquimode), 10개의 펩타이드와 TLR9 리간드 (CpG) 그리고 10개의 펩타이드와 L-pampo (리포펩타이드와 폴리 (I:C) 아쥬번트) 총 7개군이다(도 8a 내지 도 8b). 실험결과, 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트, 즉 L-pampo를 사용한 시험 백신에서 TLR2, TLR3, TLR7/8 또는 TLR9 아쥬번트를 사용한 시험 백신보다 IFN-γ 를 생산하는 세포의 수가 월등히 증가함을 확인하였고 각 펩타이드 특이적인 IFN- γ 분비 또한 L-pampo를 사용한 시험 백신에서 TLR2, TLR3, TLR7/8 또는 TLR9 아쥬번트를 사용한 시험 백신보다 증가하였음을 확인하였다(도 8a 내지 도 8b).
또한 도 8에서 수행한 마우스 모델에서 10개의 펩타이드 조합과 리포펩타이드가 표면에 삽입된 리포좀과 면역활성물질로 구성된 Lipo-pam 아쥬번트로 제조된 시험 백신이 L-pampo와 유사한 세포성 면역반응을 유도할 수 있는지 확인하여 본 결과 Lipo-pam을 사용한 시험백신에서 L-pampo를 사용한 백신과 유사하게 IFN-γ 를 생산하는 세포의 수가 대조군에 비하여 월등히 증가함을 확인하였다 (도 9).
이와 같은 결과를 종합했을 때 본 발명의 일 측면에서 제공하는 항암 백신 조성물은 타 아쥬번트 TLR2, TLR3, TLR7/8 또는 TLR9 아쥬번트 등이 포함된 백신 조성물에 비하여 암세포를 죽일 수 있는 세포성 면역반응을 강력하게 유도할 수 있는 항암 백신 조성물임을 보여준다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서 항암 백신 조성물은 아쥬번트가 리포펩타이드와 면역활성물질을 일정 비율로 혼합하여 제조되는 것이다.
상기 상기 항암 백신 조성물은 그 제형이 오일 에멀전 또는 수용액 제형일 수 있다.
상기 항암 백신 조성물은 부가적으로 완충제, 등장화제, 보존제, 안정화제 및 용해보조제를 포함할 수 있다. 완충제로는 인산염, 초산염, 인산암모늄, 탄산암모늄, 구연산염 등을 사용할 수 있다.
상기 조성물을 포함하는 전체 백신 조성물의 조성비에 있어서, 리포펩타이드 및 폴리(I:C) 아쥬반트에서 리포펩타이드는 0.01 내지 0.5 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하나, 0.01 내지 0.1 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하고, 폴리(I:C)는 0.01 내지 0.4 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하며 0.01 내지 0.08 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
아울러, 등장화제로는 염화나트륨이 0.1 내지 0.8 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하고, 0.2 내지 0.6 중량%의 중량비로 포함되는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 0.44 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하다.
또한, 완충제로는 인산염, 초산염, 인산암모늄, 탄산암모늄, 구연산염 등이 사용되는 것이 바람직하고, 본 발명의 바람직한 실시에에 의하면 인산염 및 초산염이 사용되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 인산염은 0.01 내지 0.4 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하고, 0.01 내지 0.2 중량%의 중량비로 포함되는 것이 더욱 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 0.13 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 초산염은 0.01 내지 0.3 중량 %의 중량비로 포함되는 것이 바람직하고, 0.01 내지 0.2 중량%의 중량비로 포함되는 것이 더욱 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시에에 따르면 0.08 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명의 백신 조성물에 완충제는 0.02 내지 0.6 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 0.15 내지 0.25 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하다.
한편, 본 발명의 다른 일 실시예에서 상기 아쥬번트는 리포펩타이드가 표면에 삽입된 리포좀(liposome)과 면역활성물질을 혼합하여 제조된다.
상기 리포펩타이드는 20 내지 250, 20 내지 50, 50 내지 250, 150 내지 250, 50 내지 150, 20 내지 2500, 20 내지 500, 50 내지 2500, 150 내지 2500 또는 50 내지 1500 ㎍/dose 농도로 리포좀에 삽입될 수 있다.
상기 리포좀은 지질로 구성된다.
상기 지질은 상기 지질은 양이온, 음이온 또는 중성 지질일 수 있다. 일례로, DOTAP(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DDA(Dimethyldioctadecylammonium), DC-chol(3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol), DOPG(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3phosphocholine), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 콜레스테롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 지질은 15 내지 300, 15 내지 150, 15 내지 90, 15 내지 50, 15 내지 40, 20 내지 30, 15 내지 3000, 15 내지 1500, 15 내지 900, 15 내지 500, 15 내지 400 또는 20 내지 300 ㎍/dose 농도로 리포좀에 삽입될 수 있다.
상기 아쥬번트는 양성 전하를 가진 리포펩타이드가 지질이중층에 삽입된 양성 전하를 가진 리포좀과 음성 전하를 가진 면역활성물질로 구성된다.
상기 항암 백신 조성물은 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있다.
상기 항암 백신 조성물은 Th1 면역반응을 증진시킬 수 있다. 항바이러스 및 항암 면역반응에 효과적인 Th1 면역반응을 증진시키는 IgG2a 또는 IgG2b의 항체는 도움 T 세포 1(helper T cell 1; Th1)에 의해 생산되는 사이토카인에 의해 생산된다. 따라서, 본 발명의 항암 백신 조성물은 바이러스 감염에서부터 진행되는 암의 예방 또는 치료제로도 사용될 수 있다.
상기 체액성 면역반응은 본 발명의 아쥬번트에 의해 T follicular helper cell (Tfh)를 증가되어 사이토카인이 분비되는 것으로부터 유도할 수 있다.
상기 세포성 면역반응은 IFN-γ, TNF-α 및 granzyme B의 분비가 증진되는 것으로부터 유도할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항암 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 항암 백신 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 상기 항암 백신 조성물은 아쥬반트 및 항원을 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 리포펩타이드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 여기에 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 경피, 경비 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코욜, 프로필렌글리콘, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 백신효과를 나타낼 수 있는 동시에 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 백신에 포함될 항원에 따라 달라질 수 있다. 또한, 상기 예방 또는 치료제는 환자의 연령, 체중, 건강, 성별 및 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 투여 방법 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 투여는 1회 내지 수회 투여일 수 있다.
상기 암은 난소암, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 음경암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암 및 피부암으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 항암 백신 조성물은 화학 항암제, 표적 항암제, 면역관문억제제 및 방사선 요법으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 치료와 병용될 수 있고, 기존 치료에 비해 상승적인 항암 효과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 종양 연관 항원에서 유래된 MHC class I 과 MHC class II 항원 펩타이드 에피톱 발굴
실시예 1-1. 면역원성 유도를 위한 펩타이드 후보의 선정
면역원성을 유도하기 위한 펩타이드의 후보를 선정하기 위하여, 다양한 암종을 대상으로 임상실험이 진행되고 있는 이미 알려진 종양 연관 항원들에서부터 기인한 펩타이드들을 후보로 선정하였다. 선정된 종양 연관 항원들은 hTERT, Survivin, MAGE-A3, MUC-1, EGFRvIII, NY-ESO-1 그리고 WT-1 항원이며, 이들에서 유도된 16개의 펩타이드를 선정하였다 (표 1).
| 구분 | 종양 연관 항원 | 아미노산 서열 | HLA class | HLA type | 서열번호 |
| CHA-1 | hTERT | ILAKFLHWL (540-548) | I | A02 | 1 |
| CHA-2 | hTERT | VYAETKHFL (324-332) | I | A24 | 2 |
| CHA-3 | hTERT | EARPALLTSRLRFIPK (611-626) | II | DRB1 | 3 |
| CHA-4 | hTERT | RPGLLGASVLGLDDI (672-686) | II | DRB1 | 4 |
| CHA-5 | Survivin | ELTLGEFLKL (96-104) | I | A02 | 5 |
| CHA-6 | Survivin | LMLGEFLKL (97-104) | I | A02 | 6 |
| CHA-7 | Survivin | AYACNTSTL (80-88) | I | A24 | 7 |
| CHA-8 | Mage-A3 | KVAELVHFL (112-120) | I | A02 | 8 |
| CHA-9 | Mage-A3 | IMPKAGLLI (195-203) | I | A24 | 9 |
| CHA-10 | Mage-A3 | TQHFVQENYLEY (246-260) | II | DRB1 | 10 |
| CHA-11 | Mage-A3 | FLWGPRALV (271-279) | I | A02 | 11 |
| CHA-12 | MUC-1 | STAPPVHNV (179-187) | I | A02 | 12 |
| CHA-13 | EGFRvIII | LEEKKGNYVVTDHC (1-13) | II | DRB1 | 13 |
| CHA-14 | NY-EOS-1 | SLLMWITQCFLPVF (157-170) | II | DRB1 | 14 |
| CHA-15 | WT-1 | RMFPNAPYL (126-134) | I | A02 | 15 |
| CHA-16 | WT-1 | KRYFKLSHLQMHSRKH (332-346) | II | DRB1 | 16 |
이들 16개 펩타이드 중 3개의 펩타이드(CHA-7, CHA-13, CHA-14)는 모두 아미노산 잔기에 시스테인(cysteine)을 가지고 있어, 다이설파이드 결합(disulfide bone)을 형성하여 MHC 분자에 결합하는 것을 방해할 수 있기 때문에 제외되었다.
이렇게 선정된 13개의 펩타이드가 MHC class I 또는 MHC class II에 결합 친화력이 좋은 펩타이드인지 확인하기 위하여 인실리코(in silico) 알고리즘을 이용하였다.
그 결과, 선정된 13개의 펩타이드가 다양한 종양 연관 항원에서 기인하며, HLA-A02/A24, 그리고 HLA-DRB1에 특이적으로 결합함을 확인함으로써, 상기 13개의 펩타이드를 면역원성을 유도하기 위한 펩타이드 후보로서 확정하였다. 확정된 13개의 펩타이드 시퀀스는 펩타이드 합성회사(애니젠, 대한민국)에 의뢰하여 펩타이드로 합성하였다.
실시예 1-2. 선정된 펩타이드의 면역원성 확인 및 최종 펩타이드 선정
상기 실시예 1에서 선별된 13개의 펩타이드의 면역원성을 확인하기 위하여 인터페론감마(IFNg)-고착화 효소 항체법(Enzyme Linked Immuno-SPOT assay, ELISPOT)을 수행하였다.
이 실험은 단 한 개의 세포가 분비한 사이토카인을 검출해 낼 수 있는 민감한 면역검사법으로, 세포가 활성화될 때 분비하는 사이토카인을 포획항체(capture antibody)에 부착시킴으로써 세포표면에 발현하는 단백질이나 단백질 분해효소의 영향을 받지 않고 분비된 사이토카인을 측정할 수 있다. 사이토카인을 포획항체와 부착시킨 후 세포를 제거하고 부착된 포획항체를 인식할 수 있는 효소와 결합된 검출항체(detecting antibody)를 첨가한 후에 이 효소에 대한 발색기질을 다시 첨가하면 사이토카인을 분비하고 있는 세포의 위치에 발색스팟(spot)이 형성되고 이 발색된 스팟 수로 자극 항원에 반응한 세포 수를 확인하는 방법이다.
실험에 필요한 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 다음과 같이 사람의 정맥혈액에서 분리하였다. 정맥혈액을 1 X PBS로 희석한 후, SepMate-50 튜브에 넣고, 실온에서 800 g, 20분 동안 원심분리(centrifugation)하였다. 원심분리 후, 혈장(plasma)과 분리된 PBMC를 세척한 후, 1 x 106 cells/mL 농도로 6 웰 조직 배양 플레이트(6 well tissue culture plate)의 각 웰(well)에 넣어준 후 배양기(incubator)에서 밤새 배양하였다(37 ℃, 5 % CO2). 다음날, PBMC 배양액을 회수한 후 실온에서 2000 rpm, 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, PBMC를 6 웰 세포 배양 플레이트(6 well cell culture plate)에 분주(seeding)하고, 펩타이드를 넣고 배양하여 자극(stimulation)시켜주었다.
이때, 실시예 1에서 선별한 13개의 펩타이드를 단독 또는 여러가지 펩타이드조합으로 처리하였고, 비교 분석을 위해서 무처리 그룹(untreated group)과 ConA group도 함께 준비하였다. 6 웰 세포 배양 플레이트에서 배양 후, ELISPOT 플레이트의 각 웰에 PBMC 세포 배양액을 200 μL씩 분주하여 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 1 X PBS로 5번 세척하여 ELISPOT 분석을 준비하였다. 검출항체(R4-642-biotin)를 PBS (0.5 % FBS)에 희석하여 100 μL/well로 넣어 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 후, 1 X PBS로 5번 세척한 다음, Streptavidin-HRP를 PBS (0.5 % FBS)에 희석하여 100 μL/well로 넣어 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 후, 1 X PBS로 세척하고, TMB 기질용액(substrate solution)을 100 μL/well씩 넣어주었다. 스팟의 발색이 선명하게 올라오면 D.W.로 6회 세척하여 반응을 종료시켰다. 물기 제거 후 호일로 싸서 그늘에서 하루 동안 건조시켰다. 건조시킨 ELISPOT 플레이트에 ELI-FOIL을 부착하여 멤브레인(membrane)을 찍어낸 후, ELISPOT 리더(Reader)에서 각 웰의 스팟 개수를 읽어주었다. 시험군의 스팟 수에서 무처리 그룹의 스팟 수를 제한 값으로 그래프를 작성하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 모든 13개의 펩타이드 처리군에서 펩타이드를 처리하지 않은 컨트롤 군(untreated)보다 면역원성이 증가함을 확인하였다. 그 중에서 일관성 있게 가장 낮은 면역원성을 나타내는 CHA-6, CHA-10, 그리고 CHA-11은 제외하기로 하였다. 이는 낮은 면역원성을 보여주는 펩타이드를 같이 넣어주었을 경우, 이러한 펩타이드로 인해 면역내성이 유도될 수 있기 때문이다. 따라서 13개의 펩타이드 중 면역원성에 의한 결과를 바탕으로 최종적으로 10개의 펩타이드(CHA-1 내지 CHA-5, CHA-8, CHA-9, CHA-12, CHA-15 및 CHA-16)를 확정하였다(표 1).
이후 확정된 10개의 펩타이드를 대상으로 다양한 암 항원에 대한 가장 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 펩타이드 조합을 선정하기 위하여 먼저 5가지의 각 항원에 해당되는 펩타이드를 섞어서 6명의 건강한 사람의 PBMC에 처리한 후 ELISPOT 실험방법을 통해 면역원성의 증감을 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 5가지 항원을 항원별로 각각 섞은 조합에 비하여, hTERT와 WT-1 조합 그리고 MAGE-A3와 Survivin에 해당하는 펩타이드를 섞은 조합이 더욱 효과적으로 면역원성을 증강시킴을 확인하였다. 또한, 이 조합에 다른 항원의 조합을 더 섞어 주었을 때 또는 이 두 조합 외의 다른 항원을 각각 조합했을 때는 오히려 면역원성이 감소되거나 면역원성이 증가되더라도 이 두 조합 값보다 더 증가하지는 않음을 확인하였다.
위의 실험에서 hTERT와 WT-1 항원 조합에 포함되는 펩타이드는 6개(hTERT 유래 4개 및 WT-1 유래 2개), 그리고 MAGE-A3와 Survivin의 조합에 포함되는 펩타이드는 3개(MAGE-A32개 및 Survivin 1개)로 구성되어 있으므로, 펩타이드의 수의 조합에 따라 면역원성이 증가되는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.
이를 위해, 도 3과 같이 다양한 조건으로 펩타이드를 조합해서 3명의 건강한 사람의 PBMC에 처리하였고, 펩타이드 수에 따른 ELISPOT 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 10개의 펩타이드를 처리한 군에서 다른 조합군 보다 높은 면역원성을 보였고 특별히 hTERT+WT-1 조합 그리고 Survivin+MAGE-A3 조합보다도 더 면역원성이 증강됨을 확인하였다.
상기의 결과는 10개의 펩타이드 조합, 즉 CHA-1, CHA-2, CHA-3, CHA-4, CHA-5, CHA-8, CHA-9, CHA-12, CHA-15 및 CHA-16의 조합이 다양한 암 항원(hTERT, Survivin, MAGE-A3, MUC-1 및 WT-1)에서 유도된 펩타이드로 구성되어 있으므로 다양한 암 항원에 대한 항암 면역반응을 유도할 수 있고, 항암 면역반응에 중요한 CD8과 CD4 T 세포를 함께 활성화시킬 수 있는 MHC Class I과 II에 대한 펩타이드를 모두 포함하고 있기때문에 가장 증진된 면역원성을 보여주는 것으로 생각된다. 따라서, 상기 10개의 펩타이드 조합이 다양한 암종에 대한 치료 예방 백신의 가장 효과적인 펩타이드 에피톱 조합임을 확인하였다.
<실시예2> 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드를 포함하는 항암 백신의 제조
모든 펩타이드는 C 말단에서 N 말단으로 적당한 수지(resin)을 이용하는 Fmoc chemistry를 사용하여 표준 및 잘 확립된 고체상 펩타이드 합성방법으로 합성되었다(애니젠, 대한민국). 각 개별 펩타이드의 정제와 순도는 질량 분석법과 HPLC 분석법에 의해 확인되었다. 펩타이드는 백색 동결건조 합성물이며 >95%의 순도로서 얻어졌다. 모든 펩타이드는 10mg/ml의 농도로 사용하였다.
<실시예3> [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드] 및 [리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트]를 포함하는 항암 백신의 제조
실시예 3-1. L-pampo
본 발명의 실시예 1-2에 선정된 펩타이드 조합과 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C) 아쥬번트를 혼합하여 항암 백신을 제조하였다.
먼저 Pam3Cys-SKKKK와 폴리(I:C)를 동시에 사용하여 제제화 했을 경우의 아쥬번트 효과를 관찰하기 위하여 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 혼합한 시험백신을 제조하였다. 펩타이드를 포함하는 백신 혼합물을 제조할 때는 150 mM NaCl과 10 mM 인산 나트륨(sodium phosphate)이 포함된 10X 완충용액(pH는 7.0)을 이용하였다.
실시예 3-2. Lipo-pam
먼저, DOTAP:DPPC 리포좀을 제조하였다. 이를위해 클로로포름을 이용해 DOTAP 및 DPPC를 각각 녹인 후, DOTAP 및 DPPC의 혼합액이 유리 용기의 기벽에 골고루 분포할 수 있도록 돌려가며 질소가스로 유기용매를 기화시켰다. 이때, 기벽에 얇은 필름이 만들어지는데 형성된 막에 잔존하는 유기용매는 진공 데시케이터(decicator)에 보관하여 제거하였다. 완전히 건조된 지질 필름에 증류수를 첨가하여 재수화시켰다. 다층판의 소포(multilamella vesicle, MLV) 현탁 용액이 생성되면 20 mM의 인산나트륨에 300 mM의 NaCl이 포함된 2X 완충용액(pH 7.0)을 증류수와 동일한 양으로 넣어주었다. 생성된 MLV를 3초/3초(pulse on/off)의 조건으로 5분씩 5사이클 동안 초음파처리를 하여, 작은 다층판의 소포(small unilamellar vesicle, SUV)형태인 DOTAP:DPPC 리포좀을 제조하였다.
이어서, Lipo-pam은 유기용매를 이용해 DOTAP, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 각각 녹인 후, DOTAP 및 DPPC를 혼합하고 여기에 Pam3-CSKKKK를 첨가한 것을 제외하고는 상기 DOTAP:DPPC 리포좀과 동일한 방법으로 제조하였다. 이러한 Lipo-pam에 면역활성물질 아쥬번트((폴리(I:C))와 펩타이드를 첨가하여 백신 혼합물을 제조하며 이 때에도 150 mM NaCl과 10 mM 인산나트륨이 포함된 10X 완충용액(pH는 7.0)을 사용하였다.
<실험예 1> 펩타이드 조합의 CD8 T 세포 특이적인 면역원성 유도 검증
CD8+ T 세포는 항암면역작용에서 가장 중요한 면역세포로서 직접 암세포를 죽이며 또한 암세포의 증식을 막는다. 따라서 종양 연관 항원에 특이적인 CD8+ T 세포가 많이 존재하게 되면 더 효과적인 항암면역작용을 유도할 수 있다. 본 실험예 1에서는 실시예 1에서 제시된 펩타이드 단일, 펩타이드 조합 및 펩타이드 조합과 아쥬번트(리포펩타이드와 폴리(I:C))의 병용투여에 의한 CD8+ T 세포의 증식을 확인하기 위하여 사량체 결합 분석(tramer binding assay)을 수행하였다.
사량체 결합 분석은 MHC/peptide complex 4개를 하나의 complex로 만든 후에 여기에 형광단 표지(fluorophore-label)된 스트렙타비딘(streptavidin)을 붙인 “MHC 사량체”를 이용하여 유세포분석(flow cytometry)을 통해 MHC 사량체가 결합된 CD8+T 세포의 수 또는 빈도(%)를 측정함으로써 항원특이적 CD8 T 세포 반응, 특별히 CTL (cytotoxic T lymphocyte) 반응을 민감하게 검증할 수 있는 실험 방법이다.
따라서 본 실험에서는 CD8 T 세포를 인지할 수 있는 MHC class I type, 즉 HLA-A02와 HLA-24에 대한 펩타이드를 이용하여 다음과 같은 4개의 사량체를 제작하였다(CHA-2/HLA-A24 사량체, CHA-8/HLA-A02 사량체, CHA-9/HLA-A24 사량체, 그리고 CHA-15/HLA-A02 사량체).
ELISPOT 분석과 동일하게 사람의 정맥혈액에서 PBMC를 분리하고 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 200 mL씩 넣어 분주하였다. 분주한 PBMC에 펩타이드를 처리하여 자극하였다. 이때, 각각의 펩타이드는 5 mg/mL 또는 50 mg/mL 로 처리하고 실시예 1-2에서 확정한 10개 펩타이드 조합을 섞어서 처리해줄 경우에도 같은 농도로 처리하였다. 이때, 분석을 위해서 펩타이드를 처리하지 않은(untreated) 또는 관련성이 없는 펩타이드(non-specific tetramer)를 처리한 대조군도 함께 준비하였다.
96 웰 세포 배양 플레이를 배양기에 넣고, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 배양이 완료되면 96 웰 플레이트를 꺼내서 배양한 세포를 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 튜브(tube)로 수확(harvest)한 후 실온에서 2000 rpm, 15분 동안 원심분리(centrifugation)하였다. 원심분리가 완료되면 상층액 제거 후 FVS(Fixable Viability Stain)을 처리한 뒤 세포를 재분산시켰다(cell resuspension). 재분산(resuspension) 후 FACS 튜브를 호일로 덮고, 실온에서 15분 반응시켰다. 2 mL PBS로 세척 후 2000 rpm, RT, 5분 원심분리하였다. 원심분리가 완료되면 FACS 튜브를 꺼내서 상층액 제거 후 FACS 완충용액을 1 mL 넣어 세척한 후 원심분리기에 넣고, 실온에서 2000 rpm, 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리가 완료되면 FACS 튜브를 꺼내서 상층액 제거 후 FACS 완충용액을 100 μL 넣고, 재분산하였다. 재분산 후 FACS 튜브에 Human Fc R 블로킹 용액과 MHC 사량체를 넣어준 뒤 잘 섞어주었다. FACS 튜브를 호일로 싸서 실온에서 20분 동안 반응시킨다. 20분 뒤 항-인간 CD3, CD45, CD8 항체를 넣고, 잘 섞어주었다. FACS 튜브를 호일로 싸서 냉장에서 반응시킨 후 FACS 튜브를 냉장고에서 꺼내 FACS 완충용액을 넣은 뒤, 실온에서 원심분리하였다. 원심분리가 완료되면 FACS 튜브를 꺼내서 상층액 제거 후 FACS 완충용액을 넣어 세포를 재현탁시키고, 유세포분석기(Flow cytometer)를 이용하여 MHC Tetramer+CD8+ T 세포의 수와 전체 CD8+T 세포에서 MHC Tetramer+CD8+ T 세포가 얼마만큼의 빈도(%)를 나타내는지 분석하였다.
그 결과, 도 4a 내지 도 4h에 나타난 바와 같이, CHA-2, CHA-8, CHA-9 그리고 CHA-15 펩타이드를 각각 단독으로 넣은 경우보다 10개의 펩타이드 조합을 넣어준 그룹에서 각각의 펩타이드에 특이적인 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도(%)와 전체 수 (No.)가 증가했고 (파란색 박스), 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 10개의 펩타이드 조합과 섞어서 처리해 주었을 때에는 각각의 펩타이드에 대한 Tetramer+CD8+T 세포의 빈도와 수가 10개의 펩타이드 조합만을 넣어주었을 때 보다 더 증가했음을 확인하였다 (붉은색 박스).
상기 결과는 CD8+ T 세포를 활성화시켜줄 수 있는 하나의 펩타이드보다 선정된 10개의 펩타이드 조합이 더 효과적으로 CD8+ T 세포를 증가시켜 줄 수 있으며, 특히 10개의 펩타이드 조합과 아쥬번트를 같이 투여한 경우 더 큰 상승적인 효과가 있음을 보여준다. 이는 특별히 10개의 펩타이드 조합에서 MHC class II에 결합할 수 있는 펩타이드(CHA-3, CHA-4, CHA-16)에 의해서 CD4+ T 세포가 활성화되고 그에 따라 활성화된 CD4+ T 세포의 도움으로 펩타이드 특이적인 CD8+ T 세포가 더 많이 증식될 수 있기 때문이다. 또한 이와 같은 CD8+ T 세포의 증식은 이미 알려져 있는 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트에 유도된 Th1 반응으로 인해 그 상승적 효과가 극대화 되었다고 볼 수 있다.
<실험예2> 펩타이드 조합에 의해 유도된 CD8+ T 세포의 세포 독성 능력 검증
다양한 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드 조합에 의해 증식되고 기능이 활성화된 T 세포가 CTL (cytotoxic T lymphocytes, 세포 독성 T 세포)로서 암세포를 인식하고 죽일 수 있는지를 확인하기 위하여, 이펙터세포(effector cell)와 암세포를 같이 배양한 후에 CTL에 의해 죽은 암 세포의 빈도를 유세포분석기를 이용하여 분석하는 세포독성 분석을 진행하였다.
먼저 이펙터세포, 즉 펩타이드에 의해 증식되고 활성화된 CTL을 준비하기 위하여 사람의 정맥 혈액에서 PBMC를 분리한 후 실시예 1-2에서 선정된 10개의 펩타이드를 각각 10 mg/mL와 hIL-2 5 ng/mL을 넣고 배양하였다. 대조군으로는 펩타이드를 넣지 않고 hIL-2 5 ng/mL만 넣고 배양한 세포를 사용하였다.
펩타이드에 의해 증가된 이펙터세포가 MHC 특이적으로 표적 암 세포(target cancer cell)를 인식하고 죽일 수 있는지 확인하기 위하여, HLA-A02, HLA-A24 단독 또는 HLA-A02와 HLA-A24를 모두 발현하는 암세포와 같이 배양하였다. 배양조건으로 펩타이드 조합을 넣고 또는 넣지 않고 배양한 이펙터세포와 표적세포(암세포)의 비율을 각각 2.5:1, 5:1, 10:1로 넣어서 16시간동안 같이 배양한 후 이펙터세포에 의해 암세포가 죽은 정도를 CFSE/7-AAD(Carboxyfluorescein succinimidyl ester/7-Aminoactinomycin D) 염색법을 이용하여 측정하였다.
CFSE/7-AAD 염색법은 표적 암 세포를 CFSE라고 하는 물질로 염색하는데 그렇게 되면 암세포는 초록색을 띄게 된다. 이렇게 CFSE로 염색이 된 표적 암 세포를 이펙터세포와 함께 16시간 배양한 후 다시 7-AAD라는 물질로 염색을 하게 된다. 7-AAD는 죽은 셀에만 염색이 되고 빨간색으로 표시가 되기 때문에 CFSE를 발현하면서 7-AAD를 함께 발현하 표적 암 세포는 이펙터세포에 의해서 죽은 세포로 판명이 된다. 염색 후에 유세포분석기를 이용해서 CFSE+7-AAD+인 암세포의 빈도수를 측정하고 이 결과를 그래프로 나타내었다.
HLA-A02와 HLA-A24를 다 같이 발현하는 암세포인 대장암 세포주 SW620, HLA-24만 발현하는 암세포인 전립선암 세포주 PC-3, HLA-02만 발현하는 암세포인 유방암 세포주 MCF-7와 난소암 세포주 OVCAR-3를 타겟으로 한 각각의 실험 결과, 펩타이드 조합에 의해 활성화된 이펙터세포가 펩타이드를 넣지 않고 배양한 이펙터세포에 비해 더 많은 암세포를 죽였고 3명의 기증자(donor)에서 동일한 경향이 나타남을 확인하였다. 그리고 이펙터세포 수가 더 많을수록 더 많은 암세포가 죽는 것으로 보아 세포 특이적 세포독성 효과임도 확인할 수 있었다 (도 5a 내지 도 5h).
<실험예3> 펩타이드 조합에 의한 Granzyme B 분비 유도 확인
다양한 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드 조합에 의해 증식되고 기능이 활성화된 T 세포가 CTL (cytotoxic T lymphocytes, 세포 독성 T 세포)로서 암세포를 직접 죽일 수 있는 Granzyme B를 분비할 수 있는지를 확인하기 위해 이펙터세포와 암세포를 같이 배양한 배양액에서 Granzyme B의 수준을 ELISA를 이용하여 분석하였다.
상기 <실험예2>와 동일한 방법으로 펩타이드 조합을 넣고 또는 넣지 않고 배양한 이펙터세포와 표적세포(암세포)의 비율을 각각 2.5:1, 5:1, 10:1로 넣어서 16시간동안 같이 배양한 후 배양액을 수득하였다. 수득한 배양액을 2000 rpm으로 5분동안 원심분리한 후 상층액을 수득하여 Granzyme B 분석에 사용하였다.
Granzyme B ELISA는 MABTECH사의 Human Granzyme B (HRP) (cat no. 3486-1H-6) kit를 이용하여 해당 프로토콜로 진행하였다. 2 μg/mL의 capture mAb MT34B6를 100 μL/well로 96 웰 이뮤노 플레이트에 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응시킨 후 상층액을 제거하고 0.1% BSA가 포함된 PBST (PBS+0.05% Tween 20)를 200 μL/well를 넣고 실온에서 1시간동안 반응시켰다. PBST (PBS+0.05% Tween 20)로 5번 세척한 후 수득한 각 상층액 또는 0 - 2000 pg/mL의 키트 내 표준물질을 100 μL/well로 넣고 2시간동안 실온에서 반응시켰다. PBST (PBS+0.05% Tween 20)로 5번 세척한 후 1 μg/mL의 MT28-biotin을 100 μL/well로 넣고 1시간동안 실온에서 반응시켰다. PBST (PBS+0.05% Tween 20)로 5번 세척한 후 Streptavidin-HRP를 100 μL/well로 넣고 1시간동안 실온에서 반응시켰다. PBST (PBS+0.05% Tween 20)로 5번 세척하였다. TMB 기질을 100 μL/well로 넣고 실온에서 15분동안 반응시킨 후 0.2M 황산을 50 μL/well 넣어 TMB 기질 반응을 정지시켰다. ELISA 판독기를 이용하여 450nm 파장에서 O.D 값을 측정한 후 표준물질과 대조하여 상층액 내 Granzyme B 양을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 6명의 건강한 사람으로부터 유래된 PBMC에 펩타이드 조합을 처리하여 활성화된 이펙터세포과 대장암 세포주 SW620, 전립선암 세포주 PC-3, 유방암 세포주 MCF-7 또는 난소암 세포주 OVCAR-3을 같이 배양한 배양액에서 펩타이드를 넣지 않은 이펙터세포와 암세포를 같이 배양한 배양액보다 월등히 높은 Granzyme B가 측정됨을 확인하였다. 이를 통해 CTL이 암세포를 인식하고 Granzyme B를 분비함으로서 암세포의 사멸을 유도함을 알 수 있었다.
<실험예4> 암 항원별 또는 펩타이드 수 조합에 따른 세포 독성 T 세포의 암세포 사멸 능력 검증
상기 (도 3)을 통해 우수한 면역원성을 나타냄을 확인한 10개의 펩타이드 조합과 상기 (도 2)에서 높은 면역원성을 보여준 Survivin+MAGE-A3 또는 hTERT+WT-1 펩타이드 조합과의 CTL 활성 효능을 비교하였다.
실험 방법은 상기 <실험예 2, 3>과 동일하며 암세포는 대장암 세포주인 SW620을 사용하였다.
그 결과, 도 7a 내지 도 7d에 나타난 바와 같이, 3명의 건강한 사람으로부터 유래한 PBMC에 10개의 펩타이드 조합을 처리하여 활성화된 이펙터세포가 Survivin+MAGE-A3 또는 hTERT+WT-1 펩타이드 조합을 처리하여 활성화된 이펙터세포 보다 월등히 높은 Granzyme B를 분비하고 많은 암세포를 죽일 수 있음을 확인하였다.
상기의 결과는 10개의 펩타이드 조합이 다양한 암 항원(hTERT, Survivin, MAGE-A3, MUC-1 및 WT-1)에서 유도된 펩타이드로 구성되어 있어 다양한 암 항원에 대한 항암 면역반응을 유도할 수 있고, 항암 면역반응에 중요한 CD8과 CD4 T 세포를 함께 활성화시킬 수 있기 때문에 암세포에 대한 면역반응이 높게 유도되고 유도된 면역반응을 통해 활성화된 CTL에 의해 더 많은 암세포를 죽일 수 있음을 시사한다.
<실험예5> 마우스 모델에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합과 리포펩타이드와 면역활성물질 아쥬번트 또는 타 TLR 아쥬번트로 제조된 시험백신의 세포성 면역반응 유도 효능 평가
마우스모델에서 10개의 펩타이드 조합과 리포펩타이드와 면역활성물질 아쥬번트가 포함되도록 제조된 시험 백신(L-pampo) 또는 타 TLR 아쥬번트가 포함되도록 제조된 시험 백신의 세포성 면역반응 유도 수준을 비교하였다.
시험 백신은 10개의 펩타이드를 각각 50 ㎍씩 혼합한 후 상기 혼합물에 리포펩타이드(Pam3Cys-SKKKK)와 면역활성물질(폴리(I:C)) 아쥬번트(L-pampo) 또는 타 TLR 아쥬번트(TLR2 리간드인 리포펩타이드, TLR3리간드인 폴리 (I:C), TLR7/8 리간드인 lmiquimod, TLR9 리간드인 CpG)를 포함시키도록 제조하였다. 각 시험 백신은 100 μL로 C57BL/6 마우스에 1주 간격으로 3회에 걸쳐서 피하로 주사하였다. 3회 면역 투여 1주 후에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, ELISPOT 방법을 사용하여 면역원성을 분석하였다.
그 결과, 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, Pam3Cys-SKKKK와 폴리(I:C) 아쥬번트를 사용한 시험 백신(L-pampo)에서 TLR2, TLR3, TLR7/8 또는 TLR9 아쥬번트를 사용한 시험 백신에 비해 IFN-γ 를 생산하는 세포 수가 월등히 증가하였고 각 펩타이드 특이적인 IFN-γ 분비 또한 증가함을 확인하였다.
상기의 결과는 본 발명의 일 측면에서 제공하는 항암 백신 조성물이 타 아쥬번트 TLR2, TLR3, TLR7/8 또는 TLR9 아쥬번트가 포함된 백신 조성물에 비하여 암세포를 죽일 수 있는 세포성 면역반응을 더욱 강력하게 유도할 수 있음을 보여준다.
<실험예6> 마우스 모델에서 본 발명에서 제공된 종양 연관 항원에서 유래된 펩타이드 조합과 리포펩타이드와 면역활성물질로 구성된 아쥬번트 또는 리포펩타이드가 표면에 삽입된 리포좀과 면역활성물질로 구성된 Lipo-pam 아쥬번트로 제조된 시험백신의 세포성 면역반응 유도 효능 비교 평가
마우스모델에서 10개의 펩타이드 조합과 리포펩타이드와 면역활성물질 아쥬번트가 포함되도록 제조된 시험 백신(Lipo-pam)과 10개의 펩타이드 조합과 리포펩타이드가 표면에 삽입된 리포좀(liposome)과 면역활성물질로 구성된 Lipo-pam 아쥬번트로 제조된 시험 백신들의 세포성 면역반응 유도를 비교하였다.
시험 백신은 10개의 펩타이드를 각각 50 ㎍씩 혼합한 후 상기 혼합물에 리포펩타이드(Pam3Cys-SKKKK)와 면역활성물질(폴리(I:C)) 아쥬번트 또는 리포펩타이드(Pam3Cys-SKKKK)가 표면에 삽입된 리포좀과 면역활성물질(폴리(I:C)) 로 구성된 Lipo-pam 아쥬번트를 포함시키도록 제조하였다. 각 시험 백신은 100 μL로 C57BL/6 마우스에 1주 간격으로 3회에 걸쳐서 피하로 주사하였다. 3회 면역 투여 1주 후에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, ELISPOT 방법을 사용하여 면역원성을 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, Pam3Cys-SKKKK가 표면에 삽입된 리포좀과 폴리(I:C)로 구성된 Lipo-pam 아쥬번트를 사용한 시험 백신은 Pam3Cys-SKKKK와 폴리(I:C) 아쥬번트를 사용한 시험 백신(Lipo-pam)과 유사하게 IFN-γ 를 생산하는 세포의 수가 대조군에 비해 월등히 증가함을 확인하였다.
상기의 결과는 본 발명의 일 측면에서 제공하는 항암 백신 조성물인 리포펩타이드와 면역활성물질 아쥬번트 또는 리포펩타이드가 표면에 삽입된 리포좀과 면역활성물질이로 구성된 Lipo-pam 아쥬번트가 암세포를 죽일 수 있는 세포성 면역반응을 강력하게 유도할 수 있는 항암 백신 조성물임을 보여준다.
Claims (22)
- [종양 연관 항원(TAA, tumor associated antigen)으로부터 유래된 펩타이드]를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- [종양 연관 항원(TAA, tumor associated antigen)으로부터 유래된 펩타이드] 및 [리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트]를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 종양 연관 항원은 hTERT, MAGE-A3, MUC-1, Survivin 및 WT-1으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드]는 하기의 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물:
i) hTERT로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호1의 펩타이드(서열번호1: ILAKFLHWL),
ii) hTERT로부터 유래되고 HLA-A24(MHC Class I) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호2의 펩타이드(서열번호2: VYAETKHFL),
iii) hTERT로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호3의 펩타이드(서열번호3: EARPALLTSRLRFIPK),
iv) hTERT로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호4의 펩타이드(서열번호4: RPGLLGASVLGLDDI),
v) Survivin으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호5의 펩타이드(서열번호5: ELTLGEFLKL),
vi) Mage-A3로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호8의 펩타이드(서열번호8: KVAELVHFL),
vii) Mage-A3로부터 유래되고 HLA-A24(MHC Class I) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호9의 펩타이드(서열번호9: IMPKAGLLI),
viii) MUC-1으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호12의 펩타이드(서열번호12: STAPPVHNV),
ix) WT-1으로부터 유래되고 HLA-A02(MHC Class I) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호15의 펩타이드(서열번호15: RMFPNAPYL) 및
x) WT-1으로부터 유래되고 HLA-DRB1(MHC Class II) 타입인 것을 특징으로 하는 서열번호16의 펩타이드(서열번호16: KRYFKLSHLQMHSRKH).
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 [종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드]는 MHC Class I, MHC Class II 또는 두가지 모두를 인식하는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제2항에 있어서
상기 아쥬번트는 리포펩타이드와 면역활성물질을 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 아쥬번트는 리포펩타이드가 표면에 삽입된 리포좀(liposome)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 리포펩타이드는 Pam3Cys-SKKKK, Pam3-CSKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2CysSKKKK, PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK, Dhc-SKKKK 및 FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 리포좀(liposome)은 지질로 구성되는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 지질은 DOTAP(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DDA(Dimethyldioctadecylammonium), DC-chol(3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol), DOPG(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3phosphocholine), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 콜레스테롤로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 아쥬번트는 양성 전하를 가진 리포펩타이드가 지질이중층에 삽입된 양성 전하를 가진 리포좀(liposome)과 음성 전하를 가진 면역활성물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 면역활성물질은 폴리(I:C), QS21, MPLA(Monophosphoryl Lipid A), CpG 및 플라겔린(Flagellin)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 폴리(I:C)는 그 길이가 50 내지 5,000 bp인 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 혼합은 리포펩타이드 및 폴리(I:C)는 조성비를 1.25:1 내지 2:1로 포함하고, 여기서 리포펩타이드는 0.01 중량% 내지 0.1 중량%; 및 폴리(I:C)는 0.01 중량% 내지 0.08 중량%의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항암 백신 조성물은 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항암 백신 조성물은 Th1면역반응을 증진시키는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 체액성 면역반응은 T follicular helper cell (Tfh)를 증가시켜서 사이토카인을 분비하는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 세포성 면역반응은 IFN-γ, TNF-α 및 granzyme B의 분비가 증진되는 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 그 제형이 수용액 제형인 것을 특징으로 하는 항암 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 항암 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제19항에 있어서,
상기 암은 난소암, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 음경암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암 및 피부암으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제19항에 있어서,
상기 항암 백신 조성물은 화학 항암제(chemotherapy), 표적 항암제(targeted therapy) 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor) 및 방사선 요법(Radiation therapy)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상과 병용하는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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Also Published As
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