KR20220034563A

KR20220034563A - 신규 치주 질환 특이 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220034563A
Application number: KR1020200117106A
Authority: KR
Inventors: 정주연; 김혜란; 국경혜; 이규선
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2022-03-18
Also published as: KR20230069076A; KR102610281B1

Abstract

본 발명은 치주 질환에 대한 빠른 진단 정보를 제공할 수 있는 신규 항체를 제공한다. 본 발명에 따른 항체는 Arg-gingipain A, Arg-gingipain B, Lys-gingipain 및/또는 이들 모두의 항원에 대한 친화성이 높아 치주 질환에 대한 체외진단 키트로 우수한 효과를 나타낸다.

Description

신규 치주 질환 특이 항체 및 이의 용도 {NOVEL ANTIBODY FOR PERIODONTAL DISEASE AND USE THEREOF}

본 발명은 치주 질환 특이 항체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Arg-specific gingipain A로 RgpA, Arg-specific gingipain B로 RgpB 및/또는 Lys-specific gingipain으로 Kgp에 특이적인 항체 및 이를 이용한 치주 질환 진단 방법에 관한 것이다.

치주 질환은 연령이 증가할수록 발병이 증가한다. 잇몸에만 치주질환이 국한된 경우 치은염이라고 하며, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸뼈 주변까지 진행된 경우 치주염이라고 한다. 치주염이 진행되면 치주인대, 더 나아가 치조골까지 손상시킨다. 치조골 손상의 한 예로 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy)가 있는데, 더욱 세분하면 치조골다공증(alveolar bone osteoporosis), 치조골연화증(alveolar bone osteomalacia), 치조골감소증(alveolar bone osteopenia) 등을 포함한다. 치조골이 손상되면 결국 치아가 손실된다.

성인의 약 7 내지 15%가 치주염을 앓고 있으며, 이는 가장 일반적인 질환의 하나이다. 치아와 잇몸 사이의 낭(pocket)에 병원성 박테리아의 존재가 필수적이기는 하나 충분한 기준이 아닌 경우가 다인성 질환이다. 숙주 염증계 및 면역계가 또한 상기 질환의 발병에 중요한 역할을 한다. 치주염의 진행은 치아의 지지 조직의 파괴를 초래하는 박테리아에 대한 만성 염증성 반응이라고 생각된다. 이의 거동은 순환적이며 초기 단계에서는 간과된 채로 있을 수 있다.

파괴 과정은 숙주의 방어 시스템과 치주낭의 특이적 박테리아 종 사이의 복잡한 상호작용의 결과라고 생각된다. 치주 질환의 발생과 진행에 관련된 병원성 박테리아는 비제한적으로 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 박테로이데스 포르시터스(Bacteroides forsythus), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 트리포네마 덴티콜라(Triponema denticola) 및 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)를 포함한다.

보다 최근에, 박테리아의 병독성 생성물(주로 독소 및 효소)의 중요성이 널리 연구되었고 발병에 주요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 박테리아는 상이한 증식 단계를 거치고 이러한 증식 단계 동안 치주낭에서 보다 더 또는 덜 파괴적으로 되는 것으로 생각된다. 활성 박테리아는 병독성 생성물을 생성하여 치주낭에서 자신의 생존 및 영양을 돕는다. 상승된 박테리아 활성의 기간 동안 이러한 병독성 생성물은 치아의 지지 조직의 파괴 및 숙주의 방어 시스템의 유효성의 감소에 기여한다.

오늘날 치과의는 치주낭의 탐침 깊이를 측정하고, 치조골에 대한 치아 부착의 엑스레이 상을 검사하고 탐침시 출혈을 참조함으로써 치주염을 검사한다. 위험 인자에는 흡연 습관, 스트레스 및 치주염에 대한 가족 병력이 포함된다. 방법은 치과의의 개인적인 전문 지식에 크게 의존하고 있다. 탐침 깊이는 단지 조직학적 부착 손실의 측정치이며 따라서 치주염의 실제 발생 또는 이의 미래 진행에 대한 정보 제공에 도움을 거의 주지 못한다.

때때로, 미생물 시료가 취해지고 배양 또는 DNA-기술(소크란스키에 의해 개발된 체커보드 DNA-DNA 하이브리드화 기술)에 의한 분석을 위해 실험실로 보내어진다. 그러나, 그 결과는 약 일주일이 지나서야 알 수 있으며 반드시 치주염을 나타낸다고 할 수 없는 특정 박테리아의 존재만을 보여준다. 또한, 치주염의 진행을 진단하거나 예측할 수 있는 치은 열구액(GCF)과 같은 환자의 구강으로부터의 액체 중의 화합물, 주로 효소 또는 사이토카인과 같은 단백질을 발견하기 위하여 광대한 양의 작업이 수행되어야 하는 문제점이 존재한다.

치주질환의 치료를 위해서는 최초에 빠르게 이의 질환 발병을 진단하고 이의 위험을 예측하여 치료, 모니터링 및 환자 관리 대상으로 적절히 분배하는 것이 중요하다. 따라서, 적절하면서도 초기에 치료할 수 있는 정확한 진단이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허공보 10-2020-0066749

전술한 문제점을 보완하기 위해 본 발명가들은 치주 질환 진단을 위한 신규의 항체를 발명하였고, 이를 이용한 신속 진단 키트를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 Arg-specific gingipain A(RgpA), Arg-specific gingipain B(RgpB) 및 Lys-specific gingipain(Kgp)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 Arg-specific gingipain A(RgpA), Arg-specific gingipain B(RgpB) 및 Lys-specific gingipain(Kgp)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 치주 질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 Arg-specific gingipain A(RgpA), Arg-specific gingipain B(RgpB) 및 Lys-specific gingipain(Kgp)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 치주 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 Arg-specific gingipain A(RgpA), Arg-specific gingipain B(RgpB) 및 Lys-specific gingipain(Kgp)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, Arg-specific gingipain A(RgpA), Arg-specific gingipain B(RgpB) 및 Lys-specific gingipain(Kgp)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 검출 또는 정량방법을 제공한다.

본 발명은 또한 Arg-specific gingipain A(RgpA), Arg-specific gingipain B(RgpB) 및 Lys-specific gingipain(Kgp)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 치주 질환 진단 방법을 제공한다.

이에, 본 발명은 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

구체적으로, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다 :

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다(RgpB-1A9 antibody).

또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다(KGP-H3 antibody).

본 발명에 있어서, "Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상"은 각각의 진지파인으로 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 또는 Lys-진지파인을 의미할 수 있으며, 이들의 둘 이상의 조합을 의미할 수 있으며, 이들 모두를 의미할 수 있다. 구체적인 일실시양태에 따르면 Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인일 수 있다. 다른 일실시양태에 따르면 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인일 수 있다.

상기 항체에서 서열번호 1 내지 6 및/또는 서열번호 7 내지 12에 해당하는 부분 이외의 부분은 임의의 항체의 상응하는 부분(CDR 이외의 부분)이 될 수 있다.

본 발명의 "항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 상기 용어는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab') 2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab') 2 단편을 얻을 수 있다), 구체적으로는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

"단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 발명의 "항원"은 항체와 결합하는 부위를 포함하고 있는 분자로, 항원분자에는 항원특이성을 결정하는 입체 분자 구조가 존재하고 그것과 대응하는 항체와 반응하며, 그 구조부위를 항원결정기 또는 에피토프라고 한다.

항체의 "항원-결합 부분" (또는 단순히 '항체 부분')이란 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 지닌 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체(full-length)의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 '항원-결합 부분'이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체 단일 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341:544, 1989);및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다.

상기 CDR 영역으로 서열번호 1 내지 6을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

상기 CDR 영역으로 상기 서열번호 7 내지 12을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 15으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

상기 항체에서 서열번호 13 및 서열번호 14; 및/또는 서열번호 15 및 서열번호 16에 해당하는 부분 이외의 부분은 임의의 항체의 상응하는 부분(경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역 이외의 부분)이 될 수 있다.

본 발명에 따른 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 결합능을 가진다.

구체적으로, 상기 CDR 영역으로 서열번호 1 내지 6을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 결합능을 가진다. 바람직하게 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인에 특이적인 결합능을 가진다.

또한, 상기 CDR 영역으로 서열번호 7 내지 12를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두에 대해 특이적으로 결합하는 결합능을 가진다. 바람직하게 Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인에 특이적인 결합능을 가진다.

P. 진지발리스가 생산하는 트립신 유사 프로테아제 활성을 가지는 단백질 분해 효소에는 수종류가 알려져 있지만, 그들 중, Lys-진지파인(Lys-gingipain,「KGP」라 약칭함), Arg-진지파인 A(Arg-gingipain A, 「Rgp-A」라 약칭함), Arg-진지파인 B (Arg-gingipain, 「Rgp-B」라 약칭함)이 주요 단백질 분해 효소이며, 이들 효소는 고분자 키니노겐(kininogen)이나 피브리노겐(fibrinogen)에 대해 높은 분해 활성이 있는 것으로 알려져 있고, 균의 정착, 치주병의 발현이나 치주 조직의 파괴에 관여하는 것으로 여겨지고 있다.

이에 본 발명에 따른 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 위 KGP, Rgp-A 및/또는 Rgp-B에 대해 특이적으로 결합함으로써 예를 들어 치주 질환의 발생과 진행에 관련된 병원성 박테리아로 예컨대 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 박테로이데스 포르시터스(Bacteroides forsythus), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 트리포네마 덴티콜라(Triponema denticola), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia) 등에 대한 감염 여부에 대한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 대한 감염 여부에 대한 정보를 제공할 수 있다. 또한, 치주 질환을 진단하거나 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상를 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용하여 치주 질환의 예방 및 치료 용도를 목적하여 사용 가능하다.

본 발명은 상기 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 RNA 또는 상기 RNA에 대한 cDNA일 수 있다. 일 구현예로서 상기 핵산 분자는 위 언급한 각각의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 기초로 각각 서열번호 17 내지 20로 기재되는 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, Fab 형태의 RGPB-A9 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열은 서열번호 17, 중쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열을 서열번호 18로 나타낼 수 있으며, Fab 형태의 KGP-H3 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열은 서열번호 19, 중쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열을 서열번호 20으로 나타낼 수 있다.

본 발명은 상기 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, gt10과 gt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.

본 발명의 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 '플라스미드(plasmid)' 및 '벡터(vector)'는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션 (ligation)할 수 있다.

본 발명은 재조합 벡터를 적절한 숙주세포, 예를 들어 효모 세포, 동물 세포 등에 형질전환시킨 후 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 대량 생산할 수 있다.

상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7:monkey kidney cells)세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO:chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자 조작 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, micro-injection(세포에 DNA를 직접 넣는 것), liposome, directed DNA uptake, receptor~mediated DNA transfer 또는 Ca⁺⁺을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement: 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위의 세포들에서 사용할 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 '작동가능하게 연결(operably linked)'된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, '작동가능하게 연결된'은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명의 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대하여 특이적으로 결합하는 항체는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득하는 것이 바람직한데, 구체적으로는 항체의 중쇄 가변영역 또는 중쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열 및 경쇄 가변영역 또는 경쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열을 하나의 벡터 또는 2개의 벡터에서 따로 발현시킬 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

상기와 같이 재조합적으로 생산된 펩타이드 또는 단백질은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다.

항체 발현에 사용된 세포는 동결-해동 순화, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 Arg-specific gingipain A(RgpA), Arg-specific gingipain B(RgpB) 및 Lys-specific gingipain(Kgp)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출 또는 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 치주 질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 "진단" 또는 "검출"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 치주 질환의 발병 여부, Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인의 유무 등을 확인하는 모든 행위로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 "검출 또는 진단용 조성물"이란, 목적하는 질환의 진단에 사용되는 주된 수단을 의미하며, 본 발명의 목적에 따라 치주 질환 발병 여부 등을 진단하기 위한 물질들이 포함될 수 있다. 진단 방법은 항체 또는 항체 단편을 샘플과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 그와 같은 샘플은, 예를 들어 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등일 수 있으며, 바람직하게 타액일 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "타액"이란, 침샘으로부터 입 안으로 분비되는 분비액을 의미한다.

진단 방법은 또한 항원/항체 복합체의 검출을 포함할 수 있다.

본 발명에서 치주 질환이란 풍치라고도 하며, 치은(잇몸)과 치아 사이의 틈에 박테리아가 감염되어 치주인대와 인접조직을 손상시키는 질환을 의미하는데, 병증의 정도에 따라 치은염과 치주염으로 구분된다. 상기 치주질환의 발병시 염증이 진행되어 더 많은 조직이 손상되면서 치주낭(periodontal pocket)이 형성되고, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 되는데, 치주낭이 깊어지면서 치주인대에 염증이 생기게 되고 최종적으로는 골소실이 유발된다고 알려져 있다. 또한, 상기 치주 질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket), 치조골 파손(alveolar bone breakage) 또는 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 상기 항체 단독을 포함할 수도 있으며, 상기 항체 2개 모두를 포함할 수 있다.

예를 들어, 2개의 항체를 모두 포함하는 경우, 각각을 포획 항체 및 검출 항체로 이용할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 표지 물질을 접합시키고 이를 이용하여 Arg-gingipain A, Arg-gingipain B 및/또는 Lys-gingipain의 항원에 특이적으로 결합하는 검출 항체로 이용할 수 있다. 이러한 검출 항체의 이용은 Arg-gingipain A, Arg-gingipain B 및/또는 Lys-gingipain을 검출하는데 이용될 수 있다.

또한, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포획 항체로 이용할 수 있다. 이러한 포획 항체의 이용은 Arg-gingipain B 및/또는 Lys-gingipain을 검출하는데 이용될 수 있다.

보다 구체적으로, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 표지 물질을 접합시키고 이를 이용하여 Arg-gingipain B 및/또는 Lys-gingipain의 항원에 특이적으로 결합하는 검출 항체로 이용할 수 있다.

또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포획 항체로 이용할 수 있다.

"항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³ ⁺, Eu³ ⁺킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I, ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 상기 조성물에 있어서, 표지를 위한 항체는 예를 들어 금속나노입자에 항체 분자가 결합된 항체-금속나노입자 복합체일 수 있다. 상기 금속나노입자는 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag), 철(Fe) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 금속나노입자는 금(Au) 또는 은 (Ag)일 수 있다. 이러한 나노입자는 직경이 1~100 나노미터 단위인 입자로서 육안 또는 흡/형광 장비로 확인이 가능하다.

본 발명은 상기 또한 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 치주 질환 진단용 키트를 포함한다.

예를 들어, 상기 각각의 항체를 포함하거나, 이들 모두를 포함하는 치주 질환 진단용 키트를 제공할 수 있다.

이들 모두를 포함하는 경우, 상기 키트는 포획 항체로 사용될 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 기재에 부착될 수 있으며, 검출가능하게 표지된 검출 항체를 이용하여 검출 및 진단을 수행할 수 있다.

즉, 예를 들어 본 발명의 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 형태일 수 있고, 구체적으로 상기 키트는 전술한 항체를 포획 항체 및 검출 항체로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 ELISA는 (i) 본 발명에 따른 항체 중 어느 하나를 포획 항체; (ii) 본 발명에 따른 항체 중 나머지 하나를 검출표지로 표지하여 검출 항체로 이용하는 것일 수 있으나, 실시 형태는 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)"는 효소면역 측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.

또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.

본 발명의 검출 또는 진단용 조성물, 또는 키트는 또한 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 항체를 이용함으로써 치주 질환에 대한 빠른 진단 정보를 제공할 수 있다. 또한 상기 키트는 사용 지침(instruction) 및 기타 검출에 필요한 도구 또는 장비를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 키트는 래피드 키트일 수 있다.

구체적으로 본 발명에 따른 키트는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하고 기판 (substrate)에 부착되어 있는, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및

Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하고 표지물질이 접합된 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편;을 포함하는 치주 질환 진단용 키트일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 키트에 있어서 포획 항체는 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있으며, 이에 따라 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두의 유무에 대한 정보를 제공하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 치주 질환의 진단 방법을 제공한다.

여기서 치주 질환의 진단은 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 존재를 확인함으로써 진행될 수 있다. 따라서, Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 검출되는 경우, 이를 치주염의 발병으로 확인할 수 있다.

본 발명은 상기 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 검출 또는 정량방법을 제공한다.

상기 진단, 검출 또는 정량 방법은 예를 들어 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서는 바람직하게 ELISA(enzyme-lined immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay) 방법을 이용하였으며, 본 발명의 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체는 포획용 항체 또는 검출용 항체로 이용될 수 있다.

본 발명은 치주 질환에 대한 빠른 진단 정보를 제공할 수 있는 신규 항체를 제공하며, 항체는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원에 대한 친화성이 높아 치주 질환에 대한 체외진단 키트로 우수한 효과를 나타낸다.

도 1은 패닝 결과 선별된 다가 및 단일클론 항체(RgpB-1A9 antibody)의 KGP, RgpA 및 RgpB에 대한 ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 패닝 결과 선별된 다가 및 단일클론 항체(Kgp-H3 Antibody)의 KGP, RgpA 및 RgpB에 대한 ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 RgpB-1A9 항체의 경쇄 가변영역 및 중쇄가변영역 서열(핵산 및 아미노산 서열)을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 Kgp-H3 항체의 경쇄 가변영역 및 중쇄가변영역 서열(핵산 및 아미노산 서열)을 나타낸 도이다.
도 5는 정제된 본 발명의 항체로 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 래피드 키트 진단 스트립 상에서의 KGP에 대한 검출능을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 래피드 키트 진단 스트립 상에서의 RgpB에 대한 검출능을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 타액과 혼합한 KGP, RgpA RgpB 시료에서 검출능을 확인한 결과를 나타내는 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Arg -진지파인 A ( RgpA ), Arg -진지파인 B ( RgpB ), Lys -진지파인 (KGP)에 특이적으로 결합하는 항체 선별

1-1. 파지 디스플레이 항체 라이브러리(phage-displayed human antibody library) 제조

하기 방법으로 본 실험실에서 보유하고 있는 인간 항체 라이브러리를 증폭하였다.

상기 인간 항체 라이브러리를 포함하고 있는 E. coli 세포를 OD600=0.6-0.7까지 배양한 후, 헬퍼 파지(helper phage)를 첨가하여 30분간 방치하고(standing) 30분간 진탕(shaking)한 후, 카나마이신(kanamycin)을 첨가하고 밤새 배양하였다. 그 후 증폭된 라이브러리 파지를 배양액으로부터 회수하였다.

1-2. 바이오패닝(biopanning)

KGP, RgpA 또는 RgpB 각각 100 μg을 튜브 내에 코팅하고(immunotube), 상기 튜브에 상기 1-1에서 준비한 라이브러리 파지를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 둔 후 0.5% PBST로 10회 세척하였다. 세척 후 남아있는 파지를 0.1 M 글리신-HCl(pH 2.5)로 희석한 후, E. coli TG1 변이주에 감염시켜 증폭하였다. 이때 패닝 방법은 동일하게 하고, 패닝 횟수가 증가할 때마다 0.5% PBST로 세척하는 횟수를 10회씩 증가시켰다.

1차 패닝부터 4차 패닝까지의 유입(input) 및 유출(output) 역가는 도 1 및 2의 Bio-panning 표에 구체적으로 기재하였다.

1-3. Arg -진지파인 A ( RgpA ), Arg -진지파인 B ( RgpB ), Lys -진지파인 ( KGP )에 특이적인 항체 클론 선별

1차 패닝 내지 4차 패닝에서 증폭된 클론들을 무작위로 선택하여 E. coli TG1 변이주에 감염시킨 세포를 약 1000개의 단일 콜로니(single colony)가 되도록 플레이팅(plating)하여 각각의 단일 콜로니를 OD600=0.6-0.7까지 배양한 후 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)로 37℃유도한 상층액(sup)을 KGP, RgpA 또는 RgpB가 100 ng/well로 코팅되어있는 96 웰 플레이트에 넣고 37℃에서 1시간 둔 뒤, 0.05% PBST로 3번 세척하였다.

그 다음 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 상기 증폭된 클론을 KGP, RgpA 또는 RgpB가 코팅된 96 웰 플레이트에 첨가하고, 상기 96 웰 플레이트에 1차 항체(Goat F(ab')2 Anti-Human IgG (Fab')2 (HRP), abcam으로부터 구입(cat.ab98535))를 0.05% PBST에 1:3000으로 희석한 후 37℃에서 1시간 동안 결합시키고, 세척한 다음 TMB가 결합된 2차 항체와 반응시킨 후 세척하고, TMB 기질 용액을 첨가하여 Arg-진지파인 A (RgpA), Arg-진지파인 B (RgpB), Lys-진지파인 (KGP)에 결합한 클론을 검출하였다. 음성 대조군으로는 BSA를 사용하였다.

그 결과를 도 1 및 2에 각각 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성 대조군(negative control)에는 결합하지 않고 Arg -진지파인 A ( RgpA ), Arg -진지파인 B ( RgpB ), Lys -진지파인 ( KGP )에 선택적으로 결합하는 클론(RgpB-A9)을 수득하였다.

또한, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성 대조군(negative control)에는 결합하지 않고 Arg -진지파인 B ( RgpB ), Lys -진지파인 ( KGP )에 선택적으로 결합하는 클론(KGP-H3)을 수득하였다.

상기 클론들을 시퀀싱하여 그 중에서 2개의 항체 클론을 선별하였다. 시퀀싱 결과, RgpB-A9에 대하여 서열번호 13의 중쇄 가변 영역 서열과 서열번호 14의 경쇄 가변 영역 서열을 얻었으며, KGP-H3에 대하여 서열번호 15의 중쇄 가변 영역 서열과 서열번호 16의 경쇄 가변 영역 서열을 얻었다. 해당 서열은 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다. 붉은색 글씨로 표시한 부분은 CDR 영역에 해당한다.

상기 RgpB-A9에 대하여 중쇄 가변영역의 CDR1 부위는 서열번호 1, CDR2 부위는 서열번호 2, 및 CDR3 부위는 서열번호 3이었고, 경쇄 가변영역의 CDR1 부위는 서열번호 4, CDR2 부위는 서열번호 5, 및 CDR3 부위는 서열번호 6이었으며, KGP-H3에 대하여 중쇄 가변영역의 CDR1 부위는 서열번호 7, CDR2 부위는 서열번호 8, 및 CDR3 부위는 서열번호 9이었고, 경쇄 가변영역의 CDR1 부위는 서열번호 10, CDR2 부위는 서열번호 11, 및 CDR3 부위는 서열번호 12이었다.

상기와 같은, 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 2로 기재되는 CDR2, 서열번호 3으로 기재되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및, 서열번호 4로 기재되는 CDR1, 서열번호 5로 기재되는 CDR2, 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체를 RgpB-A9로 명명하였고,

서열번호 7로 기재되는 CDR1, 서열번호 8로 기재되는 CDR2, 서열번호 9로 기재되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및, 서열번호 10으로 기재되는 CDR1, 서열번호 11로 기재되는 CDR2, 및 서열번호 12로 기재되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체를 KGP-H3으로 명명하였다.

실시예 2. 선별된 항체 클론의 전항체화

상기 선별된 클론들을 보다 정밀하게 분석하기 위해 하기 방법에 따라 전항체(whole Ig) 형태로 전환하였다.

Fab 형태의 RGPB-A9 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열은 서열번호 17, 중쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열을 서열번호 18로 나타낼 수 있으며, Fab 형태의 KGP-H3 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열은 서열번호 19, 중쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열을 서열번호 20을 중합효소연쇄반응을 통해 증폭시켰다. 증폭을 위한 서열은 아래 표 1의 서열을 이용하였다.

증폭된 서열 (RGPB-A9)	프라이머
경쇄 리더 시퀀스	정방향	(서열번호 21) 5'- TGC AAA GCT TCG GCA CGA GCA -3'
경쇄 리더 시퀀스	역방향	(서열번호 22) 5'- TCC TTC AAC ACC AGA CAA C -3'
중쇄 리더 시퀀스	정방향	(서열번호 23) 5'- GAC GAA TTC ACT CTA ACC ATG GAA -3'
중쇄 리더 시퀀스	역방향	(서열번호 24) 5'- GGA GTG GAC ACC TGT AG -3'
증폭된 서열 (KGP-H3)	프라이머
경쇄 가변영역	정방향	(서열번호 25) 5'- TTG TCT GGT GTT GAA GGA GAC ATC CAG ATG ACC CAG -3'
경쇄 가변영역	역방향	(서열번호 26) 5'- GCA GCC GCC GTA CGT TT GAT CTC CAC CTT GGT CCC TTG -3'
중쇄 가변영역	정방향	(서열번호 27) 5'- ACT ACA GGT GTC CAC TCC GAA GTG CAG CTG GTG GAG -3'
중쇄 가변영역	역방향	(서열번호 28) 5'- CAC CGG TTC GGG GAA GT -3'

증폭된 서열을 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex)을 통하여 분리한 다음 정제하고, 전기영동을 수행하여 확인하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 RGPB-A9(Rgp) 및 KGP-H3(Kgp)의 전항체 및 중쇄와 경쇄의 밴드가 나타나고, 다른 밴드가 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 항체를 환원시켰을 때의 항체의 중쇄 및 경쇄의 분자량으로 알려진 50KDa, 25KDa의 분자량을 갖는 단백질 밴드를 관찰하였다. 따라서 전항체화가 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.

실시예 3. 래피드(Rapid) 진단 키트를 이용한 치주 질환 진단능 확인

래피드 키트를 이용해 Arg-진지파인 A (RgpA), Arg-진지파인 B (RgpB), Lys-진지파인 (KGP)에 대한 검출능을 확인하였다.

구체적으로, KGP-H3(H3) 항체를 포획 항체로 이용하고, RGPB-A9(1A9) 항체를 검출 항체로 이용하였다. A7 항체 (테스트라인) 및 Anti-human IgG 항체(컨드롤 라인)를 니트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)에 점적한 스트립을 4mm X 50 mm로 준비하였다. 그 다음, G5 항체-금 나노입자 축합체를 컨주게이트 패드에 분주한 후 건조하여 준비하였다. 니트로레룰로오스 멤브레인 하단에 컨주게이트 패드와 시료패드를 부착하고 상단에는 흡수패드를 부착시켜 래피드 키트를 제조한 후, Kgp, RgpB, RgpA가 포함된 시료를 검체주입부에 넣고 테스트라인의 색상 변화 정도를 관찰하였다.

제조된 래피드 키트를 이용하여 Kgp, RgpA, RgpB에 대하여 검출능을 시험하였다.

도 6의 실험에서는 Kgp를 농도별로 처리하고, Kgp, RgpA, RgpB에 대한 직접적 검출을 확인하였으며, 도 7의 실험에서는 RgpB를 농도별로 처리하고, RgpB, Kgp 및 RgpA에 대한 직접적 검출을 확인하였다.

도 6 및 도 7에서 각각 확인할 수 있는 바와 같이, 두 시스템에서 모두 Kgp 및 RgpB에 대한 우수한 검출 효능을 나타내었다.

또한, 타액과 혼합된 경우를 이용한 실험을 도 8에 나타내었다. 구체적으로, 도 8의 경우 타액에 각각 Kgp, RgpA, RgpB를 혼합한 시료를 이용하여 검출능을 확인하였다. 그 결과, 타액 혼합 시료에서도 Kgp, RgpB에 대한 우수한 검출 효능을 나타내었다.

즉, 도 6 내지 8의 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 단백질이 포함되어 있지 않은 블랭크(blank)를 상기 래피드 키트에 시료(sample)로서 가하였을 때에는 대조선 (C)에서만 선이 나타나고 검사선 (T)에서는 선이 보이지 않았다. 그러나, Kgp, RgpB가 포함된 완충액을 상기 래피드 키트에 가하였을 때에는 대조선 (C) 및 검사선 (T)에서 모두 색깔의 선이 나타났다. 검사창의 대조선 (C)과 검사선 (T) 위치에 모두 색깔의 발색 라인이 나타나는 경우 시료 내에 Kgp, RgpB가 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 이는 특히 타액에 포함된 시료에서도 확인되었는 바, 상기 결과로부터 본 발명의 래피드 키트를 이용하여 치주 질환을 빠르게 진단할 수 있음을 검증하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> NOVEL ANTIBODY FOR PERIODONTAL DISEASE AND USE THEREOF <130> P69 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-HC_CDR1 <400> 1 Asp Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-HC_CDR2 <400> 2 Asp Ile Asp Gly Thr Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-HC_CDR3 <400> 3 Trp Asp Ser Cys Gly Asp Tyr Val Ser Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-LC_CDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-LC_CDR2 <400> 5 Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-LC_CDR3 <400> 6 Gln Gln His Ser Gln Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-HC_CDR1 <400> 7 Phe Asp Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-HC_CDR2 <400> 8 Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-HC_CDR3 <400> 9 Trp Glu Met Val Glu Ser Glu Val Trp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-LC_CDR1 <400> 10 Arg Ala Ser Gln Val Ser Asn Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-LC_CDR2 <400> 11 Trp Ala Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-LC_CDR3 <400> 12 Gln Gln Thr Asp Gln Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-HC <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Asp Gly Thr Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Asp Ser Cys Gly Asp Tyr Val Ser Val Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-LC <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Asn Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Gln Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-HC <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Glu Met Val Glu Ser Glu Val Trp Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-LC <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ser Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asp Gln Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-HC <400> 17 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcact gactactgga tgagctgggt tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttctgat attgatggta ctagcggtgc tactaactac 180 gcagactctg tgaagggccg tttcaccatc tcccgggaca actctaagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtct attactgtgc gaaatgggac 300 agctgcggcg actacgtgtc tgttatggat tattggggcc aaggcaccct ggtcaccgtc 360 tcctcggcca gc 372 <210> 18 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgpB-1A9-LC <400> 18 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgcgtcacc 60 aacacttgcc gggcaagtca ggatatctct aactacctgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcttccagca gggaaagtgg ggtcccatca 180 cgcttcagtg gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cactcccagt ctcctttgac gttcggccaa 300 ggtaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 19 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-HC <400> 19 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcgac tcttacgcta tgagctgggt tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttctgat atttatccga atggcggtga tactgactac 180 gcagactctg tgaagggccg tttcaccatc tcccgggaca actctaagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtct attactgtgc gcgttgggag 300 atggtggagt cggaggtgtg ggctatggat tattggggcc aaggcaccct ggtcaccgtc 360 tcctcggcca gc 372 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kgp-H3-LC <400> 20 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgcgtcact 60 atcacttgcc gggcaagtca ggtttctaac tcttacctgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctactgg gcttccaact tggcaagtgg ggtcccatca 180 cgcttcagtg gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag actgaccagt atcctttgac gttcggccaa 300 ggtaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGPB-A9_LC-Forward <400> 21 tgcaaagctt cggcacgagc a 21 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGPB-A9_LC-Reverse <400> 22 tccttcaaca ccagacaac 19 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGPB-A9_HC-Forward <400> 23 gacgaattca ctctaaccat ggaa 24 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGPB-A9_HC-Reverse <400> 24 ggagtggaca cctgtag 17 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGP-H3_LC-Forward <400> 25 ttgtctggtg ttgaaggaga catccagatg acccag 36 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGP-H3_LC-Reverse <400> 26 gcagccgccg tacgtttgat ctccaccttg gtcccttg 38 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGP-H3_HC-Forward <400> 27 actacaggtg tccactccga agtgcagctg gtggag 36 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGP-H3_HC-Reverse <400> 28 caccggttcg gggaagt 17

Claims

Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는
서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄 가변 영역으로 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄 가변 영역으로 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄 가변 영역으로 서열번호 13의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역으로 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄 가변 영역으로 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄 가변 영역으로 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 Arg-진지파인 B, Lys-진지파인 또는 이들 모두에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄 가변 영역으로 서열번호 15의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역으로 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
제9항의 핵산 분자를 함유하는 재조합 벡터.
제10항의 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자를 함유하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산능을 가지는 재조합 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 치주 질환 진단용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출 또는 진단용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 치주 질환 진단용 키트.
제14항에 있어서, 기재에 부착된 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 포획 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 검출가능하게 표지된 Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 검출 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 치주 질환 진단용 키트.
제14항에 있어서, 상기 키트는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay) 형태인, 치주 질환 진단용 키트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, Arg-진지파인 A, Arg-진지파인 B 및 Lys-진지파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 검출 또는 정량방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 치주 질환의 진단 방법.