JP2004141154A - 腫瘍抗原 - Google Patents

Abstract

【課題】　ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識される分子（腫瘍抗原）を見出すこと。
【解決手段】　ＨＬＡ−Ｂ５２分子と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ｂ５２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用い、この腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する腫瘍抗原を、遺伝子発現クローニング法を用いて、ヒト肺腺癌細胞株のｃＤＮＡライブラリーから同定し、さらにＨＬＡ−Ｂ５２拘束性および／またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導することのできる、該腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドを見出した。

Description

　本発明は、腫瘍抗原に関し、さらに詳しくはＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドに関する。また、該ペプチドからなる医薬、該ペプチドを含有してなる癌ワクチンおよび該ペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤に関する。さらに、該ペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に関する。また、該ペプチドに対する抗体および該ペプチドの細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物に関する。さらに、該ペプチド、該抗体および該化合物から選ばれる少なくとも１つを含む医薬組成物に関する。また、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはその相補鎖、およびＲＮＡまたはその相補鎖に関する。さらに、該ポリヌクレオチドの部分塩基配列から設計して得たオリゴヌクレオチドに関する。また、該ペプチドの細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物の同定方法に関する。さらに、該ペプチド、該抗体、該ポリヌクレオチド、該ＤＮＡまたは該ＲＮＡの測定方法に関する。また、該ＲＮＡの測定に基づく癌の検査方法に関する。さらに、該ペプチド、該抗体、該ポリヌクレオチド、該ＤＮＡおよび該ＲＮＡのうちの少なくとも１を含む試薬キットに関する。

　生体における癌の排除には免疫系、特に細胞性免疫に係る細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下ＣＴＬと略称することもある。）が重要な役割を果たしている。癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤が認められている（非特許文献１）。腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子（腫瘍抗原）は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８個乃至１１個のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍抗原ペプチド）になり、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ分子と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ拘束性に腫瘍細胞を認識する。

　ＨＬＡは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別されるが、細胞傷害性Ｔ細胞により抗原ペプチドと共に認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ等に分類され、ヒトでは有核細胞がそれぞれ異なった量のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ抗原等を有する。また、その遺伝子は多型性に富むことが報告されている。例えば、ＨＬＡ−ＡにはＡ１、Ａ２、およびＡ２４等の、ＨＬＡ−ＢにはＢ８、Ｂ２７、Ｂ５２、およびＢ６２等の、ＨＬＡ−ＣにはＣｗ３やＣｗ６等の多型が存在する。そのため、それぞれの個体が有するＨＬＡの型は必ずしも同一ではない。

　細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡクラスＩ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するとき、ＨＬＡの型をも認識する。また、ＨＬＡ分子と結合する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列には、ＨＬＡの型により異なるモチーフ（規則的配列）が存在することが知られている。そのため、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化するためには、各型のＨＬＡに結合するペプチドを選択する必要がある。

　近年、腫瘍拒絶抗原遺伝子およびＴ細胞抗原受容体（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等の特異免疫に関与する分子が、種々の癌、例えばメラノーマや食道癌等で同定されてきており、進行癌または転移性癌においてペプチドによる特異的免疫療法が検討されている（非特許文献２−７）。例えば欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法が開発されつつあり、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。具体的には、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２を静脈内投与することにより、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている（非特許文献８）。さらに、複数ペプチドを用いた免疫治療（ｍｕｌｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ　ｂａｓｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）が、癌治療において有効であることが報告されている（非特許文献９−１１）。このように腫瘍抗原は、癌ワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。

　今までに同定されている腫瘍抗原遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ拘束性のものが多い。しかしながら、ＨＬＡ−Ｂ拘束性の腫瘍抗原遺伝子に関する報告は少ない。既に同定されているＨＬＡ−Ｂ拘束性抗原性ペプチドの代表例として、ＨＬＡ−Ｂ４４により提示されるＭＡＧＥ−３由来ペプチドおよびチロシナーゼ由来ペプチド、ＨＬＡ−Ｂ７により提示されるＲＡＧＥ１由来ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ１由来ペプチド、ＨＬＡ−Ｂ４５により提示されるＭＡＲＴ−１由来ペプチド、そしてＨＬＡ−Ｂ２７分子により提示されるＣＥＡ由来ペプチドが挙げられる（非特許文献１２−１７）。また、ＭＡＧＥ−３およびＭＡＧＥ−１２に共通のペプチドでＨＬＡ−Ｂ４０によって提示されるペプチドも報告されている（非特許文献１８）。

　ＨＬＡ−Ｂ７拘束性にＣＴＬにより認識される腫瘍抗原として、腎細胞癌で見出されている異常転写物であるＲＵ２遺伝子のリバースストランド（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｓｔｒａｎｄ）にコードされる抗原性ペプチドが同定されている（非特許文献１９）。このアンチセンス転写物（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の発現は、悪性腫瘍細胞特異的であり、ほとんどの正常組織では認めらなかったことが報告されている。

　別な種類の異常転写物として、近年、幾つかの遺伝子のイントロンが悪性腫瘍細胞においてｍＲＮＡに転写されていることが明らかになり、これらの翻訳産物から新規腫瘍特異抗原が見出されている（非特許文献２０−２２）。例えば、Ｎ−アセチルグルコースアミニルトランスフェラーゼＶがコードする抗原性ペプチド、およびＴＲＰ−２（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ−２）の異なったイントロンにコードされる２つのペプチド等の腫瘍抗原を挙げることができる。これらイントロンの転写産物は、正常組織および正常細胞では認められず、腫瘍において特異的に検出された。

　一方、腫瘍抑制遺伝子と考えられているテスティン遺伝子は、そのｍＲＮＡが全ての正常ヒト組織で発現している。しかし、多数の悪性腫瘍細胞では、５′末端のメチル化によりその発現が抑制されている（非特許文献２３）。テスティンはまた、ラットのセルトリ細胞の細胞周期において調整機能を果たすことが報告されている（非特許文献２４）。しかしながら、テスティンが腫瘍抑制遺伝子として作用するという直接的な証拠は未だに得られていない。

　以下に本明細書において引用した文献を列記する。
「アーカイブス　オブ　サージェリー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｅｒｙ）」，１９９０年，第１２６巻，ｐ．２００−２０５。 「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９１年，第２５４巻，ｐ．１６４３−１６４７。 「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９６年，第１８３巻，ｐ．１１８５−１１９２。 「ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，１９９９年，第１６３巻，ｐ．４９９４−５００４。 「プロシーディング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンシズ　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイツ　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９９５年，第９２巻，ｐ．４３２−４３６。 「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９５年，第２６９巻，ｐ．１２８１−１２８４。 「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９７年，第１８６巻，ｐ．７８５−７９３。 「ネイチャー　メディシン（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９８年，第４巻，ｐ．３２１−３２７。 「クリニカル　キャンサー　リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，２００１年，第７巻，ｐ．３９５０−３９６２。 「ジャーナル　オブ　クリニカル　オンコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」，２００１年，第１９巻，ｐ．３８３６−３８４７。 「ネイチャー　メディシン（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９８年，第４巻，ｐ．３２８−３３２。 「ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，１９９６年，第２６巻，ｐ．２２４−２３０。 「イムノジェネティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，１９９６年，第４３巻，ｐ．３７７−３８３。 「イムノジェネティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，１９９６年，第４４巻，ｐ．３２３−３３０。 「インターナショナル　ジャーナル　オブ　キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ）」，１９９８年，第７５巻，ｐ．４５１−４５８。 「ティッシュー　アンチジェンズ（Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ）」，２０００年，第５５巻，ｐ．１４９−１５２。 「インターナショナル　ジャーナル　オブ　キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ）」，２００２年，第９７巻，ｐ．５８−６３。 「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，２００２年，第１９５巻，ｐ．３９１−３９９。 「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９９年，第１９０巻，ｐ．１７９３−１８００。 「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９６年，第１８３巻，ｐ．１１７３−１１８３。 「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９８年，第１８８巻，ｐ．１００５−１０１６。 「ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，２００２年，第１６８巻，ｐ．９５１−９５６。 「ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」，２００２年，第６８巻，ｐ．１−１２。 「ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９７年，第２７２巻，ｐ．６４９９−６５０９。 「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，２０００年，第６０巻，ｐ．３５５０−３５５８。 「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，２００１年，第６１巻，ｐ．６４５９−６４６６。 「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９８３年，第２１９巻，ｐ．６６６−６７１。 「ペプチド合成」，丸善株式会社，１９７５年。 「ペプチド　シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ），１９９６年。 「エイチエルエー（ＨＬＡ）１９９１」，第１巻，ｐ．１０６５−１２２０，オックスフォード　サイエンティフィック　パブリケーションズ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ），１９９２年。 「ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９９８年，第１８７巻，ｐ．２７７〜２８８。 「イムノジェネティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，１９９５年，第４１巻，ｐ．１７８−２２８。 「ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，２０００年，第１６４巻，ｐ．２５６５−２５７４。 「ゲノム　リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９６年，第６巻，ｐ。９８６−９９４。

　近年、癌ワクチン療法の開発が試みられているが、ＨＬＡ−Ｂ分子によって提示されるペプチドワクチンの癌患者に対する臨床試験は、文献レベルで見る限り開始されていない。その理由の１つは、種々のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）の中で、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子が非常に高い多様性を有することにある。そのため、各ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の抗原頻度は、一般的に他の遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）、例えばＨＬＡ−ＡやＨＬＡ−Ｃのものより低い。例えば、ＨＬＡ−Ｂ５２対立遺伝子およびＨＬＡ−Ｂ６２対立遺伝子の抗原頻度は、日本人ではそれぞれ２１．４％および１６．６％である。他方、ＨＬＡ−Ａ２４は、日本人の約６０％、白人の約２０％、アフリカ人の約１２％でみられる。ＨＬＡ−Ａ２は、日本人の約３８％、中国人の約５３％、北コーカサス人の４９％、南コーカサス人の３８％、黒人アフリカ人の２３％においてみられる。

　ＨＬＡ遺伝子の多型により各個体において機能する腫瘍抗原ペプチドの種類が異なることを考えると、頻度が少ないとはいえ、ＨＬＡ−Ｂ拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し得る腫瘍抗原ペプチドを同定することは、癌治療において患者の多様なＨＬＡに対応するためには重要である。

　さらに、癌の多様性を考えると、全ての癌細胞において同一の腫瘍抗原が同程度発現されているとは考えられない。癌細胞の種類や組織の違いにより、発現している腫瘍抗原の種類や発現量が異なる。勿論、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。しかし、癌の治療において抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を惹起し、且つ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、ＨＬＡ拘束性および癌の多様性に応じた数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが必要である。

　本発明が解決しようとする課題は、新規な腫瘍抗原を見出し提供することである。具体的には少なくともＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原を提供することである。さらに詳しくはＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されるペプチド、該ペプチドからなる医薬、該ペプチドを含有してなる癌ワクチン、該ペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドの細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、これらの１種以上を含む医薬組成物、該ペプチドと相互作用する化合物の同定方法、該ペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、該ペプチドまたは該抗体の測定方法、並びに該ペプチドおよび／または該抗体を含む試薬キットを提供することである。

　上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＨＬＡ−Ｂ５２分子と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ｂ５２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬを肺腺癌患者由来の腫瘍浸潤リンパ球から樹立し、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬをＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に活性化する腫瘍抗原をコードするＤＮＡを、ヒト肺腺癌細胞株１１−１８のｃＤＮＡライブラリーから遺伝子発現クローニング法を用いて単離・同定した。そして該腫瘍抗原のアミノ酸配列に基づいてＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるエピトープを有するペプチドを取得し、また該ペプチドの１つがＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されることを見出した。さらにこれらペプチドが、ＨＬＡ表現型がＨＬＡ−Ｂ５２あるいはＨＬＡ−Ｂ６２である癌患者の末梢血単核細胞からペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを見出して本発明を完成した。

　すなわち本発明は、
　１．配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
　２．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチド、
　３．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチド、
　４．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする医薬、
　５．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有してなる癌ワクチン、
　６．ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の特異性がＨＬＡ−Ｂ５２および／またはＨＬＡ−Ｂ６２である癌の治療に用いる前記５．の癌ワクチン、
　７．上皮癌の治療に用いる前記５．または６．の癌ワクチン、
　８．肺癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌および／またはメラノーマの治療に用いる前記５．または６．の癌ワクチン、
　９．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
　１０．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、
　１１．配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫学的に認識する抗体、
　１２．配列表の配列番号１若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ｂ５２と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物の同定方法であって、該ペプチド、ＨＬＡ−Ｂ５２陽性細胞およびＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を少なくとも用いることを特徴とする同定方法、
　１３．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ｂ６２と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物の同定方法であって、該ペプチド、ＨＬＡ−Ｂ６２陽性細胞およびＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を少なくとも用いることを特徴とする同定方法、
　１４．前記１２．または１３．の方法により同定された化合物、
　１５．配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の認識を増強する化合物、
　１６．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の認識を増強する化合物、
　１７．前記１．から３．のいずれかのペプチド、前記１１．の抗体および前記１４．から１６．のいずれかの化合物のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物、
　１８．前記１．から３．のいずれかのペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
　１９．配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖、
　２０．配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡまたはその相補鎖、
　２１．配列表の配列番号５から配列番号９のいずれか１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
　２２．前記１．から３．のいずれかのペプチド、前記１１．の抗体、前記１８．のポリヌクレオチド、前記１９．のＤＮＡまたは前記２０．のＲＮＡを定量的あるいは定性的に測定する方法、
　２３．前記１９．に記載のＤＮＡまたは前記２０．に記載のＲＮＡを定量的あるいは定性的に測定する方法であって、配列表の配列番号５および配列番号６に記載の各塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡまたはＲＮＡの部分塩基配列を増幅し、増幅産物を検出することを含む測定方法、
　２４．前記１９．に記載のＤＮＡまたは前記２０．に記載のＲＮＡを定量的あるいは定性的に測定する方法であって、配列表の配列番号７および配列番号８に記載の各塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡまたはＲＮＡの部分塩基配列を増幅し、増幅産物を配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて検出することを含む測定方法、
　２５．癌組織あるいは癌細胞における前記２０．に記載のＲＮＡの発現量を測定し、検査することを特徴とする癌の検査方法、
　２６．前記１．から３．のいずれか１項に記載のペプチド、前記１１．に記載の抗体、前記１８．に記載のポリヌクレオチド、前記１９．に記載のＤＮＡ、前記２０．に記載のＲＮＡおよび前記２１．に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを含んでなる試薬キット、
に関する。

　本発明によれば、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性および／またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し得るペプチドを提供可能である。これらペプチドは、癌患者の末梢血単核細胞において癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るため、癌の特異的免疫療法に用いることができる。例えばＨＬＡ−Ｂ５２陽性および／またはＨＬＡ−Ｂ６２陽性の癌、さらにＨＬＡ−Ｂ５２陽性および／またはＨＬＡ−Ｂ６２陽性であり且つこれらペプチドを発現している癌の予防および／または治療に有用である。ＨＬＡ−Ｂ５２対立遺伝子あるいはＨＬＡ−Ｂ６２対立遺伝子は、日本人の３４％、朝鮮人の２５％、中国人の２７％および北アメリカ白人の１３％で認められる。また、当該ペプチドをコードするｍＲＮＡの発現が正常細胞では低レベルであるかほとんど検出されないため、これらペプチドが示す副作用は少ないと考えられる。したがって、本発明は癌の予防および／または治療において多大な貢献を期待できる。

　本発明の理解のために、本明細書において用いる用語についてまず説明する。「腫瘍抗原」とは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであり、腫瘍細胞が有する蛋白質またはペプチドを意味する。また「腫瘍抗原ペプチド」とは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し得るアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原エピトープ（腫瘍抗原決定基）という。

　ここで、「認識する（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ）」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ペプチドを認識するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された腫瘍抗原ペプチドにＴ細胞抗原受容体を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに増強するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が活性化するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された抗原を認識することにより、例えばインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γと略称する。）を産生すること、あるいは細胞傷害性Ｔ細胞が認識した標的細胞（ターゲットともいう）に対し細胞傷害活性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性若しくは該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を分化および／または増殖させることを意味する。また、本明細書において「細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤」とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。

　本明細書においては、単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ペプチド」という用語を使用し、ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸配列を表記する場合、１文字にて表記する場合と３文字にて表記する場合がある。

　以下、本発明について発明の実施の態様を説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。

　本発明においては、配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。

　本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ｂ５２分子および／またはＨＬＡ−Ｂ６２分子を細胞表面上に有する細胞に導入することにより、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、該細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または活性化することができる。かかるポリヌクレオチドまたはその相補鎖も本発明の範囲に含まれる。

　本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、具体的には配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。本発明に係るポリヌクレオチドは当該ＤＮＡに限定されず、本発明に係るペプチドをコードする限りにおいて該ＤＮＡの相同物も包含する。相同物には、上記ＤＮＡの塩基配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。かかる変異を有するＤＮＡは、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲなどを単独でまたは適宜組合せて用いることができる。本発明に係るＤＮＡの相同物にはまた、上記ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡが挙げられる。これらＤＮＡは目的のＤＮＡにハイブリダイゼーションするものであれば目的のＤＮＡの相補的配列でなくてもよい。

　配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ヒト肺腺癌細胞株１１−１８のｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子発現クローニング法を用いて単離・同定した。当該ＤＮＡの塩基配列は、１９５２ｂｐ長であり、テスティン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　アクセッション番号：ＡＦ２６０２２５）の第６エクソンと第７エクソンの間に存在するイントロンの配列と同一であった。以下、この塩基配列からなるＤＮＡをテスティン関連遺伝子（Ｔｅｓｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ）と呼称し、ＴＲＧと略称する。ＴＲＧは、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＹ１４３１７１として登録した。

　ＴＲＧ　ｍＲＮＡは、多数の癌細胞株および癌組織で検出されたが、正常細胞および正常組織においてはわずかに心臓、肝臓および膵臓等で低レベルの発現が認められた他はほとんど検出されなかった（実施例５および６並びに表１〜３を参照。）。例えば、ＴＲＧ　ｍＲＮＡは、試験した上皮癌細胞株（非小細胞肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、頭頚部癌、膀胱癌および膵臓癌由来の細胞株）の約８０％、非上皮癌細胞株（小細胞肺癌、肝臓癌、白血病および骨肉腫由来の細胞株）の約１８％において検出された。一方、腫瘍抑制遺伝子であると考えられているテスティン遺伝子のｍＲＮＡ発現は全ての正常ヒト組織および多数の悪性腫瘍細胞で認められた。本発明において初めて明らかにしたＴＲＧ由来のＲＮＡ、すなわち配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡまたはその相補鎖、あるいはその相同物も本発明の範囲に包含される。

　近年、幾つかの遺伝子のイントロンが悪性腫瘍細胞においてｍＲＮＡに転写されていることが明らかになり、それらの翻訳産物から新規腫瘍特異抗原が提供されている（非特許文献２０−２２）。これらイントロンの転写物は、もっぱら腫瘍で検出され、正常組織や正常細胞では検出されない。また、別な種類の異常転写物が腎細胞癌で見出されている。これはＲＵ２遺伝子のリバースストランドにコードされる抗原性ペプチドであり、該ペプチドはＨＬＡ−Ｂ７拘束性にＣＴＬにより認識される腫瘍抗原として同定された（非特許文献１９）。このアンチセンス転写産物の発現はまた、悪性腫瘍細胞に限局している。

　腫瘍細胞において選択的に検出されるこのような遺伝子産物は、免疫療法にとってマザー遺伝子の本来の転写物よりふさわしい標的分子である。従って、ＴＲＧの遺伝子産物は、テスティン遺伝子の転写産物より免疫療法にとって有用である。

　ＴＲＧは、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性の腫瘍特異的ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原をコードしており、細胞で発現させると、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性にＣＴＬに認識され、ＣＴＬを誘導するおよび／または活性化する。具体的には、ＴＲＧ　ｃＤＮＡをＨＬＡ−Ｂ５２遺伝子と共に遺伝子導入したサル腎癌細胞株ＣＯＳ７は、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬにより認識され、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生をプラスミド用量依存的に促進した。

　ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ｂ５２分子と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ｂ５２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞であり、既報（非特許文献２５および２６）記載の方法に従って、肺腺癌患者（ＨＬＡ−Ａ０２０６／２４０２，Ｂ３９／５２，Ｃｗ７）の腫瘍浸潤リンパ球から樹立した。ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬは、細胞表面マーカーがＣＤ３^＋ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋であり、その抗原認識はＨＬＡ−Ｂ遺伝子座拘束性である。すなわち、ＨＬＡ−Ｂ５２陽性（以下、ＨＬＡ−Ｂ５２^＋と表記する）細胞を認識するが、ＨＬＡ−Ｂ５２陰性（以下、ＨＬＡ−Ｂ５２⁻と表記する）細胞を認識しない。「ＨＬＡ−Ｂ５２陽性」とは、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の抗原特異性がＢ５２であることを意味する。「ＨＬＡ−Ｂ５２陰性」とは、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の抗原特異性がＢ５２以外のものであることを意味する。

　配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＴＲＧがコードする推定アミノ酸配列に基づいてＨＬＡ−Ｂ５２０１分子結合モチーフに適合するペプチドとして同定し合成した１０種類のペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号１０〜１７）から、実際にＨＬＡ−Ｂ５２拘束性にＣＴＬにより認識されるペプチドを選択して得たものである。以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをＴＲＧ１−２０と呼称し、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをＴＲＧ２−４１と呼称する。

　ＴＲＧ１−２０（配列番号１）およびＴＲＧ２−４１（配列番号２）は、ＨＬＡ−Ｂ５２^＋細胞またはＨＬＡ−Ｂ５２を発現させた細胞にパルスしたときに、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性ＣＴＬにより認識され、該ＣＴＬを活性化する。具体的には、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）は、ＨＬＡ−Ｂ５２０１を発現させた細胞（エプスタインバーウイルスで形質転換したＢ細胞）にパルスしたとき、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬにより認識され、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生をペプチド用量依存的に促進した。

　ＴＲＧ１−２０（配列番号１）およびＴＲＧ２−４１（配列番号２）はさらに、癌患者由来の末梢血単核細胞（以下、ＰＢＭＣと略称することもある。）から、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性且つペプチド特異的な腫瘍特異的ＣＴＬを誘導することができる。すなわち、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）で予め刺激したＨＬＡ−Ｂ５２^＋癌患者（非小細胞肺癌患者、大腸腺癌患者および胃腺癌患者）由来ＰＢＭＣは、刺激に用いたペプチドと同じペプチドをパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞（エプスタインバーウイルスで形質転換したＨＬＡ−Ｂ５２^＋ヒトＢ細胞）を認識し、有意なレベルのＩＦＮ−γを産生した。また、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激した上記ＰＢＭＣは、肺腺癌細胞株１１−１８を認識し、有意なレベルのＩＦＮ−γを産生した。さらに、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）で刺激したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞、例えば１１−１８細胞を認識して細胞傷害活性を示した。しかし、ＨＬＡ−Ｂ５２⁻腫瘍細胞またはＴＲＧ⁻腫瘍細胞には反応しなかった。これらから、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）は、ＴＲＧを発現している腫瘍細胞をＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に認識して細胞傷害活性を示すＣＴＬを、癌患者ＰＢＭＣにおいて誘導することが判明した。当該ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ^＋ＰＨＡ芽球化細胞には細胞傷害活性を示さなかった。ＰＨＡ芽球化細胞は、ヒト正常Ｔ細胞をフィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で芽球化した細胞である。このことから、当該ＣＴＬは正常細胞に対しては、細胞傷害活性を示さない、あるいは細胞傷害活性が弱いことが明らかになった。また、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激したＰＢＭＣがＴＲＧ１−２０（配列番号１）をパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞を認識して細胞傷害活性を示したが、ペプチドをパルスしないＳＳ−ＥＢＢ細胞には細胞傷害活性を示さなかったことから、該ＰＢＭＣにおいて誘導されたおよび／または活性化されたＣＴＬはＴＲＧ１−２０（配列番号１）特異的であることが判明した。同様に、ＴＲＧ２−４１（配列番号２）により癌患者ＰＢＭＣにおいて誘導されたおよび／または活性化されたＣＴＬはＴＲＧ２−４１（配列番号２）特異的であることが判明した。

　ＴＲＧ１−２０（配列番号１）はさらに、ＨＬＡ−Ｂ１５０１（血清学的に決定されたＨＬＡ−Ｂ６２と同一の分子）に比較的高い親和性を持つため、ＨＬＡ−Ｂ６２^＋癌患者由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ｂ６２拘束性且つペプチド特異的な腫瘍特異的ＣＴＬを誘導することができる。すなわち、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で予め刺激したＨＬＡ−Ｂ６２^＋癌患者（非小細胞肺癌患者、前立腺癌患者およびメラノーマ患者）由来ＰＢＭＣは、刺激に用いたペプチドと同じペプチドをパルスしたＡＹ−ＥＢＢ細胞（エプスタインバーウイルスで形質転換したＨＬＡ−Ｂ６２^＋ヒトＢ細胞）を認識し、有意なレベルのＩＦＮ−γを産生した。また、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激した上記ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋（Ｂ６２^＋）ＴＲＧ^＋腫瘍細胞を認識し、有意なレベルのＩＦＮ−γを産生した。さらに、ＴＲＧ１−２０で刺激したＰＢＭＣ（ＨＬＡ−Ｂ６２^＋／Ｂ５２⁻）は、ＴＲＧ　ｃＤＮＡとＨＬＡ−Ｂ１５０１　ｃＤＮＡとを共遺伝子導入した細胞をＴＲＧの用量依存的に且つＨＬＡ−Ｂ１５０１拘束性に認識して有意なレベルのＩＦＮ−γを産生した。しかし、ＴＲＧ　ｃＤＮＡとコントロールであるＨＬＡ−Ｂ５２０１　ｃＤＮＡとを共遺伝子導入した細胞は認識しなかった。これらから、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）は、ＨＬＡ−Ｂ６２拘束性且つペプチド特異的なＣＴＬをも誘導できることが明らかになった。

　ＴＲＧ１−２０（配列番号１）およびＴＲＧ２−４１（配列番号２）はこのように、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性のペプチド特異的なＣＴＬに認識されるので、該ＣＴＬを誘導するおよび／または活性化する腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。従って、これらペプチドは、癌の予防および／または治療、特にＴＲＧを発現している癌の予防および／または治療に使用できる。ＴＲＧの発現は、試験した大多数の癌細胞株、特に上皮癌細胞株、並びに癌組織で認められた。また、正常組織では、心臓、肝臓、膵臓、精巣およびＰＨＡ芽球化細胞でわずかに検出された他は、いずれの組織でもほとんど発現していなかった。これらから、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）およびＴＲＧ２−４１（配列番号２）は、好ましくはＴＲＧを発現している癌、より好ましくはＴＲＧを発現している上皮癌の予防および／または治療に用いることができる。健常人由来ＰＢＭＣにおいては、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）によりＣＴＬが誘導される例が少ないこと、またＴＲＧの発現が正常組織ではほとんど認められないことから、これらペプチドの癌の予防および／または治療における副作用が少ないことが予想される。このことは、これらペプチドの癌の予防および／または治療への使用において大きな利点であると考える。

　本発明に係るペプチドには、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）およびＴＲＧ２−４１（配列番号２）のアミノ酸配列において１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入等の変異が存するものも包含される。好ましくは、このような変異を有するペプチドであって、少なくともＨＬＡ−Ｂ５２拘束性ＣＴＬにより認識されるおよび／またはＨＬＡ−Ｂ５２拘束性のＣＴＬを誘導するペプチドである。また、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）アミノ酸配列においてかかる変異を有するペプチドであって、少なくともＨＬＡ−Ｂ６２拘束性ＣＴＬにより認識されるおよび／またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性のＣＴＬを誘導するペプチドも本発明に範囲に包含される。変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加、挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（非特許文献２７）を利用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基若しくはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。

　本発明に係るペプチドは、ＣＴＬを誘導するおよび／または活性化するために単独で使用してもよいし、組合わせて使用してもよい。ＣＴＬは種々の抗原を認識する複数種類の細胞集団であることから、好ましくはこれらを組合わせて用いることが推奨される。

　ペプチドの製造は、通常のペプチド化学において知られる方法で実施可能である。例えば成書に記載の方法（非特許文献２８および２９）が例示できるが、無論既知の方法が広く利用可能である。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等を挙げることができる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするペプチドを回収することにより製造可能である。

　ペプチドの精製および／または回収は、ペプチドの機能、例えばＣＴＬの誘導能および／または活性化能を指標にして実施できる。より具体的には、例えばＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を指標に行なうことができる。精製および／または回収の方法としては、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段、ゲルろ過、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が挙げられ、これらを単独でまたは組合わせて使用する。より好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作製し、得られたポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体により特異的に吸着回収する方法を用いる。

　本発明においては、本発明に係るペプチドを免疫学的に認識する抗体を提供することができる。抗体は、上記ペプチドを抗原として用いて作製する。抗原は上記ペプチド自体でもまたはその断片でもよく、少なくとも５個、より好ましくは８個以上のアミノ酸で構成される。上記ペプチドに特異的な抗体を作製するためには、該ペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも該ペプチドのアミノ酸配列と相同である必要はなく、該ペプチドの立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に該ペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定できる。

　抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行なうことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害な作用を及ぼさず且つ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等を例示できる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合わせが例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。

　ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。

　モノクロ−ナル抗体は、免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８細胞等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、目的のペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。

　かくして得られた、本発明に係るペプチドを認識し結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該ペプチドの精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用できる。

　本発明に係るペプチドおよび該ペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独でまたは複数種類を組合わせることにより、ＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強し得る物質の同定に有効な手段を提供する。同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。例えば、ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ｂ５２^＋細胞とＣＴＬとを共に培養し、ＣＴＬによるペプチドの認識および／またはＣＴＬの活性化を測定する実験系を用いて、被検物質を評価することにより、ＣＴＬによるペプチドの認識を増強する物質を同定できる。ペプチドをパルスするＨＬＡ−Ｂ５２^＋細胞としては、例えばＨＬＡ−Ｂ５２^＋Ｂ細胞等、またはＨＬＡ−Ｂ５２　ｃＤＮＡを常法により遺伝子導入して細胞表面上に発現させた細胞を用いることができる。細胞へのペプチドのパルスは、細胞とペプチドとを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である（実施例２参照。）。ＣＴＬとしては、自体公知のＨＬＡ−Ｂ５２拘束性ＣＴＬ培養細胞株、例えばＧＫ−Ｂ−ＣＴＬを挙げることができる。ＣＴＬによるペプチドの認識および／またはＣＴＬの活性化は、簡便にはＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生量を指標にして測定できる。また、自体公知のＨＬＡ−Ｂ６２拘束性ＣＴＬ培養細胞株、並びにＨＬＡ−Ｂ６２^＋細胞を用いて同様の実験系を構築することにより、ＣＴＬによる上記ペプチドのＨＬＡ−Ｂ６２拘束性の認識を増強し得る物質を同定できる。上述の実験系は同定方法の１つを説明するものであり、本発明に係る同定方法はこれに限定されない。

　本発明は、上記同定方法によって得られた化合物も包含する。該化合物は、本発明に係るペプチド、例えばＴＲＧ１−２０（配列番号１）若しくはＴＲＧ２−４１（配列番号２）および／またはＨＬＡ−Ｂ５２分子と相互作用してＨＬＡ−Ｂ５２拘束性ＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物であり得る。あるいは、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）および／またはＨＬＡ−Ｂ６２分子と相互作用してＨＬＡ−Ｂ６２拘束性ＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物であり得る。かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。

　本発明に係るペプチドは、腫瘍抗原ペプチドとしてＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性にペプチド特異的なＣＴＬを誘導するおよび／または活性化するために使用できる。したがって、本ペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、並びに本ペプチドを用いることを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法も本発明の範囲に包含される。本誘導剤および誘導方法により誘導される細胞傷害性Ｔ細胞としては、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞が例示できる。本ペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化するために、単独で使用してもよいし、２つ以上を組合わせて使用してもよい。細胞傷害性Ｔ細胞は種々の抗原を認識する複数の細胞集団であることから、好ましくはこれらを２つ以上組合わせて用いることが推奨される。

　細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法は、その一態様として、本発明に係るペプチドを細胞にパルスする工程、および該工程で得られた細胞を用いて細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程を含む。ペプチドをパルスする細胞としては、ＨＬＡ−Ｂ５２表現型および／またはＨＬＡ−Ｂ６２表現型を示す細胞、例えば該表現系を示す公知の細胞株が例示できる。あるいは、ＨＬＡ−Ｂ５２またはＨＬＡ−Ｂ６２以外の表現型を示す細胞に、ＨＬＡ−Ｂ５２　ｃＤＮＡまたはＨＬＡ−Ｂ６２　ｃＤＮＡを常法により遺伝子導入して細胞表面上に目的のＨＬＡ分子を発現させた細胞を用いることもできる。細胞へのペプチドのパルスは、細胞と腫瘍抗原ペプチドとを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である（実施例２参照。）。細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞を含む細胞集団は、例えばヒト末梢血より調製した末梢血細胞、より好ましくは末梢血単核細胞、さらに好ましくはＨＬＡ−Ｂ５２表現型および／またはＨＬＡ−Ｂ６２表現型を示す末梢血単核細胞が挙げられる。当該細胞集団の刺激は、当該細胞集団とペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ｂ５２^＋および／またはＨＬＡ−Ｂ６２^＋細胞とを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である（実施例３参照。）。細胞集団と標的細胞との組合わせは、好ましくは両細胞のＨＬＡ−Ｂ表現型の少なくとも一方が一致することが望ましい。

　本発明に係るペプチド、該ペプチドを免疫学的に認識する抗体、該ペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ｂ５２分子若しくはＨＬＡ−Ｂ６２分子と相互作用してＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物は、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明に係るペプチド、抗体または化合物は、これらのうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。さらに他の抗腫瘍ペプチドをその有効量含むことも可能である。他の抗腫瘍ペプチドとしては、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであることができ、これらＨＬＡ表現型以外のＨＬＡクラスＩ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであってもよい。好ましくは、患者のＰＢＭＣからペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものが好ましい。ペプチドによるＰＢＭＣからの特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導は、ＰＢＭＣとペプチドとを適当な期間培養し、対応するペプチドをパルスしたＨＬＡ分子を細胞表面に有する細胞と反応させて、産生されるＩＦＮ−γ量を測定することにより評価できる（実施例３参照。）。例えば、ＩＦＮ−γ産生量が、ペプチド非存在下で培養したＰＢＭＣと比較して多ければ、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたと判断できる。

　上記医薬、医薬組成物、ＣＴＬの誘導剤、およびＣＴＬの誘導方法は、例えば癌の予防および／または治療において有用である。特にＴＲＧを発現している癌、より好ましくはＴＲＧを発現している上皮癌で予防効果および／または治療効果が期待できる。具体的には、肺癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌およびメラノーマ等が例示できる。これらは、好ましくは、ＨＬＡ−Ｂ５２対立遺伝子および／またはＨＬＡ−Ｂ６２対立遺伝子を有する癌患者に適用できる。ＨＬＡ−Ｂ５２対立遺伝子は日本人の人口の約２１．４％、アメリカ白人の２．４％、朝鮮人の４．８％、北方中国人の４．２％に見られる（非特許文献３０）。また、ＨＬＡ−Ｂ６２対立遺伝子は日本人の人口の約１６．６％、アメリカ白人の１１．０％、朝鮮人の２１．０％、北方中国人の２３．６％に見られる（非特許文献３０）。これらから、本発明に係る医薬、医薬組成物、ＣＴＬの誘導剤、およびＣＴＬの誘導方法は多数の患者においてその効果を期待できる。

　具体的には、例えば上記ペプチドから選ばれた１種以上からなる医薬、さらに上記ペプチドから選ばれた１種以上を含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用できる。ここでいう癌ワクチンとは、癌細胞に対する特異的免疫応答を誘導するおよび／または増強することにより、癌細胞を選択的に傷害し得る薬物を意味する。癌ワクチンとして使用するとき、免疫応答の誘導および／または増強のために、適当なアジュバントの存在下または非存在下に、ペプチドを単独でまたは担体に結合して用いることができる。担体は、それ自体が人体に対して有害な作用を及ぼさず且つ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。アジュバントは、通常のペプチドワクチン接種に用いられるものであればよく、フロイント不完全アジュバント、ＡＬＵＭ、百日咳ワクチン、鉱物油等が例示される。

　癌ワクチンとして上記ペプチドを使用する場合、１種類のペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数種類の上記ペプチドを組合せて使用することもできる。最近、複数ペプチドに基づく免疫治療が有効であることが報告されている（非特許文献９−１１）。癌患者のＣＴＬはペプチド特異的なＣＴＬの複数種類からなる細胞集団であるため、１種類のペプチドを癌ワクチンとして使用するより複数を組合せて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られるときがある。

　製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその用量範囲は、特に限定されないが、成分の有効性、投与形態、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断により適宜選択することが望ましい。一般的には、適当な用量範囲は、例えば１用量当り約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度、さらに好ましくは１μｇ〜１ｍｇ程度とするのが望ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行なうことができる。

　投与形態は、公知の医療用ペプチドの投与方法に準じて行えばよく、局所投与または全身投与のいずれも選択することができる。いずれにおいても、疾患、症状等に応じた適当な投与形態を選択する。全身投与は例えば、経口、静脈内、動脈内等への投与により実施できる。局所投与は例えば、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。

　その他、患者の末梢血より単核細胞画分を採取して、本発明に係るペプチドを用いて刺激した後に、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導および／または細胞傷害性Ｔ細胞の活性化が認められた該単核細胞画分、あるいは該単核細胞画分から精製した細胞傷害性Ｔ細胞を、当該患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。ペプチドによる刺激は、単核細胞画分をペプチド、ペプチドを発現させた細胞、またはペプチドをパルスした細胞と共に培養することにより行なうことができる。培養の条件、例えば単核細胞濃度、ペプチド濃度またはペプチドをパルスした細胞の濃度、培養時間等は、簡単な実験により決定できる。培養時に、インターロイキン−２等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。細胞傷害性Ｔ細胞の精製は常法により行なうことができるが、例えばＣＤ８^＋細胞を回収することにより実施可能である。

　また、本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖を、癌の遺伝子治療に利用することも可能である。これらポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入して発現させる方法またはヒトから細胞を採取した後に体外で細胞内に導入して発現させる方法のいずれも利用可能である。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が知られているが、レトロウイルス系が推奨される。これらウイルスは複製欠陥性のものを用いる。投与量は、ＣＴＬによる該ペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には本発明に係る腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡ含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。

　本発明に係るペプチド、抗体または化合物を医薬組成物として製造する場合、医薬製剤中に含まれるこれら有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。

　医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。

　例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。

　所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することもできる。

　安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。

　緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。

　等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。

　キレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。

　本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。

　本発明においてはまた、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは抗体の定量的若しくは定性的な測定方法を提供する。当該測定の方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。利用できる方法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）等が例示できる。また、ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、例えば増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法等を用いて検出および定量が可能である。

　測定される試料としては、個体由来の細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等があげられる。また、測定される核酸は、上記各試料から自体公知の核酸調製法で得られる。

　本発明に係るＤＮＡまたはＲＮＡの測定は具体的には、実施例５に記載の方法により実施可能である。例えば、核酸試料について、配列番号５および配列番号６に記載の各塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを用いて、当該ＤＮＡまたはＲＮＡの部分塩基配列を増幅し、増幅産物を検出することにより、当該ＤＮＡまたはＲＮＡの測定が可能である。あるいは、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）を用いて本発明に係るＤＮＡまたはＲＮＡを測定し、ハウスキーピング遺伝子（β−アクチン、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素、リボソーマルプロテイン　Ｓ５等）をＤＮＡ標準として用いて比較することにより、より感度高く当該ＤＮＡまたはＲＮＡを測定できる。リアルタイムＰＣＲは、例えば当該ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅に配列番号７および配列番号８に記載の各オリゴヌクレオチドを用い、増幅産物の検出に配列番号９に記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて実施できる。これら具体例は例示に過ぎず、用いることのできる測定方法はこれらに限定されない。

　ＴＲＧの発現は、試験したほとんどの上皮癌細胞株および癌組織で認められたが、正常組織では、心臓、肝臓、膵臓、精巣およびＰＨＡ芽球化細胞でわずかに検出された他は、いずれの組織でもほとんど発現していなかった。このことから、ＴＲＧの発現を定量的または定性的に測定することにより、例えば癌の、より好ましくは上皮性の癌や腺癌等の検査および診断が可能になる。具体的には、個体由来試料、例えば癌の疑いがある組織または細胞について、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡの発現量、すなわち配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡの量を測定し、発現量が基準値よりも高いときには癌である可能性が高いと判定できる。基準値は、正常細胞および正常組織における当該ＲＮＡの発現量を測定し、その発現量を基に決定することが可能である。上記測定方法はさらに、癌治療後の予後の検査および診断にも利用可能である。

　本発明に係るペプチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは抗体、および該ＤＮＡ由来のオリゴペプチドは、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、ペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体等それぞれの性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。本発明はまた、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。これらは試薬キットであるとき、本発明に係るペプチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは抗体を検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液など、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。

　試薬および試薬キットは、本発明に係る化合物の同定方法および細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に使用できる。また、本発明に係る測定方法および検査方法に、測定試薬、検査試薬、測定キットまたは検査用キットとして使用可能である。

　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性腫瘍抗原をコードする遺伝子の同定）
　肺腺癌細胞株１１−１８由来のｃＤＮＡクローンとＨＬＡ−Ｂ５２０１　ｃＤＮＡとを共遺伝子導入したＣＯＳ７細胞を、ＣＴＬと共に培養して、該ＣＴＬを活性化せしめるｃＤＮＡクローンを得た。ＣＴＬの活性化は、ＣＴＬが産生するＩＦＮ−γ量を指標にして測定した。この方法により、腫瘍抗原をコードする遺伝子の同定が可能である（非特許文献３１）。

　ここで用いたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬである。この細胞は、肺腺癌患者（ＨＬＡ−Ａ０２０６／２４０２、Ｂ３９／５２、Ｃｗ７）の腫瘍浸潤リンパ球から、インターロイキン−２のみを用いて長期培養により樹立した（非特許文２５および２６）。まず、肺腺癌患者から得た腫瘍浸潤リンパ球を１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して５０日以上長期培養した。培養７日毎にこれらＩＬ−２活性化腫瘍浸潤リンパ球の一部を採取し、種々の腫瘍細胞または正常細胞と共に培養して、ＩＦＮ‐γ産生の測定により、そのＣＴＬ活性を検定した（非特許文献４）。ＩＦＮ‐γの測定は、ＥＬＩＳＡにより行なった。

　ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬの表現型はＣＤ３^＋ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋であり、１１−１８肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０１／２４０２、Ｂ５２０１／５４、Ｃ０１０２／１２０２）およびＳｑ−１肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ１１０１／２４０２、Ｂ５２０１／１５０１、Ｃ０１０２／）を認識してＩＦＮ−γを産生したが、ＨＬＡ−Ｂ５２０１⁻細胞、例えばＣＯＳ−７細胞およびＶＡ１３細胞に対する反応においてはこれらを認識せず、ＩＦＮ−γを産生しなかった。抗ＨＬＡクラスＩ抗体（Ｗ６／３２，ＩｇＧ２ａ）および抗ＨＬＡ−ＢＣ抗体（Ｂ１−２３，ＩｇＧ２ａ）により、Ｓｑ−１肺癌細胞に対する反応におけるＧＫ−Ｂ−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生が阻害された。これらから、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬの抗原認識がＨＬＡ−Ｂ遺伝子座拘束性であることが明らかになった。

　肺腺癌細胞株１１−１８由来のｃＤＮＡライブラリーは、該細胞のｍＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、ＳａｌＩアダプターにライゲーションし、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ２．０（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に挿入することにより作製した。このｃＤＮＡライブラリーの合計１×１０^５クローンを１０００ウエルにほぼ均等に分け、一次スクリーニングを次のように行なった。まず、分割した各プールの精製されたｃＤＮＡと１００ｎｇのＨＬＡ−Ｂ５２０１　ｃＤＮＡとを、細胞数５×１０^３のＣＯＳ７細胞に共遺伝子導入した。次いで、これら細胞とＧＫ−Ｂ−ＣＴＬを共に培養し、培養上清中に産生されたＩＦＮ−γ量を測定した。そして、腫瘍抗原をコードする遺伝子として、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した細胞に導入したｃＤＮＡクローンを選択した。

　その結果、１つのクローン、クローン１２Ａを見出した。クローン１２Ａは、ＨＬＡ−Ｂ５２０１と共にＣＯＳ７細胞に共遺伝子導入したときにプラスミド用量依存的にＧＫ−Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した（図１）。一方、ＨＬＡ−Ａ２６０１と共に共遺伝子導入したときにはクローン１２ＡはＧＫ−Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進しなかった（図１）。ＨＬＡ−Ｂ５２０１と空ベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２とを共遺伝子導入した細胞もまた、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬにより認識されなかった。これらから、クローン１２Ａの遺伝子産物は、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬによりＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に認識され、該ＣＴＬを活性化する腫瘍抗原として作用することが判明した。

　クローン１２Ａの塩基配列は、オートリードシーケンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いてダイデオキシヌクレオチドシーケンシング法を行ない、ＡＢＩ　ｐｒｉｓｍ　３７７（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）で分析することにより決定し、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＹ１４３１７１として登録した（配列表の配列番号３）。クローン１２Ａは、１９５２ｂｐ長のｃＤＮＡインサートを含んでいた。当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を、フレーム１、フレーム２、およびフレーム３の全読み取り枠について推定したところ、３２〜６４アミノ酸をコードする短い読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）が７つ含まれていた。当該塩基配列はテスティン遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ２６０２２５）の第６エクソンと第７エクソンの間に存在するイントロンの配列と同一であった。

（腫瘍抗原ペプチドの同定）
　実施例１で得たクローン１２Ａの遺伝子産物から、腫瘍抗原ペプチドを同定した。まず、配列番号３に記載の塩基配列にコードされる推定アミノ酸配列に由来するペプチドから、ＨＬＡ−Ｂ５２０１分子結合モチーフを有するペプチドを、ＢＩＭＡＳ（ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮＩＨ）ソフトウエアを使用して検索した（非特許文献３２）。これらのモチーフは第２位にＱを、並びに第８および９位にＩ、Ｖ、Ｍ、またはＦを含んでいた。かくして１０種類のペプチドを同定し（配列番号１、２および１０〜１７）、これらの合成ペプチドをＢｉｏｌｏｇｉｃａ社から得た（純度＞９５％）。ＨＬＡ−Ｂ５２に結合し得るヒト免疫不全ウイルスエンベロプ蛋白質由来ペプチド（配列番号１８：以下、ＨＩＶペプチドと呼称する）およびインフルエンザ由来ペプチド（配列番号１９）は、それぞれ陰性コントロールおよび陽性コントロールとして用いた。

　ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬにより認識される抗原性ペプチドを同定するために、上記１０種類の各合成ペプチドをＳＳ−ＥＢＢ細胞（ＨＬＡ−Ｂ５２０１／５４）に、１０μＭの濃度で３７℃にてパルスした。２時間後にその上清を除去し、細胞数１×１０^５のＧＫ−Ｂ−ＣＴＬを培養に加え、３７℃でさらに１８時間インキュベーションした。次いで、培養上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡで測定した。トリプリケートアッセイで測定した結果を、スチューデントｔテストを用いて統計的に分析した。

　上記ペプチドのうち、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）およびＴＲＧ２−４１（配列番号２）は、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬにより認識され、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を有意に且つ用量依存的に促進した（図２-Ａおよび図２-Ｂ）。

（癌患者由来ＰＢＭＣにおけるＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
　２つのペプチド、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）およびＴＲＧ２−４１（配列番号２）について、ＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導能について試験した。ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ｂ５２^＋癌患者１０例〔非小細胞肺癌（ＬＣ）５例、大腸腺癌（ＣＣ）４例および胃腺癌（ＳＣ）１例〕およびＨＬＡ−Ｂ５２^＋健常人（ＨＤ）４例から調製した。ＰＢＭＣはペプチドで３日ごとに４回刺激し、ペプチドをパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞またはＨＬＡ−Ｂ５２０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞に対する反応におけるそれらのＩＦＮ−γ産生能を検討した。

　細胞数１×１０^５のＰＢＭＣは、既報と同様に（非特許文献２５、２６および３３）、１０μＭの各ペプチドと共に９６ウエルプレート中で１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２存在下でインキュベーションした。培養３日目、６日目、および９日目に、細胞を１０μＭの対応するペプチドで再刺激した。１２日目に、各ウエルの培養上清を除去し、細胞を新鮮培地に再浮遊し、２つのウエルに分配した。２つのウエルの細胞を、それぞれ対応するペプチドまたはコントロールＨＩＶペプチドをパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞あるいはＨＬＡ−Ｂ５２０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞１１−１８で刺激した。培養１８時間後に、培養上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡでトリプリケートアッセイにて測定した。対応するペプチドをパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞またはＨＬＡ−Ｂ５２０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞１１−１８で刺激した上清中のＩＦＮ−γ濃度から、コントロールＨＩＶペプチドをパルスしたＥＢＢ細胞でまたはＨＬＡ−Ｂ５２０１⁻Ｂ１５０１⁻ＴＲＧ^＋ＱＧ５６細胞で刺激した培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をそれぞれ減算した。

　ＴＲＧ１−２０（配列番号１）をパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞に対する反応において、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激したＰＢＭＣからの有意なレベルのＩＦＮ−γ（＞１００ｐｇ／ｍｌ）産生が、癌患者１０例中８例および健常人４例中１例のＰＢＭＣで認められた（図３-Ａの左図）。同様の結果が１１−１８腫瘍細胞に対する反応で認められた（図３-Ａの右図）。

　ＴＲＧ２−４１（配列番号２）をパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞に対する反応において、ＴＲＧ２−４１（配列番号２）で刺激したＰＢＭＣからの有意なレベルのＩＦＮ−γ（＞１００ｐｇ／ｍｌ）産生が、癌患者１０例中６例のＰＢＭＣで認められた（図３-Ｂ）。

　ポジティブコントロールであるインフルエンザ由来ペプチドは癌患者１０例中６例および健常人４例中３例のＰＢＭＣからペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。一方、ネガティブコントロールであるＨＩＶペプチドではＣＴＬは全く誘導されなかった。

　ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）で刺激した上記ＰＢＭＣの細胞傷害活性を、標準的な６時間の^５１Ｃｒ遊離試験でさらに検討した。この試験は、上記ＰＢＭＣをＩＬ−２で長期培養して充分な数の細胞を得た後に行なった。まず、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）で刺激した細胞を、９６ウエルＵ底マイクロカルチャープレート中で、放射線照射して対応するペプチドでパルスした自己ＰＢＭＣ２×１０^５を用いてさらに培養した。この細胞を二次培養の３日目および７日目に各ペプチドで刺激し、そしてさらにＩＬ−２のみで培養した。培養２８〜４２日目に細胞を回収してエフェクターとして用い、様々なターゲットに対するそれらの細胞傷害活性を、標準的な６時間の^５１Ｃｒ遊離試験を様々なエフェクター：ターゲット比（Ｅ／Ｔ比）で行なうことにより測定した（非特許文献２５および２６）。

　代表的な結果を図４-Ａおよび図４-Ｂに示す。ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）で刺激したＰＢＭＣはＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ^＋肺癌細胞（１１−１８）に対して細胞傷害活性を示した（図４-Ａおよび図４-Ｂの左図）。一方、これらの細胞は、ＨＬＡ−Ｂ５２⁻ＴＲＧ^＋（ＱＧ５６）またはＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ⁻（ＬＣ６５Ａ）肺癌細胞のいずれにも細胞傷害活性を示さなかった。これらの細胞はＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ^＋ＰＨＡ芽球化細胞には反応しなかった。また、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）で刺激したＰＢＭＣは、それぞれＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）をパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞に対して細胞傷害活性を示した（図４-Ａおよび図４-Ｂの右図）。この結果から、これらペプチドで刺激したＰＢＭＣのペプチド特異性が明らかになった。コントロールであるインフルエンザ由来ペプチドで刺激したＰＢＭＣはいずれのターゲットに対しても細胞傷害活性を示さなかった。図示した結果は、肺癌患者例（ＬＣ１、ＬＣ３およびＬＣ５）並びに胃癌患者例（ＳＣ１）由来の末梢血単核細胞についての結果であるが、その他の患者例においても同様の結果が得られた。これらの細胞傷害活性は抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（Ｗ６／３２，ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡ−ＢＣモノクローナル抗体（Ｂ１−２３，ＩｇＧ２ａ）、ＨＬＡ−Ｂ５２分子を含むＨＬＡ−Ｂサブグループに反応する抗体である抗ＨＬＡ−Ｂｗ４モノクローナル抗体（ＩｇＭ）、または抗ＣＤ８抗体（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ，ＩｇＧ２ａ）によって阻害されたが、抗クラスＩＩ抗体（Ｈ−ＤＲ−１，ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４抗体（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ，ＩｇＧ１）、または抗ＣＤ１４抗体（Ｈ１４，ＩｇＧ１）では阻害されなかった。代表的な結果を図５に示す。

　これらから、２つのペプチド、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）およびＴＲＧ２−４１（配列番号２）は、癌患者由来のＰＢＭＣにおいて、それぞれペプチド特異的且つＨＬＡ−Ｂ５２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが明らかになった。

（癌患者由来ＰＢＭＣにおけるＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
　ＴＲＧ１−２０（配列番号１）がＨＬＡ−Ｂ１５０１に比較的高い親和性をもつことがＢＩＭＡＳソフトウエアを用いた解離半減期の推定スコアを計算することにより明らかになった。そこで、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）がＨＬＡ−Ｂ１５０１拘束性且つ腫瘍特異的なＣＴＬを誘導するか検討した。ＨＬＡ−Ｂ１５０１の結合モチーフは第２位がＱまたはＬであり、第９位がＦまたはＹである（非特許文献３２）。また、ＨＬＡ−Ｂ１５０１は血清学的に決定されたＨＬＡ−Ｂ６２と同一である。

　ＨＬＡ−Ｂ６２^＋癌患者７例〔非小細胞肺癌（ＬＣ）２例、前立腺癌（Ｐｒｏ）４例およびメラノーマ（Ｍ）１例〕のＰＢＭＣをＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激し、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）をパルスしたＨＬＡ−Ｂ６２^＋ＡＹ−ＥＢＢ細胞またはＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋（Ｂ６２^＋）ＴＲＧ^＋腫瘍細胞に対する反応性を実施例３と同様の方法で試験した。７例中３例のＰＢＭＣからの有意なレベルのＩＦＮ−γ産生が、ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ｂ６２^＋ＡＹ−ＥＢＢ細胞（図６-Ａの左図）およびＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞（図６-Ａの右図）に対する反応において認められた。ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激したＰＢＭＣ（ＨＬＡ−Ｂ６２^＋／Ｂ５２⁻）について、ＴＲＧ　ｃＤＮＡとＨＬＡ−Ｂ１５０１　ｃＤＮＡまたはＴＲＧ　ｃＤＮＡとコントロールであるＨＬＡ−Ｂ５２０１　ｃＤＮＡを共遺伝子導入したＣＯＳ７細胞に対する反応性をさらに検討した。これらのＰＢＭＣはこれらＣＯＳ７細胞をＴＲＧの用量依存的に且つＨＬＡ−Ｂ１５０１拘束性に認識して有意なレベルのＩＦＮ−γを産生した（図６-Ｂ）。

　ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激したＰＢＭＣの細胞傷害活性をさらに実施例３と同様の方法で^５１Ｃｒ遊離試験により検討した。その代表的な結果を図７-Ａに示す。ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激した肺癌患者例およびメラノーマ患者例由来のＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞株である膀胱癌細胞株ＨＴ１３７６および膵臓癌細胞株ＰＡＣＡ２に対して細胞傷害活性を示したが、ＨＬＡ−Ｂ１５０１⁻ＴＲＧ^＋肺癌細胞株ＱＧ５６あるいはＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋ＴＲＧ⁻肝臓癌細胞株ＫＩＭ−１には反応しなかった。細胞傷害活性は抗クラスＩ抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＨＬＡ−ＢＣ抗体、またはＨＬＡ−Ｂ６２分子を含むＨＬＡ−Ｂのサブグループに反応する抗ＨＬＡ−Ｂｗ６抗体で阻害されたが、抗クラスＩＩ抗体、抗ＣＤ４抗体、または抗ＣＤ１４抗体では阻害されなかった。代表的な結果を図７-Ｂに示す。これらから、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）はＨＬＡ−Ｂ６２^＋癌患者由来のＰＢＭＣから、ペプチド特異的且つＨＬＡ−Ｂ６２拘束性のＣＴＬを誘導することが明らかになった。

　このようにＴＲＧ１−２０（配列番号１）は、ＨＬＡ−Ｂ５２^＋癌患者由来のＰＢＭＣにおいてのみならず、ＨＬＡ−Ｂ６２^＋癌患者由来のＰＢＭＣからも、ペプチド特異的且つＨＬＡ−Ｂ拘束性のＣＴＬを誘導することが判明した。

（ＴＲＧの組織発現の解析）
　実施例１で得られたクローン１２Ａ（以下、ＴＲＧと呼称することもある）の組織発現をノザンブロット分析により解析した。種々の細胞および正常組織からＲＮＡｚｏｌ　Ｂ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ社）を用いて抽出した総ＲＮＡ（１０μｇ／ｌａｎｅ）をホルムアルデヒドアガロースゲル（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ）上で分離し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にトランスファーした。当該メンブレンは、ハイブリダイゼーションバッファー（７％　ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ７．２）中で、クローン１２ＡのＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩによる切断断片（９５１ｂｐ）を^３２Ｐで標識したものをプローブとして、６５℃にて一晩さらにハイブリダイゼーションした。その後、このメンブレンは、洗浄用バッファー（１％　ＳＤＳ、４０ｍＭ　ＮａＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ７．２）を用いて室温で３回、６５℃で１回洗浄し、次いでオートラジオグラフィーで測定した。コントロールプローブとして、ヒトβ−アクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて同様に検討した。その結果、ＴＲＧの発現は、図８に示すように、１．９ｋｂのバンドとして１１−１８肺腺癌細胞株でのみ認められた。

　さらに、ＴＲＧの発現解析を、より検出感度の高いＲＴ−ＰＣＲ法で行なった。逆転写反応は、オリゴ−ｄＴプライマー（ｏｌｉｇｏ−ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ）を用いてスーパースクリプトファーストストランドプレパレ−ションキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈ社）を使用し、その使用説明書に従って行なった。総ＲＮＡ試料は、ＤＮａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）で３７℃にて２０分間処理して、夾雑しているゲノムＤＮＡを取り除いた後に逆転写反応にかけた。

　ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は次に示す条件で行なった：デナチュレーション（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５８−６０℃で３０秒間）およびエクステンション（７２℃で９０秒間）を１サイクルとして３５サイクル。

　ＰＣＲプライマーは次に記載のオリゴヌクレオチドを用いた（図９-Ａ参照）。
テスティン用
　フォワードプライマー：５０８７７Ｆ（配列番号２０）
　リバースプライマー　：５１４８８Ｒ（配列番号２１）
ＴＲＧ用
　フォワードプライマー：４５２Ｆ　（配列番号５）
　リバースプライマー　：１１６７Ｒ（配列番号６）

　ＴＲＧ用のプライマーは、ＴＲＧの第４５２位から第１１６７位の領域を検出するために設計した（図９-Ａ）。テスティン用のプライマーは、ゲノムＤＮＡの夾雑がないことを証明し、且つテスティンｍＲＮＡ発現を分析するために設計した。テスティン用のプライマーはテスティン遺伝子の第５エクソン中の第５０８７７位から第６エクソン中の第５１４８８位までの領域を検出するために設計した。第５エクソンと第６エクソンの間のイントロンの長さは３４２ｂｐである。もし試料がゲノムＤＮＡを含んでいれば、ＲＴ−ＰＣＲにより６１２ｂｐの産物が増幅されると予想される。しかしながら、試料にゲノムＤＮＡの夾雑がなければ２７０ｂｐの産物が増幅される（図９-Ｂ）。

　結果を表１および表２に示した。いずれの癌細胞株または正常組織から抽出したＲＮＡについてもゲノムＤＮＡの夾雑は認められなかった。ＴＲＧ　ｍＲＮＡは、ほとんどの（２６検体中２１検体；８１％）上皮癌細胞株（非小細胞肺癌細胞株１２種のうち１１種；食道癌細胞株３種のうち１種；胃癌細胞株３種のうち２種；大腸癌細胞株３種全て；頭頚部癌細胞株３種のうち２種；膀胱癌１種；膵臓癌細胞株１種）で検出された。一方、非上皮癌細胞株におけるＴＲＧ　ｍＲＮＡの発現は比較的まれであり（１１検体のうち２検体；１８％）、小細胞肺癌細胞株２種および肝癌細胞株３種では検出されず、白血病細胞株１種および骨肉種細胞株５種のうち１種で検出された。ＴＲＧの発現は非上皮癌細胞株と比較して上皮癌細胞株で有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ＴＲＧは、精巣およびＰＨＡ芽球化細胞で発現していたが、それ以外の試験したいずれの正常組織でも発現していなかった。

　表１および２において、＋は各ｍＲＮＡが検出されたことを示し、−は検出されなかったことを示す。

　表中、ｎ．ｔは試験しなかったことを示す。

　ＴＲＧの組織発現をリアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）によりＡＢＩ　ｐｒｉｓｍ　５７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてさらに定量的に解析した（非特許文献３４）。

　クローン１２Ａおよび全長β−アクチンプローブ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＤＮＡ標準として用いた。ｃＤＮＡ試料としてヒトＭＴＣパネルＩ、ＩＩ、およびヒト腫瘍ＭＴＣパネル（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。ｃＤＮＡ試料およびＤＮＡ標準のリアルタイムＰＣＲは、１×ＴａｑＭａｎ　Ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、４００ｎＭのプライマーおよび１６０ｎＭのプローブを用いて総容量２５μｌ中で行なった。

　プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは次に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。プローブはいずれも５′末端および３′末端をそれぞれレポーター色素ＦＡＭおよびクエンチャー色素ＴＡＭＲＡで標識して用いた。
　ＴＲＧフォワードプライマー：配列番号７
　ＴＲＧリバースプライマー：配列番号８
　ＴＲＧプローブ：配列番号９
　β−アクチンフォワードプライマー：配列番号２２
　β−アクチンリバースプライマー：配列番号２３
　β−アクチンプローブ：配列番号２４

　ＰＣＲは次に示す条件で行なった：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、４０サイクルのデナチュレーションおよびアニーリング／エクステンション（デナチュレーション：９５℃で１５秒間、アニーリング／エクステンション：６０℃で１分間）。

　ＴＲＧの発現は、ＴＲＧ　ｍＲＮＡのコピー数をβ−アクチン　ｍＲＮＡのコピー数×１０^４で除して数値化し、表３に示した。表に示した数値が高いほど、ＴＲＧの発現レベルが高い。ＴＲＧは、正常組織においては心臓、肝臓および膵臓で低レベルの発現が検出された他は、大多数の組織でほとんどその発現が認められなかった。それに反して、試験した癌組織全てにおいて（乳癌、肺癌、大腸腺癌および前立腺癌）、高レベルのＴＲＧ発現が認められた。

　本発明は、例えば癌の特異的免疫療法に使用することができ、医薬分野における利用可能性が非常に高く有用である。また、本発明は、Ｔ細胞による腫瘍の認識に関する分子の基礎的研究にも多大に寄与するものである。

肺腺癌細胞株１１−１８由来ｃＤＮＡクローンの１つであるクローン１２Ａ（ＴＲＧ、配列番号３）が、ＨＬＡ−Ｂ５２０１１　ｃＤＮＡと共にＣＯＳ７細胞に共遺伝子導入したときにＧＫ−Ｂ−ＣＴＬにより認識され、プラスミド用量依存的にＧＫ−Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進したことを説明する図である。クローン１２ＡとＨＬＡ−Ｂ２６０１　ｃＤＮＡとを共遺伝子導入したＣＯＳ７細胞または空ベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２とＨＬＡ−Ｂ５２０１１　ｃＤＮＡとを共遺伝子導入したＣＯＳ７細胞はいずれもＧＫ−Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進しなかった。 テスティン関連遺伝子（ＴＲＧ）由来の合成ペプチドのうちＴＲＧ１−２０（配列番号１）またはＴＲＧ２−４１（配列番号２）をパルスしたＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＳＳ−ＥＢＢ細胞が、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬに認識されて、ＧＫ−Ｂ−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進したことを説明する図である。図中、アスタリスク（＊）は、トリプリケートアッセイの結果をスチューデントｔテストで統計処理して、有意差（ｐ＜０．０５）があったことを示す。＊の意味は、以下の図３〜７に援用する。 上図は、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）が用量依存的にＧＫ−Ｂ−ＣＴＬに認識されてそのＩＦＮ−γ産生を促進したことを説明する図である。下図は、ＴＲＧ２−４１（配列番号２）が用量依存的にＧＫ−Ｂ−ＣＴＬに認識されてそのＩＦＮ−γ産生を促進したことを説明する図である。 ＴＲＧ１−２０（配列番号１）が９例の異なったＨＬＡ−Ｂ５２^＋癌患者のうち、肺癌患者４例（ＬＣ１〜４）、胃癌患者１例（ＳＣ１）および大腸癌患者２例（ＣＣ２およびＣＣ３）、並びに健常人１例（ＨＤ４）の末梢血単核細胞においてＣＴＬを誘導したこと、および誘導されたＣＴＬがＴＲＧ１−２０（配列番号１）をパルスしたＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＳＳ−ＥＢＢ細胞（左図）またはＨＬＡ−Ｂ５２０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞（右図）を認識してＩＦＮ−γの産生を促進したことを説明する図である。 ＴＲＧ２−４１（配列番号２）が肺癌（ＬＣ）患者４例、胃癌患者（ＳＣ）１例および大腸癌患者（ＣＣ）１例の末梢血単核細胞においてＣＴＬを誘導したこと、および誘導されたＣＴＬがＴＲＧ２−４１（配列番号２）をパルスしたＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＳＳ−ＥＢＢ細胞を認識してＩＦＮ−γの産生を促進したことを説明する図である。 左図は、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激した肺癌患者（ＬＣ３）の末梢血単核細胞が、ＨＬＡ−Ｂ５２０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞（１１−１８）に対して細胞傷害活性を示したが、ＨＬＡ−Ｂ５２⁻ＴＲＧ^＋腫瘍細胞（ＱＧ５６）、ＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ⁻腫瘍細胞（ＬＣ６５Ａ）、およびＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ^＋正常細胞（ＰＨＡ芽球化細胞）に対しては示さなかったことを説明する図である。右図は、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激した胃癌患者（ＳＣ１）の末梢血単核細胞が、ＴＲＧ１−２０（配列番号１）をパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞に対して細胞傷害活性を示したが、当該ペプチドをパルスしていないＳＳ−ＥＢＢ細胞には細胞傷害活性を示さなかったことを説明する図である。 左図はＴＲＧ２−４１（配列番号２）で刺激した肺癌患者（ＬＣ１）の末梢血単核細胞が、ＨＬＡ−Ｂ５２０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞（１１−１８）に対して細胞傷害活性を示したが、ＨＬＡ−Ｂ５２⁻ＴＲＧ^＋腫瘍細胞（ＱＧ５６）、ＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ⁻腫瘍細胞（ＬＣ６５Ａ）、およびＨＬＡ−Ｂ５２^＋ＴＲＧ^＋正常細胞（ＰＨＡ芽球化細胞）に対しては示さなかったことを説明する図である。右図は、ＴＲＧ２−４１（配列番号２）で刺激した肺癌患者（ＬＣ５）の末梢血単核細胞が、ＴＲＧ２−４１（配列番号２）をパルスしたＳＳ−ＥＢＢ細胞に対して細胞傷害活性を示したが、当該ペプチドをパルスしていないＳＳ−ＥＢＢ細胞には細胞傷害活性を示さなかったことを説明する図である。 ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激した大腸癌患者の末梢血単核細胞のＨＬＡ−Ｂ５２０１^＋ＴＲＧ^＋１１−１８細胞に対する細胞傷害活性が、抗ＨＬＡ−Ｂｗ４抗体、抗ＨＬＡ−ＢＣ抗体、抗ＣＤ８抗体、または抗ＨＬＡクラスＩ抗体により阻害されたことを説明する図である。 ＴＲＧ１−２０（配列番号１）がＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に７例のＨＬＡ−Ｂ６２^＋癌患者のうち非小細胞肺癌患者１例（ＬＣ６２−１）、前立腺癌患者１例（Ｐｒｏ６２−２）およびメラノーマ患者１例（Ｍ６２−１）からＣＴＬを誘導したこと、および誘導されたＣＴＬがＨＬＡ−Ｂ１５０１（Ｂ６２）^＋ＡＹ−ＥＢＢ（左図）またはＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋ＴＲＧ^＋膀胱癌細胞株ＨＴ１３７６（右図）を認識してＩＦＮ−γを産生したことを説明する図である。 ＨＬＡ−Ｂ６２^＋前立腺癌患者（Ｐｒｏ６２−２）からＴＲＧ１−２０（配列番号１）により誘導されたＣＴＬが、ＴＲＧ　ｃＤＮＡおよびＨＬＡ−Ｂ１５０１　ｃＤＮＡを共遺伝子導入したＣＯＳ７細胞に反応したが、ＴＲＧ　ｃＤＮＡおよびＨＬＡ−Ｂ５２０１　ｃＤＮＡを共遺伝子導入した細胞には反応しなかったことを説明する図である。 ＴＲＧ１−２０（配列番号１）によりＨＬＡ−Ｂ６２^＋癌患者から誘導されたＣＴＬがＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞（ＨＴ１３７６またはＰＡＣＡ２）には細胞傷害活性を示したが、ＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋ＴＲＧ⁻腫瘍細胞（ＫＩＭ−１）またはＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋ＴＲＧ^＋正常細胞（ＰＨＡ芽球化細胞）には示さなかったことを説明する図である。 ＴＲＧ１−２０（配列番号１）で刺激した前立腺癌患者（Ｐｒｏ６２−２）の末梢血単核細胞のＨＬＡ−Ｂ１５０１^＋ＴＲＧ^＋腫瘍細胞ＨＴ１３７６に対する細胞傷害活性が、抗ＨＬＡ−Ｂｗ６抗体、抗ＨＬＡ−ＢＣ抗体、抗ＣＤ８抗体、または抗ＨＬＡクラスＩ抗体により阻害されたことを説明する図である。 ＴＲＧのｍＲＮＡレベルでの発現をノザンブロッティングにより分析した結果、肺癌細胞株１１−１８では検出されたが、ＣＯＳ７並びに肺癌細胞株ＬＣ６５ＡおよびＬＫ７９では検出されなかったこと説明する図である。 ＴＲＧおよびテスティン遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより検出したときに使用した各プライマーの塩基配列のテスティン遺伝子およびＴＲＧにおける位置、並びにゲノムＤＮＡ、テスティンｍＲＮＡ、およびＴＲＧ　ｍＲＮＡから増幅されるＲＴ−ＰＣＲ産物の予測サイズを説明する図である。 ＴＲＧおよびテスティン遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を説明する図である（レーンＡ：ゲノムＤＮＡ；レーンＢ：テスティンｍＲＮＡ；レーンＣ：ＴＲＧ　ｍＲＮＡ）。

配列表の配列番号１：ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号２：ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド。
配列表の配列番号５：配列番号３に記載のＤＮＡまたは配列番号４に記載のＲＮＡを検出するためのプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号６：配列番号３に記載のＤＮＡまたは配列番号４に記載のＲＮＡを検出するためのプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号７：配列番号３に記載のＤＮＡまたは配列番号４に記載のＲＮＡを検出するためのプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号８：配列番号３に記載のＤＮＡまたは配列番号４に記載のＲＮＡを検出するためのプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号９：配列番号３に記載のＤＮＡまたは配列番号４に記載のＲＮＡを検出するためのプローブ用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号１０：ＨＬＡ−Ｂ５２結合モチーフに適合するアミノ酸配列を有する設計されたペプチド。
配列表の配列番号１１：ＨＬＡ−Ｂ５２結合モチーフに適合するアミノ酸配列を有する設計されたペプチド。
配列表の配列番号１２：ＨＬＡ−Ｂ５２結合モチーフに適合するアミノ酸配列を有する設計されたペプチド。
配列表の配列番号１３：ＨＬＡ−Ｂ５２結合モチーフに適合するアミノ酸配列を有する設計されたペプチド。
配列表の配列番号１４：ＨＬＡ−Ｂ５２結合モチーフに適合するアミノ酸配列を有する設計されたペプチド。
配列表の配列番号１５：ＨＬＡ−Ｂ５２結合モチーフに適合するアミノ酸配列を有する設計されたペプチド。
配列表の配列番号１６：ＨＬＡ−Ｂ５２結合モチーフに適合するアミノ酸配列を有する設計されたペプチド。
配列表の配列番号１７：ＨＬＡ−Ｂ５２結合モチーフに適合するアミノ酸配列を有する設計されたペプチド。
配列表の配列番号１８：ヒト免疫不全ウイルスエンベロプ蛋白質由来ペプチド。
配列表の配列番号１９：インフルエンザ由来ペプチド。
配列表の配列番号２０：テスティン遺伝子の発現を検出するためのプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号２１：テスティン遺伝子の発現を検出するためのプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号２２：β−アクチンの発現を検出するためのプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号２３：β−アクチンの発現を検出するためのプライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列表の配列番号２４：β−アクチンの発現を検出するためのプローブ用に設計されたオリゴヌクレオチド。

Claims (26)

1. 配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
2. 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチド。
3. 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性に、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチド。
4. 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする医薬。
5. 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有してなる癌ワクチン。
6. ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の特異性がＨＬＡ−Ｂ５２および／またはＨＬＡ−Ｂ６２である癌の治療に用いる請求項５に記載の癌ワクチン。
7. 上皮癌の治療に用いる請求項５または６に記載の癌ワクチン。
8. 肺癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌および／またはメラノーマの治療に用いる請求項５または６に記載の癌ワクチン。
9. 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
10. 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
11. 配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫学的に認識する抗体。
12. 配列表の配列番号１若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ｂ５２と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物の同定方法であって、該ペプチド、ＨＬＡ−Ｂ５２陽性細胞およびＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を少なくとも用いることを特徴とする同定方法。
13. 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ｂ６２と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物の同定方法であって、該ペプチド、ＨＬＡ−Ｂ６２陽性細胞およびＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を少なくとも用いることを特徴とする同定方法。
14. 請求項１２または１３に記載の方法により同定された化合物。
15. 配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するＨＬＡ−Ｂ５２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の認識を増強する化合物。
16. 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するＨＬＡ−Ｂ６２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の認識を増強する化合物。
17. 請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド、請求項１１に記載の抗体および請求項１４から１６のいずれか１項に記載の化合物のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物。
18. 請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
19. 配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖。
20. 配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＲＮＡまたはその相補鎖。
21. 配列表の配列番号５から配列番号９のいずれか１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
22. 請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド、請求項１１に記載の抗体、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載のＤＮＡまたは請求項２０に記載のＲＮＡを定量的あるいは定性的に測定する方法。
23. 請求項１９に記載のＤＮＡまたは請求項２０に記載のＲＮＡを定量的あるいは定性的に測定する方法であって、配列表の配列番号５および配列番号６に記載の各塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡまたはＲＮＡの部分塩基配列を増幅し、増幅産物を検出することを含む測定方法。
24. 請求項１９に記載のＤＮＡまたは請求項２０に記載のＲＮＡを定量的あるいは定性的に測定する方法であって、配列表の配列番号７および配列番号８に記載の各塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡまたはＲＮＡの部分塩基配列を増幅し、増幅産物を配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて検出することを含む測定方法。
25. 癌組織あるいは癌細胞における請求項２０に記載のＲＮＡの発現量を測定し、検査することを特徴とする癌の検査方法。
26. 請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド、請求項１１に記載の抗体、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載のＤＮＡ、請求項２０に記載のＲＮＡおよび請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを含んでなる試薬キット。

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