EA008026B1 - Производные от сурвивина пептиды и их применение - Google Patents
Производные от сурвивина пептиды и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA008026B1 EA008026B1 EA200501206A EA200501206A EA008026B1 EA 008026 B1 EA008026 B1 EA 008026B1 EA 200501206 A EA200501206 A EA 200501206A EA 200501206 A EA200501206 A EA 200501206A EA 008026 B1 EA008026 B1 EA 008026B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- peptide
- survivin
- nba
- hla
- cancer
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 462
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 title claims abstract description 248
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 182
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 title claims abstract 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 155
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 149
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 89
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 76
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 70
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 31
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 29
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 28
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 27
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 24
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 23
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 23
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 12
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 11
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 claims description 8
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 claims description 8
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010032218 HLA-A*23 antigen Proteins 0.000 claims 1
- 108010089211 HLA-A*25 antigen Proteins 0.000 claims 1
- 108010080347 HLA-A*26 antigen Proteins 0.000 claims 1
- 108010057606 HLA-B21 antigen Proteins 0.000 claims 1
- 101000896234 Homo sapiens Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Proteins 0.000 claims 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 claims 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000047803 human BIRC5 Human genes 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 66
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 46
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 24
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 217
- 230000004044 response Effects 0.000 description 84
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 25
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 23
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 20
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 18
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 17
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 15
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 14
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 14
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 13
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 108010004141 HLA-B35 Antigen Proteins 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 10
- 108010086377 HLA-A3 Antigen Proteins 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 7
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 7
- 108010036972 HLA-A11 Antigen Proteins 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 7
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108010091938 HLA-B7 Antigen Proteins 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 101150114515 CTBS gene Proteins 0.000 description 4
- 102000007513 Hemoglobin A Human genes 0.000 description 4
- 108010085682 Hemoglobin A Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 101150044181 hem12 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 108010090931 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000013535 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Human genes 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000006710 cytostatic response Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 2
- 108700020831 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100021834 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004152 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000654 Bone morphogenetic protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 2
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- 108010039075 HLA-B8 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 101710120903 Malignant T-cell-amplified sequence 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710186853 Malignant T-cell-amplified sequence 1 homolog Proteins 0.000 description 2
- 108010023335 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 206010027451 Metastases to adrenals Diseases 0.000 description 2
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100034068 Monocarboxylate transporter 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000005969 Uveal melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 2
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- AWNBSWDIOCXWJW-WTOYTKOKSA-N (2r)-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-(2-aminoethylamino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-naphthalen-2-yl-1-oxopropan-2-yl]-n'-hydroxy-2-(2-methylpropyl)butanediamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(=O)NO)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCN)=CC=C21 AWNBSWDIOCXWJW-WTOYTKOKSA-N 0.000 description 1
- FSPGHNOTSORRHO-POCWEVLXSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-amino-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[4-[benzyl-(2-chloroethyldiazenyl)amino]-4-oxobutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)CCC(=O)N(N=NCCCl)CC1=CC=CC=C1 FSPGHNOTSORRHO-POCWEVLXSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UWZOVBMIXFYRIJ-UHFFFAOYSA-N 1h-tetrazol-1-ium;phosphate Chemical compound [NH2+]1C=NN=N1.[NH2+]1C=NN=N1.[NH2+]1C=NN=N1.[O-]P([O-])([O-])=O UWZOVBMIXFYRIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030346 Antigen peptide transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030343 Antigen peptide transporter 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108050003866 Bifunctional ligase/repressor BirA Proteins 0.000 description 1
- 102100033743 Biotin-[acetyl-CoA-carboxylase] ligase Human genes 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229940126074 CDK kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101100277553 Caenorhabditis elegans dep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240606 Caenorhabditis elegans scc-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034770 Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100028005 Cytochrome b-c1 complex subunit 9 Human genes 0.000 description 1
- 101100055841 Danio rerio apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N Doxorubicin hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010002668 HLA-B12 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010021736 HLA-B15 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010091980 HLA-B16 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010013698 HLA-B17 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010075646 HLA-B18 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010061486 HLA-B27 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000012153 HLA-B27 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010014597 HLA-B44 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010058038 HLA-B5 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010075326 HLA-B51 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000945639 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001079630 Homo sapiens Cytochrome b-c1 complex subunit 9 Proteins 0.000 description 1
- 101100395310 Homo sapiens HLA-A gene Proteins 0.000 description 1
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000011202 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 1
- 241001214257 Mene Species 0.000 description 1
- 206010059282 Metastases to central nervous system Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 101100422515 Mus musculus Stk32c gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009421 Myristica fragrans Nutrition 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000218204 Nigella Species 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101800001442 Peptide pr Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710180319 Protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101800000849 Tachykinin-associated peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- WCHSQACWYIQTKL-XPWFQUROSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2r,3r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]([C@@H](O)[C@H]1O)O[C@H]1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 WCHSQACWYIQTKL-XPWFQUROSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- YXVHVBFCVDBUMB-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O YXVHVBFCVDBUMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N alvocidib Chemical compound O[C@@H]1CN(C)CC[C@@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N 0.000 description 1
- 229950010817 alvocidib Drugs 0.000 description 1
- 238000011224 anti-cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 108700000711 bcl-X Proteins 0.000 description 1
- 102000055104 bcl-X Human genes 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- XJMXIWNOKIEIMX-UHFFFAOYSA-N bromo chloro 1h-indol-2-yl phosphate Chemical compound C1=CC=C2NC(OP(=O)(OBr)OCl)=CC2=C1 XJMXIWNOKIEIMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011342 chemoimmunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002875 cyclin dependent kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- YAKWPXVTIGTRJH-UHFFFAOYSA-N fotemustine Chemical compound CCOP(=O)(OCC)C(C)NC(=O)N(CCCl)N=O YAKWPXVTIGTRJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004783 fotemustine Drugs 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000005986 heart dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009033 hematopoietic malignancy Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011141 high resolution liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011293 immunotherapeutic strategy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 201000003445 large cell neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000001115 mace Substances 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 201000002120 neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000002976 reverse transcriptase assay Methods 0.000 description 1
- 102200158977 rs116107386 Human genes 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000005005 sentinel lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 208000037992 stage IV cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011521 systemic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001148—Regulators of development
- A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464448—Regulators of development
- A61K39/46445—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464838—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/57—Skin; melanoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
Abstract
Рестриктированные по МНС классу I производные опухолеассоциированного антигена - сурвивина, которые способны связываться с молекулами HLA класса I при высокой аффинности, способны элиситировать INF-γ-продуцирующие клетки в популяции PBL пациентов, страдающих раком, и способны к in situ обнаружению цитотоксических Т-клеток в опухолевой ткани, терапевтическая и диагностическая композиция, включающая пептид, и ее применение.
Description
Область изобретения
Данное изобретение касается новых пептидов - производных сурвивина и их применения для диагностики и лечения, в особенности, рака. В частности, новые пептиды являются рестриктированными по МНС (главному комплексу гистосовместимости человека) класса I эпитопами Т-клеток, способными элиситировать цитотоксические Т-клеточные ответы у пациентов, больных раком, включая ответы ίη δίΐιι и ех νίνο. В частности, такие новые пептиды являются производными от ингибитора апоптоза - белка сурвивина, распознаваемого опухолеассоциированного антигена (ТАА).
Уровень техники
Процесс распознавания и реагирования иммунной системы млекопитающих на внешние или чужеродные вещества является сложным процессом. Важный аспект системы - Т-клеточный ответ. Для этого ответа необходимо, чтобы Т-клетки распознавали и взаимодействовали с комплексами молекул клеточной поверхности, которые называются лейкоцитарными антигенами человека (НЬА), образующими МНС, и пептидов. Пептиды являются производными от более крупных молекул, которые вырабатываются клетками, а также представляют НЬА/МНС молекулу. Взаимодействие Т-клеток и комплексов НЬА/пептид является ограниченным, Т-клетка должна быть специфической для определенной комбинации НЬА молекулы и пептида. Если специфическая Т-клетка отсутствует, то Т-клеточный ответ не произойдет, даже если присутствует указанный комплекс. Аналогичным образом, иммунный ответ не будет развиваться, если Т-клетка присутствует, а специфический комплекс отсутствует.
Механизм распознавания Т-клетками клеточных отклонений вовлечен в процесс ракообразования. Например, в XVО 92/20356 раскрыто семейство генов, продуктами которых являются пептиды, что, в свою очередь, экспрессируются на поверхностях клеток, и могут приводить к лизису раковых клеток специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами (СТЬ). Эти гены, известные как семейство меланомных антигенов (МАСЕ), кодируют молекулы предшественников антигена отторжения опухоли или ТКАР и производные от них пептиды, известные как антигены отторжения опухоли или ТКА.
В νθ 94/05304 описаны нонапептиды, которые связываются с молекулой НЬА-А1. В ссылке показано, что данная известная специфичность пептидов к определенным НЬА молекулам проявляется в том, что специфический пептид связывается только с определенным НЬА. Это важно, потому что различные индивиды обладают различными НЬА фенотипами. В результате, несмотря на то, что идентификация специфического пептида, как партнера для определенного НЬА, имеет диагностическое и терапевтическое значение, это приемлемо только для индивидов с определенным НЬА фенотипом.
Охарактеризовано несколько пептидов, представленных молекулами МНС, и обнаружено, что некоторые из них могут нести посттрансляционные модификации, которые, возможно, способны воздействовать на функциональные возможности комплекса НЬА/пептид. Таким образом, множество исследований связывают изменения в характере фосфорилирования со злокачественным превращением. Кроме того, показано, что фосфорилирование может не влиять или оказывать отрицательный, или даже положительный эффект на связывание пептида с МНС класса I, и, что может быть получен фосфопептидспецифический СТЬ, различающий фосфорилированные и не фосфорилированные версии пептида, и такие СТЬ, наиболее вероятно, являются частью репертуара СТЬ, рестриктированных по МНС класса I. Ранее показано, что фосфорилированные пептиды действительно преобразованы естественным путем и представлены молекулами МНС класса I ίη νίνο. К тому же, было установлено наличие фосфорилированных пептидов в экстрактах изолированных молекул класса I от нескольких различных ЕВУ (вирус Эпштейна-Барра)-трансформированных В-клеток.
Таким образом, четко установлено, что пептидные эпитопы, производные от опухолеассоциированных антигенов (ТАА), могут быть распознаны как антигены цитотоксическими Т-лимфоцитами (СТЬ) в составе МНС (1). Однако, достоверно известно, что не все опухоли являются антигенными, только немногие из них действительно иммуногенные, т. е. полностью контролируются иммунной системой.
Чтобы преодолеть это ограничение, были начаты несколько иммуннотерапевтических исследований, например, вакцинация пептидами - производными ТАА. При меланоме, когда было охарактеризовано наибольшее число СТЬ-типированных ТАА, вакцинация вызвала мощные ответы СТЬ на антигены, и некоторые пациенты испытали полную ремиссию заболевания (2, 3). Однако большинство пептидных эпитопов, используемых в этих опытах с вакцинацией, являются меланоцит специфическими, и эти пептиды не могут быть применены для опухолей немеланоцитной природы. Кроме того, экспрессия этих ТАА является гетерогенной у опухолей различных пациентов и может меняться в метастазах даже одного пациента. Однако в течение нескольких последних лет было идентифицировано множество специфических опухолевых пептидных антигенов, которые экспрессируются при различных формах рака, например НЕК-2 (4), Мис-1 (5) и теломераза (6).
Также показано, что соответствующим образом опухолевые антигены, присутствующие в опухолях, могут контактировать с иммунной системой. Исследования показали, что СЭ8+ СТЬ ветвь иммунного ответа, одна или в комбинации с СЭ4+ Ть-клетками, составляет первичную антиопухолевую эффекторную ветвь адаптивного иммунного ответа. До настоящего времени внимание, главным образом, было направлено на СТЬ ветвь иммунного ответа. Однако выясняется, что ответ СЭ4 Т-клетки играет существенную роль в отторжении опухоли, особенно на стадии индукции или при распространении СТЬ ответа
- 1 008026 ίη νίνο. Следовательно, включение опухолевых антигенов, рестриктированных по классу II, в схемы эффективных противоопухолевых вакцинаций могло бы увеличить эффективность вакцинации.
Апоптоз - генетическая программа клеточной смерти, и предполагают, что ингибирование апоптоза является важным механизмом при ракообразовании, заключающимся в продлении продолжительности жизни клеток, склонных к накоплению трансформирующих мутаций (7). Сурвивин не так давно идентифицирован как член семейства белков - ингибиторов апоптоза (ΙΑΡ). Общим анализом экспрессии гена проверено приблизительно 4 миллиона транскрипций, сурвивин был определен как один из главных генов, который неизменно активируется при многих формах рака, но не выявляется в нормальной ткани (8). Солидная злокачественная опухоль, при которой оверхэкспрессируется сурвивин, включает рак легкого, толстого кишечника, молочной железы, поджелудочной железы и простаты, а так же и злокачественную опухоль кроветворных органов (9). К тому же, меланомные и немеланомные формы рака кожи, как сообщается, были неизменно сурвивин позитивными (10, 11). Оверхекспрессия сурвивина при большинстве форм рака человека предполагает общее ингибирование апоптоза при прогрессировании опухоли. Существует обоснованное наблюдением мнение, что при раке ободочной и прямой кишки, мочевого пузыря и нейробластомы экспрессия сурвивина связана с неблагоприятным прогнозом. Напротив, сурвивин не выявляется в нормальных взрослых тканях. Это характеризует сурвивин как приемлемый ТАА и для диагностических и терапевтических целей.
Таким образом, на протяжении последнего десятилетия идентифицировано большое количество ТАА, распознавание которых СТЬ ограничено наличием комплекса антигенов гистосовместимости (МНС). Так как сурвивин оверхэкпрессирован при большинстве форм рака человека, и ингибирование его функции приводит к усилению апоптоза, этот белок может служить мишенью для терапевтических ответов СТЬ. Сурвивин - белок, потенциальное диагностическое и терапевтическое применение которого раскрыто в (8) и патенте США 6245523, включенных в данное описание в виде ссылки. Сурвивин является цитоплазматическим белком (16,5 кДа), содержащим одиночный ΒΙΚ (адаптерный домен) и высоко заряженную карбоксильную концевую спиральную область вместо пальцеобразной области кольцевого типа, который ингибирует апоптоз, вызванный изъятием фактора роста (1Ь-3), если перенесен в предшественники В-клеток. Ген, кодирующий сурвивин, почти идентичен последовательности рецептора-1 Протеазы Эффекторной Клетки (ΕΡΚ-1), но ориентирован в противоположном направлении. Таким образом, предполагается существование двух отдельных генов, дуплицированных в конфигурации голова к голове. Соответственно, сурвивин может быть описан как продукт антисмысловой последовательности ΕΡΚ-1. Таким образом, ингибирование экспрессии сурвивина путем активирования его природного антисмыслового ΕΡΚ-1 транскрипта приводит к массовому апоптозу и уменьшению роста клеток.
Патент США 6245523 представляет получение очищенного сурвивина, нуклеиново-кислотные молекулы, кодирующие белок сурвивин, антитела и другие молекулы, которые связаны с сурвивином. Патент США 6245523 также раскрывает аниапоптозные активные фрагменты сурвивина и его модификации, где аминокислотный остаток был вставлен на Ν- или С-конце или внутри описанной последовательности сурвивина. В частности описано, что такие пептиды должны содержать ключевые функциональные остатки, необходимые для апоптоза, например, Тгр в положении 67, Ρτο в положении 73 и Суз в положении 84.
Данное изобретение основывается на открытии того, что пептиды, рестриктированные по МНС класса I, могут быть производными от белка сурвивина, являются способными к связыванию с НЬА МНС класса I и, таким образом, к элиситированию и ех νίνο и ίη зйи иммунных ответов СТЬ у пациентов, страдающих раком с широким диапазоном форм. Эти открытия наводят на мысль, что сурвивин действует как молекула ΤΚΑΡ, которая преобразуется клетками в пептиды, обладающими активностью ТКА. Очевидно, эти результаты открывают путь для новых терапевтических и диагностических методов, которые являются общеприменимыми при контроле рака, вследствие того, что, по-видимому, сурвивин экспрессируется во всех случаях опухолевыми клетками.
Краткое изложение изобретения
Согласно первому аспекту данное изобретение касается эпитопа пептида, рестриктированного по МНС класса I, производного от сурвивина, указанный эпитоп обладает по меньшей мере одной из следующих особенностей:
(ί) способность к связыванию с молекулой НЬА класса I, по которой он рестриктирован, при аффинности, измеряемой как половина максимально возможного количества связанных молекул НЬА класса I (значение С50), что составляет, максимум, 50 рМ, как определено анализом структурных связей, описанным здесь, (ίί) способность к элиситированию ΓΝΕ-у-продуцирующих (интерферон-у-продуцирующих) клеток в популяции периферических лимфоцитов крови (ТВЬ) у пациента, больного раком, при частоте по меньшей мере 1 на 104 ГВЬ. как определено иммуноферментным спот-анализом (ЕМБЬОТ), и/или (ίίί) способность к ίη зйи обнаружению в опухолевой ткани СТЬ, которые взаимодействуют с эпитопным пептидом.
Предпочтительно пептид по данному изобретению обладает по меньшей мере двумя, наиболее
- 2 008026 предпочтительно всеми тремя этими особенностями.
Дальнейшие аспекты данного изобретения представляют фармацевтическую композицию и композицию для ех νίνο или ίη Μΐι.ι диагностирования наличия у пациента, больного раком, сурвивинактивных Т-клеток среди РВЬ или в опухолевой ткани, данная композиция включает пептид, как указано выше.
В следующих аспектах данное изобретение касается диагностического набора для ех νίνο или ίη 8Йи диагностирования наличия у пациента, больного раком, сурвивин активных Т-клеток среди РВЬ или в опухолевой ткани, данный набор включает пептид по изобретению и комплекс такого пептида и молекулы НЬЛ класса I или фрагмент такой молекулы.
В другом аспекте также представлен способ выявления у пациента, больного раком, сурвивин реактивных Т-клеток, способ включает контактирование опухолевой ткани или образца крови с комплексом, определенным выше, и определение связывания комплекса с клетками ткани или крови.
Следующие аспекты данного изобретения касаются молекулы, которая способна к специфичному связыванию с пептидом по изобретению, таким как антитело или его фрагмент, а также касаются молекулы, способной блокировать связывание вышеуказанной молекулы.
Важным аспектом данного изобретения является применения пептидов по изобретению для изготовления лекарственного препарата для лечения рака. Дальнейший аспект касается применения композиции или молекулы, как упомянуто выше, для изготовления лекарственного препарата для лечения рака.
Дальнейшие аспекты касаются способа лечения рака у млекопитающего, такого как человек, включая введение пациенту, страдающему от болезни, эффективного количества пептида, композиции или молекулы по изобретению.
Детальное описание изобретения
Новый пептид по изобретению, рестриктированный по классу I МНС, характеризуется наличием по меньшей мере одной из нескольких особенностей. Одной из особенностей является способность к связыванию с молекулой НЬЛ класса I, по которой он рестриктирован, при аффинности, измеряемой как половина максимально возможного количества связанных молекул класса I НЬЛ (значение С50), как определено анализом структурных связей, описанным здесь, что составляет, максимум, 50 цМ. Этот анализ структурных связей выполняли, как ранее описано (12, 13), анализ базируется на стабилизации молекулы НЬЛ после загрузки пептида к линии клеток Т2, в которых отсутствует переносчик пептидов. Затем правильно свернутые крупные цепочки стабильного НЬЛ иммунопреципитируют с использованием конформационно-зависимых антител и проводят количественный анализ пептидных связей.
Этот опыт представляет простой способ обследования кандидатных пептидов по их способности связаться с данным аллелем НЬЛ при вышеупомянутой аффинности. В предпочтительных вариантах осуществления пептид по изобретению имеет значение С50, составляющее, самое большее, 30 цМ, например значение С50, составляющее, самое большее, 20 цМ, включая значение С50, составляющее, самое большее, 10 цМ, самое большее, 5 цМ и, самое большее, 2 цМ.
Как упомянуто выше, НЬЛ система представляет систему главного комплекса гистосовместимости человека (МНС). Обычно, МНС системы контролируют ряд характеристик: антигены трансплантации, тимус зависимые иммунные ответы, некоторые комплементы и предрасположенность к некоторым болезням. Более детально, МНС кодирует три различных типа молекул, например, молекулы класса I, II и III, которые шире характеризуют МНС. Из них молекулы класса I, так называемые НЬЛ-Л, НЬЛ-В и НЬА-С молекулы, представлены на поверхности большинства клеток, имеющих ядро, и тромбоцитов.
Пептиды по данному изобретению характеризуются их способностью связываться (будучи рестриктированными) со специфической молекулой класса I МНС НЬА. Таким образом, в данном варианте осуществления пептид является рестриктированным по молекуле НЬА-А МНС класса I, включая НБА-А1, НБА-А2, НБА-А3, НБА-А9, НБА-А10, НБА-А11, НЬА-АмТ9, НБА-А23 (9), 111.А-А24 (9), 111.А-А25 (10), Н1.А-А26 (10), НБА-А28, 111.А-А29 (^19), НБА-А30 (^19), НБА-А31 (^19), НБА-А32 (^19), НЬА-А^33 (^19), НЬА-А^34 (10), НЬА-А^36, НЬА-АмД3, НЬА-А^66 (10), НЬА-А^68 (28), 111.А-А69 (28). В литературе также применяются упрощенные обозначения, где используется только первое числовое обозначение, например, НБА-А19 или НБА-А24, вместо НЬА-А^19 и НБА-А24 (9), соответственно. В специфических вариантах осуществления пептид по изобретению рестриктирован по видам НЬА МНС класса I, выбранным из группы, состоящей из НБА-А1, НБА-А2, НБА-А3, НБА-А11 и НБА-А24.
Пептиды по изобретению получены из известной последовательности сурвивина, например последовательности, описанной в патенте США 6245523. Отбор пептидов, потенциально имеющих способность связываться со специфической молекулой НЬА, может быть осуществлен сравнительным анализом первичной структуры известных последовательностей, которые связываются с данной специфической молекулой НЬА, чтобы таким образом показать преобладание нескольких соотнесенных аминокислот в определенных положениях пептидов. Такие преобладающие аминокислотные остатки также упоминаются здесь как якорные остатки или мотивы якорных остатков. Такой относительно простой способ основывается на данных известной последовательности, которые могут быть получены из доступных баз данных, пептиды могут быть производными молекулы белка сурвивина, которые, вероятно, связываются со специфической молекулой НЬА. Типичные примеры данных таких анализов для ряда молекул НЬА
- 3 008026 приведены в таблице ниже.
| Аллель НЬА | Положение 1 | Положение 2 | Положение 3 | Положение 5 | Положение 6 | Положение 7 | С-конец |
| НЬА-ΑΙ | Т,8 | ϋ,Ε | Ь | Υ | |||
| НБА-А2 | Ь,М | V | ЬУ | ||||
| НЬА-АЗ | ЬУ,М | Ε,Υ | Κ,Υ,Ρ | ||||
| НЬА-ΑΙ1 | ν,Ι,Ε,Υ | М,Ь,РД | к,в. | ||||
| НБА-А23 | ι,υ | У/Д | |||||
| НБА-А24 | Υ | ι,ν | Р | 1,Ь,Р | |||
| НЬА-А25 | Μ,Α,Τ | I | XV | ||||
| НБА-А26 | ЕД) | УТД,Ь,Р | 1,ЬУ | Υ,Ρ | |||
| НБА-А28 | ЕД) | У,А,Ь | А,В | ||||
| НБА-А29 | Ε | ΥΛ | |||||
| НЬА-АЗО | у,ь,ру | Υ | |||||
| НЬА-А31 | Ь,М,Р,У | в. | |||||
| НЬА-А32 | 1,Ь | ||||||
| НЬА-АЗЗ | уд,ьу | в | |||||
| НЕА-А34 | УЬ | в | |||||
| НЬА-Абб | ЕД) | ту | в,к | ||||
| НБА-А68 | ЕД) | τ,ν | в,к | ||||
| НЕА-А69 | ν,Τ,Α | УЬ | |||||
| НБА-А74 | Τ | УЬ | |||||
| НБА-В5 | Α,Ρ | Ρ,γ | 1,Ь | ||||
| НБА-В7 | Ρ | ь,р | |||||
| НБА-В8 | к | К,В | ь | ||||
| НБА-В14 | Β,Κ | ьу | |||||
| НЬА-ΒΙ 5 (В62) | ζ>,Σ,Κ,Ρ,Η, ν,ι,Μ,δ,τ | Ρ,Υ,^ν | |||||
| НБА-В17 | ьу | ||||||
| НБА-В27 | В | У,К,Р,Ь |
- 4 008026
| ΗΕΑ-Β35 | Р | Ι,Ε,Μ,Υ | |||||
| НБА-В37 | ϋ,Ε | Ι,Ε,Μ | |||||
| НБА-В38 | Н | ϋ,Ε | Ε,Ε | ||||
| НБА-В39 | К,Н | Б,Р | |||||
| ΗΕΑ-Β40 (В60,61) | Е | Ε,Ι,ν | Ε,ν,Α,λΥ, Μ,Τ,Κ | ||||
| НБА-В42 | ь,р | ΥΛ | |||||
| НБА-В44 | Е | Ρ,Υ,λΥ | |||||
| НБА-В46 | Μ,Ι,Ε,ν | Υ,Ρ | |||||
| НБА-В48 | Ω,κ | Ε | |||||
| НБА-В51 | Α,ρ,σ | ρ,γ,ι,ν | |||||
| НБА-В52 | Ω | Ρ,γ | Ι,ν | ||||
| НБА-В53 | Р | λν,Ρ,Ε | |||||
| НБА-В54 | Р | ||||||
| НБА-В55 | Р | Α,ν | |||||
| НБА-В56 | Р | Α,ν | |||||
| НБА-В57 | Α,Τ,δ | ρ,\ν,γ | |||||
| НБА-В58 | Α,Τ,δ | ρ,λν,γ | |||||
| ΗΕΑ-Β67 | Р | Б | |||||
| НБА-В73 | к | Ρ | |||||
| НБА-Сл¥1 | А,Б | Б | |||||
| НБА-Су/2 | А,Б | Ρ,Υ | |||||
| НЬА-С\уЗ | А,Е | Б,М | |||||
| НБА-С«/4 | Υ,Ρ,Ρ | Ε,Μ,Ρ,Υ | |||||
| НБА-Сдуб | Υ | Ρ,Υ,Ρ,Υ | |||||
| НБА-Слу8 | Υ | Б,1 | |||||
| нба- С\у16 | А,Б | Б,У |
Таким образом, например, нонапептиды, потенциально обладающие способностью связываться с НБА-А1, имеют одну из следующих последовательностей: Хаа-Т-Б-Хаа-Хаа-Хаа-Б-Хаа-У, Хаа-Т-Е-ХааХаа-Хаа-Б-Хаа-У, Хаа-8-Б-Хаа-Хаа-Хаа-к-Хаа-У или Хаа-8-Е-Хаа-Хаа-Хаа-Б-Хаа-У (Хаа обозначает какой-либо остаток аминокислоты). Таким же образом можно изобразить последовательности, потенциально имеющие способность связываться с любой другой молекулой НБА.
Будет оценено то, что специалист в этой области сможет в дальнейшем идентифицировать мотивы якорных остатков для данной молекулы НБЛ.
Таким образом, в практических вариантах осуществления пептиды по изобретению включают пептиды, последовательности которых содержат в каждом специфическом НБЛ аллеле, внесенном в таблицу, любой из аминокислотных остатков, внесенный в таблицу.
Таким образом, простой подход к идентифицированию пептидов по изобретению включает следующие этапы: отбор специфической молекулы НБЛ, например, встречающейся с высокой частотой в данной популяции, выполнение сравнительного анализа первичной структуры, как описано выше, для выявления мотивов якорных остатков в белке сурвивине, выделение или построение пептидов подходящего размера, которые включают один или больше выявленных якорных остатков, и тестирование полученных пептидов по (1) способности связывания со специфической молекулой НБЛ, с использованием анализа
- 5 008026 структурных связей, как описано здесь, (ίί) способности пептидов элиситировать ΙΝΕ-γ-продуцирующие клетки в популяции РВЬ у пациента, больного раком, при частоте по меньшей мере 1 на 104 РВЬ, как определено ЕЫ8РОТ анализом, описанным здесь, и/или (ίίί) способность пептидов обнаруживать ίη δίΐιι СТЬ в опухолевой ткани, которые взаимодействуют с тестируемыми эпитопными пептидами.
В специфических вариантах осуществления пептидом по изобретению является производный от сурвивина пептид, рестриктированный по ΗΕΆ-Ά2, имеющий последовательность, выбранную из ЕРКЕВКЕКА (сурвивин101-109) ( + +) ГО Νο: 1), ТРРРАА'ОРЕР (сурвивин5-14) (5ЕО ГО Νο: 2), ЕЬТЬОЕЕЬКЬ (сурвивин95-104) (5ЕО ГО Νο: 3), ЬЬЬОЕЕЬКЬ (5ЕО ГО Νο: 4) и ЬМЬОЕЕЬКЬ (5ЕО ГО Νο: 5). (Обозначение в скобках указывают на положения остатков в белке сурвивине, как описано в патенте США 6245523). ЕЕЕОЕРЬКЕ (5ЕО ГО Νο: 4) является последовательностью, производной от сурвивин96104 заменой Т в положении 2 пептида на Ь, и ЬМЕОЕРЬКЕ (5ЕО ГО Νο: 5) является последовательностью, производной от сурвивин96-104 заменой Т в положении 2 пептида на М.
В следующих практических вариантах осуществления пептид по изобретению является пептидом, рестриктированным по молекуле МНС НЬА-В класса Ι, включая НЬА-В5, НЬА-В7, НЬА-В8, НЬА-В12, НБА-В13, НБА-В14, НЬА-В15, НЬА-В16, НЬА-В17, НЬА-В18, НБА-В21, Н1.А-В\\22. НЬА-В27, НЬАВ35, НБА-В37, НБА-В38, НЬА-В39, НЬА-В40, НЬА-Вм41, НЬА-Вм42, НЬА-В44, НЬА-В45, НРА-Вм46 и НЬА-В^47. В специфических вариантах осуществления виды НЬА-В МНС класса Ι, с которыми способен связываться пептид по изобретению, выбраны из НЬА-В7, НЬА-В35, НЬА-В44, НЬА-В8, НЬАВ15, НБА-В27 и НБА-В51.
В специфических вариантах осуществления пептид по изобретению является производным сурвивина, рестриктированным по НЬА-В35, имеющим последовательность, выбранную из СРТЕНЕРЬЬ (сурвивин46-54) (5ЕО ΙΌ Νο: 6), ЕРОВАОСВВ (сурвивин51-59) (5ЕО ГО Νο: 7), СРТЕХЕРОУ (5Е+) ГО Νο: 8) и ЕРЬЬАОСЕУ (5ЕО ГО Νο: 9). (Обозначения в скобках указывают положения остатков в белке сурвивине как описано в патенте США 6245523). СРТЕХЕРЬУ (5ЕО ГО Νο: 8) является последовательностью, производной от сурвивин46-54 заменой Ь на С-конце пептида на Υ, и ЕРОЬАОС+Υ (5ЕО ГО Νο: 9) является последовательностью, производной от сурвивин51-59 заменой Е остатка на С-конце 2 на Υ.
В дальнейших специфических вариантах осуществления пептид по изобретению является рестриктированным по НЬА-А1 пептидом с последовательностью, выбранной из сурвивин38-46 (5ιιγ38Υ9) (С заменен на Υ в Р9, МАЕА6ЕIΗΥ) (5ЕО ГО Νο: 38), сурвивин47-56 (§ι.ιγ47Υ 10) (О заменен на Υ в Р10, Р'1+У+Р1)РАУ (5Е+) ГО Νο: 39)), сурвивин92-101 (5иг92-101) (ОЕР+РТРС+Е) (5Е+) ГО Νο: 27) и сурвивин93-101 (8ит93Т2) (Е заменен на Т в Р2, ЕТЕЬТЬОЕЕ (5ЕО ГО Νο: 36)). Пептид по изобретению может также быть рестриктированным по НЬА-А3, таким как сурвивин18-24 (8ит18К10) (Е заменен на К в Р10, КЬНЕКШУРК. (5ЕО ГО Νο: 57), и/или рестриктированным по НЬА-А11, таким как сурвивин53-62 (8ит5362) ГОБАОСЕЕСЕК) (5ЕО ГО Νο: 45), и/или рестриктированным по НЬА-А2, таким как сурвивин18-28 (8ит18-28) (ККТЕКН^РЕЪ) ( + +) ГО Νο: 66).
В следующих практических вариантах осуществления пептид по изобретению является пептидом, рестриктированным по молекуле НЬА-С МНС класса Ι, включая НЬА-С^1, НЬА-С^2, НЬА-С^3, НЬАСм4, НЬА-С^5, НРА-См6, НЬА-СмЛ и НРА-См16.
Предпочтительно, пептид по изобретению включает менее чем 50 аминокислотных остатков, и, более предпочтительно, включает, самое большее, 20 аминокислотных остатков, например, самое большее, 10 аминокислотных остатков. В специфических вариантах осуществления пептид является гептапептидом, октопептидом, нонапептидом, декапептидом или андекапептидом.
Пептид по изобретению, как упомянуто выше, является производным от белка сурвивина или его фрагментом. Белок сурвивин, из которого может быть получен пептид, является белком каких-либо видов животных, у которых этот белок экспрессирован. В предпочтительных вариантах осуществления стартовый белок сурвивин является белком млекопитающих, включая виды грызунов, кролика и приматов, таких как человек. На основании последовательности выбранного белка сурвивина пептид по изобретению получают любым приемлемым химическим или ферментативным способом из стартового материала сурвивина, в результате получают пептид нужного размера, как описано выше, или синтезируют каким-либо традиционным способом, известным специалисту данной области.
Пептид по изобретению может иметь последовательность, которая является естественной последовательностью белка сурвивина, от которого пептид получен. Однако пептиды, имеющие более высокую аффинность к какой-либо данной молекуле НЬА, могут быть получены из такой естественной последовательности, путем модификации последовательности заменой, удалением или добавлением по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например способом, описанным выше, с помощью которого идентифицировали мотивы якорных остатков.
Соответственно, чтобы увеличить иммуногенность пептидов, производных сурвивина, для усиления связи пептида с молекулой НЬА класса Ι аминокислотные замещения произвели в якорных положениях, а не в контактирующих сегментах ТОК. (антиген распознающий рецептор Т-клеток). В результате получили более иммуногенные эпитопы, например, усилилась способность индуцировать СТЬ, реагирующие с раковыми клетками, и более приемлемым образом была продемонстрирована индукция клинически значимых СТЬ ответов. Тем не менее, важен тот факт, что раковые клетки-мишени экспресси
- 6 008026 руют и представляют только естественный пептид, производный сурвивина, на поверхности клетки. В этом отношении, принципиально важно, что индуцированные терапевтическим путем СТЬ, специфические для модифицированных пептидов, производных сурвивина, дают перекрестную реакцию с родственными аналогами.
Данное изобретение также охватывает варианты и функциональные эквиваленты пептидов, производных сурвивина, как описано здесь. Функциональные эквиваленты в данном контексте определяются посредством ссылки как соответствующие выполняемые функции предетерминированного фрагмента рассматриваемой последовательности. Функциональная эквивалентность может быть установлена, например, сходными аффинностями связей с молекулами НЬЛ класса I, или сходной силой, измеренной ЕЫБРОТ анализом.
Функциональные эквиваленты или варианты пептида, производного сурвивина, как описано здесь, подразумевают аминокислотные последовательности, немного отличающиеся от предпочтительных, предетерминированных последовательностей, как числом, так и размером вставок, удалений и замещений, включая консервативные замещения, прибавления. Это различие измерили как уменьшение гомологичности между предпочтительной, предетерминированной последовательностью и вариантом, производным сурвивина, или функциональным эквивалентом, производным сурвивина.
Гомологичность аминокислотных последовательностей можно рассчитать с помощью известных в данной области алгоритмов. Фрагменты, гомологичные фрагментам, включающим или состоящим из последовательных аминокислотных остатков, производных сурвивина, можно рассматривать как находящиеся в рамках данного изобретения, если они являются предпочтительно гомологичными предетерминированному пептиду, производному сурвивина по меньшей мере на приблизительно 90%, например, по меньшей мере на 94%, включая 95, 96, 97, 98 или 99%.
Кроме того, может быть эффективным выполнение посттрансляционной модификации пептидов по изобретению. Показано, что воздействие лекарственных препаратов, включая адриамицин, таксол, или ультрафиолетового облучения на клетки карциномы молочной железы МСЕ-7 или карциномы шейки матки НеЬа приводит к увеличению экспрессии сурвивина в 4-5 раз. Изменения в уровнях сурвивина после лечения рака не вызвали модуляцию экспрессии мРНК сурвивина и не зависели от транскрипции гена бе ηονο. Наоборот, ингибирование фосфорилирования сурвивина на ТЬг34 ингибитором циклинзависимой киназы флавопиридолом привело к потере экспрессии сурвивина, и нефосфорилированный сурвивин Т11Г34 - А1а продемонстрировал более быстрый процесс апоптической элиминации по сравнению с диким типом сурвивина. Последовательная абляция фосфорилирования сурвивина на ТЬг34 увеличивало апоптоз опухолевых клеток, индуцированный антираковыми лекарственными препаратами независимо от р53 и подавило рост опухоли без токсичности в ксенотрансплантатной модели ίη νίνο рака молочной железы. Эти данные наводят на мысль, что фосфорилирование на ТЬг34 критически регулирует уровни сурвивина в клетках опухоли, и что последовательная абляция активности р34сбс2 киназы может удалить сурвивиновый контроль жизнеспособности и увеличить апоптоз в клетках опухоли.
Предполагается, что пептиды, производные сурвивина, по изобретению охватывают фосфорилированные пептиды. Нативные сурвивин фосфопептидные антигены можно идентифицировать при обследовании на присутствие мотивов, пептидов, связанных с МНС, в пределах сайта фосфорилирования ТЬг34. Таким образом, возможные последовательности сурвивин-производного фосфопептида включают ТРЕВМАЕАСЕ, предполагаемый рестриктированный по НЬА-В35 и/или НБА-В7 и/или НБА-В51 пептидный антиген. Дополнительные нативные фосфопептиды, упомянутые здесь, включают: НБА-А2: САСТРЕВМА и СТРЕВМАЕА; НБА-А3: ЕЬЕССАСТР; НЬА-В7/НЬА-В35/НЬА-В51:^РЕЪЕССАСТ (Фосфорилированный ТЬг остаток выделен жирным шрифтом).
Существенной особенностью пептида по изобретению является его способность распознавать или элиситировать ΙΝΕ-γ-продуцирующие Т-клетки-респондеры, т.е. цитотоксические Т-клетки (СТЬ), которые специфически распознают специфический пептид в РВЬ популяции или клетках опухоли (клеткахмишенях) пациента, больного раком. Эту активность легко определили с помощью ЕБ1БРОТ анализа РВЬ или клеток опухоли пациента, как описано в ссылке (16) и в последующих примерах. Является эффективным предварительное стимулирование анализируемой популяции РВЬ или клеток опухоли тестируемым пептидом. Предпочтительно, чтобы пептид был способен к элиситированию или распознаванию ΙΝΕ-γ-продуцирующих Т-клеток при частоте по меньшей мере 1 на 104 РВЬ, как определено ЕБ1БРОТ анализом, применяемым здесь. Более предпочтительно, чтобы частота составляла по меньшей мере 5 на 104 РВЬ, наиболее предпочтительно по меньшей мере 10 на 104 РВЬ, например по меньшей мере 50 или 100 на 104 РВЬ.
ЕБ1БРОТ анализ представляет собой надежный инструмент исследования сурвивин пептид специфического Т-клеточного ответа. Однако, хотя показано, что реакционная способность ЕБ1БРОТ в большинстве случаев кореллирует со способностью хронической лимфоцитной лейкемии (СЕТ) лизировать клетки-мишени. Можно привести явное убедительное доказательство этого утверждения. Прямое доказательство представлено (см. пример 2) тем, что сурвивин активные клетки, выделенные с помощью комплексов НЬА/пептид, обладают функциональной способностью лизировать клетки-мишени. К тому
- 7 008026 же продемонстрировано, что изолированные СТЬ, специфически распознающие пептид по изобретению, способны лизировать сингенные по НЬЛ клетки опухоли различной природы, например меланомы и рака молочной железы. Этот результат убедительно говорит о том, что раковые клетки участвуют в общем процессе и представляют собой тот же самый эндогенный сурвивин пептид. Поэтому, главное значение результатов заключается в том, что пептиды по изобретению являются экспрессированными и сопряженными с молекулами НЬЛ в различных раковых клетках различного гистологического происхождения. Это делает раковые клетки восприимчивыми к разрушению СТЬ и подтверждает потенциальную пригодность сурвивина в иммунизации для контроля роста различных новообразований. Наличие спонтанных СТЬ-ответов в РВЬ и клетках опухоли эпитопов пептидов, производных сурвивина, рестриктированных по НЬЛ, у пациентов, страдающих тремя несвязанными между собой формами рака, т.е. раком молочной железы, меланомой и СЬЬ, также доказывает универсальный иммунотерапевтический потенциал этого опухолевого антигена.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, пептид по изобретению способен к элиситированию ΙΝΡ-γ-продуцирующих клеток в РВЬ популяции пациента, больного раком, где сурвивин экспрессирован, включая злокачественное новообразование кроветворных органов, хроническую лимфацитную лейкемию и хроническую миелоидную лейкемию, меланому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы и рак простаты. В частности, пептид по изобретению способен элиситировать иммунный ответ в форме Т-клетки, обладающей цитотоксической активностью к линии раковых клеток, экспрессирующих сурвивин, включая выбранную из линии клеток рака молочной железы МСР-7 и линии клеток меланомы РМЗ.
В дополнение к способности элиситировать иммунные ответы в популяциях РВЬ и линиях раковых клеток было показано, что пептиды по изобретению также способны к элиситированию цитолитических иммунных ответов ίη 8Йи, т.е. в тканях солидных опухолей. Это было показано с помощью комплексов НЬЛ/пептид, взаимодействующих с эпитопом пептида по изобретению, которые, например, мультимеризированы, мечены и иммуногистохимически окрашены, для обнаружения СТЬ в опухолевой ткани. Соответственно, следующая существенная особенность пептида по изобретению заключается в том, что он является способным к ίη δίΐιι определению СТЬ в опухолевой ткани, которые взаимодействуют с эпитопом пептида.
Предполагается, что пептиды по изобретению, дополнительно к их способности связываться с молекулами НЬЛ, что приводит к образованию комплексов НЬЛ и пептидов на поверхностях клеток, причем комплексы, в свою очередь, действуют как эпитопы или мишени для цитолитических Т-клеток, могут элиситировать другие типы иммунных ответов, такие как В-клеточные ответы, приводящие к выработке антител против комплексов и/или реакции гиперчувствительности замедленного типа (ЭТИ). Последний тип иммунного ответа проявляется как покраснение и ощутимое затвердение на участке инъекции пептида по изобретению.
Как известно, различные молекулы НЬЛ преобладают в основных популяциях человека. Соответственно, для идентификации эпитопов пептидов, рестриктированных по нескольким молекулам НЬЛ класса Ι, необходимо расширить группу пациентов, которых можно лечить способами по данному изобретению. Исследование многочисленных эпитопов сурвивина с различными элементами рестрикции НЬЛ расширяет клинический потенциал этого антигена мишени благодаря двум важным особенностям. (ί) Увеличение числа пациентов, которым подходит иммунотерапия, основанная на пептидах, производных сурвивина. НЬЛ-Л2 антиген экспресируется у приблизительно 50% популяций Кавказа и Азии, НЬЛ-Л1 и НЬА-ЛЗ антигены экспрессируются у приблизительно 25% кавказцев и 5% азиатов, тогда как НЬЛ-Л11 антиген экспресируется у приблизительно 15% кавказцев и 30% азиатов. Даже при том, что эти показатели нельзя суммировать из-за коэкспрессии, композиция пептидов, ограниченная их разнообразием, конечно, позволила бы охватить большинство пациентов, больных раком. (ίί) Коллективное нацеливание нескольких рестриктированных элементов у каждого пациента вероятно уменьшит риск иммунного ускользания потерей НЬЛ-аллеля. Потеря одиночного НЬЛ-аллеля является существенным компонентом изменений МНС, описанных для раковых клеток, тогда как полная потеря экспрессии класса I происходит довольно редко. Таким образом, с идентификацией эпитопов сурвивина, рестриктированных по различным НЬЛ-аллелям, стало возможным нацеливать более чем одну молекулу НЬЛ одновременно у пациентов с перекрыванием аллелей.
Следовательно, на основании описания данного изобретения специалист в данной области сможет разработать высоко иммуногенные эпитопные вакцины.
Предпочтительно, такие вакцины должны быть предназначены для облегчения одновременной доставки приемлемых пептидов, производных сурвивина, необязательно в композиции с другими приемлемыми пептидами и/или вспомогательными веществами, как описано далее.
Кроме того, как ранее описано, увеличили фокус при элиситировании иммунитета опухолеспецифических Т-хелперов, т.е. при вакцинировании эпитопами, рестриктированными по классу II МНС, несмотря на то, что опухоли обычно не экспрессируют МНС класса II. Это основывается на ранее обнаруженном факте, что индукция и эффективность индуцированного вакциной противоопухолевого ответа во многих случаях требуют взаимодействия опухолеспецифических СЭ4+ Ть-клеток. Таким образом, важным фактором, стимулирующим разработку вакцин, имеющих комплексный состав, является необходи
- 8 008026 мость наличия нескольких опухолевых антигенов, например, разработка вакцин, включающих или кодирующих набор тщательно отобранных эпитопов СТЬ и Ть-клеток.
Очевидно, мультиэпитопные вакцины представляют эффективный способ повысить устойчивость к эпитопам, полученным из нескольких различных антигенов, без необходимости применения (кодируемых генами) потенциально опасных белков, таких как онкобелки. Такие вакцины также обеспечивают селективную индукцию иммунитета против субдоминантных и криптэпитопов Т-клеток, которые могут быть особенно важны в случае опухолеассоциированных аутоантигенов, когда может наблюдаться толерантность к эпитопам, заметно представленным в нормальных тканях. Кроме того, антигенпрезентирующие клетки могут быть не в состоянии презентировать некоторые эпитопы, которые экспрессируются в опухолевых клетках, из-за функциональных различий между иммунопротеосомами антигенпрезентирующих клеток и конституционных протеосом, представленных в большинстве опухолевых клеток. В случае пептид-основных вакцин, такие эпитопы могут вводиться в МНС-готовой форме, которая позволяет введение с помощью экзогенной загрузки независимо от антигенного поглощения и процессирования антигенпрезентирующими клетками-хозяевами.
Очевидно, что результаты данного изобретения являются обоснованием для терапевтического и диагностического применений пептидов, производных сурвивина.
Согласно следующему аспекту данное изобретение представляет фармацевтическую композицию, включающую один или более пептидов по изобретению, по одному или в приемлемой композиции с другими белками или фрагментами пептида. В специфических вариантах осуществления такие белки или фрагменты пептида включают, но не ограничиваются, белки или фрагменты пептида, вовлеченные в регуляцию клеточного апоптоза. Приемлемыми примерами таких белков могут быть белки, выбранные из семейства белков Вс1-2, например, Вс1-2 белок, Вс1-\т белок, Мс1-1 белок, Вс1-Х|. белок и фрагменты пептида, производного от какого-либо из этих белков. Другие известные ингибиторы апоптоза включают членов семейства белков-ингибиторов апоптоза (ΙΑΡ), таких как Х-ΙΑΡ, С-1АР1 и С-1АР2, эти белки относительно убиквитарно экспрессированы, тогда как ингибитор апоптоза полипептид МЬ-ΙΑΡ имеет довольно селективную экспрессию, и, в основном, обнаруживается в меланомах. Таким образом, фрагменты МЬ-ΙΑΡ, способного к элиситированию специфического Т-клеточного ответа, т.е. цитостатического ответа Т-клетки или ответа Т-хелпера, могут необязательно быть включены в композицию по данному изобретению. Применимые пептидные фрагменты МЬ-ΙΑΡ включают МЬ-ΙΑΡ^ (ЬЬОЕЕЬТСКУ) (8ΕΟ ΙΌ Νο: 75), МЬ-ΙΑΡ^ο (^^СΡIСΚΑΡV) (8ΕΟ ΙΌ N0: 76), МЬ-ΙΑΡ,» (ΡΕΑ8ΕΥΙ)\\'ΡΕ) ΝΕΟ ΙΌ Νο: 77), МЬΙΑΡ154 (ЬЬКЖОКОЕУ) ΝΕΟ ΙΌ Νο: 78), \1Ε-Ε\Ρ;; (ΥΡΕΡΡΟΑΡΟΥ) ΝΕΟ ΙΌ Νο: 79), МЬ-ΙΑΡ,» (ΡΌΤΑΕνΡΡΕΌ) (8ΕΟ ΙΌ Νο: 80), МЕ-ΙΑΙΝ ΝΕΕΝΡνΕΟΕ) ΝΕΟ ΙΌ Νο: 81), МР-Ι.ΑΡ,· (ΟΙΡΟΟΡΡΡΡ) ΝΕΟ ΙΌ Νο: 82), МЕ-Ι.ΑΡ (ΕΤΑ1ΆΊΨΕΕ) ΝΕΟ ΙΌ Νο: 83), МЬ-ΙΑΡ^ (6Μ68ΕΕ^Β^) ΝΕΟ ΙΌ Νο: 84) и МЕ-Ι.ΑΡ; (ΕΌΡΤΡΚΚΕν) ΝΕΟ ΙΌ Νο: 85).
К тому же, композиция по данному изобретению может быть представлена как мультиэпитопная вакцина, включающая рестриктированный по классу Ι эпитоп и/или рестриктированные по классу ΙΙ эпитопы, как определено выше.
Пример представленных предпочтительных мультиэпитопных вакцин включает комбинации специального назначения эпитопа пептида, производного сурвивина, в зависимости от типа ткани данного пациента, например индивид, несущий ΗΌΑ-Α2, ΗΌΑ-Α3 и ΗΌΑ-Β35 фенотипы, может быть привит вакциной, включающей 8иг1М2, 8иг9, 8иг18К10, 8πγ46Υ9, 8πγ51Υ9. К тому же, фармацевтическая композиция по изобретению может преимущественно включать также по меньшей мере один иммуногенный белок или пептидный фрагмент его, выбранный из белка или пептидного фрагмента, не принадлежащего к сурвивину или не являющегося его производным. В специфических вариантах осуществления иммуногенный белок или пептидный фрагмент его является производным от семейства белка Вс1-2, как описано выше. Следующим иммуногенным Вс1-2-производным пептидом является рестриктированный по ΗΌΑΑ2 пептид, имеющий последовательность, выбранную из Вс11-2, Вс1180, Вс1208 и Вс1214.
Поскольку пептиды по изобретению - относительно маленькие молекулы, может возникнуть потребность в таких композициях, сочетающих пептиды с различными веществами, такими как адъюванты, для производства вакцин, иммуногенных композиций и т.д. Адъюванты, в широком смысле, являются веществами, создающими благоприятные условия для иммунных ответов. Часто адъювант выбора является полным адъювантом Фрейнда или неполным адъювантом, или инактивированным В. рсгШ^А используемым, например, в композиции с антигеном, осаждаемым квасцами. Общий обзор адъювантов представлен в Οοάίη^, Μοηοс1οηа1 ΑηίΦοάίοδ: Ρπηαρ1θ5 &атр; ΡπκΙχο (2ηά οόίΐίοη, 1986) на стр. 61-63. Однако Οοάίη§ отмечает, что, если антиген имеет низкий молекулярный вес или является слабо иммуногенным, рекомендуется связывание с иммуногенным носителем. Примеры таких молекул носителей включают гемоцианин фисурелла, бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин и куриный иммуноглобулин. Для применения в качестве адъювантов в иммуногенных композициях сапонина были также предложены различные экстракты. Ранее, было предложено использовать как адъювант фактор, стимулирующий гранулоцитарно-макрофагальную колонию (ОМ-С8Е), хорошо известный цитокин (\О 97/28816).
Соответственно, данное изобретение охватывает терапевтическую композицию, также включающую какое-либо адъювантное вещество, включая какое-либо вещество из вышеупомянутых или их ком
- 9 008026 позиции. Предполагается, что антиген, т.е. пептид по изобретению и адъювант могут вводиться отдельно в какой-либо приемлемой последовательности.
Выбор антигена в фармацевтической композиции по изобретению будет зависеть от параметров, которые определяются специалистом в данной области. Как было упомянуто, каждый из различных пептидов по изобретению представлен на поверхностях клеток специфической молекулой НЬЛ. По существу, если НЬЛ фенотип индивида, который будет принимать лечение, определен, то пептид/пептиды выбирают в зависимости от специфической молекулы НЬЛ.
Альтернативно, антиген, представляющий интерес, выбран на основании преобладания различных НЬА фенотипов в данной популяции. Например, НЬА-А2 - самый распространенный фенотип в кавказской популяции, и поэтому композиция, содержащая пептид, производный сурвивина, связанный с НЬАА2, будет активной для большой части той популяции. Впрочем, композиция по изобретению может также содержать комбинацию двух или больше пептидов, производных сурвивина, каждый из которых специфически взаимодействует с различными молекулами НЬА, для того чтобы охватить большую часть целевой популяции. Таким образом, например, фармацевтическая композиция может содержать комбинацию пептида, рестриктированного по молекуле НЬА-А и пептида, рестриктированного по молекуле НЬА-В, например, включая те молекулы НЬА-А и НЬА-В, которые соответствуют преобладанию фенотипов НЬА в целевой популяции, такие как НЬА-А2 и НЬА-В35. К тому же, композиция может содержать пептид, рестриктированный по молекуле НЬА-С.
Предполагается, что применимые иммуногенные композиции по изобретению вдобавок к пептиду, производному сурвивина, как определено здесь, могут также включать иммунологически эффективное количество белка сурвивина, как определено здесь, или иммуногенный фрагмент его.
Количество иммуногенного пептида по изобретению в фармацевтической композиции может изменяться, в зависимости от специфического применения. Однако, отдельная доза иммуногена составляет, предпочтительно, от приблизительно 10 до приблизительно 5000 μ г, более предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 2500 μ г, например приблизительно от 100 до приблизительно 1000 μη Способы введения включают внутрикожное, подкожное и внутривенное введение, имплантат в форме замедленного высвобождения и т.д. Все упомянутые здесь способы введения известны в этой области. Также здесь упомянуты все известные формы дозировки, которые известны в этой области как приемлемые для введения иммуногенной пептидной композиции, иммуногенного пептида, например лиофильные формы и растворы, суспензии или эмульсии, если необходимо, общепринятых фармацевтически приемлемых носителей, разжижителей, консервантов, адъювантов, буферных компонентов и т.д.
Иммунопротективный эффект композиции по изобретению может быть определен с использованием нескольких подходов, проиллюстрированных следующими примерами. Пример определения ответа СТЬ, вызванного иммуногенной композицией, представлен в νθ 97/28816, выше. Успешный иммунный ответ может также быть определен путем возникновения ЬТН после иммунизации и/или обнаружения антител, специфически распознающих пептид(ы) композиции вакцины.
В предпочтительных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по изобретению является иммуногенной композицией или вакциной, способной элиситировать иммунный ответ при раке. Используемое здесь выражение иммуногенная композиция или вакцина относится к композиции, элиситирующей по меньшей мере один тип иммунного ответа, направленного против раковых клеток. Следовательно, такой иммунный ответ может быть каким-либо из упомянутых выше: СТЬ ответ, при котором образуют ся СТЬ, что является способностью распознания НЬА/пептид комплекса, представленного на клеточной поверхности, и приводит к лизису клетки, т. е. вакцина элиситирует продуцирование у вакцинированного индивида эффекторных Т-клеток, обладающих цитотоксическим эффектом против раковых клеток; В-клеточный ответ, повышающий продуцирование противораковых антител; и/или ЭТН тип иммунного ответа.
В практических вариантах осуществления иммуногенный ответ, направленный против рака, элиситируется ведением пептида по изобретению или нанесением молекулы МНС класса I на антигенпрезентирующие клетки (АРС) пациента, изолированием РВЬ пациента и инкубированием клеток с пептидом до инъекции клеток пациенту, или изолированием предшественников АРС пациента и дифференцированием клеток в выполняющие функции АРС с использованием цитокинов и антигена перед инъекцией клеток пациенту обратно. Таким образом, в одном варианте осуществления данного изобретения способ лечения пациентов, страдающих раком, заключается в том, что пептид вводят в антигенпрезентирующие клетки (АРС) пациента ех νίνο с последующим введением таким образом обработанных АРС назад пациенту. Существует по меньшей мере два альтернативных способа выполнения такой задачи. Один заключается в изолировании АРС пациента, больного раком, и инкубировании молекул МНС класса I с пептидом. Нанесение молекул МНС класса I означает инкубирование АРС с пептидом так, чтобы АРС с молекулами МНС класса I, специфическими для пептида, связали пептид и, таким образом, стали способными предоставить его Т-клеткам. Затем АРС вводятся обратно пациенту. Другой альтернативный путь опирается на недавние открытия, сделанные в области биологии дендритных клеток. В этом случае, моноциты (будучи клетками-предшественниками дендритов) выделяются у пациента и дифференцируются ίη νίΐτο в профессиональные АРС (или дендритные клетки) при помощи цитокинов и антигена. Это описано в
- 10 008026 примерах 3 и 5, где адгезивные РВЬ (являющиеся, главным образом, моноцитами) культивировались ίη νίίτο вместе с СМ-С8Е, 1Ь-4 и ΤΝΡ-α (фактор некроза опухоли α). Затем ίη νίίτο произведенные дендритные клетки сенсибилизируются пептидом и вводятся обратно пациенту.
Вследствие того, что сурвивин, очевидно, экспрессируется при большинстве форм рака, вероятно, что вакцины по изобретению могут обеспечивать контроль над каким-либо типом рака, при котором экспрессирован сурвивин. Таким образом, например, композиция вакцины по изобретению является иммунологически активной против злокачественной опухоли кроветворных органов, включая хроническую лимфатическую лейкемию и хроническую миелоидную лейкемию, меланому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы и рак простаты.
Из вышеупомянутого описания квалифицированному специалисту будет понятно, что пептиды по изобретению применяются в качестве средств диагностики рака, особенно, поскольку пептиды являются производными от сурвивина, экспрессированного при всех формах рака. Поэтому пептиды по изобретению являются основанием для развития универсально применимых диагностических и прогностических процедур относительно рака. Таким образом, в других приемлемых вариантах осуществления композиция по изобретению является композицией для ех νΐνο и ίη 8Йи диагностики наличия у пациента рака, например, базируется на обнаружении сурвивин активных Т-клеток среди РВЬ или в опухолевой ткани.
Согласно следующим аспектам, предусматривается диагностический набор для ех νΐνο и ίη δίΐιι диагностики присутствия сурвивин реактивных Т-клеток среди РВЬ или в опухолевой ткани, включающий один или более пептидов по изобретению, и способ обнаружения у пациента, больного раком, присутствия сурвивин активных Т-клеток, способ, включающий контактирование опухолевой ткани или образца крови с комплексом пептида по изобретению и молекулы НЬЛ класса I или фрагментом такой молекулы и обнаружение связи комплекса с тканью или клетками крови.
Следующий применимый диагностический или прогностический подход базируется на продуцировании антител у гетерологических видов животных, например антитела крысы, направленные против пептида человека, производного сурвивина, по изобретению, что может использоваться, например, для диагностирования наличия раковых клеток, презентирующих пептид. Для иммунизации количество пептида может быть меньше, чем используемое в терапии ίη νΐνο, как описано выше. В общем, предпочтительная доза может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 750 μτ пептида. Также возможно продуцирование моноклональных антител, основанное на иммунизации пептидом по изобретению. Соответственно, данное изобретение также касается молекулы, в особенности моноклонального или поликлонального антитела, включая его фрагмент, которая способна к специфическому связыванию с пептидом по изобретению и с молекулой, способной к блокированию такого связывания, например, индуцирование антитела против моноклонального или поликлонального антитела, направленного против пептида по изобретению.
В одном из аспектов изобретение представляет комплекс пептида по изобретению и молекулы НЬЛ класса I или фрагмента такой молекулы, который применяется в качестве диагностического реактива, как описано выше. Комплекс получен каким-либо удобным способом, включая описанные в следующих примерах. Такой комплекс может быть мономерным или мультимерным.
Данное изобретение представляет способы облегчения или лечения рака. Следовательно, следующим аспектом изобретения является применение пептидов, как определено выше, для изготовления лекарственного препарата для лечения рака. Другой аспект данного изобретения касается применения молекулы или композиции, как определено выше, для изготовления лекарственного препарата для лечения рака. Предпочтительно, рак ассоциируется с экспрессией сурвивина, включая в качестве примеров: злокачественную опухоль кроветворных органов, в том числе хроническую лимфатическую лейкемию и хроническую миелоидную лейкемию, меланому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы и рак простаты. Применение включает введение пациенту, страдающему раком, эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению, молекула, которой способна к специфическому связыванию с пептидом по изобретению, и/или молекула, котора способна блокировать данное связывание.
В некоторых случаях будет уместно комбинировать применение по изобретению с традиционным лечением рака, таким как радиотерапия или химиотерапия.
Изобретение ниже будет описано в деталях, неограничивающих примерах и фигурах, где
Фиг. 1 иллюстрирует Т-клеточный ответ, проанализированный с помощью ЕЫ8РОТ анализа у пациента, страдающего СЬЬ1, на отсутствие пептида, пептид 8иг1 (ЕТЬСЕЕЕКЕ, 8ЕС ГО Νο: 10) и пептид 8иг9 (ЕЕТЬСЕЕЕКЕ, 8ЕС ГО Νο: 3). РВЬ простимулировали однократно пептидом прежде, чем высеять на чашку Петри по 6х105 клеток в лунку в двух повторностях. Среднее число пятен на пептид рассчитали с помощью прибора с зарядовой связью (ССГО) и компьютерной системы.
Фиг. 2 иллюстрирует Т-клеточный ответ, проанализированный с помощью ЕЫ8РОТ анализа у пациента, страдающего СЬЬ1, на отсутствие пептида, аналог пептида 8иг1Ь2 (ЕТЬСЕЕЕКЕ, 8ЕС ГО Νο: 4) и аналог пептида 8иг1М2 (ЬМЬСЕЕЬКЬ, 8ЕС ГО Νο: 5). РВЬ простимулировали однократно пептидом прежде, чем высеять на чашку Петри по 1х104 клеток в лунку в двух повторностях. Среднее число пятен на пептид рассчитали с помощью прибора с зарядовой связью (ССГО) и компьютерной системы.
- 11 008026
Фиг. 3 показывает Т-клеточный ответ, проанализированный с помощью ЕЫЗРОТ анализа у пациента, страдающего СЬЬ2 и СЬЬЗ, на отсутствие пептида (черный столбик), на пептид 8ит1 (ЬТЬСЕЕЕКЬ, 8Еф ΙΌ Νο: 10) (серый столбик), на пептид 8ит9 (ЕЕТЬбЕЕЬКЬ, 8Еф ГО Νο: 3) (белый столбик), на аналог пептида 8ит1Ь2 (ЕЬЕСЕЕЬКЕ, 8Еф ГО Νο: 4) (светло-серый столбик) и на аналог пептида 8ит1М2 (ЬМЬСЕЕЕКЬ, 8ЕО ГО Νο: 5) (темно-серый столбик). Каждый эксперимент выполняли на 1х105 клеток в лунку в двух повторностях. Рассчитали среднее число пятен на пептид.
Фиг. 4 представляет Т-клетки, которые выделили из инфильтрующей опухоли лимфатического узла пациента, страдающего Ме11, Ме12, и Ме13, простимулированы однократно ίη νίίτο, и проанализировали с помощью ЕЬКРОТ анализа их ответ на отсутствие пептида (черный столбик), на пептиды 8ит1 (ЬТЬСЕЕЕКЕ, 8ЕО ГО Νο: 10) (серый столбик) и 8ит9 (ЕЕТЬСЕЕЕКЬ, 8Еф ГО Νο:3) (белый столбик). Каждый эксперимент выполняли на 1х105 клеток в лунку в двух повторностях. В каждый эксперимент были включены по две лунки без добавления пептида. Среднее число пятен на пептид рассчитали для каждого пациента.
Фиг. 5 показывает функциональную активность сурвивин специфических СТЬ. СТЬ выделили из инфильтрующей меланомы лимфатического узла с использованием покрытых сурвивином магнитных гранул. (А) Специфический лизис линий клеток меланомы; НЕА-А2 позитивный ЕМ3 (треугольник) и НЕА-А2 негативный ЕМ45 (квадрат). (В) Специфический лизис линий клеток рака молочной железы; НЬА-А2 позитивный МСЕ-7 (треугольник) и НЬА-А2 негативный ВТ-20 (квадрат).
Фиг. 6 показывает частоту сурвивин активных СТЬ в РВЬ пациентов, больных раком. Активность проанализировали с помощью ЕЫ8РОТ анализа у трех пациентов, больных раком молочной железы (вершина, середина и основание, соответственно). Для каждого пациента анализ выполняли на отсутствие пептида, на присутствие пептида 8ит1, на присутствие 8ит9 и на присутствие модифицированного пептида 8ит1М2. Использовали 1х104 эффекторных клеток на лунку. График показывает определение количества активных клеток; серые колонки представляют среднее количество ΙΕΝ-γ-продуцирующих клеток.
Фиг. 7 иллюстрирует связывание НЬА-35 пептидов, производных сурвивина, и анализ пептидопосредованного связывания молекул НЬА-В35 пептидами, производными сурвивина. Продукты лизиса метаболически маркированных Т2-В35 клеток инкубировали при 4°С в присутствии 50, 5, 0,5, 0,05 и 0,005 мМ пептида. Связывание НЬА-В35 проанализировали методом структурных связей и количество затем определили электрофорезом на 1ЕЕ-геле, используя программное обеспечение 1шадеСаиде аппарата для визуализации (ГИЛ ρΐιοίο П1т ^., ЬТИ., Япония). Значение С50 представляет концентрацию пептида, необходимую для связывания половины максимально возможного количества молекул НЬА-В35.
Фиг. 8 показывает спонтанные ответы Т-клеток, наблюдаемые в РВЬ у пациентов, больных раком. А) Число ΙΓΝ-γ-продуцирующих клеток, формирующих пятна, проанализировали с помощью ЕЬ18РОТ анализа без пептида (белые столбики), с 8ит51-59 (черные столбики) или 8ит46-54 (серые столбики), среди простимулированных ίη νίίτο РВЬ пациента, страдающего СЬЬ5 (105 клеток/лунка), НЕМ12 (105 клеток/лунка) и НЕМ8 (5х104 клеток/лунка). В) Число клеток, формирующих пятна, среди 1,7х105 РВЬ из НЕМ12, культивируемых в течение 10 дней с сенсибилизированными пептидом зрелыми аутологическими дендритными клетками. Столбики представляют среднее число измерений в двух повторностях.
Фиг. 9 показывает спонтанные ответы Т-клеток на нативные и модифицированные сурвивиновые пептиды у пациентов с меланомой. А) Число клеток, продуцирующих пятна, проанализировали с помощью ЕЬ18РОТ анализа по 8ит51-59 и 8иг51У9 у пациента, страдающего ГМ25, в РВЬ (4х103 клеток/лунка) и Т1Ь (7х104 клеток/лунка), так же как Т1Ь от ГМ45 (104 клеток/лунка). В) Число клеток, формирующих пятна, проанализировали с помощью ЕЬ18РОТ анализа по 8ит46 и 8иг46У9 в Т1Ь от ГМ74 (5х103 клеток/лунка). Столбики представляют среднее число измерений в двух повторностях с вычетом высвобождения неспецифических ΙΓΝ-γ.
Фиг. 10 иллюстрирует аффинность связывания пептидов, производных сурвивина, с НЬА-А1. Полосы тяжелых цепей МНС класса I количественно определили на аппарате для визуализации. Подъем стабилизированной тяжелой цепи НЬА-А1 прямо пропорционально связан с аффинностью связывания добавленного пептида. Пептид-опосредованное связывание НЬА-А1 (произвольно выбранные единицы) индуцируется 40, 4, 0,4, 0,04 мМ 8иг93-101 (линия), 8иг93Т2 (квадрат), 8ит49-58 (кружок) или Грипп А, РВ1 591-599 (треугольник).
Фиг. 11 показывает спонтанные ответы на пептиды, рестриктированные по НЬА-А1. Спонтанные Тклеточные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализировали с помощью ЕЬ18РОТ. Показано среднее число пептид специфических ΙΓΝ-γ пятен, сформированных в ответ на 8ит92-101, 8ит38У9, 8ит47У10 и 8ит93Т2 у 5х104 ίη νίίτο простимулированных РВЬ или ТГО у пациентов, больных меланомой. Пептид специфические ответы наблюдались в 6 исследуемых образцах РВЬ и 3 образцах ТГО у пациентов с меланомой (Ме1). Неспецифические ΙΓΝ-у пятна вычитались. Столбики: амплитуда повторностей.
Фиг. 12 показывает спонтанные ответы на пептиды, рестриктированные по НЬА-А11. Спонтанные Т-клеточные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализировали с помощью ЕЫЗРОТ. Показано среднее число пептид специфических ΙΓΝ-γ пятен, сформированных в ответ на 8ит53-62 у 5х104 ίη νίίτο простимулированных РВЬ или ТГО у пациентов, больных раком. Пептид специфические ответы наблюдались у 5 обследуемых пациентов с меланомой (Ме1) (5 РВЬ, 1 ТГО) и 2 пациентов с СЬЬ (СЬЬ) (РВЬ). Неспецифические ΙΓΝ-γ пятна вычитались. Столбики: амплитуда повторностей.
- 12 008026
Фиг. 13 показывает спонтанные ответы на пептиды, рестриктированные по НБЛ-Л3. Спонтанные Тклеточные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализировали с помощью БЫ8РОТ. Показано среднее число пептид специфических ΙΡΝ-γ пятен, сформированных в ответ на 8ит18К10 у 5х104 ίπ νίίτο простимулированных РВБ или Т1Б у пациентов, больных меланомой. Пептид специфические ответы наблюдались в 23 исследуемых образцах РВБ и 4 образцах Т!Б пациентов с меланомой (Ме1). Неспецифические ΙΡΝ-γ пятна вычитались. Столбики: амплитуда повторностей.
Фиг. 14 показывает спонтанные ответы на пептиды, рестриктированные по НБЛ-Л2. Спонтанные Тклеточные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализировали с помощью БЫ8РОТ. Показано среднее число пептид специфических ΙΡΝ-γ пятен, сформированных в ответ на пептиды, содержащие 11 мономеров, 8иг18-28 у 5х104 ίπ νίίτο простимулированных РВБ у пациентов, больных раком. Пептид специфические ответы наблюдались в 10 исследуемых образцах РВБ у пациентов с меланомой (Ме1), 6 образцах у пациентов с СББ (СББ) и 2 образцах у пациентов с раком молочной железы (МС). Неспецифические ΙΡΝ-γ пятна вычитались. Столбики: амплитуда повторностей.
Фиг. 15 показывает спонтанные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализированные с помощью ББ18РОТ. Показано среднее число пептид специфических ΙΡΝ-γ пятен, сформированных в ответ на 8ит6-14 (РРРЛШОРНР) у 105 ίπ νίίτο простимулированных РВБ у 5 пациентов с меланомой (те125, те126, те13, те16, те139), 2 пациентов с СББ (СББ1, СББ54) и 2 пациентов с раком молочной железы (МС11, МС15). Неспецифические ΙΡΝ-γ пятна вычитались.
Фиг. 16 иллюстрирует лабораторные значения стабильного измерения лактат дегидрогеназы (БЭН), холинэстеразы, креатинина, гемоглобина, лейкоцитов и тромбоцитов после вакцинирования четырех пациентов (▲ К№, • ΚΝ, - \У\УЕ, СВ).
Фиг. 17 демонстрирует кинетический анализ иммунности к сурвивиновым пептидам, оцененным ΙΡΝ-γ ББ^РОТ анализом. РВМС (мононуклеары периферической крови) получили перед первой ЭС прививкой и спустя 3 месяца. Показаны количества ΙΡΝ-γ-продуцирующих клеток, формирующих пятна.
В следующую таблицу внесены аминокислотные последовательности для применяемых здесь пептидов и соответствующие им номера 8РС) ΙΌ Νο.
| 8Εζ) ГО ΝΟ: | Обозначение | Последовательность |
| 1 | 8иг6 | РБКБОКЕКА |
| 2 | 8иг8 | ТЬРРА^РРБ |
| 3 | 8иг9 | ЕЬТБСЕРЬКЬ |
| 4 | 8иг1Ь2 | ЬБЕСЕРЕКЕ |
| 5 | 8иг1М2 | ЬМБОЕРЬКЕ |
| 6 | 8иг46-54 | СРТЕХЕРОЬ |
| 7 | 8иг51-59 | ЕРОЬАРСРР |
| 8 | 8иг46У9 | ΟΡΤΕΝΕΡϋΥ |
| 9 | зиг51У9 | ЕРОБА9СРУ |
| 10 | 8иг1 | ЬТБСЕРБЬСБ |
| И | С1 | 1ЬКЕРУНОУ |
| 12 | 8иг2 | ΚΑΙΕ0ΈΑΑΜ |
| 13 | 8игЗ | КУККА1Е9Б |
| 14 | 8иг4 | 8ТРКМУРРБ |
| 15 | 8иг5 | ЗУККСРЕЕЦ |
- 13 008026
| 16 | 8иг7 | ΤΑΚΚνΚΚΑΙ |
| 17 | 8иг10 | ЕТАККУККА1 |
| 18 | 8иг6-14 | ЬРРА^РРЬ |
| 19 | 8иг11-19 | (^ррькоши |
| 20 | 8иг34-43 | ТРЕКМАЕАОР |
| 21 | С24 | УРЬНЕрНрМ |
| 22 | 8иг14-22 | ЬКОНК18ТР |
| 23 | 8иг38-46 | МАЕАСР1НС |
| 24 | 8иг93-101 | РЕЕЬТЬСЕР |
| 25 | 8иг47-56 | ΡΤΕΝΕΡϋΕΑζ) |
| 26 | 8иг49-58 | ЕКЕРОЬАрСР |
| 27 | 8иг92-101 | РРЕЕЕТЬСЕР |
| 28 | С1 | νδϋΟΟΡΝΕΥ |
| 29 | 8иг14У9 | ΕΚΏΗΚΙ8ΤΥ |
| 30 | 8иг93У9 | РЕЕЬТЬСЕУ |
| 31 | 8иг92У9 | (^ΡΕΕΣΊΈΟΕΥ |
| 32 | 8иг34У9 | ΤΡΕΚΜΑΕΑΟΥ |
| 33 | 8иг49У9 | ΕΝΕΡϋΕΑρϋΥ |
| 34 | 8иг92Т2 | (ЗТЕЕЬТЬСЕР |
| 35 | 8иг9282 | РЗЕЕЬТЬОЕР |
| 36 | 8иг93Т2 | РТЕЬТЬбЕР |
| 37 | 8иг9382 | РЗЕЬТЬОЕР |
| 38 | 8иг38У9 | ΜΑΕΑΟΡΙΗΥ |
| 39 | 8иг47У10 | РТЕУЕРОЬАУ |
| 40 | 8иг5-13 | ТЕРРАШС^РР |
- 14 008026
| 41 | 8иг53-61 | ОЬАЦСРРСР |
| 42 | 8иг54-62 | ЬАЦСРРСРК |
| 43 | 8иг95-103 | ЕЬТЬСЕРЬК |
| 44 | 8иг112-120 | ΚΙΑΚΕΤΝΝΚ |
| 45 | 8и13-22 | РЬКЕ)НВ18ТР |
| 47 | 8иг53-62 | ОЬАЦСРРСРК |
| 50 | 8иг103-112 | ΚΕϋΚΕΒΑΚΝΚ |
| 51 | 8иг112-121 | ΚΙΑΚΕΤΝΝΚΚ |
| 52 | 8иг 113-122 | ΙΑΚΕΤΝΝΚΚΚ |
| 53 | СЗ | 1ЬК.С8УАНК |
| 54 | 8иг5К9 | ТЬРРА^УЦРК |
| 55 | 8иг53К9 | ОЬАЦСРРСК |
| 56 | 8иг54Ь2 | ШЬЦСРРСРК |
| 57 | 8иг13К9 | РЬКОНВ18ТК |
| 58 | 8иг18К10 | ΚΙδΤΡΚΝλΥΡΚ |
| 59 | 8иг113Ь2 | ΙΕΚΕΤΝΝΚΚΚ |
| 60 | 8игЕхЗ-АЗ-1 | ΤΙΚΚΚΝΕΚΚ |
| 61 | 8игЕхЗ-АЗ-2 | ΡΤΙΚΚΚΝΕΚΚ |
| 62 | 8иг2Ь-АЗ-1 | ΚΙΤΚΕΕΗΚΚ |
| 63 | С4 | ΑνΡϋΚΚδϋΑΚ |
| 64 | Сб | ЦРВАР1ВР1 |
| 65 | С7 | КРИРПЖЬ |
| 66 | 8иг4-14 | РТЬРРААУЦРРЬ |
| 67 | 8иг18-28 | ΕΙδΤΡΚΝν/ΡΡΕ |
| 68 | 8иг54-64 | ЬАЦСРРСРКЕЬ |
| 69 | 8иг86-96 | РЬЗУККЦРЕЕЬ |
| 70 | 8иг88-98 | 8УККрРЕЕЬТЬ |
| 71 | 8игЮЗ-113 | ΚΕϋΚΕΚΑΚΝΚΙ |
| 72 | ЕЬу, ВМЬР1 | СЬСТЕУАМЬ |
| 73 | Ηΐν, Ро1 | ШКЕРУНСУ |
| 74 | Грипп А, нуклеобелок 265-273 | 1ЬКСг8УАНК |
Пример 1. Идентификация цитостатического ответа Т-лимфоцитов на белок сурвивин, ингибирующий апоптоз, у пациентов, больных раком.
Резюме
С помощью ЕЫ8РОТ анализа изучалось применение эпитопов СТГ, полученных из сурвивина специфической Т-клетки, активной против таких антигенов в периферической крови пациентов с хронической лимфацитной лейкемией (СББ) и в лимфатических узлах при инфильтрующей опухоли у пациентов с меланомой. СТБ ответы на эпитопы пептида, производного сурвивина, обнаружены у 3 из 6 пациентов с меланомой и у 3 из 4 пациентов с СББ. Отсутствие Т-клеточной активности наблюдали в РВГ у 6 здоровых контрольных индивидов. Таким образом, пептиды, производные сурвивина, могут служить важными и широко применимыми мишенями в антираковой иммунотерапевтической стратегии.
- 15 008026
Введение
Белок сурвивин изучили на предмет присутствия связанных с НЕА-А*0201 (11ЕА-А2) пептидных мотивов, и после успешной идентификации пептиды использовались для тестирования специфической Т-клеточной активности у пациентов с лейкемией и меланомой с помощью ЕЫ8РОТ анализа. В обеих группах пациентов обнаружили СТЬ ответы на два эпитопа пептида, производного сурвивина, тогда как у здоровых контрольных индивидов Т-клеточная активность отсутствовала. Эти данные предлагают, что сурвивин представляет широко экспрессированный опухолевый антиген, распознаваемый аутологическими Т-клетками.
Материалы и способы Пациенты и нормальный контроль
У 4 пациентов с обнаруженной СЕЕ (СЬЫ-4) и у 6 здоровых индивидов в гепаринизированные пробирки отобрали образцы периферической венозной крови. РВЕ выделили путем сепарации лимфы и заморозили в эмбриональной сыворотке теленка (ЕС8) с 10% диметилсульфоксидом. Дополнительно у 6 пациентов с меланомой (те11-6) получили Т-лимфоциты из инфильтрующей опухоли лимфатических узлов. Свежерезецированные лимфатические узлы измельчили на маленькие фрагменты, раздавили, чтобы выпустить клетки в культуру и криоконсервировали. РВЕ были взяты у 4 пациентов с меланомой. С помощью анализа диаграммы рассеяния возбужденной флуоресценции сортированных клеток (ЕАС8), используя 11ЕА-А2 специфическое антитело ВВ7.2, определили, что все индивиды были 11ЕА-А2 положительными. Антитело выделили из супернатанта гибридомы. Образцы у пациентов получили в Больнице Государственного университета, Херлев, Дания. Перед каким-либо из данных исследований на основе информированности получили согласие пациентов.
Пептиды, производные сурвивина
Все пептиды были получены из Кезеагсй СепеЕсз (Хантсвилл, Алабама, США) и обеспечили их >90% чистоту, проверенную высоко разрешающей жидкостной хроматографией (НРЕС) и Массспектрометрией (М8). Используемые пептиды внесены в табл. 1.
Таблица 1. Пептиды, проанализированные в данном исследовании, и их связывающая аффинность с НБА-А2
| Название | Белок8 | Последовательность | 8ЕЦ ГО ΝΟ: | С50 (μΜ)Β |
| С1 | Н1У-1 ρθ1476-484 | 1ЬКЕРУНСУ | 11 | 0,7 |
| 8иг1 | Сурвивин96.104 | ЬТЕСЕГЕКЬ | 10 | >100 |
| 8иг2 | СурВИВИН133.141 | КАШОЬААМ | 12 | нет связывания |
| 8игЗ | СурВИВИН130-138 | КАгеЦЬААМ | 13 | >100 |
| 8иг4 | СурВИВИН20-28 | ЗТЕКЕАУРРЬ | 14 | нет связывания |
| 8иг5 | Сурвивин88-9б | ЗУККОЕЕЕЬ | 15 | нет связывания |
| 8иг6 | Сурвивин ю 1-109 | ЕЕКЬОКЕЕА | 1 | 30 |
| 8иг7 | СурВИВИН127_135 | ТАККУККА1 | 16 | нет связывания |
| 8иг8 | СурВИВИН5_14 | ΤΕΡΡΑλνΟΡΕΣ | 2 | 30 |
| 8иг9 | СурВИВИН95.104 | ЕЬТЕСЕЕЕКЬ | 3 | 10 |
| 8иг10 | СурВИВИН126_135 | ЕТАККУККА1 | 17 | нет связывания |
| 8иг1Ь2 | ЬЕЕбЕЕЕКЬ | 4 | 1 | |
| 8иг1М2 | ЬМЕОЕРЕКЬ | 5 | 1 |
аДиапазон значений, записанных в нижнем индексе, указывает положение пептида в последовательности сурвивина, как раскрыто в патенте США 6245523.
вС50 - концентрация пептида, необходимого для связывания половины максимального количества молекул НЕА-А2, как определено ниже.
Анализ структурных связей пептида с молекулами МНС класса I
Анализ структурных связей синтетического пептида с молекулами МНС класса I, метаболически помеченными [358]-метионином, выполняли, как описано в (12, 13). Анализ структурных связей основывается на стабилизации молекул класса I после загрузки к линии клеток Т2, в которых отсутствует переносчик пептидов. Затем правильно свернутые стабильные тяжелые цепи МНС осадили с помощью кон
- 16 008026 формационно-зависимых антител. После электрофореза на ШЕ гели проверили на аппарате для визуализации, и связывание пептида определили количественно с помощью программы ^адедиап! Ρ11Ο3рйоНтадег (Мо1еси1аг Оупат1сз, Саннивал, Калифорния).
Антигенная стимуляция РВЬ
Чтобы увеличить чувствительность ЕМБЬОТ анализа, ΡΒΕ простимулировали однократно ίη νίίτο до анализа (14, 15). Свежие и предварительно замороженные ΡΒΕ дали подобные результаты при ЕМБЬОТ анализе. В день 0 ΡΒΕ или измельченный лимфатический узел разморозили и поместили на 24-луночный планшет (Шис, Дания) по 2мл/лунка при концентрации 2х106 клеток на среду А[М V (Ь1Ге ТесЬм^^з, Роскилд, Дания), с добавлением 5% инактивированной высокой температурой человеческой сыворотки и 2 мМ Ь-глутамина в присутствии 10 рМ пептида. В каждый опыт включили лунки без пептида. 2 дня спустя к культурам добавили 300 международных единиц(МЕ)/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (ΣΕ-2) (Οιίτοη, Ратинген, Германия). Активность культивируемых клеток проверили ЕМБЬОТ анализом на 12 день.
ЕЫ8РОТ анализ
ЕШ^ОТ анализ для определения количества эпитопа пептида специфических интерферон-упродуцирующих эффекторных клеток выполняли, как описано в (16). Вкратце, нитроцеллюлозные 96луночные планшеты (Ми1ί^8с^ееη МАШ N45, МП^юю, Хедехузен, Дания) покрыли анти-Ш^у антителом (1-Ό1Κ, МаЫесЕ Нака, Швеция). Лунки промыли, наполнили средой АГМ V и поместили клетки в двух повторностях при различных концентрациях клеток. Затем в каждую лунку добавили пептиды, и планшеты инкубировали на протяжении ночи. На следующий день среду удалили и лунки промыли перед добавлением биотинилированного вторичного антитела (7-В6-1-Биотин, МаЫесй). Планшеты инкубировали в течение 2 ч, промыли и в каждую лунку добавили авидин-ферментный конъюгат (АЕ-Асхбт, Са1Ьюсйет, ЫГе ΤесЬηο1οд^ез). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем в каждую лунку добавили ферментный субстрат ΝΒΠΒΟΡ (Οί^ο, ЫГе ΤесЬηο1οд^ез) и выдержали при комнатной температуре 5-10 мин. Реакцию остановили промыванием водопроводной водой после появления темно-фиолетовых пятен. Пятна подсчитали с помощью системы АфМтадет (А1рйа Iηηοίесй, Сан-Леандро, Калифорния, США) и частоту пептид специфических СТЬ можно было рассчитать по числу клеток, формирующих пятна. Анализы выполнялись в двух повторностях для каждого пептидного антигена.
Результаты
Связывание пептидов, производных сурвивина, с ИБА-А2
Аминокислотную последовательность белка сурвивина изучили для определения наиболее вероятного девяти- и десятимерных пептидных эпитопов НБА-А2, используя главные НБА-А2 специфические якорные остатки (17). Синтезировали десять пептидов, производных сурвивина, и исследовали их связывание с НБА-А2. Эпитоп от НРУ-1 ρο1476-484 (I^ΚΕΡVНСV, 8ЕО ГО Νο: 11) (табл. 1) использовали как положительный контроль. В положительном контроле концентрация пептида, необходимая для связывания половины максимально возможного количества молекул МНС класса I (значение С50), составила 0,7. Для сравнения, пептид, обозначаемый 8иг9 (ЕЕТЬСЕЕЕКЬ, 8ЕО ГО Νο: 3), связывался с аффинностью С50=10 рМ. Пептиды, обозначаемые 8ит6 (ЕЕКБОКЕКА, 8ЕО ГО Νο: 1) и 8ит8 (Τ^ΡΡΑ\V^ΡЕ^. 8ЕО ГО Νο: 2), соответственно, связывались с НБА-А2 при С50=30 рМ, тогда как у 8ит1 (ЬТЬСЕЕЕКЕ, 8ЕО ГО Νο: 10) и 8ит3 (КУК-КАГОрЬ, 8ЕО ГО Νο: 13) наблюдалось более слабое связывание (С50>100 рМ). Пять из исследованных пептидов (8ит2, 8ит4, 8ит5, 8ит7, и 8ит10) не связывались с НБА-А2.
Так как 8ит1 слабо связывается с НБА-А2, синтезировали два аналоговых пептида, обозначенных 8ит1Ь2 и 8ит1М2, соответственно, в которых улучшенным якорным остатком (лейцином или метионином) заменили нативный треонин в положении 2. Оба эти пептида связываются с НБА-А2 с почти одинаковой высокой аффинностью, как в положительном контроле (С50=1 рМ).
СТЬ ответ на сурвивин у пациентов, больных СЬЬ
ΡΒΕ четырех НБА-А2 положительных пациентов, больных СЬЬ, простимулировали однократно ίη νίίτο перед ЕШ^ОТ анализом. Эта процедуру провели для увеличения чувствительности ЕБЛЗБОТ анализа. Все 10 пептидов, производных сурвивина, включили в первую линию экспериментов. Ответы определили для 8ит1 и 8иг9, данные этих пептидов представлены в фигурах. Фиг. 1 показывает активность СТЬ к 8ит1 и 8ит9, как определено у пациента СЬЬ1. Каждое пятно представляет пептидную активность ЮТ-у-продуцирующей клетки. Среднее число пятен на пептид рассчитали с помощью устройства ССГО и компьютерной системы. У пациента СЬЬ 1 обнаружили пятьдесят два специфических пятна пептида 8ит9 (после вычитания пятен, появившихся без добавления пептида) на 6х105 клеток (фиг. 1). На слабо связывающийся с НБА-А2 пептид 8ит1 не обнаружили ответ, однако, пациент отвечал на прочно связывающийся с НБА-А2 аналоговый пептид 8ит1М2 (35 пептидных специфических пятен на 104 клеток) (фиг. 2). Не обнаружили ответ на другой прочно связывающийся с НБА-А2 аналоговый пептид 8ит1Ь2 у этого пациента (фиг. 2). Пациент СЬЬ2 заметно отвечал на 8ит9 (128 пептид специфических пятен на 105 клеток) и слабо - на 8ит1 (22 пептид специфических пятна на 105 клеток) (фиг. 3). Ответ на аналоговый пептид 8ит1Ь2 только немного увеличен по сравнению с нативным эпитопом, тогда как пациент отвечал одинаково сильно на пептид 8ит1М2 и десятимерный пептид 8иг9. У пациента СЬЬ3 наблюдали слабый
- 17 008026 ответ на 8иг9 (фиг. 3). Не было ответа у пациента на пептиды 8иг1 или модифицированный 8иг1. Не обнаружили ответы у последнего пациента СЬЬ4 (данные не показаны). РВЬ 6 здоровых индивидов НЬЛЛ2 положительного контроля проанализировали на возможность ответа на сурвивин. Не обнаружили ответ ни в одном контроле, ни на один из пептидов, производных сурвивина.
СТЬ ответ на сурвивин у пациентов, больных меланомой
Исследовали Т-лимфоциты, выделенные из инфильтрующей опухоли лимфатического узла у НЬЛЛ2 положительных пациентов с меланомой. Свеже резецированный лимфатический узел измельчили на мелкие фрагменты и раздавили, чтобы выпустить клетки в культуру. Перед ЕЫ8РОТ анализом клетки однократно простимулировали пептидом ίη νίίτο. Сурвивин специфические Т-клетки определили у трех из шести анализируемых пациентов. Заметный ответ на 8иг9 наблюдали у пациента Ме12 и Ме13. Также у этих пациентов определили более слабый ответ на пептид 8иг1 (фиг. 4). У пациента Ме11 ответ на слабо связанный пептид 8иг1 был заметнее, чем ответ на более сильно связывающийся с НЬЛ-Л2 пептид 8иг9 (фиг. 4). Не обнаружили ответ в инфильтрующей опухоли лимфатических узлов последних 3 пациентов с меланомой (Ме14-6). Исследовали РВЬ двух сурвивин активных пациентов Ме11 и Ме12 и двух пациентов Ме14 и Ме15, не имеющих активности. В РВЬ ни одного из этих пациентов не мог быть обнаружен никакой ответ ни на 8иг9, ни на 8иг1 (данные не показаны).
Пример 2. Спонтанные цитостатические ответы Т-клетки на рестриктированные по МНС классу I Т-клеточные эпитопы, производные сурвивина, ίη кйи и ех νίνο у пациентов, больных раком.
Резюме
Показаны ίη δίΐιι и ех νίνο спонтанные цитостатические ответы Т-клетки на рестриктированные по МНС классу I Т-клеточные эпитопы, производные сурвивина, у пациентов с раком молочной железы, лейкемией и меланомой. Кроме того, сурвивин активные Т клетки, изолированные с помощью магнитных гранул, покрытых комплексами МНС/пептид, оказались цитостатическими к НЬЛ-совместимым опухолям различных типов ткани. Являясь универсальным опухолевым антигеном, сурвивин может служить широко применимой мишенью для антираковой иммунотерапии.
Материалы и способы
Конструкция комплекса ИЬА-пептид для окрашивания и отбора Т-клеток
В Е. со11 ВЬ21 (ΌΕ3) с помощью биотин белоковой лигазы (В1гЛ) в связке с 5'-концами экстрацеллюлярных доменов НЬЛ А*0201 (остатки 1-275) экспрессировали сайт узнавания для ферментативного биотинилирования. Рекомбинантный белок очистили гель хроматографией (8ерйабех С25. Рйагшас1а) и ионно обменной хроматографией (ιηοηο-Ο, Рйагшааа) от включений, растворенных в 8М мочевины. НЬЛ А*0201 свернули ίη νίίτο растворением в присутствие модифицированного сурвивин пептида 8иг1М2 (ЬМЕбЕЕЕКЬ, 8Е0 Ю Νο: 5) или пептида МАА др100154-163, и затем биотинилировали, как описано выше (35, 36).
После гель-фильтрации на колонке Рйагтас1а 8ер11айех С25 для удаления несвязанного биотина белок мультимеризировали со стрептавидин-НТС (флуоресцентный изотиоцианат) конъюгированными молекулами декстрана, (любезно предоставленными Ь. ^V^ηίЬе^, ЭЛКО, Дания), чтобы получить мультиспецифическое соединение НЬЛ/декстран для иммуногистохимии. Конструкцию НЬЛ А*0201 любезно предоставил доктор Магк М. Ωηνίδ (факультет микробиологии и иммунологии Станфордского университета, Пало-Альто, Калифорния). Разделение клеток выполнили, как описано ранее (37). Вкратце, 5х106 меченных стрептавидином магнитных гранул (Оуηη1, Осло, Норвегия) промыли дважды 200 цл холодным РВ8 (натрий фосфатный буфер), добавили 0,5 цг мономеров пептид/А*0201, и смесь инкубировали 15 мин при комнатной температуре. После двух промываний эти гранулы смешали с РВЬ в отношении 1:10, затем инкубировали 1 ч, с последующим осаждением связанных гранулами клеток в магнитном поле. Этап осаждения провели однократно.
Иммуногистохимическое окрашивание
Для окрашивания НТС-коньюгированных мультимерных пептид/МНС комплексов участки ткани высушили на протяжении ночи и затем зафиксировали холодным ацетоном в течение 5 мин. Все этапы инкубации выполняли при комнатной температуре и в темноте: (ί) первичное антитело - 45 мин (разбавление 1: 100), (ίί) конъюгат Су3 с козьими антителами к мыши (разбавление 1:500; код 115-165-100, .Таскбюп Iттиηο Кекеагсй, полученный от ^^апονа, Гамбург, Германия) - 45 мин, и, наконец, (ίίί) мультимеры - 75 мин. Между каждым этапом предметные стекла промыли 2 раза по 10 мин 0,1% РВ8/В8Л. Слайды поместили в УеЛакЫеИ® и хранили в холодильнике до изучения под софокусным микроскопом.
Цитотоксический анализ
Традиционные [51Сг]-высвобождающие анализы СТЕ-опосредованной цитотоксичности выполняли, как описано в (13). Клетки-мишени являются аутологическими ЕВУ-трансформированными линиями В-клеток, НЕЛ-Л2 положительными линиями клеток рака молочной железы МСЕ-7 (доступные из американской коллекции типовых культур (АТСС)), НЕЛ-Л2 положительными линиями клеток меланомы ЕМ3 (38), НЕЛ-Л2 отрицательными линиями клеток рака молочной железы ВТ-20 (доступные из АТСС) и НЕЛ-Л2 отрицательной линией клеток меланомы ЕМ45 (38). Все линии раковых клеток экспрессировали сурвивином, как исследовали с помощью КТ-РСЯ (ревертазо-полимеразная цепная реакция) (дан
- 18 008026 ные не показаны).
ЕЫ8РОТ анализ
ЕЫ8РОТ анализ применяли для определения количества эпитопа пептида специфических интерферон-у-продуцирующих эффекторных клеток, как было описано ранее (39). Вкратце, нитроцеллюлозные 96-луночные планшеты (Мн11|8сгеен МА1Р Ν45, Μίΐΐίροΐΐ) покрыли анти-ΙΡΝ-γ антителом (1-Ό1Κ, МаЫесй, Швеция), и неспецифическое связывание блокировали, используя А1М V (С^ЬсοВΚ^, Ь1Ее ТесЫ-ю^Дех 1пс., Гайтерсбург, Мэриленд, США). Лимфоциты добавляли при различной концентрации клеток вместе со специфическими пептидами и Т2 клетками и инкубировали на протяжении ночи при 37°С. После двухразового промывания добавили биотинилированное антитело (7-В6-1-Биотин, МаЫесй). Специфическое связывание визуализировали с помощью авидин-щелочной фосфатазы вместе с соответствующим субстратом (СЛАВКЕ). Реакция остановили при появление темных фиолетовых пятен, которые подсчитали с помощью системы А1рйа1тадег (А1рйа Iηηοίесй, СанЛеандро, Калифорния, США). Для ЕБ18РОТ анализа использовали пептиды 8иг1, 8иг9 и 8иг1 аналоговый пептид 8иг1М2, как описано в примере 1.
Результаты
Ιη Ши окрашивание НЬА-А2/сурвивин активных Т-клеток
В примере 1 два пептидных эпитопа, производного сурвивина, распознавались Т-клетками при лейкемии и меланоме, т. е., был идентифицирован 8иг1. Слабая аффинность связывания 8иг1 с НБА-А2 была убедительно доказана заменой треонина в положении 2 на лучший якорный остаток (метионин; 8иг1М2). Эта мера позволила получить стабильные НЬА-А2/пептид комплексы. Эти комплексы мультимеризировали с помощью стрептавидин-Е1ТС конъюгированной молекулы декстрана.
Мультимеризированные МНС-комплексы использовали для окрашивания зафиксированного ацетоном замороженного материала. Используя софокусный лазерный микроскоп, можно было обнаружить ίη Ши в микроокружающей среде опухоли 8иг1М2/НЬА-А*0201 активные СТЬ. Такие клетки обнаружили в первичной опухоли и в сторожевом лимфатическом узле у пациента с меланомой III стадии, а так же и в первичном повреждении раком молочной железы. Чтобы гарантировать специфичность окрашивания, выполнили серию отрицательного контроля. Положительное окрашивание не наблюдали ни в случае применения пептид/НЬА-декстран мультимеров с пептидами, полученными из меланомного дифференцированного антигена др100 в той же опухоли, ни в случае 8иг1М2/НЕА-декстран мультимеров образца опухоли, полученного от НБА-А2 отрицательного донора.
Лизис линии клеток опухоли различной природы изолированными сурвивин активными СТЬ
Чтобы охарактеризовать функциональную способность сурвивин активных СТЬ, эти клетки выделили с помощью магнитных гранул, покрытых НЬА-А2/8иг1М2-комплексами (36). Свежерезецированный лимфатический узел инфильтрующей меланомы измельчили на маленькие фрагменты и раздавили, чтобы выпустить клетки в культуру. Перед выделением клетки стимулировали однократно пептидом ίη νίίτο. Спустя 1 день после изоляции добавили ГЕ-2, а на 5 день способность этих клеток убивать опухолевые клетки проанализировали либо ЕЫ8РОТ анализом, либо стандартным анализом с 51Сг-меткой. Вопервых, посредством ЕЫ8РОТ анализа стало возможным установить, что СТЬ, изолированные с помощью модифицированного 8иг1М2/НЬА-А2-комплекса также отвечают на нативный пептид 8иг1 (данные не показаны). Во-вторых, проверили цитотоксичность сурвивин активных СТЬ против НБА-А2 положительной линии клеток меланомы ЕМ3 (фиг. 5А) и НБА-А2 положительной линии клеток рака молочной железы МСЕ-7 (фиг. 5В). Изолированные Т-клетки, эффективно лизировали обе линии клеток НЬАА*0201. В отличие от этого, не обнаружили цитотоксичность по отношению к НБА-А2 отрицательной линии клеток меланомы ЕМ45 (фиг. 5А) или НБА-А2 отрицательной линии клеток рака молочной железы ВТ-20 (фиг. 5В).
Сурвивиновая активность, измеренная в РВЬ ЕЫ8РОТ анализом
Присутствие сурвивин активных Т-клеток в РВЬ у 10 пациентов с НБА-А2 положительным раком молочной железы исследовали ЕЫ8РОТ анализом. Перед анализом РВЬ простимулировали однократно ίη νίίτο, чтобы увеличить чувствительность анализа. Исследовали активность к следующим сурвивиновым пептидам: 8ит1, 8ит9 и 8ит1М2. Сурвивин специфические Т-клетки обнаружили у 6 из 10 пациентов с НБА-А2 положительным раком молочной железы. Типичные примеры представлены на фиг. 6. В РВЬ 2 пациентов обнаружили ответ на 8ит1 и модифицированный аналог 8ит1М2, но не на 8ит9 (фиг. 6, вершина, середина), у 3 пациентов обнаружили ответ на 8ит9, но не на 8ит1 или 8ит1М2 (основание фиг. 6), и 1 пациент отвечал только на 8ит1М2. Напротив, ответы на сурвивин не были обнаружены в РВЬ 20 здоровых НБА-А2 положительных доноров. Так же исследовали РВЬ у 14 НБА-А2 положительных пациентов с меланомой. Сурвивин ответы наблюдались у 7 из этих пациентов (табл. 2). Два пациента отвечали на пептид 8иг9, трое - на пептид 8ит1М2, один - и На8ит1, и на 8ит1М2, и один - на все три пептида. В примере 1 протестировали ответ Т-клетки на сурвивин у 3 пациентов с хронической лимфатической лейкемией (СТЬ) (табл. 2; СЬЫ, СЕЬ2, СЬЬ3). Эти исследования расширили, используя РВЬ трех дополнительных пациентов с СЬЬ. Примечательно то, что у всех пациентов наблюдался ответ Т-клеток по меньшей мере на один эпитоп сурвивина (табл. 2; СЕЬ5, СЕЬ6, СЬЬ7). Кроме того, исследовали РВЬ одного пациента, страдающего хронической миелоидной лейкемией (СМЬ). У этого пациента идентифицирова- 19 008026 ли ответ на все три пептида (данные не показаны). Данные помещены в табл. 2.
Таблица 2. Пациенты с сурвивин пептид-специфическими Т-лимфоцитами в РВЬ, измеренными ЕЫ8РОТ анализом
| Меланома а) | |
| Пациент | 8иг1 |
| Р4 | - |
| Р11 | - |
| Р13 | - |
| Р15 | 61 |
| Р17 | - |
| Р39 | - |
| Р64 | 112 |
| Рак молочной же | лезы б) |
| Пациент | 8иг1 |
| В1 | 122 |
| В2 | 67 |
| ВЗ | - |
| В4 | - |
| В5 | - |
| В6 | - |
| СЬЬ в) | |
| Пациент | 8иг1 |
| СЬЫ | - |
| С1Х2 | - |
| СЬЬЗ | 23 |
| СЬЬ5 | - |
| СЬЬб | - |
| С1Х7 | 68 |
| 8иг9 | 8иг1М2 |
| - | 97 |
| - | 112 |
| - | 71 |
| - | 101 |
| 172 | - |
| 127 | - |
| 70 | 128 |
| 8иг9 | 8иг1М2 |
| - | 208 |
| - | 72 |
| 54 | - |
| 45 | - |
| 19 | - |
| - | 24 |
| 8иг9 | 8иг1М2 |
| 27 | 320 |
| 39 | - |
| 127 | 122 |
| 100 | 124 |
| 121 | 360 |
| 132 | 174 |
а) Частота активных клеток на 104; обследованы 14 пациентов.
б) Частота активных клеток на 104; обследованы 10 пациентов.
в) Частота активных клеток на 105; обследованы 7 пациентов.
Пример 3. НЬА-В35-рестриктированные иммунные ответы на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, страдающих раком.
Резюме
В данном исследовании идентифицировали и охарактеризовали два эпитопа, производного сурвивина, рестриктированных по Н1.А-В35. У пациентов с различными формами опухоли кроветворных органов и меланомой в периферической крови присутствовала специфическая Т-клеточная активность на оба эти эпитопа. Замещение якорного остатка на С-конце улучшили распознавание лимфоцитами инфильтрующей опухоли у пациентов с меланомой. Кроме того, продемонстрированы спонтанные цитотоксические ответы Т-клеток на сурвивин ίη δίΐυ. при первичном меланомном повреждении. Эти эпитопы
- 20 008026 расширяют возможность применения стратегий вакцинирования, основанных на пептидах сурвивина, по отношению к злокачественным опухолям, так же как НЬА профиль вовлеченных пациентов.
В примерах 1 и 2 изучались рестриктированные по НЕЛ-Л2 эпитопы Т-клеток, производные сурвивина. Так как НБА-А2 экспрессирован только у приблизительно 30% кавказской популяции (63), чтобы расширить группу пациентов, которых можно будет вылечить, необходимо определить пептидные эпитопы, рестриктированные по другим молекулам НЬА класса I. В данном исследовании идентифицировали два новых Т-клеточных эпитопа сурвивина, рестриктированного по НБА-В35, который экспрессирован у 9% кавказской популяции (63), и определили спонтанные иммунные ответы на эти пептиды сурвивина у пациентов с различными опухолями кроветворных органов и меланомой.
Материалы и способы Пациенты
У пациентов, больных раком, отобрали образцы периферической венозной крови, выделили РВЬ, используя 1.утр11оргер'; сепарацию, определили НЬА-тип (Отделение Клинической Иммунологии, университетская больница, Копенгаген) и заморозили в ЕСБ с 10% диметилсульфоксидом. Для дальнейшего обследования отобрали десять НБА-В35 положительных пациентов. Эти пациенты страдали меланомой, СЬЬ, фолликулярной лимфомой (ЕБ), диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой (ЭЕВСЬ) и множественной миеломой (ММ), соответственно. На момент отбора образцов крови пациенты не получали лечения в течение предыдущих 4 месяцев. Дополнительно у 3 пациентов с меланомой из лимфатических узлов выделили лимфоциты инфильтрующей опухоли (ТП.) и заморозили их в ЕСБ с 10% диметилсульфоксидом.
Пептиды
В исследовании использовали семь синтетических пептидов, производных сурвивина: Биг6-14, Биг11-19, Биг34-43, Биг46-54, Биг51-59, 8иг46У9, 8иг51У9, и один ЕВУ-производный пептид, ЕВNА3А 457-466 (63). Все пептиды были получены от ВезеагеЬ Сепейез (Хантсвилл, Алабама) и обеспечили чистоту >90%, проверив высокоэффективной жидкостной хроматографией (НРЬС) и масс-спектрометрическим анализом (МБ). Пептиды внесены в табл. 3, ниже.
Таблица 3. НБА-В35 связывание пептидов, производных сурвивина
| Название | Белок и его положение | Последовательность | 8Е(2 ГО ΝΟ: | С50 (μΜ) |
| 8иг6-14 | Сурвивин6.14 | ЬРРАУ^РЕБ | 18 | >100 |
| 8иг11-19 | СурВИВИН! Ы9 | (ЗРЕЬкоши | 19 | Нет связывания |
| 8иг34-43 | СурВИВИН34_43 | ТРЕКМАЕА6Г | 20 | >100 |
| 8иг46-54 | СурВИВИН4б.54 | ΟΡΤΕΝΕΡϋΕ | 6 | 20 |
| 8иг51-59 | СурВИВИН51_59 | ЕРОЬАрСЕЕ | 7 | 13 |
| 8иг46У9 | Модифицированн ый пептид | ΟΡΤΕΝΕΡϋΥ | 8 | 4 |
| 8иг51У9 | Модифицированн ый пептид | ЕАЬАОСЕУ | 9 | 1,5 |
| С24 | ΕΒΝΑ3Α458-466 | УРЬНЕрНрМ | 21 | 0,8 |
Анализ структурных связей пептидного связывания с молекулами МНС класса I.
Для измерения аффинности синтетических пептидов с молекулами НБА-В35, метаболически меченными [835] метионином, применили анализ структурных связей, описанный в примерах 1 и 2. Вкратце, анализ основывается на пептид-опосредованной стабилизации свободных молекул НБА, выделенных при лизисе клетки из линии ТАР дефицитных клеток Т2, стабильно трансфекцированных с НБА-В35 (любезно предоставленная Доктором Дж. Наигит, БутрКореп АрБ, Лингби, Дания). Стабильно свернутые молекулы НБА осадили с помощью конформационно-зависимого моноклонального антитела \\'6 '32. Молекулы НБА отделили 1ЕЕ электрофорезом, гели исследовали аппаратом визуализации (1шадтд р1а1е, Еил ρΙοίο ГИт Со., ЕТ1), Япония), проанализировали и количество правильно свернутых молекул НБА определили с помощью программного обеспечения 1тадеСаиде ρΙπ^ρΙιοππίΒ^ι· (Еил ρΙιοίο ГИт Οο., БТО, Япония).
Стимуляция антигена РВЬ
Чтобы увеличить чувствительность ЕЫБРОТ анализа, лимфоциты однократно простимулировали ΐη νίίτο с пептидом до анализа (14, 15). РВЬ или ΕΙΕ оттаяли и простимулировали 50 цМ эпитопов пептида в 96-луночном планшете 2 ч при 26°С (5х105-106 клеток на пептид) и объединили для дальнейшего 10- 21 008026 дневного культивирования при 37°С на среде х-νίνο с 5% человеческой сывороткой (Н8) в 24-луночном планшете (Нанк, Роскилд, Дания) с 2х106 клетками в лунке. На второй день инкубации добавили 40 цг/мл +-2 (Аробап А/8, Дания). На 10 день культуральные клетки проверили на активность ЕЫ8РОТ анализом.
ЕЫ8РОТ анализ
ЕЫЗРОТ анализ для определения количества специфического пептида ΞΕΝ-γ продуцирующих эффекторных клеток в РВЬ или ТТЬ, отобранных у пациентов, страдающих раком, выполняли, как описано в примере 1. Вкратце, нитроцеллюлозные 96-луночные планшеты (МиШ8сгееп МАР N45; М1Шроге, Хедехузен, Дания) покрыли моноклональными антителами против ΞΕΝ-γ человека, 7,5 цг/мл (1-Б1К; МаЬ1ес1т Нака, Швеция). Лунки промыли, заполнили средой χ-νίνο (х-νίνο 15ТМ ВюАЫйаскег, Мо1еси1аг Арр11саЕоп8 Арк, Дания) и добавили клетки в двух повторностях при различных концентрациях.
Для демонстрации антигена в каждую лунку добавили 104 Т2-В35 клетки без пептида и с10 цМ пептида. Планшеты инкубировали на протяжении ночи, клетки удалили, а лунки промыли до добавления биотинилированного вторичного антитела (7-В6-1-Биотин; МаЫесН). Планшеты инкубировались 2 ч при комнатной температуре, и добавили конъюгат авидин-щелочной фосфатазы (АР-А\абт; Са1Ьюсйет, Ь1£е ТесЬм^^ек, Шс.). После 1 ч инкубации при комнатной температуре добавили субстрат фермента нитросиний тетразолий/5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (Кодовый Номер К0598, ^акοСуΐοтаΐ^οη №гбеп А/8), темно-фиолетовые пятна появились через 3-7 мин. Реакцию остановили промыванием водопроводной водой. Пятна подсчитали с помощью системы А1рЬа Ипадег (А1рЬа IηηοΐесЬ, СанЛеандро, Калифорния), и частота пептид специфических Т-клеток рассчитали по числу клеток, формирующих пятна. Все анализы выполняли в двух повторностях для каждого антигена пептида, и лимфоциты, культивируемые в тех же лунках, тестировали в равных количествах клеток с пептидом и без пептида, чтобы измерить число пептид специфических клеток в культуре.
Созревание дендритных клеток (ОС)
Адгезивные клетки изолировали от РВЬ после 2 ч культивирования. Их культивировали еще 10 дней на питательной среде ΚРМI 1640 (СЬ^ТМ [пгйгодеп ^^οι^ίοη, Великобритания) с 10% ЕС8. Каждый третий день добавляли 800 нг/мл СМ-С8Е (гранулоцит-макрофаг колонне стимулирующий фактор) (РгергоТесЬ, Лондон, Великобритания) и 40 нг/мл !И-4 (РгергоТесЬ). На 10 день БС довели до полного созревания, добавляя 50 нг/мл ΊΝΕ-α в течение 24 ч (РгергоТесЬ). После созревания БС высвободили и сенсибилизировали 20М пептида в присутствии 3 цг/мл в2-микроглобулина в течение 2 ч при 26°С.
Выделение пептид специфических Т-клеток
Антиген специфические клетки изолировали с помощью покрытых 8иг51У9/НЕА-В35 магнитных гранул, как описано в примере 2. Биотинилированные мономеры НБА-В35 с 8иг51У9 (получено от Рго^шипе, Оксфорд, Великобритания) соединили с покрытыми стрептавидином магнитными бусинками (БупаЬеабк М-280, Бупа1 А/8, Осло, Норвегия), инкубируя 2,5 цг мономеров с 5х106 гранулами в 40 цл РВ8 20 мин при комнатной температуре. Магнитные комплексы трижды промыли в РВ8, используя магнитное устройство (Бупа1 А/8, Осло, Норвегия) и затем смешали с РВЬ в отношении 1:10 в РВ8 с 5% В8А при очень мягком вращение в течение 1 ч. Антиген специфические СБ8+ Т-клетки, связавшиеся магнитными комплексами, мягко промыли дважды или трижды. Изолированные клетки ресуспендировали несколько раз ш νίνο добавлением 5% сывороткой человека и инкубировали 2 ч прежде, чем магнитные гранулы были освобождены и удалены из клеточной суспензии. Изолированные антиген специфические СБ8+ Т-клетки подвергли ЕЫ8РОТ анализу для изучения перекрестной отвечаемости между нативным и модифицированным пептидом.
Картирование клонотипа электрофорезом в денатурирующем градиентном геле (БССЕ)
Картирование ТСР клонотипа электрофорезом в денатурирующем градиентном геле ТСР ВУ участков 1-24 человека подробно описано в (66). Вкратце, РКН изолировали с помощью набора для выделения Ригексг1р1® (СеШга 8уЧетк Шс. МХ) и транскрибированную кДНК амплифицировали ПЦР (полимеразно цепная реакция) с помощью праймеров для переменных областей ТСР-В цепи в конъюгации с праймером известной константной области. Чтобы убедиться, что амплифицированные молекулы ДНК были охвачены БССЕ анализом, к 5'-концу константной области праймера присоединили 50 пар нуклеотидов СС-богатой последовательности (СС-с1атр). БССЕ анализ сделали на 6% полиакриламидных гелях, содержащих градиент мочевины и формамида от 20 до 80%. Электрофорез выполнили при 160 У в течение 4,5 ч в 1-кратном ТАЕ буфере (трис-ацетат-этилендиаминтетраацетат) при постоянной температуре 54°С.
Для идентификации антиген специфических Т-клеток ш κίΐιι в опухолевых повреждениях у пациентов, страдающих раком, применили иммуногистохимическое окрашивание мультимеризированных пептид/НЬА комплексов, как описано в примере 2. Биотинилированный мономер 8иг51¥9/НЬА-В35 был предоставлен Рго1ттипе йтйеб, Оксфорд, Великобритания. Биотинилированный мономер 8иг51¥9/НЬА-В35 мультимирезировали со стрептавидин-ΕIТС-конъюгированными молекулами декстрана (любезно предоставленными Ь. АшШег, БАКО, Глоструп, Дания), чтобы получить мультивалентные НЬА/декстран соединения для иммуногистохимии. Кусочки ткани высушили в течение ночи и затем зафиксировали в холодном ацетоне 5 мин. Все этапы инкубации выполняли при комнатной температуре
- 22 008026 и в темноте: (ί) первичное антитело - 45 мин (разбавление 1:100), (ίί) конъюгат Су3 с козьими антителами к ЦС мыши (разбавление 1:500; код 115-165-100, 1аск8оп 1ттипо Векеагсй. полученный от Οίαηονα. Гамбург, Германия) - 45 мин. и. наконец. (ш) мультимеры - 75 мин. Между каждым этапом предметные стекла промыли 2 раза по 10 мин 0.1% ΡΒ8/Β8Λ. Предметные стекла поместили в УесЕ-МиеИ® и хранили в холодильнике до изучения под софокусным микроскопом (Ьеюа).
Результаты идентификации связанных с ИЬА-В35 пептидов, производных сурвивина
Аминокислотную последовательность сурвивина исследовали на предмет 9- и 10-мерных пептидов с якорными остатками. согласно пептид-связывающему мотиву ΗΓΑ-Β35 (67). Отобрали пять пептидов. содержащих пролин. как якорный остаток Ν-конца в положении 2. фенилаланин. лейцин. изолейцин или тирозин. как якорные остатки С-конца (табл. 3). Анализ структурных связей показал два пептида. 8ит5159 (ΕΡΌΓΑρΟΡΡ. 8ЕЦ ΙΌ Νο: 7) и 8ит46-54 (ΟΡΤΕΝΕΡΌΕ. 8ΕΟ ΙΌ Νο: 6). которые способны эффективно стабилизировать НБА-В35. Кроме того. два пептида. 8ит34-43 (ΤΡΕΒΜАΕАСЕ. 8ЕО ΙΌ Νο: 20) и 8ит6-14 (ΕΡΡΛΧνΟΡΕΕ·. 8ЕО ΙΌ Νο: 18). показали слабую стабилизацию. тогда как оставшийся пептид не стабилизировал НБА-В35 вообще. Концентрация пептида. необходимая для связывания половины максимального количества молекул НБЛ-В35 (С50) составила 13 рМ для 8ит51-59 и 20 рМ для 8ит46-54. Для сравнения. значение С50 для эпитопа С24 от ΕΒΝΛ3Λ458-466 (ΥΡΕΗΕΟΗΟΜ. 8ЕО ΙΌ Νο: 21) - положительного контроля. составило 0.81 рМ.
Чтобы усилить аффинность 8ит46-54 и 8ит51-59. С-конец аминокислоты заместили тирозином. лучшим якорным остатком (67). Связывание ΗΕΛ-Β35 модифицированными пептидами исследовали анализом структурных связей. и значения С50 составили 1.51 рМ - для 8πτ51Υ9 и 4 рМ - для 8πτ46Υ9 (фиг. 7).
Спонтанные иммунные ответы на нативные пептидные эпитопы
Первоначально. проанализировали 5 пациентов на предмет спонтанных иммунных ответов на четыре нативных связанных с ΗΕΛ-Β35 пептидов: 8ит51-59. 8ит46-54. 8ит34-43 и 8ит6-14. Эти 5 пациентов имели различные опухоли кроветворных органов: НЕМ8 и НЕМ18. страдающий ММ. ΗΕΜ12. страдающий ЕЕ·. ΗΕΜ9. страдающий ΌΕΒΟΕ. и СЕЕ5. страдающий СЕЕ.
ΙΝΕ-γ ΕΕΙ8ΡΘΤ анализ выполняли на ΡΒΕ после 10 дней стимулирования ίη νίίτο для определения пептидного предшественника СТБ. Спонтанные иммунные ответы выявили против двух из нативных ΗΕΛ-Β35 связанных пептидов. 8ит51-59 и 8ит46-54. Два пациента НЕМ12 и СЕЕ5 показали ответ и на 8ит51-59 и на 8ит46-54. тогда как НЕМ8 показал ответ только на 8ит51-59 (фиг. 8А и В). У остальных двух пациентов. НЕМ9 и НЕМ18. не обнаружили ответ. а также ответ не обнаружили к слабо связывающим пептидам 8ит34-46 и 8ит6-14 ни у одного из пациентов.
Альтернативный подход к ίη νίίτο стимуляции применили у пациента НЕМ12. т.е. ΡΒΕ культивировали с созревшими аутологическими дендритными клетками. сенсибилизированными 8ит51-59 для стимулирования СТБ ответа ίη νίίτο. ΡΒΕ из этой культуры показали сильную активность к 8ит51-59 при ΕΕΙ8ΡΘΤ анализе (фиг. 8В).
Усиленное распознавание модифицированных пептидов
Как описано выше. аффинность ΗΕΛ-Β35 к модифицированным пептидам превышает в 5-10 раз аффинность ΗΕΛ-Β35 к нативным пептидам. Группу пяти пациентов с меланомой проанализировали на предмет спонтанных иммунных ответов на нативные и модифицированные пептиды с помощью ΕΕΙ8ΡΘΤ анализа. Образцы ΡΒΕ проанализировали после ίη νίίτο стимуляции. тогда как образцы ΤΙΕ проанализировали без стимуляции. Спонтанные иммунные ответы наблюдались и в ΡΒΕ. и в ΤΙΕ у 3 из 5 пациентов. ЕМ25 показал активность к 8ит51-59 и 8πτ51Υ9 и в образцах ΡΒΕ и ΤΙΕ (фиг. 9А). У ЕМ45 обнаружили мощный ответ в ΤΙΕ только на модифицированный пептид 8ητ51Υ9. ΡΒΕ у этого пациента не рассматривали (фиг. 9А). ЕМ74 показал мощный ответ на 8πτ46Υ9 в ΤΙΕ. но ответ на нативный пептид не обнаружили (фиг. 9В). А также наблюдали слабый ответ на 8πτ46Υ9 в ΡΒΕ ЕМ74 (данные не показаны).
Перекрестная активность между нативным и модифицированным пептидом
Высокая аффинность 8ητ51Υ9 к ΗΕΛ-Β35 позволяет продуцировать стабильные мономеры ΗΕΛΒ35 с 8ητ51Υ9. Установлено присутствие сурвивин активных Т-лимфоцитов в инфильтрующей опухоли лимфатических узлов в ΡΒΕ различных пациентов. больных раком. Магнитные гранулы покрыли комплексом ΗΕΛ-Β35/8υτ51Υ9 и применили для выделения сурвивин активных Т-лимфоцитов ΡΒΕ у пациента СЕЕ5. Этот пациент показал мощный ответ на 8ит51-59. С помощью микроскопа наблюдали. как гранулы плотно прикрепились к клеточной поверхности определенных клеток (данные не показаны). обеспечивая осаждение антиген специфических клеток магнитным полем.
Изолированные 8ητ51Υ9 специфические клетки мощно отвечали на 8ит51-59 (фиг. 9). тогда как в остальных ΡΒΕ не обнаружили ответ (данные не показаны). Изолированные клетки проанализировали ΚΤ-ΡСΚ^/^ССΕ. основанном на картировании ТСЯ клонотипа. Эта методика позволяет анализировать Тклеточную клональность в популяциях комплексных клеток. даже при наличии небольшого числа клеток. Эти исследования показали. что изолировано 8 отдельных клонов (данные не показаны).
- 23 008026
Присутствие антиген специфических Т-клеток ΐη «Ни в меланомных повреждениях
Мономеры 5>иг51У9/НЬА-В35 мультимеризировали с помощью молекул декстрана, конъюгированных со стрептавидином и МТС.
Мультимеризированные комплексы МНС использовали для окрашивания фиксированного ацетоном, замороженного материал с помощью методики, описанной в примере 2. Антиген специфические клетки наблюдали с помощью софокусного лазерного микроскопа. Проанализировали участки первичной меланомы трех пациентов, и §цг51¥9/НЬА-В35-активные СТЬ легко определялись ίη 8Йи в микроокружающей среде опухоли у одного из пациентов. Совместное окрашивание с тАЬ по гранзиму В показало, что эти сурвивин специфические СТЬ производят гранзим В, проявляя цитотоксическую активность, НЬА-В35 отрицательные пациенты с меланомой использовались как контроль (данные не показаны).
Пример 4. Идентификация новых СТЬ эпитопов, производных сурвивина, с различными НЬА-Арестрикционными профилями.
Резюме
На основании СТЬ ответа у пациентов, страдающих раком, охарактеризовали новые НЬА-А1-, НЬА-А2-, НЬА-А3-и НЬА-А11-ретрикционные эпитопы сурвивина. Эти эпитопы значительно увеличивают число пациентов, имеющих показание к иммунотерапии, основанной на пептидах, производных сурвивина. К тому же, совместное нацеливание нескольких элементов рестрикции, вероятно, уменьшит риск ускользания от иммунного ответа из-за потери НЬА-аллеля.
Материалы и способы
Образцы у пациентов были получены в Вирзбургском Университете, Германия, и Университетской Больницы в Херлеве, Дания. Согласие проинформированных пациентов на участие в исследовании было получено предварительно до начала какого-либо из данных мероприятий. Типирование ткани проводили в Отделе Клинической Иммунологии Университетской Больницы, Копенгаген, Дания. С помощью Ьутрйоргер® сепарации выделили лимфоциты периферической крови (РВЬ) пациентов с меланомой, раком молочной железы и хронической лимфоцитарной лейкемией (СЬЬ) и заморозили их в эмбриональной сыворотке теленка (ЕС8) с 10% диметилсульфоксидом. Кроме того, получили Т-лимфоциты из первичных повреждений и из инфильтрующей опухоли лимфатических узлов пациентов с меланомой. Свежерезецированную опухолевую ткань измельчили на мелкие фрагменты и раздавили, чтобы выпустить лимфоциты инфильтрующей опухоли (Т1Ь) для криоконсервации.
Пептиды
Все пептиды приобрели у 1пуйгодеп (Карлсбад, Калифорния, США), довели до чистоты >80%, проверенной НРЬС и М8 анализом. Все используемые пептиды внесены в табл. 4, пример 5 ниже.
Линии клеток
Линия клеток человека Т2 является дефицитным по ТАР1 и ТАР2 гибридом В-ЬСЬ174 и Т-ЬСЬ СЕМ клеток, и, таким образом, экспрессируют низкие уровни молекул НЬА класса I (НЬА-А*0201 и НЬА-В*5101) на клеточной поверхности. Т2 клетки, трансфектированные с НЬА-А*0301, были любезно предоставлены доктором МсМюйеае1 (1ММ, ЛоИп ВабсйГГе Но§рйа1, Оксфорд). Т2 клетки, трансфектированные с НЬА-А*1101 были любезно предоставлены доктором М. Макиса (МТС, Кагойпкка 1п5111и1е. Стокгольм, Швеция). Линия клеток ВМ36.1 также дефицитна по ТАР функции, и имеет фенотип сходный с фенотипом Т2 с низкой экспрессией НЬА класса I (НЬА-А*0101, НЬА-В*3501) на поверхности. ВМ36.1 клетки были любезно предоставлены доктором 21ед1ег (НцтЬо1Ш Ишуегайу, Берлин, Германия).
Анализ структурных связей пептидного связывания молекул МНС класса I
Аффинность синтетических пептидов (1пуйгодеп, Карлсбад, Калифорния, США) к НЬА-А1,-А2, А3, или -А11 молекулам, метаболически меченным [358]-метионином, измерили анализом структурных связей, как описано ранее (12). Анализ основывается на пептид-опосредованной стабилизации свободных молекул НЬА, высвобожденных при лизисе клеток, из ТАР-дефицитных клеточных линий. Стабильно свернутые молекулы НЬА иммунно осадили с помощью НЬА класса I специфического, конформационно-зависимого тАЬ \У6/32, и отделили изоэлектрофокусировкой (ГЕЕ) гель электрофореза. Количество полос тяжелой цепи МНС определили, используя программу 1тадеСаиде РНодэйоптадег (ЕИЛ рйоГо Г11т Со., Каролтон, Техас, США). Интенсивность полосы пропорциональна количеству комплексов пептид/МНС класса I, образованных в течение опыта. Впоследствии, степень стабилизации молекулы НЬА непосредственно связана с аффинностью добавленного пептида. Концентрация пептида использовалась для анализа связывания молекул НЬА и составляла 40, 4, 0,4, 0,04 цМ для НЬА-А1 и НЬА-А11 и 100, 10, 1, 0,1, 0,01 цМ для НЬА-А2 и НЬА-А3. Значение С50 рассчитали впоследствии для каждого пептида как концентрацию пептида, достаточную для половины максимальной стабилизации.
Антигенное стимулирование РВЬ
Чтобы увеличить чувствительность ЕЫ8РОТ анализа, РВЬ однократно простимулировали ш уйго до анализа. В день начала опыта РВЬ или измельченные лимфатические узлы оттаяли и были высеяны с концентрацией 2х106 клеток в 2 мл/лунка на 24-луночные планшеты (Нанк, Роскилд, Дания) на среду хУ1уо (Вю ^Ыйакег, Волкерсвиль, Мэриленд) с 5% инактивированной высокой температурой человеческой сывороткой и 2 мМ Ь-глутамина в присутствии 10 цМ пептида. Спустя 2 дня к культурам добавили
- 24 008026
МЕ (международная единица)/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (ЕЬ-2) (Онгои. Ратинген, Германия). На 10 день культуральные клетки проверили на активность ЕЫ8РОТ анализом.
ЕЫ8РОТ анализ
ЕЫ8РОТ анализ использовали для количественного определения пептидных эпитопов специфических интерферон^-продуцирующих эффекторных клеток, как описано ранее (16). Вкратце, нитроцеллюлозный 96-луночный планшет (МиЫЗсгеен МАШ Ν45, М^11^ρο^е, ώΗιιι^ι·^ Дания) покрыли анти-ΙΓΝ-γ антителом (1-Э1К, МаЬГесЬ, Нака, Швеция). Лунки промыли, заполнили средой Χ-νίνο, и поместили клетки в двух повторностях при различных концентрациях клеток. В каждую лунку добавили пептиды, и планшеты инкубировали на протяжении ночи. На следующий день среду удалили, и лунки промыли перед добавлением биотинилированного вторичного антитела (7-В6-1-Биотин, МаЬГесй). Планшеты инкубировали в течение 2 ч, промыли, и добавили в каждую лунку конъюгированную авидин-щелочную фосфатазу (Са1Ьюсйет, ЫГе ТесЫ-ю^ще^ Шс., Сан-Диего, Калифорния, США). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Затем промыли, добавили в каждую лунку ферментный субстрат НВТ/ВСЧР (нитросиний тетразолий/бромохлороиндолилфосфат) (Па^Су^та!^ гбен А/8, Глоструп, Дания) и инкубировали при комнатной температуре 5-10 мин. После появления темнофиолетовых пятен реакцию остановили промыванием водопроводной водой. Пятна подсчитали, используя Анализатор Iттиηο8ροΐ@ серии 2.0 (СТЬ Аηа1уζе^8, ЬЬС, Кливленд, США), и частоту пептид специфической СТЬ рассчитали по числу клеток, формирующих пятно. Все анализы выполняли в двух повторностях для каждого пептидного антигена.
Результаты
Идентификация рестриктированных по ИЬА-А1 эпитопов сурвивина Связывание пептидов, производных сурвивина, с НЬА-А1
Аминокислотную последовательность белка сурвивина обследовали на предмет наиболее вероятного НЬА-А1 9-мерного или 10-мерного пептидного эпитопа, используя основные якорные остатки НЬАА1, аспарагиновую кислоту (Ό), глутаминовую кислоту (Е) в положении 3 и тирозин (Υ), фенилаланин (Γ) на С-конце. Соответственно, шесть пептидов, производных сурвивина, синтезировали и исследовали на связывание с НЬА-А1 (табл. 4). Дополнительно, включили два пептида 8ит38-46 (МАЕАСГШС) (8Еф ΙΌ Νο: 23) и 8ит47-56 (РТЕХЕРЭЕАС) (8Еф ΙΌ Νο: 25), не смотря на то, что они содержат только один из основных якорных остатков, так как оба были идентифицированы как вероятно хорошие связывающие по прогнозирующему алгоритму Каттещее и др. доступным в Ьΐίρ://8уίρе^ίЫ.Ьт^-Ье^άе1Ье^д.сοт/. Значение С50 получили для каждого пептида, как концентрацию пептида, необходимую для связывания половины от максимального количества молекул НЬА-А1 (табл. 4). Однако только один из этих пептидов 8ит92-101 (ОГЕЕЕТЕСЕГ) (8ЕО ΙΌ Νο: 27), связанный с почти такой же высокой аффинностью как у известного эпитопа положительного контроля белка Гриппа А основной полимеразы 1 (РВ1) (V8^ССРN^Υ), как показано на фиг. 10. 8ит93-101 (ГЕВЬТЬСЕГ) (8ЕО ΙΌ Νο: 24) показал низкую аффинность к НЬА-А1, поскольку ни один из других пептидов не анализировали на связывание с НЬА-А1 (табл. 4). Следовательно, было синтезировано множество аналоговых пептидов, в которых лучшие якорные остатки заменяли нативные аминокислоты. Было модифицировано два пептида 8ит38-46 (МАЕ АСИНС) (8ЕО ΙΌ Νο: 23) и 8ит47-56 (РТЕХЕРОЕЛО) (8ЕО ΙΌ Νο: 25) введением тирозина (Υ) вместо цистеина (С) или глутамина (О), соответственно, на С-конце. Оба модифицированных пептида прочно связались с НЕА-А1 (табл. 4). К тому же в двух пептидах, 8иг92-101 и 8ит93-101, были замещены аминокислоты в положении 2 вспомогательными якорными треонином (Т) или серином (8). Эти модификации не имели положительного эффекта связывания 8иг92-101 с НЬА-АЬ Напротив, 8иг93Т2 (ГТЕЬТЬСЕГ) (8ЕО ΙΌ Νο: 36) связывался с высокой аффинностью с НБА-А1 (табл. 4). Фиг. 10 иллюстрирует связывание нативного пептида 8иг93-101 с низкой аффинностью, высокую аффинность модифицированного пептида 8иг93Т2 и отсутствие связывания у пептида 8иг49-58 по сравнению с положительным контролем - эпитопом от гриппа. Наконец, модифицировали 8иг14-22, 8иг34-43, 8иг49-58, 8иг51-59, 8иг92-101 и 8иг93-101 с тирозином (Υ) на С-конце, однако, это не улучшило связывающую аффинность с НЬА-А1 какого-либо из этих пептидов (данные не показаны).
Ответ рестриктированного по НЬА-А 1 СТЬ на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, страдающих раком.
РВЬ шести пациентов с меланомой и ТГЬ трех пациентов с меланомой проанализировали на присутствие СТЬ, специфического к какому-либо из четырех пептидов, производных сурвивина, с высокой аффинностью - 8πτ38Υ9, 8πτ47Υ10, 8иг92-101, и 8иг93Т2, посредством ЕЫ8РОТ анализа. Активность Тклеток на по меньшей мере один из пептидов, производных сурвивина, наблюдалась в трех образцах РВЬ, и в одном образце ТГЬ из общего количества образцов девяти обследованных пациентов. Как видно из фиг. 11, РВЬ одного пациента, Ме1.А1-3, выполнял главную роль при Т-клеточном ответе на все четыре пептида, 8πτ38Υ9, 8πτ47Υ10, 8иг92-101 и 8иг93Т2. Ме1ЬА1-2 показал ответы на 8πτ47Υ10, 8иг92-101 и 8иг93Т2, тогда как у МеГАМ/ТГО и Ме1.А1-4/РВЬ наблюдались ответы на 8πτ47Υ10 и 8иг93Т2, соответственно (фиг. 11).
Кроме того, 10 пациентов с меланомой обследовали на иммунную активность к нативным пептидам
- 25 008026
8иг93-101, 8иг38-46 и 8иг47-56 посредством ЕЫ8РОТ анализа; однако у всех этих пациентов не обнаружили пептид-специфические ответы (данные не показаны).
Идентификация эпитопа сурвивина, рестриктированного по НЬА-А11 Связывание пептидов, производных сурвивина, с НЕА-А11
Аминокислотная последовательность белка сурвивина изучалась на предмет наличия 9-мерных или 10-мерных пептидов со связывающими мотивами, соответствующими данному суперсемейству НЕА-А3, включая НЬА-А3 и НЬА-А11. Пептидные последовательности с основными якорными остатками, лейцин (Ь) в положении 2 и лизин (К) на С-конце, выбрали вместе с пептидными последовательностями, имеющими соответственные аминокислоты в этих положениях согласно прогнозирующему алгоритму Ватшспчсс и др. (табл. 4).
Тринадцать пептидов были предсказаны в последовательности белка сурвивина и проанализированы на связывание с НЬА-А11 и НЬА-А3. Три из этих пептидов, 8ит53-62 (ПЬАрСЕЕСЕК) (8ЕО ΙΌ Νο: 47), 8иг54-62 (ЕАОСЕЕСЕК) (8 ЕЕ) ГО Νο: 42) и 8ит112-120 (КIАКЕТNNК) (8ЕЕ) ГО Νο: 44), связывали НЬА-А11 с высокой аффинностью, сопоставимой с аффинностью вирусного эпитопа ядерного антигена 4 (АУЕОВК8ПАК) (8ЕО ГО Νο: 63) ЕВУ. Кроме того, один пептид, 8иг112-121 (К1АКЕТХХКК) (8ЕО ГО Νο: 51), слабо связывался с НЬА-А11 (табл. 4).
Ответы СТЬ, рестриктированных по НТА-А11, на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, больных раком
РВЬ пяти пациентов с меланомой и двух пациентов с СЬЬ протестировали на Т-клеточную активность к четырем связывающимся с НЬА-А11 пептидам - 8иг53-62, 8иг54-62, 8иг112-120 и 8иг112-121. Обнаружили ответы на пептид 8иг53-62, производный сурвивина, у РВЬ двоих пациентов с меланомой, Ме1.А11-1, Ме1.А11-2, посредством ЕЫ8РОТ анализа (фиг. 12). К тому же, обнаружили 8иг53-62 специфические Т-клетки среди лимфоцитов в инфильтрующей опухоли (Т1Ь) из инфильтрующей опухоли лимфатических узлов у пациента Ме1.А11-2 (фиг. 12). У пациента Ме1.А11-1 наблюдался мощный иммунный ответ на пептид сурвивина 8иг53-62 в пяти различных образцах крови, взятых в течение двух лет (данные не показаны).
Идентификация эпитопа сурвивина, рестриктированного по НЬА-А3 Связывание пептидов, производных сурвивина, с НЬА-А3
Пептиды, производные сурвивина, предположительно связывающиеся с суперсемейством НЬА-А3, дополнительно проанализировали на связывание с НЬА-А3. Только два из этих пептидов, 8иг112-120 (К1АКЕТХХК) (8ЕЕ) ГО Νο: 44) и 8иг112-121 (К1АКЕТХХКК) (8ЕЕ) ГО Νο: 57), связывали НЬА-А3 с высокой аффинностью, подобной аффинности вирусного эпитопа, нуклеопротеина 265-273 Гриппа А (ГОК.О8УАНК) (8 ЕЕ) ГО Νο: 74) (табл. 4). Кроме того, два пептида, 8иг53-62 (ЕЕАОСЕЕСЕК) (8ЕЕ) ГО Νο: 47) и 8иг95-103 (ЕЕТЬбЕЕЕК) (8ЕЕ) ГО Νο: 43), слабо связывались с НЬА-А3.
Некоторые из пептидов, у которых обнаружили связывание, были модифицированы для усиления аффинности связывания с НЬА-А3. Таким образом, синтезировали два аналоговых пептида, 8иг54-62 и 8иг113-122, у которых лучший якорный лейциновый остаток (Ь) заменил нативный аланин (А) в положении 2. 8иг54Ь2 (ЕЕОСЕЕСЕК.) (8ЕО ГО Νο: 56) связывал НЬА-А3 с высокой аффинностью, тогда как 8иг113Ь2 (ГОКЕТКЛККК) (8ЕО ГО Νο: 59) связывался слабо (табл. 4). Кроме того, синтезировали четыре аналоговых пептида, 8иг5-13, 8иг13-22, 8иг18-27 и 8иг53-61, у которых лучший якорный остаток лизин (К) заменил естественный фенилаланин (Е) на С-конце. 8иг5К9 (ТБРРА^ОРК) (8ЕО ГО Νο: 54) и 8иг18К10 (В18ТЕ1<Х\УР1<) (8ЕО ГО Νο: 58) связывался с НЬА-А3 при высокой аффинности, тогда как замещения ощутимо не повлияли на связывание 8иг13К9 (ЕЕКОНК.18ТК) (8ЕО ГО Νο: 57) и 8иг53К9 (ОЬАрСЕЕСК) (8ЕО ГО Νο: 55) с НЬА-А3 по сравнению с нативными аналогами.
Ответы СТЬ, рестриктированных по НЬА-А3, на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, страдающих раком
Девять образцов пациентов с меланомой (пять РВЬ и четыре Т1Ь) проанализировали на предмет иммунной активности на два нативных пептида с высокой аффинностью к НЬА-А3 - 8иг112-120 и 8иг112-121, а так же два нативных пептида 8иг53-62 и 8иг95-103 со слабым связыванием. Однако ни у одного из пациентов не обнаружили иммунные ответы на эти пептиды ЕЫ8РОТ анализом. Впоследствии, тех же пациентов обследовали на спонтанную иммунную активность на три высоко аффинных модифицированных пептидов, производных сурвивина, 8иг5К9, 8иг18К10 и 8иг54Ь2. В образцах Т1Ь трех пациентов, Ме1.А3-1, Ме1.А3-2, Ме1.А3-3, обнаружили активность СТЬ на 8иг18К10 (фиг. 13). Ответы на два других пептида, 8иг5К9 и 8иг54Ь2, не обнаружили. Для дальнейшей проверки этих ответов на активность СТЬ реактивности к 8иг18К10 проанализировали РВЬ еще восемнадцати пациентов с меланомой. Среди них обнаружили трое пациентов с ответами, Ме1.А3-4, Ме1.А3-5 и Ме1.А3-6, в результате найдены всего шесть пациентов с ответами среди двадцати семи обследованных (фиг. 13).
Идентификация нового рестриктированного по НЬА-А2 эпитопа сурвивина Связывание 11-мерных пептидов, производных сурвивина, с НЬА-А2
Аминокислотную последовательность белка сурвивина обследовали на предмет высокой вероятности НЬА-А2 11-мерных пептидных эпитопов, используя основные НЬА-А2 специфические якорные остатки. Синтезировали и исследовали на связывание с НЬА-А2 шесть пептидов, производных сурвивина.
- 26 008026
Ни один из исследованных пептидов не связывался с такой же высокой аффинностью как у известного эпитопа ВМЬГ280-288 пептида (бЬСТЬУЛМЬ) (БЕР ΙΌ Νο: 72) вируса Эпштейна-Барра (табл. 4), который служил положительным контролем. Концентрация пептида, необходимая для связывания половины из возможного максимального количества молекул НБА-А2 (значение С50), составила в положительном контроле 0,9 рМ. Для сравнения, пептиды Биг 18-28 (ЮБТЕКШУРЕБ) (БЕР ΙΌ Νο: 67) и 8иг86-96 (ЕЬБУККрЕЕЕЬ) (БЕр ΙΌ Νο: 69) слабо связывались с НЬЛ-Л2 (С50=69 и 72 рМ, соответственно). Однако два известных, рестриктированных по НЬЛ-Л2 эпитопа сурвивина связывались также слабо с НЬАА2; Биг95-104 (ЕЕТЬбЕЕЕКЬ) (БЕр ΙΌ Νο: 43) связывался с промежуточной аффинностью (С50=10 рМ), тогда как Биг96-104 (ЬТЬбЕЕЕКЕ) (БЕр ΙΌ Νο: 10) связывался слабо (С50>100 рМ). Остальные четыре исследуемые 11-мерные пептиды (Биг4-14 (РТЬРРА^рРЕЬ) (БЕр ΙΌ Νο: 66), Биг54-64 (ЬАрСЕЕСЕКЕЬ) (БЕР ΙΌ Νο: 68), Биг88-98 (БСККОМ/ЕРТЕ) (БЕр ΙΌ Νο: 70) и Биг103-113 (КЬВКЕКАКЦИ) (БЕр ΙΌ Νο: 74), не связывались с НБА-А2.
Ответы СТЬ, рестриктированных по НБА-А2, на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, страдающих раком
РВЬ десяти пациентов, страдающих раком (двое - меланомой (Ме1), шесть - СЬЬ (СЬЬ) и двое - раком молочной железы (МС)) были изначально обследованы на предмет связывания с НБА-А2 слабо связывающихся пептидов Биг18-28 и Биг86-96 и распознавания их иммунной системой больных раком. В РВЬ двух из десяти обследованных пациентов (СЬЬ-1, СЬЬ-2, фиг. 14) обнаружили СТЬ ответы на Биг1828, тогда как ответы на Биг86-96 не наблюдались (данные не показаны). Для дальнейшей проверки этих Биг18-28 специфических ответов, проанализировали РВЬ еще двенадцати пациентов (семи с меланомой, одного с СЬЬ и четырех с раком молочной железы) на предмет СТЬ активности на этот пептид. Среди них четыре пациента (СЬЬ-3, МС-1, МС-2, Ме1.А2-1) имели Биг 18-28 специфическую иммунную активность, определяемую ЕЫБРОТ анализом (фиг. 14). Таким образом, в целом, РВЬ шести из двадцати двух обследованных пациентов проявляли СТЬ ответ на Биг18-28.
Идентификация рестриктированного по НБА-В7 эпитопа сурвивина Связывание пептидов, производных сурвивина, с НБА-В7
Обследовали аминокислотную последовательность белка сурвивина на предмет пептидов с 9-10 аминокислотами, с якорными остатками согласно связывающему пептидному мотиву НЬА-В7. Выбрали и анализом структурных связей изучили пять пептидов на способность стабилизировать НЬА-В7. Для каждого пептида значение С50 оценивали как концентрацию пептида, необходимую для стабилизации половины максимального количества молекул НЬА-В7 (табл. 4). Два пептида, производных сурвивина, Биг6-14 (ЕРРААОРЕЕ) (БЕр ΙΌ Νο: 18) и Биг11-19 (РРЕРКЭНИ!) (БЕр ΙΌ Νο: 19), слабо стабилизировали НБА-В7 с С50 около 100 рМ; тогда как Биг46-54 (СРТЕНЕРЭБ) (БЕр ΙΌ Νο: 6), Биг51-59 (ЕРПЕАРСББ) (БЕр ΙΌ Νο: 7) и Биг34-43 (ТРЕКМАЕАОГ) (БЕр ΙΌ Νο: 20) не связывались с НБА-В7 (табл. 4).
Ответы СТЬ, рестриктированного по НБА-В7, на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, больных раком
НБА-В7 положительный РВЬ пяти пациентов с меланомой (те125, те126, те13, те16, те139), двух пациентов с СЬЬ (СЬЬ1, СЬЬ54), и двух пациентов с раком молочной железы (ЬтеазШ, Ьтеаз115) протестировали на Т-клеточную активность на слабо связывающиеся с НБА-В7 пептиды Биг6-14 (ЕРРААРРБЬ) (БЕр ΙΌ Νο: 18) и Биг11-19 (РРСЬКОНК!) (БЕр ΙΌ Νο: 19). Обнаружили мощный спонтанный СТЬ ответ на пептид Биг6-14, производный сурвивина, в РВЬ у пациента с СЬЬ и у пациента с раком молочной железы (фиг. 15). Дополнительно, обнаружили слабый ответ на этот пептид у пациента с меланомой - те13 (фиг. 15).
Резюме аллель-рестриктированных по НЬА иммунных ответов на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, страдающих раком
Ряд пептидов, производных сурвивина, включающих 9-11 аминокислотных остатков, протестировали на связывание со следующими НЬА аллелями: НБА-А1, НБА-А3, НБА-А11 и НБА-В7 с помощью анализа структурных связей для связывания пептидов, описанных в предыдущих примерах, с молекулами МНС класса Ι. Кроме того, с помощью ЕЫБРОТ анализа протестировали некоторые из пептидов на их способность элиситировать СТЬ иммунный ответ, как описано выше.
Итоговые результаты, включая результаты, полученные в предыдущих примерах, приведены ниже в табл. 4.
- 27 008026
Таблица 4. С50 и данные ΕΕΙ8ΡΟΤ анализа для выбора пептидов, производных сурвивина
| НЬА аллель | Длина пептида | Положение | Последовательность | С50 (μΜ) | Коммен тарий | 8Е() Ю Νο: | Ссыл ки |
| НЬАА1 | 9мерный | 8иг14-22 | ЬКЕ)НК18ТР | Нет связывай ИЯ | 22 | ||
| 8иг51-59 | ЕРОЬАРСРР | Нет связывай ия | 7 | ||||
| 8иг38-46 | МАЕАСР1НС | Нет связывай ия | 23 | ||||
| 8иг93-101 | РЕЕЬТЬСЕР | >100 | 24 | ||||
| 10мерный | 8иг34-43 | ΤΡΕΚΜΑΕΑΟΡΝΒ | Нет связывай ия | 20 | |||
| 8иг47-56 | ΡΤΕΝΕΡϋΕΑρ | Нет связывай ия | 25 | ||||
| 8иг49-58 | ΕΝΕΡϋΕΑρΟΡ | Нет связывай ия | 26 | ||||
| 8иг92-101 | рРЕЕЬТЬОЕР | 2 | 27 | ||||
| Контро льный пептид | С1 | δϋΠΟΡΝΕΥ | 0,8 | 28 | |||
| Модиф ицирова нный пептид | 8иг14У9 | ЬКОНККТУ | Нет связывай ия | 29 | |||
| 8иг51У9 | ЕРПЕАПСРУ | Спябле связыва ние | 9 | ||||
| 8иг93У9 | РЕЕЬТЬОЕУ | Нет связывай ия | 30 | ||||
| 8иг92У9 | РРЕЕЬТЕСЕУ | Нет связывай ия | 31 | ||||
| 8иг34У9 | ΤΡΕΚΜΑΕΑΟΥ | Нет связывай ия | 32 | ||||
| 8иг49У9 | ΕΝΕΡΏΣΑΡΟΥ | Нет связывай ия | 33 | ||||
| 8иг92Т2 | РТЕЕЬТЬСЕР | 2 | 34 |
- 28 008026
| 8иг9282 | р8ЕЕЬТЬ6ЕР | 100 | 35 | ||||
| 8иг93Т2 | НТЕЬТЕСЕР | 1 | 36 | ||||
| 8иг9382 | РЗЕЬТЬОЕР | 30 | 37 | ||||
| 8иг38У9 | ΜΑΕΑΟΡΙΗΥ | 0,8 | 38 | ||||
| 8иг47У10 | ΡΤΕΝΕΡϋΕΑΥ043 9 | 0,4 | 39 | ||||
| НЬА- А2 | 8иг4-14 | РТЬРРА^РРЬ | Нет связывай ИЯ | 66 | |||
| 8иг18-28 | К18ТРКМ¥РРЬ | 69 | 67 | ||||
| 8иг54-64 | ЬАрСРРСРКЕЬ | Нет связывай ИЯ | 68 | ||||
| 8иг86-96 | РЬЗУККрРЕЕЬ | 72 | 69 | ||||
| 8иг88-98 | ЗУКК^РЕБЬТЬ | Нет связывай ИЯ | 70 | ||||
| 8иг103- 113 | ΚΕϋΚΕΚΑΚΝΚΙ | Нет связывай ИЯ | 71 | ||||
| Контро льный пептид | ЕВУ, ВМЬР1 | бЬСТЬУАМЬ | 3 | 72 | |||
| Н1У, Ро1 | 1ЬКЕРУНОУ | 0,2 | 73 | ||||
| НЬААЗ | 9мерный | 8иг5-13 | тьррау/эрр | Нет связывай ИЯ | 40 | ||
| 8иг53-61 | ОЬАрСРРСР | Нет связывай ия | 41 | ||||
| 8иг 54-62 | ЬАрСРРСРК | Нет связывай ия | 42 | ||||
| 8иг95-103 | ЕЬТЬбЕРЬК | >100 | 43 | ||||
| 8иг112- 120 | ΚΙΑΚΕΤΝΝΚ | 2 | 44 | ϊ | |||
| 10мерный | 8иг 13-22 | РЬКЕ)НК18ТР | Нет связывай ия | 45 | |||
| 8иг18-27 | ΚΙδΤΡΚΝλΥΡΡ | Нет связывай ия | 46 | ||||
| 8иг53-62 | ОЬАРСРРСРК | 100 | 47 | й | |||
| 8иг84-93 | САРЬЗУККрР | Нет связывай ия | 48 | ||||
| 8иг101- 110 | РЬКЕОКЕКАК | Нет связывай ия | 49 |
- 29 008026
| Зиг ЮЗ- 112 | ΚΈϋΚΕΚΑΚΝΚ | Нет связывай ИЯ | 50 | ||||
| Зиг112121 | ΚΙΑΚΕΤΝΝΚΚ | 1 | 51 | ||||
| 8иг113- 122 | ΙΑΚΕΤΝΝΚΚΚ | Нет связывай ИЯ | 52 | ||||
| Контро льный пептид | сз | 1ЬК68УАНК | 0,1-0,3 | 53 | |||
| Модиф ицирова нный пептид | 8иг5К9 | ТЬРРААрРК | 2 | 54 | |||
| 8иг53К9 | ОЬАрСРРСК | Нет связывай ИЯ | 55 | ||||
| 8иг54Ь2 | ЬЬрСРРСРК | 1 | 56 | ||||
| 8иг13К9 | РЬКЕ)НК18ТК | Нет связывай ИЯ | 57 | ||||
| 8иг18К10 | ΚΙ8ΤΡΚΝΑΡΚ | 0,02 | 58 | ||||
| 8иг113Ь2 | ΙΕΚΕΤΝΝΚΚΚ | >100 | 59 | ||||
| ЗигЕхЗ- АЗ-1 | ΤΙΚΚΚΝΕΚΚ | 0,5 | 60 | ϋί | |||
| ЗигЕхЗАЗ-2 | ΡΤΙΚ.ΚΚΧΈΚΚ | Нет связывай ИЯ | 61 | ||||
| 8иг2Ь-АЗ- 1 | ΚΙΤΚΕΕΗΚΚ | Нет связывай ИЯ | 62 | ||||
| Контро льный пептид | „„ А 1 ршш П, нуклеопро теин 265273 | ТТ Т>ГДСТ7 Α ΊΞΓΊΖ О V 2Λ.1 XIV | Λ 1 ν,ι | ПЛ /*Т | |||
| НЬА- А11 | 9мерный | 8иг5-13 | ТЬРРААрРЕ | Нет связывай ИЯ | 40 | ||
| 8иг53-61 | ЭЬАрСРРСР | Нет связывай ИЯ | 41 | ||||
| 8иг54-62 | ЬАрСРРСРК | 0,4 | 42 | ||||
| 8иг95-103 | ЕЕТЕСЕРЬК | Нет связывай ИЯ | 43 | ||||
| Зиг 112- 120 | ΚΙΑΚΕΤΝΝΚ | 1 | 44 | ||||
| 10- | Зиг 13-22 | РЬКВНШЗТР | Нет | 45 |
- 30 008026
| Зиг 18-27 | ΚΙ8ΤΡΚΝΨΡΡ | Нет связывай ИЯ | 46 | ||||
| 8иг53-62 | ОЬАОСРРСРК | 5 | 47 | ||||
| 8иг84-93 | САРЬЗУККрР | Нет связывай ИЯ | 48 | ||||
| 8иг101- 110 | РЕКЕОкЕкАК | Нет связывай ИЯ | 49 | ||||
| ЗигЮЗ- 112 | ΚΤϋΚΕΚΑΚΝΚ | Нет связывай ИЯ | 50 | ||||
| 8иг112- 121 | ΚΙΑΚΕΤΝΝΚΚ | >100 | 51 | IV | |||
| 8иг113- 122 | ΙΑΚΕΤΝΝΚΚΚ | Нет связывай ИЯ | 52 | ||||
| Контро льный пептид | С4 | ΑνΡϋΚΚδϋΑΚ | 0,2 | 63 | |||
| НЬА- В7 | 9мерный | 8иг6-14 | ЬРРАХУрРРЬ | >100 | 18 | V | |
| 8иг11-19 | рРРЬКОНК1 | >100 | 19 | ||||
| 8иг46-54 | ΕΡΤΕΝΕΡϋΕ | Нет связывай ИЯ | 6 | ||||
| 8иг51-59 | ЕРОЬАрСРР | Нет связывай ИЯ | 7 | ||||
| 10мерный | 8иг34-43 | ТРЕКМАЕАОР | Нет связывай ИЯ | 20 | |||
| Контро льный пептид | С6 | (2ΡΚΑΡΙΚΡΙ | 0,1 | 64 | |||
| С7 | КРР1Р1ККЬ | 0,5 | 65 |
‘У одного пациента с лимфомой (НЕМ34) посредством ЕЫ8РОТ анализа наблюдали ответ на пептид 8иг112-120.
“У троих пациентов с лимфомой (НЕМ9, 11, 34) обнаружили ответы на пептид 8иг53-62 посредством ЕЫ8РОТ анализа.
“‘Посредством ЕЫЗРОТ анализа наблюдали слабый ответ у пациента с меланомой (ΡΜ-ΤI^95).
^Посредством ЕЫ8РОТ анализа наблюдали ответ на 8иг112-121 у пациента с меланомой (РМ6), наиболее очевидный в суспензии метастатических лимфатических узлов, и более слабый в ТИ, первичной опухоли и РВЬ.
'Посредством ЕЫ8РОТ анализа наблюдали ответ на пептид 8иг6-14 у пациента с СЕЕ (СЕЬ9), и более слабый ответ у пациента с лимфомой (НЕМ 21) (данные не показаны).
Пример 5. Терапевтические способы применения пептидов, производных сурвивина, в качестве иммуногенов.
Резюме
Пять пациентов с меланомой IV стадии, с трудом поддающихся лечению, вакцинировали модифицированным рестриктированным по НЕА-Л2 эпитопом сурвивина, а именно пептидом 8иг1М2, полученным из дендритных клеток, предоставляя препарат пациенту на гуманитарных основах до получения официального разрешения на применение препарата. У четырех из пациентов установили мощный Тклеточный ответ на этот эпитоп посредством ЕЫЗРОТ анализа. Кроме того, окрашивание пептид/НЕАА2 мультимера ιη μΕι показало проникновение сурвивин активных клеток и в висцеральные метастазы, и в метастазы мягких тканей. Примечательно, что не наблюдалась токсичность, связанная с вакцинацией. Данные показывают, что возможно вызвать Т-клеточный ответ на сурвивин, даже у пациентов с последней стадией меланомы, и что эти вакцинирования хорошо переносимы.
Материалы и способы Критерии выбора пациента и режим лечения
Все клинические процедуры находились в соответствии с Хельсинской Декларацией и были получены согласия всех пациентов до лечения. Были выбраны пациенты с IV стадией кожной или увеальной меланомы, когда их болезнь прогрессировала несмотря на по меньшей мере два различных вида терапии - химио-, иммуно-, или химиоиммунотерапия. Кроме того, пациенты должны были быть в возрасте 18
- 31 008026 лет или старше, экспрессировать НЬЛЛ*0201, и болезнь которых можно выявить компьютерным томографическим сканированием черепа, груди и брюшной полости. Индекс Карновского у пациента должен был быть не менее 60%. Никакой системной химио- и/или иммунотерапии не допускалось в течение 4 недель до прививки. Важным диагностическим критерием было наличие метастаз в ЦНС (центральной нервной системе), активных аутоиммунных или инфекционных болезней, беременности и кормления грудью, а также существенные психиатрические отклонения. Дендритные клетки, сенсибилизированные пептидом, получили, как описано ранее (82). Вкратце, РВМС выделили из крови на Еутр1юргер'|Л| (Луоттеб РЬагта), заморозили в аликвотах и хранили в жидком азоте. За 1 неделю до прививки РВМС растопили, промыли и культивировали на среде, содержащей гентамицин, глутамин и аутологическую плазму, инактивированную высокой температурой. На 1 и 5 день добавили Ш-4 и СМ-С8Е. Чтобы дифференцировать зрелые ОС, на 6 день добавили ΈΝΕ-γ и простагландин Е2. На 7 день клетки, проявляющие фенотипические и морфологические характеристики зрелых ОС, т.е. вуалевидный вид, и 75% экспрессии СЭ83, сенсибилизировали модифицированным рестриктированным по НЬЛ-Л2 эпитопом сурвивин96-104, производным сурвивина, ЬМЬСЕЕЬКЬ (8ЕС Ш Νο: 10) (Отака, Швейцария) 14. Клетки использовались для прививки, если микробиологические анализы образцов, взятых из культур на 1 и 5 день, показали стерильность.
Пациентов вакцинировали с 7-дневными интервалами между первыми двумя вакцинированиями, с последующим 28-дневными интервалами между вакцинированиями. 10-20 х 106 зрелых сенсибилизированных сурвивином96-104 ОС ресуспендировали в РВ8, содержащем 1% альбумин сыворотки человека, и ввели внутрикожно в аликвотах 1,5х106 ОС на участок инъекции в вентромедиальных зонах бедер близко к региональным лимфатическим узлам. Сегменты, где дренирующие лимфатические узлы были удалены и/или облучены, были исключены. Лейкаферез повторили после 5 вакцинирований при отсутствии серьезного ухудшения состояния здоровья пациента или возникновения метастаз ЦНС.
Измерение клинических и иммунологических ответов
Срезы КТ (компьютерная томография) выполнили до вакцинирования и каждые три месяца спустя или в случае серьезных клинических признаков прогрессирования болезни. Иммунологические ответы выявили ЕЫЗРОТ анализом, используя РВМС, получаемые каждые три месяца, чтобы обнаружить высвобождение сурвивин96-104 специфического ΓΕΝ-γ. Для усиления чувствительности ЕЫ8РОТ анализа, РВМС простимулировали однократно ίη νίίτο при концентрации 1х106 клеток на 1 мл в 24-луночном планшете (Наик, Дания) на среде Х-νίνο (Είο ^Ыйакет, Волкерсвиль, Мэриленд) с добавлением 5% инактивированной высокой температурой сыворотки человека и 2 мМ Ь-глутамина в присутствии 10 цМ пептида. Через 2 дня добавили 40 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (Ш-2) (ΕΗιγοπ, Ратинген, Германия). Спустя 10 дней клетки проверили на активность. К концу этого нитроцеллюлозные 96луночные планшеты (Ми1ί^8с^ееη МЛШ Ν45, М^11^рο^е, Глоструп, Дания) заполнили анти-ШЫ^ антителом (1-ΌίΚ, МаЫесЬ, Швеция). Добавили лимфоциты при концентрации 104-105 клеток на 200 цМ среды Х-νίνο в лунке вместе с 104 Т2-клетками и релевантными пептидами до окончательной концентрации 2 цМ. После инкубирования в течение ночи при 37°С и двух промываний добавили биотинилированное детектирующее антитело (7-В6-1-Биотин, МаЫеск, Швеция); его специфическое связывание визуализировали, используя авидин-щелочную фосфатазу вместе с соответствующим субстратом (Οί^οΕΚΕ). Реакцию остановили при появление темно-фиолетовых пятен, которые подсчитали с помощью системы Л1рЬаIтаде^ (Л1р1а IηпοίесЬ, Сан Леандро, Калифорния, США).
Сурвивин96-104/НЬА-А*0201 активные СЭ8+ Т-лимфоциты также определялись ίη δίΐιι и на участках вакцинирования, и в васцилярных метастазах, и метастазах мягких тканей или кожи, с помощью мультимерных комплексов сурвивин96-104/НЬА-А*0201. Участки вакцинирования удалили через 24 ч после внутрикожной инъекции у всех пациентов, тогда как метастатические повреждения были удалены только у определенных пациентов, если их легко было увидеть (пациенты ΚΝ и СВ), или удалили по лечебному назначению (пациент \У\У). Окрашивание мультимерных комплексов пептид/МНС описано ранее (68). Мультимерные комплексы сурвивин96-104/НЬА-А*0201 получены введением сайта распознавания для ферментного биотинилирования на 5'-конце внеклеточных доменов НЬЛ-Л*0201 (остатки 1-275). Рекомбинантный белок очистили гель-фильтрацией (8ерЬабех С25, РЬагташа, Эрланген, Германия) и ионообменной (ιηοηο-Ο, РЬаттааа) хроматографией и свернули ίη νίίτο растворением в присутствии соответствующих пептидов и в2-микроглобулина. После гель-фильтрации на колонке 8ерЬабех С25, белок мультимеризировали с помощью молекул декстрана, конъюгированных со стрептавидином и МТС (любезно предоставленным Ь. ^шШет, ЭЛКО, Копенгаген, Дания) для получения мультивалентных комплексов НЬЛ/дектран. Сохраненные при криогенной температуре фрагменты соответствующих образцов сушили в течение ночи и затем зафиксировали в холодном ацетоне в течение 5 мин. Все этапы инкубации выполняли в темноте при комнатной температуре следующим образом: (ί) анти-СЭ8 антитело - 45 мин (1:100, клон ШТ8а, РИатт^е^ Сан Диего, Калифорния), (ίί) конъюгат Су3 с козьими антителами к ^С мыши (разбавление 1:500; код 115-165-100, Όίαηονα, Гамбург, Германия) - 45 мин, и, наконец, (ίίί) мультимеры - 75 мин. Между каждым этапом предметные стекла промывали два раза по 10 мин 0,1% РВ8/В8Л. Стекла поместили в Уес1а5Ые1й® и хранили в холодильнике до изучения под софокусным мик
- 32 008026 роскопом Ье1са. (ТС8 4И, Ьеюа, Мангейм, Германия).
Результаты Характеристики пациентов, токсичность и курс лечения
Для участия в эксперименте записали пять пациентов с глубокой IV стадией меланомы: двоих - с увеальной меланомой, одного - с меланомой мягких тканей и двоих - с меланомой кожи. Из-за проявления симптоматических метастаз мозга для одного пациента отменили терапию уже после двух вакцинаций. Следующие четыре пациента получили до 15 вакцинаций. Один пациент умер из-за остановки сердца без опухоли после хирургической резекции оставшихся метастаз. Для другого пациента отменили терапию после 10 прививок из-за появления висцеральных метастаз (К^). Одного пациента продолжали исследовать после 15 вакцинаций. Детальные характеристики пациентов, предварительная терапия, число вакцинаций и состояние здоровья внесены в табл. 5.
Основной токсичности не наблюдали. Таким образом, вакцинация не повлияла на гемоглобин, лейкоциты и тромбоциты, а так же на лактат дегидрогеназу, креатинин и холинэстеразу (фиг. 16). Не наблюдали признаки системной или местной токсичности на участках инъекции. Кроме того, не наблюдалось нарушение заживления раны, геморрагические нарушения, дисфункция сердца, васкулит или воспаление кишечника. В одного пациента (^^), существующие до этого метастазы печени могли бы стабилизироваться под действием вакцинации, но новые метастазы надпочечников все еще образовывались. К сожалению, этот пациент умер из-за остановки сердца, после хирургической операции по удалению опухоли. Метастаз мозга обнаружили у пациента РВ только спустя 4 недели после начала вакцинации. Поэтому, данному пациенту необходимо было отменить дальнейшую вакцинацию после двух инъекций ИС. Трое других пациентов показывали медленное прогрессирование метастаз без существенного ухудшения состояния здоровья. Замечательно, что пациент ΚΝ прожил 13 месяцев (от начала вакцинирования до смерти), несмотря на тяжелый процесс метастазирования и быстрое прогрессирование болезни в начале вакцинирования. Пациент СБ наблюдался на протяжении 14 месяцев после начала вакцинирования пептидом сурвивина, сенсибилизированным ИС. Следует отметить, однако, что оба пациента (КЛЧ и СБ) получили дополнительное местное лечение для контроля над опухолью, либо облучение подкожных опухолей (К^), либо местная химиотерапия (СБ).
Сурвивин-специфические СБ8+ Т-клеточные ответы
Для исследования кинетики цитотоксических Т-клеточных ответов РВМС, полученные до и спустя три месяца после вакцинирования, были протестированы на активность к модифицированному эпитопу сурвивина96-104 Ε^I8ΡОΤ анализом для ΣΕΝ-у. Перед анализом РВМС однократно простимулировали ίη νίίτο, чтобы усилить чувствительность данного анализа. У всех четырех обследуемых пациентов индукция сурвивин96-104 активных Т-клеток была очевидна (фиг. 17). Анализ на активность к другим пептидам сурвивина, рестриктированным по НЬА-А*0201, т.е. к не модифицированному эпитопу сурвивина96-304 и соседнему эпитопу 8ит9, показал Т-клеточный ответ на эти пептиды у двоих пациентов (ΚΝ и К\Ч) (данные не показаны).
Прогностический и клинический показатель обследований определенных опухолеспецифических Тклеточных ответов в периферической крови неоднократно проверяли; таким образом, с помощью окрашивания пептид/МНС мультимеров установили также наличие сурвивин96-104/НЬА-А*0201 активных СИ8+ Т-лимфоцитов среди лимфоцитов инфильтрующей опухоли ίη зйи. Для подтверждения достоверности метода сначала проанализировали образцы ткани с замедленным типом реакций гиперчувствительности, наблюдаемым на участке вакцинирования в течение 24 ч. Этот анализ подтверждал более ранние наблюдения того, что внутрикожные инъекции пептида, сенсибилизированного ИС, вызывают мощный инфильтрат пептид-специфических воспалительных Т-клеток. Впоследствии, с помощью окрашивания пептид/МНС мультимеров применили на метастазах мягких тканей и висцеральных метастазах, что показало наличие сурвивин96-104/НЬА-А*0201 активных клеток среди инфильтрата СИ8+. Этот факт говорит о том, что вакцинация не только не индуцирует Т-клетку с желательной специфичностью, но также и обеспечивает их необходимым хоминг-индексом.
- 33 008026
Таблица . Краткое изложения опытов по вакцинированию, характеристики пациентов
| Паци- ент | Возраст/ ПОЛ | Время от первичной опухоли ДО стадии IV | Предварительное лечение | Болезнь, поддающаяся измерению | Исход лечения | № вакцинаци | Продолжительность жизни после первой вакцинации |
| ОВ | 40/жен. | 4 года 8 месяцев | ЫТТ, фотемусин / 1Ь2ΙΡΝα, треосульфан / гемцитабин | Печень | Ρϋ (прогресирование) (медленый рост существующих ранее и новых повреждений печени, новые метастазы поджелудочной железы и плевральные) | 15 | +14 месяцев |
| ΚΝ | 53/муж. | И лет | ΙΣ-2ΙΡΝα / гистамин, фотемустин, треосульфан / гемцитабин | Печень, почка, мягкая ткань, кость | Ρϋ (медленый рост существующих ранее и новых повреждений лимфатических узлов, плевральных и медиастинальных повреждений) | 13 | 13 месяцев |
| 73/муж. | 14 месяцев | Хирургическая операция, вакцинирование, декарбазин | Печень | Ρϋ (метастазы печени стабильные, но появление новых метастаз надпочечников) | 12 | 12 месяцев из-за постхирургического удара | |
| 72/муж. | 16 лет | Хирургическая операция, радиотерапия, адрибластин / ифостамид, иксотен, декарбазин, ΤΝΡ / мелфалан | Мягкая ткань | Ρϋ (медленый рост существующих ранее и новых метастаз мягких тканей, обнаружение метастаз сердца, легкого и мышц после 12 вакцинаций)) | 12 | +12 месяцев |
Ссылки
1. Уап беп Еупбе, ВЛ. апб Βοοη, Т. Титог апЕдепз гест^т/еб Ьу Т 1утрЬосу1е8. Ы. I. С11п. ЬаЬ. Кез., 27: 81-86, 1997.
2. КοзеηЬе^д, 8.А. ^еνе1οртеηΐ οί сапсег ^ттиηοΐЬе^ар^ез Ьазеб οη 1бепЬ£1са1юп ο£ 1Ье депез еп^бшд сапсег гедгеззюп апйдепз. I. N11. Сапсег Аз!., 20; 88: 1635-1644, 1996.
3. МагсЬапб, М., νаη Вагеп, Ν., Vеуηаηΐз, Р., ВысЬагб, V., Эге^, В., Тезз1ег, М.Н., Капкт, Е., Рагткт, О., АыепИ, Е., НитЬ1е!, У., Βοи^1οηб, А., Уап\\цск, К., Пепагб, Ώ., Веаибит, М., П1е1псЬ, Р.У., Κυδδο, V., Кегдег, I., Мазиссц О., 1адег, Е., Эе бге+е, I., Аΐζрοб^еη, I., Вгаззеиг, Е., ΟοπΗθ, Р.О., νаη бег Вгиддеп, Р., апб Βοοη, Т. Типют гедгеззюпз οЬзе^νеб т раИеп1з χνίΐΐτ те1аз1аИс текиюта 1геа1еб χνίΐΐτ ап апйдетс рерйбе еп^беб Ьу депе МАОЕ-3 апб ргезеп!еб Ьу НБА-А1. Ы. I. Сапсег, 80: 219-230, 1999.
4. Вгоззаг!, Р., 81иЬ1ег, О., Е1аб, Т., 8ΐеνаηον^с, 8., Каттепзее, Н. О., Кап/, Б., апб Вгиддег, V. Нег2/пеи-бегАеб рерИбез аге ΐитο^-аззοс^аΐеб апйдепз ехргеззеб Ьу Ьитап гепа1 се11 апб ^Ьп сагспюта 1тез апб аге гессют/еб Ьу т νΐ1το тбисеб зресШс суЮюхго Т ^тр^с^ез. Сапсег Кез., 58: 732-736, 1998.
5. Вгоззаг!, Р., НетысЬ, К.8., 81иЬ1ег, О., ВеЬпке, Б., Ке1сЬагб1, У.Ь., 8ΐеνаηον^с, 8., МиЬт, А., Каттепзее, Н.О., Кап/, Б., апб Вгиддег, V. ^^11^1^ οί НЕА-А2-гез1г1с1еб Т-се11 еркюрез бегАеб Ггот !Ье МИС1 Ειπτογ апЕдеп ίοΓ Ьгоаб1у аррНсаЫе νасс^ηе 1Ьегар1ез. В^б, 93: 4309-4317, 1999.
6. Vοηбе^Ье^бе, К.Н., НаЬп, V. С, 8сЬи11/е, ЕБ., апб Ν6Αγ, Б.М. ТЬе {ектегазе са1а1уИс зиЬипИ 1з а \1бе1у ехргеззеб ΐитο^-аззοс^аΐеб апЕдеп ге^дт/еб Ьу ο^οΐοχίο Т ^тр^су!^. ЬптипЦу, 10: 673-679, 1999.
7. БаСаззе, Е.С., Ва1гб, 8., ^текк, К.О., апб МасКеп/1е, А.Е. ТЬе тИхЬЦюг-з οί арοрΐοз^з ДАРз) апб 1Ье1г етегдшд го1е т сапсег. Оп^депе, 17: 3247-3259, 1998.
8. А1Еег, Э.С., МагсЫзю, Р.С., апб МагсЫзю, С. 8игуАт арοрΐοз^з: ап Ыегкрег Ье!\ееп се11 беа!Ь апб се11 рго111ега1юп т сапсег. БаЬ. Ьшезк 79: 1327-1333, 1999.
9. АтЬгозтц О., Аб1ба, С., 8ιγιφο, О., апб АШеы, Э.С. Ыие1юп οί арοрΐοз^з апб тЫЬНюп οί се11 рго111ега1юп Ьу 8игуАт депе 1агдеИпд. I. ВюЕ СЬет., 273: 11177-11182, 1998.
10. Огоззтап, Ώ., МсАПТ, ЕМ., Ы, Е., апб А1Еег, Э.С. Ехргеззюп апб 1агде1тд οί !Ье арοрΐοз^з тЬ1Ь1Ιογ, 8игуА1п, т Ьитап текста. I. Ауезк Пегта^Ь, 113: 1076-1081, 1999.
11. Огоззтап, Ώ., МсАПТ. ГМ., Ы, Е., апб А1Еег, Э.С. Ехргеззюп οί !Ье арοрΐοз^з тЬ^Ню!·, 8игугуш, т ^птек^та зкт сапсег апб депе 1агдеЕпд т а ке^аΐ^ηοсуΐе се11 1ше. БаЬ. Ауезк, 79: 1121-1126, 1999.
12. Апбегзеп, М.Н., 8οηбе^даа^б, I., 2еи1Ьеп, I., ЕШοΐΐ, Т., апб Наигит, 1.8. Ап аззау ίοΓ рерЕбе Ьтбтд 1ο НБА-С\*0102. Т1ззие АпЕдепз., 54: 185-190, 1999.
13. Апбегзеп, М. Н., Βοηί^11, I. Е., №1з1д, А., Агзерие11, О., Шегдаагб, I., №е1]ез, I., 2еи1Ьеп, I., Е11юИ, Т., апб Наигит, 1.8. Р^зр^рерЕбе Сап Ве Т^аηзрο^ΐеб Ьу ТАР Мο1еси1ез, Ргезеп1еб Ьу С1азз I МНС Мο1еси1ез, апб Кесч^т/еб Ьу Р^зр^рерЕбе- 8рес1йс СТБ. I. ^ти^к, 163: 3812-3818, 1999.
14. МсСиΐсЬеοη, М., VеЬηе^, Ν., Vеηзку, А., КизЬпег, М., ^οаη, 8., Нз^аο, Б., СакЬгезц Р., На, Т., Тгап, Т. V., Та1е, К.М., V^ηке1Ьаке, I., апб 8раск, Е.О. А зепзкке ЕП8РОТ аззау 1ο бе!ес! кпу-Ггециепсу Ьитап Т ^тр^су!^. I. ^тишк МеЧАкз, 210: 149-166, 1997.
- 34 008026
15. Ρ;·155. Η.Λ.. 8с11\\'агх. 8.Б.. УипйегНсН. БК.. апй ^кепЬе^. 8.А. Iттиη^ζа(^οη οΓ раРегИк νίΐΠ те1агюта рер(1йе гасстек: ^ттиηο1οд^с аккекктен! иктд (Не ΕΟδΡΘΤ аккау. Сансег 1. 8с1. Ат.. 4: 316-323.
1998.
16. Бегке. Ζ.. Аийегкен. М.И.. Бейегкен. М.. Еиддег. Б.. Ζеи(кеη. 1.. апй Иаигит. 1.8. Ρер(^йеκ краптпд (Не ^иηс(^οηа1 гедюп οΓ όοΐΗ (Не аЫ/Ьсг апй (Не Ьсг/аЫ Γιικίοη рго(етк Ьтй сοттοη ΗΕΛ с1акк Ι тο1еси1ек. Беикет1а. 14: 419-426. 2000.
17. Еа1к. К.. РЩ/ксйке. О.. 8(еνаηον^с. 8.. Лтд. С.. апй Каттепкее. И.С. А11е1е-кресШс тο(^Γк ге\геа1ей Ьу кесщепстд οΓ ке1Г-рерПйек е1и(ей Ггот МИС' тο1еси1ек. №11иге. 351: 290-296. 1991.
18. Ε’οπκ1ίκοη. КБ. Ηитаη рар^11οтаν^^ик деηο(уре 16 гасстек Γογ сетса1 сапсег ргорНу1ах1к апй 1геа1теп1. Сигг. Орт. Οηοο1.. 12: 466-473. 2000.
19. Бее. 8.Ρ.. СНап. А.Т.. СНеипд. 8.Т.. ΤНοтак. У.А.. □^тСайет. Ό.. Οηλνκοη. С.У.. Τκηί. ΟΗ.. Беипд. 8.Е.. Ιοίιηκοη. Ρ.Ε. апй Ηιιηηβ. Ό.Ρ. СТБ ^η(το1 οΓ ΕΒν ίη ηакο-рНа^уηда1 сагснюта (ΝΚ): ΕΒνкресШс СТБ те^пкек ίη (Не Ь^й апй (итο^к οΓ ΝΚ райеп(к апй (Не аπ(^деη-р^οсекк^ηд &пс(юп οΓ (Не (ипюг се11к. 1. Iттиηο1.. 165: 573- 582. 2000.
20. 8\хапа. Η.8.. Сгокктап. Ό.. Аи^иу. ΕΝ.. Уе1кк. К.М.. апй А1йег. Б.С. ΤιηηοΓ οοπΐοπΙ; οΓ (Не ап(^арοр(οк^к тο1еси1е сурвивин апй гесштепсе οΓ Ь1аййег сапсег. Ν. Εη§1. ί. Мей.. 341: 452-453. 1999.
21. 8а1да11ег. М.Б.. АЕкНаг. А.. Μа^^ηсο1а. Е.М.. Κίνο1(ίηί. Б.. Ка^акатд Υ.. апй ^кепЬе^. 8.А. Кетодηίύοη οΓ ти1йр1е ер1Шрек ίη (Не Нитап те1аποта апйдеп дар100 Ьу репрНега1 Ь^й Гтр^суйк кйти1а(ей ίη νί(Γο \νίΩι куп(Не(1с рерййек. Сапсег Кек.. 55: 4972-4979. 1995.
22. 8а1да11ег. М.Б.. Μа^^ηсο1а. Е.М.. Сот-пег. ΕΝ.. апй ^кепЬег^. 8.А. Iттиη^ζа(^οη адатк( ер1Шрек ίη (Не Нитап те1аποта апйдеп дар100 Γο11ονίπ§ ра(1еп( 1тпш1Ка1юп νίίΐι куп(Не(1с рерййек. Сапсег Кек.. 56: 4749-4757. 1996.
23. νΗ1—οΓί. Ό.. Еοη(еηеаи. ЕЕ.. Εί/апа. С.М.. Се^νο^к. Ν.. Б1епагй. Ό.. К1пю1й1. Ό.. ^οηдеηее1. V.. КЮгеаи. Е.. СегоШш. ЕС.. апй ΚοιικίΌ. Ρ. Εηкаηсей депега(юп οΓ кресШс (итο^-^еас(^νе СТБ ίπ νί(το Ьу ке1ес(ей Ме^-А/МАКЫ ^ттиηοйοт^ηаη( рерййе апаГдиек. ί. Ιηιηιι.ιηο1.. 160: 1750-1758. 1998.
24. Ρа^йο11. Б.М. Сапсег νасс^ηек. №11. Мей.. 4: 525-531. 1998.
25. Кид1ег. А.. 8(иЫег. С.. Уа1йеп. Ρ.. Ζο1Γγ. С.. ΖοЬуνа1кк^. А.. Βγο^τΕ Ρ.. КеОен и.. ИПпсН. 8.. Ми11ег. С.А.. Еескег. V.. Сгокк. А.Е. Ηетте^1е^η. В.. Кап/. Б.. Ми11ег. С.А.. апй Ктдей. Κ.Η. Кедгеккюп οΓ Нитап те(ак(айс гепа1 се11 сагсйюта айег νасс^ηа(^οη \νίΩι Л1пюг се11-йепйпНс се11 НуЬпйк. №11. Мей.. 6: 332-336. 2000.
26. Еескег. ЕС.. Си1йЬегд. Ρ.. Ζеи(Неη. ί.. Етске!·. Ε.Ε.. апй Оюг 8(га(еп. Ρ. Ассити1а(юп οΓ 1йеп(1са1 Τ се11к ίη те1аηοта апй ν^(^1^дο-1^ке ^п^йетта. ί. Ιηνοδΐ. БегтаЮБ 113: 1033-1038. 1999.
27. Κο1ΐΗ\Όΐη. ί.. ^^еκ(е1кοе((е^. Ρ.. Уе1д1е. В.. ОектюНеп. А.. 8№ηιίΐζ. М.. МеНПюгп. ί.. ΟοηηΕ К.. апй К1еЬег. Ε.Ρ. Ат^йу шлюпке (ο (Не (итο^-аккοс^а(ей тЫЫЮг οΓ арοр(οк^к рго(ет 8игуМп ίη сапсег ра(1еп(к. Сапсег Кек. 2000. Арг. 1; 60.(7): 1815-7. 60: 1815-1817.
28. Ай1йа. С.. Чаюин. С.. Саи1агй. Ρ.. Бераде. Ε.. Μο^е1. Ρ.. ΒιΚιό. 1.. ^οтЬ^е(. Η.. Кеуек. Е.. □(е^й.
1.. С1кке1ЬгесН(. С.. 8а11ек. С.. А1йеп. Б.С.. апй Μο1^ηа. Τ.Ε Ρ^οдηοк(^с мдшйсапсе οΓ 8игуМп ехргеккюп ίη й1йике 1агде Β-сеП ^тр^так. Β1οοΕ 96: 1921-1925. 2000.
29. Ыат. А.. Кадеуата. Η.. Τакайа. Ν.. [ЕпуапюЮ. Т.. Τакауаки. Η.. ΓοβΗΝ Ε.. ОЫга. М.. ΗакЫζите. К.. КοЬауакЫ. Η.. КапеМ Υ.. апй Nакадаνа^а. А. КдН ехргеккюп οΓ 8игуМп. таррей (ο 17с.|25. 1к ыдтйсап(1у ак^КИей νίίΒ рοο^ рюд^Лю йсЮт апй р^οтο(ек се11 8тлКа1 ίη Нитап пеигоЫакЮта. Оп^дене. 19: 617-623. 2000.
30. Ка\уакак1. Η.. А1йег. Ό. С. Би. С.Б.. Τοуοйа. М.. Τеη^ο. Т.. апй Τаη^даνа. Ν. ΙπΠίόίΙίοπ οΓ арοр(οк^к Ьу 8игуМп ргейю(к кНюПег 8шлКа1 га(ек ίη ^1οιόΠη1 сапсег. Сапсег Кек.. 58: 5071-5074. 1998.
31. 8№ηιίΐζ. М.. ^^ек(е1кοе((е^. Ρ.. Уе1д1е. В.. 8сктасН(епЬегд. Е.. 8(еνаηον^с. 8.. Оскег(. Ό.. Каттепкее. ΗΌ.. апй К1еЬег. Ε.Ρ. Сепега(юп οΓ 8πΓνίνίη-^^κ СБ8+ Τ ейесЮг се11к Ьу йепйгтс се11к ри1кей νίΐΠ рго(ет ογ ке1ес(ей рерййек. Сапсег Кек.. 60: 4845-4849. 2000.
32. Апйегкеп. МК. Еейегкен. Б.О.. Еескег. ЕС.. апй ΙΕογ 8(га(еп. Ρ. Iйеη(^Γ^са(^οη οΓ а СуЮЮхю Τ Бутр^су(е Кекюпке (ο (Не Арοр(οке ΙπΕίΕίΙοΓ Ρτο^ίη 8игуМп ίη Сапсег Ρι^πΚ Сапсег Кек.. 61: 869-872. 2001.
33. Бее. Κ.Η.. Ρι^Ει. М. С. К1т. С.Е. К1кег. А!.. Βе((^ηο((^. МЕ. ^йеп. М.М.. Ее(ксН. Ρ.. АЬа(1. А.. ^кепЬе^. 8.А.. апй Μа^^ηсο1а. Е.М. Еипс(юпа1 ^^ο^Εοη ЬеБхееп ^са1 апй кук(етю 1ттипе шлюпке йиппд аπ(^-те1аποта рерййе νасс^ηа(^οη. ί. ΙιηιηιιηοΕ 161: 4183-4194. 1998.
34. ^кепЬе^. 8.А.. Υιπ3. ЕС.. 8сН'ета112еп(гиЬег. Ό.Ε. Ηνυ. Ρ.. Μа^^ηсο1а. Е.М.. ^раНаи. 8.Б.. Кек(ιΓο. Ν.Ρ.. Бий1еу. МЪ.. 8сНтеага. 8.Б.. 8р1екк. Ρ.Ε. УипйегйсН. 1.К.. ЕагкИигкР М.К.. Ка\уакат1. Υ.. 8е1рр. С.А.. ΕίηΠοΓη. ί.Η.. апй УН(е. Ό.Ε. Ι-Μπηο^κ апй (кегареийс еνа1иа(^οη οΓ а куп(Не(ю рерййе хассте Γογ (Не (геа(теп( οΓ райеп(к νίΐΠ те(ак(айс те1аηοта. ΝηΙ. Мей.. 4: 321-327. 1998.
35. А1(тап. ΕΌ.. Μοкк. ΡΑ.. ^π^γ. Ρ.ΕΚ. ΒηγοιιΟι. Ό.Η.. ΜсΗеуζе^ УПкатк. М.С.. Βе11. ЕБ.. МсМ1сНае1. А.Е. апй БаОк. М.М. Ρ^ηο^^ апа1ук1к οΓ апйдеп-кресШс Τ ^тр^су^к. 8с1епсе. 274: 94-96. 1996.
36. 8сНгата. Ό.. Апйегкеп. МК. Τе^Неуйеη. Ρ.. 8ск^οйе^. Б.. Еейегкен. Б.О.. ιΠογ 8(га(еп. Ρ.. апй йескег. ЕС. Ο1^дοс1οηа1 Τ-СеИ КесерЮг Икаде ΟΓ Μе1аποсу(е П1йегеп(1а(юп Аη(^деη-^еас(^νе Τ Се11к ίη
- 35 008026
8каде IV Ме1апота РаЕепкк. Сапсег Кек., 61: 493-496, 2001.
37. ЬихетЬоигд, А.Т., Вогготе, Р., Теукоп, Ь., Вгиптагк, А.В., Рекегкоп, Р.А., апб 1асккоп, М.К. В1отадпеЕс ко1аЕоп ок апЕдеп-креакк СЭ8+ Т се11к икаЬ1е ш 1ттипокЬегару. Ыак. Вккесйпо1., 16: 281-285, 1998.
38. Кккш, А.Е., КекЬей Рекегкеп, Т., О1кеп, А.С., Ы, Ь., кйог 8кгакеп, Р., апб 2еикйеп, I. СепегаЕоп ок Ьитап-те1апота кресШс Т 1утрЬосуке с1опек бекшшд поуе1 суко1уЕс кагдекк \\Ш1 рапе1к ок пете1у еккаЬйкЬеб те1апота се11 Епек. Сапсег 1ттипо1. 1ттипо111ег.. 41: 71-81, 1995.
39. 8сЬе1ЬепЬодеп, С., Ьее, К.Н., Мауег, 8., 8кеуапоук, 8., МоеЬшк, и., Негг, №., Каттепкее, Н.6., апб Ке11Ьо1х, и. А кепкШуе ЕЫ8РОТ аккау ког бекесЕоп ок СЭ8+ Т 1утрЬосукек кресШс ког НЬА с1акк IЬшбшд рерЕбе ер1корек бепуеб кгот ЕШиепха ргокешк ш кЬе Ь1ооб ок Ьеа1кЬу бопогк апб те1апота раЕепкк. С1ш. Сапсег Кек., 3: 221-226, 1997.
40. кйог 8кгакеп, Р., 6и1бЬегд, Р., 6тЬакк, К., 2еикЕеп, к, апб Вескег, 1.С. 1п 81ки Т-Се11 Кекропкек адашкк Ме1апота Сотрпке Н1дЬ ЫитЬегк ок Ьоса11у Ехрапбеб Т-Се11 С1опокурек. I. 1ттипо1., 163: 443447, 1999.
41. Кекк1ег, ЕН., Веектап, N.1, Вгек-Лоетапк, 8.А., Vе^б^^к, Р., уап Vее1еп, Р.А., К1ооккегтапкооккеп, А.М., Щккегк, О.С., кеп ВоксЬ, 6.1, Кеккег, М.6., 8цкк, А., №оикег, Ό.Ι, Оккепбогр, Е., ОккЕпда, К., апб МеЕек, С.1. ЕкЕскпк 1бепЕккаЕоп ок поуе1 НЬА-А (*) 0201-ргекепкеб сукокохк Т 1утрЬосуке ер1корек ш кЬе ^1бе1у ехргеккеб китог апЕдеп РКАМЕ Ьу ргокеакоте-теб1акеб б1декЕоп апа1укк. I. Ехр. Меб., 193:7388, 2001.
42. бе V^^ек, ТА., Еоигкоиг, А., №оЬЬек, Т., Vе^к^оокк, 6., Кшкег, ΌΑ., апб уап Миуеп, 6.Ν. Некегодепеоик ехргекккп ок 1ттипокЬегару сапб1баке ргоке1пк дар100, МАКТ-1, апб кугокшаке ш Ьитап те1апота се11 Епек апб ш Ьитап те1апосуЕс 1еккпк. Сапсег Кек., 57: 3223-3229, 1997.
43. 1адег, Е., КшдЬоккег, М., КагЬасЬ, к, Агапб, М., ОексЬ, Е., апб КпикЬ, А. 1пуегке ге1аЕопкШр ок те1апосуке бШегепЕаЕоп апЕдеп ехргекккп ш те1апота Еккиек апб СЭ8+ сукокохк-Т-се11 гекропкек: еу1бепсе ког 1ттипоке1есЕоп ок апЕдеп-1окк уапапкк ш у1уо. 1пк. I. Сапсег, 66: 470-476, 1996.
44. Согткг, ΕΝ., АЬаЕ, А., ЕекксЬ, Р., Нуаг1, У.М., КокепЬегд, 8.А., Маппсо1а, Е.М., апб Торайап,
8.Ь. СотрагаЕуе апа1укк ок кЬе ш у1уо ехргекккп ок кугокшаке, МАКТ-1/Ме1ап-А, апб дар100 ш текаккаЕс те1апота 1еккпк: трйсаЕопк ког 1ттипокЬегару. I. 1ттипокЬег., 21: 27-31, 1998.
45. К1кег, А., Согткг, к, РапеШ, М., Катти1а, и., №апд, Е., АЬаЕ, А., ЕекксЬ, Р., Ьее, К.Н., 8кешЬегд,
8., КокепЬегд, 8., апб МаЕпсо1а, Е. 1ттипе кексЕоп аккег апЕдеп-кресШс 1ттипокйегару ок те1апота. 8игдегу, 126: 112-120, 1999.
46. Маеигег, МА., 6оШп, 8.М., Майш, Ό., 8теапеу, №., Вгуапк, I., СаккеШ, С, КоЬЬшк, Р., Рагт1аш, 6., 8когкик, №.1., апб Ьок/е, М.Т. Титог ексаре кгот 1ттипе гесодпШоп: 1екЬа1 гесиггепк те1апота ш а раЕепк аккоаакеб \νί!1ι бо\упгеди1а1юп ок кЬе рерЕбе кгапкрогкег ргокеш ТАР-1 апб 1окк ок ехргекккп ок кЬе 1ттипоботшапк МАКТ-1/Ме1ап-А апЕдеп. к С11п. 1пуекк., 98: 1633-1641, 1996.
47. бгокктап, Ό., К1т, РА., 8сЬесЬпег, Ι.8., апб А1Еег, Ь.С. 1пЬ1Ь1Еоп ок те1апота китог дготекй ш У1уо Ьу 8шу1уш кагдеЕпд. Ргос. №Е. Асаб. 8ск И.8.А, 98:635-640, 2001.
48. Татт, I., №апд, Υ., 8аикуШе, Е., 8сибкго, Ό. А., Щдпа, Ν., О1кегкбогк, Т., апб Кееб, ЕС. 1АРГатПу ргокеш 8шу1уш 1пЬ1Ь1кк сакраке асЕу1ку апб ароркокк шбисеб Ьу Еак (СЭ95), Вах, сакракек, апб апЕсапсег бгидк. Сапсег Кек., 58: 5315-5320, 1998.
49. Мопхо, М., Коке11, К., ЕеЕр, Е., АккибШо, I., 8апсЬех, ЕЕ, Маеккге, I., Майш, С., Еопк, А., Вагпабак, А., апб АЬаб, А. А поуе1 апЕ-ароркокк депе: Ке-ехргекккп ок 8шу1уш теккепдег ΕΝΛ ак а ргодпокк тагкег ш поп-кта11-се11 1ипд сапсегк. I. СЕп. Опсо1., 17: 2100-2104, 1999.
50. А. Мо1еси1аг Ьакк ок кропкапеоик гедгекккп ок пеигоЬ1аккота: го1е ок пеигокгорШс к1дпа1к апб депеЕс аЬпогтаЕЕек. Нит. Се11, 11: 115-124, 1998.
51. Кепкукк, Ν., СаккеШ, С., КоЬЬшк, Р.Е., апб Рагт1аш, 6. А 1кЕпд ок Ьитап китог апЕдепк гесодшхеб Ьу Т се11к. Сапсег 1ттипо1. 1ттипокЬег., 50: 3-15, 2001.
52. МеЕек, С.Е, Тоек, К.Е., Мебета, ЕР., уап бег Вигд, 8.Н., Оккепбогр, Е., апб ОккЕпда, К. 8Еакедкк ког 1ттипокЬегару ок сапсег. Абу. 1ттипо1., 75: 235-82.: 235-282, 2000.
53. 611Ьоа, Е. ТЬе такшдк ок а китог ге)ес1юп апЕдеп. 1ттишку., 11: 263-270, 1999.
54. Ь1, Е., АтЬгокт1, 6., СЬи, Ξ.Υ., Р1екс1а, I., Тодшп, 8., МагсШкк, Р. С, апб А1Еег, Ό.6 Сопкго1 ок ароркокк апб т1коЕс кртб1е сЬескрошк Ьу 8шу1уш. №киге, 396: 580-584, 1998.
55. ΖакГа^оп^, Ν. апб Па1бопе, М. 6. 8шу1уш ехргекккп апб гекккапсе ко апЕсапсег кгеактепкк: регкресЕуек ког пе\у кйегареиЕс шкегуепЕопк. Эгид Кеккк. Ирбак., 5: 65-72, 2002.
56. 8Шпохатеа, I., 1покисШ, К., №акаЬауакШ, I., апб Эан, К. ЬкШгЬеб ехргекккп ок кЬе апЕ-ароркокк депе, 8шу1уш, апб ЕРК-1 ш Ьетако1одка1 тайдпапскк. Ьеик. Кек, 24: 965-970, 2000.
57. 6гапхкго, Ь., 6Ша, Р., Сксокка, Р., 6оккагб1, Ό., 8кго1а, 6., 6еипа, М., Мопкадпа, Ь., РксоН, Р., СШ1ок1, М., апб СаНдаЕк-Саррк, Е. 8шу1уш к ехргеккеб оп СЭ40 кЕти1аЕоп апб шкейасек ргойкегаЕоп апб ароркокк ш В-се11 сйгошс 1утрЬосуЕс 1еикет1а. В1ооб, 97: 2777-2783, 2001.
58. АтЬгок1ш, 6., Аб1ба, С., апб АШег, Ь.С. А поуе1 апЕ-ароркокк депе, 8игу1уш, ехргеккеб ш сапсег апб 1утрЬот. №11. Меб., 3: 917-921, 1997.
59. А1Еег, Ь.С. Vа1^бак^пд 8шу1уш ак а сапсег кЬегареиЕс кагдек. ΝιΙ. Кеу. Сапсег, 3: 46- 54, 2003.
- 36 008026
60. О11е, К.А., 8^тοек-Αикΐ, А. Р., Ваитапп, В., ЬеесН, 8.Н., ЕаЬЬго, Б., 8!аЬе1, К.А., апб 2апдете1к1ег-А1бке, и. А ηονе1 апбкепке ο1^дοηис1еοΐ^бе ΐ-гдебпд 8ωνίνίη ехргек- кюп тбисек -рор(ок1к апб кепкШ/ек 1ипд сапсег се11к ΐο сΗетοΐΗе^ару. Сапсег Кек., 60: 2805-2809, 2000.
61. Апбегкеп, М.Н. апб ΙΗογ 8!га1еп, Р. 8игуМп - а ишуегк— (цшог апбдеп. Н|кЮ1. Н^кΐοраΐΗο1., 17: 669675, 2002.
62. Апбегкеп, М.Н., Ребегкеп, Ь.О., Саре1ег, В., Вгоскег, Е.В., Вескег, 1.С., апб ΙΗογ, 8.Р. 8рοηίаηеοиκ суЮЮ.хю Т-се11 гекропкек ада1пк( 8игубтп-бепуеб МНС с1акк !-гек(г1с(еб Т-се11 ерИорек т кби ак \хе11 ак ех νίνο ίη сапсег рабегИк. Сапсег Кек, 61:5964-5968, 2001.
63. Ситег, 1.К., Ки!а, Е.С., Тигк, Е., ЕагНагЕ Ь.В., Ьоот1к-Рг1се, Ь., Ни^хкк 8., Ееггап, С., В1гх, Б.Ь., апб Сох, кН. А рапе1 о£ МНС с1акк I гек(г1с(еб хба1 рерббек £ог ике ак а с|иа1Иу сопбо1 £ог уассше 1г1а1 ЕЫ8РОТ аккаук. 1. Тттипок МеШобк, 260: 157-172, 2002.
64. ε1νίп, 1., Робег, С, Е1Ноб, Т., Сегипбо1о, У., апб Тотепкепб, А. А теЛоб ΐο с.|иапбГу Ьтбтд о£ ип1аЬе1еб рерббек ΐο с1акк I МНС то1еси1ек апб беΐесΐ б1еб а11е1е кресШсбу. к Iттиηο1. МеШобк, 158: 161-171, 1993.
65. Кирреб, 1., 81бпеу, 1., СеНк, Е., КиЬо, К.Т., Сгеу, Н.М., апб 8ебе, А. РгопбпегИ го1е оГ кесопбагу апсНог гек1биек ш рерббе Ьтбтд ΐο Н6А-А2.1 то1еси1ек. Се11, 74: 929-937, 1993.
66. (Ног 8ΐ^аΐеη, Р., ВагГоеб, А., 8егете1 Т., 8ае1егбаН I., 2еиШеп, 1., апб Си1бЬегд, Р. Бе1есбоп апб сНагас1епхабоп оГ а1рНа-Ье(а-Т-се11 с1опа1бу Ьу бепаШбпд дгаб1еп( де1 е1ес(горНогек1к (БССЕ). ВЮесНшциек, 25: 244-250, 1998.
67. Каттепкее, Н., ВасНтапп, 1., ЕттепсН, КР., ВасНог, О.А., апб 8ΐеνаπον^с, 8. 8ΥΕРЕIТНI: ба(аЬаке Гог МНС бдапбк апб рерббе тобГк. ^типодепебск, 50: 213-219, 1999.
68. 8сНгата, Б., Ребегкеп Ьк, Ь.О., 1<е1кахоиккк Р., Апбегкеп, М.Н., 8(га(еп, Р.Р., Вгоскег, Е.В., Катрдеп, Е., апб Вескег, кС. Аддгедабоп оГ апбдеп-кретбс Т се11к а( (Не шоси1абоп кИе оГ та(иге бепбпбс се11к.
1. ТпуеБб Бегта(о1., 119: 1443-1448, 2002.
69. МаНо(ка, С., Аепхек М., 8рппдег, Е., СаЬЬеб, Н.Е., апб СегНагх, С.Б. 8игуМп-беНаЕх3 апб 8игуМп-2В: 1\хо ηονе1 крбсе уапап(к о Г (Не арорЮкб ίπΗίόίΐοΓ 8ωνίνίη \\НН б|ГГегеп( апНарорЮбс ргорегбек. Сапсег Кек., 59: 6097-6102, 1999.
70. НюкНп, Б.к, Маппсо1а, Е.М., апб Ееггопе, 8. НЬА с1акк I апбдеп бо\упгеди1абоп ш Нитап сапсегк Т-се11 пптипо(Негару гех1хек ап о1б к(огу. Мо1пМебЬТобау, 5: 178-186, 1999.
71. 8ебдег В., СаЬгега, Т., Сатбо, Е., апб Ееггопе, 8. НЬА с1акк I апбдеп аЬпогтаббек апб 1ттипе ексаре Ьу табдпаП се11к. 8етт. Сапсег Вю1., 12: 3-13, 2002.
72. 8ебе, А., У1бе11о, А., КеНегтап, В., ЕоМег, Р., №уегкша, К., Как(, А.М., МеНе£, С.к, ОкегоГГ, С., Уиап, Ь., Кирреб, 1., апб. ТНе ге1а(1опкН1р ЬеЕхееп с1акк I Ьтбтд аГПпбу апб 1ттиподешсбу о£ ро(еп(1а1 су(о(ох1с Т се11 ерборек. 1. Iттиηο1., 153: 5586-5592, 1994.
73. Моибдб, К.Б. апб 8егсагх, Е.Е. Сап апбШтог 1ттипе гекропкек б1ксптб1а(е ЬеЕхееп ке1Г апб попке1Г ? Iттиηο1. Тобау, 15: 353-355, 1994.
74. РагкНигкЕ М.К., 8а1да11ег, М.Ь., 8ои(Нетооб, 8., КоЬЬтк, Р.Е., 8ебе, А., КокепЬегд, 8.А., апб Ка\уакат1, Υ. биргохеб тбисбоп о£ текиюта-геасбхе СТЬ \\НН рерббек £гот (Не те1апота апбдеп дар100 тоббгеб а( НЬА-А*0201-Ьтбтд геыбиек. 1. Iттиηο1., 157: 2539-2548, 1996.
75. СшсНагб, С., 2егЬ1Ь, А., Ье Са1, Е.А., НоеЬеке, 1., Соппап, Е., СНоррт, 1., Впапб, 1.Р., апб СиШеЕ кС. Ме1апота рерббе МАКТ-1 (27-35) апа1одиек \\НН епНапсеб Ьтбтд сарасбу ΐο (Не Нитап с1акк I НМосотрабЬббу то1еси1е НБА-А2 Ьу шбобисбоп о£ а ЬеЕ-ьатто ас1б гек1бие: трбсабопк Гог гесодшбоп Ьу и.|тог-Н1ГШга6пд 1утрΗοсуΐек. ί. Меб. СНет., 43: 3803-3808, 2000.
76. С1ау, Т.М., Си^ег, М.С., МсКее, М.Б., РагкНигкЕ М., КоЬЬтк, Р.Е., КегУапп, К., АипбегНсН, 1., КокепЬегд, 8.А., апб №кЫтига, М.к СНапдек ш б1е Ппе крес^Г^с^ΐу о£ др100 (209-217)-^еасΐ^νе Т се11к ш раНегПк Го11о\уН1д νасс^ηаΐ^οη \\НН а рерббе тобйгеб -ϊ ап НБА-А2.1 апсНог гетбие.). ^типок, 162: 17491755, 1999.
77. Мебе£, С.1, хап бег Вигд, 8.Н., Тоек, К.Е., Оккепбогр, Е., апб Ойлпда, К. ЕГГесΐ^уе Шег-реиЕс апбсапсег уасстек Ьакеб оп ргеткюп дшбшд о£ суЮ1убс Т 1утрΗοсуΐек. Iттиηο1. Кеу., 188: 177-182, 2002.
78. 1адег, Е., КтдНойег, М., АНтаппкЬегдег, М., Агапб, М., КагЬасН, 1., 1адег, Б., ОексН, Е., апб Кпи(Н, А. Iттиηοке1есΐ^οη ίη νίνο: шберепбеп 1окк о£ МНС с1акк I апб те1аηοсуΐе ббТсгепбабоп апбдеп ехргеккюп ίη и^аУаЕс те1апота. Τηΐ. ί. Сапсег, 71: 142-147, 1997.
79. ТНигпег, В., Напб1е, I., Кобег, С., Б1есктапп, Б., Ке1кауоикк1, Р., 1опи1еб, Н., Вепбег, А., Масхек, С., 8сНгешег, Б., νοη беп, Б.Р., Вгоскег, Е.В., 8ΐе^ηтаη, К.М., Епк, А., Катрдеп, Е., апб 8сНи1ег, С. Уасс1пабоп тебН таде-3А1 рерббе-ри1кеб таШге, тοηοсуΐе-бе^^νеб беηб^^ΐ^с се11к ехрапбк кресШс су(о(ох1с Т се11к апб тбисек гедгеккюп о£ коте теΐакΐакек ίη абуапсеб Чаде К те1апота. 1 Ехр. Меб., 190: 1669-1678,
1999.
80. Υее, С., ТНотркоп, кА., КосНе, Р., Вугб, Б.К., Бее, Р.Р., Р1еркот, М., Кепуоп, К., Бау1к, М.М., К1ббе11, 8.К., апб СгеепЬегд, Р.Б. Ме1аποсуΐе бекбисбоп аГΐе^ апбдеп-кресШс хттипоШегару о£ те1апота: блей ех1бепсе о£ ΐ се11-теб|;-иеб νίΐίΗβο. ί. Ехр. Меб., 192: 1637-1644, 2000.
81. 81топ, К.М., 8ΐе^ηЬе^д, 8.М., НатШоп, М., НббекНет, А., КН1е1Г, 8., Ктеак, Ь.А., Маска11, С.Ь., 8сН1от, 1., Торабап, 8.Б., апб ВегхоГкку, кА. Сбшса1 ϊγι-1 беыдпк Гог Ше еаг1у сбшса1 бехе^ртегП о£ б1ега
- 37 008026 реийс сапсег сассюез. 1. С1ш. ОпотЕ 19: 1848-1854, 2001.
Claims (34)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Фармацевтическая композиция, включающая комбинацию двух или более эпитопных пептидов, производных сурвивина, рестриктированных по МНС классу I, каждый из которых является специфически взаимодействующим с молекулой НЬА и обладающим по меньшей мере одной из следующих характеристик:(ί) способность связывания с молекулой НЬА класса I, по которой он рестриктирован, при аффинности, измеряемой количеством пептида, что способно связать половину молекул НЬА класса I из возможно максимального количества (значение С50), которое составляет максимум 50 рМ, как определено анализом структурных связей, описанным здесь, (ίί) способность пептидов к элиситированию ЮТ-у-продуцирующих клеток в ΡΒΕ популяции пациента, больного раком, при частоте по меньшей мере 1х104 ΡΒΕ, как определено ЕЫ&ГОТ анализом, описанным здесь, и/или (ΐϊϊ) способность к ίη зйи обнаружению в опухолевой ткани СТЬ, которые взаимодействуют с эпитопом пептида.
- 2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой каждый эпитопный пептид специфически взаимодействует с молекулой НЬА-А МНС класса I, молекулой НЬА-Β МНС класса I или молекулой НЬА-С МНС класса I.
- 3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, в которой указанная молекула НЬА-А МНС класса I включает НБА-А1, НБА-А2, НБА-А3, НБА-А9, НБА-А10, НБА-А11, 1П.А-А\\ 19, НЬА-А23(9), НЬАА24(9), НЬА-А25(10), НЬА-А26(10), НБА-А28, Н1.А-А29(\\ 19), НБА-А30Щ19), НБА-А31Щ19), НЬАА32Щ19), НБА-А32Щ19), НБА-А33Щ19), НЬА-А34(10), НБА-А^36, НБА-А^43, НБА-А^66(10), НЬАА^68(28), НЬА-А69(28).
- 4. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, в которой указанная молекула НЬА-Β МНС класса I включает одно из следующих: НЕА-Б5, НЕА-Б7, НЕА-Б8, НЕА-Б12, НЕА-Б13, НЬА-ΒΜ, НЕА-Б15, ΒΙΑ-ΒΕλ НЬА-ΒΠ, III..А-Β18, НЬА-Б21, III..А-Βχχ22, НБАШ27, НБАШ35, НБАΒ37, Н^Α-Β38, Н^Α-Β39, Н^Α-Β40, Н^Α-Β^41, НЕА^^, Н^Α-Β44, Н^Α-Β45, ΙΙΑ-ΒιΑΙ) и НБАΒ^47.
- 5. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, в которой указанная молекула НБА-С МНС класса I включает одно из следующих: НБА-СЮ, НБА-С^2, НБА-С^3, НБА-С^4, НБАС^5, НВА-СМс Н1.А-С\\7 и НБА-СЮ6.
- 6. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, в которой указанный эпитопный пептид, рестриктированный по видам НЬА МНС класса I, выбран из группы, включающей НБА-А1, НБА-А2, НБА-А3, НБА-А11 и НБА-А24.
- 7. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, в которой указанный эпитопный пептид, рестриктированный по видам НЬА МНС класса I, выбран из группы, включающей Н^Α-Β7, Н^Α-Β35, Н^Α-Β44, НБА-В8, НЬА-Иб, Н^Α-Β27 и НБА^Е
- 8. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая эпитопный пептид, который является нативной последовательностью сурвивина млекопитающего.
- 9. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая эпитопный пептид, который является производным от сурвивина человека.
- 10. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая эпитопный пептид, выбранный из группы, состоящей из 5>ЕО ГО Νο: 1, 8ЕО ГО Νο: 2, 8Еф ГО Νο: 3, 8Еф ГО Νο: 6, 8ЕО ГО Νο: 7, 8ЕО ГО Νο: 27, 8ЕО ГО Νο: 45 и 8ЕО ГО Νο: 66.
- 11. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая эпитопный пептид, который является производным от нативной последовательности сурвивина посредством замещения, удаления или добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка.
- 12. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой указанный эпитопный пептид является модифицированным путем замещения в якорных положениях, но не в ТСК контактирующих остатках.
- 13. Фармацевтическая композиция по п.11 или 12, в которой указанный эпитопный пептид выбран из группы, включающей: 8Еф ГО Νο: 4, 8Еф ГО Νο: 5 (основание р8, 122), 8Еф ГО Νο: 8, 8Еф ГО Νο: 9, 8ЕО ГО Νο: 36, 8ЕО ГО Νο: 38, 8ЕО ГО Νο: 39, 8ЕО ГО Νο: 57.
- 14. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, в которой указанный эпитопный пептид является способным элиситировать ΕΝΕ-у-продуцирующие клетки в популяции ΡΒΕ у пациента, страдающего раком, при частоте по меньшей мере 10х104 ΡΒΕ.
- 15. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, в которой указанный эпитопный пептид является способным элиситировать ΕΝΕ-у-продуцирующие клетки в популяции ΡΒΕ у пациента, страдающего раковым заболеванием, у которого экспрессирован сурвивин.
- 16. Фармацевтическая композиция по п.15, где раковое заболевание выбрано из группы, включающей злокачественную опухоль кроветворных органов, в том числе хроническую лимфатическую лейке- 38 008026 мию и хроническую миелоидную лейкемию, меланому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы и рак простаты.
- 17. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая эпитопный пептид, который является посттрансляционно модифицированным.
- 18. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая фосфорилированный пептид.
- 19. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая эпитопный пептид, который содержит ТКг34 нативного сурвивина.
- 20. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, также включающая иммуногенный белок или пептидный фрагмент, выбранный из белка или пептидного фрагмента, не принадлежащего к семейству сурвивиновых белков, или является производным семейства сурвивиновых белков.
- 21. Фармацевтическая композиция по п.20, в которой иммуногенный белок или фрагмент пептида, не принадлежащий к семейству сурвивиновых белков или производный семейства сурвивиновых белков, является белком или его пептидным фрагментом, включенным в регулирование клеточного апоптоза.
- 22. Фармацевтическая композиция по п.20 или 21, в которой иммуногенный белок или фрагмент пептида, не принадлежащий к семейству сурвивиновых белков или производный семейства сурвивиновых белков, является Вс1-2 или его пептидным фрагментом.
- 23. Фармацевтическая композиция по п.20 или 21, в которой иммуногенный белок или фрагмент пептида, не принадлежащий к семейству сурвивиновых белков или производный семейства сурвивиновых белков, является членом семейства 1АР белков или его пептидным фрагментом.
- 24. Фармацевтическая композиция по п.23, в которой указанный член семейства 1АР белков является МБ-1АР.
- 25. Фармацевтическая композиция по одному из пп.20, 21, 23 и 24, в которой иммуногенный белок или фрагмент пептида, не принадлежащий к семейству сурвивиновых белков или производный от семейства сурвивиновых белков, выбран из группы, включающей БЕО ΙΌ Νο: 75, БЕО ΙΌ Νο: 76, БЕО ΙΌ Νο: 77, БЕС) ΙΌ Νο: 78, БЕС) ΙΌ Νο: 79, БЕС) ΙΌ Νο: 80, БЕС) ΙΌ Νο: 81, БЕС) ΙΌ Νο: 82, БЕС) ΙΌ Νο: 83, БЕС) ΙΌ Νο: 84, БЕС) ΙΌ Νο: 85.
- 26. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая эпитопы, рестриктированные по НЬА класса Ι и НЬА класса ΙΙ.
- 27. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, включающая адъювант.
- 28. Фармацевтическая композиция по одному из предыдущих пунктов, которая является композицией для ех νίνο или ίη κίίι,ι диагностики присутствия сурвивин активных Т-клеток среди РВЬ или в опухолевой ткани.
- 29. Мультиэпитопная вакцина, включающая композицию рестриктированных по МНС классу Ι эпитопных пептидов, производных от сурвивина, обладающих по меньшей мере одной из следующих характеристик:(ί) способность связывания с молекулой НЬА класса Ι, по которой они рестриктированы, при аффинности, измеряемой количеством пептида, что способно связать половину молекул НЬА класса Ι из возможно максимального количества (значение С50), которое составляет, максимум, 50 цМ, как определено анализом структурных связей, описанным здесь, (ίί) способность элиситировать ΙΝΡ-γ-продуцирующие клетки в РВЬ популяции пациента, больного раком, при частоте по меньшей мере 1х104 РВЬ, как определено ЕЫБРОТ анализом, описанным здесь, и/или (ίίί) способность к ίη δίίιι обнаружению в опухолевой ткани СТЬ, которые взаимодействуют с эпитопным пептидом.
- 30. Мультиэпитопная вакцина по п.29, включающая композицию эпитопов пептидов, производных от сурвивина, обусловленную типом ткани данного пациента.
- 31. Мультиэпитопная вакцина по п.29 или 30, которая является способной элиситировать иммунный ответ при раковом заболевании, где экспрессирован сурвивин.
- 32. Мультиэпитопная вакцина по п.31, где раковое заболевание выбрано из группы, включающей злокачественную опухоль кроветворных органов, в том числе хроническую лимфатическую лейкемию и хроническую миелоидную лейкемию, меланому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы и рак простаты.
- 33. Мультиэпитопная вакцина по одному из пп.29-32, которая способна элиситировать продуцирование у вакцинированных пациентов эффекторных Т-клеток, обладающих цитотоксической активностью против раковых клеток.
- 34. Применение композиции пептидов по одному из пп.1-28 для получения лекарственного препарата для лечения рака в сочетании с традиционным лечением рака, таким как радиотерапия или химиотерапия.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10/354,090 US20040210035A1 (en) | 2002-01-30 | 2003-01-30 | Survivin-derived peptides and use thereof |
| US10/715,417 US7892559B2 (en) | 2002-01-30 | 2003-11-19 | Survivin-derived peptides and use thereof |
| PCT/DK2004/000062 WO2004067023A2 (en) | 2003-01-30 | 2004-01-30 | Survivin-derived peptides and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200501206A1 EA200501206A1 (ru) | 2006-02-24 |
| EA008026B1 true EA008026B1 (ru) | 2007-02-27 |
Family
ID=32829435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200501206A EA008026B1 (ru) | 2003-01-30 | 2004-01-30 | Производные от сурвивина пептиды и их применение |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7892559B2 (ru) |
| EP (5) | EP1587532B1 (ru) |
| JP (1) | JP5121143B2 (ru) |
| CN (2) | CN1767848B (ru) |
| AT (3) | ATE454159T1 (ru) |
| AU (1) | AU2004208469B2 (ru) |
| CA (1) | CA2513104C (ru) |
| DE (3) | DE602004016287D1 (ru) |
| EA (1) | EA008026B1 (ru) |
| ES (2) | ES2312956T3 (ru) |
| HK (2) | HK1087335A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA05008128A (ru) |
| NO (1) | NO333213B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ541510A (ru) |
| PT (3) | PT2005966E (ru) |
| WO (1) | WO2004067023A2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2502740C2 (ru) * | 2008-06-19 | 2013-12-27 | Онкотерапи Сайенс, Инк. | Cdca1 эпитоп-пептиды и содержащие их вакцины |
| US10344075B2 (en) | 2013-11-22 | 2019-07-09 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Engineered high-affinity human t cell receptors |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7892559B2 (en) * | 2002-01-30 | 2011-02-22 | Survac Aps | Survivin-derived peptides and use thereof |
| US20040210035A1 (en) * | 2002-01-30 | 2004-10-21 | Straten Eivind Per Thor | Survivin-derived peptides and use thereof |
| WO2005049073A2 (en) | 2003-11-19 | 2005-06-02 | Survac Aps | Proteins belonging to the bcl-2 family and fragments thereof, and their use in cancer patients |
| JP4602006B2 (ja) * | 2004-06-29 | 2010-12-22 | 独立行政法人科学技術振興機構 | サバイビン由来のｈｌａ−ａ２４結合性癌抗原ペプチド |
| US8487076B1 (en) | 2005-01-25 | 2013-07-16 | Nec Corporation | HLA-binding peptide, and DNA fragment and recombinant vector coding for said HLA-binding peptide |
| AU2011203535B2 (en) * | 2005-02-04 | 2012-10-11 | Survac Aps | Survivin peptide vaccine |
| AU2011203536B2 (en) * | 2005-02-04 | 2012-11-15 | Survac Aps | Survivin peptide vaccine |
| CN103169958A (zh) * | 2005-02-04 | 2013-06-26 | 萨瓦克公司 | 存活蛋白肽疫苗 |
| US20060276423A1 (en) * | 2005-04-18 | 2006-12-07 | Rachel Altura | Survivin-directed RNA interference-compositions and methods |
| US20070104689A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
| FR2891462B1 (fr) * | 2005-09-30 | 2009-10-16 | Commissariat Energie Atomique | Epitopes t cd4+ de la survivine et leurs applications |
| IL172896A0 (en) * | 2005-12-29 | 2006-06-11 | Yeda Res & Dev | Cxcr4 inhibition |
| US8580269B2 (en) | 2007-07-19 | 2013-11-12 | Health Research, Inc. | Survivin peptides for autoimmune therapies |
| CN101754768B (zh) * | 2007-07-19 | 2013-07-10 | 健康研究股份有限公司 | 用作癌症疫苗的存活蛋白肽 |
| CN101981187A (zh) * | 2008-03-31 | 2011-02-23 | 株式会社生物免疫平衡 | MHC Ⅱ类分子提呈的存活蛋白(Survivin)的部分肽及其利用方法 |
| DK2119726T5 (en) * | 2008-05-14 | 2018-03-26 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel and powerful MHC class II peptides derived from survivin and neurocan |
| RS53782B1 (en) * | 2008-10-01 | 2015-06-30 | Immatics Biotechnologies Gmbh | TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES PREPARED AND ANTI-CHANGE RESPONSE FOR GLIOBLASTOMA (GBM) AND OTHER CANCER TREATMENTS |
| US9023802B2 (en) | 2009-12-14 | 2015-05-05 | Immatics Biotechnologies Gmbh | HLA-binding peptides derived from prostate-associated antigenic molecules and methods of use thereof |
| GB201004575D0 (en) | 2010-03-19 | 2010-05-05 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Composition of tumor associated peptides and related anti cancer vaccine for the treatment of gastric cancer and other cancers |
| MX2013006758A (es) | 2010-12-14 | 2013-08-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptidos de union a hla derivados de moleculas antigenicas asociadas a la prostata y metodos de uso de los mismos. |
| WO2012126118A1 (en) * | 2011-03-21 | 2012-09-27 | Atlantic Cancer Research Institute | Polypeptides with affinity for heat shock proteins (hsps) and hsp associated complexes (hacs) and their use in diagnosis and therapy |
| AU2013266066A1 (en) | 2012-05-25 | 2014-12-11 | Agenus Inc. | Identification of MHC class I phospho-peptide antigens from breast cancer utilizing sHLA technology and complementary enrichment strategies |
| EP2872532A4 (en) | 2012-07-10 | 2016-04-13 | Oncotherapy Science Inc | CDCA1-EPITOPPEPTIDES FOR TH1 CELLS AND VACCINES THEREWITH |
| CN111905099A (zh) | 2013-03-27 | 2020-11-10 | 免疫疫苗技术有限公司 | 用于改善存活蛋白疫苗在癌症治疗中的功效的方法 |
| MA40253A (fr) | 2014-07-15 | 2017-05-24 | Juno Therapeutics Inc | Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive |
| EP3242883A4 (en) | 2015-01-06 | 2018-10-17 | ImmunoVaccine Technologies Inc. | Lipid a mimics, methods of preparation, and uses thereof |
| GB201507030D0 (en) | 2015-04-24 | 2015-06-10 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC |
| US20180162913A1 (en) * | 2015-05-01 | 2018-06-14 | Immunovaccine Technologies Inc. | Methods for potentiating an immune response using depot-forming and non-depot-forming vaccines |
| MA42895A (fr) | 2015-07-15 | 2018-05-23 | Juno Therapeutics Inc | Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive |
| WO2017083963A1 (en) | 2015-11-18 | 2017-05-26 | Immunovaccine Technologies Inc. | Adjuvanting systems and water-free vaccine compositions comprising a polyi:c polynucleotide adjuvant and a lipid-based adjuvant |
| GB201604755D0 (en) * | 2016-03-21 | 2016-05-04 | Vaxeal Res Sas | Immunogenic compositions |
| JP7346291B2 (ja) | 2016-09-21 | 2023-09-19 | アマル セラピューティクス エスエー | 癌を治療するための細胞透過性ペプチド、マルチエピトープ、及びｔｌｒペプチドアゴニストを含む融合体 |
| EP3522917A2 (en) | 2016-10-07 | 2019-08-14 | Enterome S.A. | Microbiota sequence variants of tumor-related antigenic epitopes |
| KR102622188B1 (ko) | 2016-10-07 | 2024-01-05 | 엔터롬 에스.에이. | 암 치료를 위한 면역원성 화합물 |
| US11478538B2 (en) | 2016-10-07 | 2022-10-25 | Enterome S.A. | Immunogenic compounds for cancer therapy |
| CN110651189A (zh) | 2017-03-03 | 2020-01-03 | 特雷斯生物公司 | 肽疫苗 |
| JP6993677B2 (ja) * | 2017-11-08 | 2022-01-13 | 学校法人日本医科大学 | 犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移の予防のためのがんペプチドワクチン |
| BR112020020780A2 (pt) * | 2018-04-11 | 2021-03-02 | Enterome S.A. | peptídeos antigênicos para prevenção e tratamento do câncer |
| MA53543A (fr) | 2018-09-04 | 2021-07-14 | Treos Bio Ltd | Vaccins peptidiques |
| FR3087448B1 (fr) | 2018-10-23 | 2023-10-13 | Pdc Line Pharma | Lignee pdc modifiee pour secreter une cytokine |
| AU2019383785A1 (en) * | 2018-11-19 | 2021-06-03 | Immunovaccine Technologies Inc. | Methods for improving the efficacy of a survivin therapeutic in the treatment of tumors |
| WO2020120786A1 (en) * | 2018-12-14 | 2020-06-18 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Isolated mhc-derived human peptides and uses thereof for stimulating and activating the suppressive function of cd8+cd45rclow tregs |
| CN111440246B (zh) * | 2020-04-16 | 2022-03-18 | 成都仕康美生物科技有限公司 | 靶向HLA-B的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备方法、用途 |
| KR20230044133A (ko) * | 2021-09-24 | 2023-04-03 | 주식회사 차백신연구소 | 종양 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드 및 리포펩타이드와 면역활성물질로 구성되는 아쥬번트를 포함하는 항암 백신 조성물 및 이의 용도 |
| CN115477686B (zh) * | 2022-09-22 | 2024-01-30 | 北海黑珍珠海洋生物科技有限公司 | 一种具有美白功效的珍珠贝活性肽及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000003693A1 (en) * | 1998-07-14 | 2000-01-27 | Jenner Biotherapies, Inc. | Survivin, and peptides thereof, as an anti-cancer vaccine |
| US6245523B1 (en) * | 1996-11-20 | 2001-06-12 | Yale University | Survivin, a protein that inhibits cellular apoptosis, and its modulation |
| WO2003102023A1 (de) * | 2002-05-29 | 2003-12-11 | Immatics Biotechnologies Gmbh | An mhc-moleküle bindende tumor-assoziierte peptide |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5342774A (en) | 1991-05-23 | 1994-08-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1 |
| US6037135A (en) * | 1992-08-07 | 2000-03-14 | Epimmune Inc. | Methods for making HLA binding peptides and their uses |
| ATE280180T1 (de) | 1992-08-31 | 2004-11-15 | Ludwig Inst Cancer Res | Vom mage-3-gen abgeleitetes und von hla-a1 präsentiertes, isoliertes nonapeptid und dessen anwendungen |
| US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| US6096313A (en) | 1996-02-09 | 2000-08-01 | Ludwig Institute For Cancer Research | Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant |
| WO1999050637A2 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated multimeric complexes useful in analysis of t cells, peptides useful in making the complexes, and uses thereof |
| CA2323514A1 (en) * | 1998-04-01 | 1999-10-07 | Yale University | Method for selectively modulating the interactions between survivin and tubulin |
| DK2336167T3 (da) * | 2001-03-14 | 2019-09-02 | Dako Denmark As | MHC-molekylkonstrukter og deres anvendelse til diagnose og terapi |
| US7892559B2 (en) | 2002-01-30 | 2011-02-22 | Survac Aps | Survivin-derived peptides and use thereof |
| US20040210035A1 (en) * | 2002-01-30 | 2004-10-21 | Straten Eivind Per Thor | Survivin-derived peptides and use thereof |
| WO2005049073A2 (en) | 2003-11-19 | 2005-06-02 | Survac Aps | Proteins belonging to the bcl-2 family and fragments thereof, and their use in cancer patients |
-
2003
- 2003-11-19 US US10/715,417 patent/US7892559B2/en active Active
-
2004
- 2004-01-30 PT PT08163405T patent/PT2005966E/pt unknown
- 2004-01-30 EP EP04706615A patent/EP1587532B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 JP JP2005518634A patent/JP5121143B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 DE DE602004016287T patent/DE602004016287D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 AU AU2004208469A patent/AU2004208469B2/en not_active Expired
- 2004-01-30 EA EA200501206A patent/EA008026B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-01-30 AT AT08163405T patent/ATE454159T1/de active
- 2004-01-30 EP EP08163405A patent/EP2005966B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 WO PCT/DK2004/000062 patent/WO2004067023A2/en active IP Right Grant
- 2004-01-30 US US10/543,755 patent/US8318174B2/en active Active
- 2004-01-30 ES ES04706615T patent/ES2312956T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 CN CN2004800070526A patent/CN1767848B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 NZ NZ541510A patent/NZ541510A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-01-30 MX MXPA05008128A patent/MXPA05008128A/es active IP Right Grant
- 2004-01-30 DE DE602004032483T patent/DE602004032483D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 ES ES08163405T patent/ES2339193T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 CA CA2513104A patent/CA2513104C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 DE DE602004025059T patent/DE602004025059D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 PT PT04706615T patent/PT1587532E/pt unknown
- 2004-01-30 AT AT04706615T patent/ATE406906T1/de active
- 2004-01-30 EP EP10180878.0A patent/EP2359841B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 CN CN2010101195668A patent/CN101906148B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 AT AT09155102T patent/ATE506962T1/de active
- 2004-01-30 EP EP14191676.7A patent/EP2857034B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 EP EP09155102A patent/EP2092938B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-30 PT PT09155102T patent/PT2092938E/pt unknown
-
2005
- 2005-08-29 NO NO20053999A patent/NO333213B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-07-10 HK HK06107692.0A patent/HK1087335A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-06-22 HK HK09105575.3A patent/HK1126668A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-09-28 US US13/630,862 patent/US9534030B2/en not_active Ceased
-
2018
- 2018-07-19 US US16/039,999 patent/USRE48522E1/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6245523B1 (en) * | 1996-11-20 | 2001-06-12 | Yale University | Survivin, a protein that inhibits cellular apoptosis, and its modulation |
| WO2000003693A1 (en) * | 1998-07-14 | 2000-01-27 | Jenner Biotherapies, Inc. | Survivin, and peptides thereof, as an anti-cancer vaccine |
| WO2003102023A1 (de) * | 2002-05-29 | 2003-12-11 | Immatics Biotechnologies Gmbh | An mhc-moleküle bindende tumor-assoziierte peptide |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| ANDERSEN MADS HALD ET AL.: "Identification of a cytotoxic T lymphocyte response to the apoptosis inhibitor protein survivin in cancer patients", CANCER RESEARCH, vol. 61, no. 3, 1 February 2001 (2001-02-01), pages 869-872, XP002283853, ISSN: 0008-5472, the whole document * |
| ANDERSEN MADS HALD ET AL.: "Spontaneous cytotoxic T-cell responses against survivin-derived MHC class I-restricted T-cell epitopes in situ as well as ex vivo in cancer patients", CANCER RESEARCH, vol. 61, no. 16, 15 August 2001 (2001-08-15), pages 5964-5968, XP002283854, ISSN: 0008-5472, the whole document * |
| DATABASE BIOSIS [Online], BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 16 November 2002 (2002-11-16), SCHMIDT SUSANNE M. ET AL.: "Survivin Is a Shared Tumor-Associated Antigen Expressed in a Broad Variety of Malignancies and Recognized by Specific Cytotoxic T-Cells", XP002283859, Database accession no. PREV200300357946, abstract & BLOOD, vol. 100, no. 11, 16 November 2002 (2002-11-16), page Abstract No. 3675, 44TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY; PHILADELPHIA, PA, USA; DECEMBER 06-10, 2002, ISSN: 0006-4971 * |
| FORTUGNO PAOLA ET AL.: "Survivin exists in immunochemicany distinct subcellular pools and is involved in spindle microtubule function", JOURNAL OF CELL SCIENCE, vol. 115, no. 3, 1 February 2002 (2002-02-01), pages 575-585, XP002283857, ISSN: 0021-9533, page 577, right-hand column, paragraph 4 - page 578, left-hand column, paragraph 1 * |
| HIROHASHI YOSHIHIKO ET AL.: "An HLA-A24-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope of a tumor-associated protein, survivin", CLINICAL CANCER RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, JUN 2002, vol. 8, no. 6, June 2002 (2002-06), pages 1731-1739, XP002283856, ISSN: 1078-0432, the whole document * |
| SCHMIDT SUSANNE M. ET AL.: "Survivin is a shared tumor-associated antigen expressed in a broad variety of malignancies and recognized by specific cytotoxic T cells.", BLOOD, vol. 102, no. 2, 15 July 2003 (2003-07-15), pages 571-576, XP002283858, ISSN: 0006-4971, the whole document * |
| SCHMITZ MARC ET AL.: "Generation of survivin-specific CD8+ T effector cells by dendritic cells pulsed with protein or selected peptides", CANCER RESEARCH, vol. 60, no. 17, 1 September 2000 (2000-09-01), pages 4845-4849, XP002283855, ISSN: 0008-5472, the whole document * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2502740C2 (ru) * | 2008-06-19 | 2013-12-27 | Онкотерапи Сайенс, Инк. | Cdca1 эпитоп-пептиды и содержащие их вакцины |
| US9387238B2 (en) | 2008-06-19 | 2016-07-12 | Oncotherapy Science, Inc. | CDCA1 epitope peptides and vaccines containing the same |
| US10711047B2 (en) | 2008-06-19 | 2020-07-14 | Oncotherapy Science, Inc. | CDCA1 epitope peptides and vaccines containing the same |
| US10344075B2 (en) | 2013-11-22 | 2019-07-09 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Engineered high-affinity human t cell receptors |
| RU2729383C2 (ru) * | 2013-11-22 | 2020-08-06 | Зэ Борд оф Трастиз оф зэ Юниверсити оф Иллинойс | Сконструированные высокоаффинные t-клеточные рецепторы человека |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA008026B1 (ru) | Производные от сурвивина пептиды и их применение | |
| US7404270B2 (en) | Tumor antigen | |
| KR101216655B1 (ko) | Ｂｃｌ-2 패밀리에 속한 단백질들, 그들의 단편들 및 암환자에 대한 그들의 용도 | |
| NO340433B1 (no) | Survivin-avledet dekapeptid for bruk som medikament. | |
| NO344833B1 (no) | Survivin-avledede peptider og bruken av dem | |
| JP2004141154A (ja) | 腫瘍抗原 | |
| NO336825B1 (no) | Survivin-avledet nona-peptid, farmasøytisk blanding, multi-epitop vaksine og anvendelse av peptidet for fremstilling av et medikament for behandling av kreft |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |