CN101754768B

CN101754768B - 用作癌症疫苗的存活蛋白肽

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Publication number: CN101754768B
Application number: CN2008800252039A
Authority: CN
Inventors: M·西塞尔斯基; R·A·芬斯特梅克
Original assignee: Health Research Inc
Current assignee: Health Research Inc
Priority date: 2007-07-19
Filing date: 2008-07-18
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2028-07-18
Also published as: KR101585042B1; EP2178548A4; CA2694011C; US7943138B2; US20090041732A1; JP2010533735A; EP2178548B1; EP2178548A1; HK1142813A1; CN101754768A; KR20100051643A; ES2529193T3; WO2009012460A1; CA2694011A1; JP5438676B2

Abstract

提供了用于治疗表达存活蛋白的癌症的组合物和方法。该组合物包含具有改善的MHC-I结合特性的存活蛋白肽模拟物。该方法包括给予个体具有改善的MHC-I结合特性的存活蛋白肽模拟物，以在所述个体中实现对表达存活蛋白的癌细胞的生长抑制作用。

Description

用作癌症疫苗的存活蛋白肽

本申请要求2007年7月19日提交的美国专利申请序列第60/961,206号的优先权，将其内容纳入本文作参考。

本发明得到国立卫生研究院(National Institute of Health)政府基金的资助，基金号为NS049309-02。政府对本发明拥有某些权利。

技术领域

本发明一般涉及癌症疫苗，更具体涉及用作癌症疫苗的修饰的存活蛋白肽。

背景技术

存活蛋白是一种16.5kDa的胞内蛋白质，属于凋亡蛋白抑制剂(IAP)家族。存活蛋白与有丝分裂纺锤体协同作用以调节细胞分裂。存活蛋白在某些细胞中在细胞周期的G2/M相表达，在细胞周期进程的该相期间与纺缍体微管形成中心结合[Zhao J等，(2000)J Cell Sci，113：4363-71；Li F等，(1998)Nature，396：580-4；Fortugno P等，(2002)J Cell Sci，115：575-85]。也证明存活蛋白能够调节某些胱冬酶功能，直接抑制凋亡[Tamm I等，(1998)CancerRes，58：5215-20；Conway等，(2000)Blood 95：1435-42；Shin S等，(2001)Biochemistry，40：1117-23]。此外，存活蛋白可抑制细胞周期蛋白D/cdk4复合物[Fukuda S，Pelus LM.(2002)Cell Cycle，1(5)：322-6]，允许细胞周期进程。因此，存活蛋白在许多不同细胞位点发挥关键作用以调节细胞周期和抑制凋亡细胞死亡。

存活蛋白在大多数癌症细胞细胞周期的G(2)/M相期间过度表达，是迄今为止鉴定的特异性最高的癌症抗原之一。在大部分肿瘤中表达，而在正常成人组织中几乎检测不到[Overwijk WW等，(1998)J Exp Med，188：277-86；Adida C等，(1998)Am J Pathol 152：43-49]。虽然在一些情况下存活蛋白在受到促血细胞生成生长因子刺激的CD34(+)造血干细胞和祖细胞中表达，但通常不在这些细胞的表面表达。[Fukuda S，Pelus LM.(2002)Cell Cycle.1(5)：322-6]。

除许多其他癌症之外，存活蛋白还在与预后不良有关的恶性胶质瘤中表达[Kajiwara Y等，(2003)Cancer 97：1077-1083；Sasaki T，(2002)ActaNeuropathol(Berl)104：105-109；Chakravarti A等，(2002)J Clin Oncol，20：1063-8]。由于存活蛋白在许多不同的癌症类型中表达，因此将其用作肿瘤疫苗靶点在抗癌疫苗治疗中具有广泛的应用。然而，过去的研究没能鉴定肿瘤攻击后给予时有效的存活蛋白肽。而且，很少有关于存活蛋白肽在人体中的潜在效力的数据。因此，仍然需要适合用作抗-存活蛋白癌症免疫疗法的能够引出强效细胞免疫应答的存活蛋白肽。

发明内容

本发明提供了用于治疗表达存活蛋白的癌症的组合物和方法。该组合物包含存活蛋白肽模拟物，在野生型存活蛋白蛋白序列的氨基酸位置57处的半胱氨酸改变为甲硫氨酸。该肽长度为9-23个氨基酸，具有SEQ ID NO：4(ENEPDLAQMFFCFKELEGWEPDD)的序列或其片段，其中所述片段包括SEQ ID NO：4的至少9个毗连的氨基酸，所述片段也包含SEQ ID NO：5(QMFFCF)的序列。与具有野生型存活蛋白序列的肽引出的细胞介导的免疫应答相比，该肽能够刺激改良的对抗表达存活蛋白的人癌症细胞的人细胞介导的免疫应答。还证明该肽能够延长小鼠胶质瘤模型的存活。

本发明方法包括给予诊断患有或者疑似患有表达存活蛋白的癌症的个体包含本发明肽的组合物，从而抑制癌症生长。

还提供了加载有本发明肽的基本纯化的哺乳动物树突细胞群。

附图简述

图1提供了野生型和本发明中使用的经改变的肽序列的总结。

图2提供了野生型和经改变的肽序列的比较图，以加框形式显示了MHCI类(HLA-A*0201)表位。所有本发明肽共有的序列(QMFFCF)在存活蛋白-53-67/57M中以斜体标出。

图3提供了存活蛋白肽结合试验获得的体外试验数据的图示。

图4提供了采用基于存活蛋白氨基酸53-67的经改变的肽在GL261鼠模型中进行的颅内存活研究获得的数据的图示。利用负载肽的树突细胞(DC)疫苗或作为钥孔血蓝素(KLH)偶联物来给予肽。

图5提供了根据本发明方法进行处理(右图)和阴性对照(左图)的小鼠磁共振成像试验的图示。

图6A、6B和6C提供了存活蛋白肽的HLA-A*0201的结合性质试验所得数据的图示。在MHC I类肽竞争置换试验中使用存活蛋白肽表位，以获得图6A和6B总结的数据。IC50表示置换荧光标记的已知人MHC I类配体(HPV18-27)所需的存活蛋白肽的50％抑制浓度。阳性对照肽(Flu和gp100)表示已知的免疫原性MHC I类配体。数据是三份样品得到的平均荧光±S.E.M.。图6C提供了野生型和经改变的存活蛋白肽表位的特异性HLA-A*0201五聚体结合数据的图示。

图7提供了来自人胶质瘤样本的存活蛋白mRNA的RT-PCR扩增后电泳分离的图示。从人胶质瘤的细胞裂解物分离RNA并用RT-PCR进行扩增。预计大小的存活蛋白谱带在11/12样品以及对照(M)中丰富检出。对照谱带源自存活蛋白存活蛋白cDNA的PCR。

图8提供了用异源错配U87胶质瘤(HLA-A*03T细胞与HLA-A*02胶质瘤；异源错配)攻击负载存活蛋白的自体树突细胞进行离体T细胞刺激获得的数据的图示。

图9提供了用异源U87胶质瘤(HLA-A*02；异源匹配)攻击负载存活蛋白的自体树突细胞进行离体T细胞刺激获得的数据的图示。

图10提供了第二种情况的图示，其中用异源U87胶质瘤(HLA-A*02；异源匹配)攻击负载存活蛋白的自体树突细胞进行离体T细胞刺激。

图11提供了用自体胶质瘤(HLA-A*03，HLA-A*29；自体)攻击负载存活蛋白的自体树突细胞进行离体T细胞刺激获得的数据的图示。

图12提供了用异源DS-GBM胶质瘤(HLA-A*03；异源匹配)攻击负载存活蛋白的自体树突细胞进行离体T细胞刺激获得的数据的图示。

图13提供了用自体CNS淋巴瘤(HLA-A*2901，HLA-A*3002；自体)攻击负载存活蛋白的自体树突细胞进行离体T细胞刺激获得的数据的图示。

发明详述

本发明提供了用于抑制表达存活蛋白的癌细胞生长的组合物和方法。本发明的组合物包含存活蛋白肽模拟物，该模拟物能引出能够抑制含有表达存活蛋白的癌细胞的肿瘤的生长的强效抗肿瘤细胞介导的免疫。本发明方法包括给予诊断患有或者疑似患有表达存活蛋白的癌症的个体有效量的本发明肽模拟物，以抑制个体中表达存活蛋白的癌细胞的生长。本文所述的生长抑制包括降低现有肿瘤的大小。

本发明方法刺激针对表达存活蛋白的癌细胞的细胞介导的免疫应答。与细胞介导的免疫的产生相关联，认为强效的细胞免疫应答通常需要在结合MHC I类分子的抗原呈递细胞(APC)的表面展示肽表位，从而触发CD8+T细胞应答(细胞毒T细胞或CTL)。为维持这种作用，优选通过向细胞因子分泌型CD4+T细胞(T辅助细胞)呈递结合MHC II类分子的肽表位来支持CTL免疫应答。虽然已证明一些存活蛋白肽能够引出CTL应答，提供来自存活蛋白氨基酸53-67区域的活肽疫苗候选物的尝试失败了，可能是因为HLA*0201结合能力的缺失[Bachinsky MM等，(2005)Cancer Immun.22；5：6]。

本发明通过提供源自野生型序列的肽克服了这些和其他限制，其中，所述肽包含改善MHC I结合性质的改变的氨基酸序列，使得该肽在引出针对表达存活蛋白的癌细胞的人CTL应答方面比野生型肽更有效。

人和鼠存活蛋白的完整氨基酸序列分别参见SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2。人和小鼠序列在氨基酸31到71之间100％同源。

本发明提供的肽是全长存活蛋白的片段。该片段大小为9-23个氨基酸。SEQ ID NO：3(ENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDD)包括野生型存活蛋白氨基酸49-71。

本发明9-23个氨基酸的肽各自包含在野生型存活蛋白序列氨基酸位置57处半胱氨酸到甲硫氨酸(C到M)的改变。

SEQ ID NO：4(ENEPDLAQMFFCFKELEGWEPDD)是野生型存活蛋白氨基酸49-71构成的23个氨基酸的肽，只是在全长存活蛋白的氨基酸位置57处存在C到M的改变(C到M的改变在SEQ ID NO：4的第9个氨基酸位置)。本发明的肽包括9-23个SEQ ID NO：4的毗连氨基酸，包括9-23之间的所有整数，其中所述肽在全长存活蛋白的氨基酸位置57处包括C到M的改变。本发明的肽各自还包含SEQ ID NO：5(QMFFCF)的核心序列。

图1提供了代表性的存活蛋白肽和本文采用的肽的命名法。

本发明提供的一些非限制性的肽的例子也可参见图2，其中示出了在较长的合适的肽序列中加框并且斜体的SEQ ID NO：5的核心表位序列，在图2右侧所示肽中较长的合适的肽序列也加框表示。因此，各个包括斜体核心序列的加框序列是包括在本发明范围内的序列。

在一个实施方式中，本发明的肽包括SEQ ID NO：6(DLAQMFFCFKELEGW)。该肽可选地称为“SVN53-67/M57”、“存活蛋白M57”和“M57”。SVN53-67/M57包含结合人MHC I分子的表位和能够结合人MHC II分子的表位以引出CD4+辅助T细胞应答。

不希望受任何具体理论的限制，相信本发明肽中C到M的改变将改善MHC I结合表位向人免疫系统的呈递，部分地通过更有效地锚定于MHC I，导致肽、MHC I分子和可能的T细胞受体之间更长的缔合持续时间，因而更强效的免疫应答。较短的肽排他性地结合MHC I。较大的肽，例如15-merSVN53-67/M57，设计成除MHC I类外还结合MHC II类。

我们发现，在HLA-A*0201的原位结合试验中，相对于野生型序列，SVN53-67/M57中C到M的氨基酸取代能提高MHC I结合约73倍(总结在图2和图6C)。我们还发现，包含C到M改变的肽可用于有效刺激CD8+CTL，刺激源自CD4+T细胞的细胞因子支持，在小鼠脑癌模型中提高存活(并潜在地治愈胶质瘤)，以及引出针对人胶质瘤和CNS淋巴瘤样品的强效离体裂解反应。因此，预期人体内用作疫苗时，因为加工的肽的表位和MHC-I锚定残基之间伴随发生的改善的缔合，本发明的肽可用于引发提高的MHC-I结合和改善的针对表达存活蛋白的癌细胞的CTL活性的方法中。

预期SVN 53-67肽(含或不含C到M的改变)将结合大量患者人群中共同存在的各种MHC I类和II类分子(表1)。

表1.

本发明的肽可通过任何本领域技术人员已知的技术或者通过随后开发的技术进行制备。例如，可采用固相合成技术来制备肽(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，15：2149-2154(1963)；M.Bodanszky等，(1976)《肽合成》(PeptideSynthesis)，John Wiley&Sons，第2版；Kent和Clark-Lewis，《生物学和医学中的合成肽》(Synthetic Peptides in Biology and Medicine)，第295-358页，Alitalo，K.等编，科学出版社(Science Publishers)，(阿姆斯特丹，1985)。也可采用液相方法合成肽，参见《蛋白质》The Proteins，第II卷，第3版，第105-237页，Neurath，H.等编，纽约州纽约的学术出版社(Academic Press)，(1976)。合成的肽可通过制备型高效液相色谱或者其他本领域可获得的相当的技术进行基本纯化。合成肽的组成通过氨基酸组成分析技术进行验证。

可用合适的佐剂来配制本发明的肽以提高免疫原性应答。合适的佐剂包括但不限于：无机盐，包括氢氧化铝以及铝和钙的磷酸盐凝胶，基于油乳剂和表面活性剂的制剂，皂苷，AS02[SBAS2](水包油乳剂)，Montanide ISA-51和ISA-720，颗粒性佐剂，包括病毒小体，AS04，[SBAS4]Al盐与MPL，ISCOMS(皂苷和脂质的结构复合物)，聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)，天然和合成的微生物衍生物，类脂免疫刺激剂OM-174(脂质A衍生物)，含免疫刺激性CpG基序的合成寡核苷酸，修饰的细菌毒素，内源性人免疫调节剂，包括hGM-CSF和hIL-12，hIL-15，hIL-17，hIL-21，Immudaptin和惰性载体，包括金颗粒。可根据已知技术将肽与标准药学上可接受的载体组合来制备以常规剂型给予的肽。药学上可接受的载体的一些例子可参见：雷明登药物科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)(2005)，第21版，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA.)Lippincott Williams&Wilkins。

在一个实施方式中，本发明肽可偶联于免疫原性载体蛋白。合适的载体包括但不限于：鲎蛛血蓝素(LPH)、中国鲎血蓝素(TTH)和牛血清白蛋白(BSA)、破伤风类毒素和白喉毒素、DHBcAg、聚核糖醇核糖磷酸(polyribotolribosyl phosphate)(PRP)、PncPD11和纳米颗粒制剂。

在一个实施方式中，合适的免疫原性载体蛋白是钥孔血蓝素(KLH)。

本发明肽也可作为负载肽的树突细胞来给予。因此，方法包括将树突细胞给予个体，所述树突细胞与本发明肽孵育从而摄取所述肽，获得有利于呈递肽中存在的MHC表位的负载肽的树突细胞。出于该目的采用的树突细胞可从与肽孵育后进行递送的个体分离，或者可以从异源匹配的个体获得。因此，本发明还提供了包含基本纯化的哺乳动物树突细胞群的组合物，其中所述树突细胞与本发明的肽孵育以摄取所述肽。

可采用本领域技术人员已知的各种方法将本发明的组合物引入个体。这些方法包括但不限于：颅内、鞘内、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服和鼻内途径。

本领域技术人员将理解，本发明方法中采用的具体给药方案的形式和特点取决于给药途径和其他公知的变量，例如个体尺寸和疾病阶段。基于这种标准和本文呈现的数据，本领域技术人员能够确定对于任何特定的个体能够有效抑制表达存活蛋白的癌细胞生长的肽的量。通常认为，肽的用量从微克级到毫克级。

本发明方法可与常规和抗癌治疗联用。这些治疗包括但不限于：化疗、外科干预和放疗。本发明的组合物可以在这些抗癌治疗之前、同时或之后给予。

以下实施例是为了说明而非限制本发明。

实施例1

本实施例提供了根据SYFPEITHI预测的选定存活蛋白肽表位与MHC I类分子结合的体外试验(表2)。阳性对照肽(OVA-258)代表已知的免疫原性MHC I类配体，具有代表强效潜在结合的评分。带有下划线的氨基酸残基代表MHC I锚定位置。

表2.

预测的H-2K^b结合位置	表位	评分
			OVA-258	S I I N F E K L(SEQ ID NO：7)	25
SVN-9	A W Q P F L K D(SEQ ID NO：8)	12
			SVN-18	R I S T F K N W(SEQ ID NO：9)	13
SVN-39	A E A G F I H C(SEQ ID NO：10)	12
			SVN-57-64	C F F C F K E L(SEQ ID NO：11)	20
SVN-57-64/M57	M F F C F K E L(SEQ ID NO：17)	20
			SVN-82	S G C A F L S V(SEQ ID NO：12)	18
SVN-L82	L G C A F L S V(SEQ ID NO：13)	18
			SVN-97	T L G E F L K L(SEQ ID NO：14)	22

图3给出了肽结合试验的体外测试数据。在常规MHC I类肽结合试验中使用存活蛋白肽表位，以获得图3给出的数据。图3中的平均荧光表示SVN肽与H2-K^b的结合。采用缺乏表面MHC I类分子表达的鼠RMA-S细胞表面H2-K^b分子的上调来体外确定实际的存活蛋白肽结合。图3所示数据表示在37℃100μM肽的结合。阴性对照是不能结合MHC I类的无关肽。数据是三份样品得到的平均荧光±S.E.M.。

从图3所示数据可知，计算机分子不足以可靠地预测改变的肽序列对MHC结合强度的作用。注意，SVN_97-104是目前在临床试验中使用的肽，但其结合小于SVN 57-64野生型，显著小于SVN 57-64/M57，虽然表2的数据表明SVN_97-104比野生型或突变型SVN 57-64肽显示更强结合。而且，虽然氨基酸的其他改变也能提高结合，我们已经证实氨基酸锚定位置57、59和64的改变(包括57C到L，59F到Y和64L到V)不会改善肽的免疫应答，虽然计算机分析预测与野生型序列相比改善的MHC保持能力。此外，通过对在存活蛋白氨基酸位置82处包含S到M的改变的存活蛋白九肽的分析，我们还证实，仅仅取代MHCI类第一锚定位置中的氨基酸甲硫氨酸并不必然提高颅内胶质瘤小鼠模型的存活。

实施例2

本实施例显示了本发明方法在治疗颅内胶质瘤小鼠模型中的效力。

为了评价本发明肽引出针对表达存活蛋白的癌细胞的免疫应答的能力，我们使用相信是可获得的在测试疫苗对胶质瘤的效力中最严谨的模型。在该方面，广泛的认识是颅内肿瘤的生长非常难以抑制，尤其对于癌症疫苗来说，因为皮下肿瘤所得结果常常不能反映颅内有效性。响应多次基于M57的肽方案导致的颅内肿瘤生长受抑制证实本发明确切的抗肿瘤效果。

除非另有说明，本实施例给出的数据采用同系GL261-C57BL/6鼠颅内胶质瘤模型产生。大脑内GL261胶质瘤模型的特征在于，存活窗口狭窄、初始存活高以及一致的重现性。

采用以下材料和方法来获得实施例所呈现的数据。

细胞系与培养条件在37℃、5％CO₂中，在100-mm的组织培养板上用含有10％胎牛血清、5,000单位青霉素/链霉素、50μM 2-巯基乙醇、25mMHEPES和1x非必需氨基酸的完全Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)培养GL261鼠胶质瘤细胞，每周换液2-3次。用含有10％胎牛血清、5,000单位青霉素/链霉素、50μM 2-巯基乙醇、25mM HEPES，1x非必需氨基酸和20ng/mlGM-CSF(新泽西州洛基山脉的派罗科技公司(PeproTech，Rocky Hill，NJ))的RPMI以2×10⁶个细胞/毫升的密度培养DC2.4树突细胞系。在37℃、5％CO₂中，在100-mm的组织培养板上用含有10％胎牛血清、5,000单位青霉素/链霉素、50μM 2-巯基乙醇、25mM HEPES和1x非必需氨基酸的完全Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)培养GL261鼠胶质瘤细胞，每周换液2-3次。

肽用Fmoc化学和固相载体树脂(德克萨斯州伍德兰的SG公司(Sigma-Genosys，The Woodlands，TX))进行肽合成。每种肽在-20℃储存备用并用DMSO稀释。卵清蛋白(OVA)肽序列SIINFEKL用作对照。

用负载肽的DC免疫小鼠由用如上所述培养基中培养的DC2.4细胞系或收获的源自骨髓的树突细胞(BMDC)产生负载肽的树突细胞(DC)，例如参见Ciesielski等Cancer Immunol Immunother.2006第12卷，第1491-503页。从处死的6周龄C57BL/6小鼠的长骨收获BMDC，并用含有10％胎牛血清、5,000单位青霉素/链霉素、50μM 2-巯基乙醇、25mM HEPES，1x非必需氨基酸和20ng/ml GM-CSF(新泽西州洛基山脉的派罗科技公司(PeproTech，RockyHill，NJ))的RPMI以2×10⁶个细胞/毫升的密度培养细胞。48小时后，去除未贴附的细胞，补充含GM-CSF的培养基。6天后，收获未贴附的细胞用于负载肽。向含3×10⁶个DC/毫升的各个孔中加入40μg的各种肽来负载DC2.4细胞和BMDC。肽和DC在37℃孵育2小时，收获，洗涤并重悬于PBS中。通常采用总量1×10⁶个DC经皮下途径接种各个动物。根据存活，每7天用相同组合物加强免疫。

脾细胞和T细胞分离实验结束时收集已接种的C57BL/6小鼠的脾组织。用无菌镊子从小鼠脾脏获取细胞并用70μm滤器过滤。(BD Falcon)。用含有10％胎牛血清、IL-2(10单位/ml)和IL-7(1ng/ml)的DMEM培养脾细胞。第2和第7天补充培养基。为分离T细胞，脾细胞离心5分钟并将所得沉淀重悬于RBC裂解缓冲液(R&D系统)中。细胞洗涤两次并重悬于完全RPMI培养基中。

CTL裂解肿瘤细胞采用活/死细胞介导的细胞毒性试剂盒(分子探针-英吉公司(Molecular Probes-Invitrogen)进行肿瘤靶细胞的特异性T细胞裂解的细胞试验。胰酶消化GL261细胞并以1×10⁶个细胞/毫升的密度重悬，然后加入10μl DiOC₁₈标记(绿色荧光)，37℃孵育20分钟。标记后，细胞离心，用PBS洗涤两次，并以1×10⁶个细胞/毫升的密度重悬于DMEM中。然后，将1×10⁴GL261DiOC₁₈-标记靶细胞加入各个培育管中。将已接种动物的脾细胞以1∶25到1∶100的比率加入靶细胞中，37℃孵育2小时。也设定条件以分析背景水平，自发膜融合损失和最大裂解。将碘化丙锭加入各个培养管中，用渗透细胞膜的红色标记细胞。细胞离心后用于FACS分析。用以下公式计算细胞毒性百分率：(实验PI-DiOC₁₈细胞-自发)/(最大PI-DiOC₁₈-自发PI-DiOC₁₈)x100。通过重复冻融DiOC₁₈标记的靶细胞来测定最大释放。通过在没有效应细胞存在下孵育PI-DiOC₁₈细胞来测定自发释放。用流式分析软件(FCSExpress)分析数据。分析基于对GL261细胞设门，以消除来自效应细胞的任何背景。

大脑内GL261肿瘤细胞注射和存活分析。腹膜内(i.p.)注射氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(20mg/kg)麻醉雄性C57BL/6小鼠，并固定在头部立体定位架中(加利福尼亚州途加的DK设备公司(David Kopf Instruments，Tujunga，CA))。制备头皮中线切口并鉴定前囟点。测定立体定位坐标轴(前囟点旁2.0mm处)，将细胞植入前侧深处白质。在该点头颅钻孔，1×10⁵GL261细胞重悬于5μlDMEM中并通过带有固定的25号插管的汉密尔顿注射器注入相对于硬膜3.0mm深处。以2.5μl/分钟进行注射。取出针头并缝合切口。绘制卡普兰-迈耶生存曲线，确定所有组的平均存活时间。用对数秩MC(logrank Mantel-Cox)方法分析存活差异的显著性。

表3提供了鼠颅内胶质瘤模型的存活研究所得结果的总结。

表3.

肽序列	结果
		DLAQMFFCFKELEGW(SVN53-67/57M)(SEQ ID NO：6)	DC疫苗＝平均存活时间53天2/8存活100天
DLAQMFFCFKELEGW(SVN53-67/57M)(SEQ ID NO：6)	KLH疫苗＝平均存活时间51天1/8存活100天
		AQMFFCFKEL(SVN55-64/57M)(SEQID NO：15)	DC疫苗＝平均存活时间43天
QMFFCFKEL(SVN56-64/57M)(SEQ ID NO：16)	DC疫苗＝平均存活时间40天
		MFFCFKEL(SVN57-64/57M)(SEQ ID NO：17)	DC疫苗＝平均存活时间29天
DLAQCFFCFKELEGW(SVN53-67)(SEQ ID NO：18)	DC疫苗＝平均存活时间57天2/8存活100天
		CFFCFKEL(SVN57-64)(SEQ ID NO：11)	DC疫苗＝平均存活时间25天

图4提供了颅内存活研究数据的图示小结，显示了具有脑内GL261胶质瘤植入物的C57BL6小鼠的存活。为获得图4所示的数据，小鼠颅内植入1×10⁵GL261细胞，并用存活蛋白肽DC疫苗处理。用SVN57-64基改变的肽或负载OVA258-265肽的DC2.4细胞免疫接种C57BL/6小鼠，以及直接皮下注射不完全弗氏佐剂(IFA)加100ng GM-CSF配制的100ug SVN 53-67/M57-KLH肽。肿瘤细胞植入后4天开始疫苗接种，每7天重复(加强)接种以模拟治疗环境。根据卡普兰-迈耶方法绘制存活率。高场强MRI证实长期存活小鼠无肿瘤。

如表3和图4所示，在GL261-C57BL/6胶质瘤模型中，相对于野生型的肽，肽SVN57-64/M57DC疫苗能适当提高存活。重要的是，用作DC疫苗时在超过40天的时间内SVN53-67/M57和SVN53-67(野生型)的存活率为100％。也测定了作为KLH疫苗的SVN53-67/M57，中期存活时间51天。

图5提供了图4所示存活曲线所用小鼠代表性的磁共振图像。通常，最迟第18天发生致死性肿瘤，如左图中的对照小鼠所示。接受SVN53-67/M57肽疫苗的小鼠第40天仍然无肿瘤。免疫接种小鼠图像的左前侧半球中观察到小的针状管道和残余疤痕组织。

因此，该实施例证明本发明的肽能够提高存活，并且能够潜在地治愈临床相关的小鼠胶质瘤模型。

实施例3

本实施例显示了相对于野生型肽本发明肽提高的MHC I类结合，也显示了本发明的方法能够引出针对表达存活蛋白的人癌细胞，包括针对非胶质瘤癌细胞的提高的细胞介导的免疫应答。

不希望受任何具体理论的限制，认为SVN53-67/M57和SVN53-67在C57BL/6小鼠中具有类似的存活概况，因为M57改变并不依赖相对于小鼠H-2Kb分子的锚定位置。这样，小鼠中这两种肽将以类似程度结合H-2Kb(鼠MHC I类副本)。观察到虽然包含改变的人表位，SVN53-67/M57在小鼠中保留野生型免疫原性应答，表明这是一种有效的肽模拟物(虽然预期由于与T细胞受体相互作用的破坏，这种氨基酸改变可能对免疫造成不良影响)，并且当SVN53-67/M57用作疫苗时C到M的改变不会造成有害影响。然而，预期给予人体本发明肽将显示其提高的效能，因为57C到M的改变改变了野生型的肽，使其包含有利于改善与MHC I类的相互作用的序列。这可以在野生型和M57肽不同的MHC I类结合特征中得到证明(图6A-C)。竞争性肽结合试验证实，SVN53-67/M57与HLA-A*0201的结合比野生型SVN53-67强大约12倍(图6A-B)。而且，采用存活蛋白/MHC I类-特异性五聚体，核心肽SVN56-64/M57与HLA-A*0201的结合比野生型SVN56-64强大约73倍(图6C)。总之，这些结果表明，相对于野生型存活蛋白序列，C到M的改变导致肽模拟物对MHC I类分子的亲和力提高。因此，C到M的改变诱导超出野生型序列的MHC I类结合的显著改善。预期这种改善将提高针对自体癌细胞的CTL激活。因此，值得注意的是，与野生型的肽相比，SVN53-67/M57能够将针对异源HLA-匹配的人胶质瘤(图9-10)、自体人胶质瘤(图11-12)和自体人淋巴瘤细胞(图13)的CTL介导的杀死作用提高3-5倍，表明本发明方法能够引出显著优于具有野生型序列的肽所诱导的细胞介导的免疫应答。而且，图13的数据表明，本发明方法能够引出针对除胶质瘤以外其他人癌细胞的细胞介导的免疫应答。因此，预期该方法在所有表达存活蛋白的癌细胞中具有广泛应用。

实施例4

本实施例显示了用人U87成胶质细胞瘤或人淋巴瘤细胞攻击负载存活蛋白的自体人树突细胞进行离体T细胞刺激。所述攻击所得数据呈现在图8-13中。

为得到图8-13所示数据，使用活/死细胞介导的细胞毒方法通过流式细胞仪进行靶细胞特异性T细胞裂解的CTL试验。在GM-CSF和IL-4的存在下，将源自患者的外周血单核细胞(PBMC)离体培养成DC。5-6天分化形成不成熟的DC后，加入特异性的肽和CD-40L进行刺激DC并使其发育形成成熟DC。成熟后额外加入自体PBMC，使其形成CTL的PBMC。10天后，取出细胞，与自体或异源的人胶质瘤细胞混合培养以评价CTL的细胞杀伤能力。将CTL以5∶1到40∶1的比率加入胶质瘤靶细胞中，37℃孵育2小时。分析基于对标记的胶质瘤细胞设门以消除来自效应细胞的背景。用乙醇处理的靶细胞模拟最大细胞毒性。自发细胞毒作用代表在没有效应细胞存在下孵育的靶细胞。Flu和gp100肽刺激代表额外的刺激对照。数据是三份样品得到的平均特异性裂解百分率±S.E.M.。

以与图9-12所示基本相同的方式获得图13的数据，只是分析了CTL对自体CNS淋巴瘤细胞(而非自体或异源胶质瘤)的作用。

图9-12的数据表明，本发明的肽能够引出针对自体-匹配或自体胶质瘤的强效细胞介导的免疫应答。因此，预期给予个体时本发明方法能够诱导类似的应答。重要的是，也产生强效针对自体CNS淋巴瘤细胞的细胞介导的免疫应答(图13)，表明本发明的肽并不限于能够诱导仅仅针对成胶质细胞瘤细胞的细胞介导的应答。

因此，基于以上数据，预期本发明方法能够在个体中诱导针对任何类型的表达存活蛋白的癌细胞的有效的细胞介导的免疫应答，因而抑制这些癌细胞的生长。

通过具体实施方式描述了本发明。然而，对组成、方法和装置的常规改进是本领域技术人员所明白的，并且这些改进包括在本发明的范围内。

序列表

<110>R.A.芬斯特梅克(Fenstermaker，Robert A)

M.西塞尔斯基(Ciesielski，Michael J)

<120>用作癌症疫苗的存活蛋白肽

<130>003551.00331

<150>60/961,206

<151>2007-07-19

<160>20

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>142

<212>PRT

<213>人

<400>1

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His

65 70 75 80

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys

100 105 110

Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala

115 120 125

Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp

130 135 140

<210>2

<211>140

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Met Gly Ala Pro Ala Leu Pro Gln Ile Trp Gln Leu Tyr Leu Lys Asn

1 5 10 15

Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asn Pro Ile Glu Glu His Arg Lys His

65 70 75 80

Ser Pro Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys Lys Gln Met Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Gln Arg Ala Lys Asn Lys

100 105 110

Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Gln Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala

115 120 125

Lys Thr Thr Arg Gln Ser Ile Glu Gln Leu Ala Ala

130 135 140

<210>3

<211>23

<212>PRT

<213>人

<400>3

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1 5 10 15

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp

20

<210>4

<211>23

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>氨基酸位置57处具有C到M改变的野生型存活蛋白氨基酸49-71

<400>4

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Met Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1 5 10 15

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp

20

<210>5

<211>6

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>全长存活蛋白氨基酸57处具有C到M改变的存活蛋白疫苗核心表位

<400>5

Gln Met Phe Phe Cys Phe

1 5

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>位置57处具有C到M改变的存活蛋白氨基酸53-67

<400>6

Asp Leu Ala Gln Met Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp

1 5 10 15

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>7

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>8

Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5

<210>9

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>9

Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp

1 5

<210>10

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>10

Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys

1 5

<210>11

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>11

Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1 5

<210>12

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>12

Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val

1 5

<210>13

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>SVN-L82S到L改变

<400>13

Leu Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val

1 5

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>14

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys

1 5

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>位置57处C到M改变

<400>15

Ala Gln Met Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1 5 10

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>位置57处C到M改变

<400>16

Gln Met Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1 5

<210>17

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>位置57处具有C到M改变的SVN-57-64

<400>17

Met Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1 5

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>18

Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp

1 5 10 15

<210>19

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>19

Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1 5 10

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>20

Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1 5

Claims

1.一种包含肽的组合物，其中，所述肽由选自下组的序列组成：SEQID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述肽由SEQ IDNO:6(DLAQMFFCFKELEGW)的序列组成。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述肽偶联于免疫原性蛋白质载体。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含已经与所述肽孵育的树突细胞。

5.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含佐剂。

6.权利要求1所述的组合物在制备抑制诊断患有或疑似患有胶质瘤或淋巴瘤的个体中癌细胞生长用的药物中的用途，其中，所述癌细胞表达存活蛋白。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肽偶联于免疫原性载体蛋白。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肽由SEQ ID NO:6的序列组成。

9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述组合物中的肽存在于摄取所述肽的树突细胞中。

10.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述癌细胞存在于肿瘤中。

11.如权利要求6所述的用途，其特征在于，给予所述组合物能刺激个体针对存活蛋白的细胞介导的免疫应答。

12.一种纯化的哺乳动物树突细胞群，其中，所述树突细胞已经用权利要求1所述的肽进行孵育，使得所述树突细胞摄取所述肽。

13.如权利要求12所述的树突细胞，其特征在于，所述肽由SEQ IDNO:6的序列组成。