ES2312956T3

ES2312956T3 - Peptidos derivados de survivina y uso de los mismos.

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Publication number: ES2312956T3
Application number: ES04706615T
Authority: ES
Inventors: Eivind Per Thor Straten; Mads Hald Andersen
Original assignee: Survac ApS
Current assignee: Survac ApS
Priority date: 2003-01-30
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2024-01-30
Also published as: EP2092938B1; PT2092938E; US7892559B2; PT2005966E; ATE506962T1; EP2857034A1; USRE48522E1; MXPA05008128A; WO2004067023A3; CN101906148A; NO20053999L; DE602004016287D1; EA008026B1; ATE454159T1; PT1587532E; US20130115216A1; ATE406906T1; JP5121143B2; AU2004208469B2; EP2857034B1

Abstract

Un péptido de epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epítopo la secuencia RISTFKNWPK como se especifica en SEQ ID NO: 58 y al menos una de las siguientes características: (i) capaz de unirse a la molécula HLA-A3 de clase I con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C 50) que es como máximo de 50 muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA (ii) capaz de inducir células productoras de IFN-gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10 4 PBLs determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o (iii) capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que reaccionan con el péptido del epítopo.

Description

Péptidos derivados de survivina y uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos derivados de survivina, y a su uso para propósitos de diagnóstico y terapéuticos, específicamente en cáncer. En particular, los péptidos nuevos son epítopos de células T restringidos a HLA-A3 de MHC de clase I que son capaces de provocar respuestas de células T citotóxicas en los pacientes de cáncer, incluyendo respuestas in situ y ex vivo. De una manera específica, tales péptidos nuevos derivan de la proteína inhibidora de apoptosis survivina, un reconocido antígeno asociado a tumor (TAA, tumor associated
antigen).

Antecedentes técnicos y técnica anterior

El proceso mediante el cual el sistema inmune de mamíferos reconoce y reacciona a los materiales extraños o ajenos es complejo. Una faceta importante del sistema es la respuesta de células T. Esta respuesta requiere que las células T reconozcan e interactúen con complejos de moléculas de la superficie celular referidos como antígenos de leucocitos humanos (HLA, human leukocyte antigens), que constituyen el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, y péptidos. Los péptidos derivan de moléculas más grandes, que son procesadas por las células, que también presentan la molécula HLA/MHC. La interacción de las células T y complejos HLA/péptido está restringida, requiriendo una célula T que es específica para una combinación particular de una molécula de HLA y un péptido. Si no está presente una célula T específica, no hay respuesta de células T, incluso si está presente su complejo asociado. De una manera similar, no hay respuesta si el complejo específico está ausente, pero la célula T está
presente.

El mecanismo mediante el cual las células T reconocen las anormalidades celulares también se ha implicado en cáncer. Por ejemplo, en WO 92/20356, se da a conocer una familia de genes que se procesan a péptidos, que a su vez se expresan en las superficies celulares, y pueden producir lisis de las células tumorales por CTLs específicos. Estos genes son referidos como la familia MAGE, y se dice que codifican para "precursores de antígeno de rechazo de tumor" o moléculas "TRAP", y los péptidos derivados de los mismos son referidos como "antígenos de rechazo de tumor" o moléculas "TRAs" (tumour rejection antigens).

En WO 94/05304, se dan a conocer nonapéptidos que se unen a la molécula HLA-A1. La referencia da a conocer que dada la especificidad conocida de péptidos particulares para moléculas de HLA particulares, se debe esperar que un péptido particular se una a una molécula de HLA, pero no a otras. Esto es significativo, debido a que diferentes individuos poseen diferentes fenotipos de HLA. Como resultado, aunque la identificación de un péptido particular como que es un asociado para una molécula de HLA específica tiene ramificaciones de diagnóstico y terapéuticas, éstas solamente son pertinentes para los individuos con ese fenotipo de HLA particular.

Se han caracterizado varios péptidos presentados por las moléculas de MHC, y se ha encontrado que algunos de éstos pueden llevar modificaciones postraduccionales que posiblemente tengan un impacto sobre la funcionalidad del complejo HLA-péptido. Por consiguiente, un número de estudios han asociado las alteraciones en el patrón de fosforilación con la transformación maligna. Adicionalmente, se ha demostrado que la fosforilación podría tener un efecto neutro, negativo, o incluso positivo, sobre la unión del péptido al MHC de clase I, y que se podría generar CTL específico de fosfopéptido, que discriminaría entre las versiones fosforilada y no fosforilada del péptido, mostrando que tal CTL lo más probablemente es parte del repertorio de CTL restringido a MHC de clase I. Recientemente, se ha demostrado que los péptidos fosforilados realmente son procesados de una forma natural y presentados por las moléculas de MHC de clase I in vivo. Adicionalmente, se ha establecido la presencia de péptidos fosforilados en extractos de moléculas de clase I aisladas de varias células B transformadas por diferentes
EBV.

Por lo tanto, está bien establecido que los epítopos peptídicos derivados de antígenos asociados a tumor (TAAs) pueden ser reconocidos como antígenos por los linfocitos T citotóxicos (CTLs) en el contexto de las moléculas de MHC (1). Sin embargo, aunque en general se acepta que la mayoría de, si no todos, los tumores son antigénicos, solamente unos cuantos son en realidad inmunogénicos en el sentido de que la evolución del tumor se controla fácilmente mediante el sistema inmune.

Para superar esta limitación, se han iniciado varios ensayos inmunoterapéuticos, por ejemplo vacunaciones con péptidos derivados de TAA. Para melanoma, el tumor para el que se ha caracterizado el mayor número de TAAs definidos por CTL, se han inducido poderosas respuestas de CTL contra los antígenos mediante vacunación y algunos pacientes experimentaron una remisión completa de su enfermedad (2, 3). Sin embargo, la mayoría de los epítopos peptídicos utilizados en estos ensayos de vacunación son específicos del melanocito, y estos péptidos no se pueden aplicar para tumores de origen no melanocítico. Además, la expresión de estos TAAs es heterogénea entre tumores de diferentes pacientes, e incluso puede variar entre las metástasis obtenidas de un paciente. Sin embargo, durante el último par de años, se han identificado un número de antígenos peptídicos específicos de tumores, que se expresan en un número de cánceres diferentes, es decir, HER-2 (4), Muc-1 (5) y telomerasa (6).

También se ha demostrado que mediante la manipulación apropiada los antígenos tumorales presentes en los tumores se pueden exponer al sistema inmune. Estudios han demostrado que el brazo CTL CD8+ de la respuesta inmune, solo o en combinación con las células T_{h} CD4+, constituye el brazo efector anti-tumoral primario de la respuesta inmune adaptativa. Hasta ahora, el enfoque ha estado principalmente sobre el brazo CTL de la respuesta inmune. Sin embargo, cada vez está más claro que la respuesta de células T CD4 tiene un papel esencial en el rechazo del tumor, en especial en la fase de inducción o en la extensión de una respuesta de CTL in vivo. Por consiguiente, la incorporación de antígenos tumorales restringidos a la clase II en protocolos de vacunación de tumores eficaces, podría aumentar la eficacia de las vacunas.

La apoptosis es un programa genético de suicidio celular, y se ha sugerido que la inhibición de la apoptosis es un mecanismo importante involucrado en la formación de cáncer mediante la extensión del lapso de vida de las células, que favorece la acumulación de mutaciones transformantes (7). La survivina es un miembro recientemente identificado de la familia de inhibidores de las proteínas de apoptosis (IAPs). En un análisis de expresión genética global de aproximadamente 4 millones de transcritos, se identificó la survivina como uno de los genes principales invariablemente aumentados en muchos tipos de cáncer, pero no en tejido normal (8). Los tumores malignos sólidos que sobreexpresan survivina incluyen cáncer de pulmón, colon, mama, páncreas, y próstata, así como tumores malignos hematopoyéticos (9). Adicionalmente, se han descrito series de melanomas y cánceres de piel no melanoma como invariablemente positivos para la survivina (10, 11). La sobreexpresión de survivina en la mayoría de los cánceres humanos sugiere un papel general de inhibición de la apoptosis en la evolución del tumor, una noción sustanciada por la observación de que en el caso del cáncer colorrectal y de vejiga, así como en neuroblastoma, la expresión de la survivina estaba asociada con un pronóstico desfavorable. Por el contrario, la survivina es indetectable en tejidos adultos normales. Estas características califican a la survivina como un TAA adecuado tanto para fines de diagnóstico como
terapéuticos.

Por consiguiente, durante la última década se han identificado un gran número de TAAs que son reconocidos por CTLs de una forma restringida al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Debido a que la survivina se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres humanos y la inhibición de su función da como resultado un aumento de la apoptosis, esta proteína puede servir como una diana para las respuestas terapéuticas de CTL. La proteína survivina y el uso potencial de diagnóstico y terapéutico de la misma se dan a conocer en (8) y en US 6245523. La survivina es una proteína citoplásmica de 16.5 kDa que contiene un único BIR, y una región carboxi-terminal enrollada altamente cargada en lugar de un dedo RING, que inhibe la apoptosis inducida por la retirada de factor de crecimiento (IL-3) cuando se transfiere a precursores de células B. El gen que codifica la survivina es casi idéntico a la secuencia del Receptor de Proteasa de Células Efectoras-1 (EPR-1, Effector Cell Protease Receptor-1), pero está orientada en la dirección opuesta, sugiriendo de esta manera la existencia de dos genes separados duplicados en una configuración cabeza con cabeza. De conformidad con lo anterior, la survivina se puede describir como un producto anti-sentido de EPR-1. Funcionalmente, la inhibición de la expresión de survivina mediante el aumento de su transcrito anti-sentido natural EPR-1, da como resultado apoptosis masiva y crecimiento celular
reducido.

US 6245523 da a conocer el aislamiento de la survivina purificada y proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican la proteína survivina, y anticuerpos y otras moléculas que se unen a survivina. US 6245523 también da a conocer fragmentos activos anti-apoptóticamente de la proteína survivina y variantes de los mismos en donde se ha insertado un residuo de aminoácido N- ó C-terminal a, o dentro de, la secuencia de survivina dada a conocer. Se da a conocer específicamente que estos péptidos deben contener residuos funcionales claves para la apoptosis, es decir, Trp en la posición 67, Pro en la posición 73, y Cys en la posición 84.

Andersen et al. CANCER RESEARCH, Vol. 61, no. 3 (2001) 869-872 divulgan péptidos de survivina específicos de HLA-A2: Sur1-Sur10, Sur1L2 y Sur1M2. Andersen y col. también divulgan respuestas CTL específicas contra dichos péptidos, valores de afinidad para la unión de dichos péptidos a moléculas de HLA de clase I y sugiere el uso de los péptidos en vacunación, terapia contra el cáncer y diagnóstico de cáncer.

Andersen et al. CANCER RESEARCH, Vol. 61, no. 16 (2001) 5964-68 divulgan péptidos de survivina que se unen a HLA: Sur1 (LTLGEFLKL), Sur9 (ELTLGEFLKL) y Sur1M2 y la generación de respuestas CTL por dichos péptidos. El documento también divulga complejos MHC de clase I/péptidos que se multimerizaron, y su uso en la detección de células reactivas a survivina en tejido tumoral. Andersen y col. sugieren el uso de tales péptidos de survivina para vacunas anticáncer basadas en péptidos en combinación con terapia convencional contra el
cáncer.

Schmitz et al. CANCER RESEARCH, Vol. 60, no. 17 (2000) 4845-49 divulga el péptido de unión a HLA
ELTLGEFLKL. El artículo demuestra la generación de respuestas CTL por dicho péptido y sugiere el uso del péptido en vacunas anticáncer.

Hirohashi et al. CLINICAL CANCER RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN
ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, Vol. 8, no. 6 (2002) 1731-39 divulga un epítopo CTL restringido a HLA-A24 de survivina-2B (variante de ayuste encontrada en tumores). El artículo también divulga otros péptidos de survivina, por ejemplo, AFLSVKKQF y QFEELTLGEF.

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Fortugno et al. JOURNAL OF CELL SCIENCE, Vol. 115, no. 3 (2002) 575-85 divulga anticuerpos policlonales contra epítopos de survivina Ala3-Ile19, Met38-Thr48, Pro47-Phe58 y Cys57-Trp67.

Ninguno de los documentos de la técnica anterior divulga el epítopo restringido a MHC de clase I de la presente invención, que comprende la secuencia RISTFKNWPK. Además, la técnica anterior solo da a conocer la unión de epítopos CTL de survivina al alelo HLA-A2. Sin embargo, para desarrollar programas de vacunas eficaces basados en péptidos, es necesario también ser capaz de tener como objetivo diferentes moléculas HLA, incluyendo los alelos HLA-A3, HLA-B y HLA-C. Por último, es deseable una serie de péptidos de epítopos de survivina múltiples para su uso en tales vacunas, en donde cada péptido interaccione específicamente con una molécula de HLA
diferente.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que péptidos restringidos a MHC de clase I se pueden derivar de la proteína survivina, los cuales son capaces de unirse a las moléculas de HLA de MHC de clase I y de esta manera provocan las respuestas inmunes de CTL tanto ex vivo como in situ en los pacientes que padecen un amplio rango de enfermedades cancerosas. Estos descubrimientos sugieren fuertemente que la survivina actúa como una molécula TRAP, que es procesada por las células a péptidos que tienen funcionalidad TRA. Evidentemente, estos descubrimientos abren el camino para planteamientos terapéuticos y de diagnóstico nuevos que, debido al hecho de que la survivina parece estar expresada universalmente por las células tumorales, son en general aplicables en el control de enfermedades cancerosas.

Compendio de la invención

De conformidad con lo anterior, la invención concierne en un primer aspecto a un péptido de epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epítopo la secuencia RISTFKNWPK como se especifica mediante SEQ ID NO: 58, y al menos una de las siguientes características:

(i) es capaz de unirse a la molécula HLA de clase I a la que se restringe con una afinidad medida por la cantidad del péptido que es capaz de tener una recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM, como se determina mediante un ensayo de estabilización de HLA,

(ii) es capaz de inducir células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs como se determina mediante un ensayo ELISPOT, y/o

(iii) es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que son reactivos con el péptido del epítopo.

De preferencia, el péptido de la invención tiene al menos dos, más preferiblemente las tres características.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido como se ha definido anteriormente.

En aspectos adicionales la invención proporciona una composición farmacéutica y una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente de cáncer de células T que reaccionan con survivina entre PBLs o en el tejido tumoral, composición que comprende un péptido como se definió anteriormente.

Un aspecto importante de la invención se refiere al uso del péptido como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

Por último, la invención proporciona una vacuna multi-epítopo que comprende un epítopo restringido a MHC de clase I según la invención.

Descripción detallada de la invención

El nuevo péptido restringido a MHC de clase I de la invención se caracteriza por tener al menos una de varias características, una de las cuales es la capacidad para unirse a la molécula de HLA-A3 de clase I a la cual se restringe con una afinidad, que cuando se mide por la cantidad de péptido que es capaz de tener una recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) en un ensayo de estabilización de HLA, es como máximo de 50 \muM. Este ensayo de estabilización de HLA se lleva a cabo como se ha descrito previamente (12, 13), y se basa en la estabilización de la molécula de HLA después de cargar el péptido en la línea celular deficiente en transportador de péptidos T2. Posteriormente, se inmunoprecipitan las cadenas pesadas de HLA estables correctamente plegadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformación, y se cuantifica la unión del
péptido.

Este ensayo proporciona un medio simple para cribar péptidos candidatos por su capacidad para unirse a una molécula de un alelo de HLA dada con la afinidad anterior. En formas de realización preferidas, el péptido de la invención es uno que tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 30 \muM, tal como un valor C_{50} que es como máximo de 20 \muM.

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Como se mencionó anteriormente, el sistema de HLA representa el sistema mayor de histocompatibilidad (MHC) humano. En general, los sistemas de MHC controlan un número de características: antígenos de trasplante, respuestas inmunes dependientes del timo, ciertos factores del complemento, y predisposición para ciertas enfermedades. De una manera más específica, el MHC codifica tres tipos diferentes de moléculas, es decir, moléculas de clase I, II, y III, las cuales determinan las características más generales del MHC. De estas moléculas, las moléculas de clase I son denominadas moléculas HLA-A, HLA-B, y HLA-C que se presentan sobre la superficie de la mayoría de las células nucleadas y de los trombocitos.

Por lo tanto, un planteamiento simple para identificar los péptidos de la invención incluye los siguientes pasos: seleccionar una molécula HLA particular, por ejemplo una que se da con un alto índice en una población dada, llevar a cabo un análisis de alineamiento como se describe anteriormente para identificar los "motivos de residuos de anclaje" en la proteína survivina, aislar o construir péptidos de un tamaño adecuado que comprendan uno o más de los residuos de anclaje identificados, y probar los péptidos resultantes para determinar (i) su capacidad para unirse a la molécula de HLA particular utilizando el ensayo de estabilización de HLA descrito en la presente, (ii) la capacidad de los péptidos para inducir células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs determinado mediante un ensayo ELISPOT como se describe en la presente, y/o (iii) la capacidad de los péptidos para detectar in situ en un tejido tumoral los CTLs que reaccionan con los péptidos de epítopos que se están probando.

En formas de realización específicas, el péptido de la invención es un péptido restringido a HLA-A3 tal como Survivina_{18-24} (Sur18K10) (una F cambiada a una K en P10, RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 58).

De preferencia, el péptido de la invención comprende como máximo 20 residuos de aminoácidos, tal como un máximo de 10 residuos de aminoácidos. En formas de realización específicas, el péptido es un nonapéptido, un decapéptido, o un undecapéptido.

El péptido de la invención, como se mencionó anteriormente, deriva de una proteína survivina, o de un fragmento de la misma. La proteína survivina de la que puede derivar el péptido, es la proteína survivina de cualquier especie animal en la se expresa la proteína. En formas de realización preferidas, la proteína de partida survivina es de una especie de mamífero incluyendo especies de roedores, conejo, y una especie de primate, tal como seres humanos. Basándose en la secuencia de la proteína survivina seleccionada, el péptido de la invención se deriva mediante cualquier tratamiento químico o enzimático apropiado del material de partida de survivina que dé como resultado un péptido de un tamaño adecuado como se indica anteriormente, o se puede sintetizar mediante cualquier procedimiento convencional de síntesis de péptidos con los que esté familiarizado el experto en la materia.

Una característica significativa del péptido de la invención es su capacidad para inducir células T que responden a la producción de INF-\gamma, es decir, células T citotóxicas (CTLs) que reconocen de una manera específica el péptido particular en una población de PBL o células tumorales de un paciente de cáncer (células diana). Esta actividad se determina fácilmente sometiendo los PBLs o células tumorales de un paciente a un ensayo ELISPOT como se describe en la referencia (16) y en los siguientes ejemplos. Antes del ensayo, puede ser conveniente estimular la población de PBL o las células tumorales que se vayan a ensayar poniendo en contacto las células con el péptido que se vaya a probar. De preferencia, el péptido es capaz de inducir o reconocer células T productoras de INF-\gamma a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs como se determina mediante un ensayo ELISPOT como se utiliza en la
presente.

El ensayo ELISPOT representa una herramienta consistente para seguir las respuestas de células T específicas del péptido de survivina. Sin embargo, aunque se ha demostrado que la reactividad de ELISPOT en la mayoría de los casos se correlaciona con la capacidad de los CLLs para lisar células diana, la evidencia conclusiva para esta noción solamente se puede dar de una manera directa. Tal evidencia directa se proporciona en la presente, ya que se demostró (ver el ejemplo 2) que las células que reaccionan con survivina aisladas por medio de complejos HLA/péptido poseen la capacidad funcional para lisar células diana. De una manera adicional, se demostró que los CTLs aislados que reconocen específicamente un péptido de la invención, eran capaces de lisar las células tumorales emparejadas con HLA de diferente origen, por ejemplo melanomas y cáncer de mama. Este descubrimiento sugiere fuertemente que las células de cáncer en general procesan y presentan el mismo péptido de survivina endógeno. Por consiguiente, una implicación principal de los descubrimientos de la presente es que los péptidos de la invención se expresan y forman complejos con las moléculas de HLA en una variedad de células de cáncer de diferentes orígenes histológicos. Esto hace que estas células de cáncer sean susceptibles a la destrucción por parte de los CTLs y enfatiza la utilidad potencial de la inmunización con survivina para controlar el crecimiento de diferentes neoplasias. La presencia de respuestas espontáneas de CTL en PBLs y células tumorales a epítopos de péptidos derivados de survivina restringidos a HLA de los pacientes que padecen tres tipos de cáncer no relacionados, es decir, cáncer de mama, melanoma, y CLL, sustancia además el potencial inmunoterapéutico universal de este antígeno
tumoral.

De conformidad con lo anterior, en otra forma de realización preferida el péptido de la invención es capaz de inducir células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa la survivina incluyendo un tumor maligno hematopoyético, incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, y cáncer de próstata. De una manera específica, el péptido de la invención es capaz de provocar una respuesta inmune en forma de células T que tienen un efecto citotóxico contra las células que expresan survivina de una línea celular de cáncer, incluyendo una línea celular seleccionada de la línea celular de cáncer de mama MCF-7 y la línea celular de melanoma FM3.

Además de su capacidad para provocar respuestas inmunes en las poblaciones de PBL y en líneas celulares de cáncer, se demostró que los péptidos de la invención también son capaces de provocar respuestas inmunes citolíticas in situ, es decir, en tejidos tumorales sólidos. Esto se demostró al suministrar complejos HLA-péptido, por ejemplo, que se multimerizan y que están provistos de una marca detectable, y utilizando estos complejos para tinciones de inmunohistoquímica para detectar en un tejido tumoral CTLs que son reactivos con el péptido de epítopo de la invención. De conformidad con lo anterior, una característica significativa adicional del péptido de la invención es que es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que sean reactivos con el péptido del
epítopo.

Se contempla que los péptidos de la invención, además de su capacidad para unirse a moléculas de HLA que dan como resultado la presentación de complejos de HLA y péptidos en las superficies celulares, complejos que a su vez actúan como epítopos o dianas para las células T citolíticas, pueden provocar otros tipos de respuestas inmunes, tales como respuestas de células B que den como resultado la producción de anticuerpos contra los complejos y/o una reacción de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH). El último tipo de respuesta inmune se define como un enrojecimiento y endurecimiento palpable en el sitio de la inyección del péptido de la invención.

Es bien sabido que las diferentes moléculas de HLA, son de una prevalencia diferente en las poblaciones humanas principales. De conformidad con lo anterior, existe un requerimiento para identificar los epítopos de péptidos restringidos a varias moléculas de HLA de clase I para extender la cohorte de pacientes que se puedan tratar de acuerdo con los métodos de la presente invención. La caracterización de múltiples epítopos de survivina con diferentes elementos de restricción de HLA amplía el potencial clínico de este antígeno diana en dos maneras importantes: (i) aumenta el número de pacientes elegibles para inmunoterapia basada en los péptidos derivados de survivina. El antígeno HLA-A2 se expresa en alrededor del 50% de las poblaciones caucásicas y asiáticas, los antígenos HLA-A1 y HLA-A3 se expresan ambos en alrededor del 25% de caucásicos y el 5% de asiáticos, mientras que el antígeno HLA-A11 se expresa en alrededor del 15% de caucásicos y el 30% de asiáticos. Aún cuando estos números no se puedan sumar debido a la coexpresión, una combinación de péptidos restringidos por una multiplicidad de éstos ciertamente abarcaría a la mayoría de los pacientes de cáncer, (ii) el direccionamiento colectivo de varios elementos de restricción en cada paciente probablemente reduzca el riesgo del escape inmune por la pérdida del alelo de HLA. La pérdida de un solo alelo de HLA es un componente significativo de las alteraciones del MHC descritas para las células de cáncer, mientras que la pérdida total de la expresión de la clase I es un evento más bien infrecuente. Por consiguiente, con la identificación de los epítopos de survivina restringidos a diferentes alelos de HLA, ahora es posible atacar más de una molécula de HLA simultáneamente en pacientes con solapamiento
alélico.

De conformidad con lo anterior, basado en la divulgación de la presente invención, el experto en la materia sería capaz de desarrollar vacunas de multiepítopos muy inmunogénicas. De preferencia, tales vacunas se deben diseñar para facilitar una administración simultánea de los péptidos derivados de survivina más adecuados opcionalmente en combinación con otros péptidos y/o adyuvantes adecuados como se describen posteriormente en la presente.

Otro aspecto de la invención proporciona así una vacuna multiepítopo que comprende un péptido de un epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epítopo la secuencia RISTFKNWPK como se especifica en SEQ ID NO: 58 y al menos una de las siguientes características:

(i): capaz de unirse a la molécula HLA-A3 de clase I a la que está restringido con una afinidad medida mediante la cantidad de péptido que es capaz de de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA

(ii): capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PLB de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs determinado mediante ensayo de ELISPOT, y/o

(iii): capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que son reactivos con el péptido del epítopo.

En formas de realización preferidas la vacuna multiepítopo incluye una combinación de epítopos de péptidos derivados de survivina dependiendo del tipo de tejido del paciente determinado. La selección de péptidos que potencialmente tienen la capacidad de unirse a una molécula de HLA particular se puede hacer mediante alineamiento de secuencias que se sabe que se unen a una molécula de HLA particular dada para revelar en las mismas la predominancia de unos pocos aminoácidos relacionados en posiciones particulares en los péptidos. A tales residuos predominantes de aminoácidos también se hace referencia aquí como "residuos de anclaje" o "motivos de residuos de anclaje". Siguiendo tal procedimiento relativamente simple basado en datos de secuencias conocidas que se pueden encontrar en bases de datos accesibles, se pueden derivar péptidos de la molécula de la proteína survivina que probablemente se unan a la molécula de HLA particular. Se dan ejemplos representativos de tales análisis para un intervalo de moléculas de HLA en la tabla siguiente:

1

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

Por consiguiente, como ejemplo, los nonapéptidos que potencialmente tienen la capacidad para unirse a HLA-1 tendrían una de las siguientes secuencias: Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y, Xaa-T-E-Xaa-XaaXaa-L-Xaa-Y; Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y o Xaa-S-E-XaaXaa-Xaa-L-Xaa-Y (indicando Xaa cualquier residuo de aminoácido). De una manera similar, se pueden diseñar secuencias que tengan potencialmente la capacidad para unirse a cualquier otra molécula de HLA.

Además, como se ha descrito anteriormente, ha habido un enfoque incrementado sobre la provocación de la inmunidad de células T auxiliares específicas de tumor, es decir, vacunar con epítopos restringidos a MHC de clase II a pesar del hecho de que los tumores en general no expresan MHC de clase II. Esto se basa en el reciente descubrimiento de que la inducción y la eficacia de la respuesta anti-tumoral inducida por vacuna en muchos casos requieren la cooperación de células T_{h} CD4 positivas específicas de tumor. Por lo tanto, un factor importante que impulsa el desarrollo de vacunas que tengan una composición más compleja es el deseo de atacar múltiples antígenos tumorales, por ejemplo mediante el diseño de vacunas que comprendan o codifiquen una colección de epítopos de células CTL y T_{h} cuidadosamente seleccionados.

Obviamente, las vacunas multiepítopo constituyen una manera eficiente de provocar la inmunidad contra los epítopos derivados de varios antígenos diferentes sin la necesidad de introducir (genes que codifiquen) proteínas potencialmente peligrosas, tales como oncoproteínas. Tales vacunas también permiten la inducción selectiva de inmunidad contra los epítopos de células T subdominantes y crípticos, que pueden ser especialmente importantes en el caso de los autoantígenos asociados con tumor, para los que puede existir tolerancia para los epítopos que se presentan prominentemente en tejidos normales. Además, las células presentadoras de antígeno pueden fracasar al presentar ciertos epítopos que se expresan en células tumorales debido a diferencias funcionales entre los inmunoproteasomas de las células presentadoras de antígeno y los proteasomas "constitutivos" presentes en la mayoría de las células tumorales. En el caso de vacunas basadas en péptidos, tales epítopos se pueden administrar en una forma "lista para MHC", que hace posible la presentación a través de una carga exógena independientemente de la captación y el procesamiento del antígeno por parte de las células huéspedes presentadoras de antígeno.

Es evidente que los descubrimientos de la presente invención proporcionan la base para las aplicaciones terapéuticas así como de diagnóstico de los péptidos derivados de survivina.

De esta manera, un aspecto importante de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de un epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epítopo la secuencia RISTFKNWPK como se especifica en SEQ ID NO: 58 y al menos una de las siguientes característi-
cas:

(i): capaz de unirse a la molécula HLA-A3 de clase I a la que está restringida con una afinidad medida mediante la cantidad de péptido que es capaz de de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA,

(ii): capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs determinado mediante ensayo de ELISPOT, y/o

En un aspecto adicional la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de los péptidos de la invención solos o en una combinación adecuada con otras proteínas o fragmentos de péptidos. En particular la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende además del epítopo que tiene la secuencia RISTFKNWPK, una combinación de dos o más péptidos de epítopos restringidos a MHC de clase I derivados de survivina, interaccionando cada uno específicamente con una molécula de HLA diferente y que tienen al menos una de las siguientes características:

(i): capaz de unirse a la molécula HLA de clase I a la que está restringido con una afinidad medida mediante la cantidad de péptido que es capaz de de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA,

En formas de realización particulares la composición farmacéutica es una, en donde cada péptido de epítopo interacciona específicamente con una molécula HLA-A de MHC de clase I, una molécula HLA-B de MHC de clase I o una molécula HLA-C de MHC de clase I.

En formas de realización adicionales dicha molécula HLA-A de MHC de clase I es una molécula HLA-Al, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(w19), HLA-A30(w19), HLA-A31(w19), HLA-A32(w19), HLA-Aw33(w19), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68(28), o HLA-A69(28).

En aún formas de realización adicionales, dicha molécula HLA-B de MHC de clase I incluye cualquiera de las siguientes: HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 y HLA-Bw47.

En otras formas de realización dicha molécula HLA-C de MHC de clase I incluye cualquiera de las siguientes: HLA-Cw1, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 y HLA-Cw16.

Según algunas formas de realización la composición farmacéutica comprende un péptido de epítopo, que es una secuencia nativa de survivina de una especie de mamífero.

En formas de realización adicionales la composición farmacéutica comprende un péptido de epítopo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 66. En otras formas de realización la composición farmacéutica comprende un péptido de epítopo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 57.

En formas de realización preferidas los dichos péptidos de epítopos son capaces de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 10 por 10^{4} PBLs. En formas de realización más preferidas los dichos péptidos de epítopo son capaces de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

Además, puede ser conveniente llevar a cabo modificaciones postraduccionales de los péptidos de la invención. Se ha demostrado que la exposición de células de carcinoma de mama MCF-7 o de carcinoma cervical HeLa a agentes contra el cáncer, incluyendo Adriamicina, Taxol, o UVB daba como resultado una expresión de survivina aumentada 4-5 veces. Los cambios en los niveles de survivina después del tratamiento anticáncer no involucraban modulación de la expresión del ARNm de survivina y eran independientes de la transcripción genética de novo. Por el contrario, la inhibición de la fosforilación de survivina en Thr^{34} por el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina flavopiridol dio como resultado una pérdida de la expresión de survivina, y la survivina no fosforilable Thr^{34}\rightarrowAla exhibió una eliminación acelerada comparada con la survivina salvaje. La ablación secuencial de la fosforilación de survivina en Thr^{34} potenció la apoptosis de células tumorales inducida por agentes anticáncer independientemente de p53 y suprimió el crecimiento tumoral sin toxicidad en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama in vivo. Estos datos sugieren que la fosforilación en Thr^{34} regula de una manera crítica los niveles de survivina en células tumorales y que la ablación secuencial de la actividad quinasa de p34^{cdc2} puede eliminar el punto de control de la viabilidad de la survivina y potenciar la apoptosis en las células tumorales. De conformidad con lo anterior, se contempla que los péptidos derivados de survivina de la invención abarcan péptidos fosforilados. Los antígenos de fosfopéptido de survivina nativos se pueden identificar mediante la exploración para determinar la presencia de motivos de unión de péptido a MHC alrededor del sitio de fosforilación Thr34. Por lo tanto, las posibles secuencias de fosfopéptido derivadas de survivina incluyen TPERMAEAGF, un antígeno de péptido supuesto restringido a HLA-B35 y/o HLA-B7 y/o HLA-B51. Los fosfopéptidos nativos adicionales abarcados en la presente incluyen: HLA-A2: CACTPERMA y CTPERMAEA; HLA-A3: FLEGCACTP; HLA-B7/HLA-B35/HLAB51: WPFLEGCACT (residuo de Thr fosforilado está marcado en negrita).

Formas adicionales de realización de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden además una proteína o fragmento peptídico inmunogénico seleccionado de una proteína o fragmento peptídico que no pertenece a o deriva de de la familia de proteínas de survivina.

En formas de realización específicas tales otras proteínas o fragmentos de péptidos incluyen pero no se limitan a, proteínas involucradas en la regulación de la apoptosis celular o fragmentos peptídicos de las mismas. Los ejemplos adecuados de tales proteínas se pueden seleccionar de la familia de proteínas Bcl-2, por ejemplo la proteína Bcl-2, la proteína Bcl-w, la proteína Mcl-1, la proteína Bcl-X_{L}, y fragmentos peptídicos derivados de cualquiera de las proteínas. Otros inhibidores de apoptosis conocidos incluyen los miembros de la familia de proteínas inhibidoras de apoptosis (IAP), tales como X-IAP, C-IAP1, y C-IAP2 estas proteínas se expresan todas de una manera relativamente ubicua mientras que el polipéptido inhibidor de apoptosis ML-IAP tiene una expresión más bien selectiva, y se detecta predominantemente en melanomas. Por consiguiente, los fragmentos de ML-IAP capaces de provocar una respuesta de células T específica, es decir, una respuesta de células T citotóxicas o una respuesta de células T auxiliares, opcionalmente se pueden incluir en la composición de la presente invención. Los fragmentos peptídicos útiles de ML-IAP incluyen ML-IAP_{245} (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO: 75), ML-IAP_{280} (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO: 76), ML-IAP_{90} (RLASFYDWPL) (SEQ ID NO: 77), ML-IAP_{154} (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO: 78), ML-IAP_{230} (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO: 79), ML-IAP_{98} (PLTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 80), ML-IAP_{34} (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO: 81), ML-IAP_{54} (QILGQLRPL) (SEQ ID NO: 82), ML-IAP_{99} (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 83), ML-IAP_{83} (GMGSEELRL) (SEQ ID NO: 84), y ML-IAP_{200} (ELPTPRREV) (SEQ ID NO: 85).

Adicionalmente, la composición de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar como una vacuna multiepítopo que comprende epítopo restringido a clase I, y/o epítopos restringidos a clase II, como se definen anteriormente en la presente.

Los ejemplos de vacunas multiepítopos preferidas actualmente incluyen combinaciones "hechas a la medida" de epítopos de péptidos derivados de survivina que dependen del tipo de tejido del paciente determinado, por ejemplo, un sujeto portador de fenotipos HLA-A2, HLA-A3, y HLA-B35 se podría vacunar con una vacuna que comprenda sur1M2, sur9, sur18K10, sur46Y9, sur51Y9. Adicionalmente, la composición farmacéutica de la invención puede comprender de una manera conveniente al menos una proteína inmunogénica adicional o un fragmento peptídico de la misma seleccionada de una proteína o fragmento peptídico que no pertenezca a, ni derive de, la proteína survivina. En formas de realización específicas, la proteína inmunogénica o el fragmento peptídico de la misma deriva de la familia de proteínas Bcl-2 como se ha descrito anteriormente en la presente. Un péptido inmunogénico adicional derivado de Bcl-2 es un péptido restringido a HLA-A2, que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: Bcl_{172}, Bcl_{180}, Bcl_{208,} y Bcl_{214}.

Debido a que los péptidos de la invención son moléculas relativamente pequeñas se puede requerir en estas composiciones que se combinen los péptidos con diferentes materiales tales como adyuvantes, para producir vacunas, composiciones inmunogénicas, etc. Los adyuvantes, ampliamente definidos, son sustancias que promueven las respuestas inmunes. Con frecuencia, el adyuvante de elección es un adyuvante completo o incompleto de Freund, u organismos muertos de B. pertussis, utilizados por ejemplo en combinación con un antígeno precipitado en alumbre. Se proporciona una discusión general de los adyuvantes en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2ª Edición, 1986) en las páginas 61-63. Sin embargo, Goding observa que, cuando el antígeno de interés es de bajo peso molecular, o es pobremente inmunogénico, se recomienda el acoplamiento con un soporte inmunogénico. Los ejemplos de tales moléculas soporte incluyen hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina bovina, ovoalbúmina, e inmunoglobulina de aves. También se ha sugerido que diferentes extractos de saponina son útiles como adyuvantes en las composiciones inmunogénicas. Recientemente, se ha propuesto utilizar el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), una citoquina bien conocida, como un adyuvante (WO
97/28816).

De conformidad con lo anterior, la invención abarca una composición terapéutica que además comprende cualquier sustancia adyuvante incluyendo cualquiera de las anteriores o combinaciones de las mismas. También se contempla que el antígeno, es decir, el péptido de la invención y el adyuvante se puedan administrar por separado en cualquier secuencia apropiada.

La elección del antígeno en la composición farmacéutica de la invención, dependerá de parámetros que pueden ser determinados por el experto en la materia. Como se ha mencionado, cada uno de los diferentes péptidos de la invención se presenta en las superficies celulares por una molécula de HLA particular. Como tal, si un sujeto que se vaya a tratar se tipifica con respecto al fenotipo de HLA, se selecciona(n) un péptido/péptidos que se sepa que se une(n)
a esa molécula de HLA particular.

De una manera alternativa, el antígeno de interés se selecciona basándose en la prevalencia de los diferentes fenotipos de HLA en una población dada. Como ejemplo, HLA-A2 es el fenotipo más prevalente en la población caucásica, y por consiguiente, una composición que contenga un péptido derivado de survivina que se une a HLA-A2 será activo en una gran proporción de esa población. Sin embargo, la composición de la invención también puede contener una combinación de dos o más péptidos derivados de survivina, interaccionando cada uno de una manera específica con una molécula HLA diferente de modo que se cubra una mayor proporción de la población diana. Por lo tanto, como ejemplos, la composición farmacéutica puede contener una combinación de un péptido restringido a una molécula HLA-A y un péptido restringido a una molécula HLA-B, por ejemplo incluyendo las moléculas HLA-A y HLA-B que corresponden a la prevalencia de los fenotipos de HLA en la población diana, tales como, por ejemplo, HLA-A2 y HLA-B35. Adicionalmente, la composición puede comprender un péptido restringido a una molécula HLA-C.

Se contempla que las composiciones inmunogénicas útiles de las invenciones además de un péptido derivado de survivina como se define en la presente pueden comprender una cantidad inmunológicamente eficaz de la proteína survivina tal como se define en la presente o un fragmento inmunogénico de la misma.

La cantidad del péptido inmunogénico de la invención en la composición farmacéutica puede variar, dependiendo de la aplicación particular. Sin embargo, una dosis individual del inmunógeno está preferiblemente en cualquier parte desde aproximadamente 10 \mug hasta aproximadamente 5000 \mug, más preferiblemente desde aproximadamente 50 \mug hasta aproximadamente 2500 \mug tal como de aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 1000 \mug. Los modos de administración incluyen la administración intradérmica, subcutánea, e intravenosa, implantación en forma de una formulación de liberación con el tiempo, etc. En la presente se abarcan cualquiera y todas las formas de administración conocidas en la técnica. También se abarcan cualquiera y todas las formas de dosificación convencionales que se conozcan en la técnica como apropiadas para formular composiciones peptídicas inmunogénicas inyectables, tales como formas liofilizadas y soluciones, suspensiones, o formas de emulsión que contengan, si se requiere, vehículos, diluyentes, conservantes, adyuvantes, componentes reguladores del pH, etc., convencionales farmacéuticamente aceptables.

El efecto inmunoprotector de la composición de la invención se puede determinar empleando varios planteamientos. En los siguientes ejemplos se proporcionan ejemplos de los mismos. Un ejemplo adicional sobre cómo determinar una respuesta de CTL provocada por la composición inmunogénica se proporciona en WO 97/28816, supra. También se puede determinar una respuesta inmune de éxito por la presencia de reacciones de DTH después de la inmunización, y/o la detección de anticuerpos que reconozcan específicamente el/los péptido(s) de la composición de
vacuna.

En formas de realización preferidas, la composición farmacéutica de la invención es una composición inmunogénica o vacuna capaz de provocar una respuesta inmune a una enfermedad cancerosa. Como se utiliza en la presente, la expresión "composición inmunogénica o vacuna" se refiere a una composición que provoca al menos un tipo de respuesta inmune dirigida contra las células de cáncer. Por consiguiente, tal respuesta inmune puede ser cualquiera de los tipos mencionados anteriormente: una respuesta de CTL donde se generan CTLs que son capaces de reconocer al complejo HLA/péptido presentado en las superficies celulares que produce la lisis celular, es decir, la vacuna provoca la producción en el sujeto vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células de cáncer; una respuesta de células B que da lugar a la producción de anticuerpos contra el cáncer; y/o una respuesta inmune de tipo DHT.

En formas de realización útiles se provoca una respuesta inmunogénica dirigida contra una enfermedad cancerosa mediante la administración del péptido de la invención ya sea mediante la carga de moléculas de MHC de clase I en células presentadoras de antígeno (APCs, antigen presenting cells) del paciente, mediante el aislamiento de PBLs del paciente e incubación de las células con el péptido antes de inyectar las células de nuevo al paciente, o mediante el aislamiento de APCs precursoras del paciente y la diferenciación de las células a APCs profesionales utilizando citoquinas y antígeno antes de inyectar las células de nuevo al paciente. Por lo tanto, en una forma de realización de la presente invención, un método para tratar a los pacientes de cáncer es uno en donde el péptido se administra mediante la presentación del péptido a las células presentadoras de antígeno del paciente (APCs) ex vivo seguido por inyección de las APCs así tratadas de nuevo al paciente. Existen al menos dos maneras alternativas de llevar esto a cabo. Una alternativa es aislar las APCs del paciente de cáncer e incubar (cargar) las moléculas de MHC de clase I con el péptido. La carga de las moléculas de MHC de clase I significa incubar las APCs con el péptido de tal manera que las APCs con las moléculas de MHC de clase I específicas para el péptido se unirán al péptido y por consiguiente serán capaces de presentarlo ante las células T. Posteriormente, las APCs se vuelven a inyectar en el paciente. Otra manera alternativa se apoya en los descubrimientos recientes hechos en el campo de la biología celular dendrítica. En este caso, se aíslan monocitos (que son precursores de células dendríticas) del paciente y se diferencian in vitro a APCs profesionales (o células dendríticas) mediante el uso de citoquinas y antígeno. Esto se describe en los ejemplos 3 y 5, donde se cultivan PBLs adherentes (que son principalmente monocitos) in vitro, junto con GM-CSF, IL-4, y TNF-\alpha. Posteriormente, se pulsan las CDs generadas in vitro con el péptido y se inyectan en el
paciente.

Debido al hecho de que la survivina parece que se expresa en la mayoría de las formas de cáncer, es muy probable que se puedan proporcionar las vacunas de la invención para controlar cualquier tipo de enfermedad cancerosa en donde se expresa la survivina. Por consiguiente, como ejemplos, la composición de vacuna de la invención es inmunológicamente activa contra un tumor maligno hematopoyético, incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, y cáncer de próstata.

De la descripción anterior, el experto se dará cuenta fácilmente de que los péptidos de la invención son útiles como herramientas de diagnóstico de cáncer, en particular porque los péptidos se derivan a partir de survivina expresada en todos los tipos de cáncer. Por consiguiente, los péptidos de la invención proporcionan la base para desarrollar procedimientos de diagnóstico y pronóstico universalmente aplicables con respecto a las enfermedades cancerosas. Por lo tanto, en otras formas de realización útiles la composición de la invención es una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente de cáncer, por ejemplo basado en la detección de las células T que reaccionan con survivina entre los PBLs o en el tejido tumoral.

En un aspecto, la invención proporciona un complejo de un péptido de la invención y una molécula de HLA de clase I o un fragmento de tal molécula, que es útil como un reactivo de diagnóstico, tal como se ha descrito anteriormente. El complejo se hace por cualquier medio convencional incluyendo los descritos en los siguientes ejemplos. Tal complejo puede ser monomérico o multimérico.

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La presente invención proporciona el medio para aliviar o curar una enfermedad cancerosa. De conformidad con lo anterior, es un aspecto adicional de la invención utilizar los péptidos como se han definido anteriormente en la presente para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Un aspecto todavía adicional de la presente invención se refiere al uso de una molécula o de una composición como se define anteriormente en la presente para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. De preferencia, una enfermedad cancerosa asociada con la expresión de survivina, incluyendo como ejemplos: un tumor maligno hematopoyético, incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, y cáncer de próstata. El uso comprende administrar a un paciente que padece la enfermedad, una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, una molécula que es capaz de unirse de forma específica a un péptido de la invención y/o una molécula que es capaz de bloquear la unión de tal molécula.

En algunos casos, será apropiado combinar el uso de la invención con un tratamiento contra el cáncer convencional tal como radioterapia o quimioterapia.

Ahora se describirá la invención con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y en las figuras, en las cuales:

La Figura 1 ilustra la respuesta de células T medida en un ELISPOT en el paciente CLL1 a ningún péptido, al péptido Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10), y al péptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3). Los PBLs se estimularon una vez con el péptido antes de sembrarse a 6x10^{5} células por pocillo por duplicado. Se calculó el número medio de manchas por péptido utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador,

La Figura 2 ilustra la respuesta de células T medida en un ELISPOT en el paciente CLL1 a ningún péptido, al análogo de péptido Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO: 4), y al análogo de péptido Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5). Los PBLs se estimularon una vez con el péptido antes de sembrarse a 10^{4} células por pocillo por duplicado. Se calculó el número medio de manchas por péptido utilizando un dispositivo de barrido CCD, y un sistema de
ordenador,

La Figura 3 muestra las respuestas medidas en un ELISPOT en los pacientes CLL2 y CLL3 a ningún péptido (barra negra), al péptido Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) (barra gris), al péptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) (barra blanca), al análogo de péptido Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO: 4) (barra gris clara), y al análogo de péptido Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) (barra gris oscura). Cada experimento se llevó a cabo con 10^{5} células por pocillo por duplicado, y se calculó el número medio de manchas,

La Figura 4 representa células T que se aislaron de los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor de los pacientes Mel1, Mel2, y Mel3, estimulados una vez in vitro y analizados en un ensayo ELISPOT para determinar la respuesta a ningún péptido (barra negra), los péptidos Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) (barra gris) y Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) (barra blanca). Cada experimento se llevó a cabo por duplicado con 10^{5} células por pocillo. En cada experimento, también se incluyeron dos pocillos sin adición de péptido. Se calculó el número medio de manchas por péptido para cada paciente,

La Figura 5 muestra la actividad funcional de CTLs específicos de survivina. Los CTLs se aislaron de un ganglio linfático infiltrado por melanoma usando bolas magnéticas recubiertas con survivina. (A) Lisis específica de líneas celulares de melanoma; la FM3 positiva para HLA-A2 (triángulo), y la FM45 negativa para HLA-A2 (cuadrado). (B) Lisis específica de líneas celulares de cáncer de mama; la MCF-7 positiva para HLA-A2 (triángulo), y la BT-20 negativa para HLA-A2 (cuadrado),

La Figura 6 muestra la frecuencia de CTLs que reaccionan con survivina en PBL de pacientes de cáncer de mama. La reactividad se examinó en tres pacientes de cáncer de mama (superior, media, e inferior, respectivamente) mediante ELISPOT. Para cada paciente los ensayos se llevaron a cabo en ausencia de péptido, en presencia de péptido sur1, en presencia de péptido sur9, y en presencia del péptido modificado sur1M2. Se utilizaron 1x10^{4} células efectoras por pocillo. La gráfica ilustra la cuantificación de células reactivas; las columnas grises representan el número promedio de células productoras de IFN-\gamma,

La Figura 7 ilustra la unión a HLA-B35 de los péptidos derivados de survivina y el análisis de la recuperación mediada por péptido de las moléculas de HLA-B35 por los péptidos derivados de survivina. Se incubaron lisados de células T2-B35 metabólicamente marcadas a 4ºC en presencia de 50, 5, 0,5, 0,05, y 0,005 mM de péptido. La recuperación de HLA-B35 se analizó en un ensayo de ensamblaje y se cuantificó posteriormente a electroforesis IEF en gel, usando el software de Phosphorimager ImageGauge (FUJI photo film Co., LTD., Japón). El valor C_{50} es la concentración del péptido requerida para la unión semi-máxima a HLA-B35,

La Figura 8 muestra respuestas espontáneas de células T observadas en PBLs de pacientes de cáncer. A) El número de células formadoras de mancha de IFN\gamma medidas en el ensayo ELISPOT sin péptido (barras blancas), con sur51-59 (barras negras) o sur46-54 (barras grises), entre PBLs estimulados in vitro de los pacientes CLL5 (10^{5} células/pocillo), HEM12 (10^{5} células/pocillo), y HEM8 (5x10^{4} células/pocillo). B) El número de células formadoras de mancha entre 1.7x10^{5} PBLs de HEM12, cultivadas durante 10 días con células dendríticas autólogas maduradas por pulsos con péptidos. Las columnas representan la media de dos medidas,

La Figura 9 demuestra las respuestas espontáneas de células T contra los péptidos de survivina nativos y modificados en pacientes de melanoma. A) El número de células formadoras de manchas medidas en el ensayo ELISPOT contra sur51-59 y sur51Y9 del paciente FM25 en PBLs (4x10^{3} células/pocillo) y TILs (7x10^{4} células/pocillo), así como TILs de FM45 (10^{5} células/pocillo). B) El número de células formadoras de manchas medidas en el ensayo ELISPOT contra sur46 y sur46Y9 medidas en TILs de FM74 (5x10^{3} células/pocillo). Las columnas representan la media de dos medidas con la liberación de IFN\gamma no específico sustraída,

La Figura 10 ilustra la afinidad de unión de los péptidos derivados de survivina a HLA-A1. Se cuantificaron las bandas de cadena pesada de MHC de clase I en un Phosphorimager. La cantidad de cadena pesada de HLA-A1 estabilizada está directamente relacionada con la afinidad de unión del péptido añadido. La recuperación de HLA-Al mediada por péptido (unidades arbitrarias) se indujo por 40, 4, 0,4, 0,04 \muM de Sur93-10l (línea), Sur93T2 (cuadrado), Sur49-58 (círculo), o virus de la gripe A, PB1 591-599 (triángulo),

La Figura 11 muestra las respuestas espontáneas contra los péptidos restringidos a HLA-A1. Respuestas espontáneas de células T contra péptidos derivados de survivina medidas mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFN\gamma específicas del péptido formadas en respuesta a Sur92-101, Sur38Y9, Sur47Y10, y Sur93T2 entre 5x10^{4} PBLs o TILs de pacientes de melanoma estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron entre los análisis de seis muestras de PBL y tres muestras de TIL de pacientes de melanoma (Mel). Se sustraen las manchas de IFN\gamma no específicas. Barras: rango de duplicados,

La Figura 12 muestra las respuestas espontáneas contra los péptidos restringidos a HLA-A11. Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados de survivina medidas mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFN\gamma específicas de péptidos formadas en respuesta a Sur53-62 entre 5x10^{4} PBLs o TILs de pacientes de cáncer estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron entre los análisis de cinco pacientes de melanoma (Mel) (5 PBL, 1 TIL), y dos pacientes de CLL (CLL) (PBL). Se sustraen las manchas no específicas de IFN\gamma. Barras: rango de duplicados,

La Figura 13 ilustra las respuestas espontáneas contra los péptidos restringidos a HLA-A3. Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFN\gamma específicas de péptidos formadas en respuesta a Surl8Kl0 entre 5x10^{4} PBLs o TILs de pacientes de melanoma estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron entre los análisis de 23 muestras de PBL y cuatro muestras de TIL de pacientes de melanoma (Mel). Se sustraen las manchas no específicas de IFN\gamma. Barras: rango de duplicados,

La Figura 14 ilustra las respuestas espontáneas contra los péptidos restringidos a HLA-A2. Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFN\gamma específicas de péptidos formados en respuesta al péptido 11-mero, Surl8-28, entre 5x10^{4} PBLs de pacientes de cáncer estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron entre los análisis de 10 muestras de PBL de 2 pacientes de melanoma (Mel), 6 de CLL (CLL), y 2 de carcinoma de mama (MC). Se sustraen las manchas no específicas de IFN\gamma. Barras: rango de duplicados,

La Figura 15 ilustra las respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFN\gamma específicas de péptidos formadas en respuesta a sur6-14 (LPPAWQPFL) entre 10^{5} PBLs de 5 pacientes de melanoma (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), dos pacientes de CLL (CLL1, CLL54), y 2 pacientes de cáncer de mama (mama11, mama15) estimulados in vitro. Se sustraen las manchas no específicas de IFN\gamma,

La Figura 16 ilustra los valores de laboratorio de la detección estable de LDH, colinesterasa, creatinina, hemoglobina, leucocitos, y trombocitos tras la terapia de vacunación de cuatro pacientes (\blacktriangleRW, \bulletKN, -WWE, \blacksquareGB), y

La Figura 17 demuestra el análisis cinético de la inmunidad a los péptidos de survivina evaluado mediante ELISPOT de IFN\gamma. Se obtuvieron PBMCs antes de la primera vacunación con CD y tres meses después de la misma. Se muestran los números de células formadoras de manchas de IFN\gamma por encima del fondo.

En la siguiente tabla, se enumeran las secuencias de aminoácidos para los péptidos utilizados en la presente y sus respectivas SEQ ID NOs:

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Ejemplo 1

Identificación de una respuesta de linfocitos T citotóxicos a la proteína inhibidora de apoptosis survivina en pacientes de cáncer Resumen

Utilizando epítopos de CTL derivados de survivina, se ha estudiado la reactividad de células T específicas contra estos antígenos en sangre periférica de pacientes de leucemia linfática crónica (CLL, chronic lymphatic leukemia) y en los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor de pacientes de melanoma, mediante análisis ELISPOT. Las respuestas de CTL a los epítopos de péptidos derivados de survivina se detectaron en tres de seis pacientes de melanoma, y en tres de cuatro pacientes de CLL. No se detectó reactividad de células T en PBL de 6 controles sanos. Por consiguiente, los péptidos derivados de survivina pueden servir como dianas importantes y ampliamente aplicables para las estrategias inmunoterapéuticas contra el cáncer.

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Introducción

La proteína survivina se exploró para determinar la presencia de motivos HLA-A*0201 (HLA-A2) de unión a péptido y después de una identificación de éxito, los péptidos se utilizaron para probar la reactividad de células T específicas en pacientes de leucemia y melanoma mediante ensayo ELISPOT. En ambas cohortes de pacientes se detectaron respuestas de CTL a dos epítopos de péptidos derivados de survivina, mientras que no se pudo detectar reactividad alguna de células T en los controles sanos. Estos datos sugieren que la survivina representa un antígeno tumoral ampliamente expresado reconocido por las células T autólogas.

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Materiales y Métodos Pacientes y Controles Normales

Se recogieron muestras de sangre de vena periférica de 4 pacientes diagnosticados con CLL (designados como CLL1-4) y muestras de sangre de 6 individuos normales en tubos heparinizados. Se aislaron los PBLs utilizando separación por Limphoprep y se congelaron en suero fetal de ternera (SFT) con dimetilsulfóxido al 10%. Adicionalmente, se obtuvieron linfocitos T de los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor de 6 pacientes de melanoma (designados como mel1-6). Los ganglios linfáticos recién cortados se trocearon en pequeños fragmentos, se trituraron para liberar las células al cultivo y se crioconservaron. Los PBLs de 4 pacientes de melanoma estuvieron disponibles. Todos los individuos incluidos eran positivos para HLA-A2 como se determinó mediante análisis por FACS utilizando el anticuerpo BB7.2 específico de HLA-A2. El anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante del hibridoma. Las muestras de los pacientes se obtuvieron del Hospital de la Universidad del estado, Herlev, Dinamarca. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas.

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Péptidos Derivados de Survivina

Todos los péptidos se obtuvieron de Research Genetics (Huntsville, AL, EE.UU.) y se suministraron a una pureza >90% como se verificó mediante análisis por HPLC y MS. Los péptidos utilizados se enumeran en la Tabla 1.

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TABLA 1 Péptidos examinados en este estudio y su afinidad de unión a HLA-A2

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Ensayo de ensamblaje para unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I

Se llevaron a cabo los ensayos de ensamblaje para la unión de los péptidos sintéticos a las moléculas MHC de clase I metabólicamente marcadas con [35S]-metionina, como se describe (12,13). El ensayo de ensamblaje se basa en la estabilización de las moléculas de clase I después de cargar el péptido en la línea celular T2, deficiente en transportador peptídico. Posteriormente, se inmunoprecipitan las cadenas pesadas de MHC estables correctamente plegadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformación. Después de la electroforesis IEF, los geles se expusieron a pantallas de phosphorimager, y se cuantificó la unión del péptido utilizando el programa Imagequant PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

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Estimulación de PBLs por antígeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, se estimularon los PBLs una vez in vitro antes del análisis (14, 15). Los PBLs frescos y los previamente congelados dieron resultados similares en el ensayo ELISPOT. En el día 0, se descongelaron los PBLs o ganglios linfáticos triturados y se sembraron en 2 ml/pocillo a una concentración de 2x106 células, en placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca), en medio AIM V (Life Technologies, Roskilde, Dinamarca), suero humano inactivado por calor al 5%, y 2 mM de L-glutamina en presencia de 10 \muM del péptido. En cada experimento, se incluyó un pocillo sin péptido. Dos días después, se añadieron 300 IU/ml de interleuquina-2 recombinante (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemania) a los cultivos. Las células cultivadas se probaron para determinar su reactividad en el ensayo ELISPOT en el día 12.

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Ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT utilizado para cuantificar las células efectoras liberadoras de interferón-\gamma específicas del epítopo del péptido se llevó a cabo como en (16). Brevemente, las placas de 96 pocillos de fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) se recubrieron con anticuerpo anti-IFN-\gamma (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron, se bloquearon con medio AIM V, y se añadieron las células en duplicados a diferentes concentraciones celulares. Luego se añadieron los péptidos a cada pocillo, y las placas se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se desechó el medio, y los pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas, se lavaron, y se añadió el conjugado de avidina-enzima (AP-Avidin, Calbiochem, Life Technologies) a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP (Gibco, Life Technologies) a cada pocillo, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. La reacción se terminó lavando con agua corriente hasta que surgieron manchas púrpuras oscuras. Las manchas se contaron utilizando un Sistema AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.), y se pudo calcular la frecuencia de CTL específica del péptido a partir de los números de células formadoras de manchas. Los ensayos se llevaron a cabo todos por duplicado para cada antígeno peptídico.

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Resultados Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-A2

La secuencia de aminoácidos de la proteína survivina se rastreó para determinar los epítopos de péptidos nona- y decaméricos de HLA-A2 más probables, utilizando los principales residuos de anclaje específicos de HLA-A2 (17). Se sintetizaron diez péptidos derivados de survivina y se examinaron para determinar la unión a HLA-A2. Se utilizó un epítopo de HIV-1 pol476-484 (ILKEPVHGV, SEQ ID NO: 11) (Tabla 1) como control positivo. La concentración de péptido requerida para la recuperación semi-máxima de MHC de clase I (valor C_{50}) fue de 0,7 \muM para el control positivo. En comparación, el péptido designado como Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) se unió con una afinidad de C_{50} = 10 \muM. Los péptidos designados como Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID NO: 1) y Sur8 (TLPPAWQPFL, SEQ ID NO: 2) se unieron respectivamente a HLA-A2 a una C_{50} = 30 \muM, mientras que Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) y Sur3 (KVRRAIEQL, SEQ ID NO: 13) se unieron más débilmente (C_{50} >100 \muM). Cinco de los péptidos examinados (Sur2, Sur4, Sur5, Sur7, y Sur1O) no se unieron a HLA-A2.

Debido a que Sur1 se une de forma débil a HLA-A2, se sintetizaron dos péptidos análogos designados como Sur1L2 y Sur1M2, respectivamente, en los que un residuo de anclaje mejor (leucina o metionina) reemplazó a la treonina nativa en la posición 2. Ambos péptidos se unen a HLA-A2 con alta afinidad casi similar a la del control positivo (C_{50} = 1 \muM).

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Respuesta de CTL a survivina en pacientes de CLL

Los PBLs de 4 pacientes de CLL positivos para HLA-A2 se estimularon una vez in vitro antes de examinarse en el ensayo ELISPOT. Este procedimiento se seleccionó para aumentar la sensibilidad del ELISPOT. Se incluyeron todos los 10 péptidos derivados de survivina anteriores en la primera línea de los experimentos. Se detectaron respuestas a Sur1 y Sur9 y en las figuras solamente se dan los datos para estos péptidos. Fig. 1 muestra la reactividad de CTL a Sur1 y Sur9 determinada en el paciente CLL1. Cada mancha representa una célula productora de IFN-\gamma que reacciona con el péptido. El número medio de manchas por péptido se calculó utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador. Se detectaron 52 manchas específicas del péptido Sur9 (después de la sustracción de las manchas sin el péptido añadido) por 6x10^{5} en el paciente CLL1 (Fig. 1). No se detectó respuesta alguna al péptido Sur1 de unión débil a HLA-A2, sin embargo el paciente respondió fuertemente al análogo de péptido Sur1M2 de unión fuerte a HLA-A2 (35 manchas específicas del péptido por 10^{4} células) (Fig. 2). No se detectó respuesta alguna al otro análogo de péptido Sur1L2 de fuerte unión a HLA-A2 en este paciente (Fig. 2). El paciente CLL2 respondió fuertemente a Sur9 (128 manchas específicas del péptido por 10^{5} células), y débilmente a Sur1 (22 manchas específicas del péptido por 10^{5} células) (Fig. 3). La respuesta al análogo Sur1L2 se incrementó sólo ligeramente en relación con el epítopo natural, mientras que el paciente respondió fuertemente de una manera similar al péptido Sur1M2 que al péptido decamérico Sur9. En el paciente CLL3 se observó una respuesta débil a Sur9 (Fig. 3). No se observó respuesta alguna a Sur1 o a los péptidos modificados de Sur1 en el paciente. No se detectaron respuestas de survivina en el último paciente CLL4 (datos no mostrados). Se analizaron los PBLs de seis controles positivos sanos para HLA-A2 con el fin de investigar si se podría detectar una respuesta a la survivina en los individuos sanos. No se observó respuesta alguna en cualquiera de los controles a cualquiera de los péptidos derivados de survivina.

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Respuesta de CTL a survivina en pacientes de melanoma

Se examinaron linfocitos T aislados de ganglios linfáticos infiltrados por tumor de pacientes de melanoma positivos para HLA-A2. El ganglio linfático recién cortado se troceó en pequeños fragmentos y se aplastó para liberar las células al cultivo. Las células se estimularon una vez con el péptido in vitro antes de examinarse en el ensayo ELISPOT. Se detectaron células T específicas de survivina en tres de los seis pacientes analizados. Se detectó una fuerte respuesta de Sur9 en los pacientes Mel2 y Mel3. También se detectó una respuesta más débil al péptido Sur1 en estos pacientes (Fig. 4). En Mel1 la respuesta al péptido de unión débil Sur1 fue más fuerte que la respuesta a Sur9 de unión más fuerte a HLA-A2 (Fig. 4). No se detectó respuesta alguna en los ganglios linfáticos infiltrados por tumor de los últimos tres pacientes de melanoma (Mel4-6). Se examinaron los PBLs de dos de los pacientes que reaccionaron a survivina, Mel1 y Mel2, y de dos de los pacientes que no reaccionaron, Mel4 yMel5. No se pudo detectar respuesta alguna a Sur9 o Sur1 en los PBLs de cualquiera de estos pacientes (datos no mostrados).

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Ejemplo 2

Respuestas espontáneas de células T citotóxicas a los epítopos de células T restringidos a MHC de clase I derivados de survivina in situ y ex vivo en pacientes de cáncer Resumen

Se demostraron respuestas espontáneas de células T citotóxicas a los epítopos de células T restringidos a MHC de clase I derivados de survivina in situ así como ex vivo en pacientes de cáncer de mama, leucemia, y melanoma. Además, las células T que reaccionan con survivina aisladas mediante bolas magnéticas recubiertas con complejos MHC/péptido eran citotóxicas a tumores emparejados con HLA de diferentes tipos de tejido. Al ser un antígeno tumoral universal, la survivina puede servir como diana ampliamente aplicable para la inmunoterapia contra el cáncer.

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Materiales y Métodos Construcción de complejos HLA-péptido para tinción de células T y la separación de células T

Se expresó un sitio de reconocimiento para la biotinilación enzimática utilizando ligasa de proteína biotina (BirA) en fusión con el extremo 5' de los dominios extracelulares de HLA A*0201 (residuos 1-275) en E. coli BL21 (DE3). La proteína recombinante se purificó mediante cromatografía por tamaño (Sephadex G25, Pharmacia) y de intercambio iónico (mono-Q, Pharmacia) a partir de cuerpos de inclusión solubilizados en urea 8 M. HLA A*0201 se plegó in vitro mediante dilución en presencia del péptido modificado de survivina Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) o del péptido MAA gp100154-163, y posteriormente se biotiniló como se ha descrito anteriormente (35, 36).

Después de la filtración en gel en una columna de Sephadex G25 de Pharmacia para eliminar la biotina no unida, la proteína se multimerizó con moléculas de dextrano conjugadas con estreptavidina-FITC (amablemente proporcionadas por L. Winther, DAKO, Dinamarca) con el fin de generar compuestos multivalentes HLA-dextrano para la inmunohistoquímica. La construcción HLA A*0201 fue un obsequio amable del Dr. Mark M. Davis (Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Stanford, Palo Alto, CA). La separación celular se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente (37). Brevemente, se lavaron 5x10^{6} bolas magnéticas conjugadas con estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega) dos veces en 200 \mul de PBS frío, se añadieron 0,5 \mug de monómeros de péptido/A*0201 y la mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de dos lavados estas bolas se mezclaron con PBLs en una proporción de 1:10 y posteriormente se incubaron durante 1 hora seguido por una precipitación de las células unidas a las bolas en un campo magnético. El paso de precipitación se repitió una vez.

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Tinciones de inmunohistoquímica

Para teñir con los complejos péptido/MHC multiméricos conjugados con FITC, las secciones de tejido se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fría durante 5 minutos. Todos los pasos de incubación se llevaron a cabo a temperatura ambiente y en la oscuridad: (i) 45 minutos del anticuerpo primario (diluido 1:100), (ii) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; código 115-165-100, Jackson ImmunoResearch, obtenido de Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos, y finalmente (iii) los multímeros durante 75 minutos. Entre cada paso los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0.1%. Los portaobjetos se montaron en Vectashield y se mantuvieron en la nevera hasta que se observaron con el microscopio confocal.

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Ensayo de citotoxicidad

Se llevaron a cabo ensayos convencionales de liberación de [51Cr] para determinar la citotoxicidad mediada por CTL como se describe en (13). Las células diana eran líneas de células B autólogas transformadas por EBV, la línea celular de cáncer de mama MCF-7 positiva para HLA-A2 (disponible en ATCC), la línea celular de melanoma FM3 positiva para HLA-A2 (38), la línea celular de cáncer de mama BT-20 negativa para HLA-A2 (disponible en ATCC) y la línea celular de melanoma FM45 negativa para HLA-A2 (38). Todas las líneas celulares de cáncer expresaban survivina examinadas mediante RT-PCR (datos no mostrados).

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Ensayo ELISPOT

Se utilizó el ensayo ELISPOT para cuantificar las células efectoras liberadoras de IFN-\gamma específicas del epítopo del péptido y se ha descrito anteriormente (39). Brevemente, las placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore) se recubrieron con anticuerpo anti-IFN-\gamma (1-D1K, Mabtech, Suecia) y se bloqueó la unión no específica utilizando AIM V (GibcoBRL, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.). Se añadieron linfocitos a diferentes concentraciones celulares junto con los péptidos específicos y células T2 y se incubaron durante la noche a 37ºC. Tras dos lavados, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado (7-B6-1-Biotina Mabtech). La unión específica se visualizó utilizando fosfatasa alcalina-avidina junto con el sustrato respectivo (GibcoBRL). La reacción se terminó tras la aparición de manchas púrpuras oscuras, que se cuantificaron utilizando el Sistema AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.). Los péptidos utilizados para el ELISPOT fueron Sur1, Sur9, y el péptido análogo de Sur1 Sur1M2, como se describe en el Ejemplo 1.

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Resultados Tinción in situ de células T que reaccionan con HLAA2/survivina

En el Ejemplo 1 se identificaron dos epítopos de péptidos derivados de survivina reconocidos por las células T en leucemia y melanoma, es decir, Sur1. La afinidad débil de unión de Sur1 con HLA-A2 mejoró sustancialmente mediante el reemplazo de la treonina en la posición 2 con un residuo de anclaje mejor (metionina; Sur1M2). Esta medida hizo posible la construcción de complejos HLA-A2/péptido estables. Estos complejos se multimerizaron utilizando moléculas de dextrano, que se conjugaron con estreptavidina y FITC. Se utilizaron complejos de MHC multimerizados para teñir el material congelado fijado con acetona. Utilizando un microscopio láser confocal se pudieron detectar fácilmente los CTLs que reaccionan con Sur1M2/HLA-A*0201 in situ en el microentorno tumoral. Se representan estas células en el tumor primario y en el ganglio linfático centinela de un paciente de melanoma en etapa III así como en una lesión de cáncer de mama primario. Con el fin de asegurar la especificidad de la tinción, se llevaron a cabo una serie de controles negativos. Ni el uso de los multímeros péptido/HLA-dextrano con péptidos derivados del antígeno de diferenciación de melanoma gp100 en el mismo tumor, ni los multímeros Sur1M2/HLA-dextrano en el caso de una muestra tumoral obtenida a partir de un donante negativo para HLA-A2, dieron como resultado una tinción positiva.

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CTLs aislados que reaccionan con survivina lisan líneas celulares tumorales de diferente origen

Con el fin de caracterizar la capacidad funcional de los CTLs que reaccionan con survivina, estas células se aislaron por medio de bolas magnéticas recubiertas con complejos HLA-A2/Sur1M2 (36). Un ganglio linfático infiltrado por melanoma recién cortado se troceó en pequeños fragmentos y se aplastó para liberar las células al cultivo. Las células se estimularon una vez con el péptido in vitro antes del aislamiento. Un día después del aislamiento se añadió IL-2, y en el día 5 se probó la capacidad de estas células para aniquilar células tumorales, ya sea mediante ELISPOT o en un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Primero, por medio del análisis ELISPOT fue posible establecer que los CTLs aislados utilizando el complejo modificado Sur1M2/HLA-A2 también respondían al péptido Sur1 nativo (datos no mostrados). Segundo, se probó la citotoxicidad de los CTLs que reaccionan con survivina contra la línea celular de melanoma FM3 positiva para HLA-A2 (Fig. 5A) y la línea celular de cáncer de mama MCF-7 positiva para HLA-A2 (Fig. 5B). Las células T aisladas lisaron de una manera eficaz ambas líneas celulares de HLA-A*0201. En contraste, no se observó citotoxicidad alguna contra la línea celular de melanoma FM45 negativa para HLA-A2 (Fig. 5A) o la línea celular de cáncer de mama BT-20 negativa para HLA-A2 (Fig. 5B).

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Reactividad de survivina medida en PBL mediante ELISPOT

Se examinó la presencia de células T que reaccionan con survivina en PBLs de 10 pacientes de cáncer de mama positivos para HLA-A2 mediante el ELISPOT. Antes del análisis, los PBLs se estimularon una vez in vitro para aumentar la sensibilidad del ensayo. Se examinó la reactividad a los siguientes péptidos de survivina: Sur1, Sur9, y Sur1M2. Se detectaron células T específicas de survivina en seis de los diez pacientes de cáncer de mama positivos para HLA-A2. Se dan ejemplos representativos en la Figura 6. En los PBLs de dos pacientes se detectó una respuesta contra Sur1 y el análogo modificado Sur1M2, pero no contra Sur9 (Fig. 6, parte superior, media), en tres pacientes se detectó una respuesta a Sur9, pero no a Sur1 o Sur1M2 (Fig. 6, parte inferior), y un paciente respondió solamente a Sur1M2. En contraste, no se detectaron respuestas de survivina en los PBLs de 20 donantes sanos positivos para HLA-A2. De una manera similar, se examinaron los PBLs de 14 pacientes de melanoma positivos para HLA-A2. Hubo respuestas de survivina presentes en siete de estos pacientes (Tabla 2). Dos pacientes respondieron al péptido Sur9, tres al péptido Sur1M2, uno tanto a Sur1 como a SurM2, y uno a los tres péptidos. En el ejemplo 1, se probó la respuesta de células T a survivina en tres pacientes de leucemia linfática crónica (CLL) (Tabla 2; CLL1, CLL2, CLL3). Estos estudios se extendieron utilizando PBLs de tres pacientes adicionales de CLL. Notablemente, todos los pacientes produjeron una respuesta de células T a al menos un epítopo de survivina (Tabla 2; CLL5, CLL6, CLL7). Además, se examinaron los PBLs de un paciente que padecía leucemia mieloide crónica (CML). En este paciente, se identificó una respuesta a los tres péptidos (datos no mostrados). Los datos se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2 Pacientes con linfocitos T específicos del péptido survivina en PBLs medido mediante ELISPOT

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Ejemplo 3

Respuestas inmunes restringidas a HLA-B35 a péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer Resumen

En este estudio, se identificaron y caracterizaron dos epítopos derivados de survivina, que están restringidos a HLA-B35. La reactividad de células T específica contra ambos epítopos estuvo presente en la sangre periférica de los pacientes con diferentes tumores malignos hematopoyéticos y melanoma. Las sustituciones del residuo de anclaje C-terminal mejoró el reconocimiento por parte de los linfocitos infiltrantes en el tumor de los pacientes de melanoma. Adicionalmente, se demostraron respuestas espontáneas de células T citotóxicas a survivina in situ en una lesión de melanoma primario. Estos epítopos extienden la aplicabilidad de futuras estrategias de vacuna basada en los péptidos de survivina en relación con los tumores malignos así como el perfil de HLA de los pacientes
involucrados.

En los ejemplos 1 y 2, se estudiaron los epítopos de células T derivados de survivina restringidos a HLA-A2. Debido a que HLA-A2 solamente se expresa en aproximadamente el 30% de la población caucásica (63), se necesita identificar los epítopos de péptidos restringidos a otras moléculas de HLA de clase I para extender la fracción de pacientes que se podrían tratar. En este estudio, se identificaron dos epítopos nuevos de células T de survivina restringidos a HLA-B35, que se expresan en el 9% de la población caucásica (63), y se detectaron respuestas inmunes espontáneas a estos péptidos de survivina en pacientes con diferentes tumores malignos hematopoyéticos y
melanoma.

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Materiales y Métodos Pacientes

Se recogieron muestras de sangre de vena periférica de los pacientes de cáncer, se aislaron los PBLs utilizando separación por Lymphoprep, se tipificó la HLA (Departamento de Inmunología Clínica, Hospital de la Universidad, Copenhague), y se congelaron en SFT con DMSO al 10%. Se seleccionaron 10 pacientes positivos para HLA-B35 para un análisis adicional. Estos pacientes padecían melanoma, CLL, linfoma folicular (FL), linfomas difusos de células B grandes (DLBCL) y mieloma múltiple (MM), respectivamente. En el momento en que se recogieron las muestras de sangre los pacientes no habían sido tratados médicamente en los cuatro meses anteriores. Adicionalmente, se recogieron linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) aislados de ganglios linfáticos de tres de los pacientes de melanoma, y se congelaron en SFT con DMSO al 10%.

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Péptidos

Se utilizaron siete péptidos sintéticos derivados de survivina en este estudio: Sur6-14, Sur11-19, Sur34-43, Sur46-54, Sur51-59, Sur46Y9, Sur51Y9, y un péptido derivado de EBV, EBNA3A 457-466 (63). Todos los péptidos se obtuvieron de Research Genetics (Huntsville, AL) y se suministraron a una pureza >90%, como se verificó mediante análisis de HPLC y MC. Los péptidos se enumeran en la siguiente tabla 3.

TABLA 3 Unión de los péptidos derivados de survivina a HLA-B35

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Ensayo de ensamblaje para la unión del péptido a moléculas de MHC de clase I

Se utilizó el ensayo de ensamblaje descrito en los ejemplos 1 y 2 para medir la afinidad de unión de los péptidos sintéticos a las moléculas HLA-B35 metabólicamente marcadas con [S35]metionina. Brevemente, el ensayo se basa en la estabilización mediada por el péptido de las moléculas de HLA vacías liberadas, después de la lisis celular, de la línea celular T2 deficiente en TAP, establemente transfectada con HLA-B35 (amablemente proporcionada por el Dr. J. Haurum, Symphogen ApS, Lyngby, Dinamarca). Las moléculas de HLA establemente plegadas se inmunoprecipitaron utilizando el mAb W6/32 dependiente de la conformación. Las moléculas de HLA se separaron mediante electroforesis IEF, los geles se expusieron a pantallas de phosphorimager (Imaging plate, FUJI film Co., LTD., Japón), se analizaron y se cuantificó la cantidad de moléculas de HLA correctamente plegadas, utilizando el software de phosphorimager ImageGauge (FUJI photo film Co., LTD., Japón).

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Estimulación de PBLs por antígeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, los linfocitos se estimularon una vez in vitro con el péptido antes del análisis (14, 15). Los PBLs o TILs se descongelaron y se estimularon con 50 \muM de los epítopos de péptidos individuales en placas de 96 pocillos durante 2 horas a 26ºC (5x10^{5}-10^{6} células por péptido) y se juntaron durante 10 días adicionales de cultivo a 37ºC en ex-vivo con suero humano (HS) al 5%, en placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca), a 2x10^{6} células por pocillo. Al segundo día de la incubación, se añadieron 40 \mug/ml de IL-2 (Apodan A/S, Dinamarca). En el día 10, las células cultivadas se probaron para determinar su reactividad en el ensayo ELISPOT.

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El ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT utilizado para cuantificar las células efectoras liberadoras de IFN-\gamma específicas del péptido en PBLs o TILs recogidos de pacientes de cáncer se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, las placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45; Millipore, Hedehusene, Dinamarca) se recubrieron con el mAb contra IFN-\gamma humano, 7.5 \mug/ml (1-D1K; Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron y se bloquearon con ex-vivo (ex-vivo ISTM BioWhittacker, Molecular Applications Aps, Dinamarca) y las células se añadieron por duplicado a diferentes concentraciones. Para la presentación del antígeno, se añadieron 10^{4} células T2-B35, con y sin el péptido 10 \muM, por pocillo. Las placas se incubaron durante la noche, las células se desecharon, y los pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina; Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron y se añadió el conjugado de avidina-fosfatasa alcalina (AP-Avidina; Calbiochem, Life Technologies, Inc.). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se añadió el sustrato enzimático nitroazul de tetrazolio/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (Código No. K0598, DakoCytomation Norden A/S), y surgieron manchas púrpuras oscuras en 3-7 minutos. La reacción se terminó lavando con agua corriente. Las manchas se contaron utilizando el Sistema Alpha Imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA), y se calculó la frecuencia de células T específicas del péptido a partir del número de células formadoras de
manchas.

Todos los ensayos se llevaron a cabo en duplicado para cada antígeno de péptido, y los linfocitos cultivados en el mismo pocillo se probaron en números celulares iguales con y sin péptido, para medir el número de células específicas del péptido en el cultivo.

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Maduración de células dendríticas (CDs)

Se aislaron células adherentes de PBLs después de 2 horas de cultivo. Estas se cultivaron durante 10 días adicionales en RPMI 1640 (GibcoTM Invitrogen Corporation, RU) con SFT al 10%. Se añadieron 800 ng/ml de GM-CSF (PreproTech, Londres, RU) y 40 ng/ml de IL-4 (PreproTech) cada tres días. En el día 10, las CDs se hicieron madurar durante 24 horas mediante la adición de 50 ng/ml de TNF-\alpha (PreproTech). Después de la maduración, las CDs se liberaron y se pulsaron con el péptido 20 \muM en presencia de 3 \mug/ml de \beta2-microglobulina durante 2 horas a
26ºC.

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Aislamiento de células T específicas de péptido

Se aislaron células específicas del antígeno utilizando bolas magnéticas recubiertas con sur51Y9/HLA-B35, como se describe en el ejemplo 2. Los monómeros biotinilados de HLA-B35 con sur51Y9 (obtenidos de ProImmune, Oxford, RU) se acoplaron a bolas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280, Dynal A/S, Oslo, Noruega), mediante incubación de 2.5 \mug de monómeros con 5x10^{6} bolas en 40 \mul de PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los complejos magnéticos se lavaron tres veces en PBS, utilizando un dispositivo magnético (Dynal A/S, Oslo, Noruega), y posteriormente se mezclaron con los PBLs en una proporción de 1:10 en PBS con BSA al 5%, y se rotaron muy suavemente durante 1 hora. Las células T CD8^{+} específicas del antígeno que se asociaron con los complejos magnéticos, se lavaron suavemente dos o tres veces. Las células aisladas se resuspendieron varias veces en ex-vivo suplementado con suero humano al 5%, y se incubaron durante 2 horas antes de que se liberaran las bolas magnéticas y se eliminaran de la suspensión celular. Las células T CD8^{+} específicas del antígeno aisladas se utilizaron en el ensayo ELISPOT, para analizar la reactividad cruzada entre el péptido nativo y
modificado.

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Mapeo de clonotipo de TCR mediante electroforesis en gel en gradiente en condiciones desnaturalizantes (DGGE)

El mapeo del clonotipo por DGGE de las regiones 1-24 de TCR BV humanas se ha descrito con detalle (66). Brevemente, se aisló el ARN utilizando el kit de Aislamiento Purescript (Gentra Systems Inc. MN) y se amplificó el ADNc transcrito mediante PCR utilizando cebadores para las regiones variables de las cadenas beta de TCR junto con un cebador común de la región constante. Se utilizó el programa de ordenador MELT87 para asegurar que las moléculas de ADN amplificadas fueran adecuadas para el análisis por DGGE, siempre que se uniera una secuencia rica en GC de 50 bp (pinza-GC) al extremo 5' del cebador de la región constante. El análisis por DGGE se hizo en geles de poliacrilamida al 6% que contenían un gradiente de urea y formamida del 20% al 80%. La electroforesis se llevó a cabo a 160 V durante 4.5 horas en tampón TAE 1x a una temperatura constante de
54ºC.

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Tinciones de inmunohistoquímica

Se utilizaron complejos péptido/HLA multimerizados para identificar las células T específicas del antígeno in situ en lesiones tumorales de pacientes de cáncer empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. El monómero sur5lY9/HLA-B35 biotinilado fue suministrado por Proimmune Limited, Oxford, RU. Los monómeros biotinilados sur51Y9/HLA-B35 se multimerizaron con moléculas de dextrano conjugadas con estreptavidina-FITC (amablemente proporcionadas por L. Winther, DAKO, Glostrup, Dinamarca), para generar compuestos multivalentes HLA-dextrano para la inmunohistoquímica. Las secciones de tejido se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fría durante 5 minutos. Todos los pasos de incubación se llevaron a cabo en la oscuridad a temperatura ambiente: (a) 45 minutos del anticuerpo primario (diluido 1:100) (b) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; código 115-165-100; Jackson ImmunoResearch, obtenido en Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos; y finalmente (c) los multímeros durante 75 minutos. Entre cada paso, los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0.1%. Los portaobjetos se montaron en Vectashield y se mantuvieron en la nevera hasta que se observaron con el microscopio confocal (Leica).

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Resultados Identificación de los péptidos derivados de survivina que se unen a HLA-B35

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de survivina para determinar los péptidos nonaméricos y decaméricos con residuos de anclaje, de acuerdo con el motivo de unión a péptido de HLA-B35 (67). Se seleccionaron cinco péptidos que contenían prolina como el anclaje N-terminal en la posición 2, y fenilalanina, leucina, isoleucina, o tirosina como residuos de anclaje C-terminales (Tabla 3). El ensayo de ensamblaje reveló que dos péptidos, sur51-59 (EPDLAQCFF, SEQ ID NO: 7) y sur46-54 (CPTENEPDL, SEQ ID NO: 6) fueron capaces de estabilizar HLA-B35 de una manera eficaz. Adicionalmente, dos péptidos, sur34-43 (TPERMAEAGF, SEQ ID NO: 20) y sur6-14 (LPPAWQPFL, SEQ ID NO: 18) mostraron una estabilización débil, mientras que el péptido restante no estabilizó HLA-B35 en absoluto. La concentración del péptido requerida para la recuperación semi-máxima de HLA-B35 (C50) se estimó en 13 \muM para sur51-59 y en 20 \muM para sur46-54. En comparación, el epítopo del control positivo C24 de EBNA3A458-466 (YPLHEQHQM, SEQ ID NO: 21) tuvo un valor C_{50} estimado de
0.8 \muM.

Con el fin de mejorar la afinidad de unión de sur46-54 y sur51-59 el aminoácido C-terminal fue reemplazado con tirosina, un residuo de anclaje mejor (67). Se analizó la recuperación de HLA-B35 mediada por los péptidos modificados en el ensayo de ensamblaje, y se estimaron los valores C_{50} en 1.5 \muM para sur51Y9, y en 4 \muM para sur46Y9 (Fig. 7).

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Respuestas inmunes espontáneas contra los epítopos de péptidos nativos

Inicialmente, se analizaron cinco pacientes para determinar las respuestas inmunes espontáneas a los cuatro péptidos de unión a HLA-B35 nativos, sur51-59, sur46-54, sur34-43, y sur6-14. Estos cinco pacientes tenían diferentes tumores malignos hematopoyéticos: HEM8 y HEM18 padecían MM, HEM12 padecía FL, HEM9 tenía DLBCL, y CLL5 tenía CLL.

Se llevaron a cabo los ensayos ELISPOT de INF-\gamma sobre los PBLs después de 10 días de estimulación in vitro para detectar los CTLs precursores del péptido. Las respuestas inmunes espontáneas se detectaron contra dos de los péptidos de unión a HLA-B35 nativos, sur51-59 y sur46-54. Dos pacientes, HEM12 y CLL5 mostraron respuesta tanto a sur51-59 como a sur46-54, mientras que HEM8 solamente mostró respuesta a sur51-59 (Figura 8A y B). No se pudo detectar respuesta alguna en los dos pacientes restantes, HEM9 y HEM18, y no se pudo detectar respuesta alguna a los péptidos de unión mala sur34-46 y sur6-14 en ninguno de los pacientes.

Se utilizó un planteamiento alternativo a la estimulación in vitro en el paciente HEM12, es decir, los PBLs se cocultivaron con células dendríticas autólogas maduras pulsadas con sur51-59 para estimular una respuesta de CTL in vitro. Los PBLs de este cultivo mostraron una fuerte reactividad hacia sur51-59 en el ELISPOT (Figura
8B).

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Reconocimiento aumentado de los péptidos modificados

Como se ha descrito anteriormente, las modificaciones de péptidos para mejorar la afinidad a HLA-B35 dieron como resultado una afinidad de 5-10 veces más alta para HLA-B35 en relación con los péptidos nativos. Se analizó un grupo de cinco pacientes de melanoma para determinar las respuestas inmunes espontáneas tanto a los péptidos nativos como modificados, por medio del ensayo ELISPOT. Las muestras de PBL se analizaron después de la estimulación in vitro, mientras que las muestras de TIL se analizaron directamente. Se observaron respuestas inmunes espontáneas ya sea en los PBLs o en los TILs de tres de los cinco pacientes. FM25 mostró reactividad contra sur51-59 y sur51Y9 tanto en muestras de PBL como de TIL (Fig. 9A). FM45 respondió solamente al péptido modificado sur51Y9, con una fuerte respuesta detectable en los TILs. No hubo PBLs disponibles de este paciente (Fig. 9A). FM74 mostró una fuerte respuesta a sur46Y9 en TIL, pero no fue detectable respuesta alguna al péptido nativo (Fig. 9B). También se observó una respuesta débil a sur46Y9 en PBLs de FM74 (datos no
mostrados).

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Reactividad cruzada entre el péptido nativo y el modificado

La alta afinidad de sur51Y9 por HLA-B35 hace posible la producción de monómeros estables de HLA-B35 con sur51Y9. Habiendo establecido la presencia de los linfocitos T que reaccionan con survivina en los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor y en PBLs de diferentes pacientes de cáncer, se recubrieron bolas magnéticas con estos complejos HLA-B35/sur51Y9 y se utilizaron para aislar los linfocitos T que reaccionan con el péptido de survivina de PBL del paciente CLL5. Este paciente mostró una fuerte respuesta a sur51Y9. Las bolas estaban fuertemente unidas a la superficie celular de las células específicas, como se visualizó mediante microscopía (datos no mostrados), permitiendo la precipitación de las células específicas de antígeno mediante un campo magnético. Las células específicas de sur51Y9 aisladas respondieron fuertemente a sur51-59 (Figura 9), mientras que no se pudo detectar respuesta alguna en los PBLs restantes (datos no mostrados). El aislamiento se analizó mediante el mapeo de clonotipo de TCR basado en RT-PCR/DGGE. Esta técnica permite hacer el análisis de la clonalidad de células T en poblaciones celulares complejas, incluso cuando solamente están disponibles pequeños números de células. Estos análisis mostraron que se aislaron 8 clones distintos (datos no mostrados).

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Células T específicas de antígeno presentes in situ en lesiones de melanoma

Los monómeros sur51Y9/HLA-B35 se multimerizaron utilizando moléculas de dextrano conjugadas con estreptavidina y FITC. Los complejos de MHC multimerizados se utilizaron para teñir el material congelado y fijado con acetona, empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Las células específicas de antígeno se visualizaron utilizando un microscopio láser confocal. Se analizaron secciones de melanoma primario de tres pacientes y se pudieron detectar fácilmente los CTLs que reaccionan con sur5lY9/HLA-B35 in situ, en el microentorno tumoral en uno de los pacientes. La cotinción con un mAb contra la granzima B mostró que estos CTLs específicos de survivina liberaban granzima B, ejerciendo una actividad citotóxica, se utilizaron los pacientes de melanoma negativos para HLA-B35 como controles (datos no mostrados).

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Ejemplo 4

Identificación de nuevos epítopos de CTL derivados de survivina con diferentes perfiles de restricción a HLA-A Resumen

Se caracterizaron nuevos epítopos de survivina restringido a HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3 y HLA-A11 en base en las respuestas de CTL en los pacientes de cáncer. Estos epítopos aumentan de manera significativa el número de pacientes elegibles para la inmunoterapia basada en los péptidos derivados de survivina. Adicionalmente, es probable que el direccionamiento colectivo a varios elementos de restricción reduzca el riesgo de escape inmune por pérdida del alelo HLA.

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Materiales y Métodos Pacientes

Las muestras de pacientes se recibieron de la Universidad de Würzburg, Alemania, y del Hospital de la Universidad en Herlev, Dinamarca. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas. La tipificación del tejido se realizó en el Departamento de Inmunología Clínica, Hospital de la Universidad, Copenhague, Dinamarca. Se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBL) de los pacientes de cáncer con melanoma, carcinoma de mama y leucemia linfocítica crónica (CLL), utilizando separación por Lymphoprep y se congelaron en suero fetal de ternera (SFT) con dimetilsulfóxido al 10%. Además, se obtuvieron linfocitos T de lesiones primarias y de ganglios linfáticos infiltrados por tumor de los pacientes de melanoma. El tejido tumoral recién cortado se troceó en pequeños fragmentos y se aplastó para liberar los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) para la
crioconservación.

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Péptidos

Todos los péptidos se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.) y se suministraron a una pureza de >80% como se verificó mediante el análisis de HPLC y MS. Todos los péptidos utilizados se enumeran en la Tabla 4, en el ejemplo 5 más adelante.

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Líneas celulares

La línea celular humana T2 es un híbrido deficiente en TAP1 y TAP2 de las células B-LCL.174 y T-LCL CEM, y por lo tanto, solamente expresa bajos niveles de moléculas de HLA de clase I (HLA-A*0201 y HLA-B*5101) en la superficie celular. Las células T2 transfectadas con HLAA*0301 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. A. McMicheael, IMM, John Radcliffe Hospital, Oxford. Las células T2 transfectadas con HLA-A*1101 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. M. Masucci, MTC, Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia. La línea celular BM36.1 también es deficiente para la función TAP, y tiene un fenotipo similar a T2 con una baja expresión de HLA de clase I (HLA-A*0101, HLA-B*3501) en la superficie. Las células BM36.1 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. A. Ziegler, Universidad Humboldt, Berlín, Alemania.

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Ensayo de ensamblaje para la unión de péptido a moléculas de MHC de clase I

La afinidad de unión de los péptidos sintéticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a las moléculas HLA-A1, -A2, -A3, o -A11 metabólicamente marcadas con [^{35}S]- metionina, se midió en el ensayo de ensamblaje, como se ha descrito anteriormente (12). El ensayo se basa en la estabilización mediada por péptido de las moléculas de HLA vacías liberadas después de la lisis celular, de las líneas celulares deficientes en TAP. Las moléculas de HLA establemente plegadas se inmunoprecipitaron utilizando el mAb W6/32 dependiente de la conformación, específico de HLA de clase I y se separaron mediante electroforesis en gel con isoelectroenfoque (IEF). Las bandas de cadena pesada del MHC se cuantificaron utilizando el programa ImageGauge PhosphorImager (FUJI photo film Co., Carrollton, TX, EE.UU.). La intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de complejo de MHC de clase I unido al péptido recuperado durante el ensayo. Posteriormente, el nivel de la estabilización de la molécula de HLA está directamente relacionado con la afinidad de unión del péptido añadido. La concentración del péptido utilizada para analizar la recuperación de las moléculas HLA fue de 40, 4, 0,4, 0,04 \muM para HLA-A1 y HLA-A11, y de 100, 10, 1, 0,1, 0,01 \muM para HLA-A2 y HLA-A3. Posteriormente se calculó el valor C_{50} para cada péptido como la concentración de péptido suficiente para una estabilización semi-máxima.

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Estimulación de PBL por antígeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, se estimularon los PBLs una vez in vitro antes del análisis. En el día 0, se descongelaron los PBLs o ganglios linfáticos aplastados y se sembraron como 2x10^{6} células en 2 ml/pocillo en placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en un medio ex-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), suero humano inactivado por calor al 5%, y 2 mM de L-glutamina en presencia de 10 \muM del péptido. Dos días después, se añadieron a los cultivos 20 IU/ml de interleuquina-2 recombinante (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemania). Las células cultivadas se probaron para determinar su reactividad en el ELISPOT en el día
10.

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Ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT se utilizó para cuantificar las células efectoras liberadoras de interferón-\gamma específicas del epítopo del péptido, como se ha descrito anteriormente (16). Brevemente, las placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) se recubrieron con anticuerpo anti-IFN-\gamma (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron, se bloquearon con el medio ex-vivo, y las células se añadieron en duplicado a diferentes concentraciones celulares. Luego se añadieron los péptidos a cada pocillo y las placas se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se eliminó el medio y los pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina, Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas, se lavaron y se añadió a cada pocillo el conjugado avidina-fosfatasa alcalina (Calbiochem, Life Technologies, Inc. San Diego, CA, EE.UU.). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora, se lavaron y se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP (DakoCytomation Norden A/S, Glostrup, Dinamarca) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Tras el surgimiento de manchas púrpuras oscuras, se terminó la reacción lavando con agua corriente. Las manchas se contaron utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.) y se pudo calcular la frecuencia de CTLs específicos de péptido a partir de los números de células formadoras de manchas. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado para cada antígeno de
péptido.

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Resultados Identificación de epítopos de survivina restringidos a HLA-A1 Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-A1

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina para los epítopos de péptidos nonaméricos o decaméricos de HLA-A1 más probables, utilizando los principales residuos de anclaje de HLA-A1, ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) en la posición 3, y tirosina (Y), fenilalanina (F) en el extremo C. De conformidad con lo anterior, se sintetizaron seis péptidos derivados de survivina y se examinaron para determinar la unión a HLA-A1 (Tabla 4). Adicionalmente, se incluyeron los dos péptidos sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO: 23) y Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO: 25), a pesar de que solamente contenían uno de los anclajes principales, debido a que ambos se identificaron como posibles buenos unidores mediante el algoritmo predictivo de Rammensee y col. disponible en http://syfpeithi.bmiheidelberg.com/. Se estimaron los valores C_{50} para cada péptido como la concentración de péptido necesaria para la estabilización semi-máxima de HLA-A1 (Tabla 4). Sin embargo, solamente uno de estos péptidos, sur92-101 (GFEELTLGEF) (SEQ ID NO: 27) se unió con una afinidad alta casi similar a la del epítopo del control positivo conocido de la proteína del virus de la gripe A, polimerasa básica 1 (PB1) (VSDGGPNLY), como se ejemplifica en la Figura 10. Sur93-101 (FEELTLGEF) (SEQ ID NO: 24) tuvo una baja afinidad de unión a HLA-A1, mientras que ninguno de los otros péptidos analizados se unió a HLA-A1 (Tabla 4). En consecuencia, se sintetizaron un número de péptidos análogos en donde mejores residuos de anclaje reemplazaron a los aminoácidos naturales. Se modificaron los dos péptidos Sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO: 23) y Sur47-56 (PTENEPD
LAQ) (SEQ ID NO: 25), introduciendo tirosina (Y) en lugar de cisteína (C) o glutamina (Q), respectivamente, en el extremo C. Ambos péptidos modificados se unieron fuertemente a HLA-A1 (Tabla 4). Adicionalmente, se sustituyeron los aminoácidos en la posición 2 con los anclajes auxiliares de treonina (T) o serina (S) en los dos péptidos Sur92-101 y Sur93-101. Estas modificaciones no tuvieron un efecto positivo en la unión de Sur92-101 a HLA-A1. En contraste, Sur93T2 (FTELTLGEF) (SEQ ID NO: 36) se unió con una alta afinidad a HLA-A1 (Tabla 4). La Figura 10 ilustra la unión del péptido nativo de baja afinidad Sur93-101, del péptido modificado de alta afinidad Sur93T2, y del péptido que no se une Sur49-58, comparados con el epítopo del control positivo del virus de la gripe. Finalmente, se modificaron Sur14-22, Sur34-43, Sur49-58, Sur51-59, Sur92-101, y Sur93-101 con tirosina (Y) en el extremo C, sin embargo esto no mejoró la afinidad de unión a HLA-A1 para ninguno de estos péptidos (datos
no mostrados).

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Respuestas de CTLs restringidos a HLA-A1 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Se analizaron PBLs de seis pacientes de melanoma, y TILs de tres pacientes de melanoma, para determinar la presencia de CTLs específicos contra cualquiera de los cuatro péptidos de alta afinidad deducidos de survivina Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 y Sur93T2 por medio de ELISPOT. Se observó reactividad de células T contra al menos uno de los péptidos derivados de survivina en tres muestras de PBL y una muestra de TIL del total de nueve pacientes analizados. Como se ve en la Figura 11, los PBLs de un paciente, Mel.A1-3, alojaron una respuesta de células T contra los cuatro péptidos, Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 y Sur93T2. Mel.A1-2 mostró respuestas contra Sur47Y10, Sur92-10 y Sur93T2, mientras que en Mel.A1-1/TIL y Mel.A1-4/PBL, se observaron respuestas contra Sur47Y10 y Sur93T2, respectivamente (Figura 11).

Además, se probaron diez pacientes de melanoma para determinar la reactividad inmune contra los péptidos nativos Sur93-101, Sur38-46 y Sur47-56, por medio de ELISPOT; sin embargo, no se detectaron respuestas específicas de péptido en ninguno de estos pacientes (datos no mostrados).

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Identificación de los epítopos de survivina restringidos a HLA-A11 Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-A11

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina para determinar los péptidos nonaméricos o decaméricos con motivos de unión correspondientes al de la superfamilia de HLA-A3, incluyendo HLA-A3 y HLA-A11. Se seleccionaron las secuencias de péptidos con los residuos de anclaje principales, leucina (L) en la posición 2 y lisina (K) en el extremo C, junto a las secuencias peptídicas que tuvieran aminoácidos relacionados en estas posiciones, de acuerdo con el algoritmo predictivo de Rammensee y colaboradores (Tabla 4).

Se predijeron trece péptidos a partir de la secuencia de proteína de survivina y se analizaron para determinar la unión a HLA-A11 y HLA-A3. Tres de estos péptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 47), Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 42) y Sur112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO: 44) se unieron a HLA-A11 con una alta afinidad, comparable con el epítopo viral del antígeno nuclear 4 de EBV (AVFDRKSDAK) (SEQ ID NO: 63). Además, unpéptido, Sur112-121(KIAKETNNKK)(SEQ ID NO: 51) se unió débilmente a HLA-A11 (Tabla
4).

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Respuestas de CTL restringidos a HLA-A11 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Se probaron PBLs de cinco pacientes de melanoma y dos pacientes de CLL, para determinar la reactividad de células T contra los cuatro péptidos de unión a HLA-A11, Sur53-62, Sur54-62, Sur112-120, y Sur112-121. Se pudieron detectar respuestas contra el péptido derivado de survivina Sur53-62 en PBLs de dos de los pacientes de melanoma, Mel.A11-1, Mel.A11-2, por medio de ELISPOT (Figura 12). Adicionalmente, se pudieron detectar células T específicas de Sur53-62 entre los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) de un ganglio linfático infiltrado por tumor en el paciente Mel.A11-2 (Figura 12). En el paciente Mel.A11-1 se observó una fuerte respuesta inmune contra el péptido de survivina Sur53-62 en cinco muestras diferentes de sangre tomadas durante un período de 2 años (datos no mostrados).

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Identificación de los epítopos de survivina restringidos a HLA-A3 Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-A3

Los péptidos derivados de survivina predichos para la unión a la superfamilia de HLA-A3 se analizaron adicionalmente para determinar la unión a HLA-A3. Solamente dos de los péptidos, Sur112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO: 44) y Sur112-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO: 57) se unieron a HLA-A3 con alta afinidad, similar a la del epítopo viral, la nucleoproteína 265-273 del virus de la gripe A (ILRGSVAHK) (SEQ ID NO: 74) (Tabla 4). Además, dos péptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 47) y Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID NO: 43), se unieron débilmente a HLA-A3.

Algunos de los péptidos sin unión detectable se modificaron en un intento por aumentar la afinidad de unión a HLA-A3. Por consiguiente, se sintetizaron dos péptidos análogos de Sur54-62 y Sur113-122, en los que un mejor residuo de anclaje, leucina (L), reemplazó a la alanina natural (A) en la posición 2. Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID NO: 56) se unió a HLA-A3 con alta afinidad, mientras que Sur113L2 (ILKETNNKKK) (SEQ ID NO: 59) solamente se unió débilmente (Tabla 4). Además, se sintetizaron cuatro péptidos análogos de Sur5-13, Sur13-22, Sur18-27, y Sur53-61, en donde el mejor residuo de anclaje lisina (K) reemplazó a la fenilalanina natural (F) en el extremo C. Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID NO: 54) y Sur18K10 (RISTFKNWPK) (SEQ ID NO: 58) se unieron a HLA-A3 con alta afinidad, mientras que las sustituciones no tuvieron un efecto detectable sobre la unión a HLA-A3 de Sur13K9 (FLKDHRISTK) (SEQ ID NO: 57) y Sur53K9 (DLAQCFFCK) (SEQ ID NO: 55), comparados con los análogos nativos.

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Respuestas de CTL restringidos a HLA-A3 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Se analizaron nueve muestras de pacientes de melanoma (cinco de PBL y cuatro de TIL) para determinar la reactividad inmune contra los dos péptidos nativos de unión a HLA-A3 de alta afinidad Sur112-120 y Sur112-121, así como contra los dos péptidos nativos de unión débil Sur53-62 y Sur95-103. Sin embargo, no se pudieron detectar respuestas inmunes contra estos péptidos mediante ELISPOT en ninguno de los pacientes. Posteriormente, los mismos pacientes se analizaron para determinar la reactividad inmune espontánea contra los tres péptidos modificados derivados de survivina, de alta afinidad, Sur5K9, Sur18K10, y Sur54L2. Se detectó reactividad de CTL contra Sur18K10 en muestras de TIL de tres pacientes, Mel.A3-1, Mel.A3-2, Mel.A3-3 (Figura 13). No se detectaron respuestas contra los otros dos péptidos, Sur5K9 y Sur54L2. Con el fin de verificar adicionalmente estas respuestas, se analizaron PBLs de 18 pacientes adicionales de melanoma para determinar la reactividad de CTLs contra Sur18K10. Entre éstos, se encontraron tres pacientes que respondieron, Mel.A3-4, Mel.A3-5, y Mel.A3-6, dando como resultado un total de seis pacientes que respondieron, entre los veintisiete pacientes analizados (Figura
13).

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Identificación de un epítopo nuevo de survivina restringido a HLA-A2 Unión de péptidos 11-meros derivados de survivina a HLA-A2

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina para detectar los epítopos de péptidos 11-meros de HLA-A2 más probables, utilizando los principales residuos de anclaje específicos de HLA-A2. Se sintetizaron seis péptidos deducidos de survivina, y se examinaron para determinar la unión a HLA-A2. Ninguno de los péptidos examinados se unió con alta afinidad similar a la de un epítopo del control positivo conocido del péptido BMLF_{280-288} del virus Epstein-Barr (GLCTLVAML) (SEQ ID NO: 72) (Tabla 4). La concentración de péptido requerida para la recuperación semi-máxima de HLA-A2 (valor C_{50}) fue de 0.9 \muM para el control positivo. En comparación, los péptidos Sur18-28 (RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO: 67) y Sur86-96 (FLSVKKQFEEL) (SEQ ID NO: 69), se unieron débilmente a HLA-A2 (C_{50} = 69 \muM y 72 \muM, respectivamente). Sin embargo, los dos epítopos de survivina restringidos a HLA-A2 conocidos se unieron de manera similar débilmente a HLA-A2; Sur95-104 (ELTLGEFLKL) (SEQ ID N0: 43) se unió con una afinidad intermedia (C_{50} = 10 \muM), mientras que Sur96-104 (LTLGEFLKL) (SEQ ID NO: 10) se unió sólo débilmente (C_{50} >100 \muM). Los cuatro péptidos 11-meros restantes examinados (Sur4-14 (PTLPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 66), Sur54-64 (LAQCFFCFKEL) (SEQ ID NO: 68), Sur88-98 (SVKKQFEELTL) (SEQ ID NO: 70), y Sur103-113 (KLDRERAKNKI) (SEQ ID NO: 74)), no se unieron a
HLA-A2.

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Respuestas de CTL restringidos a HLA-A2 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Los PBL de diez pacientes de cáncer (dos pacientes de melanoma (Mel), seis de CLL (CLL), y dos de carcinoma de mama (MC)), se analizaron inicialmente para investigar si los dos péptidos 11-meros de unión débil, Sur18-28 y Sur86-96, eran presentados por HLA-A2 y reconocidos por el sistema inmune de los pacientes de cáncer. Se encontraron respuestas de CTL contra Sur18-28 en PBLs de dos de los diez pacientes analizados (CLL-1, CLL-2, Figura 14), mientras que no se pudieron detectar respuestas contra Sur86-96 (datos no mostrados). Con el fin de verificar adicionalmente estas respuestas específicas de Sur18-28, se analizaron PBL de doce pacientes adicionales (siete pacientes de melanoma, un paciente de CLL, y cuatro pacientes de carcinoma de mama) para determinar la reactividad de CTL contra este péptido. Entre éstos, cuatro pacientes (CLL-3, MC-1, MC-2, Mel.A2-1) tenían una actividad inmune específica de Sur18-28 detectable mediante ELISPOT (Figura 14). Por consiguiente, en total, los PBLs de seis de veintidós pacientes analizados, alojaban una respuesta de CTL contra Sur18-28.

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Identificación de epítopos de survivina restringidos a HLA-B7 Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-B7

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina para determinar los péptidos de nueve a diez aminoácidos, con residuos de anclaje de acuerdo con el motivo de unión de péptido a HLA-B7. Se seleccionaron cinco péptidos y se analizaron para determinar su capacidad para estabilizar HLA-B7 en el ensayo de ensamblaje. Se estimaron los valores C_{50} para cada péptido como la concentración de péptido necesaria para la estabilización semi-máxima de HLA-B7 (Tabla 4). Dos péptidos derivados de survivina, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) y sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19) estabilizaron HLA-B7 débilmente, con valores C_{50} por encima de 100 \muM; mientras que sur46-54 (CPTENEPDL) (SEQ ID NO: 6), sur51-59 (EPDLAQCFF) (SEQ ID NO: 7), y sur34-43 (TPERMAEAGF) (SEQ ID NO: 20), no se unieron a HLA-B7 (Tabla 4).

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Respuestas de CTL restringidos a HLA-B7 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Se probaron PBL positivos para HLA-B7 de cinco pacientes de melanoma (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), dos pacientes de CLL (CLL1, CLL54), y dos pacientes de cáncer de mama (mama11, mama15), para determinar la reactividad de células T contra los péptidos de unión débil a HLA-B7, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) y sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19). Se pudo detectar una fuerte respuesta espontánea de CTL contra el péptido derivado de survivina sur6-14 en PBLs de un paciente de CLL, y en un paciente de cáncer de mama (Figura 15). Adicionalmente, se puedo detectar una débil respuesta contra este péptido en el paciente de melanoma mel3 (Figura 15).

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Resumen de las respuestas inmunes restringidas al alelo de HLA a péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Se probaron un número de péptidos derivados de survivina que comprendían de 9 a 11 residuos de aminoácidos, para determinar la unión a los siguientes alelos de HLA: HLA-A1, HLA-A3, HLA-A11, y HLA-B7, utilizando el ensayo de ensamblaje para la unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I descritas en los ejemplos anteriores. Además, se probaron varios de los péptidos para determinar su capacidad para provocar una respuesta inmune de CTL utilizando el ensayo ELISPOT, también como se describe en lo anterior.

En la siguiente Tabla 4, se da un resumen de los resultados, incluyendo los resultados obtenidos en los ejemplos anteriores:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Datos de C_{50} y ELISPOT para péptidos derivados de survivina seleccionados

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Ejemplo 5

Procedimientos de ensayo terapéutico utilizando péptidos derivados de survivina como inmunógenos Resumen

Se vacunaron cinco pacientes de melanoma en fase IV que habían sido previamente muy tratados, con el epítopo de survivina restringido a HLA-A2 modificado, es decir, el péptido Sur1M2, presentado por células dendríticas autólogas en un marco de uso compasivo. Cuatro de los pacientes produjeron una fuerte respuesta de células T a este epítopo, como se midió mediante el ensayo ELISPOT. Además, la tinción in situ de multímero péptido/HLA-A2reveló la infiltración de células que reaccionaban con survivina tanto en las metástasis viscerales como en las de tejido blando. Notoriamente, no se observó toxicidad asociada con la vacunación. Los datos demuestran que es factible inducir una respuesta de células T contra survivina incluso en pacientes de melanoma en etapa tardía, y que estas vacunaciones se toleran bien.

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Materiales y Métodos Criterios de elegibilidad de pacientes y pauta de tratamiento

Todos los procedimientos clínicos estuvieron de acuerdo con la Declaración de Helsinki y todos los pacientes proporcionaron el consentimiento informado antes de la terapia. Los pacientes de melanoma cutáneo o uveal en fase IV fueron elegibles cuando su enfermedad era progresiva a pesar de al menos dos quimio-, inmuno-, o quimioinmuno-terapias diferentes. Además, los pacientes debían ser mayores de 18 años de edad, expresar HLAA*0201, y padecer una enfermedad mensurable validada mediante exploraciones de tomografía computarizada craneal, torácica y abdominal. El índice de Karnofsky de los pacientes tenía que ser del 60% o mejor. No se permitió quimio- y/o inmunoterapia sistémica en las cuatro semanas antes de la vacunación. Los criterios de exclusión importantes fueron la evidencia de metástasis al sistema nervioso central (SNC), enfermedades autoinmunes o infecciosas activas, embarazo y lactancia, así como anormalidad psiquiátrica significativa. Se generaron células dendríticas pulsadas con péptidos como se ha descrito anteriormente (82). Brevemente, se aislaron PBMCs por leucaféresis con Lymphoprep^{MR} (Mycomed Pharma), se congelaron en alícuotas y se almacenaron en nitrógeno líquido. Una semana antes de la vacunación, las PBMCs se descongelaron, se lavaron y se cultivaron en un medio que contenía gentamicina, glutamina, y plasma autólogo inactivado por calor. En los días 1 y 5, se añadieron IL-4 y GM-CSF. Con el fin de diferenciar CDs maduras, se añadieron TNF-\gamma y prostaglandina E2 en el día 6. En el día 7, las células que exhibían características fenotípicas y morfológicas de CDs maduras, es decir, apariencia en velo, y expresión de CD83 = 75%, se pulsaron con un epítopo de survivina_{96-104} restringido a HLA-A2 derivado de survivina modificado, LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 10) (Clinalfa, Suiza) 14. Las células solamente se utilizaron para la vacunación si las pruebas microbiológicas de las muestras tomadas de los cultivos en los días 1 y 5 probaron que eran
estériles.

Los pacientes se vacunaron a intervalos de 7 días para las primeras dos vacunaciones, seguidos por intervalos de 28 días para las vacunaciones adicionales. Se resuspendieron un total de 10-20x106 CDs maduras, pulsadas por survivina_{90-104} en PBS, que contenía seroalbúmina humana al 1% y se inyectaron intradérmicamente en alícuotas de 1.5x106 CDs por sitio de inyección en las regiones ventromediales de los muslos cerca de los ganglios linfáticos regionales. Se excluyeron los miembros donde se hubieran eliminado y/o irradiado los ganglios linfáticos de drenaje. Se repitió la leucaféresis después de 5 vacunaciones en ausencia de un deterioro grave del estado de salud del paciente o de la presentación de metástasis en el SNC.

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Medida de las respuestas clínicas e inmunológicas

Se llevaron a cabo exploraciones por tomografía computarizada (TC) antes de la vacunación y cada tres meses posteriormente o en el caso de signos clínicos graves de evolución de la enfermedad. Las respuestas inmunológicas se siguieron mediante el ensayo ELISPOT, utilizando las PBMCs obtenidas cada tres meses, para detectar la liberación de IFN-\gamma específico de survivina_{96-104}. Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, las PBMCs se estimularon una vez in vitro a una concentración de 1x10^{6} células por ml en placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca) en medio ex-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), suplementado con suero humano inactivado por calor al 5% y 2 mM de L-glutamina en presencia de 10 \muM del péptido. Dos días después, se añadieron 40 IU/ml de interleuquina-2 recombinante (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemania). Después de 10 días las células se probaron para determinar su reactividad. Para este fin, placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Glostrup, Dinamarca) se recubrieron con anticuerpo anti-IFN-\gamma (1-D1K, Mabtech, Suecia). Se añadieron linfocitos a 10^{4}-10^{5} células en 200 \mul de medio ex-vivo por pocillo junto con 10^{4} células T2 y los péptidos relevantes a una concentración final de 2 \muM. Después de una incubación durante la noche a 37ºC y de dos lavados, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado (7-B6-1-Biotina, Mabtech, Suecia); su unión específica se visualizó utilizando fosfatasa alcalina-avidina junto con el sustrato respectivo (GibcoBRL). La reacción se terminó tras la aparición de manchas púrpuras oscuras, que se cuantificaron utilizando el Sistema AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.).

También se siguieron in situ los linfocitos T CD8+ que reaccionan con survivina_{96-104}/HLA-A*0201, tanto en los sitios de vacunación como en las metástasis viscerales, de tejido blando o cutáneas, por medio de complejos multiméricos survivina_{96-104}/HLA-A*0201. Los sitios de vacunación se cortaron 24 horas después de la inyección intradérmica en todos los pacientes, mientras que las lesiones metastásicas solamente se eliminaron en pacientes seleccionados, si eran fácilmente accesibles (pacientes KN y GB), o se eliminaron durante un intento curativo (paciente WW). El procedimiento de tinción para los complejos multiméricos péptido/MHC se ha descrito recientemente (68). Los complejos multiméricos survivina_{96-104}/HLA-A*0201 se generaron mediante la introducción de un sitio de reconocimiento para la biotinilación enzimática en el extremo 5' de los dominios extracelulares de HLA-A*0201 (residuos 1-275). La proteína recombinante se purificó mediante cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G25, Pharmacia, Erlangen, Alemania) y de intercambio iónico (mono-Q, Pharmacia), y se plegó in vitro mediante dilución en presencia de los péptidos respectivos y \beta2-microglobulina. Después de la filtración en gel en una columna de Sephadex G25, la proteína se multimerizó con estreptavidina-FITC conjugada con moléculas de dextrano (amablemente proporcionadas por L. Winther, DAKO, Copenhague, Dinamarca), para generar complejos multivalentes HLA-dextrano. Las secciones crioconservadas de las muestras respectivas se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fría durante 5 minutos. Todos los pasos de incubación se llevaron a cabo en la oscuridad a temperatura ambiente como sigue: (i) 45 minutos de un anticuerpo anti-CD8 (1:100, clon HIT8a, Pharmingen, San Diego, CA), (ii) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; código 115-165-100, Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos, y finalmente (iii) los multímeros durante 75 minutos. Entre cada paso los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0.1%. Finalmente, los portaobjetos se montaron en Vectashield y se observaron con un Microscopio Confocal Leica (TCS 4D, Leica, Mannheim,
Alemania).

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Resultados Características de pacientes, toxicidad y evolución clínica

Se inscribieron cinco pacientes de melanoma en etapa IV muy avanzado, dos que padecían melanoma uveal, uno de melanoma de tejido blando, y los dos restantes con melanoma cutáneo. Debido a la manifestación de metástasis cerebrales sintomáticas, un paciente se sacó de la terapia después de solamente dos vacunaciones. Los otros cuatro pacientes recibieron hasta 15 vacunaciones. Un paciente murió de paro cardíaco en un estado libre de tumor después de la resección quirúrgica de las metástasis restantes. Otro paciente se sacó de la terapia después de 10 vacunaciones debido a la aparición de metástasis viscerales (RW). Un paciente permaneció en el estudio después de 15 vacunaciones. Las características detalladas de los pacientes, la terapia previa, el número de vacunaciones, y el estado de supervivencia, se resumen en la Tabla 5.

No se presentaron toxicidades principales. Por consiguiente, la hemoglobina, leucocitos y trombocitos, así como lactato-deshidrogenasa, creatinina, y colinesterasa, no estuvieron influenciados por la terapia de vacunación (Fig. 16). No se observaron signos de toxicidad sistémica o local en los sitios de inyección. Además, no hubo detección de deterioro en la curación de heridas, desórdenes hemorrágicos, disfunción cardíaca, vasculitis, o enfermedad inflamatoria del intestino. En un paciente (WW), se pudieron estabilizar las metástasis de hígado previamente existentes con la terapia de vacunación, pero todavía se presentó una nueva metástasis suprarrenal. Desafortunadamente, este paciente murió debido a paro cardíaco, incluso cuando estaba libre del tumor después de la cirugía curativa. Se detectó una metástasis de cerebro en el paciente PB solamente cuatro semanas después de iniciarse la vacunación. Por consiguiente, este paciente se tuvo que excluir de vacunaciones adicionales después de solamente dos inyecciones de CD. Los otros tres pacientes demostraron una evolución lenta de la enfermedad metastásica sin un deterioro sustancial en su estado general de salud. Notoriamente, para el paciente KN, se pudo alcanzar una supervivencia global de 13 meses (desde el inicio de la vacunación hasta el fallecimiento) a pesar de una pesada carga metastásica y una rápida evolución de la enfermedad al principio de la vacunación. El paciente GB permaneció en el protocolo 14 meses después de iniciarse la vacunación con CDs pulsadas con el péptido de survivina. Sin embargo, se debe observar que ambos pacientes (RW y GB) recibieron un tratamiento localizado adicional para el control del tumor, ya sea radiación de tumores subcutáneos (RW), o bien quimioterapia local (GB).

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Respuestas de células T CD8+ específicas de survivina

Con el fin de seguir la cinética de las respuestas de células T citotóxicas, se probaron PBMCs obtenidas antes de y tres meses después de la vacunación para determinar su reactividad al epítopo de survivina_{96-104} modificado mediante ELISPOT para IFN-\gamma. Antes del análisis, las PBMCs se estimularon una vez in vitro para aumentar la sensibilidad de este ensayo. En los cuatro pacientes probados, fue evidente una inducción de células T reactivas con survivina_{96-104} (Fig. 17). El análisis de la reactividad a otros péptidos de survivina restringidos a HLA-A*0201, es decir, survivina_{96-104} no modificad y el epítopo Sur9 adyacente, demostró una respuesta de células T contra estos péptidos en dos de los pacientes (KN y RW) (datos no mostrados).

Se ha cuestionado repetidamente el valor de pronóstico y clínico de las mediciones de las respuestas de células T específicas de tumor en sangre periférica; por lo tanto, también se probó la presencia de linfocitos T CD8+ reactivos con survivina_{96- 104}/HLA-A*0201 entre los linfocitos infiltrantes de tumor in situ, mediante tinción de multímero péptido/MHC. Con el fin de validar este método, primero se analizaron muestras de tejido de reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado que se presentaron en el sitio de la vacunación en 24 horas. Este análisis confirmó las observaciones anteriores de que las inyecciones intradérmicas de CDs pulsadas con péptido inducen un fuerte infiltrado de células T inflamatorias específicas del péptido. Posteriormente, se aplicó el procedimiento de tinción de multímero péptido/MHC en metástasis de tejido blando y viscerales, que reveló la presencia de células reactivas con survivina_{96-104}/HLA-A*0201 entre el infiltrado de CD8+. Esta observación sugiere que la vacunación no solamente induce a las células T con una especificidad deseada, sino que también las dota con la capacidad de recuperación necesaria.

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<110> Straten, Eivind Per Thor

{}\hskip1cm Andersen, Mads Hald

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<120> PÉPTIDOS DERIVADOS DE SURVIVINA Y USO DE LOS MISMOS

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<170> FastSEQ for Windows versión 4.0

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\hskip0,7cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

67

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

70

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

71

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

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\hskip0,7cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

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\hskip0,7cm

75

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<210> 61

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

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\hskip0,7cm

76

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

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\hskip0,8cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

880

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Sur53K9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Péptido Sur53K9

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<400> 82

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\hskip0,8cm

96

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<210> 83

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido Sur53K9

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<400> 83

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\hskip0,7cm

97

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<210> 84

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido Sur53K9

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<400> 84

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\hskip0,7cm

98

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<210> 85

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido Sur53K9

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<400> 85

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\hskip0,7cm

99

Claims

1. Un péptido de epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epítopo la secuencia RISTFKNWPK como se especifica en SEQ ID NO: 58 y al menos una de las siguientes características:

(i): capaz de unirse a la molécula HLA-A3 de clase I con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA

(ii): capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o

(iii): capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que reaccionan con el péptido del epítopo.

2. Un péptido según la reivindicación 1 que tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 30 \muM.

3. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 20 \muM.

4. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende como máximo 20 residuos de aminoácidos.

5. Un péptido según la reivindicación 4 que comprende como máximo 10 residuos de aminoácidos.

6. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es capaz de inducir células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs.

7. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es capaz de inducir células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

8. Un péptido según la reivindicación 7 donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

9. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es capaz de inducir células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa, teniendo dichas células productoras de INF-\gamma efecto citotóxico contra células que expresan survivina de una línea celular de cáncer, incluyendo una línea celular seleccionada del grupo que consiste en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 y la línea celular de melanoma FM3.

10. Una composición farmacéutica que comprende el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 10, comprendiendo dicha composición una combinación de dos o más péptidos de epítopos restringidos a MHC de clase I derivados de survivina, que interaccionan cada uno de forma específica con una molécula de HLA diferente y que tienen al menos una de las siguientes características:

(i): capaz de unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringida con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA

12. Una composición farmacéutica según la reivindicación 11, en donde cada péptido de epítopo interacciona de forma específica con una molécula HLA-A de MHC de clase I, una molécula HLA-B de MHC de clase I o una molécula HLA-C de MHC de clase I.

13. Una composición farmacéutica según la reivindicación 11 ó 12, en donde dicha molécula HLA-A de MHC de clase I incluye HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(w19), HLA-A30(w19), HLA-A31(w19), HLA-A32(w19), HLA-Aw33(w19), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68(28), HLA-A69(28).

14. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde dicha molécula HLA-B de MHC de clase I incluye cualquiera de las siguientes: HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 y HLA-Bw47.

15. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde dicha molécula HLA-C de MHC de clase I incluye cualquiera de las siguientes: HLA-Cw1, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 y HLA-Cw16.

16. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11-15 que comprende un péptido de epítopo, que es una secuencia nativa de survivina de una especie de mamífero.

17. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, que comprende un péptido de epítopo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 66.

18. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, que comprende un péptido de epítopo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 57.

19. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en donde los dichos péptidos de epítopo son capaces de inducir células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 10 por 10^{4} PBLs.

20. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11-19, en donde los dichos péptidos de epítopo son capaces de inducir células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

21. Una composición farmacéutica según la reivindicación 20, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

22. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-21, que comprende un péptido de epítopo que está modificado postraduccionalmente.

23. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-22, que comprende un péptido fosforilado.

24. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-23, que comprende además una proteína o fragmento peptídico inmunogénico seleccionado de una proteína o fragmento peptídico que no pertenecen a o derivan de la familia de proteínas de survivina.

25. Una composición farmacéutica según la reivindicación 24, en donde la proteína o fragmento peptídico inmunogénicos que no pertenecen a o derivan de la familia de proteínas de survivina es una proteína, o un fragmento peptídico de la misma, implicada en la regulación de la apoptosis celular.

26. Una composición farmacéutica según la reivindicación 24 ó 25, en donde la proteína o fragmento peptídico inmunogénicos que no pertenecen a o derivan de la familia de proteínas de survivina es Bcl-2 o un fragmento peptídico de la misma.

27. Una composición farmacéutica según la reivindicación 24 ó 25, en donde la proteína o fragmento peptídico inmunogénicos que no pertenecen a o derivan de la familia de proteínas de survivina es un miembro de la familia de proteínas IAP o un fragmento peptídico de la misma.

28. Una composición farmacéutica según la reivindicación 27, en donde dicho miembro de la familia de proteínas IAP es ML-IAP.

29. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 24, 25, 27 y 28, en donde la proteína o fragmento peptídico inmunogénicos que no pertenecen a o derivan de la familia de proteínas de survivina se selecciona del grupo que comprende SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85.

30. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-29 que comprende epítopos restringidos a HLA de clase I y HLA de clase II.

31. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-30 que comprende un adyuvante.

32. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-30, que es una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia de células T que reaccionan con survivina entre PBLs o en tejido
tumoral.

\newpage

33. Una vacuna multiepítopo que comprende un péptido de epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epítopo la secuencia RISTFKNWPK como se especifica en SEQ ID NO: 58 y al menos una de las siguientes características:

(i): capaz de unirse a una molécula HLA-A3 de clase I a la que está restringido con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA,

(iii): capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que reaccionan con el péptido de epítopo.

34. Una vacuna multiepítopo según la reivindicación 33, que incluye una combinación de epítopos peptídicos derivados de survivina que dependen del tipo de tejido del paciente determinado.

35. Una vacuna multiepítopo según la reivindicación 33 ó 34, en donde la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmune contra una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

36. Una vacuna multiepítopo según la reivindicación 35, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

37. Una vacuna multiepítopo según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en donde la vacuna provoca la producción en el sujeto vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas.

38. Uso de un péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con tratamiento contra el cáncer convencional tal como radioterapia o quimioterapia.