JP2007515393A - Ｗｔ１特異的な免疫治療のための組成物および方法 - Google Patents

Ｗｔ１特異的な免疫治療のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

白血病およびガン等の悪性疾患の治療のための組成物および方法を開示する。この組成物は、ＷＴ１ポリヌクレオチド、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドを提示する抗原提示細胞；ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体；またはＷＴ１ポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞のうちの１つ以上を含む。このような組成物は、例えば、悪性疾患の予防および治療のために用いられ得る。本発明によって、白血病およびガン等の疾患の診断および治療のための組成物および方法が得られる。本発明によって、天然のＷＴ１の免疫原性部分を含むポリペプチド、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なるその変異体であって、その変異体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が実質的に低下しないように異なる変異体が得られる。

Description

（連邦政府の支援による研究または開発に関する声明）
本発明は、ＮＩＨ ＳＢＩＲ Ｐｈａｓｅ Ｉ 認可番号ＩＲ４３ ＣＡ８１７５２−０１Ａ１として一部は合衆国政府の支援によって行なわれた。合衆国政府は本発明に対して一定の権利を有し得る。
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は概して、白血病およびガン等の悪性疾患の免疫療法に関する。本発明はさらに詳細には、ＷＴ１に対する免疫応答を生成または増強するための組成物、および悪性疾患を予防および／または治療するためのかかる組成物の使用に関する。
（関連技術の説明）
ガンおよび白血病は、米国および世界中で重大な健康上の問題である。このような疾患の検出および治療においては進歩があるが、ガンおよび白血病の予防または治療のために利用可能なワクチンも他の普遍的に成功を収める方法も現在はない。この疾患の管理は現在、初期の診断および積極的な治療の組み合わせに依存するが、これには、外科手術、放射線療法、化学療法およびホルモン療法のような種々の治療のうちの１つ以上を挙げることができる。特定のガンのための治療の経過はしばしば、特定の腫瘍マーカーの分析を含む、種々の診断パラメーターに基づいて選択される。しかし、確立されたマーカーの使用はしばしば、説明が困難な結果につながり、多くのガン患者では引き続き高い死亡率が認められている。
免疫療法は、ガンおよび白血病の治療および生存を実質的に改善する能力を有する。近年のデータでは、白血病は、骨髄移植（例えば、ドナーのリンパ球注入）の状況では免疫療法によって治癒可能であることが実証されている。このような療法は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫応答の生成または増強を改善し得る。しかし、現在のところ、ＴＡＡは比較的わずかしか知られておらず、このような抗原に対する免疫応答の生成が治療上有益であるということは、まれな例外を除いては示されていない。
従って、白血病およびガンの予防および治療のための改良方法が当該分野では必要である。本発明はこれらの必要性を満たし、さらに他の関連の利点を提供する。
（発明の簡潔な要旨）
簡潔に述べれば、本発明によって、白血病およびガン等の疾患の診断および治療のための組成物および方法が得られる。１つの態様では、本発明によって、天然のＷＴ１の免疫原性部分を含むポリペプチド、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なるその変異体であって、その変異体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が実質的に低下しないように異なる変異体が得られる。本発明の特定の実施形態では、このポリペプチドは、ＷＴ１のアミノ酸２〜２８１内に含まれる、ＷＴ１の少なくとも免疫原性部分を含む。特定の実施形態では、このポリペプチドは、未改変のＷＴ１ポリペプチドの１６以下の連続するアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、このポリペプチドは、未改変のＷＴ１ポリペプチドのアミノ酸残基１〜１７４の免疫原性部分またはその変異体を含み、ここでこのポリペプチドは、この未改変のＷＴ１ポリペプチドのアミノ酸１７５〜４４９内に存在する１６以下の連続するアミノ酸残基を含む。この免疫原性部分は好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはクラスＩＩ分子に結合する。特定の実施形態では、このポリペプチドは（ａ）表ＩＩ−ＸＬＶＩのうちのいずれか１つ以上に挙げられる配列、（ｂ）１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なる前述の配列の変異体であって、その変異体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が実質的に低下しないように異なる変異体、ならびに（ｃ）上記に挙げられたポリペプチドの模倣物であって、その模倣物が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が実質的に低下しないような模倣物、からなる群より選択される配列を含む。
他の実施形態では、このポリペプチドは、（ａ）ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３４）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（配列番号８８）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号４９および２５８）、ＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（配列番号１９９および２９６）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（配列番号１９８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（配列番号１４７および２８４）、ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（配列番号３５および２５５）、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８５および２９３）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号２４１）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ（配列番号４１１）、配列番号４１４〜４５０、ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号４５１）、（ｂ）１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なる前述の配列の変異体であって、その変異体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が実質的に低下しないように異なる変異体、ならびに（ｃ）上記に挙げられたポリペプチドの模倣物であって、その模倣物が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が実質的に低下しないような模倣物、からなる群より選択される配列を含む。模倣物は、１つ以上のアミノ酸模倣物と組み合わせてアミノ酸を含んでもよく、または全体として非ペプチド模倣物であってもよい。
さらなる態様では、本発明によって、ＷＴ１タンパク質の免疫原性部分の変異体を含むポリペプチドが得られるが、この変異体は免疫原性部分内の１〜３の間のアミノ酸位置での置換に起因してこの免疫原性部分とは異なり、その結果この変異体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力は未改変のＷＴ１タンパク質に対して実質的に低下しないかまたは増強される。
本発明はさらに、上記のようなＷＴ１ポリペプチドをコードするＷＴ１ポリヌクレオチドを提供する。
他の態様では、本発明は薬学的組成物およびワクチンを提供する。薬学的組成物は、上記のようなポリペプチドもしくは模倣物、および／または（ｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチドと特異的に反応するＴ細胞、または（ｉｖ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの１つ以上を、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて含んでもよい。ワクチンは、上記のようなポリペプチド、および／または（ｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチドを発現する抗原提示細胞、または（ｉｉｉ）抗イディオタイプ抗体、および非特異的な免疫応答エンハンサーのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、未改変のＷＴ１ポリペプチドのうち２３未満連続するアミノ酸残基、好ましくは１７未満のアミノ酸残基が、このような薬学的組成物およびワクチン内に使用されるＷＴ１ポリペプチド内に存在する。免疫応答エンハンサーは、アジュバントであってもよい。好ましくは、免疫応答エンハンサーは、Ｔ細胞応答を増強する。
本発明はさらに、患者において免疫応答を増強または誘導するための方法を提供するが、この方法は、上記のような薬学的組成物またはワクチンを患者に投与する工程を包含する。特定の実施形態では、患者はヒトである。
本発明はさらに、患者における悪性疾患の進行を阻害するための方法を提供するが、この方法は、上記のような薬学的組成物またはワクチンを患者に投与する工程を包含する。悪性疾患としては、限定はしないが、白血病（例えば、急性骨髄性、急性リンパ球性、および慢性骨髄性）およびガン（例えば、乳癌、肺癌、甲状腺癌または胃腸の癌または黒色腫）が挙げられる。患者は、必ずしもではないが、悪性疾患に罹患している可能性があり、薬学的組成物またはワクチンの投与は、このような疾患の発現を阻害し得、または既存の疾患の進行および／もしくは転移を阻害し得る。
本発明はさらに、他の態様において、骨髄および／もしくは末梢血、またはその画分からＷＴ１を発現する細胞を取り出すための方法を提供し、この方法は、骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分を、ＷＴ１ポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞と接触させる工程を包含し、この接触工程は、ＷＴ１陽性細胞を、この骨髄、末梢血または画分における骨髄性細胞またはリンパ細胞数の１０％未満まで、好ましくは５％未満、さらに好ましくは１％未満まで除去することを可能にするのに十分な条件および時間で行なう。骨髄、末梢血および画分は、ＷＴ１発現に関連する疾患に罹患している患者から得てもよいし、またはこのような疾患に罹患していないヒトもしくは非ヒト哺乳動物から得てもよい。
関連の態様では、本発明は患者における悪性疾患の進行を阻害するための方法を提供し、この方法は、上記のような骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分を患者に対して投与する工程を包含する。このような骨髄、末梢血または画分は、自系であってもよいし、または関連もしくは非関連のヒトもしくは非ヒト動物（例えば、同系、同種異系）由来であってもよい。
他の態様では、本発明は、Ｔ細胞を刺激（またはプライミング）および／または増殖するための方法を提供し、この方法は、Ｔ細胞の刺激および／または増殖を可能にするのに十分な条件および時間でＴ細胞をＷＴ１ポリペプチドと接触させる工程を包含する。このようなＴ細胞は、ＷＴ１特異的Ｔ細胞に自系であっても、同種異系であっても、同系であっても、または関係が無くてもよく、インビトロまたはインビボで刺激されてもよい。増殖されたＴ細胞は、特定の実施形態では、骨髄内、末梢血にまたは骨髄もしくは末梢血の画分に存在してもよく、（その必要はないが）クローン性であってもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、刺激および／または増殖の間に哺乳動物に存在し得る。ＷＴ１特異的Ｔ細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入物内で用いられてもよい。
関連の態様では、上記のように調製されたＴ細胞を患者に投与する工程を包含する、患者における悪性疾患の進行を阻害するための方法が提供される。このようなＴ細胞は、特定の実施形態では、自系であっても、同系であっても、同種異系であってもよい。
本発明はさらに、他の態様において、患者におけるＷＴ１発現に関連する悪性疾患のための免疫または治療の有効性をモニターするための方法を提供する。このような方法は、患者における抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の応答をモニタリングすることに基づく。このような特定の態様では、方法は以下の工程を含んでもよい：（ａ）第一の生物学的サンプルと、（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞：のうちの１つ以上とをインキュベートする工程であって、この第一の生物学的サンプルが治療または免疫の前に患者から得られ、このインキュベーションが免疫複合体を形成することを可能にするのに十分な条件および時間で行なわれる工程と；（ｂ）ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する、ＷＴ１ポリペプチドと抗体との間で形成された免疫複合体を生物学的サンプルにおいて検出する工程と；（ｃ）治療または免疫後に同じ患者から得られた第二の生物学的サンプルを用いて工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程と；（ｄ）第一および第二の生物学的サンプルにおいて検出される免疫複合体の数を比較して、それから患者における治療または免疫の有効性をモニタリングする工程。
上記の方法の特定の実施形態では、検出工程は、（ａ）免疫複合体と、免疫複合体に結合し得る検出試薬とをインキュベートする工程であって、この検出試薬がレポーター基を含む工程と、（ｂ）未結合の検出試薬を除去する工程と、（ｃ）レポーター基の有無を検出する工程とを包含する。検出試薬は、例えば、ＷＴ１ポリペプチドまたはプロテインＡのような分子に特異的に結合する抗体に結合し得る、二次抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでもよい。他の実施形態では、レポーター基は、ＷＴ１ポリペプチドに結合され、検出工程は、未結合のＷＴ１ポリペプチドを除去する工程と、引き続いてレポーター基の有無を検出する工程とを包含する。
さらなる態様では、患者におけるＷＴ１発現をともなう悪性疾患のための免疫または治療の有効性をモニターするための方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）第一の生物学的サンプルと、（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞：のうちの１つ以上とをインキュベートする工程であって、この生物学的サンプルがＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、治療または免疫の前に患者から得られ、このインキュベーションがＴ細胞の特異的な活性、増殖および／または溶解を可能にするのに十分な条件および時間で行なわれる工程と；（ｂ）Ｔ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を検出する工程と；（ｃ）ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第二の生物学的サンプルを用いて工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程であって、この第二の生物学的サンプルが治療または免疫後に同じ患者から得られる工程と；（ｄ）この第一および第二の生物学的サンプルにおけるＴ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を比較して、それから患者における治療または免疫の有効性をモニタリングする工程。
本発明はさらに、患者におけるＷＴ１発現をともなう悪性疾患の進行を阻害するための方法を提供するが、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞と、（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞：のうちの１つ以上とを、このＴ細胞が増殖するようにインキュベートする工程と；（ｂ）この増殖されたＴ細胞の有効量を患者に投与して、それによってこの患者における悪性疾患の進行を阻害する工程。特定の実施形態では、Ｔ細胞をインキュベートする工程を１回以上繰り返してもよい。
他の態様では、本発明は、患者におけるＷＴ１発現をともなう悪性疾患の進行を阻害するための方法を提供するが、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞と、（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞：のうちの１つ以上とを、このＴ細胞が増殖するようにインキュベートする工程と；（ｂ）増殖された１つ以上の細胞をクローニングする工程と；（ｃ）このクローニングされたＴ細胞の有効量をこの患者に投与する工程。
他の態様では、患者におけるＷＴ１発現をともなう悪性疾患の有無を検出するための方法を提供するが、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞と、（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞：のうちの１つ以上とをインキュベートする工程と；（ｂ）Ｔ細胞の特異的活性化の有無を検出して、これによってＷＴ１発現をともなう悪性疾患の有無を検出する工程。特定の実施形態では、この検出工程は、Ｔ細胞の増殖の有無を検出する工程を包含する。
さらなる態様では、本発明は、患者におけるＷＴ１発現をともなう悪性疾患の有無を検出するための方法を提供するが、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルと、（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞：のうちの１つ以上とをインキュベートする工程であって、このインキュベーションが免疫複合体の形成を可能にするのに十分な条件および時間で行なわれる工程と；（ｂ）ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する、ＷＴ１ポリペプチドと抗体との間で形成される免疫複合体を、生物学的サンプル中で検出して；これからＷＴ１発現を伴う悪性疾患の有無を検出する工程。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。本明細書に開示される全ての引用文献は、各々が個々に組み込まれているかのようにその全体が参考文献として本明細書に組み込まれる。
（発明の詳細な説明）
本明細書で引用される、／または出願データシート（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｓｈｅｅｔ）に列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、その全体が参考文献として本明細書に組み込まれる。
上記のとおり、本発明は一般に、悪性疾患の免疫療法および診断のための組成物および方法に関する。本明細書に記載される組成物としては、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、樹状細胞）、ＷＴ１ポリペプチドに結合する抗体のような因子、および／またはＷＴ１に特異的な免疫系細胞（例えばＴ細胞）を挙げることができる。本発明のＷＴ１ポリペプチドは一般に、ウィルムス腫瘍遺伝子産物（ＷＴ１）またはその変異体の少なくとも一部を含む。本発明の核酸配列は一般に、このようなポリペプチドの全てもしくは一部をコードするか、またはこのような配列に対して相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。抗体は一般に、免疫系タンパク質、またはその抗原結合フラグメントであって、ＷＴ１ポリペプチドの一部に結合し得るものである。このような組成物内で使用され得るＴ細胞は一般に、ＷＴ１ポリペプチドに特異的なＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）である。本明細書に記載される特定の方法はさらに、本明細書に提供されるようなＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞を使用する。
本発明は、ウィルムス腫瘍（ＷＴ）遺伝子産物（例えば、ＷＴ１）に対して惹起された免疫応答がＷＴ１遺伝子発現の増大によって特徴付けられる悪性疾患に罹患している患者に予防的および／または治療的な利点を提供し得るという発見に基づく。このような疾患としては、限定はしないが、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ求性白血病（ＡＬＬ）および小児ＡＬＬ）、ならびに多くのガン、例えば、肺癌、乳癌、甲状腺癌および胃腸の癌および黒色腫が挙げられる。ＷＴ１遺伝子はもともと、ウィルムス腫瘍を有する患者における染色体１１ｐ１３での細胞形成欠失に基づいて同定されて、単離された（Ｃａｌｌら、米国特許第５，３５０，８４０号を参照のこと）。この遺伝子は、１０のエキソンからなり、ジンクフィンガー転写因子をコードしており、マウスおよびヒトのＷＴ１タンパク質の配列は、図１および配列番号３１９および３２０に示される。
（ＷＴ１ポリペプチド）
本発明の状況では、ＷＴ１ポリペプチドとは、本明細書に記載されるように、未改変のＷＴ１（すなわち遺伝子的に改変されていない生物体によって発現されたＷＴ１タンパク質）の少なくとも免疫原性部分、またはその変異体を含むポリペプチドである。ＷＴ１ポリペプチドは、それが未改変のタンパク質の少なくとも免疫原性部分またはその変異体を含む条件であれば、任意の長さであってもよい。言い換えれば、ＷＴ１ポリペプチドは、オリゴペプチド（すなわち、ペプチド結合によって結合された、比較的少数のアミノ酸残基、例えば８〜１０残基からなる）であっても、全長ＷＴ１タンパク質（例えば、ヒトまたはマウスのような非ヒト動物に存在する）であっても、中間サイズのポリペプチドであってもよい。特定の実施形態では、未改変のＷＴ１ポリペプチドの少数の連続するアミノ酸残基を含むＷＴ１ポリペプチドの使用が好ましい。このようなポリペプチドは、Ｔ細胞応答の生成が所望される特定の用途に好ましい。例えば、このようなＷＴ１ポリペプチドは、天然のＷＴ１ポリペプチドのうち２３未満、好ましくは１８以下、さらに好ましくは１５以下の連続するアミノ酸残基を含んでもよい。未改変のＷＴ１ポリペプチドの９つ連続するアミノ酸残基を含むポリペプチドが一般に、このような目的に適切である。未改変のタンパク質および／または異種の配列に由来するさらなる配列が任意のＷＴ１ポリペプチド内に存在してもよく、このような配列はさらなる免疫原性の特性または抗原性の特性を（必須ではないが）有してもよい。本明細書に提供されるポリペプチドは他のポリペプチドまたは非ポリペプチド化合物とさらに会合（共有結合的にまたは非共有結合的に）されてもよい。
本明細書において用いる場合、「免疫原性部分（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｏｒｔｉｏｎ）」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）ポリペプチドの一部をいう。特定の好ましい免疫原性部分がＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの分子に結合する。本明細書において用いる場合、免疫原性部分は、このような結合が当該分野で公知の任意のアッセイを用いて検出可能である場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対して「結合する（ｂｉｎｄ ｔｏ）」と言われる。例えば、あるポリペプチドがＭＨＣクラスＩに結合する能力は、ＭＨＣクラスＩ／β２ｍ／ペプチド異種三量体複合体への１２５Ｉ標識されたβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）の取り込みを生じる能力をモニタリングすることによって直接評価可能である（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４を参照のこと）。あるいは、当該分野で公知の機能的ペプチド競合アッセイを使用してもよい。特定の免疫原性部分は、表ＩＩ〜ＸＩＶのうちの１つ以上に列挙される配列のうちの１つ以上を有する。代表的な免疫原性部分としては、限定はしないが、ＲＤＬＮＡＬＬＰＡＶＰＳＬＧＧＧＧ（ヒトＷＴ１の残基６〜２２；配列番号１）、ＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ（ヒトおよびマウスＷＴ１の残基１１７〜１３９；それぞれ配列番号２および３）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡＧＳＳＳＳＶＫＷＴＥ（ヒトＷＴ１残基２４４〜２６２；配列番号４）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（ヒトＷＴ１残基２４４〜２５２；配列番号８８）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（ヒトおよびマウスＷＴ１の残基２３５〜２４３；それぞれ配列番号４９および２５８）、ＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（マウスＷＴ１残基１３６〜１４４；配列番号２９６）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（ヒトＷＴ１残基１３６〜１４４；配列番号１９８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（ヒトおよびマウスＷＴ１の残基２２５〜２３３；それぞれ配列番号１４７および２８４）；ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（マウスＷＴ１残基１０〜１８；配列番号２５５）；ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（ヒトおよびマウスＷＴ１の残基１２６〜１３４；それぞれ配列番号１８５および２９３）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（ヒトＷＴ１残基３７〜４５；配列番号２４１）、またはＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ（ヒトＷＴ１残基３７〜４６；配列番号４１１）が挙げられる。さらなる免疫原性部分は、配列番号４１４〜４５１に示される。さらなる免疫原性部分は、本明細書に提供され、その他は一般に、周知の技術、例えば、Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、２４３〜２４７（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに引用された参考文献にまとめられる技術を用いて同定され得る。免疫原性部分を同定するための代表的な技術は、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程を包含する。天然のＷＴ１ポリペプチドの免疫原性部分とは、このような抗血清および／またはＴ細胞と、実質的に全長ＷＴ１の反応性以上のレベルで反応する（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）部分である。言い換えれば、免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、全長ポリペプチドの反応性と同様かまたはそれ以上のレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは一般に、当業者に周知の方法、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載の方法を用いて行なうことができる。
あるいは、免疫原性部分は、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドモチーフについて検索する、Ｔｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．７：９３〜１００，１９８８；Ｄｅａｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５〜１５５，１９９６を参照のこと）のようなコンピューター分析を用いて同定され得る。マウスおよびヒトのクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣに結合するのに適切なモチーフを有するＣＴＬペプチドは、ＢＩＭＡＳ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４）および他のＨＬＡペプチド結合予測分析に従って同定され得る。あるいは、特定のＭＨＣ分子に結合する免疫原性部分は、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８〜２２８，１９９５に記載のような規定のペプチド結合モチーフを用いることによって同定され得る。マウスおよびヒトのクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子に対するペプチド結合を確認するために、当該分野で公知のペプチド結合アッセイを用いてもよい。免疫原性を確認するために、ペプチドは、ＨＬＡ Ａ２または他のトランスジェニックマウスモデル、および／または樹状細胞、線維芽細胞もしくは末梢血細胞を用いるインビトロ刺激アッセイを用いて試験され得る。
上記のとおり、組成物は、未改変のＷＴ１タンパク質の変異体を含んでもよい。本明細書において用いる場合、ポリペプチド「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、そのポリペプチドの免疫原性が保持される（すなわち、その変異体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する能力が未改変のポリペプチドに対して実質的に低下していない）ような、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において天然のポリペプチドとは異なるポリペプチドである。言い換えれば、ある変異体が抗原特異的な抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する能力は、未改変のポリペプチドに対して増強されても不変であってもよいし、または未改変のポリペプチドに対して５０％未満まで、好ましくは２０％未満まで、低下されていてもよい。１実施形態では、変異体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力は、天然のポリペプチドに対して１０％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％まで低下されてもよい。このような変異体は一般に、上記のポリペプチド配列の１つを改変すること、ならびにこの改変されたポリペプチドと本明細書に記載のような抗血清および／またはＴ細胞との反応性を評価することによって同定され得る。本発明の１実施形態では、変異体は、その変異体がヒトまたはマウスのＨＬＡ分子に結合する能力を評価することによって同定され得る。１つの好ましい実施形態では、変異体ポリペプチドは、この変異体ポリペプチドがクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５０１、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−ＣＷ０３、ＨＬＡ−ＣＷ０６、またはＨＬＡ−ＣＷ０７に結合する能力が野生型（改変されていない）ＷＴ１ポリペプチドの能力に対して増大されるような改変を有する。さらなる実施形態では、アミノ酸１〜２８１のＷＴ１のＮ末端部分は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５０１、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−ＣＷ０３、ＨＬＡ−ＣＷ０６、またはＨＬＡ−ＣＷ０７に結合し得るそのなかの多数のポリペプチドの能力が野生型（改変されていない）ＷＴ１ポリペプチド配列の能力に対して増大されるように改変される。さらなる実施形態では、少なくとも１つの免疫原性部分（エピトープ）を含むポリペプチドは、ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５０１、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−ＣＷ０３、ＨＬＡ−ＣＷ０４、ＨＬＡ−ＣＷ０６、またはＨＬＡ−ＣＷ０７に結合する能力が増大されるように改変される。実施例３０は、生成され得る代表的な変異体を記載する。当業者は、これらが例示的な変異体であること、および他の変異体がＨＬＡ−Ａ２以外のＨＬＡ分子に結合するペプチドについて同様の様式で生成され得ることを容易に理解する。さらなる実施形態では、改変ポリペプチドがＨＬＡ分子に結合する能力は、未改変のＷＴ１ポリペプチドの能力に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、４倍または５倍まで増大される。本発明の状況内では、ＷＴ１ポリペプチドの免疫原性部分内の比較的少数の置換（例えば、１〜３）は、このポリペプチドが免疫応答を誘発する能力を向上させるように機能し得るということが見出されている。適切な置換は一般に、上記のようなコンピュータープログラム、ならびにこの改変ポリペプチドと本明細書に記載のような抗血清および／またはＴ細胞との反応性に基づいて確認された効果を用いることによって同定され得る。従って、特定の好ましい実施形態では、ＷＴ１ポリペプチドは、免疫原性部分内の１〜３アミノ酸残基が、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が、未改変のポリペプチドの能力よりも統計的に大きいように置換されている変異体を含む。このような置換は好ましくは、上記のように同定され得るポリペプチドのＭＨＣ結合部位内に位置する。好ましい置換によって、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する結合の増大が可能になる。
特定の変異体は、保存的置換を含む。「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換されており、その結果ペプチド化学の当業者はこのペプチドの二次構造および疎水性親水性指標が実質的に不変であると予想する置換である。アミノ酸置換は一般に、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて行なわれ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられる；そして同様に親水性値を有する非荷電の極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化に相当し得る他の群のアミノ酸としては以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｌｉｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。変異体はまた、代わりに保存的変化を含んでもよい。変異体はまた、（代わりに）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性指標に対する影響が最小であるアミノ酸の欠失または付加によって改変されてもよい。
好ましい実施形態では、ＷＴ１ Ｎ−末端の改変ポリペプチド（アミノ酸１〜２４９）が構築され、この改変ポリペプチドは、全長ＷＴ１および／またはＷＴ１Ｎ末端ポリペプチドを認識する抗体に結合し得る。抗体の非限定的な例は、抗ＷＴ１抗体ＷＴ１８０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）である。
上記のとおり、ＷＴ１ポリペプチドは、タンパク質の移入を翻訳と同時的にまたは翻訳後に指向するタンパク質のＮ末端のシグナル（またはリーダー）配列に対して結合され得る。ポリペプチドはまた、代替的には、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製または同定の容易さのために、または固体支持体に対するポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列に結合されてもよい。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合されてもよい。
ＷＴ１ポリペプチドは、任意の種々の周知の技術を用いて調製され得る。本明細書に記載のようなＷＴ１ポリヌクレオチドによってコードされる組み換えポリペプチドは、ポリヌクレオチドから容易に調製され得る。概して、組み換えＷＴ１ポリペプチドを発現させるために当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用してもよい。発現は、組み換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換されるかまたはトランスフェクトされている任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母および高等な真核生物細胞が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ、酵母またはＣＯＳもしくはＣＨＯのような哺乳動物細胞である。培養培地中へ組み換えタンパク質またはポリヌクレオチドを分泌する適切な宿主／ベクター系由来の上清は、市販のフィルターを用いてまず濃縮され得る。次いで、この濃縮物を、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂のような適切な精製マトリックスに適用してもよい。最終的には、組み換えポリペプチドをさらに精製するために１回以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用してもよい。未改変のポリペプチドまたはその変異体を調製するためにこのような技術を用いてもよい。例えば、種々の未改変のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは一般に、標準的な変異誘発技術、例えば、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発を用いて調製されてもよく、ＤＮＡ配列の一部を除去して、短縮型ポリペプチドの調製を可能にしてもよい。
特定の部分および他の変異体はまた、当業者に周知の技術を用いて合成方法によって生成され得る。例えば、約５００アミノ酸より少ない、好ましくは約１００アミノ酸より少ない、それより好ましくは約５０アミノ酸より少ないポリペプチドを合成してもよい。ポリペプチドは、アミノ酸が成長しているアミノ酸鎖に連続して付加される、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成方法のような任意の市販の固相技術を用いて合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動的な合成のための装備は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給業者から市販されており、製造業者の指示に従って操作され得る。
概して、本明細書に記載されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離される。「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとは、そのもとの環境から取り出されているものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、天然の系においてある程度のまたは全ての既存の物質から分離される場合に、単離される。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％が純粋、より好ましくは少なくとも約９５％が純粋、最も好ましくは少なくとも約９９％が純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部ではないベクター中にクローニングされている場合に、単離されているとみなされる。
さらなる態様では、本発明は、ＷＴ１ポリペプチドの模倣物を提供する。このような模倣物は、１つ以上のアミノ酸模倣物に連結されたアミノ酸を含んでもよく（すなわち、ＷＴ１タンパク質内の１つ以上のアミノ酸がアミノ酸模倣物によって置き換えられてもよい）、または全体として非ペプチドの模倣物であってもよい。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸に対して立体配置的に同様であり、その結果抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力を実質的に低下することなくＷＴ１ポリペプチド内のアミノ酸について置換され得る化合物である。非ペプチド模倣物とは、アミノ酸を含まない、ＷＴ１ポリペプチドと同様の全体的立体配置を有し、その結果この模倣物がＷＴ１特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力は、ＷＴ１ポリペプチドの能力に対して実質的に低下しない化合物である。このような模倣物は、ペプチド配列の三次元構造を評価する標準的な技術（例えば、核磁気共鳴および計算的な技術）に基づいて設計され得る。ＷＴ１ポリペプチドの側鎖官能基の１つ以上が、同じサイズまたは容積を有する必要は無いが、同様の生物学的応答を生じる同様の化学的および／または物理的特性を有する基で置換される模倣物が設計され得る。本明細書に記載される実施形態では、模倣物はＷＴ１ポリペプチドで置換され得るということが理解されるべきである。
他の例示的実施形態では、ポリペプチドは本明細書に記載のような複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載のような少なくとも１つのポリペプチド、および無関係の配列、例えば公知の腫瘍タンパク質を含む融合ポリペプチドであってもよい。融合パートナーは、例えば、ヘルパーＴエピトープ（免疫学的な融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるヘルパーＴエピトープを提供することを補助し得るか、または未改変の組み換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質（発現エンハンサー）を発現するのを補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的な融合パートナー、発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解度を増大するように、またはポリペプチドが所望の細胞内区画に対して標的にされることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーは、ポリペプチドの精製を促進するアフィニティータグを含む。
融合ポリペプチドは一般に、化学的結合を含む標準的な技術を用いて調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において非融合ポリペプチドに対して増大したレベルの生成を可能にする組み換えポリペプチドとして発現される。要するに、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は別々にアセンブルされて、適切な発現ベクターに連結されてもよい。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、その配列のリーディングフレームが同位相になるようにペプチドリンカーの有無の状態で、第二のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結される。これによって、両方の成分のポリペプチドの生物学的活性を保持する単独の融合ポリペプチドへの翻訳が可能になる。
ペプチドリンカー配列は、各々のポリペプチドをその二次構造および三次構造に折り畳むことを確実にするのに十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために使用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合ポリペプチドに組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選択され得る：（１）それらが可塑性の細長い構成を取り入れる能力；（２）それらが第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用する二次構造を採用することができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電された残基の欠失。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。他のほぼ中立のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもこのリンカー配列において用いられ得る。リンカーとして通常使用され得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ ４０：３９〜４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８〜８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は一般に、１〜約５０アミノ酸長であってもよい。第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを隔てて、かつ立体障害を妨げるために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合には、リンカー配列は必要ではない。
連結されたＤＮＡ配列は適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終止シグナルを終わらせるのに必要な終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して３’側にのみ存在し得る。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなポリペプチドを無関係の免疫原性タンパク質、例えば、想起応答（ｒｅｃａｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発し得る免疫原性タンパク質と一緒に含んでもよい。このようなタンパク質の例としては、破傷風、結核および肝炎のタンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３６：８６〜９１，１１９７を参照のこと）。
１つの好ましい実施形態では、免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来Ｒａ１２フラグメントのように、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．，由来である。異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増強するのにおけるＲａ１２組成物およびそれらの使用のための方法は、その開示が全体に参考文献として本明細書に組み込まれる、米国特許出願第６０／１５８，５８５号に記載される。要するに、Ｒａ１２とは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＭＴＢ３２Ａ核酸の配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、病原性および非病原性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株における遺伝子によってコードされる３２ＫＤ分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、記載されている（例えば、米国特許出願６０／１５８，５８５号；また参考文献として本明細書に組み込まれる、Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８−４００７を参照のこと）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは高レベルで発現し、精製プロセスを通じて可溶性ポリペプチドとして残る。さらに、Ｒａ１２は、それが融合されている異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に相当する１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする、少なくとも約１５連続するヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチドまたは少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、天然の配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよいし、またはこのような配列の変異体を含んでもよい。Ｒａ１２ポリヌクレオチド変異体は、コードされる融合ポリペプチドの生物学的活性が、未改変のＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドに対して実質的に低下しないような１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。変異体は好ましくは、未改変のＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
他の好ましい実施形態では、免疫学的な融合パートナーは、グラム陰性細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂの表面タンパク質であるプロテインＤに由来する（ＷＯ ９１／１８９２６）。好ましくはプロテインＤ誘導体は、このタンパク質のほぼ三分の一（例えば、Ｎ末端の最初の１００〜１１０アミノ酸）を含み、プロテインＤ誘導体は、脂質化されてもよい。特定の好ましい実施形態では、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基をＮ末端に含み、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供して、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルを増大させる（これによって、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テールが抗原提示細胞に対する抗原の最適の提示を保証する。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（赤血球凝集素ヘマグルチニン）が挙げられる。代表的には、Ｎ末端の８１個のアミノ酸を用いるが、Ｔヘルパーエピトープを含む種々のフラグメントを使用してもよい。
別の実施形態では、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその一部（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡとして公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（ＬｙｔＡ遺伝子によってコードされる；Ｇｅｎｅ ４３：２６５〜２９２，１９８６）を合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格における特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素（ａｕｔｏｌｙｓｉｎ）である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンに対する、またはＤＥＡＥのようないくつかのコリンアナログに対する親和性を担う。この特性は、融合タンパク質の発現のために有用なプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｃ−ＬＹＴＡの開発のために開発されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製は記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態では、ＬＹＴＡの繰り返し部分は、融合ポリペプチドに組み込まれてもよい。繰り返し部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域で見出される。特に好ましい繰り返し部分は残基１８８〜３０５を組み込む。
別の例示的実施形態では、融合パートナーは、Ｎ末端上にＥ．ｃｏｌｉのＴｏｒＡシグナルペプチド由来のツインアルギニン転位（ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）（ＴＡＴ）シグナルペプチドを含む；その全体が本明細書において参考として援用される、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）２（２）：１７９〜１８９；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ ２００１ ｐ６０４〜６１０ 第１８３巻、２号；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６巻、２００１年３月１６日、ｐｐ８１５９〜８１６４）を参照のこと。
さらに別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドを含むが、ここで融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載されるような、エンドソーム／リソソーム区画に対してポリペプチドを指向し得る標的化シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的化シグナルと融合される場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子とさらに効率的に会合して、それによってこのポリペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ刺激を増強する。
本発明は、融合パートナーの付加なしにＥ．ｃｏｌｉで組み換え発現され得る短縮型のＷＴ１ポリペプチドを提供する。これらの短縮型の例は、配列番号３４２〜３４６に示され、配列番号３３７〜３４１に示されるポリヌクレオチドによってコードされる。これらの短縮型のバリエーションでは、ＷＴ１の最初の７６アミノ酸をこのタンパク質のＣ末端に融合し、これによってＥ．ｃｏｌｉで発現するのが容易な組み換えタンパク質を作製することができる。Ｅ．ｃｏｌｉに加えて他の宿主、例えばＢ．Ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどを用いることもできる。タンパク質はさらに、ヒスチジンタグなしで調製されてもよい。
他の実施形態では、種々のサブユニットを作製して、未改変のＷＴ１の順序とは異なる順序で一緒に融合してもよい。さらに、例えば、Ｒａ１２との融合を行なってもよい。例示的な融合タンパク質は、配列番号３３２〜３３６に示され、配列番号３２７〜３３１に示されるポリヌクレオチドによってコードされ得る。
（ＷＴ１ポリヌクレオチド）
本明細書に記載されるようなＷＴ１ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドは、本発明によって包含されるＷＴ１ポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）であっても、二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコード配列または非コード配列は、必須ではないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必須ではないが、他の分子および／または支持物質に連結されてもよい。
ＷＴ１ポリヌクレオチドは、未改変のＷＴ１タンパク質をコードしてもよく、または本明細書に記載のようなＷＴ１の変異体をコードしてもよい。ポリヌクレオチド変異体は、コードされたポリペプチドの免疫原性が未改変のＷＴ１タンパク質に対して低下しないような１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含んでもよい。コードされたポリペプチドの免疫原性に対する効果は一般に、本明細書において記載されるように評価されてもよい。好ましい変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入および／または付加を、未改変のＷＴ１配列の免疫原性部分をコードするヌクレオチド位置の２０％以下、好ましくは１０％以下で含む。特定の変異体は、未改変の遺伝子またはその一部に対して実質的に相同である。このようなポリヌクレオチド変異体は、ＷＴ１ポリペプチドをコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的な配列）に対して中度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。適切な中度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ，０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液での事前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ一晩でのハイブリダイズ；その後の０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々を用いる２０分間の６５℃での２回の洗浄を含む。このようなハイブリダイズするＤＮＡ配列はまた、本発明の範囲内である。
遺伝子コードの縮重の結果として、ＷＴ１ポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在するということが当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して有する相同性が最小である。それにもかかわらず、コドン用法における相違に起因して変化するポリヌクレオチドが本発明によって特に意図される。
従って、本発明の別の態様によれば、本明細書に示されるポリヌクレオチド配列、本明細書に示されるポリヌクレオチド配列の相補体、および本明細書に示されるポリヌクレオチド配列の縮重変異体のいくつかまたは全てを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特に好ましい実施形態では、本明細書に示されるポリヌクレオチド配列は、上記のような免疫原性ポリペプチドをコードする。
ＷＴ１の免疫原性部分が一旦同定されれば、上記のように、ＷＴ１ポリヌクレオチドは、任意の種々の技術を用いて調製され得る。例えば、ＷＴ１ポリヌクレオチドは、ＷＴ１を発現する細胞から調製されたｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーは、免疫原性部分の配列に基づいて設計されてもよく、購入されても合成されてもよい。例えば、ヒトＷＴ１遺伝子のＰＣＲ増幅のために適切なプライマーとしては以下が挙げられる：第一工程−Ｐ１１８：１４３４−１４１４：５’ＧＡＧ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＡＧＴ ３’（配列番号５）およびＰ１３５：５’ＣＴＧ ＡＧＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＴＧＧ ＧＣ ３’（配列番号６）；第二工程−Ｐ１３６：５’ ＧＡＧ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＧＧ ＧＣＴ ＣＣＧ ＡＣＧ ＴＧＣ ＧＧＧ ３’（配列番号７）およびＰ１３７：５’ＧＧＧ ＧＴＡ ＣＣＣ ＡＣＴ ＧＡＡ ＣＧＧ ＴＣＣ ＣＣＧ Ａ ３’（配列番号８）。マウスＷＴ１遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーとしては以下が挙げられる：第一工程−Ｐ１３８：５’ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＡＴＧ ３’（配列番号９）およびＰ１３９：５’ＧＣＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ３’（配列番号１０）、第二工程−Ｐ１４０：５’ＧＡＧ ＣＡＴ ＧＣＧ ＡＴＧ ＧＧＴ ＴＣＣ ＧＡＣ ＧＴＧ ＣＧＧ ３’（配列番号１１）およびＰ１４１：５’ＧＧＧ ＧＴＡ ＣＣＴ ＣＡＡ ＡＧＣ ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴ ３’（配列番号１２）。
次いで増幅された部分は、周知の技術を用いて、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからまたは適切なｃＤＮＡライブラリーからの全長遺伝子の単離のために用いられ得る。あるいは、全長遺伝子は、複数のＰＣＲフラグメントから構築されてもよい。ＷＴ１ポリヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチド成分を合成すること、および完全なポリヌクレオチドを一緒に生成するために成分を連結することによって調製されてもよい。
ＷＴ１ポリヌクレオチドはまた、化学的合成（例えば、固相ホスホラミダイト化学合成）を含む、当該分野で公知の任意の方法によって合成され得る。ポリヌクレオチド配列における改変はまた、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ ２：１８３，１９８３を参照のこと）のような標準的な変異誘発技術を用いて導入され得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を有するベクターにＷＴ１ポリペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれる条件であれば、そのＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボ転写によって生成されてもよい。本明細書に記載されるような、コードされるポリペプチドを調製するために特定の部分を用いてもよい。さらに、代替的には、一部はそのコードされたポリペプチドがインビボで生成されるように患者に投与され得る（例えば、ＷＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ構築物を有する樹状細胞のような抗原提示細胞をトランスフェクトすること、および患者に対してトランスフェクトされた細胞を投与することによって）。
ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは一般に、インビトロまたはインビボにおいて、ポリペプチドの生成のために用いられ得る。コード配列に対して相補的であるＷＴ１ポリヌクレオチド（すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド）はまた、プローブとして、またはＷＴ１発現を阻害するために用いられ得る。アンチセンスＲＮＡに転写され得るｃＤＮＡ構築物はまた、アンチセンスＲＮＡの生成を促進する組織の細胞に導入されてもよい。
任意のポリヌクレオチドをインビボでの安定性を増大するようにさらに修飾してもよい。可能性のある修飾としては、限定はしないが、５’および／または３’末端に隣接する配列の付加；骨格中のホスホジエステラーゼ連結ではないホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；および／またはイソシン、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−および他の改変型のような非伝統的な塩基の包含が挙げられる。
本明細書に記載されるようなヌクレオチド配列は、確立された組み換えＤＮＡ技術を用いて種々の他のヌクレオチド配列に連結され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、λファージ誘導体およびコスミドを含む任意の種々のクローニングベクターにクローニングされてもよい。特定の目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。一般に、ベクターは、少なくとも１つの生物体における複製機能の起点、従来の制限エンドヌクレアーゼ部位および１つ以上の選択マーカーを含む。他のエレメントは、所望の用途に依存し、当業者には明らかである。詳細には、本発明の１実施形態は、本発明の核酸分子を発現コントロール配列（プロモーター）に対して作動可能な結合（すなわち、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」）で組み込む発現ベクターを含む。例示的なベクターとしては、限定はしないが、本明細書において実施例２０および４０に記載されるベクターが挙げられる。ワクシニアウイルスまたは弱毒化ウイルスベクターの構築は十分に、目的の分子をコードする真核生物細胞株または原核生物細胞株を生成するための細胞の形質転換またはトランスフェクションと同様に、当該分野の技術の範囲内である。この方式で使用され得る宿主細胞の例はＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａまたはＳｆ−９細胞）、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞などである。原核生物細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌も使用され得る。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞に入ってそこで発現することを可能にするように処方され得る。このような処方物は以下に記載するように、治療目的で特に有用である。当業者は、標的細胞においてポリヌクレオチドの発現を達成する多くの方法が存在し、任意の適切な方法が使用され得るということを承知している。例えば、ポリヌクレオチドは、限定はしないがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはワクシニアもしくは他のポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルス）のようなウイルスベクターに組み込まれてもよい。このようなベクターにＤＮＡを組み込むための技術は、当業者には周知である。レトロウイルスベクターは、選択マーカー（形質導入された細胞の同定または選択を補助する）および／または標的化部分のために、遺伝子を、例えば、このベクターを標的特異的にするために、特定の標的細胞上のレセプターについてのリガンドをコードする遺伝子などを、さらに移入するかまたは組み込んでもよい。標的化はまた、当業者に公知の方法によって抗体を用いて達成され得る。このようなベクター内のｃＤＮＡ構築物は例えば、腫瘍保護および養子免疫療法実験を行なってこのような細胞の腫瘍または白血病発達阻害もしくは溶解を実証するために用いられ得るＷＴ１陽性の腫瘍モデルを樹立するのにおける使用のために、ヒトまたは動物細胞株をトランスフェクトするのに、用いられ得る。
ポリヌクレオチドのための他の治療用処方物としては、コロイド性分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。インビトロおおびインビボにおける送達ビヒクルとしての使用のために好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。このような系の調製および使用は当該分野で周知である。
（抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子）
別の態様によれば、本発明はさらに、本明細書に開示されるＷＴ１ポリペプチドに対する、またはその一部、変異体もしくは誘導体に対する免疫学的結合を示す結合因子、例えば、抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ）」、「免疫学的に結合する（ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ）」といわれ、／または検出可能なレベルで（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイで）ポリペプチドと反応して、同様の条件で無関係のポリペプチドとは検出可能に反応しない場合に、本発明のＷＴ１ポリペプチドに対して「免疫学的に反応性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ）」である。
この文脈で使用される場合、免疫学的結合とは、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的である抗原との間で起こるタイプの非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に換算して表現されてもよく、ここではＫｄが小さいほど、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して、定量され得る。このような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を必要とするが、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方の方向における速度に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに依存する。従って、「会合速度定数（ｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｎ）および「解離速度定数（ｏｆｆ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｆｆ）の両方とも、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比によって、親和性に関係しない全てのパラメーターの排除が可能になり、従ってこの比は、解離定数Ｋｄに等しい。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９〜４７３を参照のこと。
抗体の「抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」または「結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」とは、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の部分をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「超可変領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）」といわれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間で、それに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子においては、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。この抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に対して相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）」またたは「ＣＤＲ」といわれる。
結合因子は、本明細書中に提供される代表的なアッセイを用いて、ＷＴ１関連の癌を有する患者と有さない患者との間をさらに識別できる。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは、この疾患を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において、癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、またはそれに加えて、この抗体は、癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、この疾患の非存在を示す陰性のシグナルを生成する。結合因子がこの要求を満たすか否かを決定するために、癌（標準的な臨床試験によって決定されるような）を有する患者および有さない患者からの生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）を、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されるようにアッセイしてもよい。好ましくは、疾患を有するサンプルおよび有さないサンプルの統計的に有意な数をアッセイする。各結合因子は、上記の基準を満足すべきである；しかし、当業者は、結合因子が、組合せて使用されて、感度を改善し得ることを認識する。
上記の要求を満足する任意の薬剤は、結合因子であり得る。例えば、結合因子は、ペプチド成分を含むか含まないリボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、組換え抗体の生成を可能にするために、本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む細胞培養技術によって、または適切な細菌細胞宿主もしくは哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原を最初に、任意の広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射する。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として機能し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンに結合される場合に、優れた免疫応答が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースト免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、これらの動物は、定期的に採血される。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９，１９７６の技術およびその改善物を用いて、調製され得る。要するに、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫された動物と同系であるものとの融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤と組合され、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単独のコロニーを選択し、それらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、適切な脊椎動物宿主、例えば、マウスの腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入のような種々の技術が、収量を向上させるために使用され得る。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。混入物は、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用されてもよい。
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは優先的に、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）フラグメント」）のうちの２つの各々は、無傷な抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含むいくつかのフラグメントを提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および希にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含み、このへテロダイマーは、未改変の抗体分子の抗原認識および結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９〜２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６〜２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１〜４０９６。
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９〜５８８３。抗体Ｖ領域からの自然に凝集する（ただし化学的には隔てられた）ポリペプチド軽鎖および重鎖を、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造に折り畳まれるｓＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらの米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと。
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含むがその、各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、互いに対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖ＦＲセットと軽鎖ＦＲセットの間に挿入される。本明細書中で用いる場合、用語「ＣＤＲセット」とは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、各々、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む。単独のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識単位（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが実証されており、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３との接触である。従って、分子認識単位が主に、抗原結合部位の特異性を担う。
本明細書中で用いる場合、「ＦＲセット（ＦＥ ｓｅｔ）」という用語は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接するアミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因である。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「正準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」構造に折り畳まれたＣＤＲループの折り畳まれた形状に影響するＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関係することが公知である。
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体分子が記載されており、この抗体分子には、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常領域に融合されたそれらの会合ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０〜４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４〜４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７〜３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲにグラフトされたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５）、ならびに組換えベニアリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開番号５１９，５９６、１９９２年１２月２３日公開）を有するキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を限定するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
本明細書中で用いる場合、用語「ベニアリングされたＦＲ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ ＦＲｓ）」および「組換えベニアリングされたＦＲ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ ｖｅｎｅｅｒｅｄ ＦＲｓ）」は、未改変のＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するための、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域からのＦＲ残基のヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニアリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９〜４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、免疫系に容易に遭遇する外部（例えば、溶媒がアクセス可能な）ＦＲ残基は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニアリング表面または実質的に非免疫原性のベニアリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子が得られる。
ベニアリングのプロセスは、Ｋａｂａｔデータベースの最新版である、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）において、Ｋａｂａｔらによって編集されたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データを利用し、他の米国および海外のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。Ｖ領域アミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒトおよびマウス抗体フラグメントについての既知の３次元構造から推定され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記の供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同的なヒトＶ領域が、対応するマウスアミノ酸と、残基ごとに比較される。ヒト対応物とは異なるマウスＦＲにおける残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基切り換え（Ｒｅｓｉｄｕｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）は、少なくとも部分的に露出した（溶媒アクセス可能である）部分を用いて実行されるのみであり、Ｖ領域ドメインの三次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸の置換において、注意が払われる。
この様式において、得られた「ベニアリングされた（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」マウス抗原結合部位は、従って、マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋没したかほとんど埋没した（溶媒のアクセスが不可能）として同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な（例えば、静電的および疎水的）接触に関係すると考えられる残基、およびＣＤＲループの「正準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」三次構造に影響を与えると考えられるＦＲの保存された構造領域由来の残基を保持するように設計される。次いで、これらの設計基準は、ヒト様ＦＲへのマウス抗原結合部位の軽鎖および重鎖の両方のＣＤＲを組合せる組換えヌクレオチド配列を調製するために使用され、このヒト様ＦＲが、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために用いられる。
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療剤に結合され得る。この点に関して適切な薬剤としては、放射性核種、分化インデューサー、薬物、毒素、およびそれの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化インデューサーとしては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）いずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基、例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基は、他方の上のカルボニル含有基例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるように働き得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、そうでなければ不可能である、薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進し得る。
ホモ官能性とヘテロ官能性の両方の、種々の二官能性または多官能性の試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献、例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらの米国特許第４，６７１，９５８号が存在する。
本発明の免疫結合体の抗体部分がない場合に治療剤がより強力である場合、細胞中への内部移行の間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構としては、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断が挙げられる。
２つ以上の薬剤を抗体に結合させることが望ましいかもしれない。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、２つ以上の型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、２つ以上の薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、２つ以上の薬剤が、抗体分子に直接的に結合されてもよいし、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが用いられてもよい。あるいは、キャリアが用いられてもよい。
キャリアは、直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む種々の方法で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアとしては、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むものを含む、キレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
（Ｔ細胞）
免疫療法組成物はまた、代替的には、ＷＴ１に特異的なＴ細胞を含んでもよい。このような細胞は一般的に、標準的手順を用いて、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム、例えば、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏ Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ ＷＡから入手可能なＣＥＰＲＡＴＥＴＭシステム（また、米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３も参照のこと）を用いて、哺乳動物、例えば、患者の骨髄、末梢血、または骨髄もしくは末梢血の画分内に存在し得る（かまたはそれから単離され得る）。あるいはＴ細胞は、関連もしくは無関係のヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物由来であってもよい。
Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、ＷＴ１ポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にするのに十分な条件および時間で、行われる。好ましくは、ＷＴ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、送達ビヒクル、例えば、ミクロスフェア中に存在して、抗原特異的Ｔ細胞の生成が容易になる。要するに、慣用的な技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって）患者または関連もしくは無関係のドナーから単離され得るＴ細胞をＷＴ１ポリペプチドとともにインキュベートする。例えば、Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）またはＷＴ１ポリペプチドの匹敵する量を合成する細胞と一緒に３７℃で２〜９日間（代表的には４日）インビトロでインキュベートされ得る。コントロールとして機能するＷＴ１ポリペプチドの非存在下でＴ細胞サンプルの別個のアリコートをインキュベートすることが所望され得る。
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、ＷＴ１ポリペプチドでコーティングされた標的細胞またはこのようなポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、ＷＴ１ポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを用いて評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、陰性コントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０６５〜１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、ＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。Ｔ細胞増殖を検出する他の方法は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生の増大、Ｃａ２＋フラックス、または３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムのような色素取り込みを測定する工程が挙げられる。あるいは、リンホカイン（例えば、インターフェロン−γ）の合成を測定してもよいし、またはＷＴ１ポリペプチドに応答し得るＴ細胞の相対的な数を定量してもよい。３〜７日間のＷＴ１ポリペプチド（２００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じるはずであり、／または２〜３時間の上記のような接触は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定される場合、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ １９９８）を参照のこと）。ＷＴ１特異的Ｔ細胞は標準的な技術を用いて増殖され得る。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、患者または関連もしくは無関係のドナー由来であり、刺激および増殖後にその患者に投与される。
ＷＴ１ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＷＴ１発現ＡＰＣに応答して活性化されているＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的な活性化は、種々の方法で検出できる。特異的なＴ細胞活性化を検出するための方法は、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えば、リンホカイン）の産生、または細胞溶解活性の生成（すなわち、ＷＴ１に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の生成）を検出する工程を包含する。ＣＤ４＋Ｔ細胞については、特異的なＴ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋Ｔ細胞については、特異的なＴ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、細胞溶解活性の生成の検出である。
治療目的については、ＷＴ１のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に増殖され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子、例えば、インターロイキン−２の添加を伴うか、または伴わずに、ＷＴ１ポリペプチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露されてもよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が生じる場合、刺激細胞の添加が好ましい。Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチドでの間欠的な再刺激に応答する特異性を保持したままで、インビトロにおいて大きく増殖され得る。要するに、最初のインビトロ刺激（ＩＶＳ）のためには、多数のリンパ球（例えば、４×１０７個より多い）を、ヒト血清を含む培地とともにフラスコに入れてもよい。ＷＴ１ポリペプチド（例えば、ペプチドで１０μｇ／ｍｌ）を破傷風トキソイド（例えば、５μｇ／ｍｌ）とともに直接添加してもよい。次いでフラスコをインキュベートしてもよい（例えば、３７℃で７日間）。第二のＩＶＳのためには、次いでＴ細胞を回収して、新しいフラスコ中に２〜３×１０７個の照射した末梢血単核球とともに入れる。ＷＴ１ポリペプチド（例えば１０μｇ／ｍｌ）を直接添加する。このフラスコを３７℃で７日間インキュベートする。第二のＩＶＳの２日および４日後、２〜５単位のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加してもよい。三回目のＩＶＳのためには、Ｔ細胞をウェルに入れて、ペプチドでコーティングした個体の自己のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞で刺激してもよい。ＩＬ−２は、各々のサイクルの２日目および４日目に添加してもよい。細胞が特異的に細胞毒性のＴ細胞であることが示されるとすぐに、２、４および６日目に、より高いＩＬ−２（２０単位）による１０日の刺激サイクルを用いてそれらを増殖させてもよい。
あるいは、ＷＴ１ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数的に増殖され得る。細胞をクローニングする方法は、当該分野で周知であり、限界希釈を包含する。応答者Ｔ細胞は、密度勾配遠心分離およびヒツジ赤血球ロゼッティングによって、感作された患者の末梢血から精製され、照射された自系のフィラー細胞（ｆｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）の存在下で名目上の抗原での刺激によって、培養物中で樹立され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞株を生成するために、ＷＴ１ポリペプチドを、抗原刺激因子として用い、エプスタイン・バーウイルスでの感染によって不死化した自己の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）またはリンパ芽球腫細胞株（ＬＣＬ）を抗原提示細胞として用いる。ＣＤ８＋Ｔ細胞株を生成するために、ＷＴ１ポリペプチドを産生する発現ベクターでトランスフェクトした自己の抗原提示細胞を刺激細胞として用いてもよい。樹立したＴ細胞株は、１×１０６個の照射されたＰＢＬまたはＬＣＬ細胞および組み換えインターロイキン−２（ｒＩＬ２）（５０Ｕ／ｍｌ）とともに、９６ウェル平底プレート中に１ウェルあたり０．５個の細胞という頻度で、刺激されたＴ細胞をプレートすることによって、抗原刺激の２〜４日後にクローニングし得る。クローン性の増殖が樹立されたウェルは、最初のプレート後にほぼ２〜３週間で同定して、自系の抗原提示細胞の存在下で適切な抗原を用いて再刺激し、次いで、抗原刺激の２〜３日後に低用量のｒＩＬ２（２０Ｕ／ｍｌ）の添加によって引き続いて増殖し得る。Ｔ細胞クローンは、ほぼ２週間ごとに、抗原およびｒＩＬ２を用いた周期的な再刺激によって２４ウェルプレート中に維持してもよい。
特定の実施形態では、同種異系のＴ細胞をインビボおよび／またはインビトロでプライミング（ｐｒｉｍｅ）（すなわちＷＴ１に対して感作）してもよい。このようなプライミングは、Ｔ細胞とＷＴ１ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこのようなポリペプチドを産生する細胞とを、Ｔ細胞のプライミングを可能にするのに十分な条件および時間のもとで接触させることによって達成することができる。一般には、Ｔ細胞は、本明細書に記載のように、標準的な増殖、クロム遊離アッセイおよび／またはサイトカイン遊離アッセイによって測定した場合、例えば、ＷＴ１ポリペプチドとの接触によってＴ細胞の増殖および／または活性化が得られる場合に、プライミングされたとみなされる。陰性コントロールに比較して、増殖または溶解における２倍を超える刺激係数の増大、サイトカインのレベルの３倍を超える増大は、Ｔ細胞特異性を示す。インビトロでプライミングされた細胞は、例えば、骨髄移植で、またはドナーリンパ球注入として使用されてもよい。
ＷＴ１に特異的なＴ細胞は、ＷＴ１タンパク質を発現する細胞を殺傷し得る。ＷＴ１のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）鎖をコードする遺伝子の導入を、ＷＴ１保有白血球およびガン細胞に対する応答を定量的におよび定性的に改善するための手段として用いる。ＷＴ１陽性細胞に反応し得るＴ細胞の数を増大するためのワクチンは、ＷＴ１保有細胞を標的する方法の１つである。ＷＴ１に特異的なＴ細胞を用いるＴ細胞療法は別の方法である。Ｔ細胞または溶菌能力を有する他の細胞へＷＴ１特異的なＴＣＲ鎖を導入することが別の方法である。適切な実施形態では、ＴＣＲαおよびβ鎖をＷＴ１特異的Ｔ細胞株からクローニングして、本明細書に参考として援用されるＷＯ９６／３０５１６に記載されるような養子Ｔ細胞療法に用いる。
（Ｔ細胞レセプター組成物）
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、ジスルフィド結合によって連結されている、Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖と呼ばれる、２つの異なる非常に可変性のポリペプチド鎖からなる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、１４８〜１５９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。このα／βヘテロダイマー（異種二量体）は、細胞膜で不変のＣＤ３鎖と複合体化する。この複合体は、ＭＨＣ分子に結合した特定の抗原性ペプチドを認識する。ＴＣＲ特異性の膨大な多様性は、体細胞遺伝子再配列により、まるで免疫グロブリンの多様性のように生成される。このβ鎖遺伝子は、５０を超える可変性領域（Ｖ）、２つの多様性領域（Ｄ）、１０を超える連結セグメント（Ｊ）、および２つの定常領域セグメント（Ｃ）を含む。α鎖遺伝子は、７０を超えるＶセグメント、および６０を超えるＪセグメントを含むが、Ｄセグメントを含まず、１つのＣセグメントを含む。胸腺におけるＴ細胞発達の間、β鎖のＤ〜Ｊ遺伝子再配列が生じ、続いて、Ｖ遺伝子セグメントのＤＪへの再配列が生じる。この機能的ＶＤＪβエキソンは、転写され、スプライシングされてＣβに連結される。α鎖に関しては、Ｖα遺伝子セグメントは、Ｊα遺伝子セグメントに再配列されて、機能的エキソンを形成し、これが次に転写されて、Ｃαにスプライシングされる。多様性は、さらにβ鎖のＶセグメントと、Ｄセグメントと、Ｊセグメントとの間、α鎖のＶセグメントと、Ｊセグメントとの間のＰおよびＮ−ヌクレオチドの無作為な付加によって、組み換えプロセスの間にさらに増大される（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、９８および１５０．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。
本発明は、別の態様において、本明細書に開示のポリペプチド、またはその変異体もしくは誘導体に特異的なＴＣＲを提供する。本発明に従って、本明細書に記載の腫瘍ポリペプチドを認識するＴ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖について、Ｖ−ＪもしくはＶ−Ｄ−Ｊ接合領域、またはその部分について、ポリヌクレオチドおよびアミノ酸の配列が提供される。一般に、本発明のこの態様は、ＭＨＣの文脈において提示される腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合するＴ細胞レセプターに関する。好ましい実施形態において、Ｔ細胞レセプターによって認識される腫瘍抗原は、本発明のポリペプチドを含む。例えば、ＷＴ１ペプチドに特異的なＴＣＲをコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学技術および組み換えＤＮＡ技術を用いて、腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞から単離され得る。
本発明はさらに、腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合する本発明のＴ細胞レセプターと実質的に同じ機能または活性を有する、Ｔ細胞レセプターまたはそのアナログを包含する。このようなレセプターとしては、限定はしないが、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターのフラグメント、または本明細書に提供されるＴ細胞レセプターの、置換、付加、もしくは欠失の変異体が挙げられる。本発明はまた、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターに実質的に相同であるか、または実質的に同じ活性を保持する、ポリペプチドまたはペプチドを包含する。「アナログ」という用語は、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターと実質的に同一のアミノ酸残基配列を有する任意のタンパク質またはポリペプチドであって、１つ以上の残基、好ましくは５残基以下、より好ましくは、２５残基以下が、機能的に類似の残基で保存的に置換されており、本明細書に記載のようなＴ細胞レセプターの機能的態様を示す、任意のタンパク質またはポリペプチドを包含する。
本発明はさらに、適切な哺乳動物宿主細胞、例えば非特異的Ｔ細胞であって、本明細書に記載のポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされており、これによって、この宿主細胞はこのポリペプチドに特異的にされる、適切な哺乳動物宿主細胞を提供する。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、別々の発現ベクターに含まれてもよいし、またはこれもリボソーム内侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）の下流の遺伝子のｃａｐ依存性翻訳のためのＩＲＥＳを含む単一の発現ベクターに含まれてもよい。このポリペプチドに特異的なＴＣＲを発現するこの宿主細胞は、例えば、以下にさらに考察されるようなＷＴ１関連性ガンの養子免疫療法のために、用いられ得る。
本発明のさらなる態様において、本明細書に挙げたポリペプチドに特異的なクローニングされたＴＣＲは、ＷＴ１関連性ガンの診断のためのキットに用いられ得る。例えば、腫瘍特異的ＴＣＲの核酸配列またはその一部は、生物学的サンプル中で、特定のＴＣＲをコードする再配列された遺伝子の発現を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る。従って、本発明はさらに、ポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするメッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡを検出するためのアッセイを提供する。
（ペプチド−ＭＨＣ四量体複合体）
本発明は、別の態様では、本明細書に開示されるポリペプチドを認識するＴ細胞に特異的なペプチド−ＭＨＣ四量体複合体（テトラマー）、またはその変異体もしくは誘導体を提供する。１実施形態では、四量体は、ＷＴ１特異的Ｔ細胞の検出において用いられ得る。四量体は、ＷＴ１特異的免疫応答をモニタリングするのに、ＷＴ１関連性悪性腫瘍の早期検出に、微小残存病変をモニタリングするために用いられ得る。四量体染色は代表的には、フローサイトメトリー分析で行なって、再発または疾患進行の危険性が高い、ＷＴ１関連性疾患に罹患している患者集団内の群を同定することができる。
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物への投与のための、単独かまたは治療の１つ以上の他の様相と組合わせるかのいずれかでの、薬学的に受容可能なキャリア中の本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の処方物に関する。
所望される場合、本明細書中に開示される組成物が、同様に他の薬剤、例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤などと組合わせて、投与され得ることが、理解される。事実、さらなる薬剤が標的細胞または宿主細胞と接触した際に有意な有害な影響をもたらさないとすれば、さらに含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、この組成物は、特定の例において必要とされる種々の他の薬剤と共に送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは、本明細書中に記載されるように化学的合成され得る。同様に、このような組成物はさらに、置換または誘導体化されたＲＮＡ組成物またはＤＮＡ組成物を含み得る。
従って、本発明の別の態様において、生理学的に受容可能なキャリアと組合わせた、本明細書中に記載される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはＴ細胞組成物を含む薬学的組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防ワクチン適用および治療ワクチン適用における使用のための、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド組成物および／または免疫原性ポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ，１９９５）に記載される。一般的にこのような組成物は、１つ以上の免疫刺激剤と組み合わせて、本発明のポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物の１つ以上を含む。
本明細書中に記載される任意の薬学的組成物が本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、例えば、有機塩基（例えば、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む、薬学的に受容可能な非毒性の塩基から調製され得る。
別の実施形態では、本発明の例示的な免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物は、上記のようなポリペプチドの１つ以上をコードするＤＮＡを含み、その結果このポリペプチドは、インサイチュで生成される。上記のように、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の種々の送達系の内で投与され得る。実際、多数の遺伝子送達技術、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５：１４３〜１９８，１９９８およびその中に引用される参考文献に記載される遺伝子送達技術が、当該分野で周知である。当然ながら、適切なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現のための必要な調節性のＤＮＡ調節配列（例えば、適切なプロモーターおよび終止シグナル）を含む。あるいは、細菌送達系は、その細胞表面上にポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはエピトープなどを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含み得る。
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知のウイルスに基づく系のうちのいずれかを用いて、発現のために適切な哺乳動物宿主細胞に導入される。１つの例示的な実施形態においては、レトロウイルスが、遺伝子送達系のための簡便かつ有効な基盤を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され、被験体に送達され得る。多数の例示的なレトロウイルス系が記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０〜９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５〜１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３〜８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２〜１０９。
さらに、多数の例示的なアデノウイルスに基づく系もまた、記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に存続し、従って、挿入の変異誘発に伴う危険性を最小限にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７〜２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１〜５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７〜７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１〜５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１〜４７６）。
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達に関して開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ ９２／０１０７０およびＷＯ ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３〜５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５〜１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７〜１８７５を参照のこと。
遺伝子移入による、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、ポックスファミリーのウイルス、例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスから誘導されるウイルスベクターが挙げられる。例として、新規分子を発現するワクシニアウイルスの組換え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列、例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列に隣接するように、適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを使用して、ワクシニアで同時に感染される細胞にトランスフェクトする。相同組換えは、ワクシニアプロモーターに加えて目的のポリペプチドをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入するように働く。生じるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でこの細胞を培養し、この５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークをピックアップすることによって、選択され得る。
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの誘導可能な一過性発現または同時発現を生物体の宿主細胞において提供するために、好都合に使用され得る。この特定の系において、細胞を最初に、インビトロで、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルスの組換え体で感染させる。このポリメラーゼは、それがＴ７プロモーターを保有する鋳型のみを転写するという点で、鋭敏な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチド（単数または複数）でトランスフェクトさせる。ワクシニアウイルスの組換え体から細胞質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いでこのＲＮＡが宿主翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法によって、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルで一過性の細胞質産生が提供される。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３〜６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２〜８１２６を参照のこと。
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルスを用いて、目的のコード配列を送達してもよい。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を与えることが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、従って、哺乳動物細胞においては感染性ではないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、ワクシニアウイルスの産生に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ ９１／１２８８２；ＷＯ ８９／０３４２９；およびＷＯ ９２／０３５４５を参照のこと。多数のポックスウイルスが外因性のタンパク質の発現のための生のウイルスベクターとして開発されている（Ｃｅｐｋｏら、Ｃｅｌｌ ３７：１０５３〜１０６３（１９８４）；Ｍｏｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４６２６〜４６３０（１９８７）；Ｌｏｗｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３８９６〜３９００（１９８７）；Ｐａｎｉｃａｌｉ＆Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７〜４９３１（１９８２）；Ｍａｃｈｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５〜７４１９（１９８２））。代表的な鶏痘ウイルスおよび豚痘ウイルスは、それぞれアクセッション番号ＶＲ−２２９およびＶＲ−３６３としてＡＴＣＣから入手可能である。組み換えワクシニア−ＣＥＡは、アクセッション番号ＶＲ２３２３としてＡＴＣＣから入手可能である。他の例示的なウイルスベクターとしてはまた、限定はしないが、Ｔｈｅｒｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ（Ｃａｍｂｒｉｄｇ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって、例えば、米国特許第６，０５１，４１０号、同第５，８５８，７２６号、同第５，６５６，４６５号、同第５，８０４，１９６号、同第５，７４７，３２４号、同第６，３１９，４９６号、同第６，１６５，４６０号に記載されるウイルスベクターが挙げられる。
任意の多数のアルファウイルスベクター、例えば、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４号に記載されるベクターもまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用可能である。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクターもまた、使用され得、この例示的な例は、米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号に見出され得る。
さらに、分子結合体化ベクター、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクターもまた、本発明における遺伝子送達に用いてもよい。
これらおよび他の公知のウイルスベースの送達系に対するさらなる例示的情報は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７〜２１、１９９０；米国特許（Ｕ．Ｓ．）第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許（ＧＢ）第２，２００，６５１号：欧州特許（ＥＰ）第０，３４５，２４２号；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３に見出すことができる。
当業者に容易に理解されるように、多数のさらなる成分が、本明細書に記載されるように、ＷＴ１ポリペプチドまたはその任意の部分を発現するＤＮＡまたはレトロウイルスベクターに存在し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはペプチドの送達のための発現ベクターは、多数の種々の同時刺激分子を含んでもよく、これには限定はしないが、ＣＤ２８、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３が挙げられる。送達ベクターはまた、多数のサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−２を含んでもよい。１つの例示的実施形態では、組み換えウイルスベクター、例えば、ワクシニアまたは鶏痘ベクターとしては、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３が挙げられる。
本発明はまた、ＷＴ１の発現をともなう悪性疾患の治療における使用のための、本明細書に記載のＤＮＡおよび／またはウイルスベクターの任意の組み合わせの使用を包含する。１つの例示的実施形態では、組み換えワクシニアウイルスベクターは、ＷＴ１関連性の悪性疾患に罹患している動物またはヒト患者に投与され、続いて組み換え鶏痘ベクターが投与される。本発明の別の実施形態では、組み換え鶏痘は、ワクシニアベクターの投与後に２回投与される（例えば、プライム／ブースト／ブーストというワクチン接種レジメン）。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込んでもよい。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して特定の位置および方向であってもよいし、または無作為な非特異的位置に組み込まれてもよい（遺伝子増大（ｇｅｎｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ））。なおさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントすなわち「エピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）」は、宿主細胞の周期に独立してまたは同調して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、この細胞中にこのポリヌクレオチドが残る様式は、使用される発現構築物のタイプに依存する。
本発明の別の実施形態において、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載され、Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３によって概説されるように、ポリヌクレオチドは、「裸の（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡとして投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増大され得る。
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、その多くは記載されている微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）アプローチを介して送達され得る。１つの代表的な例において、ガス駆動粒子加速（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されたデバイスのようなデバイスで達成され得るが、そのデバイスのいくつかの例は、米国特許（Ｕ．Ｓ．）第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；および欧州特許（ＥＰ）第０５００７９９号に記載されている。このアプローチは、注射針のない（無注射針の）（ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ）送達アプローチを提供するが、ここでは、微視的な粒子、例えば、ポリヌクレオチド粒子、またはポリペプチド粒子の乾燥粉末処方物を、手持ち型のデバイスによって生成されたヘリウムガスジェット内で高速に加速し、目的の標的組織内へ粒子を噴射する。
関連の実施形態において、本発明の組成物のガス駆動注射針なし注入（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ ｎｅｅｄｌｅ−ｌｅｓｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に有用であり得る他のデバイスおよび方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるものが挙げられ、そのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号；および同第５，９９３，４１２号に記載されている。
別の実施形態によれば、本明細書に記載される薬学的組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞、ＴＣＲ、および／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫賦活剤（免疫促進剤）を含む。免疫賦活剤とは本質的に、外因性抗原に対する免疫応答（抗原および／または細胞媒介）を増大または増強する任意の物質をいう。免疫賦活剤の１つの好ましいタイプは、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、および免疫応答の刺激物質、例えば、リピドＡ（ｌｉｐｉｄ Ａ）、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質を含む。特定のアジュバント、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム，鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アセチル化糖；カチオンの誘導化多糖またはアニオンの誘導化多糖；ポリフォスファーゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）；生分解性ミクロスフェア：モノホスホリルリピドＡおよびモノホスホリルクイル（ｑｕｉｌ）Ａとして、市販されている。サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２およびその他の成長因子などがまた、アジュバントとして使用されてもよい。
本発明の特定の実施形態において、アジュバント組成物は、Ｔｈ１型の免疫応答を優勢に誘導するものが好ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
Ｔｈ１型優勢の応答を誘発するための特定の好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫賦活剤ＤＮＡ配列はまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、またはＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を含むその誘導体；Ｅｓｃｉｎ；Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ（ジキトニン）；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａもしくはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａのサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組み合わせ、例えば、以下のＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む群のうち少なくとも２つと組み合わせて２つ以上のサポニンを含む。
あるいは、このサポニン処方物は、キトサン、または他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−ｃｏ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、ポリサッカライドまたは化学的に改変されたポリサッカライドからなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子、などと組み合わされてもよい。サポニンはまた、コレステロールの存在下で処方されて、リポソームまたはＩＳＣＯＭｓのような粒子構造を形成し得る。さらに、サポニンは、非粒子的溶液もしくは懸濁液中で、または小数層（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームもしくはＩＳＣＯＭのような粒子状構造中で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方され得る。サポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような賦形剤と一緒に処方されて、粘度を増大されてもよいし、またはラクトースのような粉末賦形剤とともに乾燥粉末形態に処方されてもよい。
１つの好ましい実施形態において、アジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ、例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントとの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）される、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを使用する、別の特に好ましいアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
別の強化されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせがＷＯ００／０９１５９に開示されている。好ましくは、この処方物は、さらに、水中油型エマルジョンおよびトコフェノールを含む。
本発明の薬学的組成物における使用のためのさらなる代表的アジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）、例えば、係属中の米国出願登録番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０、ならびにその開示が全体として参考文献として本明細書に組み込まれる米国特許第６，３０２，３４７号に記載されるアジュバント、ならびにＷＯ ９９／５２５４９Ａ１に記載のアジュバントのようなポリオキシエチレンエーテルアジュバントが挙げられる。本発明の薬学的組成物における使用のためのさらなる例示的なアジュバントとしてはイソツセロゾール（ｉｓｏｔｕｃｅｒｏｓｏｌ）が挙げられる。
他の好ましいアジュバントは、一般式
（Ｉ）：ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒのアジュバント分子が挙げられるが、
ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなるが、ここで、ｎは、１と５０との間、好ましくは４〜２４、最も好もしくは９であり、このＲ成分は、Ｃ１〜５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、最も好ましくはＣ１２アルキルであり、Ａは、結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版、７７１７項目）に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願ＧＢ９８２０９５６．２号に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
本発明の別の実施形態に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣとなるように操作され得る他の細胞）を介して宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／もしくは維持を改善するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、／または受け手と免疫学的に適合性（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）であるように遺伝学的に改変されてもよいが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、腫瘍および腫瘍周辺組織を含む種々の生物学的な流体および器官のいずれかから単離されてもよいし、自己の細胞、同種異系の細胞、同系の細胞、または異種細胞であってもよい。
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を用いる。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５１、１９９８）、予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングして提示するそれらの能力、および未処理のＴ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。当然ながら樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原負荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用されてもよい（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：５９４〜６００，１９９８を参照のこと）。
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得ることができる。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物（単数または複数）の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、これによって、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を単純な方法で区別することが可能になる。しかしこの命名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられる。成熟表現型は代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の変異体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、このコードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与されてもよく、これによってインビボで起こるトランスフェクションが生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６〜４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合されてもよい。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーでパルスされてもよい。
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、このタイプのキャリアは、代表的に投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物は、投与の任意の適切な様式、例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、粘膜投与、静脈投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、および筋肉内投与を含む様式のために処方され得る。
このような薬学的組成物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、また生分解性であり得る。特定の実施形態において、好ましくは、この処方物は比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。しかし、他の実施形態において、投与直後のより迅速な放出速度が所望され得る。このような組成物の処方は十分に、公知の技術を使用する当業者のレベル内である。この点に関して有用な例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示的な徐放性キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）を含む超分子バイオベクター、ならびに必要に応じて、両親媒性化合物を含む外部層、例えば、リン脂質（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）を含む超分子バイオベクターが挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性な化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間、ならびに治療または予防されるべき状態の性質に依存する。
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリア系、例えば、ＷＯ／９９ ４０９３４およびそこで引用される参考文献に記載されるような系もまた、多くの用途に有用である。別の例示的なキャリア／送達系は、キャリア含有粒子−タンパク質複合体、例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載される複合体を使用するが、この複合体は、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
別の例示的な実施形態では、リン酸カルシウムコア粒子を、キャリア、ワクチンアジュバントとして、または本発明の組成物のための徐放性マトリックスとして使用する。例示的なリン酸カルシウム粒子は、例えば、公開特許出願番号ＷＯ／００４６１４７に開示される。
本発明の薬学的組成物はしばしば、１つ以上の、緩衝液（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤をさらに含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単回用量容器または多用量容器、例えば、密閉アンプルまたはバイアル中に存在し得る。このような容器は代表的に、使用まで処方物の無菌性および安定性を維持するような様式で密封される。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、薬学的組成物は、使用の直前に滅菌水性キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および処方を含む、様々な治療レジメンにおいて本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび治療レジメンの開発は、当該分野で周知であり、これらのいくつかは、一般的な例示目的のために以下で簡単に考察される。
特定の用途においては、本明細書中で開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。従って、これらの組成物は、不活性希釈剤と共にもしくはは同化可能食用キャリアと共に処方されてもよいし、またはこれらの組成物は、硬質もしくは軟質殻ゼラチンカプセルに入れられてもよいし、またはこれらの組成物は錠剤に圧縮されてもよいし、またはこれらの組成物は食餌の食品に直接組み込まれてもよい。
活性化合物は、さらに賦形剤と共に組み込まれてもよく、経口摂取錠剤、経頬粘膜錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハ剤などの形態で使用されてもよい（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７ Ｍａｒ ２７；３８６（６６２３）：４１０〜４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １９９８；１５（３）：２４３〜８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、任意の種々のさらなる成分、例えば、結合因子、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンを含んでもよく；賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ポテトデンプン、アルギン酸など；潤沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；および甘味料、例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリンが添加されてもよいし、または香料、例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料が添加されてもよい。投薬量単位形態がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして、そうでなければ投薬単位の物理的形態を改変するために、存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方でコーティングされてもよい。当然ながら、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物が、持続性放出調製物および処方物に組み込まれてもよい。
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含むが、活性成分（単数または複数）の割合は当然ながら変化し得、好都合には、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％との間またはそれ以上であってもよい。当然、治療的に有用な組成物の各々の中の活性化合物（単数または複数）の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製されてもよい。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような因子、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、従って、種々の投薬量および治療レジメンが、所望され得る。
経口投与のためには、本発明の組成物は代替的には、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤とともに組み込まれる。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液のような経口溶液に組み込まれてもよいし、または歯みがき剤に分散されてもよいし、または治療的有効量で、水、結合因子、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加されてもよい。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれてもよいし、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形されてもよい。
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのいくつかは、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての、活性化合物の溶液は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合されて水中で調製され得る。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、オイル中で調製されてもよい。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
注入用途のために適切な例示的な薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用液剤または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、滅菌でなければならず、容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、／または界面活性剤の使用によって、維持されてもよい。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって促進され得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によって、もたらされ得る。
１実施形態では、水溶液の非経口投与のために、必要に応じてその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解されて、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加されてもよいし、または注入予定部位で注入されてもよい（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、治療される被験体の状態に依存して必然的に生じる。さらに、ヒト投与について、当然ながら、調製物は好ましくは、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を満たす。
本発明の別の実施形態において、本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方されてもよい。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、これらの塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
キャリアは、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、意図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。「薬学的に受容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ−ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」という句は、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達されてもよい。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９８ Ｍａｒ ２；５２（１〜２）：８１〜７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を用いる薬物の送達も、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での例示的な経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。
特定の実施形態においては、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために用いる。詳細には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合され得る。
潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の形成および用法は一般に、当業者に公知である（例えば、各々が、その全体を本明細書中で参考として詳細に援用される、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８ Ｊｕｌ；１６（７）：３０７〜２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９８ Ｍａｒ；５６（３）：６９１〜５；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ａｕｇ；３５（８）：８０１〜９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２〜３）：２３３〜６１；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号を参照のこと）。
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションが通常困難である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９０ Ｓｅｐ ２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ａｐｒ；９（３）：２２１〜９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答にも受容不可能な毒性にも関連しないようである。
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、多層同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自然に形成する。
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を安定かつ再現可能な様式で捕獲し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ．１９９８ Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３〜２８を参照のこと）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを用いて設計してもよい。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１〜２０；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８ Ｍａｒ；４５（２）：１４９〜５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８ Ｊａｎ ２；５０（１〜３）：３１〜４０；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されるようにして作製され得る。
（悪性疾患の治療）
ガン治療への免疫学的アプローチは、ガン細胞が、異常な細胞および分子または外来の細胞および分子に対する人体の防御をしばしば回避し得、これらの防御が、失った基盤（ｇｒｏｕｎｄ）を取り戻すために免疫的に刺激され得るという認識に基づく（例えば、Ｋｌｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）、６２３〜６４８頁）。種々の免疫エフェクターが腫瘍の増殖を直接的または間接的に阻害し得るという多数の最近の知見は、癌治療に対するこのアプローチにおいて関心を再び戻した（例えば、Ｊａｇｅｒら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００１；６０（１）：１−７；Ｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０００ Ｄｅｃ；７９（１２）：６５１−９）。
抗腫瘍細胞の免疫および人体からの腫瘍細胞の除去に関連する機能を有する４つの基本的な細胞型は、以下の通りである：ｉ）非自己侵入細胞を認識および標識するために免疫グロブリンを血漿に分泌するＢ−リンパ球；ｉｉ）免疫グロブリンでコーティングされた標的侵入細胞の溶解および処理を担う補体タンパク質を分泌する単球；ｉｉｉ）腫瘍細胞の破壊、抗体依存性細胞傷害およびナチュラルキリング（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）のための２種類の機構を有するナチュラルキラーリンパ球；ならびにｉｖ）抗原特異的レセプターを保持し、相補的マーカー分子を保有する腫瘍細胞を認識する能力を有するＴ−リンパ球（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｈ．、１９８９、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編）、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、９２３〜９５５頁）。
癌の免疫治療は、一般に、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはそれらの両方を誘導することに焦点が当てられている。さらに、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の誘導は、抗体または細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを二次的に誘導するために必要であることが十分に確立されている。ガン細胞、特に、ＷＴ１発現に関連したガン細胞に対して選択的であるか、または理想的には特異的であるポリペプチド抗原は、ＷＴ１発現に関連するガンに対する免疫応答を誘導するための強力なアプローチを提供し、本発明の重要な態様である。
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載される組成物およびワクチンは、悪性疾患（例えば、進行性もしくは転移性の疾患、または微小残存病変のような小腫瘍負荷によって特徴付けられる疾患）の進行を阻害するために用いられ得る。一般には、このような方法は、ＷＴ１発現に関連する疾患を予防、遅延または治療するために用いられ得る。言い換えれば、本明細書において提供される治療方法は、既存のＷＴ１関連疾患を治療するために用いられてもよいし、または疾患がないかもしくはＷＴ１発現をまだ伴っていない疾患に罹患している患者においてこのような疾患の発現を予防または遅延するために用いられてもよい。
本明細書において用いる場合、疾患状態の細胞（例えば、腫瘍細胞）が、この疾患の経過の間のある時点で、同じ組織の正常な細胞よりも検出可能な高レベルのＷＴ１ポリペプチドを生成する場合、この疾患は「ＷＴ１発現を伴う、ＷＴ１発現に関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＷＴ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」。ＷＴ１発現と悪性疾患との関連は、ＷＴ１が腫瘍に存在する必要はない。例えば、ＷＴ１の過剰発現は、腫瘍の発現に関与し得るが、その後のタンパク質発現はなくてもよい。あるいは、ＷＴ１発現の増大によって特徴付けられない悪性疾患は、後に、ＷＴ１発現の増大によって特徴付けられる疾患に進行するかもしれない。従って、疾患状態の細胞が増大したレベルのＷＴ１を以前に発現したか、現在発現しているか、またはその後に発現することが期待される任意の悪性疾患は、「ＷＴ１発現を伴う、ＷＴ１発現に関連する」とみなされる。
免疫療法は、本明細書に提供される化合物または細胞が患者からＷＴ１発現細胞を除去するように機能する任意の種々の技術を用いて行なうことができる。このような除去は、ＷＴ１またはＷＴ１を発現する細胞に特異的な患者における免疫応答を増強または誘導する結果として生じ得る。あるいは、ＷＴ１発現細胞は、エキソビボで除去されてもよい（例えば、自家の骨髄、末梢血、または骨髄もしくは抹消血の画分の治療によって）。骨髄または末梢血の画分は、当該分野の任意の標準的な技術を用いて得てもよい。
このような方法では、薬学的組成物およびワクチンが患者に投与されてもよい。本明細書において用いる場合、「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」とは、任意の温血動物、好ましくはヒトをいう。患者は、悪性疾患に罹患しても罹患していなくてもよい。従って、上記の薬学的組成物およびワクチンは、疾患の発現を妨げるために（すなわち、予防的に）または疾患に罹患している患者を治療するために（例えば、既存の疾患の進行および／または転移を予防または進行させるために）用いられ得る。疾患に罹患している患者は、微小残存病変（例えば、外科的放射線療法および／または化学療法の後の、完全なもしくは部分的な寛解の白血病患者、または腫瘍負荷の減少後のガン患者における低い腫瘍負荷）を有してもよい。このような患者は、再発を阻害する（すなわち、再発を防止もしくは遅延させるか、または再発の重篤度を低下させる）ために免疫され得る。特定の好ましい実施形態では、患者は白血病（例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬまたは小児ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）またはガン（例えば、胃腸、肺、甲状腺癌または乳癌または黒色腫）に罹患しているか、またはＷＴ１発現細胞に関する自己免疫疾患に罹患しており、ここではこのガンまたは白血病はＷＴ１陽性である（すなわち、本明細書に提供されるような抗ＷＴ１抗体と検出可能に反応するか、または本明細書に記載されるように、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能なレベルでＷＴ１ ｍＲＮＡを発現する）。
ＷＴ１過剰発現に関連する他の疾患としては、Ｓａｔｏｈ Ｆら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｍｔ．５０（６）：４５８〜７１（２０００）、およびＣａｍｐｂｅｌｌ Ｃ．Ｅ．らＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７８（２）：１８２〜８（１９９８）に記載されるような、腎臓癌（例えば、腎臓細胞癌腫、またはウィルムス腫瘍）；およびＡｍｉｎ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６（２）：３４４〜５６（１９９５）に記載されるような中皮腫が挙げられる。Ｈａｒａｄａら（Ｍｏｌ．Ｕｒｏｌ．３（４）：３５７〜３６４（１９９９）は、ヒト胸腺生殖細胞腫瘍におけるＷＴ１遺伝子発現を記載している。Ｎｏｎｏｍｕｒａら、Ｈｉｎｙｏｋｉｋａ Ｋｉｙｏ ４５（８）：５９３〜７（１９９９）は、精巣癌特異的遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応を用いて精巣癌の分子のステージングを記載している。Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１９（２）：１５８〜６３（２０００）は、上皮性卵巣癌におけるウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の免疫組織化学的検出を記載する。
ＷＴ１過剰発現はまた、Ｂａｒｎｏｕｄ、Ｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２４（６）：８３０〜６（２０００）；およびＰａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９４（１０）：６９３〜７００（１９９８）によって、線維形成性小円形細胞において記載された。グリア芽細胞腫および他のガンにおけるＷＴ１の過剰発現は、Ｍｅｎｓｓｅｎ，Ｈ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２６（４）：２２６〜３２（２０００）、「Ｗｉｌｍｓ’ ｔｕｍｏｒ ｇｅｎｅ（ＷＴ１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｆｒｅｓｈｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」に記載された。ＷＴ１過剰発現を示す他の疾患としては、ＥＢＶ関連疾患、例えば、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌が挙げられる（Ｓｐｉｎｓａｎｔｉ Ｐら、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ３８（５−６）：６１１〜９（２０００）「Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」。
Ｌｅｕｋｅｍｉａ １４（９）：１６３４〜４（２０００）において、Ｐａｎらは、白血病または骨髄異形成症候群を有する患者由来の末梢血単核球のインビトロのＩＬ−１２治療を記載しており、細胞毒性の増大およびＷＴ１遺伝子発現の減少を報告した。Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３（６）：８９１〜９００（１９９９）では、Ｐａｔｍａｓｉｒｉｗａｔらは、骨髄異形成症候群および急性白血病におけるＷＴ１およびＧＡＴＡ１発現を報告した。Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３（３）：３９３〜９（１９９９）において、Ｔａｍａｋｉらは、ウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１が骨髄異形成症候群の疾患進行の診断の良好なマーカーであることを報告した。固形腫瘍におけるウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１の発現、および腫瘍細胞増殖におけるその関与は、胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌細胞株、生殖細胞腫瘍細胞株、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌細胞株、肝細胞癌について、Ｏｊｉら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９０（２）：１９４〜２０４（１９９９）に考察された。
本明細書に提供される組成物は、単独で、または従来の治療レジメン、例えば、外科手術、放射線療法、化学療法および／または骨髄移植（自家、同系、同種異系または無関係）と組み合わせて用いられ得る。以下にさらに詳細に考察されるように、本明細書に提供されるような結合因子およびＴ細胞は、自家の幹細胞のパージ（ｐｕｒｇｉｎｇ）のために用いてもよい。このようなパージは、例えば、骨髄移植または血液もしくはその成分の輸血の前が有利であり得る。本明細書に提供される、結合剤、Ｔ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および組成物はさらに、自家、同系、同種異系または無関係のＷＴ１特異的Ｔ細胞をインビトロ、および／またはインビボで増殖および刺激する（またはプイミングする）ために用いられ得る。このようなＷＴ１特異的Ｔ細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入で用いられてもよい。
投与の経路および頻度、ならびに投薬量は個体間で異なり、標準的な技術を用いて容易に達成され得る。一般には、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）によって、経鼻的に（例えば、吸引）、または経口的に投与され得る。いくつかの腫瘍では、薬学的組成物またはワクチンは、局所的に投与されてもよい（例えば、直腸結腸内視鏡、胃内視鏡、ビデオ内視鏡、血管造影法または当該分野で公知の他の方法によって）。好ましくは、１〜１０の用量を５２週間の期間にわたって投与してもよい。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量を投与して、ブースターワクチン接種をその後に定期的に行なってもよい。別のプロトコールが、個々の患者に適切であるかもしれない。適切な用量とは、上記のように投与された場合、基礎（すなわち、未処理）レベルを少なくとも１０〜５０％超える抗腫瘍免疫応答を促進し得る化合物の量である。このような応答は、患者での抗腫瘍抗体を測定することによって、またはインビトロで患者の腫瘍細胞を殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性生成によって、モニターできる。このようなワクチンは、ワクチン接種されていない患者に比べてワクチン接種した患者において、改善された臨床的転帰（例えば、より高頻度な完全もしくは部分的な寛解、または疾患のない期間がより長いか、および／または全生存）をもたらす免疫応答を生じ得るはずである。一般的には、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンのためには、ある用量中に存在する各々のポリペプチドの量は、約１００μｇ〜５ｍｇに及ぶ。適切な用量サイズは、患者のサイズで異なるが、代表的には、約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲に及ぶ。
一般的に、適切な投薬および処理レジメンによって、治療および／または予防的な利点を得るのに十分な量の活性化合物（単数または複数）が得られる。このような応答は、治療されていない患者に比較して治療された患者で、改善された臨床的転帰（例えば、より高頻度な完全もしくは部分的な寛解、または疾患のない期間がより長いか、および／または全生存）を達成することによってモニターできる。ＷＴ１に対する既存の免疫応答の増大は一般に、改善された臨床的転帰に関連する。このような免疫応答は一般に、治療の前後に患者から得られるサンプルを用いて行なわれ得る標準的な増殖、細胞毒性またはサイトカインアッセイを用いて評価され得る。
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であってもよく、ここでは治療は、免疫応答修飾因子（例えば、本明細書中で提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与を用いる、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であってもよく、ここでは治療は、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、必ずしも無傷な宿主免疫系に依存しない、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上で考察したようなＴ細胞、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および本明細書中に提供されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたはエフェクター細胞中にクローニングされ、発現され、移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
モノクローナル抗体は、検出、診断アッセイまたは治療適用において、所望される選択的な利用のために、任意の種々の標識で標識され得る（各々が個々に援用されるかのように、本明細書中でこれらの全体が参考として援用されている、米国特許第６，０９０，３６５号；同第６，０１５，５４２号；同第５，８４３，３９８号；同第５，５９５，７２１号；および同第４，７０８，９３０号に記載されている）。各々の場合において、抗原の決定部位への標識されたモノクローナル抗体の結合は、特定の治療剤の検出または異常な細胞上の抗原決定部位への特定の治療剤の送達を示す。本発明のさらなる目的は、このようなモノクローナル抗体の所望される選択的な利用を達成するために適切に標識された、特定のモノクローナル抗体を提供することである。
エフェクター細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖によって養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂していない支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）の存在下における、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養物を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされてもよいし、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされてもよい。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされてもよい。治療において使用するための培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖されかつ広範に分散可能であり、長期間生存可能でなければならない。培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖し、ＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存するように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段好ましくは、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与による滅菌形態を用いて患者に再導入されてもよい。
さらなる態様では、ＷＴ１発現をともなう悪性疾患の進行を阻害するための方法は、上記のような、ＷＴ１ポリペプチドまたはＷＴ１発現ＡＰＣに応答して活性化されている自家のＴ細胞の投与を包含する。このようなＴ細胞は、ＣＤ４＋であっても、／またはＣＤ８＋であってもよく、上記のように増殖され得る。Ｔ細胞は、悪性疾患の進行を阻害するのに有効な量で個体に投与され得る。代表的には約１×１０９〜１×１０１１個のＴ細胞／Ｍ２が静脈内に、腔内にまたは切除された腫瘍床に投与される。細胞の数および投与の頻度は、患者の応答に依存することが当業者には明らかである。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、自家骨髄移植の前に刺激され得る。このような刺激は、インビボで生じてもインビトロで生じてもよい。インビトロ刺激のためには、患者から得た骨髄および／または末梢血（または骨髄もしくは末梢血の画分）を、上記のようにＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣと、Ｔ細胞の刺激を可能にするのに十分な条件および時間のもとで接触させてもよい。次いで、骨髄、末梢血幹細胞および／またはＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を用いて患者に投与され得る。
関連の実施形態では、関連または無関係のドナーのＴ細胞は、同系または同種異系（関連または無関係の）骨髄移植の前に刺激され得る。このような刺激は、インビボで生じても、またはインビトロで生じてもよい。インビトロ刺激のためには、関連または無関係のドナーから得た骨髄および／または末梢血（または骨髄もしくは末梢血の画分）を、上記のようにＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣと、Ｔ細胞の刺激を可能にするのに十分な条件および時間のもとで接触させてもよい。次いで、骨髄、末梢血幹細胞および／またはＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を用いて患者に投与され得る。
他の実施形態では、本明細書に記載されるようなＷＴ１特異的Ｔ細胞は、自家の骨髄、末梢血、または骨髄もしくは末梢血の画分（例えば、患者への投与の前のＣＤ３４＋富化末梢血（ＰＢ））からＷＴ１発現細胞を除去するために用いられ得る。このような方法は、骨髄またはＰＢとこのようなＴ細胞とを、骨髄または末梢血中の骨髄性細胞またはリンパ性細胞の総数の１０％未満まで、好ましくは５％未満そしてさらに好ましくは１％未満までＷＴ１発現細胞の減少を可能にするのに十分な条件および時間のもとで接触させることによって行なうことができる。このような細胞が除去されている程度は、標準的な方法、例えば、定性的および定量的なＰＣＲ分析、形態学、免疫組織化学およびＦＡＣＳ分析などによって容易に決定され得る。次いで、骨髄またはＰＢ（またはそれらの画分）は、標準的な技術を用いて患者に投与され得る。
（癌の検出および診断の組成物、方法およびキット）
一般的に、ＷＴ１発現を伴う癌は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または腫瘍生検）における１つ以上のＷＴ１タンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて患者において検出され得る。言い換えると、このようなＷＴ１タンパク質は、癌の存在の有無を示すためのマーカーとして用いられ得る。本明細書中で提供される結合因子は一般に、生物学的サンプル中で、この薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。
ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、癌の存在の有無についても示す、ＷＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために用いられ得る。一般に、ＷＴ１配列は、腫瘍が発生するのと同じタイプの正常な組織よりも、腫瘍組織において、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは５倍以上のレベルで存在するはずである。この腫瘍が発生するのとは異なる組織タイプにおけるＷＴ１の発現レベルは、特定の診断実施形態において不適切である。なぜならば、この腫瘍細胞の存在は、同一の型の正常組織における発現レベルに対する、腫瘍組織において予め決定された異なる発現レベル、例えば、２倍、５倍などの観測により確認され得るからである。
他の異なる発現パターンは、診断目的のために有利に利用され得る。例えば、本発明の１つの態様において、同一の型だが他の正常組織の型ではない、腫瘍組織および正常組織例えば、ＰＢＭＣにおけるＷＴ１配列の過剰発現は、診断的に開発され得る。この場合において、例えば、循環組織部位または腫瘍が発生する組織部位とは異なるいくつかの他の組織部位から採取されたサンプル中における転移性腫瘍細胞の存在は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、このサンプル中の腫瘍配列の発現を検出することによって同定および／または確認され得る。多くの場合において、目的のサンプル中の腫瘍細胞、例えば、ＰＢＭＣを、細胞捕獲（ｃｅｌｌ ｃａｐｔｕｒｅ）技術または他の類似の技術を用いて、富化することが所望される。
サンプル中のＷＴ１ポリペプチドマーカーを検出するために結合因子を用いるための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者におけるＷＴ１を伴う癌の有無は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合因子と接触させる工程；（ｂ）結合因子に結合するＷＴ１ポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ＷＴ１ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
好ましい実施形態において、このアッセイは、ＷＴ１ポリペプチドに結合するためおよびサンプルの残りからＷＴ１ポリペプチドを除くために固体支持体上に固定された結合因子の使用を包含する。次いで、結合されたＷＴ１ポリペプチドは、レポーター基を含み、結合因子／ＷＴ１ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を用いて検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ＷＴ１ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合因子、あるいはこの結合因子に特異的に結合する他の因子、例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンを含み得る。あるいは、競合アッセイを、利用してもよく、ここではＷＴ１ポリペプチドが、レポーター基で標識され、サンプルと結合因子のインキュベーション後にその固定された結合因子に結合される。サンプルの成分が標識されたＷＴ１ポリペプチドの結合因子への結合を阻害する程度は、サンプルの固定された結合因子との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドとしては、上記のような、全長ＷＴ１タンパク質および結合因子が結合するそのポリペプチド部分が挙げられる。
固体支持体は、ＷＴ１タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク、例えば、ガラス、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質、例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニルであってもよい。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のものであってもよい。この結合因子は、特許および科学文献に十分に記載されている、当業者に公知の種々の技術を用いて固体支持体上に固定され得る。本発明の状況において、用語「固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」とは、非共有結合的な会合、例えば、吸着、および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合されてもよいし、または架橋剤による結合であってもよい）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化が好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間の長さ結合因子に接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることが、適切な量の結合因子を固定化するのに十分である。
固体支持体への結合因子の共有結合は一般に、支持体および結合因子上の官能基、例えば、水酸基またはアミノ基の両方と反応する二官能性試薬と、支持体とを最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合因子は、ベンゾキノンを用いて、または結合パートナー上のアミンおよび活性水素と支持体上のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、一般にはマイクロタイタープレートのウェルである固体支持体上で固定されている抗体とサンプルとを接触させて、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定された抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、未結合サンプルは固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、レポーター基を含む検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体）が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤、例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、当業者に公知である。次いで、固定された抗体をサンプルとインキュベートして、ポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈されてもよい。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、ＷＴ１を伴う癌を有する個体から得られたサンプル内のＷＴ１ポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。結合ポリペプチドと未結合ポリペプチドとの間の平衡で達成される少なくとも約９５％。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
次いで、未結合サンプルが、適切な緩衝液、例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳを用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。次いで、レポーター基を含む第２の抗体が、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
次いで、検出試薬を、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な長さの時間、固定された抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートする。適切な長さの時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、未結合の検出試薬は除去され、結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
ＷＴ１発現を伴う癌の存在の有無を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルを、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較する。１つの好ましい実施形態において、ＷＴ１関連性の癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体を、この癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。別の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃａｒｖｅ）を用いて決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各々の可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の、上方左側の角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされてもよいし、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされてもよい。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行され、ここでは、結合因子が、ニトロセルロースのような膜上で固定化される。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定された結合因子に結合する。次いで、第２の標識化された結合因子が、この第２の結合因子を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合因子−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合因子の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合因子が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合因子を含む領域を通って、固定された結合因子の領域まで移動する。固定された抗体の領域での第２の結合因子の濃度は、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合因子の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン、例えば、線を形成する。このようなパターンがないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合因子の量は、生物学的サンプルが、上で考察された形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、より好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
当然ながら、本発明のＷＴ１タンパク質または結合因子との使用に適する多数の他のアッセイプロトコールが存在する。上記の記載は、例示であることを意図するにすぎない。例えば、上記プロトコールは、腫瘍ポリペプチドを用いるために容易に改変可能であり、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明らかである。このようなＷＴ１特異的抗体の検出は、ＷＴ１発現を伴う癌の存在と相関し得る。
ＷＴ１発現を伴う癌はまた、代替的には、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、ＷＴ１ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、Ｔ細胞の特異的活性化の有無が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７□Ｃにてポリペプチド（例えば、５〜２５□ｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、ＷＴ１ポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者におけるＷＴ１発現を伴う癌の存在を示す。
上記のように、癌もまた、代替的には、生物学的サンプル中のＷＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて使用して、生物学的サンプルに由来するＷＴ１ｃＤＮＡの一部を増幅してもよいが、ここでは、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つが、ＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離され、検出される。
同様に、ＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこのＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、本発明のＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、このＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的には、ＲＮＡは生物学的サンプル、例えば、生検組織から抽出し、逆転写してｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的には陽性とみなされる。
本発明の別の態様において、細胞捕獲技術を、例えば、リアルタイムＰＣＲと組み合わせて用いて、ＷＴ１抗原を発現する転移細胞の検出のためのより感度の高いツールを提供し得る。生物学的サンプル、例えば、骨髄サンプル、末梢血、および小針吸引サンプルにおけるＷＴ１関連性癌細胞の検出は、ＷＴ１発現を伴う癌患者の診断および予後判定に望ましい。
細胞表面マーカーに対する特異的モノクローナル抗体、または４量体抗体複合体でコーティングされた免疫磁性ビーズを用いて、サンプル中の癌細胞を最初に富化してもよいし、またはサンプル中の癌細胞をポジティブに選択してもよい。種々の市販のキットが用いられ得るが、これらのキットとしては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｍＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）、およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。当業者は、他の方法論およびキットを用いて、所望の細胞集団を富化またはポジティブに選択し得ることを認識する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈは、正常上皮組織および新生物上皮組織上で発現された２つの糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂでコーティングされた磁性ビーズを含む。このコーティングされたビーズをサンプルに添加してもよく、次いで、このサンプルを磁石に接触させ、それによってこのビーズに結合した細胞を捕獲してもよい。所望でない細胞は洗い流され、磁石により単離された細胞は、ビーズから溶出され、さらなる分析において用いられる。
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプルから直接細胞を富化するために用いられ得るが、種々の所望でない細胞を標的とし、サンプル中に存在する赤血球（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡにそれらを架橋してロゼットを形成する４量体の抗体のカクテルからなる。Ｆｉｃｏｌｌ上で遠心分離すると、標的とした細胞ペレットは、遊離のＲＢＣとともにペレットを形成する。枯渇カクテルにおける抗体の組み合わせによって、どの細胞が除去され、結果的にどの細胞が回収されるかが決定される。利用可能な抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥ、およびＴＣＲαβ。
別の実施形態において、本明細書中に記載された組成物は、癌の進行についてのマーカーとして用いられ得る。この実施形態において、ＷＴ１発現をともなう癌の診断について上記に記載されるようなアッセイが、経時的に実行され得、反応性ポリペプチド（単数または複数）またはポリヌクレオチド（単数または複数）のレベルの変化を評価し得る。例えば、このアッセイは、６ケ月〜１年の期間、２４〜７２時間毎に実行されてもよく、その後、必要に応じて実行されてもよい。一般に、癌は、検出されるＷＴ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増大する患者において進行している。対照的に、癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままであるか、または時間とともに減少するかのいずれかである場合、進行していない。
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍上で直接実施され得る。このようなアッセイの１つは、腫瘍細胞を結合因子と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合因子は、レポーター基によって直接的または間接的に検出され得る。このような結合因子はまた、組織学的な用途において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブは、このような用途において使用されてもよい。
本発明はさらに、上記の診断方法のうちのいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。このようなキットは代表的に、診断アッセイを行うのに必要な２以上の構成要素を備える。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、ＷＴ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように支持体材料に付着されて提供され得る。１以上のさらなる容器が、アッセイにおいて使用される構成要素、例えば、試薬または緩衝液を封入し得る。このようなキットはまた、代替的には、抗体結合の直接的または間接的な検出に適切なレポーター基を含む上記のような検出試薬を備えてもよい。
あるいは、キットは、生物学的サンプル中のＷＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは一般に、ＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを備える。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得る。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、ＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは容器が挙げられる。
以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定のためではない。
（実施例１）
（血液学的悪性疾患を有する患者におけるＷＴ１に対する免疫応答の同定）
本実施例は、血液学的悪性疾患を有する患者における免疫応答の存在の同定を例証する。
患者における既存のＷＴ１特異的抗体応答の存在を評価するために、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および重篤な再生不良性貧血（ａｐｌａｓｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）を有する患者の血清をウエスタンブロット分析を用いて分析した。血清は、ヒト白血病細胞株Ｋ５６２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）由来のＷＴ１を免疫沈降する能力について試験した。各々の場合に、免疫沈降はゲル電気泳動によって分離して、膜に転写して、抗ＷＴ１抗体ＷＴ１８０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でプローブした。このウエスタンブロット分析によって、血液学的悪性疾患を有する患者におけるＷＴ１特異的抗体の能力を同定した。ＡＭＬを有する患者についての結果を示す代表的なウエスタンブロットを図２に示す。患者血清を用いて生成した免疫沈降における５２ｋＤのタンパク質は、ＷＴ１特異的抗体によって認識された。この５２ｋＤのタンパク質は、陽性コントロールと同じサイズで移動した。
さらなる研究によって、全長および短縮ＷＴ１タンパク質に対する抗体の存在についてＡＭＬおよびＣＭＬを有する患者の血清を分析した。ヒトＷＴ１／全長（アミノ酸１〜４４９）、Ｎ末端（アミノ酸１〜２４９）（ＷＴ１／Ｎ末端）およびＣ末端（アミノ酸２６７〜４４９）（ＷＴ１／Ｃ末端）領域に相当するｃＤＮＡ構築物を、改変ｐＥＴ２８ベクター中にサブクローニングした。ＷＴ１／全長タンパク質およびＷＴ１／Ｎ末端のタンパク質をＲａｌ２融合タンパク質として表した。Ｒａ１２は、ＭＴＢ３２Ｂと称される分泌されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質のＣ末端フラグメントである（Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６７；３９９８，１９９９）。Ｒａ１２−ＷＴ１／全長融合領域を、ヒスチジン−タグ修飾ｐＥＴ２８ベクター中でヒスチジン−タグに対して３’側にクローニングした。ＷＴ１／Ｎ末端領域を、改変されたｐＥＴ２８ベクター中にサブクローニングしたが、このベクターは、５’ヒスチジンタグ、その後にチオレドキシン（ＴＲＸ）−ＷＴ１／Ｎ末端融合領域、その後に３’ヒスチジンタグを有する。ＷＴ１／Ｃ末端コード領域を、改変されたｐＥＴ２８ベクター中に５’および３’ヒスチジンタグのみ、続いてトロンビンおよびＥＫ部位を含み、融合パートナーなしでサブクローニングした。
ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を３つのＷＴ１発現構築物で形質転換して、一晩増殖させて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）で誘導した。ＷＴ１タンパク質は以下のとおり精製した：細胞を収集して、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０中で３７℃でのインキュベーションと、その後の超音波処理の繰り返しによって溶解した。封入体は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０を用いて２回洗浄した。次いでタンパク質を、ニッケル−ニトロセルロース酸樹脂（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；Ｈｏｃｈｕｌｉら．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：２１７，１９８９）上での金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてＳｏｕｒｃｅ Ｑ陰イオン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でのクロマトグラフィーによって精製した。ＷＴ１タンパク質の同定は、Ｎ末端配列決定によって確認した。
新規のＡＭＬまたはＣＭＬを有する成人患者由来の血清を、ＷＴ１特異的Ａｂの存在について研究した。組み換えタンパク質をＴＣマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた。プレートをＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄して、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロックした。洗浄後、血清希釈物を添加して、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄して、Ｄｏｎｋｅｙ（ロバ）抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体を添加して（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄して、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）とともにインキュベートして、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でクエンチして、直ちに読み取った（Ｃｙｔｏ−Ｆｌｕｏｒ ２３５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。
血清学的調査のために、１：５０〜１：２０，０００の連続希釈の範囲にわたって、ヒト血清をＥＬＩＳＡによって試験した。陽性の反応とは、１：５００希釈した血清のＯＤ値が、３つの（ＷＴ１／全長、ＷＴ１Ｃ−末端）標準偏差によって、正常ドナー（ｎ＝９６）由来の血清の平均ＯＤ値を超えるとして規定された。ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質に対して正常なドナーにおけるバックグラウンドが高いことに起因して、ＷＴ１／Ｎ末端に対する正の反応とは、１：５００希釈した血清のＯＤ値が、４つの標準偏差によって、正常ドナー由来の血清の平均ＯＤ値を超えるとして規定された。患者のＡｂ応答が、ＷＴ１に対するものであって、タンパク質のＲａ１２もしくはＴＲＸ融合部分または潜在的なＥ．ｃｏｌｉ混入タンパク質に対するものではないことを確認するために、コントロールには、同様の方式で精製したＲａ１２およびＴＲＸタンパク質のみを含んだ。Ｒａ１２および／またはＴＲＸタンパク質に対する反応性を示すサンプルは、分析から排除した。
ＷＴ１に対する免疫の存在を検討するために、健常な個体および白血病を有する患者の血清における、組み換え全長ＷＴ１タンパク質および短縮型ＷＴ１タンパク質に対するＡｂを確認した。抗体の反応性をＷＴ１／全長タンパク質、ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質およびＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性によって分析した。
９６例の正常なドナーのうちのわずか２例は、ＷＴ１／全長タンパク質と反応性の血清抗体を有した（図１８）。これらの個体のうちの１例がＷＴ１／Ｎ末端タンパク質に対する抗体を有し、１例がＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する抗体を有した。対照的に、ＡＭＬを有する６３例の患者のうち１６例（２５％）が、ＷＴ１／全長タンパク質と反応性の血清抗体を有した。好対照なことに、６３例の患者のうちＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する反応性を有したのはわずか２例（３％）であった。ＣＭＬを有する８１例の患者のうち１５例（１９％）が、ＷＴ１／全長タンパク質と反応性の血清抗体を有し、８１例の患者のうち１２例（１５％）がＷＴ１／Ｎ末端との反応性を有する血清抗体を有した。８１例の患者のうちＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する反応性を有したのはわずか３例（３％）であった（図１６および１７）。
これらのデータによって、ＷＴ１に対するＡｂ応答がＡＭＬおよびＣＭＬを有する数例の患者では検出可能であることが実証される。白血病患者における抗体の頻度が高いほど、ＷＴ１タンパク質に対する免疫は、ＷＴ１を発現する悪性疾患を有する患者の結果として、またはいつか発現されたＷＴ１の結果として生じるという強力な証拠が得られる。特定の理論に限定されることはないが、ＷＴ１に対して観察された抗体応答は好ましくは、ＷＴ１に対して免疫となる患者から、彼ら自身の白血球細胞上で生じる可能性が高く、ＷＴ１が「自己（ｓｅｌｆ）」タンパク質であることにかかわらず免疫原性であり得るという直接的な証拠が得られると考えられる。
ＷＴ１に対する抗体の存在は、同時発生的なヘルパーＴ細胞応答が同じ患者にも存在するということを強く意味する。ＷＴ１は内部タンパク質である。従って、ＣＴＬ応答は、白血病治療に関して最も有効であり、免疫の最も毒性の武器であると考えられる。従って、これらのデータによって、ＷＴ１に対する治療ワクチンは、ＷＴ１に対する免疫応答を惹起できるという証拠が得られる。
検出された抗体のほとんどが、Ｎ末端内のエピトープと反応性であったが、患者のうちわずかな小グループのみがＣ末端に対する弱い抗体応答を示した。これは、Ｎ末端由来のペプチドでの免疫が抗体、ヘルパーＴ細胞およびＣＴＬ応答を惹起したが、Ｃ末端由来の試験したペプチドのどれもが抗体もＴ細胞応答も惹起しなかったという、動物モデルでの観察と一致している（Ｇａｉｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１３３４，２０００）。
（実施例２）
（ＷＴ１を発現する細胞株で免疫したマウスでのＷＴ１に対する抗体の誘導）
本実施例は、インビボにおいてＷＴ１特異的抗体応答を誘導するＷＴ１発現細胞の使用を例証する。
白血病を有する患者におけるＷＴ１に対する既存の抗体の検出で、ＷＴ１タンパク質に対する免疫によってＷＴ１に対する免疫を誘発することが可能であるということが強力に示された。ＷＴ１に対する免疫がワクチン接種によって生じ得るか否かを試験するために、マウスに、Ｂ６起源のＷＴ１陽性腫瘍細胞株であるＴＲＡＭＰ−Ｃを注射した。要するに、雄性Ｂ６マウスを５×１０６ＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞で皮下免疫して、３週間間隔で５×１０６個の細胞を用いて２回ブーストした。最終免疫の３週後に、血清を得て、脾臓の単細胞懸濁物をＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中で、２５μＭ β−２−メルカプトエタノール、１ｍｌあたり２００単位のペニシリン、１０ｍＭ Ｌグルタミン、および１０％のウシ胎仔血清を用いて調製した。
ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する免疫後、免疫された動物におけるＷＴ１特異的抗体応答が検出できた。代表的なウエスタンブロットを図３に示す。これらの結果によってＷＴ１タンパク質に対する免疫は、ＷＴ１タンパク質に対する免疫応答を誘発し得ることが示される。
（実施例３）
（ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＴｈおよび抗体応答の誘導）
本実施例は、ＷＴ１ペプチドを用いた免疫がＷＴ１に特異的な免疫応答を誘発する能力を例証する。
Ａｂおよび増殖性Ｔ細胞応答を惹起するのに適切なペプチドは、Ｔｈ応答を惹起する能力を有するペプチドモチーフについて検索する、Ｔｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｅｄおよびＴａｙｌｏｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．７：９３〜１００，１９８８；Ｄｅａｖｉｎら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５〜１５５，１９９６）に従って同定した。表Ｉに示すペプチドを合成して配列決定した。
（表Ｉ）
（ＷＴ１ペプチド）
Figure 2007515393
 免疫について、ペプチドは以下のとおり分類した：
Ａ群：ｐ６−２２ ヒト：１ｍｌ中に１０．９ｍｇ（１０μｌ＝１００μｇ）
ｐ１１７−１３９ ヒト／マウス：１ｍｌ中に７．６ｍｇ（１４μｌ＝１００μｇ）
ｐ２４４−２６２ ヒト：１ｍｌ中に４．６ｍｇ（２２μｌ＝１００μｇ）
Ｂ群：ｐ２８７−３０１ ヒト／マウス：１ｍｌ中に７．２ｍｇ（１４μｌ＝１００μｇ）
マウス ｐ２９９−３１３：１ｍｌ中に６．６ｍｇ（１５μｌ＝１００μｇ）
ｐ４２１−４３５ ヒト／マウス：１ｍｌ中に３．３ｍｇ（３０μｌ＝１００μｇ）
コントロール：（ＦＢＬペプチド１００μｇ）＋ＣＦＡ／ＩＦＡ
コントロール：（ＣＤ４５ペプチド１００μｇ）＋ＣＦＡ／ＩＦＡ
Ａ群は、ＷＴ１のアミノ末端部分内に存在するペプチドを含み（エキソン１）、Ｂ群は、他のＤＮＡ結合タンパク質に対して配列相同性を有する４つのジンクフィンガー領域を含む、カルボキシル末端内に存在するペプチドを含んでいた。Ｂ群では、ｐ２８７−３０１およびｐ２９９−３１３は、エキソン７ ジンクフィンガー１由来であって、ｐ４２１−４３５は、エキソン１０、ジンクフィンガーＩＶ由来であった。
Ｂ６マウスは、１群のＷＴ１ペプチドで、またはコントロールペプチドを用いて免疫した。ペプチドを１ｍｌの注射用滅菌水に溶解して、Ｂ６マウスを３週間の間隔で３回免疫した。用いたアジュバントはＣＦＡ／ＩＦＡ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭｏｎｔｉｎｉｄｅであった。次いでＷＴ１に特異的な抗体の存在を実施例１および２に記載のように決定して、抗原の存在下で細胞を培養する標準的なチミジン取り込みアッセイを用いて増殖性Ｔ細胞応答を評価して、増殖は取り込まれた放射能を測定することによって評価した（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０６５〜１０７０，１９９４）。詳細には、リンパ球は、９６ウェルプレート中で１ウェルあたり２×１０５個の細胞で、４×１０５照射（３０００ラド）した同系の脾細胞および示したペプチドとともに培養した。
Ａ群と名付けたペプチドの群を用いたマウスの免疫によって、ＷＴ１に対する抗体応答が惹起された（図４）。ワクチンＢに対する免疫後には抗体は検出されず、このことはワクチンＢでの免疫からはヘルパーＴ細胞応答がないことと一致している。Ｐ１１７−１３９は増殖性Ｔ細胞応答を誘発した（図５Ａ〜５Ｃ）。刺激係数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃｅｓ）（ＳＩ）は、８〜７２の間で変化した。他のペプチド（Ｐ６−２２およびｐ２９９−３１３もまた、増殖性Ｔ細胞応答を誘発することが示された。Ｐ６−２２での免疫によって、２．３という刺激係数（ＳＩ）が得られ、Ｐ２９９−３１３での免疫によって、３．３というＳＩが得られた。陽性のコントロールは、ＣｏｎＡ刺激Ｔ細胞、ならびにＣＤ４５およびＦＢＬのような公知の抗原で刺激されたＴ細胞、および同種異系のＴ細胞株を含んだ（ＤｅＢｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３〜２９７０，１９９１）。
図６Ａおよび６Ｂは、ワクチンＡ（図６Ａ）およびワクチンＢ（図６Ｂ）内の３つのペプチドの各々について観察された増殖性の応答を示す。ワクチンＡは、免疫するペプチドｐ６−２２およびｐ１１７−１３９に対する増殖性Ｔ細胞応答を誘発したが、この刺激係数（ＳＩ）は、３〜８の間で変化した（バルク・ライン（ｂｕｌｋ ｌｉｎｅｓ））。ｐ２４４−２６２に対する増殖性応答は検出されなかった（図６Ａ）。
その後のインビトロ刺激は、ｐ６−２２およびｐ１１７−１３９のみを用いて単回のペプチド刺激として行なった。ｐ１１７−１３９を用いたワクチンＡ特異的Ｔ細胞株の刺激によって、ｐ６−２２に対する応答のないｐ１１７−１３９に対する増殖が生じた（図７Ａ）。この株由来のクローンは、ｐ１１７−１３９に特異的であった（図７Ｂ）。対照的に、ｐ６−２２を用いたワクチンＡ特異的Ｔ細胞株の刺激によって、ｐ１１７−１３９に対する応答のないｐ６−２２に対する増殖が生じた（図７Ｃ）。この株由来のクローンは、ｐ６−２２に特異的であった（図７Ｄ）。
これらの結果によって、ＷＴ１ペプチドでのワクチン接種は、ＷＴ１タンパク質に対する抗体応答、および免疫ペプチドに対する増殖性Ｔ細胞応答を誘発し得ることが示される。
（実施例４）
（ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＣＴＬ応答の誘導）
本実施例は、ＷＴ１ペプチドがＣＴＬ免疫を惹起する能力を例証する。
クラスＩ ＭＨＣに対する結合について適切なモチーフを有するペプチド（９マー）を、ＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析を用いて同定した（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４）。このような分析において同定したペプチドを表ＩＩ〜ＸＬＩＶに示す。これらの表の各々において、スコアは、示したＭＨＣ分子に対するペプチドの理論的結合親和性（解離の半減期）を反映する。またこの表には、その全体が参考文献として本明細書に組み込まれる、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８〜２２８，１９９５に記載されるような規定されたペプチド結合モチースが示される。ＨＬＡ−Ｂ１４のペプチド結合モチーフは、これもその全体が参考文献として本明細書に組み込まれる、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３４２６〜２３４３４，１９９４に記載されている。ペプチド位置は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８およびＰ９と省略される。
Ｔｈ応答を惹起する能力を有するペプチドモチーフについて検索する、Ｔｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｅｄおよびＴａｙｌｏｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．７：９３〜１００，１９８８；Ｄｅａｖｉｎら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５〜１５５，１９９６）を用いて同定したペプチドをさらに、図８Ａおよび８Ｂ、ならびに表ＸＬＶに示す。
（表ＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ａ１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、位置３（Ｐ３）のＤまたはＥ；Ｐ９のＹであり；補助アンカーは、Ｐ４のＰおよびＰ７のＬである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＩＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ａ０２０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ０２０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、位置Ｐ２のＬまたはＭ；Ｐ９のＶまたはＬであり；補助アンカーは、Ｐ６のＶである）
Figure 2007515393
 （表ＩＶ）
（ヒトＨＬＡ Ａ０２０５に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ０２０５ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＶ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＰ６のＩ、Ｖ、Ｌ、Ａである補助アンカーを有するＰ９のＬである）
Figure 2007515393
 （表Ｖ）
（ヒトＨＬＡ Ａ２４に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ２４ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ５のＩまたはＶおよびＰ６のＦである補助アンカーを有するＰ９のＩ、ＬまたはＦである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＶＩ）
（ヒトＨＬＡ Ａ３に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ３ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＬ、ＶまたはＭ；Ｐ９のＫ、ＹまたはＦ；補助アンカーは、Ｐ３のＦまたはＹ、Ｐ６のＩ、Ｍ、Ｆ、ＶまたはＬ、Ｐ７のＩ、Ｌ、Ｍ、Ｆである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＶＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ａ６８．１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ６８．１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＶまたはＴ；Ｐ９のＲまたはＫである）
Figure 2007515393
 （表ＶＩＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ａ１１０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ１１０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＫ；補助アンカー残基は、Ｐ２のＶ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｐ３のＭ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｉ、Ａ、Ｐ７のＬ、Ｉ、Ｙ、ＶまたはＦである）
Figure 2007515393
 （表ＩＸ）
（ヒトＨＬＡ Ａ３１０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ３１０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＲ；補助アンカーは、Ｐ２のＬ、Ｖ、ＹまたはＦ、Ｐ３のＦ、Ｌ、Ｙ、Ｗ、Ｐ６のＬ、Ｆ、Ｖ、Ｉである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表Ｘ）
（ヒトＨＬＡ Ａ３３０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ３３０２ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＲ；補助アンカーは、Ｐ２のＡ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＹまたはＶである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ１４に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ１４ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＲ、Ｐ３のＹ、Ｐ５のＲ、Ｐ９のＬである。４つのアンカー残基の内３つは、十分である）
Figure 2007515393
 （表ＸＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ４０に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ４０ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＲ、Ｐ９のＬ、Ｗ、ＭまたはＡ；補助アンカーは、Ｐ３のＦ、ＩまたはＶである）
Figure 2007515393
 （表ＸＩＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ６０に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ６０ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＥ、Ｐ９のＬ；補助アンカーは、Ｐ７のＩまたはＶである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＩＶ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ６１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ６１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＥ、Ｐ９のＶ；補助アンカーは、Ｐ３のＦ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｐ６のＩである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＶ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ６２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ６２ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＱまたはＬ、Ｐ９のＦまたはＹ；補助アンカーは、Ｐ５のＩまたはＶである）
Figure 2007515393
 （表ＸＶＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ７に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ７ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＰ、Ｐ９のＬまたはＦ；補助アンカーは、Ｐ２のＲである）
Figure 2007515393
 （表ＸＶＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ８に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ８ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ３のＫ、Ｐ５のＫまたはＲ、Ｐ９のＬである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＶＩＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ２７０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ２７０２ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＲ、Ｐ９のＦ、Ｙ、Ｉ、ＬまたはＷである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＩＸ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ２７０５に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ２７０５ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＲ；Ｐ９のＬまたはＦ；Ｙ、Ｒ、ＨおよびＫは、天然に加工されたエピトープについてもＰ９に見出されている）
Figure 2007515393
 （表ＸＸ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ３５０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ３５０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＰ、Ｐ９のＹ、Ｆ、Ｍ、ＬまたはＩである）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ３７０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ３７０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ８のＦ、ＭまたはＬ；Ｐ９のＩまたはＬ；補助アンカーは、Ｐ２のＤ、ＥおよびＰ５のＶ、Ｉである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ３８０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ３８０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＦまたはＬ；補助アンカーは、Ｐ２のＨおよびＰ３のＤまたはＥである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＩＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ３９０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ３９０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＲまたはＨ；Ｐ９のＬ；補助アンカーは、Ｐ６のＩ、ＶまたはＬである）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＩＶ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ３９０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ３９０２ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＫまたはＱ；Ｐ９のＬ；補助アンカーは、Ｐ５のＩ、Ｌ、ＦまたはＶである）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＶ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ４４０３に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ４４０３ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＥまたはＰ９のＹまたはＦである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＶＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ５１０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ５１０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＡ、ＰまたはＧ；Ｐ９のＦまたはＩである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＶＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ５１０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ５１０２ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＰ、ＡまたはＧ；Ｐ９のＩまたはＶ；補助アンカーは、Ｐ３のＹである）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＶＩＩＩ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ５２０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ５２０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ８のＩまたはＶ；Ｐ９のＩまたはＶ；補助アンカーは、Ｐ２のＱ、Ｐ３のＦ、ＹまたはＷ、Ｐ５のＬ、ＩまたはＶである）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＩＸ）
（ヒトＨＬＡ Ｂ５８０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ５８０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＡ、ＳまたはＴ；Ｐ９のＦまたはＷ；補助アンカーは、Ｐ４のＰ、ＥまたはＫ、Ｐ５のＶ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＦである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸ）
（ヒトＨＬＡ ＣＷ０３０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−ＣＷ０３０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＬ、Ｆ、ＭまたはＩ；補助アンカーは、Ｐ３のＶ、Ｉ、Ｙ、ＬまたはＭ、Ｐ４のＰ、Ｐ６のＦまたはＹである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＩ）
（ヒトＨＬＡ ＣＷ０４０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−ＣＷ０４０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＹ、ＰまたはＦ；Ｐ９のＬ、ＦまたはＭ；補助アンカーは、Ｐ６のＶ、ＩまたはＬである）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＩＩ）
（ヒトＨＬＡ ＣＷ０６０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−ＣＷ０６０２ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＬ、Ｉ、ＶまたはＹ；補助アンカーは、Ｐ５のＩ、Ｌ、ＦまたはＭ、Ｐ６のＶ、ＩまたはＬである）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＩＩＩ）
（ヒトＨＬＡ ＣＷ００７０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−ＣＷ０７０２ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＹ、ＦまたはＬ；補助アンカーは、Ｐ２のＹまたはＰ、Ｐ５のＶ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、ＦまたはＭ、Ｐ６のＶ、Ｉ、ＬまたはＭである）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＩＶ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｄｂに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＶ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｄｄに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＶＩ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｋｂに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＶＩＩ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｋｄに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＶＩＩＩ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｋｋに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＸＸＩＸ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｌｄに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
 （表ＸＬ）
（ウシＨＬＡ Ａ２０に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
 （表ＸＬＩ）
（ヒトＨＬＡ Ａ０２０１に対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＬＩＩ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｄｂに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （表ＸＬＩＩＩ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｋｂに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
 （表ＸＬＩＶ）
（マウスＭＨＣクラスＩ Ｋｄに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についてのＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
 （表ＸＬＶ）
（ヘルパーＴ細胞応答を誘発し得るヒトＷＴ１ペプチドについてのＴ部位ペプチド結合予測分析の結果）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 特定のＣＴＬペプチド（表ＸＬＶＩに示される）を、さらなる研究のために選択した。表ＸＬＶＩの各ペプチドについては、ＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析を用いて得たスコアを提供する。
（表ＸＬＶＩ）
（ＷＴ１ペプチド配列およびＨＬＡペプチド結合予測）
Figure 2007515393
 Ｃ５７ＢＩ／６マウスＭＨＣに対するペプチド結合は、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６〜４８０，１９９０に記載されるように、白血病細胞株ＲＭＡ−Ｓを用いて確認した。要するに、ＲＭＡ−Ｓ細胞は、１％ＦＣＳを補充した完全培地中で２６℃で７時間培養した。２４ウェルプレートの各々のウェルに全部で１０６個のＲＭＡ−Ｓ細胞を添加して、単独で、または示したペプチド（２５μｇ／ｍｌ）とともに２６℃で１６時間インキュベートして、さらに完全培地中で３７℃で３時間インキュベートした。次いで細胞を３回洗浄して、フルオレセインイソチオシアネート結合体化抗Ｄｂまたは抗Ｋｂ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて染色した。標識した細胞を２回洗浄して、再懸濁し、１％パラホルムアルデヒドを含む５００μｌのＰＢＳ中で固定して、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標））において蛍光強度を分析した。ＲＭＡ−Ｓ細胞の表面でのＤｂまたはＫｂ分子の増大の割合は、ペプチドとインキュベートした細胞の蛍光強度の平均の増大を、培地単独中においてインキュベートした細胞の蛍光強度の平均と比較して測定した。
マウスを、マウスのクラスＩ ＭＨＣに結合し得るペプチドを用いて免疫した。免疫後に、脾細胞をインビトロで刺激して、ＷＴ１ペプチドとともにインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。標準的なクロム遊離アッセイ（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０６５〜１０７０，１９９４）を用いてＣＴＬを評価した。１０６個の標的細胞を、特定のペプチドの有無において、１５０μＣｉのナトリウム５１Ｃｒとともに３７℃で９０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄して、５％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ中に再懸濁した。アッセイのために、１０４個の５１Ｃｒ標識した標的細胞を種々の濃度のエフェクター細胞とともに、丸底９６ウェルプレート中において最終容積２００μｌでインキュベートした。３７℃で４〜７時間後に上清を取り出して、溶解比パーセントを式：
溶解比％＝１００×（実験的遊離−自然遊離）／（最大遊離−自然遊離）
によって決定した。
表ＸＬＶＩＩに示される結果によって、ある程度のＷＴ１ペプチドが、ＣＴＬを生成するのに必須であるクラスＩ ＭＨＣ分子に結合し得ることが示される。さらに、いくつかのペプチドが、クロム遊離アッセイを用いて決定されるとおり、ＣＴＬに特異的なペプチドを誘発することができた（図９Ａおよび９Ｂ）。ＣＴＬペプチドｐ１０−１８ ヒト、ｐ１３６−１４４ヒト、ｐ１３６−１４４マウスおよびｐ２３５−２４３に対する免疫後、ペプチド特異的ＣＴＬ株を生成して、クローンを樹立した。これらの結果によって、ペプチド特異的ＣＴＬは、ＷＴ１を発現する悪性の細胞を殺傷し得ることが示される。
（表ＸＬＶＩＩ）
（マウスＢ６クラスＩ抗原に対するＷＴ１ ＣＴＬペプチドの結合）
Figure 2007515393
 （実施例５）
（マウスにおけるＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発するＷＴ１ポリペプチドの使用）
本実施例は、代表的なＷＴ１ポリペプチドがＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷し得るＣＴＬ免疫を誘発する能力を例証する。
クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣに対する結合について適切なモチーフを有するペプチドであるＰ１１７−１３９を、ＴＳＩＴＥＳおよびＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析を用いて上記のように同定した。マウスは実施例３に記載したように免疫した。免疫後に、脾細胞をインビトロで刺激して、ＷＴ１ペプチドとともにインキュベートされた標的、ならびにＷＴ１陽性および陰性の腫瘍細胞を溶解する能力について試験した。ＣＴＬを標準的なクロム遊離アッセイを用いて評価した。図１０Ａ〜１０Ｄに示される結果によって、Ｐ１１７が、ＷＴ１陽性腫瘍細胞を殺傷し得るＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発し得ることが示されるが、一方、ＷＴ１陰性細胞の殺傷は観察されなかった。これらの結果によって、ペプチド特異的ＣＴＬが実際にＷＴ１を発現する悪性細胞を殺傷すること、ワクチンおよびＴ細胞治療がＷＴ１を発現する悪性疾患に対して有効であることが実証される。
９マーのクラスＩ ＭＨＣ結合ペプチド、ｐ１３６−１４４、ｐ２２５−２３３、ｐ２３５−２４３、ならびに２３マーのペプチドｐ１１７−１３９を用いて同様の免疫を行なった。免疫後に、各々４つのペプチドを用いて脾細胞をインビトロで刺激して、ＷＴ１ペプチドとインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴＬは、ｐ１３６−１４４、ｐ２３５−２４３およびｐ１１７−１３９について生成されたが、ｐ２２５−２３３については生成されなかった。ｐ２３５−２４３およびｐ１１７−１３９についてのＣＴＬデータを図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ペプチドｐ１３６−１４４およびｐ２２５−２３３についてのデータは示していない。
ＣＴＬ溶解には、標的ＷＴ１ペプチドが内因性に処理されて、腫瘍細胞クラスＩ ＭＨＣ分子と会合して提示されることを必要とする。上記のＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬを、ＷＴ１陰性腫瘍細胞株に対してＷＴ１陽性腫瘍細胞株を溶解する能力について試験した。ｐ２３５−２４３に特異的なＣＴＬは、ｐ２３５−２４３とともにインキュベートされた標的を溶解したが、ＷＴ１タンパク質を発現した細胞株を溶解することはできなかった（図１１Ａ）。極めて対照的に、ｐ１１７−１３９に特異的なＣＴＬは、ｐ１１７−１３９ペプチドとともにインキュベートされた標的を溶解したが、ＷＴ１を発現する悪性細胞も溶解した（図１Ｂ）。陰性コントロールとして、ｐ１１７−１３９に特異的なＣＴＬは、ＷＴ１陰性ＥＬ−４（本明細書においてはＥ１０とも呼ばれる）を溶解しなかった。
ＷＴ１特異的溶解の特異性を、コールド標的阻害によって確認した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。エフェクター細胞を種々のエフェクター：標的比について９６ウェルＵ底プレート中にプレートした。５１Ｃｒ標識なしで、示したペプチドでコーティングした標的の１０倍過剰（ホット標的に対して比較して）を添加した。結局、１ウェルあたり１０４個の５１Ｃｒ標識された標的細胞を添加して、このプレートを３７℃で４時間インキュベートした。１ウェルあたりの総容積は２００μｌであった。
ｐ１１７−１３９特異的ＣＴＬによるＴＲＡＭＰ−Ｃの溶解は、関連のペプチドｐ１１７−１３９とともにインキュベートしたＥＬ−４によって５８％〜３６％までブロックされたが、無関係のペプチドとともにインキュベートされたＥＬ−４ではブロックされなかった（図１２Ａ）。同様に、ＢＬＫ−ＳＶ４０の溶解は、関連のペプチドｐ１１７−１３９とともにインキュベートしたＥＬ−４によって１８％〜０％までブロックされた（図１２Ｂ）。ＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬはプロセシングされたＷＴ１の認識によって悪性細胞を特異的に殺傷するということが結果によって確証される。
推定のＣＴＬモチーフを有するいくつかのセグメントがｐ１１７−１３９内に含まれる。ＣＴＬエピトープの正確な配列を決定するために、ｐ１１７−１３９内の全ての可能性のある９マーのペプチドを合成した（表ＸＬＶＩＩＩ）。これらのペプチドのうちの２つ（ｐ１２６−２３４およびｐ１３０−１３８）は、Ｈ−２ｂクラスＩ分子に結合することが示された（表ＸＬＶＩＩＩ）。ｐ１１７−１３９での免疫によって生成されたＣＴＬは、ｐ１２６−１３４およびｐ１３０−１３８とともにインキュベートされた標的を溶解したが、ｐ１１７−１３９内の他の９マーペプチドでは溶解されなかった（図１３Ａ）。
ｐ１１７−１３９特異的ＣＴＬ株を、ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８のいずれかで再刺激した。ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８での再刺激後、両方のＴ細胞株とも、ペプチド特異的溶解を実証したが、ｐ１３０−１３８特異的ＣＴＬのみが、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を示した（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。従って、ｐ１３０〜１３８は、天然にプロセシングされたエピトープであると思われる。
（表ＸＬＶＩＩＩ）
（マウスＢ６クラスＩ抗原に対するｐ１１７−１３９内のＷＴ１ ＣＴＬ ９マーペプチドの結合）
Figure 2007515393
 （実施例６）
（マウス腫瘍細胞株におけるＷＴ１特異的ｍＲＮＡの同定）
本実施例は、細胞および細胞株においてＷＴ１特異的ｍＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲの使用を例証する。
密度勾配遠心によってモノクローナル細胞を単離して、直ちに凍結し、ＷＴ１特異的ｍＲＮＡの存在についてのＲＴ−ＰＣＲによる分析まで−８０℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲは概して、Ｆｒａｉｚｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８６：４７０４〜４７０６，１９９５によって記載されるように行なった。標準的な手順に従って１０７個の細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡペレットを２５μＬのジエチルピロカルボナート処理した水に再懸濁して、逆転写のために直接用いた。ジンク−フィンガー領域（エキソン７〜１０）をＰＣＲによって、３３０ｂｐのマウスｃＤＮＡとして増幅した。１回かまたは、必要に応じて、連続２回のＰＣＲの間、サーモサイクラー中で増幅を行なった。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｚｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２０ｐｍｏｌの各々のプライマーを総反応容積５０μｌ中で用いた。ＰＣＲ生成物の２０μＬのアリコートを、臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲル上で電気泳動した。このゲルを、ポラロイドフィルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ ６６７，Ｐｏｌａｒｏｉｄ Ｌｔｄ．Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で写真撮影した。ＫｗｏｋおよびＨｉｇｕｃｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：２３７〜２３８，１９８９の推奨に従って、交差汚染に対する注意を払った。陰性コントロールは、各々の実験においてｃＤＮＡの代わりに水とのｃＤＮＡ−試薬混合物およびＰＣＲ−試薬混合物を含んだ。偽陰性を回避するために、無傷なＲＮＡの存在および適切なｃＤＮＡ生成を、βアクチンプライマーを用いてコントロールＰＣＲによって各々のサンプルについて評価した。これらのプライマーで増幅しなかったサンプルは分析から排除した。
マウス細胞株におけるＷＴ１の増幅のためのプライマーは以下であった：Ｐ１１５：１４５８〜１４７８：５’ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＣＡＡ ＴＡＡ ＧＡＧ ＡＴＡ ３’（フォワードプライマー；配列番号２１）；およびＰ１１６：１７６７〜１７８７：５’ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＣＧＧ ＡＣＣ ＡＡＴ ３’（リバースプライマー；配列番号２２）（Ｉｎｏｕｅら、Ｂｌｏｏｄ ８８：２２６７〜２２７８，１９９６；Ｆｒａｉｚｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８６：４７０４〜４７０６，１９９５を参照のこと）。
コントロール反応において用いたβアクチンプライマーは以下であった：５’ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ３’（センスプライマー；配列番号２３）；および５’ＧＴＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＣＧ ＣＡＣ ＧＡＴ ＴＴＣ ３’（アンチセンスプライマー；配列番号２４）。
ヒトＷＴ１を増幅するのにおける使用のためのプライマーとしては以下が挙げられる：Ｐ１１７：９５４−９７４：５’ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＧＡ ＧＡＣ ＣＡＧ ＴＧＡ ＧＡＡ ３’（配列番号２５）；およびＰ１１８：１４３１−１４１４：５’ＧＡＧ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＡＧＴ ３’（配列番号５）。ネスト化ＲＴ−ＰＣＲのためには、プライマーは以下であってもよい：Ｐ１１９：１０２３−１０４３：５’ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＣＡ ＣＴＴ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ３’（配列番号２６）；およびＰ１２０：１３４５−１３６５：５’ＴＣＡ ＡＡＧ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＴＴ ３’（配列番号２７）。
表ＸＬＶＩＩＩは、マウス腫瘍細胞株のＷＴ１ ＰＣＲ分析の結果を示す。表ＩＶでは、（＋＋＋）は、第一の工程ＲＴ ＰＣＲにおける強力なＷＴ１ ＰＣＲ増幅産物を示し、（＋＋）は、第一の工程ＷＴ１ ＲＴ ＰＣＲによって検出可能であるＷＴ１ ＰＣＲ増幅産物を示し、（＋）は、ＷＴ１ ＲＴ ＰＣＲの第二の工程においてのみ検出可能である産物を示し、（−）は、ＷＴ１ ＰＣＲ陰性を示す。
（表ＸＬＩＸ）
（マウス腫瘍細胞株におけるＷＴ１ ｍＲＮＡの検出）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （実施例７）
（ＷＴ１ ＴＲＸ融合構築物のＥ．ｃｏｌｉにおける発現）
ＷＴ１（ＷＴ１Ｂ）の短縮オープンリーディングフレームを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２で開始するフォワードプライマー
Ｐ−３７（配列番号３４２）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６４℃
終止コドン後ろのＥｃｏＲＩ部位を作成するリバースプライマー
Ｐ−２３（配列番号３４３）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
ＰＣＲを以下の条件下で行なった：
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ
２μｌ １０μＭ 各々のオリゴ
８３μＬ 滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭ ＦＬ ＷＴ１）
９６℃ ２分
９６℃ ２０秒 ６３℃ １５秒 ７２℃ ３分×４０サイクル
７２℃ ４分
ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ゲル精製し、次いでｐＴｒｘ２Ｈベクター（Ｎ末端上のＴｒｘ融合およびＴｒｘ融合を囲む２つのＨｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクター。Ｔｒｘ融合の後に、トロンビンおよびエンテロキナーゼについてのプロテアーゼ切断部位が存在する）中にクローニングした。ｐＴｒｘ２Ｈ構築物は、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正確な構築物をＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞中にトランスフォームした。
（実施例８）
（ＷＴ１ Ｈｉｓタグ融合構築物のＥ．ｃｏｌｉにおける発現）
ＷＴ１（ＷＴ１Ａ）のＮ末端オープンリーディングフレームを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２で開始するフォワードプライマー
Ｐ−３７（配列番号３４４）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６４℃
アミノ酸２４９の後に置かれた人工終止コドン後ろのＥｃｏＲＩ部位を作成するリバースプライマー
ＰＭＤ−３３５（配列番号３４５）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６４℃
ＰＣＲは以下の条件下で行なった：
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ
２μｌ １０μＭの各々のオリゴ
８３μＬ 滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭ ＦＬ ＷＴ１）
９６℃ ２分
９６℃ ２０秒 ６３℃ １５秒 ７２℃ １分２０秒×４０サイクル
７２℃ ４分
ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ゲル精製し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化された、インフレームでＨｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクターであるｐＰＤＭ中にクローニングした。このＰＣＲ産物をまたｐＴｒｘ ２Ｈベクター中にトランスフォームした。このｐＴｒｘ２Ｈ構築物をＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正確な構築物をＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞中にトランスフォームした。
（実施例９）
（ＷＴ１Ｂ Ｈｉｓタグ融合構築物のＥ．ｃｏｌｉにおける発現）
ＷＴ１（ＷＴ１Ａ）の短縮オープンリーディングフレームを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２５０で開始するフォワードプライマー
ＰＤＭ−３４６（配列番号３４６）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ５８℃
終止コドン後ろのＥｃｏＲＩ部位を作成するリバースプライマー
Ｐ−２３（配列番号３４７）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
ＰＣＲを以下の条件下で行なった：
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ
２μｌ １０μＭ 各々のオリゴ
８３μＬ 滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭ ＦＬ ＷＴ１）
９６℃ ２分
９６℃ ２０秒 ６３℃ １５秒 ７２℃ １分３０秒×４０サイクル
７２℃ ４分
ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ゲル精製し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化された、インフレームでＨｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクターであるｐＰＤＭ中にクローニングした。このＰＣＲ産物をまたｐＴｒｘ ２Ｈベクター中にトランスフォームした。このｐＴｒｘ２Ｈ構築物をＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正確な構築物をＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞中にトランスフォームした。
実施例７〜９については、以下の配列番号が開示されている：
配列番号３２７は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１＿Ｂの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２８は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１＿Ｂの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２９は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３０は、ＷＴ１＿Ａの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３１は、ＷＴ１＿Ｂの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３２は、配列番号３２７によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号３３３は、配列番号３２８によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号３３４は、配列番号３２９によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号３３５は、配列番号３３０によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号３３６は、配列番号３３１によってコードされる推定アミノ酸配列である。
（実施例１０）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるＷＴ１の短縮型）
ＷＴ１の３つのリーディングフレームは、以下のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した：
ＷＴ１ Ｔｒ２については：
ＰＤＭ−４４１（配列番号３４８）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
ＰＤＭ−４４２（配列番号３４９）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６２℃
ＷＴ１ Ｔｒ３については：
ＰＤＭ−４４３（配列番号３５０）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６４℃
ＰＤＭ−４４４（配列番号３５１）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６４℃
ＷＴ１ Ｔｒ４については：
ＰＤＭ−４４５（配列番号３５２）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
ＰＤＭ−４４６（配列番号３５３）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
ＰＣＲを以下の条件下で行なった：
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ
２μｌ １０μＭ 各々のオリゴ
８３μＬ 滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭ ＦＬ ＷＴ１）
９６℃ ２分
９６℃ ２０秒 ６３℃ １５秒 ７２℃３０秒×４０サイクル
７２℃ ４分
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩで消化して、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＰＤＭ Ｈｉｓ（５’末端上にインフレームでＨｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクター）中にクローニングした。この構築物が正確であることを配列分析によって確認し、ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳおよびＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ細胞、またはＢＬＲ ｐＬｙｓ ＳおよびＢＬＲ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ細胞中にトランスフォームした。
（実施例１１）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１Ｃ（アミノ酸７６〜４３７）およびＷＴ１Ｄ（アミノ酸９１〜４３７）の発現）
ＷＴ１のリーディングフレームは、以下のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した：
ＰＤＭ−５０４（配列番号３５４）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６１℃
ＰＤＭ−４４６（配列番号３５５）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
ＰＣＲを以下の条件下で行なった：
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ
２μｌ １０μＭの各々のオリゴ
８３μＬ 滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭ ＦＬ ＷＴ１）
９６℃ ２分
９６℃ ２０秒 ６３℃ １５秒 ７２℃２分×４０サイクル
７２℃ ４分
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩで消化して、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化されたｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。この配列を配列分析によって確認し、次いでＣｏｄｏｎＰｌｕｓ ＲＰで同時トランスフォームしているＢＬＲ ｐＬｙｓＳおよびＢＬＲ中にトランスフォームした。
（実施例１２）
（重複するオリゴをアニーリングすることによるＷＴ１ Ｔｒ−１の合成生成）
本実施例は、発現に対するプロリンコドン用法を変化することの効果を決定するために行なった。
オリゴの以下の対をアニーリングした：
１．ＰＤＭ−５０５（配列番号３５６）
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−５０６（配列番号３５７）
Figure 2007515393
 ２．ＰＤＭ−５０７（配列番号３５８）
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−５０８（配列番号３５９）
Figure 2007515393
 ３．ＰＤＭ−５０９（配列番号３６０）
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−５１０（配列番号３６１）
Figure 2007515393
 ４．ＰＤＭ−５１１（配列番号３６２）
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−５１２（配列番号３６３）
Figure 2007515393
 ５．ＰＤＭ−５１３（配列番号３６４）
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−５１４（配列番号３６５）
Figure 2007515393
 ６．ＰＤＭ−５１５（配列番号３６６）
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−５１６（配列番号３６７）
Figure 2007515393
 ７．ＰＤＭ−５１７（配列番号３６８）
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−５１８（配列番号３６９）
Figure 2007515393
 ８．ＰＤＭ−５１９（配列番号３７０）
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−５２０（配列番号３７１）
Figure 2007515393
 各々のオリゴ対を別々に組み合わせて、ついでアニーリングした。次いでこの対を一緒に連結して、１μｌのライゲーション混合物を以下のＰＣＲ条件に用いた：
１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ
２μｌ １０μＭの各々のオリゴ
８３μＬ 滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
９６℃ ２分
９６℃ ２０秒 ６３℃ １５秒 ７２℃３０秒×４０サイクル
７２℃ ４分
ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩで消化して、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。この配列を確認し、次いでＣｏｄｏｎＰｌｕｓ ＲＰで同時トランスフォームしているＢＬＲ ｐＬｙｓＳおよびＢＬＲ中にトランスフォームした。
実施例１０〜１２については、以下の配列番号が開示されている：
配列番号３３７は、ＷＴ１＿Ｔｒ１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３８は、ＷＴ１＿Ｔｒ２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３９は、ＷＴ１＿Ｔｒ３の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４０は、ＷＴ１＿Ｔｒ４の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４１は、ＷＴ１＿Ｃの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４２は、配列番号３３７によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号３４３は、配列番号３３８によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号３４４は、配列番号３３９によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号３４５は、配列番号３４０によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号３４６は、配列番号３４１によってコードされる推定アミノ酸配列である。
ＷＴ１Ｃ配列は、ＴＲ２、ＴＲ３およびＴＲ４のコード領域を有するポリヌクレオチドに相当する。
ＷＴ１ ＴＲ−１合成配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＷＴ１ ＴＲ−１を発現し得るポリヌクレオチドを生成する、プロリンの別のコドンが天然のコドンに置換されたポリヌクレオチドに相当する。
（実施例１３）
（マウスでのＷＴ１免疫の全身的組織病理学的および毒性学的効果の評価）
本実施例の目的は、マウスでの複数回の用量漸増法においてＷＴ１タンパク質免疫の免疫原性および潜在的な合成組織病理学的および毒性学的効果を分析することである。
ＷＴ１タンパク質を用いたマウスの免疫のための実験デザインは、表Ｌにまとめられる。
（表Ｌ）
（マウスにおけるＷＴ１免疫化の実験設計）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 （アジュバントとしてＭＰＬ−ＳＥを用いる複数の用量のＷＴ１タンパク質に対するワクチン）
雌性Ｃ５７／Ｂ６マウスにおける用量漸増研究（用量は２５μｇ、１００μｇ〜１０００μｇのＷＴ１タンパク質におよぶ）によって、強力なＷＴ１特異的抗体応答（図１９）および細胞性Ｔ細胞応答（図２０）が誘発された。
ＷＴ１タンパク質を用いた免疫の全身性の組織学的または毒性学的効果は観察されなかった。毒性の組織学的証拠は以下の組織ではみられなかった：副腎、脳、盲腸、結腸、十二指腸、眼、大腿骨および骨髄、胆嚢、心臓、回腸、空腸、腎臓、喉頭、涙腺、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、食道、卵巣、膵臓、副甲状腺、唾液腺、胸骨および骨髄、脾臓、胃、胸腺、気管、甲状腺、膀胱および子宮。
潜在的な造血の毒性の評価を特別に強調した。胸骨および大腿骨骨髄における脊髄／赤血球の比は正常であった。全ての評価可能な血球カウントおよび血液化学（ＢＵＮ、クレアチニン、ビリルビン、アルブミン、グロブリン）は正常な範囲内であった（表ＬＩ）。
白血病を有する患者のうち多少ではＷＴ１に対する既存の免疫が存在するという条件、およびＷＴ１タンパク質に対するワクチン接種が、正常な組織に対する毒性なしにマウスにおいてＷＴ１特異的Ａｂおよび細胞性Ｔ細胞応答を誘発し得るという条件であれば、これらの実験によってＷＴ１が腫瘍／白血病のワクチンとして確証される。
（表ＬＩ）
（臨床化学および血液学分析）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
Figure 2007515393
Figure 2007515393
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 略号：ＷＢＣ：白血球；ＲＢＣ：赤血球；Ｈｇ：ヘモグロビン；ＨＣＴ：ヘマトクリット；ＭＣＶ：平均血球体積；ＭＣＨ：平均血球ヘモグロビン；ＭＣＨＣ：平均血球ヘモグロビン濃度；Ｐｌｔ．：血小板；Ａｂｓ．：絶対値；Ｂａｓｏ：好塩基球；Ｅｏｓ：好酸球；Ａｂｓ．Ｂａｎｄｓ：未成熟好中球；Ｐｏｌｙｓ：多形核球；Ｌｙｍｐｈ：リンパ球；Ｍｏｎｏ：単球；ＢＵＮ：血液尿素窒素
（実施例１４）
（全遺伝子のインビトロプライミングによるヒトＷＴ１特異的Ｔ細胞応答の誘発）
本実施例は、ＷＴ１特異的Ｔ細胞応答が正常な個体の血液から生じ得ることを実証する。
樹状細胞（ＤＣ）は、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌＧＭＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地中での４〜１０日間の増殖によって、正常ドナーのＰＢＭＣに由来する単球培養物から分化された。培養後、ＤＣを、組み換えＷＴ１発現ワクシニアウイルスを用いて５のＭ．Ｏ．Ｉ．で１６時間感染させるか、または組み換えＷＴ１発現アデノウイルスを１０のＭ．Ｏ．Ｉ．で用いて３日間感染させた（図２１および図２２）。ワクシニアウイルスは、Ｕ．Ｖ．照射によって不活化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、磁気ビーズを用いてポジティブ選択によって単離し、プライミング培養は、９６ウェルプレート中で開始した。培養物は、ＷＴ１を発現するように操作したアデノまたはワクシニアウイルスを用いて感染した自系の樹状細胞を用いて７〜１０日ごとに再刺激した。３〜６回の刺激サイクル後、自己のＷＴ１発現樹状細胞または線維芽細胞で同時刺激された場合特異的にインターフェロンγを生成するＣＤ８＋株が同定できた。これらの株のＷＴ１特異的活性は、さらなる刺激サイクル後に維持可能であった。これらの株は、アデノまたはワクシニアＷＴ１感染した自己の樹状細胞を特異的に認識するが、アデノまたはワクシニアＥＧＦＰ感染した自己の樹状細胞は認識しないことがＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証された（図２３）。
（実施例１５）
（感染用のＲＡ１２−ＷＴ１の処方：凍結乾燥産物を安定化するための賦形剤の使用）
本実施例は、凍結乾燥されたＲａ１２−ＷＴ１の完全な可溶化を可能にする処方物を記載する。
以下の処方物によって、組み換えタンパク質Ｒａ１２−ＷＴ１を、乾燥するまで凍結乾燥した後、水性媒体中に溶解することが可能になる：
組み換えＲａ１２−ＷＴ１濃度：０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ；緩衝液：１０〜２０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ １０．０；１．０〜５．０ｍＭ システイン；０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０）；糖：１０％ トレハロース（Ｔ５２５１，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）１０％マルトース（Ｍ９１７１，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）１０％ スクロース（Ｓ７９０３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）１０％ フルクトース（Ｆ２５４３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）１０％ グルコース（Ｇ７５２８，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）。
糖賦形剤とともに凍結乾燥したタンパク質は、糖賦形剤なしよりも有意に溶解されることが見出された。クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析では、溶解された物質中に残る固体の徴候は示されなかった。
（実施例１６）
（ＷＴ１タンパク質ワクチンの処方）
本実施例は、ＷＴ１タンパク質および２つの異なるアジュバント処方物を用いた免疫後のＷＴ１特異的免疫応答の誘導を記載する。
本実施例によれば、ＷＴ１タンパク質をＭＰＬ−ＳＥと組み合わせることでＷＴ１に対する強力なＡｂおよびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）応答が誘導される。Ｃ５７／Ｂ６マウスにおいてアジュバントとしてＭＰＬ−ＳＥまたはＥｎｈａｎｚｙｎを用いる、ＷＴタンパク質免疫後にＷＴ１特異的免疫応答を誘導するために用いた方法を以下に詳細に記載する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＰＬ−ＳＥまたはＥｎｈａｎｚｙｎアジュバントのいずれかと組み合わせた２０μｇ ｒＲａ１２−ＷＴ１で免疫した。１群のコントロールマウスは、アジュバントを用いずにｒＲａ１２−ＷＴ１で免疫して、一群は生理食塩水コントロールで免疫した。３回の筋肉内（ＩＭ）免疫を３週間空けて与えた。脾臓および血清を最終免疫の２週間後に回収した。Ｒａ１２−ＷＴ１融合物、Ｒａ１２またはＷＴ１ＴＲＸでコーティングしたプレート上でのＥＬＩＳＡによって、血清を抗体応答について分析した。Ｒａ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥおよびＲａ１２−ＷＴ１＋Ｅｎｈａｎｚｙｎを用いて免疫したマウスでは、同様のレベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１抗体の力価が観察された。アジュバントなしでｒＲａ１２−ＷＴ１を用いて免疫したマウスは、それより低いレベルのＩｇＧ２ａ抗体を示した。
インビトロでｒＲａ１２−ＷＴ１、ｒＲａ１２を用いて、またはＷＴ１ペプチドｐ６、ｐ１１７およびｐ２８７を用いる脾臓の刺激後にインターフェロン−γ産生を測定することによってＣＤ４応答を評価した。両方のアジュバントともｒＲＡ１２−ＷＴ１単独で免疫したマウスよりもＣＤ４応答を改善した。さらに、この結果によって、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥはｒＲＡ１２−ＷＴ１＋Ｅｎｈａｎｚｙｎよりも強力なＣＤ４応答を誘導したことが示される。ＩＦＮ−γ ＯＤの読み取りは、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋Ｅｎｈａｎｚｙｎで免疫したマウスでの１〜１．２に比べて、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥで免疫したマウスでは１．４〜１．６に及んだ。ペプチド応答は、ｐ１１７に対してのみ観察され、次いでｒＲａ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥで免疫したマウスでのみ観察された。陽性コントロールＣｏｎＡに対する強力なＩＦＮ−γ応答が全てのマウスで観察された。生理食塩水で免疫した陰性コントロールマウスではＣｏｎＡに対する応答のみが観察され、これによってこの応答がｒＲＡ１２−ＷＴ１に特異的であったことが示される。
（実施例１７）
（無作為に変異されたＷＴ１ライブラリーの構築）
ヒトＷＴ１の核酸配列は、８−オキソ ｄＧＴＰおよびｄＰＴＰの存在下でポリメラーゼ連鎖反応方法を用いて無作為に変異された（ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９６；２５５：５８９〜６０３）。完全な非スプライシングヒトＷＴ１遺伝子が配列番号３８０に開示されており、対応するタンパク質配列は配列番号４０４に示される。ＷＴ１のスプライスバリアントは、ＰＣＲ反応のテンプレートとして用いたが、これは配列番号３８１（ＤＮＡ）および４０８（タンパク質）に開示されている。核酸の変化の頻度がアミノ酸配列の目標とされる変化、通常はＰＣＲ産物の５〜３０％の変化をもたらすように条件を選択した。次いで、変異されたＰＣＲ産物を、４つの正常なｄＮＴＰｓを用いてヌクレオチドアナログの存在下で増幅した。このＰＣＲ産物を哺乳動物発現ベクターおよびウイルスベクター中に免疫のためにサブクローニングした。従って、このライブラリーは、無作為に変異されたＷＴ１クローンの混合集団を含む。いくつかのクローンを選択して配列決定した。変異したＷＴ１変異体ＤＮＡ配列は、配列番号３７７〜３７９に開示されており、その変異体の推定アミノ酸配列は、配列番号４０５〜４０７に示される。これらの変更された配列およびライブラリー由来の他の配列を免疫原として用いてガン細胞におけるＷＴ１タンパク質に対する強力なＴ細胞応答を誘導することができる。
（実施例１８）
（ＷＴ１−ＬＡＭＰ融合物の構築）
ポリメラーゼ連鎖反応、ならびにヒトリソソーム関連膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１）およびヒトＷＴ１配列のスプライスバリアントの所望の交差部を含む合成オリゴヌクレオチドを用いて、三部分からなる融合物を構築した。これらの融合物のために用いたＷＴ１のスプライス変異体およびＬＡＭＰ−１配列は、配列番号３８１および３８３に開示されている。詳細には、ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチド（ＬＡＭＰの塩基対１〜８７）を、ヒトＷＴ１オープンリーディングフレーム（１，２９０塩基対の長さ）の５−プライム末端に融合し、次いでＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（ＬＡＭＰの塩基対１１６１〜１２８１）をＷＴ１配列の３−プライム末端に融合した。得られたＷＴ１−ＬＡＭＰ構築物の配列を配列番号３８２（ＤＮＡ）および配列番号４０９（タンパク質）に示す。この構築物は、真核生物細胞において発現される場合、シグナルペプチドがタンパク質を小胞体（ＥＲ）に指向して、ここでＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインにおける局在シグナルは、ペプチドがクラスＩＩ ＭＨＣ分子に負荷されるリソソーム配置に対して融合タンパク質の輸送を指向するように設計された。
（実施例１９）
ＭＨＣクラスＩ提示の増強ためのＷＴ１ユビキノン融合物の構築）
ヒトユビキチンオープンリーディングフレーム（配列番号３８４）は、最後のアミノ酸をコードするヌクレオチドがグリシンの代わりにアラニンをコードするように変異された。この変異されたオープンリーディングフレームは、ヒトＷＴ１のスプライスバリアントの第一のコドンのすぐ上流のフレームにクローニングされた（配列番号３８１および４０８、それぞれＤＮＡおよびタンパク質）。Ｇ→Ａ変異は、通常は翻訳中にポリユビキチンをプロセシングする、プロテアーゼによる初期タンパク質の同時翻訳（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）切断を妨げる。得られた構築物のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３８５および４１０に示す。得られたタンパク質によって、細胞毒性はそのタンパク質がヒト細胞で発現された場合、低下したことが実証された。天然のＷＴ１を発現する安定な株を生成することは不可能であったが、融合タンパク質を発現する細胞株は容易に得られた。得られたタンパク質は、加えられたユビキチン分子のおかげでプロテオソームに標的にされると予測される。これによって、ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるタンパク質のさらに効率的な認識が得られるはずである。
（実施例２０）
（ヒトＷＴ１を発現するアデノウイルスベクターの構築）
ヒトＷＴ１のスプライスバリアント（配列番号３８１）をＥ１およびＥ３欠失アデノウイルス血清型５ベクター中にクローニングした。ＷＴ１遺伝子の発現は、高レベルのＷＴ１タンパク質発現を媒介するＣＭＶプロモーターによって制御される。この試薬によるヒト細胞の感染によって、ＷＴ１タンパク質の高レベル発現がもたらされる。感染の間に宿主細胞中に導入されて、感染後に低レベルで生成されるアデノウイルスタンパク質の抗原性の性質は、免疫サーベイランスおよび免疫学的標的としてのＷＴ１の免疫認識を増大するように作用し得る。このベクターはまた、ヒト被験体に接種された場合、ＷＴ１タンパク質に対する免疫応答を生成するために用いることができる。これらの被験体がＷＴ１発現腫瘍細胞に陽性である場合、免疫応答は、疾患の経過に対する治療的なまたは治癒的な効果を有し得る。
（実施例２１）
（ヒトＷＴ１を発現するワクシニアウイルスベクターの構築）
全長ヒトＷＴ１遺伝子（配列番号３８１）のスプライスバリアントを、ｐＳＣ１１シャトルベクターを用いてワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ株のチミジンキナーゼ遺伝子座にクローニングした。ＷＴ１遺伝子は、ワクシニアウイルス感染の経過を通じて遺伝子発現を媒介する、ハイブリッドワクシニアウイルスプロモーターの制御下である。この試薬は、インビボまたはインビトロにおいてヒト細胞中でＷＴ１タンパク質を発現するために用いられ得る。ＷＴ１はいくつかのヒト腫瘍細胞上で過剰発現される自己タンパク質である。従って、タンパク質として送達されたＷＴ１に対する免疫学的応答は、ＷＴ１の主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）媒介性認識をもたらすことはありそうにない。しかし、ワクシニアウイルスベクターによる細胞内区画におけるタンパク質の発現によって、高レベルのＭＨＣクラスＩ提示、およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＷＴ１タンパク質の認識が可能になる。ワクシニアウイルスベクターによるＷＴ１タンパク質の発現はまた、ＭＨＣクラスＩＩの状況ではＷＴ１ペプチドの提示をもたらし、従ってＣＤ４＋Ｔ細胞による認識をもたらす。
本発明の用途としてはガンワクチンとしてのその用途が挙げられる。ＷＴ１陽性腫瘍を保有するヒト被験体の免疫は、治療または治癒の応答を生じ得る。細胞内のＷＴ１の発現によって、ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方によるタンパク質の認識がもたらされる。
（実施例２２）
（全遺伝子プライミングを用いるＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの生成）
樹状細胞（ＤＣ）は、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地における４〜６日間の増殖によって、正常ドナーのＰＢＭＣから誘導された単球培養物から分化された。培養後、ＤＣを、組み換えＷＴ１発現ワクシニアウイルス（実施例２１に記載）を用いて５の感染効率（ＭＯＩ）で１６時間感染させるか、または組み換えＷＴ１発現アデノウイルスを１０のＭＯＩで用いて３日間感染させた。ワクシニアウイルスは、Ｕ．Ｖ．照射によって不活化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、磁気ビーズを用いてネガティブ枯渇（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によって単離し、プライミング培養は、９６ウェルプレート中で開始した。培養物は、ＷＴ１を発現するように操作したアデノまたはワクシニアウイルスで感染した自系の樹状細胞を用いて７〜１０日ごとに再刺激した。４〜５回の刺激サイクル後、自己のＷＴ１発現樹状細胞または線維芽細胞で同時刺激された場合特異的にインターフェロンγを生成するＣＤ８＋Ｔ細胞株が同定できた。これらの株をクローニングして、ＷＴ１導入した自己の線維芽細胞を特異的に認識するが、ＥＧＦＰ導入された線維芽細胞は認識しないことがＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証された。
ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）遺伝子は、白血病誘発に関与し、ほとんどのヒト白血病において、いくらかの固形腫瘍においては過剰発現される。ヒトでの以前の研究によって、研究されたＡＭＬ患者の１６／６３（２５％）において、ＣＭＬ患者の１５／８１（１９％）において、ＷＴ１特異的抗体（Ａｂ）応答の存在が実証された。マウスでの以前の研究によって、ＷＴ１ペプチドベースのワクチンがＷＴ１特異的Ａｂ、ＴｈおよびＣＴＬ応答を誘発することが示されている。ヒトでのワクチンとしてのペプチドの使用は、ＨＬＡ拘束によって制限され、ペプチド特異的応答を患者腫瘍特異的ＣＴＬのわずかにおいてのみ誘発する傾向である。全遺伝子免疫の利点は、いくつかのヘルパーおよびＣＴＬエピトープが単独のワクチンに含まれ得るので、特定のＨＬＡタイプに対してワクチンを制限しないということである。本明細書に開示されるデータによって、インビトロプライミングにおいて全遺伝子を用いるＷＴ１特異的免疫応答の誘導、およびＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンが生成され得るということが実証される。白血病を有する患者のうち多少ではＷＴ１に対する既存の免疫が存在するという条件、ならびにマウスおよびヒトＷＴ１がアミノ酸レベルで９６％同一であり、ＷＴ１タンパク質、ＤＮＡまたはペプチドに対するワクチンがＷＴ１特異的Ａｂ、および細胞性Ｔ細胞応答をマウスにおける正常な組織に対する毒性なしにマウスにおいて誘発し得るという条件であれば、これらのヒトインビトロプライング実験によってＷＴ１が腫瘍／白血病のワクチンとしてさらに確証される。さらに、ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを生成する能力によって、遺伝子操作されたＴ細胞を用いる、ＷＴ１過剰発現を伴う悪性疾患の治療を得ることができる。
（実施例２３）
（ＷＴ１の臨床的な製造のための組み換え構築物）
臨床等級のＷＴ１の産生については、以下に詳細に記載されるように５つの構築物を作成した。
ＨｉｓタグなしのＲａ１２／ＷＴ−Ｅ（配列番号３８８（ｃＤＮＡ）および配列番号３９１（タンパク質））およびＷＴ−１Ｅ（配列番号３８６（ｃＤＮＡ）および配列番号３９５（タンパク質））の設計：
ＷＴ−１Ｅリーディングフレームは、以下のプライマーを用いてＨｉｓなし融合構築物なしでＰＣＲ増幅された：
ＰＤＭ−７８０（配列番号３９６）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６℃
ＰＤＭ−７７９（配列番号３９７）
Figure 2007515393
 Ｔｍ６３℃
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌ １μＭの各々のオリゴ、８３μｌ滅菌水１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ），５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２ ＷＴ−１ Ｎｏ Ｈｉｓ）。反応は最初に９６℃で２分間変性し、その後に９６℃で２０秒間、６２℃１５秒間および７２℃１分４０秒間の４０サイクルを続けた。この後に７２℃で４分間の最終伸長を続けた。ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＰＤＭ Ｈｉｓ（改変ｐＥＴ２８ベクター）中にクローニングした。この構築物を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ ＳおよびＨＭＳ １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ細胞中に形質転換した。次いで、この構築物−ｐＰＤＭ ＷＴ−１をＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化して、ｐＰＤＭ Ｒａ１２ ＷＴ−１Ｆ由来のＮｃｏＩおよびＸｂａＩ挿入物のためのベクター骨格として用いた（以下を参照のこと）。この構築物を、配列分析によって確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ ＳおよびＨＭＳ １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ細胞に形質転換した。タンパク質発現は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
ＨｉｓタグなしのＲａ１２−ＷＴ−１−Ｆ（アミノ酸１〜２８１）の設計（配列番号３８９（ｃＤＮＡ）および３９３（タンパク質））：
Ｒａ１２ ＷＴ−１リーディングフレームは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅された：
ＰＤＭ−７７７（配列番号３９８）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６６℃
ＰＤＭ−７７９（配列番号３９９）
Figure 2007515393
 Ｔｍ６３℃
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌ １μＭの各々のオリゴ、８３μｌ滅菌水１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ），５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２ ＷＴ−１ Ｎｏ Ｈｉｓ）。反応は最初に９６℃で２分間変性し、その後に９６℃で２０秒間、５８℃１５秒間および７２℃３分間の４０サイクルを続けた。この後に７２℃で４分間の最終伸長を続けた。ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化されたｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ ＳおよびＨＭＳ １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ細胞中に形質転換した。タンパク質発現は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
ＨｉｓタグなしのＲａ１２−ＷＴ−１−Ｆの設計（配列番号３９０（ｃＤＮＡ）および３９２（タンパク質））：
Ｒａ１２ ＷＴ−１リーディングフレームは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅された：
ＰＤＭ−７７７（配列番号４００）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６６℃
ＰＤＭ−７７８（配列番号４０１）
Figure 2007515393
 Ｔｍ７℃
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌ １μＭの各々のオリゴ、８３μｌ滅菌水１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２ ＷＴ−１ Ｎｏ Ｈｉｓ）。反応は最初に９６℃で２分間によって変性し、その後に９６℃で２０秒間、６２℃１５秒間および７２℃２分３０秒間の４０サイクルを続けた。この後に７２℃で４分間の最終伸長を続けた。ＰＣＲ産物はＮｏｔＩおよびＮｄｅＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。この配列を配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ ＳおよびＨＭＳ １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ細胞中に形質転換した。タンパク質発現は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
ＨｉｓタグのないＥ．ｃｏｌｉでのＷＴ−１Ｃ（アミノ酸６９〜４３０）の設計（配列番号３８７（ｃＤＮＡ）および配列番号３９４（タンパク質））：
ＷＴ−１Ｃリーディングフレームは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅された：
ＰＤＭ−７８０（配列番号４０２）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６℃
ＰＤＭ−７７８（配列番号４０３）
Figure 2007515393
 Ｔｍ７℃
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌ １μＭの各々のオリゴ、８３μｌ滅菌水１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ），５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２ ＷＴ−１ Ｎｏ Ｈｉｓ）。反応は最初に９６℃で２分間変性し、その後に９６℃で２０秒間、６２℃１５秒間および７２℃２分間の４０サイクルを続けた。この後に７２℃で４分間の最終伸長を続けた。ＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化されたｐＰＤＭ Ｈｉｓ中にクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ ＳおよびＨＭＳ １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ細胞中に形質転換した。タンパク質発現は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
（実施例２４）
（全遺伝子プライミングを用いるＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの生成およびＨＬＡ−Ａ２拘束ＷＴ１エピトープの同定）
本実施例では、アデノおよびワクシニアウイルス送達ビヒクルを用いてＷＴ１特異的Ｔ細胞株を生成した。この株由来のＴ細胞クローンは、ＷＴ１に特異的であることが示され、さらにこのクローンによって認識されたエピトープが同定された。
樹状細胞（ＤＣ）は、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地における４〜６日間の増殖によって、正常ドナーのＰＢＭＣ由来の単球培養物から分化された。培養後、ＤＣを、組み換えＷＴ１発現ワクシニアウイルスを用いて５の感染効率（ＭＯＩ）で１６時間感染させるか、または組み換えＷＴ１発現アデノウイルスを３〜１０のＭＯＩで用いて３日間感染させた。ワクシニアウイルスは、Ｕ．Ｖ．照射によって不活化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６＋細胞に対する抗体を用いるネガティブ枯渇（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、続いてこれらのＡｂのＦｃ部分に特異的な磁気ビーズによって単離した。
プライミング培養は、９６ウェルプレート中で開始した。培養物は、ＷＴ１を発現するように操作したアデノまたはワクシニアウイルスで感染した自系の樹状細胞を用いて７〜１０日ごとに再刺激した。４〜５回の刺激サイクル後、自己のＷＴ１発現樹状細胞または線維芽細胞で同時刺激された場合、特異的にインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を生成するＣＤ８＋株が同定できた。これらの株をクローニングして、ＷＴ１導入した自己の線維芽細胞を特異的に認識するが、コントロール導入された線維芽細胞は認識しないことがＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証された。
これらのＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのＨＬＡ拘束をさらに分析するため、このＴ細胞クローンが樹立されたドナー（Ｄ３４９）とＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子のみを共有する、さらなるドナー（Ｄ４７５）に由来する線維芽細胞にＷＴ１を形質導入した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、Ｔ細胞クローンによるこれらのＤ４７５標的細胞の認識が実証された。さらにＨＬＡ Ａ２拘束を実証し、このエピトープがＷＴ１を「天然に（ｎａｔｕｒａｌｌｙ）」過剰発現する腫瘍細胞によって発現される（それらの悪性のトランスフォーメーションの一部として）ということを実証するために、白血病細胞株Ｋ５６２を試験した。Ｋ５６２をＨＬＡ Ａ２分子で形質導入し、ＨＬＡ−Ａ２陰性Ｋ５６２細胞を、非特異的なＩＦＮ−γ放出のコントロールとして用いた。ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、Ｔ細胞がＡ２陽性Ｋ５６２細胞株を認識したが、Ａ２陰性のＫ５６２細胞は認識しなかったことが実証された。認識の特異性およびＨＬＡ−Ａ２拘束のさらなる証明は、ＨＬＡ−Ａ２抗体ブロック実験によって実証された。
ＷＴ１エピトープをさらに規定するために、短縮ＷＴ１レトロウイルス構築物を生成した。次いで、ドナー４７５線維芽細胞にこれらの構築物を形質導入した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ＷＴ１ Ｔｒ１構築物（アミノ酸２〜アミノ酸９２）を形質導入されたＤ４７５線維芽細胞の認識が実証され、これによってＷＴ１エピトープがＷＴ１タンパク質の最初の９１個のＮ末端アミノ酸内に局在することが実証された。このエピトープを細かくマッピングするために、１１アミノ酸ずつ重複するＷＴ１タンパク質の１５マーのペプチドを合成した。ＷＴ１特異的Ｔ細胞クローンは、２つの重複する１５マーのペプチドであるペプチド９（ＱＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡ）（配列番号４１２）およびペプチド１０（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ）（配列番号４１３）を認識した。認識された最小エピトープをさらに特徴付けるために、１５マーのうち共有される９マーおよび１０マーのペプチド（全部で５つ）を用いてこのクローニングの特異性を分析した。このクローンは９マーのＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号２４１）および１０マーのＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ（配列番号４１１）を特異的に認識した。
（実施例２５）
（ＷＴ１に特異的なＣＤ８ Ｔ細胞由来のＴＣＲαおよびβ鎖のクローニングおよび配列決定）
ＷＴ１に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞クローン由来のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）αおよびβ鎖をクローニングする。配列分析を行なって、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖のファミリーの起源を実証する。さらに、固有の多様性および結合セグメント（応答の特異性に寄与する）を同定した。
ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン由来の２×１０６個の細胞由来の総ｍＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて単離して、ｃＤＮＡをＲｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏキットを用いて合成した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。クローン中でＶαおよびＶβ配列を決定するために、ＶαおよびＶβサブタイプ特異的プライマーのパネルを合成（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡによって生成されるプライマー配列に基づく）して、各々のクローンから生成されたｃＤＮＡでのＲＴ−ＰＣＲ反応において用いる。ＲＴ−ＰＣＲ反応によって、ＶαおよびＶβ配列のどちらが各々のクローンによって発現されるかが実証される。
クローンから全長ＴＣＲαおよびβ鎖をクローニングするために、イニシエーターおよびターミネーターをコードするＴＣＲヌクレオチドにおよぶプライマーを設計する。プルーフリーディング・サーモステーブル・ポリメラーゼ（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ＰＷＯ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用い、ＣＴＬクローンから合成されたｃＤＮＡおよび上記のプライマーを用いて、標準的な３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応を確立した。得られた特異的なバンド（αについて約８５０ｂｐ、βについて約９５０ｂｐ）をＰＣＲ平滑ベクター（ＰＣＲ ｂｌｕｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換する。全長のα鎖およびβ鎖を含むプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを同定し、対応するプラスミドの大規模調製物を生成する。次いで、全長のＴＣＲα鎖およびβ鎖を含むプラスミドを標準的な方法を用いて配列決定する。このように、ＴＣＲの特異性に寄与する多様性連結（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｊｏｉｎｉｎｇ）（ＤＪ）領域が決定される。
（実施例２６）
（ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、ＷＴ１発現白血病芽細胞を溶解する）
ペプチド配列ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（ヒトＷＴ１残基３７〜４５；配列番号２４１）を認識する実施例２４に最初に開示されるＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、ＨＬＡ Ａ２拘束様式でＷＴ１発現白血病標的細胞を殺傷する（溶解する）能力についてさらに試験した。ＨＬＡ Ａ２分子、ＧＦＰ、Ａ２Ｋｂを形質導入されるか、または形質導入されていないＫ５６２標的細胞を、エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比が２５：１および５：１という比である標準的な４．５時間５１クロム遊離アッセイにおいて用いた。２５：１というＥ：Ｔ比では、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、Ｋ５６２／Ａ２およびＫ５６２／Ａ２Ｋｂ細胞を溶解した（それぞれ、４０％および４９％の溶解比）が、コントロールのＧＦＰ形質導入およびＫ５６２細胞は溶解されなかった。５：１というＥ：Ｔでは、Ｋ５６２／Ａ２およびＫ５６２／Ａ２Ｋｂ細胞の溶解比はそれぞれ、２１％および２４％であった。従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−Ａ２拘束様式で、ＷＴ１を発現する白血病細胞を認識して溶解する。ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを生成する能力は、遺伝子操作されたＴ細胞を用いるＷＴ１過剰発現をともなう悪性疾患の治療において有用性を有する。
（実施例２７）
（ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド−ＭＨＣ四量体複合体の構築）
本実施例は、昆虫細胞中での可溶性ＨＬＡ−Ａ２のクローニングおよび発現、ならびに精製および抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の検出および単離のための、蛍光の多価ペプチドＭＨＣ四量体複合体中へのＨＬＡ−Ａ２のアセンブリを記載する。
このシステムは、ＨＬＡ−Ａ２がｂｉｒＡ認識配列で単独でビオチニル化されて、引き続きフィコエリトリン結合体化ストレプトアビジン足場上で多量体にアセンブリされたという点で、Ａｌｔｍａｎら（Ａｌｔｍａｎ，Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６ ２７４（５２８４）：９４〜６）によって開発され記載されたのと同様である。本明細書に記載される物質は、ＨＬＡ−Ａ２がグリコシル化された可溶性形態で昆虫細胞から発現され、ヘテロ二量体が抗ヒトクラスＩ ＭＨＣ抗体親和性カラムを用いて精製されたという点で異なる。
ｂｉｒＡビオチニル化配列を付加されたＨＬＡ−Ａ２重鎖遺伝子、およびヒトβ−２−ミクログロブリン遺伝子を、バキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｄｕａｌ中にクローニングした。昆虫細胞の感染の際、遺伝子は多様なプロモーターから同時に転写されて、完全にアセンブルされ、グリコシル化可溶性ＨＬＡ−Ａ２ヘテロ二量体が増殖培地中に分泌された。感染された昆虫細胞は、上清が回収される前に、２１℃で４日間、細胞ファクトリー中で培養された。Ｗ６／３２およびビオチン化Ｂ９．１２．１抗体を使用する捕獲ＥＬＩＳＡによってＨＬＡ−Ａ２産生をモニターした。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに連結された抗ヒトクラスＩＭＨＣモノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって１工程で９０％を超える純度まで、培養上清からＨＬＡ−Ａ２を精製した。用いた抗体はＰＡ２．１およびＷ６／３２であった。精製したＨＬＡ−Ａ２は、市販のｂｉｒＡ酵素を用いて重鎖のＣ末端上のｂｉｒＡ認識配列上で単独でビオチニル化された。ビオチニル化の有効性は、本質的に記載のとおり（Ｃｒａｗｆｏｒｄら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｊｕｎｅ；８（６）：６７５〜８２）評価して、その物質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製した。フィコエリトリン結合体化ストレプトアビジンをｂｉｏ−ＨＬＡ−Ａ２で飽和して、多価染色試薬は、ＳＥＣによって遊離のＨＬＡ−Ａ２から精製した。ＨＬＡ−Ａ２四量体は、１０倍モル過剰のＨｅｒ−２／ｎｅｕ Ｅ７５ペプチドまたはインフルエンザマトリックスＭＩペプチドとともに、室温で４８時間インキュベートし、その後に特定のＴ細胞クローンを、ペプチド負荷した四量体および抗ＣＤ８抗体の存在下において４℃で３０分間染色した。結果として、Ｍ１ ５８−６６Ｍ１インフルエンザペプチドのモル過剰の存在下でインキュベートした四量体がインフルエンザ特異的Ｔ細胞クローンを特異的に染色し、過剰のＨｅｒ−２／ｎｅｕ Ｅ７５ペプチドとともにインキュベートした四量体がＨｅｒ−２／ｎｅｗ特異的Ｔ細胞クローンを特異的に染色したことが示された。
（実施例２８）
（ＷＴ１ ＭＨＣ−ペプチド四量体を用いるＷＴ１特異的Ｔ細胞の検出）
実施例２７に記載されるＨＬＡ−Ａ２四量体を、ＨＬＡ−Ａ２によって拘束されることが実施例２４において以前に示されている、モル過剰のＷＴ１ ｐ３７−４５ペプチド（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ）（ヒトＷＴ１残基３７−４５；配列番号２４１）とともにインキュベートした。この四量体を用いて、実施例２４に記載されたＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを染色した。このクローンは、ｐ３７−４５エピトープを特異的に認識することが示された。四量体を過剰のｐ３７−４５ペプチドとともにインキュベートした場合、それらはＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを特異的に染色したが、それらの四量体を過剰の無関係のＨＬＡ−Ａ２ペプチド（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＷＴ１ｐ３８−４６、ＷＴ１ｐ３９−４７）とともにインキュベートした場合、この四量体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを染色しなかった。従って、ＷＴ１ｐ３７−４５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−Ａ２−ｐ３７−４５ペプチドＭＨＣ四量体によって特異的に認識される。
次いで、実施例２４に記載されるように生成されたＷＴ１特異的Ｔ細胞株をＨＬＡ−Ａ２−ｐ３７−４５、無関係のＨｅｒ２／ｎｅｕまたはＷＴ１ｐ３７−４６四量体を用いて染色した。ＨＬＡ−Ａ２−ｐ３７−４５四量体は、このＷＴ１特異的Ｔ細胞株の総集団の１％およびゲートの（ｇａｔｅｄ）ＣＤ８＋集団の７％を染色したが、一方、コントロールのＨＬＡ−Ａ２−ｐ３７−４６四量体の染色は、コントロールのＨＬＡ−Ａ２−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ四量体と同じバックグラウンドレベルであった。
これらの結果によってＭＨＣ−ペプチド四量体はＷＴ１特異的免疫応答を検出するために高度に鋭敏で特異的なツールである。このペプチド−ＭＨＣ四量体は、ＷＴ１関連悪性疾患の早期検出のため、ＷＴ１特異的応答をモニタリングすること、および最小残存病変をモニタリングするために使用可能である。四量体染色によるＷＴ１特異的Ｔ細胞の検出はまた、再発または疾患進行についてのリスクが高い、ＷＴ１関連疾患に罹患している患者集団内の群を同定するために有用なツールである。
（実施例２９）
（全遺伝子プライミングを用いるＨＬＡ−Ａ２４陽性ドナーからのＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株の生成）
本実施例では、アデノおよびワクシニアウイルス送達ビヒクルを用いて、ＨＬＡ−Ａ２４陽性ドナーからＷＴ１特異的Ｔ細胞株を生成した。このＴ細胞株は、ＭＨＣクラスＩ拘束されることが示された。これらの実験によって、ＷＴ１タンパク質の免疫原性がさらに確認され、ワクチンおよび／または他の免疫治療アプローチの標的としてのその用途が支持される。
樹状細胞（ＤＣ）は、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地中における４〜６日間の増殖によって正常なＨＬＡ−Ａ２４陽性ドナーのＰＢＭＣ由来の単球培養物から分化された。培養後、ＤＣを、組み換えＷＴ１発現ワクチンウイルスを用いて５の感染効率（ＭＯＩ）で１６時間感染させるか、または組み換えＷＴ１発現アデノウイルスを３〜１０のＭＯＩで用いて２〜３日間感染させた。ワクシニアウイルスは、Ｕ．Ｖ．照射によって不活化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６＋細胞に対する抗体を用いるネガティブ枯渇、続いてこれらのＡｂのＦｃ部分に特異的な磁気ビーズによって単離した。
プライミング培養は、９６ウェルプレート中で開始した。培養物は、ＷＴ１を発現するように操作したアデノまたはワクシニアウイルスで感染した自系の樹状細胞を用いて７〜１０日ごとに再刺激した。４〜５回の刺激サイクル後、自己のＷＴ１発現樹状細胞または線維芽細胞で同時刺激された場合、特異的にインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を生成するＣＤ８＋Ｔ細胞株が同定できた。これらの株をクローニングしたところ、ＷＴ１導入した自己の線維芽細胞を特異的に認識するが、コントロール導入された線維芽細胞はＭＨＣクラスＩ拘束様式で認識しないことがＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって示された。
これらの実験によって、ＷＴ１タンパク質は、Ｔ細胞応答を生成するのに使用可能であることが示され、これによってさらに、ＷＴ１抗原の免疫原性が確認され、ワクチンおよび他の免疫療法的なアプローチの標的としてのその用途が支持される。
（実施例３０）
（ＨＬＡ−Ａ２高親和性ＷＴ１エピトープの同定）
本実施例では、天然にプロセシングされたエピトープよりも高い親和性を有するＨＬＡ−Ａ２に対して結合すると予測されるＷＴ１エピトープのインシリコにおける同定を記載する。本明細書において同定されたエピトープは、ＷＴ１発現を伴うガンの治療のためのワクチンおよび／または免疫療法的ストラテジーにおいて有用性を有する。
天然にプロセシングされたペプチドよりも高い親和性でＨＬＡ−Ａ２．１に結合するためのモチーフを有する、天然にプロセシングされたＨＬＡ Ａ２拘束ＷＴ１エピトープｐ３７−４５のペプチドアナログ（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ；ヒトＷＴ１残基３７〜４５；配列番号２４１；ＨＬＡ−Ａ２によって拘束されることが実施例２４において以前に示された）を、以下にさらに詳細に記載するように構築した。
Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら（Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｊｕｔｔａ Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｎｉｅｌｓ Ｎｉｋｏｌａｕｓ Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｏｓｋａｒ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｂａｃｈｏｒ，Ｓｔｅｆａｎ Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ：ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂｅｓ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）５０：２１３〜２１９）によって、およびＰａｒｋｅｒら（Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．，Ｍ．Ａ．Ｂｅｄｎａｒｅｋ，およびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ．１９９４．Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｒａｎｋｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＨＬＡ−Ａ２ ｎｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｉｉｖｉｄｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３）によって開発されたアルゴリズムに基づくペプチドモチーフ検索プログラムを用いて、天然のｐ３７−４５ペプチドよりも高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合することが予測されるＷＴ１ ｐ３７−４５ペプチドエピトープのアナログを同定した。表ＬＩＩに示されるペプチドは、天然にプロセシングされたｐ３７−４５ペプチド以上の推定ペプチド結合スコアを有する。この結合スコアは、ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子に対する解離の推定半減期に由来する。この分析は、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｐａｒｋｅｒ博士ｋｐａｒｋｅｒ＠ａｔｌａｓ．ｎｉａｉｄ．ｇｏｖ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨによる公表文献から推定される係数の表に基づく。
（表ＬＩＩ）
（ｐ３７−４５ペプチドアナログ）
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 別の分析では、コンピューターモデルを用いて、ｐ３７−４５ ＷＴ１エピトープのペプチドエピトープアナログを同定した。ＨＬＡ−Ａ２のネイティブ構造の座標は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データベースからダウンロードした（ｐｄｂ Ｉ．Ｄ．：３ＨＬＡ）（Ｌ．Ｌ．Ｗａｌｓｈ，「Ａｎｎｏｔａｔｅｄ ＰＤＢ Ｆｉｌｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １：５，Ｄｉｓｋｅｔｔｅ Ａｐｐｅｎｄｉｘ（１９９２）。このファイルを、Ｅｘｐａｓｙウェブサイト（Ａｐｐｅｌ Ｒ．Ｄ．，Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．，Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ Ｄ．Ｆ．Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｏｓｔｓ：ｔｈｅ ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ ＷＷＷ ｓｅｒｖｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：２５８〜２６０（１９９４））から入手可能なプログラムであるＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ（Ｐｅｉｔｓｃｈ ＭＣ（１９９６）ＰｒｏＭｏｄ ａｎｄ Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌ：Ｉｎｔｅｒｎｅｔ−ｂａｓｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２４：２７４〜２７９）での操作のためのテンプレートとして用いた。このタンパク質に結合したペプチドを手技的に変異させて結合したＷＴｐ３７−４５ペプチドを得た。新規の構築物をＳｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒのＧＲＯＭＯＳ９６実行での３回のエネルギー最小化に入力した；構造全体で２回のエネルギー最小化を行い、続いて選択した不都合な残基を用いて１回行なった。最終評価によって、このモデルについて全体的な有利なエネルギー状態が示された。ラマチャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｐｌｏｔｔｉｎｇ）によって、却下された領域から遠くに唯一の非グリシニルがあることが示された。本明細書に記載されたこのモデリング方法を用いて同定されたペプチドを以下の表ＬＩＩＩに示す。
（表ＬＩＩＩ）
（コンピューターモデリングによって同定されたｐ３７−４５ペプチドアナログ）
Figure 2007515393
 次いで、上記の２つの方法を用いて同定されたいくつかのペプチドを、ｐ３７−４５特異的ＣＴＬクローンによって認識される能力について試験した（実施例２４を参照のこと）。ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、ペプチドｐ３７−１（配列番号４２６）およびモデル−１（配列番号４４５）がｐ３７−４５ＣＴＬクローンによって認識されることが示された。これらの結果によって、これらの２つのペプチドアナログは、天然にプロセシングされるエピトープよりも高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合すると予測されること、ネイティブのＴ細胞レセプターによって依然として認識されることが示唆される。
このように、この実験は、天然にプロセシングされるエピトープよりも高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合すると予測されるＷＴ１エピトープのインリシコでの同定を記載する。同定された２つのエピトープを試験したところ、ネイティブのＷＴ１ ｐ３７−４５エピトープで生成されたＣＴＬクローンによって認識されることが示された。本明細書において同定されたエピトープは、ＷＴ１発現を伴うガンの治療のためのワクチンおよび／または免疫治療的なストラテジーにおいて有用性を有する。
（実施例３１）
（ＷＴ１抗原のインビボ免疫原性）
本実施例は、マウスにおいてＷＴ１を用いるワクチン接種ストラテジーを評価するためのインビボにおける３つの免疫原性研究を記載している。この３つのストラテジーは以下から構成された：１）裸のＤＮＡワクチンのプライミング（ｐｒｉｍｅ）およびブースト（ｂｏｏｓｔ）（追加免疫）；２）弱毒化アデノウイルスプライミング、その後の弱毒化αウイルスのブースト；または３）裸のＤＮＡプライミング、その後のアデノウイルスのブースト。これらの研究で用いたＷＴ１のスプライシング変異体の全長ｃＤＮＡは配列番号３８１に示す。本明細書に記載される結果から、ＷＴ１発現を伴うガンを治療するためのワクチンストラテジーとして、ＷＴ１ ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／アデノウイルスまたはアデノウイルス／αウイルスプライミング／ブーストのレジメンの用途についての支持が得られる。
第一の研究では、Ｃ５７／ＢＩ６マウスを、ＷＴ１をコードする１００μｇの裸のＤＮＡを用いて２週間の間隔で３回免疫した。最終免疫の２〜３週間後にマウスを屠殺して、標準的なクロム遊離アッセイによってＣＴＬを評価した。この最初の研究によって、ＷＴ１ ＤＮＡ免疫は、これらのマウスにおいてＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発し、これは４０％の溶解を示す２５：１のＥ：Ｔ比であることが示された。
第二の研究では、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを、ＷＴ１をコードする５×１０８ ＰＦＵの弱毒化アデノウイルス（実施例２０に記載）を用いて１回、その４週間後にＷＴ１をコードする５×１０６ＰＦＵのαウイルス（ＡｌｐｈａＶａｘ）を用いたブーストを用いて１回免疫した。最終免疫の２〜３週間後にマウスを屠殺して、標準的なクロム遊離アッセイによってＣＴＬを評価した。この結果によって、ＨＬＡ−Ａ２／ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＷＴ１特異的ＣＴＬは、ＷＴ１発現ウイルス構築物を導入された樹状細胞（ＤＣ）およびＷＴ１ペプチドでパルスされたＤＣを特異的に溶解することが示された。従って、この免疫ストラテジーはまた、ＷＴ１特異的ＣＴＬをインビボにおいて効率的に誘発する。
第三の研究では、Ｃ５７／ＢＩ６およびＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを１００μｇの裸のＷＴ１ ＤＮＡを用いて２週あけて２回、その３週後にＷＴ１をコードする７×１０８ＰＦＵのアデノウイルスを用いるブーストによって免疫した。最終免疫の２〜３週間後にマウスを屠殺して、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＣＴＬを評価した。この結果によって、ＷＴ１ ＤＮＡおよびアデノウイルスのプライミング−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）がＨＬＡ−Ａ２／ＫｂトランスジェニックマウスにおいてＷＴ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を生じることが示された。約４２％のＣＤ８陽性細胞が、ＷＴ−１を形質導入されたＤＣでの７日の刺激後にＩＦＮ−γについて陽性に染まった。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの結果によって、この免疫ストラテジーでは新鮮な脾細胞において検出可能なＣＤ８応答を生じることが示された。脾細胞は、ＷＴ１タンパク質全体におよぶ、１１アミノ酸ずつ重複する１０個の１５マーペプチドのプールを用いて６時間刺激した。ｐ１２１−１７１で刺激した細胞のみが、ＩＦＮ−γ染色を示した。ｐ１２１−１７１ペプチドプールで刺激されたＣＤ８Ｔ細胞のうち約１．１％がＩＦＮ−γについて陽性に染色した。このペプチドは、マウスにおいてＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞および抗体応答を誘発する、実施例３に示されるｐ１１７−１３９ペプチド（配列番号２）を含む。
まとめると、これらの結果によって、本明細書において試験される３つの免疫ストラテジーではインビボでＴ細胞応答が生じることが示される。従って、これらの研究によって、ＷＴ１タンパク質の免疫原性がさらに確認され、ＷＴ１発現を伴うガンを治療するためのワクチンストラテジーとして、ＷＴ１ ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／アデノウイルスまたはアデノウイルス／αウイルスプライミング／ブーストのレジメンの用途についての支持が得られる。
（実施例３２）
（ＷＴ１タンパク質で免疫されたＨＬＡ−Ａ２／ＫｂトランスジェニックマウスでのＷＴ１＋腫瘍増殖の軽減）
本実施例は、ＷＴ１ワクチンで免疫されたトランスジェニックマウスにおけるＷＴ１＋腫瘍の軽減を記載する。これらの結果からさらに、ＷＴ１がワクチン標的として確証され、ＷＴ１発現を伴うガンを治療するためのワクチンストラテジーにおけるＷＴ１の用途が支持される。
マウス樹状細胞（ＤＣ）株 ＤＣ２．４．に、ＷＴ１−ＬＡＭＰ構築物（実施例１８を参照のこと、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ配列番号３８２および４０９に示す）を安定に形質導入した。次いでマウスに２×１０６個の細胞を皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）のいずれかに接種した。これによってマウス８０〜１００％で腫瘍増殖が生じた。インビボにおいてマウスで樹立された腫瘍は、そのＷＴ１発現を保持していた。従って、このモデルで得られた系では、ＷＴ１ワクチンストラテジーの有効性が確証される。
次いで、３群のＡ２／Ｋｂマウスを以下のように２週空けて３回、免疫した：
１群：生理食塩水単独ｓ．ｃ．（コントロール、ｎ＝１０マウス）
２群：ＭＰＬ−ＳＥ １０μｇ単独ｓ．ｃ．（コントロール、ｎ＝１０マウス）
３群：Ｒａ１２／ＷＴ１タンパク質１００μｇ＋１０μｇ ＭＰＬ−ＳＥｓ．ｃ．（ｎ＝９マウス）
最後のＷＴ１免疫の２〜３週間後、ＷＴ１を過剰発現する２×１０６個のＡ２／Ｋｂ ＤＤ２．４腫瘍細胞をマウスに接種した。腫瘍チャレンジ後、マウスをモニターして、腫瘍チャレンジの４週間後まで週に２回腫瘍サイズを測定した。
この結果によって、ＷＴ１タンパク質ワクチンを投与された群では腫瘍増殖のあるマウスの割合は約１００％（生理食塩水コントロール）または９０％（ＭＰＬ−ＳＥアジュバントコントロール）から４５％（ＷＴ１タンパク質免疫群）まで低下した。さらに、平均腫瘍容積は、この群では、コントロール群で観察された１２３３ｃｍｍ（生理食塩水コントロール）または７５３ｃｍｍ（ＭＰＬ−ＳＥアジュバントコントロール）の平均腫瘍サイズからＷＴ１タンパク質で免疫された群の２２６ｃｍｍまで減少した。組織病理学的分析によって、ワクチン接種された動物での腫瘍の縁は、組織球、好酸球、リンパ球、肥満細胞および形質細胞を含む宿主の免疫学的反応と混合された。まとめると、この結果によって、ＷＴ１タンパク質免疫は、ＷＴ１で免疫された動物において、ＷＴ１陽性腫瘍の増殖から防御するかまたはその増殖を遅延させることが実証される。従って、これらの結果によって、ＷＴ１発現を伴う悪性疾患のためのワクチンとしてのＷＴ１タンパク質の用途が支持される。
（実施例３３）
（天然にプロセシングされたＷＴ１細胞傷害性Ｔ細胞エピトープの同定）
本実施例は、細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されるＷＴ１タンパク質の天然に生成されたエピトープの同定を記載する。本実験によってさらに、ＷＴ１タンパク質の免疫原性が確認され、ワクチンおよび／または他の免疫治療的アプローチのための標的としてのＷＴ１タンパク質の用途が支持される。さらに、この実験によって、これらの適用で用いられ得るＷＴ１タンパク質のエピトープが同定される。
ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを、１００μｇの裸のＷＴ１ ＤＮＡを用いて２週空けて２回免疫し、その３週後にＷＴ１をコードする１０７ＰＦＵのアデノウイルスを用いるブーストによって免疫した。最終免疫の２〜３週間後にマウスを屠殺して、標準的なクロム遊離アッセイによってＣＴＬを評価した。前の実験において観察されるように、ＷＴ１ ＤＮＡ、続いてアデノウイルスブーストでの免疫は、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいてＷＴ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発した。どのエピトープがＴ細胞によって認識されたかを同定するために、ＣＴＬ株を生成して、標準的なプロトコールを用いて限界希釈によってクローニングした。次いで、頂部の２０個の推定ＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬエピトープに相当するペプチドでパルスしたＤＣ２．４ Ａ２／Ｋｂ細胞を標的細胞として用いて陽性のクローンを試験した。この結果、ＷＴ１ ｐ１０−１８の９マーペプチド（アミノ酸：ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ、配列番号４５１に示される）がこのＣＴＬクローンによって認識されることが示された。このエピトープは表ＸＬＶＩ、配列番号３４に記載されるとおり、エピトープであることが以前に推定されている。さらなる実験では、ｐ１０ペプチドに対するＣＴＬ応答は、試験された５匹のＷＴ１免疫動物のうちの４匹で観察された。従って、この実験によって、推定のｐ１０−１８ ＷＴ１エピトープは天然にプロセシングされて、ＣＴＬによって認識されることが実証される。さらに、この実験によって、ＷＴ１タンパク質の免疫原性が確認され、ＷＴ１の過剰発現を伴う悪性疾患の治療のためのワクチンおよび免疫療法ストラテジーにおいて用いられ得る、天然にプロセシングされたＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬエピトープがさらに限定される。
（実施例３４）
（（ツイン・アルギニン・トランスロケーター（ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ）（ＴＡＴ）シグナルペプチドを用いるＷＴ１発現構築物）
本実施例は、ＷＴ１−ＴＡＴベクターの構築およびこれらのベクターからのＷＴ１−ＴＡＴの発現を記載する。これらの構築物は、ワクチン接種ストラテジーにおける使用のためのＷＴ１−ＴＡＴ分子の発現において有用性を有する。
ＷＴ−１−Ｆ（ＷＴ１タンパク質のアミノ酸２〜２８１；ＷＴ１のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列の２〜２８１はそれぞれ、配列番号４６０および４６１に示される）、および全長ＷＴ−１は、下記のようにＨｉｓタグなしでｐＴＡＴ融合物として構築した。得られた融合物のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５２および４５３、ならびに配列番号４５４および４５５に示す。
ＷＴ−１−Ｆのオープンリーディングフレームは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−４３９（配列番号４５６）：
Figure 2007515393
 Ｔｍ６６℃
ＰＤＭ−７７９（配列番号４５７）：
Figure 2007515393
 Ｔｍ６３℃
ＷＴ−１の全長オープンリーディングフレームは、以下のプライマーを用いて増幅した：
ｐ３７（配列番号４５８）：
Figure 2007515393
 ｐ２３（配列番号４５９）：
Figure 2007515393
 ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：１μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌ １μＭの各々のオリゴ ８３μｌ滅菌水 １．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）５０ｎｇ ＤＮＡ（ｐＰＤＭ ＦＬ ＷＴ−１）。この反応物は９６℃で２分間変性し、その後に９６℃で２０秒間、６４℃１５秒間および７２℃２分３０秒間の４０サイクル、ならびに７２℃で４分間の最終伸長を続けた。
ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ部位で、ｐＴＡＴ（Ｅ．ｃｏｌｉ中でＮ末端でＴｏｒＡシグナルペプチド由来のツイン・アルギニン・転位（ＴＡＴ）シグナルペプチドを有する改変ｐＥＴ２８ベクター；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）２（２）：１７９〜１８９；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００１年１月ｐ６０４〜６１０第１８３巻２号；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２７６巻、２００１年３月１６日、ｐｐ８１５９〜８１６４を参照のこと）中にクローニングした。この配列を配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ ＳおよびＨＭＳ １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中に形質転換した。ＷＴ１−ＴＡＴタンパク質の発現は、ウエスタンブロットによって確認した。
（実施例３５）
（ＷＴ１のＮ末端は、このタンパク質のインビボにおけるドミナントな免疫原性部分である）
本実施例では、ＭＰＬ−ＳＥアジュバントとともに処方したＷＴ−１の異なるタンパク質構築物（実施例３４に記載されるようなＦ短縮（２〜２８１）および全長（２−４３０））でマウスを免疫した。短縮型の構築物によって、全長タンパク質に対して、改善されたＣＤ４応答が誘発された。従って、本実施例は、アミノ酸２〜２８１におよぶＷＴ１タンパク質のＮ末端部分がインビボにおいてＷＴ１タンパク質のドミナントな免疫原性部分であることを実証する。
４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を２０μｇのＷＴ−１タンパク質：ＷＴ−１−ＦまたはＷＴ−１全長（ＦＬ）とのＲａ１２、ＨＩＳまたはＴＡＴ融合物を用いて皮下免疫した。免疫は、０週、３週および９週で行い、脾臓を１１週で回収した。次いで、脾細胞を、培地単独、１５マーのペプチド「ｐ３２」（ＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ，ＷＴ−１のアミノ酸１２５〜１３９；配列番号２に示されるｐ１１７−１３９ペプチド内でみられる、ＣＤ２．４−ＷＴ−１／ＬＡＭＰ細胞株、またはｒＲＡ１２を用いてインビトロで６時間刺激した。次いで、ＣＤ４細胞を細胞内インターフェロンγについて染色して、ＦＡＣＳ分析によって定量した。次いで、これらの脾細胞の一部をインビトロで８日間刺激して、その後にＣＤ４＋ＩＦＮ＋細胞を数え上げた。ｐ３２での６時間の刺激後、短縮されたＮ末端構築物ｒＷＴ１−Ｆ−ＴＡＴで免疫されたマウスでは細胞内ＩＦＮ−γ染色について０．３３％のＣＤ４陽性細胞が陽性であった。対照的に、ｒＷＴ１−ＦＬ−ＴＡＴで免疫されたマウスでは細胞内ＩＦＮ−γについてＣＤ４陽性細胞のわずか０．１０％が陽性に染色された。８日間の刺激後、ｒＷＴ１−Ｆ−ＴＡＴ構築物で免疫したマウスは、ＣＤ４＋細胞の１０．７２％においてＩＦＮ−γ染色を示した。対照的に、全長ＷＴ１−ＴＡＴ構築物で免疫されたマウス由来のＣＤ４陽性細胞の０．２４％が細胞内ＩＦＮ−γについて陽性に染色された。短縮型ｒＷＴ１−ＴＡＴ構築物によって、全長ｒＷＴ１−ＴＡＴ構築物に比較して、改良されたＣＤ４応答が誘発されたことが、これらのデータによって示される。
第二のアッセイにおいて、脾細胞を、２３マーペプチド、ｐ１１７−１３９（配列番号２；ＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ、公知のＣＤ４エピトープを含み、「ｐ３２」を包含する）を用いて３日間インビトロで刺激して、その後、上清を分泌されたＩＦＮγについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。全長ＷＴ１構築物で免疫したマウス由来の脾細胞からの検出可能なＩＦＮ−γ分泌物はなかった。対照的に、ＨＩＳタグなしのｒＷＴ１−Ｆで免疫されたマウス由来の脾細胞から、平均２４７７ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γが検出された。ｒＷＴ１−Ｆ−ＴＡＴで免疫されたマウス由来の脾細胞から、平均４６５８ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γが検出された。短縮型Ｎ末端ＷＴ１構築物によって全長タンパク質に比較して、改良されたＣＤ４応答が誘発されたという観察がこれらのデータによって支持される。
ＷＴ１タンパク質は、ＥＧＲ１／Ｓｐ１ファミリーの転写因子に対して相同性を有する、２つの機能的ドメイン：Ｎ末端のプロリン−グルタミンリッチドメイン、およびＣ末端の４つのジンクフィンガーからなるジンクフィンガードメインからなる転写因子である。ＷＴ１は自己タンパク質である。Ｃ末端は、他の自己タンパク質に対して相同性であり、従って、免疫原性が低い、すなわち、免疫寛容の程度が大きい対象である。注目すべきことに、Ｃ末端内の４ジンクフィンガードメインは、ＥＧＲファミリーのメンバーに対して相同性を有する。本実施例に記載される結果によって、タンパク質の異なる部分の間では、おそらく配列相同性および機能的ドメインに依存して、寛容が異なることが示される。
まとめると、本実施例に記載されるデータは、最も有効なＷＴ１ワクチンは組み換えタンパク質または遺伝子ベースの構築物のいずれかとしてＷＴ１ Ｎ末端を含むという概念を支持する。
（実施例３６）
（ＷＴ１のＮ末端フラグメント（ＷＴ−１−Ｆ：アミノ酸１〜２８１）の発現のためのバキュロウイルス発現構築物、および昆虫細胞を用いるタンパク質の大規模産生）
ＷＴ−１のＮ末端フラグメントのｃＤＭＡは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列と一緒に、テンプレートとして、ＷＴ１−Ｆプラスミドを用いてＰＣＲによって得た（ＷＴ−１−Ｆ：開始メチオニンの下流でクローニングされたＷＴ１タンパク質のアミノ酸２〜２８１；ＷＴ１のｃＤＮＡおよび２〜２８１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６０および４６１に示される。本明細書に記載される実験においてテンプレートとして用いたｐＴＡＴ融合構築物は、実施例３４に記載される。この構築物のｃＤＮＡは配列番号４５２に示される）。以下のプライマーを増幅のために用いた：
ＷＴ１Ｆ１（配列番号４６６）：
Figure 2007515393
 ＷＴ１ＲＶ４（配列番号４６７）：
Figure 2007515393
 同じＯＲＦのｃＤＮＡに加えてＣ末端の１０残基Ｈｉｓ Ｔａｇは、リバースプライマー
Figure 2007515393
 としてＷＴ１ＲＶ４（配列番号４６８）を用いること以外は上記と同様にＰＣＲによって得た。
精製されたＰＣＲ産物を、ドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１のＸｂａＩ部位にクローニングした。組み換えドナープラスミドｐＦＢＷ１−Ｆ（ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６３および４６５に示される）およびｐＦＢＷ１−ＦＨ（１０Ｘ Ｈｉｓ Ｔａｇを有する；ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６２および４６４に示される）を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に形質転換して、部位特異的転位によってＥ．ｃｏｌｉにおいて組み換えバックミド（ｂａｃｍｉｄ）を作成した。この組み換えバックミド（ｂａｃｍｉｄ）はＰＣＲ分析によって確認し、次いでＳｆ−９昆虫細胞にトランスフェクトして、組み換えバキュロウイルスＢＶＷＴ１−ＦおよびＢＶＷＴ１−ＦＨを作成した。組み換えウイルスをＳｆ−９細胞において高力価のウイルスストックまで増幅した。
このＨｉｇｈ ５の昆虫細胞株を用いて、タンパク質発現の、組み換えタンパク質の大規模産生の条件を最適にした。タンパク質発現の条件を最適化するために、Ｈｉｇｈ ５の昆虫細胞の単層を、組み換えバキュロウイルスＢＶＷＴ１−ＦおよびＢＶＷＴ１−ＦＨを種々の感染効率（ＭＯＩ）で用いて感染させて、形質導入された細胞を種々の時点で回収した。タンパク質の同定は、ウサギの抗ＷＴ１ポリクローナル抗体［＃９４２−３２（７９９Ｌ）］を用いるウエスタンブロット分析によって確認した。ＷＴ１−ＦおよびＷＴ１−ＦＨの両方の組み換えタンパク質とも、Ｈｉｇｈ ５細胞が組み換えウイルスによって１．０または２．０というＭＯＩで感染された場合、感染の４８時間または５４時間後に十分発現された。
次いで、組み換えバキュロウイルスの増殖および組み換えＷＴ１−ＦおよびＷＴ１−ＦＨタンパク質の発現をさらに最適化した。ＢＶＷＴ１−ＦおよびＢＶＷＴ１−ＦＨの両方とも２％ウシ胎仔血清および０．５×ＰＳＦを含むＥＳＦ９２１培地中においてＳｆ９昆虫細胞部中で増殖させた。この増殖は２８℃で０．０５のＭＯＩで４日間行なった。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ昆虫細胞株を用いて、タンパク質発現の条件を最適化した。回収の前に、組み換えバキュロウイルスによって０．５、１または２というＭＯＩで３０時間、４８時間、５４時間または７２時間、Ｈｉｇｈ ５昆虫細胞を感染させた。組み換えタンパク質の同定は、ＷＴ１に対する特異的なウサギポリクローナル抗体（抗体＃９４２−３２）を用いるウエスタンブロット分析によって、キャピラリーＬＣ−ＥＳＩタンデム質量分析計によって確認した。これらの実験によって、ＷＴ１−ＦおよびＷＴ１−ＦＨの大規模産生のための最適のタンパク質発現は、Ｈｉｇｈ ５細胞が組み換えウイルスによってＭＯＩ ０．５〜１．０で感染された場合、感染後４３時間で生じることが示される。
まとめると、上記のＷＴ１バキュロウイルスは、ＷＴ１発現を伴う悪性疾患の治療のための種々のワクチンストラテジーにおける使用のためのＷＴ１のＮ末端部分の大規模タンパク質産生のために用いられ得る。
（実施例３７）
（組み換えＴＲＩＣＯＭワクシニアおよび鶏痘ベクターを用いる、マウスにおけるインビボのＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘導）
本実施例は、マウスにおけるＷＴ１を用いるワクチン接種ストラテジーを評価するためのインビボ免疫原性研究を記載する。これらの実験の目的は、ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭおよびｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭがＷＴ１に対する免疫、特にＴ細胞免疫を誘導する能力を試験することであった。本明細書に記載される結果によって、ＷＴ１発現を伴うガンを治療するためのワクチンストラテジーにおいて、ＷＴ１を発現し、かつ三つ組みの同時刺激分子（Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３）を含む、ＴＲＩＣＯＭワクシニアおよび鶏痘ベクターの使用が支持される。
第一の研究では、Ｃ５７ＢＩ／６マウス（１群あたり１２匹のマウス）を、以下の表１に示されるように一次、二次および三次の免疫の間に１４日で２回または３回免疫した。マウスを二次および三次免疫の２１日後に回収した。ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞応答は、以下にさらに詳細に記載されるように、ＷＴ１ペプチド活性化脾臓細胞のＩＦＮ−γ細胞内サイトカイン染色によってアッセイした。ＣＤ４Ｔ細胞応答は、ｒＷＴ１タンパク質刺激脾臓細胞からのＩＦＮ−γ放出によってさらにアッセイした。血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体応答はＥＬＩＳＡによってアッセイした。Ｔ細胞応答は、プールされた脾細胞培養物を用いて評価した（１時点あたり１群あたりマウス４匹）。個々のマウスについて抗体力価を決定した（１時点あたり１群あたりマウス４匹）。
Figure 2007515393
Figure 2007515393
 これらの研究で用いられるＷＴ１のスプライスバリアントの全長ｃＤＮＡは配列番号３８１に示される。本明細書において用いられるＷＴ１アデノウイルスは、実施例２０に記載されるのと同様である。両方ともＷＴ１を発現し、かつ同時刺激分子（Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３）の三つ組みを含む、ｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ組み換え鶏痘およびｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ組み換えワクシニアベクターを、Ｔｈｅｒｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって生成した。
Ｔ細胞応答を評価するために、脾細胞を、ＣＴＬおよびヘルパーＴ細胞のエピトープを含むことが公知の、ＷＴ１ペプチド「ｐ３２」（ＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ、ＷＴ−１のアミノ酸１２５〜１３９；配列番号２に示されるｐ１１７−１３９ペプチド内にみられる）を用いてインビトロで刺激した。二次免疫後２１日でｐ１２５−１３９活性化脾細胞のＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色では、ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（プライム）およびｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＭ（ブースト）で免疫されたマウスにおいて有意な割合のＷＴ１応答性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を示したが、他の群は有意なＷＴ１特異的Ｔ細胞応答を示さなかった。ＤＮＡ群は、ＤＮＡのみでプライムしてブーストしたことに注意のこと。同じ群に引き続きｒＷＴ１−Ａｄｖ三次免疫を行なった。
三次免疫後、単独のペプチド＃３２に対する応答ではなく、重複する１５マーのペプチドのプールに対する応答を評価した。ペプチドプール＃３２−３６に特異的なＷＴ１ペプチドＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（プライム）およびｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＭ（ブースト×２）を用いてワクチン接種されたマウスにおける二次免疫後の応答と同様のレベルで応答することが見出された。さらに、これらのマウス由来のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、ペプチド＃３２よりもかなり低いレベルであるが、２つの重複する１５マーペプチド＃５７−５８（ペプチド５７：ＤＮＬＹＱＭＴＳＱＬＥＣＭＴＷＮ（アミノ酸２２４−２３９）；ペプチド５８：ＭＴＳＱＬＥＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（アミノ酸２２９−２４３）；重複はＷＴ１のアミノ酸残基２２４−２４３に相当する）内に含まれる第二のＷＴ１エピトープに対して応答することが見出された。
抗体応答は、標準的なＥＬＩＳＡを用いて評価した。ＷＴ１に対する低レベルの血清ＩｇＧ２ｂ抗体は、ｒＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥで免疫したマウスにおいて、二次免疫（１：１３５０の力価）の２１日後、および三次免疫（１：３３２５の力価）の２１日後に全部で２１匹のマウスで測定可能であった。対照的に、他の全ての群では、血清ＩｇＧ２ｂ抗体力価は＜１：１００であった（表２）。
Figure 2007515393
 ＊血清力価は、１群あたり４匹のマウスの平均である。＜５０、＜７５または＜１００として記載した力価も平均であるが、全ての場合に、検出可能な力価を有したのは４匹未満のマウスであった。ＮＤは、どのマウスでも抗体が検出されなかったことを示す。
まとめると、ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（プライム）とその後のｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（ブースト）による、またはＷＴ１−ＤＮＡ（プライム）とその後のＷＴ１−アデノ（ブースト）によるＣ５７ＢＩ／６マウスの免疫で、ＷＴ１に対するＣＤ８およびＣＤ４の両方のＴ細胞応答が誘発された。ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭとそれに続くｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ、対、ＷＴ１−ＤＮＡとそれに続くＷＴ１−アデノに対するＴ細胞応答は、実験デザインの検出範囲内では等価であった。理論的に拘束はされないが、ｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭの主な利点は、複数回のブーストが、免疫のレベルを増大し続けることが可能であるということである。従って、これらの研究によって、ＷＴ１タンパク質の免疫原性がさらに確認され、ＷＴ１発現を伴うガンを治療するためのワクチンストラテジーにおけるＷＴ１ ＤＮＡ／アデノウイルスまたはｒｖ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ／ｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭによる免疫レジメンの使用が支持される。
（実施例３８）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１−Ｆの発現のためのスタンピー（Ｓｔｕｍｐｙ）−ＷＴ１−Ｆベクターの構築）
本実施例は、ＷＴ１−Ｆリーディングフレーム（ＷＴ１タンパク質の２−２８１のＮ末端部分）に融合された短縮型のツイン・アルギニン・トランスロケーター（ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ）（ＴＡＴ）シグナルペプチドを含む発現ベクターの構築を記載する。このベクターは、ＷＴ１の発現を伴う悪性疾患の治療のための免疫ストラテジーにおける使用のための単一種の短縮型ＴＡＴ−ＷＴ１−Ｆタンパク質を生成するために用いられ得る。
実施例３４において前に記載したとおり、ＴＡＴシグナル配列を用いて、種々のＷＴ１ベクターを作成した。これらのＴＡＴベクターを発現に用いた場合、多数の形態のタンパク質が観察された。これらの形態のＮ末端配列決定によって、発現されている３つの別のタンパク質の各々がＴＡＴペプチドの短縮であることが示された。これらの切断は、ツインアルギニン部位（ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｓｉｔｅｓ）の各々で生じた。このように、短縮されたＴＡＴベクターは、ＴＡＴシグナルペプチドを３９アミノ酸から１２アミノ酸に短縮して発現の間のこれらの切断産物の生成を回避するように構築された。ＴＡＴ「スタンピー（Ｓｔｕｍｐｙ）」ベクターは、ＴＡＴシグナルペプチドの最初の１２残基を最初のツインアルギニンに至るまで維持することによって生成された。このベクターは以下のとおり構築した：
以下の対のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、次いでアニーリングした。
対１：
スタンピー（Ｓｔｕｍｐｙ）１（配列番号４８６）：
Figure 2007515393
 スタンピー（Ｓｔｕｍｐｙ）３（配列番号４８７）：
Figure 2007515393
 対２：
スタンピー（Ｓｔｕｍｐｙ）４（配列番号４８８）：
Figure 2007515393
 スタンピー（Ｓｔｕｍｐｙ）２（配列番号４８９）：
Figure 2007515393
 次いで、この対を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化された改変ｐＥＴ２８ベクターであるｐＰＤＭと一緒に連結した。得られたプラスミドであるｐＳｔｕｍｐｙを配列番号４７１に示す。短縮型ＴＡＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５０６に示す。全長ＴＡＴポリヌクレオチドは配列番号５０３に示されており、配列番号５０４に示されるＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列をコードする。
次いで、ｐＳｔｕｍｐｙベクターを用いてＳｔｕｍｐｙ−ＷＴ１−Ｆベクターを構築して、切断産物なしのＷＴ１のＮ末端部分を発現した。Ｓｔｕｍｐｙ−ＷＴ１−Ｆベクターは以下のとおり構築した：
ＷＴ１−Ｆのコード領域は、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−１００５（配列番号４８４）：
Figure 2007515393
 ＰＤＭ−１００４（配列番号４８５）：
Figure 2007515393
 増幅反応物は、１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌの各々の１０μＭプライマー、８３μＬ 滅菌水、および１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含んだ。この反応物は最初に９６℃ ２分間変性し、その後に９６℃で２０秒間、６３℃１５秒間および７２℃３０秒間の４０サイクルを続けた。次いでこの反応物を７２℃で４分間の最終伸長について伸長させた。
次いで、このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＳｔｕｍｐｙベクター中にクローニングした。この構築物を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中に形質転換した。得られた短縮型ＴＡＴ ＷＴ１−Ｆ融合タンパク質は、単一の種として発現された。ｐＳｔｕｍｐｙ ＷＴ１−Ｆのコード領域のポリヌクレオチド配列は、配列番号４６９に示されており、この配列は、配列番号４７０に示されるアミノ酸配列をコードする。
（実施例３９）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのＷＴ１−Ｆ ＧＭＰ、ＷＴ１−ＧおよびＷＴ１−δＧベクターの構築）
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質産生のために最適化されたＷＴ１−Ｆ、ＷＴ１−ＧおよびＷＴ１−δＧベクターの構築を記載する。
ＴＡＴ ＷＴ−１Ｆ ＤＮＡ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化されるように、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌ，ＷＡ）によって最適化され、かつ合成的に操作されたコドンであった。ＷＴ１−Ｆのこのコドン最適化されたｃＤＮＡ配列は、配列番号４７７に示されており、配列番号４７９に示されるアミノ酸配列をコードする。次いで、この配列を含むプラスミドを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化された改変ｐＥＴ２８ベクター中にサブクローニングした。この構築物をＤＮＡ配列分析によって正確であることを確認し、次いで発現のためのＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中に形質転換した。この構築物は、ＴＡＴ ＷＴ１−ＦテンプレートＤＮＡの純粋に合成の追跡可能な供給源である。
次いで、コドン最適化配列をＰＣＲのテンプレートとして用いて、Ｎ末端領域から１４個のアミノ酸のプロリンリッチ領域を欠失させ（配列番号４６１に示されるＷＴ−１ Ｆ配列のアミノ酸５４−６７の欠失；全長ＷＴ１のアミノ酸５５−６８に相当する）、これによって、配列番号４７３に示されるＷＴ−１ Ｇ ｃＤＮＡ配列を作成したが、この配列は配列番号４７８に示されるアミノ酸配列をコードする。これは、以下のようにｐＴＡＴ−ＷＴ−１ Ｇ構築物をまず生成することによって行なった：
ＷＴ−１Ｇの５’コード領域は、以下のプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲであった：
ＰＤＭ−１００７（配列番号４９０）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ７６℃
ＰＤＭ−１００６（配列番号４９１）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ７６℃
ＷＴ−１Ｇ領域の３’コード領域は、以下のプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲであった：
ＰＤＭ−１００８（配列番号４９２）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６１℃
ＰＤＭ−１００９（配列番号４９３）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６０℃
ＷＴ１−Ｇの増幅のためのＰＣＲ反応物は、１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌの各々の１０μＭプライマー、８３μＬ 滅菌水、１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および５０ｎｇ ＤＮＡテンプレート（配列番号４７７に示されるように最適化されたｐＴＡＴ ＷＴ１−Ｆコドン）を含んだ。この反応物は最初に９６℃ ２分間変性して、その後に９６℃で２０秒間、６３℃１５秒間および７２℃３０秒間の４０サイクルを続けた。次いでこの反応物を７２℃で４分間の最終伸長について伸長させた。
次いで、この最初のＰＣＲ産物を、ＸｂａＩで消化し、ＸｂａＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化したｐＰＤＭ（改変ｐＥＴ２８ベクター）中にクローニングした。次いで得られた構築物（ｐＴＡＴ ＷＴ１−ＧＡ）をＳｒｆＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。この第二のＰＣＲ構築物を、ＥｃｏＲＩで消化して、ｐＴＡＴ ＷＴ１−ＧＡプラスミド構築物中にクローニングした。同時にＸｂａＩおよびＳｒｆｔＩで最初のＰＣＲ構築物を消化すること、ならびにＥｃｏＲＩを用いて第二のＰＣＲ構築物を消化すること、ならびにＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＰＤＭ中にクローニングすることによって三方向連結を行なった。得られたｐＴＡＴ−ＷＴ１−Ｇ構築物を、配列分析を通じて正確であることを確認し、次いで発現宿主中に形質転換した。このｐＴＡＴ−ＷＴ１−ＧのｃＤＮＡは、配列番号４７５に示しており、この配列は、配列番号４８２のアミノ酸配列をコードする。
上記の第二の方法の間の不完全なＳｒｆＩ消化に起因して、ＷＴ−１ Ｇの予期せぬ形態（ＷＴ−１δＧが作成されたが、これは１４のアミノ酸（ＷＴ−１ Ｆのアミノ酸５５−６８）が欠失されて、３つのアミノ酸が追加されている（配列番号５０２に示されるポリペプチド配列をコードする配列番号５０５に示されるＷＴ−１δＧポリヌクレオチド配列）。このＴＡＴ ＷＴ−１δＧ構築物は、ＴＡＴ ＷＴ−１Ｆ構築物に比較して予期せぬ５倍過剰発現を生じた。ｐＴＡＴ−ＷＴ１δＧ構築物のｃＤＮＡは、配列番号４７６に示されており、配列番号４８１に示されるアミノ酸配列をコードする。
ｐＴＡＴ−ＷＴ−１Ｇの生成後、Ｈｉｓタグの有無のｐＳｔｕｍｐｙ−ＷＴ１ ＧおよびＷＴ１−Ｇを、以下に記載のようにＰＣＲ反応物中のテンプレートとしてｐＴＡＴ−ＷＴ１ Ｇを用いて構築した。
ＷＴ１−Ｇ領域のコード領域は、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した：
ＰＣＲ１：
ＰＤＭ−１０１０（配列番号４９４）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６８℃
ＰＤＭ−１０１１（配列番号４９５）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
ＰＣＲ２：
ＰＤＭ−１０２３（配列番号４９６）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ７１℃
ＰＤＭ−１０１１（配列番号４９７）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
ＰＣＲ反応および増幅の条件は、テンプレートとして配列番号４７５に示されるｐＴＡＴ−ＷＴ１ Ｇを用い、上記されたのと同様であった。この最初のＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化した、ｐＰＤＭ（ｈｉｓタグをインフレームで有する、改変ｐＥＴ２８ベクター）およびｐＳＴＵＭＰＹ（配列番号４７１に示される、１２アミノ酸の短縮型ＴＡＴリーダーペプチドをインフレームで有する、改変ｐＥＴ２８ベクター）中にクローニングした。この第二のＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化された改変ｐＥＴ２８ベクター（ｐＰＤＭ）中にクローニングした。この構築物を、配列分析を通じて正確であることを確認し、次いで発現宿主中に形質転換した。この得られた構築物は以下のとおりである：Ｈｉｓタグを有するＷＴ１−Ｇのポリヌクレオチドは、配列番号４７２に示されており、これは配列番号４８０に示されるアミノ酸配列をコードする。ＨｉｓタグなしのＷＴ１−Ｇのポリヌクレオチドは、配列番号４７３に示されており、この配列は配列番号４７８に示されるアミノ酸配列をコードする。ｐＳｔｕｍｐｙ−ＷＴ１−Ｇポリヌクレオチド配列は、配列番号４７４に示されており、この配列は配列番号４８３に示されるアミノ酸配列をコードする。
関連の実験では、ｐＳｔｕｍｐｙ ＷＴ−１Ｆ ＧＭＰ（コドン最適化）ベクターは、以下のとおり構築した：
ＷＴ−１Ｆ領域のコード領域を、以下のプライマーを用いて増幅した。
ＰＤＭ−１０１０（配列番号５００）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６８℃
ＰＤＭ−１０１１（配列番号５０１）
Figure 2007515393
 Ｔｍ ６３℃
このＰＣＲ反応および増幅条件は、テンプレートとしてｐＴＡＴ ＷＴ−１Ｆ ＧＭＰを用いて上記のとおりであった。ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩで消化して、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化された、実施例３８に記載のｐＳｔｕｍｐｙベクター中にクローニングした。この構築物を、配列分析を通じて正確であることを確認し、次いで発現宿主中に形質転換した。ｐＳｔｕｍｐｙ ＷＴ−１Ｆ ＧＭＰのポリヌクレオチド配列は、配列番号４９８に示されており、これは配列番号４９９のアミノ酸配列をコードしている。
まとめると、本明細書に記載される発現ベクターは、ＷＴ１発現を伴う悪性疾患を治療するためのワクチンストラテジーにおける使用のためのＷＴ１、短縮型ＷＴ１およびＷＴ１融合タンパク質の最適発現および産生のために用いられ得る。
（実施例４０）
（ヒトＷＴ１−Ｆを発現するアデノウイルスベクターの構築）
開始コドンを含むＷＴ１−Ｆ（開始コドンを含むＷＴ１−ＦのＤＮＡ配列は配列番号５０８に示される）は、Ｅ１およびＥ３を欠失されたアデノウイルス血清型５ベクター中にクローニングされた。得られたアデノウイルスベクターは、配列番号５０７に示される。ＷＴ１−Ｆの発現は、高レベルのＷＴ１−Ｆタンパク質の発現を媒介するＣＭＶプロモーターによって制御される。この試薬を用いるヒト細胞の感染によって、ＷＴ１−Ｆタンパク質の高レベル発現がもたらされる。感染中に宿主細胞に導入され、感染後に低レベルで生成されるアデノウイルスタンパク質の抗原性の性質は、免疫原性の標的としてのＷＴ１の免疫監視および免疫認識を増大するように機能し得る。このベクターはまた、哺乳動物被験体に接種された場合にＷＴ１タンパク質に対する免疫応答を生じるために用いられ得る。これらの被験体がＷＴ１発現腫瘍細胞について陽性である場合、免疫応答はこの疾患の経過に対して治療的または治癒的な効果を有し得る。
（実施例４１）
（ＷＴ−１タンパク質に加えて種々のアジュバントを用いるＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ応答）
４匹の群のＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを、以下のアジュバントのうちの１つと混合した２０μｇのＷＴ１−Ｆ短縮タンパク質（実施例３５を参照のこと）を用いて３週間間隔で皮内に３回免疫した：１０μｇ ＲＣ−５２９−ＳＥ、１０μｇ Ｅｎｈａｎｚｙｎまたは１０μｇ ＲＣ−５２９−ＡＦ＋１０μｇ ＱｕｉｌＡ。陽性コントロール群をＷＴ１−Ｆ ＤＮＡを用い、続いてＷＴ１−Ｆをコードする１０７ＰＦＵのアデノウイルス（実施例４０を参照のこと）を用いるブーストによって２回免疫した。最終免疫の２週後にマウスを屠殺して、ＣＴＬを測定した。脾臓を回収して、インビトロでＣＤ．２４−Ａ２Ｋｂ−ＷＴ−１−ＬＡＭＰ細胞（実施例１８を参照のこと）を用いて刺激して、全長ＷＴ１−Ｆを発現するＪｕｒｋａｔ Ａ２Ｋｂ細胞に対してアッセイするか、またはＷＴ−１ ＣＤ８エピトープペプチド（ｐ１０−１８（ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ、配列番号４５１）、ｐ３２（ＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ、ｐ１１７−１３９内で見出されるアミノ酸１２５〜１３９配列番号２、およびＷＴ１ ｐ３７−４５ペプチド（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ，ヒトＷＴ１残基３７−４５；配列番号２４１）を用いてパルスした。標準クロム遊離アッセイを用いて、ＣＴＬ活性についてアッセイした。種々の実験で観察されるように、ＷＴ１ ＤＮＡを用い、続いてアデノウイルスブーストを用いる免疫によって、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスでＷＴ１特異的ＣＴＬ応答が誘発された。ＣＴＬ応答はまた、Ｅｎｈａｎｚｙｎ、ＲＣ−５２９−ＳＥと組み合わせたＷＴ１−Ｆタンパク質、ならびにＲＣ−５２９−ＡＦおよびＱｕｉｌＡの組み合わせを用いて免疫したマウスの脾臓からも検出された。誘導された応答の大きさは、ＤＮＡアデノウイルス免疫において見られる大きさに匹敵した。
上述から、本発明の特定の実施形態は、本明細書中において、例示の目的で記載されているが、種々の改変が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による限定を除いて限定されない。
図１は、マウス（ＭＯ）およびヒト（ＨＵ）のＷＴ１タンパク質配列（それぞれ、配列番号３２０および配列番号３１９）の比較を示す。 図２は、血液学的悪性疾患（ＡＭＬ）を有する患者におけるＷＴ１特異的抗体の検出を図示するウエスタンブロットである。レーン１は、分子量マーカーを示す；レーン２は、陽性コントロールを示す（ＷＴ１特異的抗体を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性ヒト白血病細胞株）；レーン３は、陰性コントロールを示す（マウス血清を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性細胞株）；そしてレーン４は、ＡＭＬを有する患者の血清を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性細胞株を示す。レーン２〜４については、免疫沈降はゲル電気泳動によって分離して、ＷＴ１特異的抗体でプローブした。 図３は、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−ｃを用いて免疫されたＢ６マウスにおけるＷＴ１特異的抗体応答の検出を図示するウエスタンブロットである。レーン１、３および５は、分子量マーカーを示し、レーン２、４および６は、ＷＴ１特異的陽性コントロール（Ｎ１８０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＷＴ１タンパク質のＮ末端領域の１８０アミノ酸におよぶポリペプチドであり、ウエスタンブロットでは５２ｋＤに移動する）を示す。用いられた一次抗体は、レーン２では、ＷＴ１８０で、レーン４では免疫されていないＢ６マウスの血清、レーン６では免疫されたＢ６マウスの血清であった。 図４は、代表的なＷＴ１ペプチドで免疫されたマウスでのＷＴ１特異的抗体の検出を図示するウエスタンブロットである。レーン１、３および５は、分子量マーカーを示し、レーン２、４および６は、ＷＴ１特異的陽性コントロールを示す（Ｎ１８０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＷＴ１タンパク質のＮ末端領域の１８０アミノ酸におよぶポリペプチドであり、ウエスタンブロットでは５２ｋＤに移動する）。用いられた一次抗体は、レーン２では、ＷＴ１８０であり、レーン４では免疫されていないＢ６マウスの血清であり、レーン６では免疫されたＢ６マウスの血清であった。 図５Ａ〜図５Ｃは、代表的なＷＴ１ペプチドで免疫されたマウスでの増殖性Ｔ細胞応答の刺激を図示するグラフである。示したとおり、１つのＴ細胞株および２つの異なるクローンを用いてチミジン取り込みアッセイを行ない、結果をｃｐｍとして表した。ｘ軸上に示されるコントロールは、抗原なし（Ｎｏ Ａｇ）およびＢ６／培地であった；用いた抗原はｐ６−２２ヒト（ｐ１）、ｐ１１７−１３９（ｐ２）またはｐ２４４−２６２ヒト（ｐ３）であった。 図６Ａおよび図６Ｂは、代表的なＷＴ１ペプチドで免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の刺激を図示する棒グラフである。三度目の免疫の３週間後に、ワクチンＡまたはワクチンＢを接種したマウスの脾細胞を培地単独（培地）で、または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）で培養し、ペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）、ｐ２４４−２６２（ｐ２４４）（ワクチンＡ；図６Ａ）またはｐ２８７−３０１（ｐ２８７）、ｐ２９９−３１３（ｐ２９９）、ｐ４２１−４３５（ｐ４２１）（ワクチンＢ；図６Ｂ）を用いてパルスしたＢ６脾臓細胞、および無関係なコントロールペプチド（無関係ペプチド）を２５μｇ／ｍｌで用いてパルスした脾臓細胞を、（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間の増殖後にアッセイした。バーは、刺激係数（ＳＩ）を示し、これは実験ウェルの平均をコントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均で割って算出している。 図７Ａ〜７Ｄは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性Ｔ細胞株およびクローンの生成を図示する棒グラフである。インビボ免疫後、最初の３つのインビトロ刺激（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）（ＩＶＳ）は、それぞれワクチンＡまたはＢの全ての３つのペプチドを用いて行なった。引き続くＩＶＳは、２つの関連のペプチドｐ１１７−１３９およびｐ６−２２のみを用いて単独ペプチド刺激として行なった。クローンは、示したとおり、ｐ６−２２およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方に由来した。Ｔ細胞は、培地単独（培地）、または脾細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）とともに培養し、ペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）または無関係のコントロールペプチド（無関係ペプチド）を２５μｇ／ｍｌで用いてパルスしたＢ６脾細胞を（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間の増殖後にアッセイした。バーは、刺激係数（ＳＩ）を示し、これは実験ウェルの平均をコントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均で割って算出している。 図８Ａおよび８Ｂは、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドについてヒトＷＴ１（配列番号３１９）のＴＳＩＴＥＳ分析の結果を示す。「Ａ」で示す領域は、ブロックのＡＭＰＨＩ中間点であり、「Ｒ」は、Ｒｏｔｈｂａｒｄ／’Ｔａｙｌｏｒモチーフにマッチする残基を示し、「Ｄ」は、ＩＡｄモチーフにマッチする残基を示し、「ｄ」は、ＩＥｄモチーフにマッチする残基を示す。 図９Ａおよび９Ｂは、ＷＴ１ペプチドで免疫されたマウスにおけるＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図９Ａは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を図示しており、図９Ｂはペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す。各々の場合に、溶解％（標準的なクロム遊離アッセイによって決定する場合）は、３つの示したエフェクター：標的比で示される。結果はリンパ腫細胞（ＬＳＴＲＡおよびＥ１０）、およびＥ１０＋ｐ２３５−２４３（Ｅ１０＋Ｐ２３５）について得られる。Ｅ１０細胞はまた、本明細書においてＥＬ−４細胞と呼ばれる。 図１０Ａは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７でのＢ６マウスのワクチン接種後、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するが、ＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ａは、非免疫Ｂ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷しないことを示す。図１０Ｂは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を図示する。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、２つの異なる実験においてＷＴ１陰性細胞株に対して比較した、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を図示する。さらに、図１０Ｃおよび図１０Ｄは、ペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す（関連のＷＴ１ペプチドＰ１１７でコーティングされたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）各々の場合に、溶解％（標準的なクロム遊離アッセイによって決定する場合）は、３つの示したエフェクター：標的比で示される。結果はリンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺癌細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された線維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）、およびＥ１０＋ｐ１１７について得られる。 図１０Ｂは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７でのＢ６マウスのワクチン接種後、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するが、ＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ａは、非免疫Ｂ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷しないことを示す。図１０Ｂは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を図示する。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、２つの異なる実験においてＷＴ１陰性細胞株に対して比較した、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を図示する。さらに、図１０Ｃおよび図１０Ｄは、ペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す（関連のＷＴ１ペプチドＰ１１７でコーティングされたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）各々の場合に、溶解％（標準的なクロム遊離アッセイによって決定する場合）は、３つの示したエフェクター：標的比で示される。結果はリンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺癌細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された線維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）、およびＥ１０＋ｐ１１７について得られる。 図１０Ｃは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７でのＢ６マウスのワクチン接種後、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するが、ＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ａは、非免疫Ｂ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷しないことを示す。図１０Ｂは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を図示する。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、２つの異なる実験においてＷＴ１陰性細胞株に対して比較した、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を図示する。さらに、図１０Ｃおよび図１０Ｄは、ペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す（関連のＷＴ１ペプチドＰ１１７でコーティングされたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）各々の場合に、溶解％（標準的なクロム遊離アッセイによって決定する場合）は、３つの示したエフェクター：標的比で示される。結果はリンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺癌細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された線維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）、およびＥ１０＋ｐ１１７について得られる。 図１０Ｄは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７でのＢ６マウスのワクチン接種後、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するが、ＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ａは、非免疫Ｂ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷しないことを示す。図１０Ｂは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を図示する。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、２つの異なる実験においてＷＴ１陰性細胞株に対して比較した、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を図示する。さらに、図１０Ｃおよび図１０Ｄは、ペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す（関連のＷＴ１ペプチドＰ１１７でコーティングされたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）各々の場合に、溶解％（標準的なクロム遊離アッセイによって決定する場合）は、３つの示したエフェクター：標的比で示される。結果はリンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺癌細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された線維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）、およびＥ１０＋ｐ１１７について得られる。 図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＣＴＬに特異的な代表的なペプチドＰ１１７−１３９がＷＴ１陽性腫瘍細胞を溶解する能力を図示する棒グラフである。三度目の免疫の３週間後、ペプチドｐ２３５−２４３またはｐ１１７−１３９を接種されていたマウスの脾臓細胞を、関連のペプチドを用いてインビトロで刺激し、ＷＴ１ペプチドとともにインキュベートされた標的を溶解する能力について、ＷＴ１陽性および陰性腫瘍細胞について試験した。バーは、２５：１というＥ：Ｔ比を用いて三連で行なったクロム遊離アッセイにおける平均の溶解比％を示す。図１１Ａは、示したとおり、以下に対するｐ２３５−ｐ２４３特異的Ｔ細胞株の細胞毒性活性を示す：ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；関連（免疫および再刺激のために用いられる）ペプチドｐ２３５−２４３でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ２３５）；関連ペプチドｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）またはｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１３０）でパルスされたＥＬ−４、およびＷＴ１陽性腫瘍細胞ＢＬＫ−ＳＶ４０（ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１陽性）およびＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）。図１１Ｂは、示したとおり、以下に対するｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞毒性活性を示す：ＥＬ−４；関連ペプチドＰ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）でパルスしたＥＬ−４、および無関係のペプチドｐ１２３−１３１（ＥＬ−４＋ｐ１２３）、またはｐ１２６−１３６（ＥＬ−４＋ｐ１２８）；ＢＬＫ−ＳＶ４０およびＴＲＡＭＰ−ＣでパルスしたＥＬ−４。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、コールド標的阻害によって実証されるような、ＷＴ１陽性腫瘍細胞の溶解の特性を実証する棒グラフである。バーは、２５：１というＥ：Ｔ比を用いて三連で行なったクロム遊離アッセイにおける平均の溶解比％を示す。図１２Ａは、示したとおり、以下に対するｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞毒性活性を示す：ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）；５１Ｃｒ標識なしの関連のペプチドｐ１１７−１３９（ＴＲＡＭＰ−Ｃ＋ｐ１１７コールド標的）でパルスされた１０倍過剰の（ホット標的に比較して）ＥＬ−４細胞とともにインキュベートされたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞、および５１Ｃｒ標識なしの関連のペプチド（ＴＲＡＭＰ−Ｃ＋無関係のコールド標的）でパルスされたＥＬ−４細胞とともにインキュベートされたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞。図１２Ｂは、示したとおり、以下に対するｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞毒性活性を示す：ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＢＬＫ−ＳＶ４０（ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１陽性）；関連のコールド標的（ＢＬＫ−ＳＶ４０＋ｐ１１７コールド標的）とともにインキュベートされたＢＬＫ−ＳＶ４０細胞、および無関係のコールド標的（ＢＬＫ−ＳＶ４０＋無関係のコールド標的）とともにインキュベートされたＢＬＫ−ＳＶ４０細胞。 図１３Ａ〜図１３Ｃは、ｐ１１７−１３９内の９マーＣＴＬエピトープの評価を示す棒グラフである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株を、適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは欠くアミノ酸１１７〜１３９内のペプチドに対して、ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８での再刺激後に試験した。バーは、２５：１というＥ：Ｔ比を用いて三連で行なったクロム遊離アッセイにおける平均の溶解比％を示す。図１３Ａは、以下に対するｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞毒性活性を示す：ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）およびペプチドｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１１９−１２７（ＥＬ−４＋ｐ１１９）、ｐ１２０−１２８（ＥＬ−４＋ｐ１２０）、ｐ１２３−１３１（ＥＬ−４＋ｐ１２３）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）、ｐ１２８−１３６（ＥＬ−４＋ｐ１２８）およびｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１３０）でパルスされたＥＬ−４細胞。図１３Ｂは、以下に対する、ｐ１２６−１３４での再刺激後のＣＴＬ株の細胞毒性活性を示す：ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）でパルスされたＥＬ−４細胞、およびＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ。図１３Ｃは、以下に対する、ｐ１３０−１３８での再刺激後のＣＴＬ株の細胞毒性活性を示す：ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１３０）でパルスされたＥＬ−４細胞、およびＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ。 図１４は、ＡＭＬを有する６３例の患者におけるＷＴ１に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質に対する血清抗体の反応性を、ＡＭＬを有する患者でのＥＬＩＳＡによって評価した。第一および第二のレーンは、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールを示す。第一および第二のレーンは、それぞれ陽性および陰性コントロールを示す。市販のＷＴ１特異的抗体ＷＴ１８０を陽性コントロールに用いた。次の６３レーンは、各々の個々の患者由来の血清を用いた結果を示す。示したＯＤ値は１：５００血清希釈を用いるＥＬＩＳＡ由来であった。この図は３つの別の実験からの累積データを含む。 図１５は、ＡＭＬを有する２例の患者におけるＷＴ１タンパク質およびコントロールタンパク質に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長、ＷＴ１／Ｎ末端、ＴＲＸおよびＲａ１２のタンパク質に対する血清抗体の反応性を、ＡＭＬを有する２例の患者でのＥＬＩＳＡによって評価した。示したＯＤ値は１：５００血清希釈を用いるＥＬＩＳＡ由来であった。ＡＭＬ−１およびＡＭＬ−２は、図１の個々の患者のうちの２例からの血清を示しており、ＷＴ１／全長に対する抗体反応性を実証する。ＷＴ１全長タンパク質は、Ｒａ１２との融合タンパク質として発現された。ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質は、ＴＲＸとの融合タンパク質として発現された。コントロールのＲａ１２およびＴＲＸタンパク質は、同様の方式で精製した。この結果によって、ＷＴ１融合タンパク質に対する血清抗体反応性がタンパク質のＷＴ１部分に対するものであることが確認される。 図１６は、ＣＭＬを有する８１例の患者におけるＷＴ１に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長タンパク質に対する血清抗体の反応性は、ＡＭＬを有する患者におけるＥＬＩＳＡによって評価した。第一および第二のレーンは、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールを示す。市販のＷＴ１特異的抗体ＷＴ１８０を陽性コントロールに用いた。次の６３レーンは、各々の個々の患者由来の血清を用いた結果を示す。示したＯＤ値は１：５００血清希釈を用いるＥＬＩＳＡ由来であった。この図は３つの別の実験からの累積データを含む。 図１７は、ＣＭＬを有する２例の患者におけるＷＴ１タンパク質およびコントロールタンパク質に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長、ＷＴ１／Ｎ末端、ＴＲＸおよびＲａ１２のタンパク質に対する血清抗体の反応性を、ＣＭＬを有する２例の患者でのＥＬＩＳＡによって評価した。示したＯＤ値は１：５００血清希釈を用いるＥＬＩＳＡ由来であった。ＣＭＬ−１およびＣＭＬ−２は、図３の個々の患者のうちの２例からの血清を示しており、これによってＷＴ１／全長に対する抗体反応性が実証された。ＷＴ１全長タンパク質は、Ｒａ１２との融合タンパク質として発現された。ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質は、ＴＲＸとの融合タンパク質として発現された。コントロールのＲａ１２およびＴＲＸタンパク質は、同様の方式で精製した。この結果によって、ＷＴ１融合タンパク質に対する血清抗体反応性がタンパク質のＷＴ１部分に対するものであることが確認される。 図１８は、血清学的分析に用いた組み換えＷＴ１タンパク質の特徴を示す。 図１９Ａ１は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ａ２は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ａ３は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｂ１は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｂ２は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｂ３は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｃ１は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｃ２は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｃ３は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｄ１は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｄ２は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｄ３は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｅ１は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｅ２は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図１９Ｅ３は、種々の用量のＷＴ１タンパク質を用いたワクチン接種によって誘発されたマウスでの抗体応答を示す棒グラフである。 図２０Ａは、ＷＴ１タンパク質で免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の棒グラフである。 図２０Ｂは、ＷＴ１タンパク質で免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の棒グラフである。 図２１は、アデノＷＴ１およびワクチンＷＴ１感染後のＷＴ１を発現する、蛍光顕微鏡によって試験したヒトＤＣの写真である。 図２２は、ヒトＤＣにおけるＷＴ１発現がアデノＷＴ１感染後に再現可能であり、コントロールのアデノ感染では誘導されないことを実証する写真である。 図２３は、ＷＴ１の全体の遺伝子のインビトロプライミングがＷＴ１特異的Ｔ細胞応答を誘発することを示すＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの写真である。 図２４は、ＷＴ１タンパク質のアミノ酸２〜２８１（配列番号４６１）、およびこれらのアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ（配列番号４６０）を示す。この短縮型のＷＴ１タンパク質をＷＴ１−Ｆと呼ぶ。

Claims (6)

  1. 患者における免疫応答を増強または誘導するための方法であって、以下：
    （ａ）配列番号４６１に示される短縮型ＷＴ１−Ｆポリペプチドを含むＷＴ１ポリペプチド；ならびに
    （ｂ）Ｅｎｈａｎｚｙｎ、ＲＣ−５２９−ＳＥ、およびＲＣ−５２９−ＡＦとＱｕｉｌＡとの組み合わせからなる群より選択されるアジュバント；
    を含有する組成物を該患者に投与する工程を包含し、
    それによって、該患者においてＷＴ１またはＷＴ１を発現する細胞に特異的な免疫応答を増強または誘導する、方法。
  2. 前記アジュバントがＥｎｈａｎｚｙｎを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アジュバントがＲＣ−５２９−ＳＥを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記アジュバントがＲＣ−５２９−ＡＦとＱｕｉｌＡとの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  5. ＷＴ１に特異的なＴ細胞を刺激および／または増殖させるための方法であって、以下：
    （ａ）配列番号４６１に示される短縮型ＷＴ１−Ｆポリペプチドを含むＷＴ１ポリペプチド；ならびに
    （ｂ）Ｅｎｈａｎｚｙｎ、ＲＣ−５２９−ＳＥ、およびＲＣ−５２９−ＡＦとＱｕｉｌＡとの組み合わせからなる群より選択されるアジュバント；
    を含有する組成物とＴ細胞とを、Ｔ細胞の刺激および／または増殖を可能にするのに十分な条件および時間のもとで接触させる工程を包含する、方法。
  6. 患者におけるＷＴ１関連悪性疾患の治療のための方法であって、以下：
    （ａ）配列番号４６１に示される短縮型ＷＴ１−Ｆポリペプチドを含むＷＴ１ポリペプチド；ならびに
    （ｂ）Ｅｎｈａｎｚｙｎ、ＲＣ−５２９−ＳＥ、およびＲＣ−５２９−ＡＦとＱｕｉｌＡとの組み合わせからなる群より選択されるアジュバント；
    を含有する組成物を該患者に投与する工程を包含し、
    それによって、該患者においてＷＴ１関連悪性疾患を治療する、方法。
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