CN110585131A - 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用 - Google Patents

共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110585131A
CN110585131A CN201910895188.3A CN201910895188A CN110585131A CN 110585131 A CN110585131 A CN 110585131A CN 201910895188 A CN201910895188 A CN 201910895188A CN 110585131 A CN110585131 A CN 110585131A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methyltryptophan
immune
micelle
organic solvent
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910895188.3A
Other languages
English (en)
Inventor
刘艳华
兰杨
孙悦
于双雨
刘璐
梁蔷薇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningxia Medical University
Original Assignee
Ningxia Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningxia Medical University filed Critical Ningxia Medical University
Priority to CN201910895188.3A priority Critical patent/CN110585131A/zh
Publication of CN110585131A publication Critical patent/CN110585131A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/331—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen
    • C08G65/332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof
    • C08G65/3322—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33303—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group
    • C08G65/33306—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33303—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group
    • C08G65/33317—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group heterocyclic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

一种共载化疗药物的1‑甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用，涉及高分子材料及药物制剂新剂型技术领域。该免疫前药胶束是应用具有肿瘤免疫调节功能的吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）抑制剂1‑甲基色氨酸，采用化学键合1‑甲基色氨酸制备免疫调节性前药载体，并通过物理包载化疗药物，制备具有化疗‑免疫联合抗肿瘤功效的共载化疗药物的1‑甲基色氨酸前药胶束。本发明基于化疗联合免疫抗肿瘤策略，胞内释放的1‑甲基色氨酸通过抑制肿瘤微环境免疫抑制蛋白酶IDO的高表达，抑制IDO介导的肿瘤免疫逃逸，同时联合化疗药物的抗肿瘤作用，实现化疗联合免疫协同抗肿瘤。本发明也为抗肿瘤研究提供一项基于免疫化疗联合抗肿瘤的新型多功能纳米载体及制剂应用策略。

Description

共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于高分子材料及药物制剂新剂型领域，具体涉及一种具有化疗联合免疫功能的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用。
背景技术
癌症作为全世界危害人类健康的重大问题，一直以来都备受关注。目前临床上用于癌症治疗的方法主要有手术治疗、化学疗法、放射疗法、免疫疗法等，常用的主要是化学疗法。目前研究发现，化疗药物可以通过增强肿瘤细胞的免疫原性，促进抗原相关免疫细胞在肿瘤细胞的表达。同时，化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时可以作用于肿瘤表面的CRT受体，诱导免疫原性细胞死亡，增强肿瘤微环境中的免疫调节系统，有助于联合免疫治疗实现最大化的抗肿瘤疗效。
目前的免疫靶点治疗在抗肿瘤研究中越来越受欢迎，其中吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）作为最好的一种特征性免疫检查点受体，在肿瘤免疫治疗中引起了重大轰动。吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）是一种免疫抑制性蛋白酶，主要产生于淋巴结和肿瘤微环境中的肿瘤细胞，巨噬细胞及树突状细胞中。其作用机制是通过促进色氨酸代谢为毒性犬尿氨酸，抑制效应性CD8+T细胞的表达，诱导免疫抑制性调节性T细胞treg的产生，从而介导了肿瘤微环境中的免疫逃逸。并且由于肿瘤微环境中IDO的高表达，促进肿瘤细胞逃避免疫系统的检测，从而抑制了免疫治疗的疗效。
1-甲基-色氨酸（1-MT)，是吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）的一种特异性免疫抑制剂。通过激活CD4+、CD8+ 效应T细胞与其配体主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子结合，抑制色氨酸代谢为毒性犬尿氨酸，增强Treg细胞的抑制活性，激活肿瘤微环境中的T淋巴细胞功能，从而辅助增加化疗药物的抗肿瘤疗效。
目前研究发现，阿霉素等临床抗肿瘤的一线化疗药，杀死肿瘤细胞的过程中，可同时作用于肿瘤细胞表面的CRT受体，促进IFN-γCD8+的分泌，增强免疫系统中辅助性T细胞Th1、Th2的表达，从而激活肿瘤微环境中T淋巴细胞免疫功能，有助于通过免疫机制联合1-MT增强抑制肿瘤细胞增殖的能力。因此，通过吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）抑制剂1-甲基色氨酸（1-MT）联合化疗药物，有助于实现化疗联合免疫最大化协同抗肿瘤。但由于1-甲基色氨酸（1-MT）与化疗药物在体内具有不同的药动学特征及组织分布，很难实现两药精准高效共递送至肿瘤组织及细胞，发挥免疫化疗联合抗肿瘤作用。
聚合物胶束结合前药技术，通过采用化学键合结合物理包载的载药方式，有效实现了具有不同药动学性质和组织分布的联用药物的体内共递送和高效蓄积至肿瘤。但是目前的共载药胶束，多采用化疗药物联合通过单一的化疗途径抑制肿瘤的增值。然而面对肿瘤微环境的多样性，仅仅通过化疗联合的形式很难实现最佳的抗肿瘤疗效，目前缺乏合适的能够实现免疫联合化疗协同抗肿瘤的新型制剂。
发明内容
有鉴于此，为了提高化疗药物抗肿瘤疗效，同时针对改善肿瘤微环境IDO介导的免疫逃逸，有必要提供一种化疗联合免疫协同抗肿瘤的共载化疗药物的1-甲基色氨酸前药胶束，通过采用化疗药物结合免疫疗法，实现免疫化疗多通路联合抗肿瘤。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束，其特征在于：所述免疫前药胶束是以亲水性聚乙二醇通过桥连连接臂赖氨酸衍生物，并化学键合吲哚胺2，3 双加氧酶（IDO）抑制剂1-甲基色氨酸（1-MT）形成免疫前药聚合物聚乙二醇-1-甲基色氨酸，化疗药物物理包埋在该免疫前药聚合物中。
优选的，所述的胶束中化学键合的1-甲基色氨酸含量为6%~40%，物理包埋的化疗药物含量为3%~20%。
优选的，所述化疗药物包括阿霉素、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、克唑替尼中的任意一种。
优选的，所述免疫前药聚合物聚乙二醇-1-甲基色氨酸中化学键合的IDO抑制剂1-甲基色氨酸为1-D-甲基色氨酸或1-L-甲基色氨酸。
优选的，聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物的结构特征为聚乙二醇-连接臂-1-甲基色氨酸。
优选的，所述聚乙二醇的分子量为2000~10000道尔顿，优选分子量为2000~5000道尔顿。
优选的，所述桥连连接臂赖氨酸衍生物为Fmoc-Lys(Boc)-OH和Boc-Lys(Boc)-OH，此衍生物可同时化学键合1分子的Fmoc基团和2 分子的1-MT。
一种共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束的制备方法，其特征在于：所述免疫前药胶束制备工艺步骤为：将聚乙二醇通过桥连连接臂Fmoc-Lys(Boc)-OH和Boc-Lys(Boc)-OH化学键合1-甲基色氨酸，制备聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物；然后进一步通过薄膜分散法将化疗药物物理包载于上述免疫前药聚合物载体中，制备共载化疗药物的1-甲基色氨酸前药胶束。
优选的，所述聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物的制备方法如下：
（1）1-甲基色氨酸，二碳酸二叔丁酯和无水碳酸钠以摩尔比摩尔比为1: 1~2: 2~3共溶于有机溶剂A，0 ℃下反应5~30 min，转至室温磁力搅拌1~2天，旋蒸除去有机溶剂，硅胶柱纯化产物，真空干燥制得白色粉末状产物；
（2）聚乙二醇单甲醚、Fmoc-Lys(Boc)-OH在N, N’-二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）以摩尔比为1：1.5~10: 2~15: 0.2~5共催化，于25~35 ℃下磁力搅拌反应3~7天，过滤，有机溶剂A沉淀纯化，真空干燥制得白色粘稠状产物；
（3）将步骤2）中所得产物与三氟乙酸以质量体积比1 : 1~5加入有机溶剂A，于25~35℃下磁力搅拌2~4 h，反应液用有机溶剂A沉淀纯化，真空干燥制得淡黄色油状产物；
（4）将步骤 3）中所得产物与Boc-Lys(Boc)-OH在N, N’-二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）催化下共溶于有机溶剂A中，加入三乙胺，25~35 ℃下磁力搅拌3~5天。有机溶剂A沉淀纯化反应液，真空干燥制得白色粘稠状产物；
（5）将步骤 4）中所得产物于与三氟乙酸以质量体积比1 : 1~5加入有机溶剂A，25~35℃下磁力搅拌2~5 h，反应液用有机溶剂A沉淀纯化，真空干燥制得淡黄色油状产物；
（6）将步骤 1）中所得产物和步骤 5）中所得产物与N, N’-二环己基碳二亚胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）以摩尔比为1：1~10: 2~10: 0.2~3共溶于有机溶剂A，于25~35 ℃搅拌4~7天，有机溶剂沉淀纯化反应液，真空干燥制得白色粘稠状产物；
（7）将步骤 6）中所得产物与三氟乙酸以质量体积比1 : 1~5加入有机溶剂A，25~35 ℃下磁力搅拌2~5 h，反应液用有机溶剂A沉淀纯化，真空干燥制得油状免疫前药聚合物聚乙二醇-1-甲基色氨酸。
优选的，所述的薄膜分散法包括以下步骤：将聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物与化疗药物以摩尔比为1：0.5~10共溶于有机溶剂B，通过氮气去除有机溶剂，形成聚合物薄膜，室温下真空干燥，之后用0.01~0.1mmol/L,pH7.4的磷酸盐缓冲液或0.01~0.05mmol/L的Hepes溶液复溶，即可制得粒径在20~200 nm的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束。
优选的，所述有机溶剂A为无水乙醇、无水乙醚、石油醚、二氯甲烷、四氢呋喃、三乙胺、氯仿、甲醇和乙酸乙酯中的任意一种；所述有机溶剂B为甲醇、无水乙醇、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷和三乙胺中的任意一种或两种。
本发明还提供了一种共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束在免疫化疗联合抗肿瘤中的应用。
本发明还提供了一种共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束在免疫化疗联合抗乳腺癌、肝癌和肺癌中的应用。
本发明采用上述技术方案，其有益效果在于：本发明基于化疗联合免疫抗肿瘤策略，应用具有肿瘤免疫调节功能的吲哚胺2, 3 双加氧酶（IDO）抑制剂1-甲基色氨酸，采用化学键合1-甲基色氨酸制备免疫前药载体，该载体可有效抑制色氨酸代谢为毒性犬尿氨酸，抑制肿瘤微环境中IDO的高表达，增强肿瘤微环境中的免疫功能。
本发明通过化疗联合免疫治疗方法，采用化学键合1-甲基色氨酸并物理包载阿霉素的聚合物前药胶束共载药技术，制备共载阿霉素的1-甲基色氨酸免疫化疗多功能前药聚合物胶束，可实现两药以其联用比例体内同步精准高效共递送至肿瘤组织及细胞。通过1-甲基色氨酸抑制色氨酸代谢为毒性犬尿酸，降低肿瘤微环境中IDO的高表达介导的免疫逃逸。同时，阿霉素在杀死肿瘤细胞的同时，作用于肿瘤细胞表面CRT受体诱导免疫原性细胞死亡 （ICD），促进辅助性T淋巴细胞的TH1、Th2表达，增强正性T淋巴细胞的免疫功能，协助增强1-甲基色氨酸免疫抑制肿瘤细胞增殖的能力，有助于实现化疗-免疫最大化协同抗肿瘤。
本发明为抗肿瘤研究提供一项基于免疫化疗联合抗肿瘤的新型多功能纳米载体及制剂策略。
附图说明
图1为本发明实施例聚乙二醇-1-甲基色氨酸免疫前药胶束的自组装及共载药示意图。
图2为本发明1-甲基色氨酸二碳酸二叔丁酯 （A）和PEG-Fmoc-1-MT (B)前药聚合物氢谱核磁鉴定图。
图3为的PEG-Fmoc-1-MT (A)、DOX/PEG-Fmoc-1-MT（B）透射电镜图。
图4为本发明DOX 溶液、1-MT溶液及共载药胶束DOX/PEG-Fmoc-1-MT的体外释放图。
图5为本发明1-MT溶液和PEG-Fmoc-1-MT胶束在乳腺4T1肿瘤细胞体外IDO抑制曲线 （A）及体外T淋巴细胞增殖实验 （B&C）。
图6为本发明的PEG-Fmoc-1-MT和DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束的体外制剂毒研究。
图7为本发明的PEG-Fmoc-1-MT和DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束的体内药效学研究。
图8为本发明PEG-Fmoc-1-MT前药聚合物胶束和共载药DOX/PEG-Fmoc-1-MT在乳腺4T1小鼠模型中肿瘤浸润性淋巴细胞数量（A&B&C）及血清中免疫细胞因子含量测定实验（D&E&F)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
本发明中的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束的制备方法包括两个步骤，步骤一：聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物的制备，步骤二：共载化疗药物的1-甲基色氨酸前药胶束的制备。以使实施例一、二为步骤一的制备方法的说明，实施例三为步骤二的说明。
实施例1：免疫前药聚乙二醇-1-甲基色氨酸（PEG-Fmoc-1-MT）的合成。
1、1-D-甲基色氨酸-二碳酸二叔丁酯的合成
取0.2 g 1-D-甲基色氨酸、0.24 g二碳酸二叔丁酯和0.2 g 碳酸钠共溶于10 mL四氢呋喃.水（THF:H2O=1:1, v:v），0 ℃下磁力搅拌10 min，转至25 ℃磁力搅拌1天，反应结束后旋蒸除去四氢呋喃。1 mol/L的盐酸调节pH至2，乙酸乙酯和水等体积冲洗产物，无水硫酸钠过滤，收集滤液并旋蒸，以二氯甲烷和甲醇（100：1，v/v）为流动相，二氯甲烷和甲醇（10：1，v/v）为展开剂，采用硅胶柱层析法梯度洗脱纯化产物，收集并旋蒸纯化后的产物，室温下真空干燥制得白色粉末状产物。
2、 PEG-Fmoc-1-MT的合成
（1）5 g 聚乙二醇单甲醚（分子量2K）与5.86 g Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.58 g DCC和0.153 g DMAP共溶于25 mL二氯甲烷中，25 ℃下磁力搅拌3天，反应液用无水乙醇、乙醚沉淀纯化，37 ℃水浴活化，减压干燥制得白色粘稠状的PEG-Fmoc-Lys(Boc)。
（2）将步骤1）中所得产物3.8 g PEG-Fmoc-Lys(Boc)溶于7.2 mL三氟乙酸和7.2mL二氯甲烷，30 ℃下磁力搅拌2 h，乙醚沉淀纯化反应液，减压干燥得油状的PEG-Lys(Fmoc)。
（3）将步骤2）中所得产物3.25 g PEG-Lys(Fmoc)与0.92 g Boc-Lys(Boc)-OH、0.541 g DCC和0.03 g DMAP共溶17 mL二氯甲烷中，加入150 μL三乙胺，30 ℃下搅拌4天。反应液用乙醇、乙醚沉淀纯化，37 ℃水浴活化产物，减压干燥得白色粘稠状的PEG-Lys(Fmoc)-Lys(Boc)。
（4）将步骤3）中所得产物2.4 g PEG-Lys(Fmoc)-Lys(Boc)溶于7 mL三氟乙酸和7mL二氯甲烷，35 ℃下磁力搅拌4 h，反应液用乙醚沉淀纯化，37 ℃水浴活化产物，旋蒸除去有机溶剂，室温下真空干燥制得油状PEG-Lys(Fmoc)-Lys。
（5）将步骤4）中所得产物1 .5 g PEG-Lys(Fmoc)-Lys与0.946 g1-甲基色氨酸-二碳酸二叔丁酯、0.997 g DCC、0.059 g DMAP共溶于7.5 mL二氯甲烷中，加入150 μL三乙胺，30 ℃磁力搅拌5天，反应液用乙醇和乙醚沉淀纯化，37 ℃水浴活化，减压干燥得白色粘稠状的PEG-Fmoc-1-MT-Boc。
（6）将步骤5）中所得产物1 g PEG-1-MT-Boc溶于2.5 mL的二氯甲烷和2.5 mL的三氟乙酸，室温下磁力搅拌2 h，反应液用无水乙醚沉淀纯化2遍，37 ℃水浴活化产物，旋蒸除去有机溶剂，室温下真空干燥制得油状PEG-Fmoc-1-MT。
实施例2：免疫前药聚乙二醇-1-甲基色氨酸（PEG-Fmoc-1-MT）的合成
1、1-D-甲基色氨酸-二碳酸二叔丁酯的合成
取0.4 g 1-D-甲基色氨酸、0.8 g二碳酸二叔丁酯和0.38 g 碳酸钠共溶于20 mL四氢呋喃.水（THF:H2O=1:1, v:v），0 ℃下磁力搅拌15 min，转至25 ℃磁力搅拌1天，反应结束后旋蒸除去四氢呋喃。1 mol/L的盐酸调节pH至2，乙酸乙酯和水等体积冲洗产物，无水硫酸钠过滤，收集滤液并旋蒸，以二氯甲烷和甲醇（100：1，v/v）为流动相，二氯甲烷和甲醇（10：1，v/v）为展开剂，采用硅胶柱层析法梯度洗脱纯化产物，收集并旋蒸纯化后的产物，室温下真空干燥制得白色粉末状产物。
2、PEG-Fmoc-1-MT的合成
（1）3 g 聚乙二醇单甲醚（分子量2000 Da）与3.52 g Fmoc-Lys(Boc)-OH、1.55 g DCC和0.09 g DMAP共溶于15 mL二氯甲烷中，25 ℃下磁力搅拌3天，反应液用无水乙醇、乙醚沉淀纯化，37 ℃水浴活化，减压干燥制得白色粘稠状的PEG-Fmoc-Lys(Boc)。
（2）将步骤1）中所得产物2.2 g PEG-Fmoc-Lys(Boc)溶于5.5 mL三氟乙酸和5.5mL二氯甲烷，30 ℃下磁力搅拌2 h，乙醚沉淀纯化反应液，减压干燥得油状的PEG-Lys(Fmoc)。
（3）将步骤2）中所得产物1.53 g PEG-Lys(Fmoc)与0.43 g Boc-Lys(Boc)-OH、0.26 g DCC和0.16 g DMAP共溶7.7 mL二氯甲烷中，加入150 μL三乙胺，30 ℃下搅拌4天。反应液用乙醇、乙醚沉淀纯化，37 ℃水浴活化产物，减压干燥得白色粘稠状的PEG-Lys(Fmoc)-Lys(Boc)。
（4）将步骤3）中所得产物1.2 g PEG-Lys(Fmoc)-Lys(Boc)溶于3 mL三氟乙酸和3mL二氯甲烷，35 ℃下磁力搅拌2 h，反应液用乙醚沉淀纯化，37 ℃水浴活化产物，旋蒸除去有机溶剂，室温下真空干燥制得油状PEG-Lys(Fmoc)-Lys。
（5）将步骤4）中所得产物1 g PEG-Lys(Fmoc)-Lys与0.63 g1-甲基色氨酸-二碳酸二叔丁酯、0.66 g DCC、0.04 g DMAP共溶于5 mL二氯甲烷中，加入150 μL三乙胺，30 ℃磁力搅拌4天，反应液用乙醇和乙醚沉淀纯化，37 ℃水浴活化，减压干燥得白色黏稠状的0.76g PEG-Fmoc-1-MT-Boc。
（6）将步骤5）中所得产物0.76 g PEG-1-MT-Boc溶于1.9 mL的二氯甲烷和1.9 mL的三氟乙酸，室温下磁力搅拌2 h，反应液用无水乙醚沉淀纯化2遍，37 ℃水浴活化产物，旋蒸除去有机溶剂，室温下真空干燥制得油状PEG-Fmoc-1-MT。
氢谱核磁鉴定见图2所示，1-D-甲基色氨酸-二碳酸二叔丁酯氢谱核磁鉴定见图2（A）所示。1-MT的氢谱信号峰出现在6.8-7.2 ppm，二碳酸二叔丁酯的核磁质谱信号峰出现在1.45 ppm，证明了1-MT-Boc的成功合成。PEG-Fmoc-1-MT的氢谱核磁图见图2（B），PEG的质子信号峰出现在3.4-3.5 ppm，1-MT的质子信号峰在6.8-7.2 ppm，Fmoc的信号峰出现在7.4-7.8 ppm，证明了前药聚合物PEG-Fmoc-1-MT胶束成功合成。
实施例3：薄膜分散法制备共载阿霉素的1-甲基色氨酸前药聚合物胶束
精密称取5 mg的 DOX 溶于0.5 mL的二氯甲烷、0.5 mL甲醇和7μL三乙胺中，制得DOX溶液（5 mg/mL)；称取实施例1或2中制得的PEG-Fmoc-1-MT 100 mg/mL溶于1 mL二氯甲烷中（100 mg/mL）；PEG-Fmoc-1-MT与DOX 以摩尔比1：1、2.5：1和5：1的投药量取所需体积，混匀吹膜，真空干燥形成薄膜，用浓度为0.01 mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液涡旋复溶，即得粒径为20~200 nm的共载 DOX 的PEG-Fmoc-1-MT 前药聚合物胶束。PEG-Fmoc-1-MT前药聚合物胶束（A）和DOX/PEG-Fmoc-1-MT共载药聚合物胶束（B）的透射电镜图见图3所示。从透射电镜图可看出，它们成光滑圆整的球状，分散性良好。
表1是1-甲基色氨酸前药聚合物PEG-Fmoc-1-MT与DOX以摩尔比1：1、2.5：1和5：1，采用薄膜分散法制备的DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束的理化性质表征。
PEG-Fmoc-1-MT前药胶束的粒径为298.4 nm，随着DOX的包载量的提高，DOX物理包载于前药聚合物的内核形成胶束，胶束壳核结构紧密，粒径明显减小。PEG-Fmoc-1-MT中化学键合的1-MT的载药量为38%，DOX的包封率高达99.04%，载药量为3.3%~16.29%。稳定性良好。
因此，通过调控PEG-Fmoc-1-MT与DOX的投料摩尔比，可精准控制联用药物1-MT和DOX的共载联用比例，有利于两药在体内以最佳联用比例共递送至肿瘤细胞，通过化疗联合免疫通路达到最佳的抗肿瘤疗效。
表1. PEG-Fmoc-1-MT和DOX/PEG--Fmoc-1-MT的制剂学表征
体外释放的测定
通过透析法考察实例3中制备的共载药胶束DOX/PEG-Fmoc-1-MT的体外释放行为。DOX溶液（DOX 浓度：250μg/mL），1-MT 溶液及DOX/PEG-Fmoc-1-MT前药聚合物胶束，分别置于截留量为3500的透析袋内，浸入100 mL，pH 7.4、浓度为0.01 mmol的磷酸盐缓冲液中，于37℃，100 r/min 摇床上振揺。分别于0.5、1、2、4、6、8、12 、24、36、48、72 h取样5 mL，并同时补充等体积新鲜的释放介质。通过荧光分光光度计和高效液相法分别测定DOX和1-MT的含量，并计算累积释放率，结果见图4。DOX溶液在24 h的释放量达到50%以上，而共载药胶束DOX/PEG-Fmoc-1-MT在72 h的释放量仅有13%； 1-MT溶液在36 h的释放量达到50%以上，而共载药胶束中1-MT的释放量只有17%。
表明共载药胶束DOX/PEG-Fmoc-1-MT可实现DOX和1-MT 在72 h的生理环境中均稳定，这有助于实现两药在体内的长循环，高效蓄积至肿瘤组织及细胞，发挥化疗免疫协同抗肿瘤功效。
体外IDO抑制及T细胞增殖实验
4T1 细胞 （5×103/孔）种于96孔板中，孵育24 h，并同时给予干扰素IFN-γ(50 ng/mL)进行刺激。给予不同浓度的1-MT溶液和PEG-Fmoc-1-MT胶束，孵育48 h后，移取150 μL的上清液，转移至新的96孔板中，然后加入75 μL的30 %三氯乙酸，于50 ℃下孵育30 min。取孵育后的上清液100 μL加入等体积的埃利希试剂于室温下反应10 min，用酶标仪于490 nm下测定，结果见图5（A）。随着1-MT溶液及PEG-Fmoc-1-MT胶束浓度的增大，对犬尿氨酸的抑制率明显增强。这表明1-MT 溶液和PEG-Fmoc-1-MT免疫前药聚合物胶束可有效抑制毒性犬尿氨酸的生成，从而有效抑制肿瘤微环境中IDO的高表达。对于T细胞增殖实验，取BALB/c小鼠的脾脏，网筛过滤，红细胞裂解液裂解破红后提取脾细胞。IFN-γ（50 ng/mL）刺激的乳腺癌4T1细胞（1×105）与CFSE标记的脾细胞（10×105）共培养后种于96孔板，给予不同浓度的1-MT及PEG-Fmoc-1-MT，并同时加入100 ng/mL CD3抗体及10 ng/mL IL-2刺激孵育72 h。收集细胞后离心 （1000 rpm，5 min）。弃上清后各加1μL CD4-PE和CD8-FITC荧光标记的抗体，避光孵育30 min，PBS缓冲液洗两遍。采用流式细胞仪检测CD4+及CD8+增殖率，结果见图5（B）和（C）。
随着1-MT溶液及PEG-Fmoc-1-MT胶束浓度的增大，CD4和CD8的阳性表达率明显增加，这表明1-MT和PEG-Fmoc-1-MT胶束可以通过增加CD4，CD8阳性表达率，正性调节免疫淋巴细胞，提高肿瘤微环境的免疫功效。
体外细胞制剂毒研究
将人源性肺癌细胞A549，肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞4T1分别以密度3000、3000和2000种于96孔板。于37 ℃，5%CO2中孵育过夜后，弃去旧的培养液，然后给予不同浓度的DOX制剂，免疫前药载体PEG-Fmoc-1-MT的给药浓度与共载药组保持一致。孵育72h, 每孔加入浓度为2 mg/mL的MTT溶液50 μL，孵育4 h后。移液枪吸去旧的培养液，每孔加入100 μLDMSO。采用酶标仪于490 nm下测定OD值，计算细胞活力。结果如图6（A），不同治疗组对肿瘤细胞抑制率随DOX浓度增大而增大，其中，DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束组抑制肿瘤细胞作用最强，这是因为通过免疫前药载体PEG-Fmoc-1-MT共递送1-MT和DOX至肿瘤细胞，在细胞水平上发挥了联合抗肿瘤作用。PEG-Fmoc-1-MT胶束组的抑制肿瘤细胞的能力较弱，这可能是由于1-MT是化学键合到前药载体的，所以比较难从前药载体上断裂下来。图6（B)和图6（C)的结果与图6（A)结果相似。
体内药效学研究
雌性BALB/c（6-8周），皮下注射4T1细胞（2×106 个/鼠）。待肿瘤体积至50 mm3，随机分为五组，即生理盐水组，DOX溶液组，DOXIL脂质体组，PEG-Fmoc-1-MT和DOX/PEG-Fmoc-1-MT组。于0、3、6天给药，并记录小鼠肿瘤体积和体重。于21天处死小鼠，取出肿瘤进行拍照，并将肿瘤组织固定于4%多聚甲醛过夜，切片进行HE染色和TUNEL染色，研究体内抗肿瘤作用。结果如图7(A)所示，与其他治疗组相比，DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束治疗组的肿瘤相对体积最小，前药胶束PEG-Fmoc-1-MT胶束治疗组次之，这表明通过前药载体PEG-Fmoc-1-MT，可实现IDO抑制剂1-MT与化疗药物DOX的体内同步共递送，经胞内吞后，共释放于肿瘤细胞，发挥免疫化疗联合抗肿瘤作用。图7（B）为不同治疗组的肿瘤大小拍照，结果同图7（A）。共载药胶束DOX/PEG-Fmoc-1-MT组的肿瘤体积最小，PEG-Fmoc-1-MT胶束组次之。这进一步证实了DOX通过前药载体PEG-Fmoc-1-MT共递送，实现了化疗联合免疫协同抗肿瘤，达到了最佳的抗肿瘤疗效。图7（C）结果进一步证实与其它治疗组相比，DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束组可以明显延长小鼠测存活时间，这也表明了通过免疫前药载体PEG-Fmoc-1-MT共递送DOX可有效抑制小鼠肿瘤，延长小鼠的存活天数。
总之，共递送DOX通过免疫前药载体PEG-Fmoc-1-MT，经EPR介导的长循环后，胞内释放高效共递送至肿瘤细胞，通过化疗免疫双通道发挥协同抗肿瘤作用。
肿瘤浸润性淋巴细胞及免疫因子检测
4T1 细胞（2×106）皮下接种于BALB/c 小鼠右后肢腋下，待肿瘤体积至100 nm 左右，分组（n = 3），尾静脉注射DOX溶液，DOXIL（DOX脂质体），PEG-Fmoc-1-MT和DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束，生理盐水组作为对照。于三次给药后（0、3、6天），隔天采集小鼠血液，离心后收集血清，采用ELISA试剂盒检测IFN-γ， IL-2和TNF-α免疫因子的表达。取血后处死小鼠，于无菌环境中提取脾脏及肿瘤组织。分别置于80目网筛研磨过滤，脾脏悬液中加入红细胞裂解液裂解，离心后收集脾脏细胞。对于肿瘤组织，研磨过筛后加入Liberase和DNase酶裂解消化后离心收集肿瘤细胞。将提取后的脾脏及肿瘤细胞分别加入CD4，CD8和Treg荧光抗体染料，于4 ℃避光孵育30 min，PBS重悬于流式管中，采用流式细胞仪分析。结果见图8A-C，与其它治疗组相比，PEG-Fmoc-1-MT和DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束组在脾脏和肿瘤细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量最多，抑制Treg的能力最强。同时，PEG-Fmoc-1-MT和DOX/PEG-Fmoc-1-MT胶束治疗组中分泌IFN-γ，IL-2和TNF-α免疫细胞因子的能力最强（D-F）。这表明通过免疫调节性前药载体PEG-Fmoc-1-MT共递送1-MT和DOX，1-MT有效抑制肿瘤微环境中IDO的高表达，促进IFN-γCD8+T细胞的表达，激活肿瘤微环境中的效应性T淋巴细胞的功能。同时，阿霉素在直接杀死肿瘤细胞的过程中，可直接作用于肿瘤表面的CRT受体，诱导免疫原性细胞的死亡，从而更进一步增强了1-MT的免疫作用。
总之，1-MT联合DOX通过免疫调节性前药载体PEG-Fmoc-1-MT可激活T淋巴细胞的毒性作用，增加了CD4+，CD8+T细胞效应免疫表达，抑制调节性T细胞treg表达, 从而实现最佳的化疗免疫联合抗肿瘤作用。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (13)

1.一种共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束，其特征在于：所述免疫前药胶束是以亲水性聚乙二醇桥通过桥连连接臂赖氨酸衍生物，并化学键合吲哚胺2，3 双加氧酶（IDO）抑制剂1-甲基色氨酸（1-MT）形成免疫前药聚合物聚乙二醇-1-甲基色氨酸，化疗药物物理包埋在该免疫前药聚合物中。
2.如权利要求1所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束，其特征在于：所述的胶束中化学键合的1-甲基色氨酸含量为6%~40%，物理包埋的化疗药物含量为3%~20%。
3.如权利要求1所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束，其特征在于：所述化疗药物包括阿霉素、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、克唑替尼中的任意一种。
4.如权利要求1所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束，其特征在于：所述免疫前药聚合物聚乙二醇-1-甲基色氨酸中化学键合的IDO抑制剂1-甲基色氨酸为1-D-甲基色氨酸或1-L-甲基色氨酸。
5.如权利要求1所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束，其特征在于：聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物的结构特征为聚乙二醇-连接臂-1-甲基色氨酸。
6.如权利要求1所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束，其特征在于：所述聚乙二醇的分子量为2000~10000道尔顿。
7.如权利要求1所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束，其特征在于：所述桥连连接臂赖氨酸衍生物为Fmoc-Lys(Boc)-OH和Boc-Lys(Boc)-OH，此衍生物可同时化学键合1分子的Fmoc基团和2 分子的1-MT。
8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束的制备方法，其特征在于：将聚乙二醇通过桥连连接臂Fmoc-Lys(Boc)-OH和Boc-Lys(Boc)-OH化学键合1-甲基色氨酸，制备聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物；然后进一步通过薄膜分散法将化疗药物物理包载于上述免疫前药聚合物载体中，制备共载化疗药物的1-甲基色氨酸前药胶束。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物的制备方法如下：
（1）1-甲基色氨酸，二碳酸二叔丁酯和无水碳酸钠以摩尔比摩尔比为1: 1~2: 2~3共溶于有机溶剂A，0 ℃下反应5~30 min，转至室温磁力搅拌1~2天，旋蒸除去有机溶剂，硅胶柱纯化产物，真空干燥制得白色粉末状产物；
（2）聚乙二醇单甲醚、Fmoc-Lys(Boc)-OH在N, N’-二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）以摩尔比为1：1.5~10: 2~15: 0.2~5共催化，于25~35 ℃下磁力搅拌反应3~7天，过滤，有机溶剂A沉淀纯化，真空干燥制得白色粘稠状产物；
（3）将步骤2）中所得产物与三氟乙酸以质量体积比1 : 1~5加入有机溶剂A，于25~35℃下磁力搅拌2~4 h，反应液用有机溶剂A沉淀纯化，真空干燥制得淡黄色油状产物；
（4）将步骤 3）中所得产物与Boc-Lys(Boc)-OH在N, N’-二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）催化下共溶于有机溶剂A中，加入三乙胺，25~35 ℃下磁力搅拌3~5天。有机溶剂A沉淀纯化反应液，真空干燥制得白色粘稠状产物；
（5）将步骤 4）中所得产物于与三氟乙酸以质量体积比1 : 1~5加入有机溶剂A，25~35℃下磁力搅拌2~5 h，反应液用有机溶剂A沉淀纯化，真空干燥制得淡黄色油状产物；
（6）将步骤 1）中所得产物和步骤 5）中所得产物与N, N’-二环己基碳二亚胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）以摩尔比为1：1~10: 2~10: 0.2~3共溶于有机溶剂A，于25~35 ℃搅拌4~7天，有机溶剂沉淀纯化反应液，真空干燥制得白色粘稠状产物；
（7）将步骤 6）中所得产物与三氟乙酸以质量体积比1 : 1~5加入有机溶剂A，25~35 ℃下磁力搅拌2~5 h，反应液用有机溶剂A沉淀纯化，真空干燥制得油状免疫前药聚合物聚乙二醇-1-甲基色氨酸。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的薄膜分散法包括以下步骤：将聚乙二醇-1-甲基色氨酸前药聚合物与化疗药物以摩尔比为1：0.5~10共溶于有机溶剂B，通过氮气去除有机溶剂，形成聚合物薄膜，室温下真空干燥，之后用0.01~0.1mmol/L,pH7.4的磷酸盐缓冲液或0.01~0.05mmol/L的Hepes溶液复溶，即可制得粒径在20~200 nm的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束。
11.如权利要求8或9中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂A为无水乙醇、无水乙醚、石油醚、二氯甲烷、四氢呋喃、三乙胺、氯仿、甲醇和乙酸乙酯中的任意一种；所述有机溶剂B为甲醇、无水乙醇、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷和三乙胺中的任意一种或两种。
12.如权利要求1至6中任一权利要求所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束在免疫化疗联合抗肿瘤中的应用。
13.如权利要求1至6中任一权利要求所述的共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束在免疫化疗联合抗乳腺癌、肝癌和肺癌中的应用。
CN201910895188.3A 2019-09-20 2019-09-20 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用 Pending CN110585131A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910895188.3A CN110585131A (zh) 2019-09-20 2019-09-20 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910895188.3A CN110585131A (zh) 2019-09-20 2019-09-20 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110585131A true CN110585131A (zh) 2019-12-20

Family

ID=68861943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910895188.3A Pending CN110585131A (zh) 2019-09-20 2019-09-20 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110585131A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111632153A (zh) * 2020-06-23 2020-09-08 宁夏医科大学 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法
CN111956609A (zh) * 2020-08-31 2020-11-20 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束及制备方法与应用
CN114306620A (zh) * 2021-12-07 2022-04-12 深圳先进技术研究院 基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物及其制备方法和应用
CN114522219A (zh) * 2022-02-23 2022-05-24 宜春学院 一种共递送聚合物前药及其制备方法和用途
CN115252808A (zh) * 2022-06-15 2022-11-01 天津科技大学 鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药及合成方法
CN115433357A (zh) * 2022-08-17 2022-12-06 苏州大学 一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂及其制备方法与应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011100295A2 (en) * 2010-02-09 2011-08-18 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Alpha-methyl-tryptophan as an inhibitor of indoleamine dioxygenase
CN105287377A (zh) * 2015-10-16 2016-02-03 姚俊华 一种紫杉醇聚合物胶束载药系统及其制备方法和应用
CN105310981A (zh) * 2015-10-16 2016-02-10 姚俊华 一种多西他赛胶束载药系统及其制备方法和应用
WO2015153857A8 (en) * 2014-04-03 2016-10-13 Georgia Regents Research Institute, Inc. Methods for enhancing the efficacy of a tumor-directed immune response
CN108670954A (zh) * 2018-06-12 2018-10-19 宁夏医科大学 一种共载化疗药物的甘草次酸前药胶束及其制备方法
WO2018213631A1 (en) * 2017-05-18 2018-11-22 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
CN109044972A (zh) * 2018-10-25 2018-12-21 宁夏医科大学 共载紫杉醇的辣椒素前药聚合物胶束及其制备方法
US20200197534A1 (en) * 2017-05-18 2020-06-25 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011100295A2 (en) * 2010-02-09 2011-08-18 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Alpha-methyl-tryptophan as an inhibitor of indoleamine dioxygenase
WO2015153857A8 (en) * 2014-04-03 2016-10-13 Georgia Regents Research Institute, Inc. Methods for enhancing the efficacy of a tumor-directed immune response
CN105287377A (zh) * 2015-10-16 2016-02-03 姚俊华 一种紫杉醇聚合物胶束载药系统及其制备方法和应用
CN105310981A (zh) * 2015-10-16 2016-02-10 姚俊华 一种多西他赛胶束载药系统及其制备方法和应用
WO2018213631A1 (en) * 2017-05-18 2018-11-22 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
US20200197534A1 (en) * 2017-05-18 2020-06-25 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
CN108670954A (zh) * 2018-06-12 2018-10-19 宁夏医科大学 一种共载化疗药物的甘草次酸前药胶束及其制备方法
CN109044972A (zh) * 2018-10-25 2018-12-21 宁夏医科大学 共载紫杉醇的辣椒素前药聚合物胶束及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAMUEL G. AWUAH ET AL.,: "A Pt(IV) Pro-drug Preferentially Targets Indoleamine-2,3-dioxygenase, Providing Enhanced Ovarian Cancer ImmunoChemotherapy", 《J AM CHEM SOC》 *
WAN ZHUOYA ET AL.,: "Dual Functional Immunostimulatory Polymeric Prodrug Carrier with Pendent Indoximod for Enhanced Cancer Immunochemotherapy", 《ACTA BIOMATER》 *
YANG LAN ET AL.,: "Codelivered Chemotherapeutic Doxorubicin via a Dual-Functional Immunostimulatory Polymeric Prodrug for Breast Cancer Immunochemotherapy", 《ACS APPL MATER INTERFACES》 *
ZHAI QIANYU ET AL.,: "Lymphoma Immunochemotherapy: Targeted Delivery of Doxorubicin via a Dual Functional Nanocarrier", 《MOL PHARM》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111632153A (zh) * 2020-06-23 2020-09-08 宁夏医科大学 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法
CN111632153B (zh) * 2020-06-23 2023-02-24 宁夏医科大学 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法
CN111956609A (zh) * 2020-08-31 2020-11-20 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束及制备方法与应用
CN114306620A (zh) * 2021-12-07 2022-04-12 深圳先进技术研究院 基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物及其制备方法和应用
WO2023104021A1 (zh) * 2021-12-07 2023-06-15 深圳先进技术研究院 基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物及其制备方法和应用
CN114522219A (zh) * 2022-02-23 2022-05-24 宜春学院 一种共递送聚合物前药及其制备方法和用途
CN114522219B (zh) * 2022-02-23 2024-03-26 宜春学院 一种共递送聚合物前药及其制备方法和用途
CN115252808A (zh) * 2022-06-15 2022-11-01 天津科技大学 鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药及合成方法
CN115433357A (zh) * 2022-08-17 2022-12-06 苏州大学 一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂及其制备方法与应用
CN115433357B (zh) * 2022-08-17 2023-10-10 苏州大学 一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110585131A (zh) 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用
US9844508B2 (en) Tumor vaccine and method for producing the same
CN112048002B (zh) 一种靶向t细胞的酶敏感纳米体系及其制备方法和应用
CN111437258B (zh) 基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米佐剂及其制备方法与应用
CN107184987B (zh) 一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用
CN112826808B (zh) 一种环二核苷酸或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂及其应用
CN110804086A (zh) 一种多肽纳米载体及其制备方法和应用
NZ555571A (en) Alpha thymosin peptides as cancer vaccine adjuvants
CN107266384B (zh) 基于2-氨基十六烷酸的n-羧基内酸酐单体和聚氨基酸及其制备方法
Sunil et al. Convection enhanced delivery of light responsive antigen capturing oxygen generators for chemo-phototherapy triggered adaptive immunity
CN117384859B (zh) 一种树突状细胞来源的外泌体的制备方法及应用
Bagasariya et al. Biomimetic nanotherapeutics: Employing nanoghosts to fight melanoma
CN108524529B (zh) 基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药及其制备方法与应用
CN107007550B (zh) 一种氧化还原响应性两亲性共聚物及其制备方法和应用
CN103816535B (zh) 一种肿瘤疫苗及其制备方法
He et al. Clickable amino acid derivative tuned self-assembly of antigen and adjuvant for cancer immunotherapy
CN113694217B (zh) 一种包含il-15阳离子脂质体复合物和塞来昔布脂质体的药物组合物及其制备方法和用途
CN110840844A (zh) 生物素与葡萄糖共同修饰的乳腺癌靶向脂质体的制备和应用
CN105477645B (zh) 基因和药物共递送的纳米载体及其制备方法
CN101428003A (zh) Rgdf-脂肪醇偶联物介导阿霉素靶向脂质体制备及作为抗肿瘤剂的应用
EP2735314B1 (en) Sugar-coated liposome composition
CN110214145B (zh) CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用
CN113398276A (zh) 脑胶质瘤靶向小檗碱与叶酸修饰的脂质材料的制备与应用
CN112979881B (zh) 促抗癌药摄入的大分子、组合物及其制备抗癌药物的用途
CN113230414B (zh) 一种用于精准靶向肺肿瘤细胞的生物纳米递药系统及其制备方法、应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191220

RJ01 Rejection of invention patent application after publication