CN111956609A - 一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束及制备方法与应用 - Google Patents

一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束及制备方法与应用，纳米胶束以疏水抗肿瘤药物为内核，内核通过基质金属蛋白酶敏感连接肽分别与组成外壳层的免疫检查点阻断多肽和聚乙二醇连接。本发明的纳米胶束具有肿瘤微环境酶响应，可在肿瘤微环境中基质金属蛋白酶作用下，响应性释放免疫检查点阻断多肽，避免免疫检查点阻断药物的肿瘤脱靶释放引起的全身性免疫相关不良反应；通过抗肿瘤药物的化疗杀伤作用和免疫检查点阻断作用，在延长纳米胶束血液循环时间的同时增强抗肿瘤药物在肿瘤病灶的蓄积，改善药物生物利用度；避免免疫检查点阻断药物的肿瘤脱靶释放引起的全身性免疫相关不良反应；实现化疗杀伤与免疫检查点阻断的协同抗肿瘤作用。

Description

一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束及制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤目前仍然是造成人类死亡的主要原因之一，传统肿瘤治疗手段包括手术切除、化疗、放疗等，肿瘤免疫疗法的出现为肿瘤的治疗带了一场革新。在众多激活治疗性抗肿瘤免疫的策略中，针对T细胞激活抑制通路中免疫检查点进行阻断是目前肿瘤免疫治疗的研究热点之一，有效性已逐步被临床试验证实。其中，针对程序性死亡蛋白-1(programmed cell-death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell-death 1ligand1,PD-L1)介导的免疫检查点信号通路的阻断在临床上取得了重大突破。然而，临床治疗结果表明，由于肿瘤免疫原性低和免疫抑制性肿瘤微环境等因素的影响，针对PD-1/PD-L1的免疫检查点治疗仅在少数患者中产生有效应答。
目前，在肿瘤免疫治疗领域，联合治疗策略已成为共识。研究表明，某些抗肿瘤药物如阿霉素、紫杉醇以及多烯紫杉醇的化疗杀伤作用能够引起肿瘤细胞免疫原性死亡，形成“原位肿瘤疫苗”，启动机体的抗肿瘤免疫应答，可改善免疫检查点阻断的治疗效果。
免疫治疗用药物存在“on-targetbut off-tumor”效应，常对正常组织表达的相关受体也有识别作用，不仅无法保证肿瘤局部有效的药物剂量，还易引发不可避免的免疫相关不良反应，严重限制其临床应用。将用于肿瘤免疫联合治疗的各类药物成功递送至肿瘤局部对于其成功治疗至关重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束。
本发明的第二个目的是提供一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束，纳米胶束以疏水抗肿瘤药物为内核，以免疫检查点阻断多肽和聚乙二醇为外壳层；所述内核通过基质金属蛋白酶敏感连接肽分别与组成外壳层的所述免疫检查点阻断多肽和聚乙二醇连接。
疏水抗肿瘤药物为阿霉素、多烯紫杉醇或紫杉醇中的一种；
聚乙二醇的数均分子量为2000-6000。
免疫检查点阻断多肽为名称是DPPA-1氨基酸序列为NYSKPTDRQYHF的多肽。
基质金属蛋白酶敏感连接肽氨基酸序列为PVGLIG、PLGLAG或GPLGVR。
一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)将甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯与基质金属蛋白酶敏感连接肽，溶于第一有机溶剂中，在室温下反应，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物1的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；将中间产物1与疏水性抗肿瘤药物、碳化二亚胺类交联剂混合溶于第一有机溶剂中，在室温下反应，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物2的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-疏水性抗肿瘤药物前药；
(2)将基质金属蛋白酶敏感连接肽与胺-巯基类交联剂溶于第一有机溶剂中混合，在室温下反应；
(3)将用第一有机溶剂溶解的巯基化的疏水性抗肿瘤药物溶液加入到步骤(2)获得的反应后的溶液中，室温反应，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物3的疏水性抗肿瘤药物-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；将中间产物3与碳化二亚胺类交联剂混合溶于第一有机溶剂，室温反应后，加入免疫检查点阻断多肽，室温下反应，透析、纯化后，冷冻干燥得到简称为中间产物4的免疫检查点阻断多肽-基质金属蛋白酶敏感连接肽-疏水性抗肿瘤药物前药；
(4)按质量比3:(1～3)的比例，将中间产物2和中间产物4混合得到中间产物混合物，将中间产物混合物溶解到第二有机溶剂中；
(5)将步骤(4)制成的溶液通过旋转蒸发除去有机溶剂制备成薄膜，然后加入水或加入pH＝7.4磷酸盐缓冲液，水化，离心，收集固体，冷冻干燥，得到免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束，所述薄膜与所述水或pH＝7.4磷酸盐缓冲液的比值为1mg：1～10mL。
所述步骤(1)优选：按比例，将1摩尔甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯与1～5摩尔基质金属蛋白酶敏感连接肽，溶于第一有机溶剂中，在室温下反应6～24小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物1的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；按比例，将1摩尔中间产物1与1～5摩尔疏水性抗肿瘤药物、1～5摩尔碳化二亚胺类交联剂混合，溶于第一有机溶剂中，在室温下反应6～24小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物2的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-疏水性抗肿瘤药物前药；
所述步骤(2)优选：按比例，将1摩尔基质金属蛋白酶敏感连接肽与1～5摩尔胺-巯基类交联剂溶于第一有机溶剂中混合，在室温下反应4～12小时；
所述步骤(3)优选：
将用第一有机溶剂溶解的巯基化的疏水性抗肿瘤药物溶液加入到步骤(2)获得的反应后的溶液中，室温反应4～12小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物3的疏水性抗肿瘤药物-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物(巯基化的疏水性抗肿瘤药物与步骤(2)中基质金属蛋白酶敏感连接肽的摩尔比为1～3：1)；将中间产物3与碳化二亚胺类交联剂混合，溶于第一有机溶剂，室温下反应6～24小时，加入免疫检查点阻断多肽(中间产物3、碳化二亚胺类交联剂和免疫检查点阻断多肽的摩尔比为1:1～5:1～5)，室温下反应6～24小时，透析、纯化后，冷冻干燥得到简称为中间产物4的免疫检查点阻断多肽-基质金属蛋白酶敏感连接肽-疏水性抗肿瘤药物前药；
所述步骤(5)优选：
将步骤(4)制成的溶液通过旋转蒸发除去有机溶剂制备成薄膜，然后加入水或加入pH＝7.4磷酸盐缓冲液，水化，10000～30000rpm转速离心10～30分钟，收集固体，冷冻干燥，得到免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束，所述薄膜与所述水或pH＝7.4磷酸盐缓冲液的比值为1mg：1～10mL。
甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯中聚乙二醇的数均分子量为2000～6000；所述疏水性抗肿瘤药物为阿霉素、多烯紫杉醇或紫杉醇中的一种。
基质金属蛋白酶敏感连接肽氨基酸序列为PVGLIG、PLGLAG或GPLGVR。
第一有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；所述第二有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和乙腈中至少一种，
所述碳化二亚胺类交联剂为N，N-二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺的一种；
所述胺-巯基类交联剂为SMCC、Sulfo-SMCC或SPDP。
所述免疫检查点阻断多肽为名称是DPPA-1氨基酸序列为NYSKPTDRQYHF的多肽。
上述一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的优点：
本发明的一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束具有肿瘤微环境酶响应，可在肿瘤微环境中基质金属蛋白酶作用下，响应性释放免疫检查点阻断多肽，避免免疫检查点阻断药物的肿瘤脱靶释放引起的全身性免疫相关不良反应；可通过抗肿瘤药物的化疗杀伤作用和免疫检查点阻断作用，可在延长纳米胶束血液循环时间的同时增强抗肿瘤药物在肿瘤病灶的蓄积，改善药物生物利用度；可避免免疫检查点阻断药物的肿瘤脱靶释放引起的全身性免疫相关不良反应；可实现化疗杀伤与免疫检查点阻断的协同抗肿瘤作用，有效抑制肿瘤生长，增强免疫检查点阻断治疗效果，本发明的免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的抗肿瘤策略对提高目前肿瘤常规治疗疗效和发展新的肿瘤治疗方案具有积极意义。
附图说明
图1为聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-阿霉素前药的核磁共振氢谱图。
图2为免疫检查点阻断多肽-基质金属蛋白酶敏感连接肽-阿霉素前药的核磁共振氢谱图。
图3(A)免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的透射电镜图和(B)基质金属蛋白酶作用下，免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束解组装后的透射电镜图。
图4为免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束介导的化疗联合免疫检查点阻断治疗对B16-F10黑色素肿瘤细胞荷瘤小鼠的抑制肿瘤生长作用：(A)小鼠平均肿瘤生长曲线；(B)瘤重；(C)小鼠平均体重变化曲线。
图5为免疫细胞在肿瘤组织的浸润评价：(A)CD8+T淋巴细胞的定量分析；(B)Tregs淋巴细胞的定量分析。
图6.免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束自组装示意图。
具体实施方式
SMCC：(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
Sulfo-SMCC：4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯。
SPDP：3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1摩尔甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯与2摩尔基质金属蛋白酶敏感连接肽，溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在室温下反应8小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物1的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；将1摩尔中间产物1与2摩尔阿霉素、2摩尔N，N-二环己基碳二亚胺混合，溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在室温下反应8小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物2的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-阿霉素前药；
(2)将1摩尔基质金属蛋白酶敏感连接肽与2摩尔Sulfo-SMCC溶于N,N-二甲基甲酰胺中混合，在室温下反应8小时；
(3)将用N,N-二甲基甲酰胺溶解的巯基化的阿霉素溶液加入到步骤(2)获得的反应后的溶液中，室温反应8小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物3的阿霉素-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；(巯基化的阿霉素与步骤(2)中的基质金属蛋白酶敏感连接肽的摩尔比为2:1)，将中间产物3与N,N-二环己基碳二亚胺混合，溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温反应10小时，加入免疫检查点阻断多肽DPPA-1，(中间产物3、N,N-二环己基碳二亚胺和免疫检查点阻断多肽DPPA-1的摩尔比为1:2:2)，室温反应10小时，透析、纯化后，冷冻干燥，得到简称为中间产物4的免疫检查点阻断多肽DPPA-1-基质金属蛋白酶敏感连接肽-阿霉素前药；
免疫检查点阻断多肽为名称是DPPA-1氨基酸序列为NYSKPTDRQYHF的多肽。
(4)按质量比3:2的比例，将中间产物2和中间产物4混合得到中间产物混合物，将中间产物混合物溶解到二氯甲烷中；
(5)将步骤(4)制成的溶液通过旋转蒸发除去有机溶剂制备成薄膜，然后加入pH＝7.4磷酸盐缓冲液，水化，20000rpm转速离心20分钟，收集固体，冷冻干燥，得到免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束，所述薄膜与pH＝7.4磷酸盐缓冲液的比值为1mg：2.5mL。
本实施例，甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯中聚乙二醇数均分子量4000。
基质金属蛋白酶敏感连接肽氨基酸序列为PVGLIG。
免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束自组装见图6。
简称为中间产物2的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-阿霉素前药的核磁共振氢谱图见图1，在4.0ppm处的峰是阿霉素结构中的(-O-CH3)，酰胺键(-CO-NH-)中氢的峰值在8.0ppm处，而聚乙二醇结构中的重复单元结构(-CH2-CH2-O)在氢谱图的3.5ppm处。另外，基质金属蛋白酶敏感连接肽结构的甲基基团中氢在0.8ppm处存在峰值。通过核磁共振氢谱图的分析，证明聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-阿霉素前药已经成功合成。
简称为中间产物4的免疫检查点阻断多肽DPPA-1-基质金属蛋白酶敏感连接肽-阿霉素前药的核磁共振氢谱图见图2，7.0ppm处的特征峰代表了DPPA-1多肽的游离氨基上的氢，8.0ppm处的特征峰表示的酰胺键(-CO-NH-)。阿霉素结构上带有的(-O-CH3)也在4.0ppm处体现。另外，基质金属蛋白酶敏感连接肽结构的甲基基团中氢在0.8ppm处存在峰值。通过核磁氢谱图的分析，证明免疫检查点阻断多肽DPPA-1-基质金属蛋白酶敏感连接肽-阿霉素前药已经成功合成。
图3A为免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的透射电镜图，可见制备的纳米胶束粒径大小为在120-150nm，形态均一；图3B为在基质金属蛋白酶作用下，免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束解组装后的透射电镜图，出现约30nm的小纳米粒子，证明了免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束具有基质金属蛋白酶响应性能。
实施例2
一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1摩尔甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯与1摩尔基质金属蛋白酶敏感连接肽，溶于二甲基亚砜中，在室温下反应24小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物1的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；将1摩尔中间产物1与1摩尔多烯紫杉醇、1摩尔1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺混合，溶于二甲基亚砜中，在室温下反应24小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物2的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-多烯紫杉醇前药；
(2)将1摩尔基质金属蛋白酶敏感连接肽与1摩尔SMCC溶于二甲基亚砜中混合，在室温下反应4小时；
(3)将用二甲基亚砜溶解的巯基化的多烯紫杉醇溶液加入到步骤(2)获得的反应后的溶液中，室温反应4小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物3的多烯紫杉醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；(巯基化的多烯紫杉醇与步骤(2)中的基质金属蛋白酶敏感连接肽的摩尔比为1:1)，将中间产物3与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺混合，溶于二甲基亚砜中，室温反应6小时后，加入免疫检查点阻断多肽DPPA-1，(中间产物3、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和免疫检查点阻断多肽DPPA-1的摩尔比为1:1:1)，室温反应6小时，透析、纯化后，冷冻干燥，得到简称为中间产物4的免疫检查点阻断多肽DPPA-1-基质金属蛋白酶敏感连接肽-多烯紫杉醇前药；
免疫检查点阻断多肽为名称是DPPA-1氨基酸序列为NYSKPTDRQYHF的多肽。
(4)按质量比3:1的比例，将中间产物2和中间产物4混合得到中间产物混合物，将中间产物混合物溶解到三氯甲烷中；
(5)将步骤(4)制成的溶液通过旋转蒸发除去有机溶剂制备成薄膜，然后加入pH＝7.4磷酸盐缓冲液，水化，10000rpm转速离心30分钟，收集固体，冷冻干燥，得到免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束，所述薄膜与pH＝7.4磷酸盐缓冲液的比值为1mg：1mL。
本实施例，甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯中聚乙二醇数均分子量2000。
基质金属蛋白酶敏感连接肽氨基酸序列为PLGLAG。
实施例3
一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1摩尔甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯与5摩尔基质金属蛋白酶敏感连接肽，溶于四氢呋喃中，在室温下反应6小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物1的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；将1摩尔中间产物1与5摩尔紫杉醇、5摩尔二异丙基碳二亚胺混合，溶于四氢呋喃中，在室温下反应6小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物2的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-紫杉醇前药；
(2)将1摩尔基质金属蛋白酶敏感连接肽与5摩尔SPDP溶于四氢呋喃中混合，在室温下反应12小时；
(3)将用四氢呋喃溶解的巯基化的紫杉醇溶液加入到步骤(2)获得的反应后的溶液中，室温反应12小时，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物3的紫杉醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；(巯基化的紫杉醇与步骤(2)中的基质金属蛋白酶敏感连接肽的摩尔比为3:1)，将中间产物3与二异丙基碳二亚胺混合，溶于四氢呋喃中，室温反应24小时后，加入免疫检查点阻断多肽DPPA-1，(中间产物3、二异丙基碳二亚胺和免疫检查点阻断多肽DPPA-1的摩尔比为1:5:5)，室温反应24小时，透析、纯化后，冷冻干燥，得到简称为中间产物4的免疫检查点阻断多肽DPPA-1-基质金属蛋白酶敏感连接肽-紫杉醇前药；
免疫检查点阻断多肽为名称是DPPA-1氨基酸序列为NYSKPTDRQYHF的多肽。
(4)按质量比3:3的比例，将中间产物2和中间产物4混合得到中间产物混合物，将中间产物混合物溶解到乙腈中；
(5)将步骤(4)制成的溶液通过旋转蒸发除去有机溶剂制备成薄膜，然后加入水，水化，30000rpm转速离心10分钟，收集固体，冷冻干燥，得到免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束，所述薄膜与所述水的比值为1mg：10mL。
本实施例，甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯中聚乙二醇数均分子量6000。
基质金属蛋白酶敏感连接肽氨基酸序列为GPLGVR。
实施例4
实施例1获得的免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束介导的抗肿瘤效果研究，将C57BL/6小鼠建立B16-F10黑色素细胞肿瘤模型，随机分组(每组5只)为：
(1)生理盐水组，
(2)游离阿霉素组，
(3)免疫检查点阻断多肽(DPPA-1)组，
(4)免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束组，给药剂量为阿霉素5mg/kg，免疫检查点阻断多肽DPPA-14.5mg/kg，每四天注射一次，共4次。如图4所示，各组小鼠的肿瘤生长体积(图4A)和平均瘤重(图4B)结果表明游离阿霉素和免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束具有明显的抑制肿瘤生长的疗效。另外，如图4C所示，与纳米胶束组相比，游离阿霉素组的小鼠表现出明显的体重减轻。上述结果表明，免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束显示出了有效的协同抗肿瘤作用，并且降低了药物的全身毒副作用。
实验证明，实施例2、3制备的一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的抗肿瘤效果及降低了药物的全身毒副作用与实施例1相似。
实施例5
C57BL/6小鼠建立的B16-F10黑色素肿瘤细胞肿瘤模型接种实施例1获得的免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束后，免疫细胞在肿瘤组织的浸润评价(图5)。免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束给药组，肿瘤组织浸润的细胞毒性CD8+T淋巴细胞浸润显著增加(27.6％±2.1％)。同时，肿瘤浸润的调节性T细胞(Regulatory cells,Tregs)水平显著降低，表明DPPA-1多肽阻断有效降低了Tregs的免疫抑制活性。
实验证明，接种实施例2、3制备的一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束后，免疫细胞在肿瘤组织的浸润评价结果与实施例1相似。
上述结果表明免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束介导的化疗和DPPA-1多肽阻断联合治疗可显着增强肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞并降低肿瘤内Tregs细胞，从而有效诱导协同抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤的发生和生长。

Claims (12)

1.一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束，其特征是所述纳米胶束以疏水抗肿瘤药物为内核，以免疫检查点阻断多肽和聚乙二醇为外壳层；所述内核通过基质金属蛋白酶敏感连接肽分别与组成外壳层的所述免疫检查点阻断多肽和聚乙二醇连接。
2.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征是所述疏水抗肿瘤药物为阿霉素、多烯紫杉醇或紫杉醇中的一种；所述聚乙二醇的数均分子量为2000-6000。
3.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征是所述免疫检查点阻断多肽为名称是DPPA-1氨基酸序列为NYSKPTDRQYHF的多肽。
4.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征是所述基质金属蛋白酶敏感连接肽氨基酸序列为PVGLIG、PLGLAG或GPLGVR。
5.一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯与基质金属蛋白酶敏感连接肽，溶于第一有机溶剂中，在室温下反应，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物1的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；将中间产物1与疏水性抗肿瘤药物、碳化二亚胺类交联剂混合溶于第一有机溶剂中，在室温下反应，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物2的聚乙二醇-基质金属蛋白酶敏感连接肽-疏水性抗肿瘤药物前药；
(2)将基质金属蛋白酶敏感连接肽与胺-巯基类交联剂溶于第一有机溶剂中混合，在室温下反应；
(3)将用第一有机溶剂溶解的巯基化的疏水性抗肿瘤药物溶液加入到步骤(2)获得的反应后的溶液中，室温反应，透析、纯化，冷冻干燥后得到简称为中间产物3的疏水性抗肿瘤药物-基质金属蛋白酶敏感连接肽的结合物；将中间产物3与碳化二亚胺类交联剂混合溶于第一有机溶剂，室温反应后，加入免疫检查点阻断多肽，室温下反应，透析、纯化后，冷冻干燥得到简称为中间产物4的免疫检查点阻断多肽-基质金属蛋白酶敏感连接肽-疏水性抗肿瘤药物前药；
(4)按质量比3:(1～3)的比例，将中间产物2和中间产物4混合得到中间产物混合物，将中间产物混合物溶解到第二有机溶剂中；
(5)将步骤(4)制成的溶液通过旋转蒸发除去有机溶剂制备成薄膜，然后加入水或加入pH＝7.4磷酸盐缓冲液，水化，离心，收集固体，冷冻干燥，得到免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束，所述薄膜与所述水或pH＝7.4磷酸盐缓冲液的比值为1mg：1～10mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯中聚乙二醇的数均分子量范围为2000～6000；所述疏水性抗肿瘤药物为阿霉素、多烯紫杉醇或紫杉醇中的一种。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述基质金属蛋白酶敏感连接肽氨基酸序列为PVGLIG、PLGLAG或GPLGVR。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述第一有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；所述第二有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和乙腈中至少一种。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述碳化二亚胺类交联剂为N，N-二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺的一种。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述胺-巯基类交联剂为SMCC、Sulfo-SMCC或SPDP。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述免疫检查点阻断多肽为名称是DPPA-1氨基酸序列为NYSKPTDRQYHF的多肽。
12.权利要求1-4之一的一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115518152A (zh) * 2022-05-09 2022-12-27 中山大学 基于肿瘤血管正常化协同免疫检查点阻断以增强光免疫治疗的多肽胶束及其制备与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107224589A (zh) * 2017-05-08 2017-10-03 中山大学 一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束及其制备方法
CN108078958A (zh) * 2017-12-28 2018-05-29 国家纳米科学中心 一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用
CN110585131A (zh) * 2019-09-20 2019-12-20 宁夏医科大学 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用
CN113648429A (zh) * 2021-07-06 2021-11-16 中山大学 靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107224589A (zh) * 2017-05-08 2017-10-03 中山大学 一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束及其制备方法
CN108078958A (zh) * 2017-12-28 2018-05-29 国家纳米科学中心 一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用
CN110585131A (zh) * 2019-09-20 2019-12-20 宁夏医科大学 共载化疗药物的1-甲基色氨酸免疫前药胶束、制备方法及其应用
CN113648429A (zh) * 2021-07-06 2021-11-16 中山大学 靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANG H N: "Blocking of the PD‐1/PD‐L1 Interaction by a D ‐Peptide Antagonist for Cancer Immunotherapy", 《ANGEW CHEM INT ED》 *
余家会: "《纳米生物医药》", 30 November 2011, 华东理工大学出版社 *
张覃沐: "《抗肿瘤药物的药理与临床应用》", 30 April 1999, 河南医科大学出版社 *
雷帅权: "对肿瘤微环境响应的抗癌纳米药物的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115518152A (zh) * 2022-05-09 2022-12-27 中山大学 基于肿瘤血管正常化协同免疫检查点阻断以增强光免疫治疗的多肽胶束及其制备与应用
CN115518152B (zh) * 2022-05-09 2023-09-01 中山大学 基于肿瘤血管正常化协同免疫检查点阻断以增强光免疫治疗的多肽胶束及其制备与应用

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