CN101428003A

CN101428003A - Rgdf-脂肪醇偶联物介导阿霉素靶向脂质体制备及作为抗肿瘤剂的应用

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Publication number: CN101428003A
Application number: CNA2008101810335A
Authority: CN
Inventors: 崔国辉; 崔纯莹; 杜荟蕊
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2028-11-21
Also published as: CN101428003B

Abstract

本发明公开了RGDF－脂肪醇偶联物介导阿霉素靶向脂质体制备及作为抗肿瘤剂的应用，本发明将抗肿瘤药物引入到该两亲性缀合物中得到抗肿瘤靶向脂质体药物，该脂质体系统可以增加抗肿瘤药物在靶部位的浓度并可减少其在非靶部位的毒副作用，提高药物的治疗指数。

Description

RGDF-脂肪醇偶联物介导阿霉素靶向脂质体制备及作为抗肿瘤剂的应用

技术领域：

本发明涉及靶向释药载体，尤其涉及RGDF-脂肪醇介导靶向药物载体及其构建方法，本发明还涉及药物载体在制备靶向抗肿瘤脂质体药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术：

许多恶性肿瘤的生长和转移均与整合素表达异常或分子结构改变相关。整合素是一跨膜蛋白大家族，由α、β两种亚基构成异二聚体。目前发现α约有18种，β约有8种，至少有24种异二聚体的整合素形式。整合素在肿瘤的进展可能具有两重性：1)肿瘤发生早期，整合素表达降低可致瘤细胞与基底膜或ECM成分的粘附作用减弱，从而有利于肿瘤在局部生长与扩散；2)瘤细胞进入血循环后，整合素表达增高有利于瘤细胞粘附于血管内皮，继而定位增殖。整合素在肿瘤细胞表面的表达高于正常细胞是公认的事实。

已知，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(Arg-Gly-Asp，RGD)是整合素特异识别序列片段，RGD三肽及修饰物通过与整合素特异结合，具有阻止肿瘤细胞定位增殖、抗肿瘤新生血管生成作用。

脂质体(liposome)是直径50～1000nm的球型脂质双层，磷脂膜的组成成分灵活，可以制成种类、大小、表面特征不同的多种类型，作为生物活性物质的有效运输载体。亲水性药物可以包容在脂质体的水核内，脂溶性药物可以嵌入磷脂双层间，中性药物可以通过调整脂质体内的pH值或通过添加反相离子与药物形成分子复合物而稳定地结合于脂质体内。

普通脂质体不具有靶向性。如在脂质体表面结合抗体、配体，利用肿瘤细胞与正常细胞表面表达的抗原受体的差异，通过抗原、抗体和受体、配体的特异性作用增加脂质体的主动靶向性，这样可以提高治疗指数。

抗肿瘤药物的主动靶向性制剂将是改进抗肿瘤药物制剂的新趋向。为了使载体系统具有特异靶向性，可将各种活性物质耦联到载体表面。受体介导的靶向策略是解决载体系统靶向性途径之一。借助这种特异性相互作用可将载有各种抗肿瘤药物的载体系统靶向到含有特异性受体的器官、组织或细胞；同时受体与配体结合可促进载体系统内药物释放到肿瘤细胞内。

阿霉素(doxorubicin，DXR)为两亲性蒽环类抗生素，抗肿瘤适应症较广，在血浆中消失迅速，广泛分布于心、肝、脾、肺、肾脏中，其心脏毒性较大。用靶向脂质体包裹阿霉素可望提高药物的靶向性、降低毒性，因而在国内外受到广泛地关注。此类载体制剂难于进入临床实践的主要原因在于现有的各类制备方法包封率不高(40％～60％)，主动靶向性不强。因此本发明将一种新的两亲性RGD偶联物引入含有阿霉素的药物传递系统制备得到阿霉素主动靶向脂质体。该脂质体系统可以增加阿霉素在肿瘤部位的浓度并可减少其在非靶部位的毒副作用，提高药物的治疗指数。

发明内容：

中国专利200710063669.5公开了一种RGDF-脂肪醇偶联物，但没有说明其在抗肿瘤靶向脂质体药物中的应用。

本发明的目的之一是提供一种含RGDF-脂肪醇偶联物的靶向脂质体及其装载水溶性抗肿瘤药物的制剂及制备方法。

本发明的目的之二是提供一种与RGDF-脂肪醇偶联物相似的对照化合物GGDF-脂肪醇偶联物以及它的靶向脂质体及其装载水溶性抗肿瘤药物的制剂及制备方法。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

具有两亲性的RGDF-脂肪醇偶联物，其分子式为：Arg-Gly-Asp-Phe-OCH₂(CH₂)_nCH₃，其中，n＝6，10，14。

将Arg-Gly-Asp-Phe分别与八烷基，十二烷基，十六烷基脂肪链进行缀合，即制备得到上述化合物。

具有两亲性的GGDF-脂肪醇偶联物，其分子式为：Gly-Gly-Asp-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃。

将Gly-Gly-Asp-Phe与十二烷基脂肪链进行缀合，即制备得到上述偶联物。

进一步，将上述具有两亲性的RGDF-脂肪醇偶联物化合物与磷脂，胆固醇按薄膜分散法进行制备，即可得到含有RGDF-脂肪醇偶联物锚点化合物的靶向脂质体药物载体；其中，在该靶向脂质体药物载体中，优选的，各组分按照以下摩尔百分比组成：天然卵磷脂70—80％，胆固醇10-28％和RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物2—10％；

将具有水溶性抗肿瘤药物(例如：阿霉素等)与天然卵磷脂、胆固醇、RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物按硫酸铵梯度法进行制备，可得到抗肿瘤药物靶向脂质体(例如：阿霉素靶向脂质体)或抗肿瘤药物靶向对照脂质体；优选后，抗肿瘤药物占靶向脂质体药物载体(天然卵磷脂、胆固醇，RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物的重量百分含量为2-10％。

为此，本发明的药物制剂各组分按照以下重量百分比组成：

抗肿瘤药物2-30％；

天然卵磷脂、胆固醇和RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物的混合物70-98％，

其中在混合物中，各组分摩尔百分比为：

RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物2-10％，

卵磷脂70—80％，

胆固醇10-28％，

本发明的药物制剂的方法，包括：

将所述各组分用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液，将空白脂质体置透析袋中透析；即得空白脂质体混悬液。

称取抗肿瘤药物，溶于水中，将水溶液加入至透析后的空白脂质体混悬液中，加热即得本发明的药物制剂

具体可以是：

(1)按以下重量百分比取各组分：抗肿瘤药物2-10％；天然卵磷脂、胆固醇和RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物的混合物90-98％，该混合物中，天然卵磷脂70—80％(摩尔百分比)，胆固醇10-28％(摩尔百分比)，RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物2-10％(摩尔百分比)；

(2)将上述各组分用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜(优选为37℃)。将120mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散(优选为30℃超声分散20min)，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析3-5次，每次透析约8h，取出后置茄瓶中；另精密称取抗肿瘤药物适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，于热水浴中放置(优选37℃，30min-60min)，不时振摇，即得。

经检测，所制备的脂质体溶液的为粒径100-300nm，Zeta电位为-30～-60mV。

以上所述抗肿瘤药物包括，包括阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇或多烯紫杉醇等。

本发明以荷肉瘤S180小鼠为模型，采用尾静脉给药的治疗方案评价了本发明所制备的阿霉素靶向脂质体制剂的抗肿瘤活性，结果显示阿霉素靶向脂质体比各对照组具有更优异的抗肿瘤活性。

本发明的偶联物与现有制备被靶向脂质体比较，偶联物与载体连接更稳定，因此，靶向性更好。

具体实施方式：

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。(注：Arg-Gly-Asp-Phe-OCH₂(CH₂)nCH₃，n＝6，10，14偶联物的具体制备实施例及有关的理化鉴别参数在已申请专利，专利申请号：200710063669.5中说明)

实施例1 Gyl-Gly-Asp-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备

1)Boc-Gly-Gly-OBzl的制备

将0.92g(5.25mmol)Boc-Gly-OH，0.68g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于无水DMF中。冰浴下再滴入1.34g(6.3mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把1.69g(5.0mmol)TosOH·Gly-OBzl悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Gly-OH消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用50ml氯仿溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。氯仿层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到1.59g(98.9％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)323.3[M+1]⁺，345.3[M+23]⁺，667.6[2M+23]⁺。

2)Boc-Gyl-Gly-OH的制备

将0.322g(1.0mmol)Boc-Gly-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Gly-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱合KHSO₄水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱合KHSO₄水溶液调pH至2，用乙酸乙酯萃取(30ml×3)。合并的乙酸乙酯相用饱和NaCl水溶液洗3次，无水Na₂SO₄干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得0.209g(90.0％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)232.11[M]⁺，233.11[M+1]⁺。

3)Boc-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备

按照Boc-Gyl-Gly-OBzl的制备方法，溶剂改为无水四氢呋喃，由1.32g(5mmol)Boc-Phe-OH和1.40g(6.5mmol)CH₃(CH₂)₁₀CH₂OH制得1.78g(82.37％)标题化合物，为白色固体。[α]^D ₂₀＝-7.1(cl，MeOH)；ESI-MS(m/z)434.6[M+1]⁺，456.6[M+23]⁺，867.9[2M+1]⁺，890.0[2M+23]⁺。

4)HCl·Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备

将1.78(4.12mmol)Boc-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃溶解在5ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨得1.42g(93.3％)标题化合物，为白色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)334.3[M+1]⁺，667.6[2M+1]⁺。

5)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备

按照Boc-Gyl-Gly-OBzl的制备方法，溶剂改为无水四氢呋喃，由1.42g(3.84mmol)HCl·Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃和1.24g(3.84mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH制得2.24g(91.4％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)639.7[M+1]⁺，661.7[M+23]⁺，1299.7[2M+23]⁺。

6)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备

将2.24(3.51mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃溶解在5ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成1.87g(92.5％)标题化合物，为白色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)539.7[M+1]⁺，1078.4[2M+1]⁺。

7)Boc-Gyl-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备

按照Boc-Gyl-Gly-OBzl的制备方法，溶剂改为无水四氢呋喃，由1.87g(3.25mmol)HCl·Asp(OBzl)Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃和0.791g(3.40mmol)Boc-Gyl-Gly-OH制得2.19g(90.2％)标题化合物，为白色固体。[α]^D ₂₀＝-9.7333(c＝1.0，MeOH)；

ESI-MS(m/z)753.7[M+1]⁺，775.9[M+23]⁺，1528.9[2M+23]⁺。

8)Boc-Gyl-Gly-Asp-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备

将0.753g(1mmol)Boc-Gyl-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃置于50ml茄形瓶中、用乙醇溶解、加200mgPd/C(5％)、通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.563g(85％)标题化合物，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z)：663.8[M+1]⁺，1325.1[2M]⁺。

9)Gyl-Gly-Asp-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备

按照HCl·Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备方法，从0.563g(0.85mmol)Boc-Gyl-Gly-Asp-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得0.454g(95％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)：561.8[M]⁺，563.0[M+1]⁺，1123.6[2M]⁺，[α]^D ₂₀＝-18.7667(c＝1.0，CH₃OH)。

实施例2.阿霉素脂质体(2)的制备

采用硫酸铵梯度法制备。取适量磷脂和胆固醇至圆底烧瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将120mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析3-5次，每次透析约8h，取出后置茄瓶中；另精密称取阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，于热水浴中放置，并不时振摇。从热水浴中取出后，即得阿霉素脂质体。

粒径100~300nm，Zeta-Potential-30~-50mV。

实施例3.膜材中含GGDF-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的阿霉素脂质体(3)的制备

各组分的用量在权利要求3范围内。

取磷脂，胆固醇和GGDF-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将120mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析3-5次，每次透析约8h，取出后置茄瓶中；另精密称取阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，置于热水浴中，并不时振摇。从热水浴中取出后，即得含GGDF-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的阿霉素脂质体。

粒径100~300nm，Zeta-Potential -40~-60mV。

实施例4.膜材中含RGDF-OCH₂(CH₂)₆CH₃的阿霉素脂质体(4)的制备

各组分的用量：阿霉素2-10％；天然卵磷脂，胆固醇和RGDF-OCH₂(CH₂)₆CH₃的混合物90-98％，该混合物中，天然卵磷脂70—80％(摩尔百分比)，胆固醇10-28％(摩尔百分比)和整合素受体靶向锚点化合物2-10％(摩尔百分比)。

参照实施例2的制备方法，取磷脂，胆固醇和RGDF-OCH₂(CH₂)₆CH₃至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将120mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析3-5次，每次透析约8h，取出后置茄瓶中；另精密称取阿霉素适量，溶于少量蒸馏水中，将此溶液与空白脂质体混悬液混合，于热水浴中放置，不时振摇。取出，即得含RGDF-OCH₂(CH₂)₆CH₃阿霉素脂质体。

粒径100~300nm，Zeta-Potential -40~-60mV。

实施例5.膜材中含RGDF-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的阿霉素脂质体(5)的制备

各组分的用量：阿霉素2-10％；天然卵磷脂，胆固醇和RGDF-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的混合物90-98％，该混合物中，天然卵磷脂70—80％(摩尔百分比)，胆固醇10-28％(摩尔百分比)和整合素受体靶向锚点化合物2-10％(摩尔百分比)。

照实施例2的制备方法，取磷脂，胆固醇和RGDF-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将120mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析3-5次，每次透析约8h，取出后置茄瓶中；另精密称取阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，于热水浴中放置，不时振摇。取出即得含RGDF-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的阿霉素脂质体。

粒径100~300nm，Zeta-Potential -40~-60mV。

实施例6.膜.材中含RGDF-OCH₂(CH₂)₁₄CH₃的阿霉素脂质体(6)的制备

各组分的用量：阿霉素2-10％；天然卵磷脂，胆固醇和RGDF-OCH₂(CH₂)₁₄CH₃的混合物90-98％，该混合物中，天然卵磷脂70—80％(摩尔百分比)，胆固醇10-28％(摩尔百分比)和整合素受体靶向锚点化合物2-10％(摩尔百分比)。

照实施例2的制备方法，取磷脂，胆固醇和RGDF-OCH₂(CH₂)₁₄CH₃至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜。将120mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液。将空白脂质体置透析袋中透析3-5次，每次透析约8h，取出后置茄瓶中；另精密称取阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，于热水浴中放置，不时振摇。即得含RGDF-OCH₂(CH₂)₁₄CH₃的阿霉素脂质体。

粒径100~300nm，Zeta-Potential -40~-60mV。

实施例7.RGDF-OCH₂(CH₂)₆CH₃脂质体(10)的制备

取磷脂(70-80％，m/m)，胆固醇(10-28％m/m)及所需RGD缀合物RGDF-OCH₂(CH₂)₆CH₃(2—10％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜，加入120mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散得具乳光的脂质体混悬液，将此脂质体混悬液置透析袋中透析3-5次，每次透析约8h。取出后即的。

粒径100~300nm，Zeta-Potential -40~-60mV。

实验例8.含RGDF-OCH₂(CH₂)_nCH₃与阿霉素的脂质体对S180腹水小鼠的治疗作用

取腹腔接种S₁₈₀腹水瘤第八天的昆明种小鼠一只，脱颈椎处死，用75％酒精消毒后置于超净台内，用镊子夹起腹部中线偏右的皮肤并用小剪刀剪一小口至可见乳白色腹水流出。将吸管由开口处轻轻插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水加到装有约3ml灭菌生理盐水的15ml的离心管中，使体积增至约10ml。用吸管轻轻吹气，使腹水与生理盐水混匀。试管加盖，1000转/分离心5分钟。弃去上清液后，加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀浮起，试管加盖，1000转/分离心5分钟，弃去上清液。试管底部有的乳白色的胶状物。往试管底部的乳白色胶状物中加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀浮起。取100μl该悬浮液加至9.9ml灭菌生理盐水中，混匀，得100倍稀释液，混匀，加盖，放入冰中待用。取100μl上述瘤细胞稀释液置入Eppendoff小管中，加100μl台盼兰染液，混匀。取少许该混匀液加至计数板的计数池内，于显微镜下计算4个大格中被染上蓝色的存活瘤细胞的个数。将原液中的存活瘤细胞稀释成1.0×10⁷个/ml，用于接种。用2％碘酒棉球和75％酒精棉球在小鼠右侧腋下消毒，并注入0.2ml瘤细胞液，缓缓抽出针头。按此方法给每批昆明种小鼠接种，随机分组，放入动物室饲养。

药物配制：本实验共设12组：1.阿霉素注射液组；2.阿霉素脂质体(实施例1所制备)组；3.膜材中含有GGDFO(CH₂)₁₁CH₃的阿霉素脂质体组(实施例2所制备)组；4.膜材中含有RGDFO(CH₂)₇CH₃的阿霉素脂质体组(实施例3所制备)组；5.膜材中含有RGDFO(CH₂)₁₁CH₃的阿霉素脂质体组(实施例4所制备)组；6.膜材中含有RGDFO(CH₂)₁₅CH₃的阿霉素脂质体组(实施例5所制备)组；7.膜材中含有小量RGDFO(CH₂)₇CH₃的阿霉素脂质体组；8.膜材中含有RGDFO(CH₂)₇CH₃的大剂量阿霉素脂质体组；9.膜材中含有RGDFO(CH₂)₇CH₃的小剂量阿霉素脂质体组；10.RGDFO(CH₂)₇CH₃脂质体组(实施例6所制备)组；11.空白脂质体组；12.生理盐水溶液组。

药物注射液制备：精密称取药物，加入0.9％氯化钠注射液溶解即得。阳性对照是阿霉素的脂质体，阴性对照为空白脂质体。各组药物除第8，9组(膜材中含有RGDFO(CH₂)₇CH₃的大剂量与小剂量阿霉素脂质体组)以0.3mg/mL与0.1mg/ml外，其余均为0.2mg/mL配制，脂质体制备方法采用硫酸铵梯度法。

实验方法：将右侧腋下接种有腹水瘤的小鼠随机分组，每组10只，共12组。各组小鼠正常饲养，从接种后24小时开始给药，每隔2天一次，共3次。每次尾静脉注射上述药物0.2ml。9天后将各组荷瘤小鼠处死，解剖，取瘤。并称体重和瘤重，按抑瘤率＝[(阴性对照组平均瘤重—治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]×100％计算抑瘤率。获得的数据以(X±SDg)表示，并做t检验。

结果见表2、表3。

由表2可见，含有RGD肽偶联物的阿霉素脂质体有优越的抗肿瘤活性；通过统计学分析可看出其中4，5，6，7，8组抗肿瘤作用均高于阿霉素脂质体组；2，3，4，5，6，7，8组抗肿瘤作用均高于阿霉素注射液组；4，5，6，7，8组抗肿瘤作用均高于含有对照化合物GGDFO(CH₂)₁₁CH₃的阿霉素脂质体组。

由表3可见，只有使用阿霉素注射液的小鼠在试验后体重减轻，而使用阿霉素靶向脂质体及普通脂质体的小鼠在试验后体重均有所增加。说明这药物的这两种制剂与游离药物比较安全性均有所提高。实验结束时各给药组的小鼠体重与空白组比较，都有不同程度下降，但都没有超过正常范围(根据《药理试验方法学》所述各组鼠在试验过程中途中变化幅度应小于15％，22g荷瘤鼠体重变化幅度应小于3.3g)。说明本次试验过程中所选用剂量适当，未对实验动物引起毒副反应。

表2 阿霉素靶向制剂对荷肉瘤S180小鼠的作用(n＝10)

#对比于阿霉素注射液有显著意义(P<0.01)；＊对比于阿霉素注射液有意义(P<0.05)；^*对比于阿霉素脂质体组有显著意义(P<0.01)；&对比于含有对照化合物GGDFO(CH₂)₁₁CH₃的阿霉素脂质体组有显著意义(P<0.01)。

表3 阿霉素靶向制剂对荷肉瘤S180小鼠体重的影响

实施例9、脂质体的药物制剂

脂质体的药物制剂，按重量百分比计算，由以下各组分组成：

抗肿瘤药物2％，

脂质体98％

其中所述的脂质体，各组分按照以下摩尔百分比组成：

卵磷脂70％，

胆固醇28％，

RGDF-脂肪醇偶联物2％。

实施例10、脂质体的药物制剂

抗肿瘤药物2％，

脂质体70％

其中所述的脂质体，各组分按照以下摩尔百分比组成：

卵磷脂70％，

胆固醇28％，

GGDF-脂肪醇偶联物10％。

实施例11、脂质体的药物制剂

抗肿瘤药物30％，

脂质体70％

其中所述的脂质体，各组分按照以下摩尔百分比组成：

卵磷脂80％，

胆固醇10％，

GGDF-脂肪醇偶联物2％。

实施例11、脂质体的药物制剂

抗肿瘤药物30％，

脂质体70％

其中所述的脂质体，各组分按照以下摩尔百分比组成：

卵磷脂80％，

胆固醇10％，

RGDF-脂肪醇偶联物2％。

实施例12、脂质体的药物制剂

抗肿瘤药物16％，

脂质体84％

其中所述的脂质体，各组分按照以下摩尔百分比组成：

卵磷脂75％，

胆固醇19％，

RGDF-脂肪醇偶联物6％。

实施例13、脂质体的药物制剂

抗肿瘤药物16％，

脂质体84％

其中所述的脂质体，各组分按照以下摩尔百分比组成：

卵磷脂75％，

胆固醇19％，

GGDF-脂肪醇偶联物6％。

Claims

1、一种含RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物的脂质体，其特征在于：由RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物，卵磷脂和胆固醇组成。

2、按照权利要求1所述的脂质体，其特征在于，各组分按照以下摩尔百分比组成：卵磷脂70—80％，胆固醇10-28％，RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物2-10％。

3、含有权利要求2的脂质体的药物制剂，其特征在于，按重量百分比计算，由以下各组分组成：抗肿瘤药物2-30％，脂质体70-98％。

4、一种制备权利要求2的所述脂质体的方法，包括：将各组分用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液，将空白脂质体置透析袋中透析；即得。

5、一种制备权利要求3的药物制剂的制备方法，其特征在于，称取抗肿瘤药物，溶于水中，将水溶液加入至透析后的空白脂质体混悬液中，加热即得。

6、按照权利要求3所述的药物制剂，其特征在于：所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇或多烯紫杉醇。

7、按照权利要求3所述的药物制剂，各物质配比在权利要求2和3的范围内，其制备方法如下：

取磷脂，胆固醇和RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层透明的膜，将120mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液加至脂膜中，超声分散，得空白脂质体混悬液，将空白脂质体置透析袋中透析3-5次，每次透析8小时，取出后置茄瓶中；另取阿霉素适量，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，置于热水浴中，并不时振摇，从热水浴中取出后，即得含RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物的阿霉素脂质体。

8、GGDF-脂肪醇偶联物，其分子式为：Gly-Gly-Asp-Phe-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃。

9、权利要求8的偶联物的制备方法，其特征在于，将Gly-Gly-Asp-Phe与十二烷基脂肪链进行缀合，即得。

10、RGDF-脂肪醇偶联物或GGDF-脂肪醇偶联物在制备抗肿瘤靶向脂质体药物中的应用。