CN105198961A - Rgd修饰的5-氟尿嘧啶,其制备,纳米结构,活性及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了化合物5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp四肽，公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它的抗肿瘤作用，公开了它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用，阐明了它在医学中的应用。

Description

RGD修饰的5-氟尿嘧啶,其制备,纳米结构,活性及应用

技术领域

本发明涉及5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S。涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它的体内外抗肿瘤作用，涉及它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物，制备抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

5-氟尿嘧啶是一临床常用的抗肿瘤药物，它可用于多种癌症的治疗，胃癌，肝癌，结肠等。虽然5-氟尿嘧啶对于肿瘤的治疗有不错的疗效，但其也存在一些不容忽视的问题。例如体内半衰期短，口服生物利用度低，给药剂量与中毒剂量相近，毒副作用大。为了能更好地发挥5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用，提高其抑瘤效果、减少毒副作用。多年来人们对5-氟尿嘧啶进行了大量的修饰工作，合成了多种5-氟尿嘧啶衍生物，如在5-氟尿嘧啶上引入葡萄糖、卟啉类化合物，金属配合物，氨基酸和短肽等。遗憾的是这些努力并没有获得期待的结果。在5-氟尿嘧啶的结构修饰中，还有将RGD三肽引入的合成研究。因为在一些重要的研究中，RGD三肽已确认对整合素受体没有识别作用，所以这种修饰是一种目标含糊的化学工作，对5-氟尿嘧啶没有任何生物学意义。

RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素α_Vβ₃的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞粘附活性。申请人曾经把它们与雌激素偶联，制备没有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把它们与四氢-β-咔啉-3-羧酸偶联制备高效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的β-咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。图1是发明人创造的结构类型的代表。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤转移作用的化合物。

发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将RGDV，RGDF或RGDS与5-氟尿嘧啶偶联，形成的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S会同时具有抗肿瘤和抗肿瘤细胞粘附浸润和迁移作用。基于这个认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S。

本发明的第二个内容是提供5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S的制备方法，该方法由以下步骤构成：

(1)60℃5-氟尿嘧啶在溴乙酸乙酯溶液，30％NaOH的水溶液中反应10h，然后在冰水浴，浓盐酸存在下形成5-氟尿嘧啶-1-基乙酸；

(2)用液相合成制备R(NO₂)GD(OBzl)V-OBzl，R(NO₂)GD(OBzl)F-OBzl，R(NO₂)GD(OBzl)S-OBzl；

(3)将R(NO₂)GD(OBzl)V-OBzl，R(NO₂)GD(OBzl)F-OBzl，R(NO₂)GD(OBzl)S-OBzl与5-氟尿嘧啶-1-基乙酸偶联，制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)V-OBzl，5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)F-OBzl，5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)S-OBzl；

(4)将5-氟尿嘧啶-1-基乙酸偶联，制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)V-OBzl，5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)F-OBzl，5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)S-OBzl脱保护，制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S。

本发明的第三个内容是评价5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S的抗细胞增殖活性。

本发明的第四个内容是评价5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S抗肿瘤细胞粘附，侵袭和迁移作用。

附图说明

图1是发明人创造的抗肿瘤活性化合物的结构类型代表，式中AA为L-氨基酸或甘氨酸。

图2是5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S的合成路线.i)DCC，HOBt，NMM，THF；ii)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)；iii)CH₃OH，2NNaOH；iv)NaOH(30％)，60℃，溴乙酸乙酯，浓HCl；v)TFA，TFMSA。

图3是5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S在纯水溶液中1×10^-5M浓度下的透射电镜照片。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酸

1.30g(10mmol)5-氟尿嘧啶置于100mL茄瓶中，加入10mLNaOH(30％)的水溶液溶解，将反应加热升温至60℃，待完全溶解，缓慢滴加1.75mL溴乙酸乙酯溶液，恒温60℃反应12h，TLC(乙酸乙酯∶冰醋酸∶水＝5∶2∶0.5)显示反应完成。将反应液冷却至室温，冰浴下缓慢滴加浓盐酸，调节pH至2，搅拌0.5h，有无色固体析出，过滤，将滤饼分别用冰水和乙醚洗三次，阴凉处晾干，得0.56g(30％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：189[M+H]⁺.¹HNMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝13.21(s，1H)，11.89(d，J＝4.5Hz1H)，8.07(d，J＝6.5Hz1H)，4.37(s，2H)。

实施例2制备HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

1)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

19.94g(62.5mmol)Boc-Arg(NO₂)用100mL无水THF溶解于500mL反应瓶中，冰浴下加入9.65g(68.75mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)及15.45g(75.0mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌30min得到反应物A。另将30.36g(85.53mmol)Tos·Gly-OBzl用150mL无水THF溶解于250mL反应瓶，冰浴下缓慢滴加N-甲基吗啉(NMM)调节pH至9，得到反应物B。冰浴下，将反应物B加入反应物A中，缓慢滴加N-甲基吗啉(NMM)调节pH至9，室温下搅拌反应12h，薄层层析TLC(二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸＝20∶1∶0.1)显示反应完成。反应液过滤，减压除去溶剂，残留物柱层析分离(二氯甲烷-甲醇系统)，得到14.56g(50％)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl。ESI-MS(m/e)：467[M+H]⁺。

2)Boc-Arg(NO₂)-Gly的制备

14.56g(31.25mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl用甲醇溶解，冰浴搅拌下缓慢滴加2NNaOH水溶液，冰浴下，薄层层析TLC(二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸＝15∶1∶0.1)显示反应完成。反应液用1NHCl调至中性，减压除去甲醇，继续加入1NHCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取，合并有机层，并用饱和氯化钠水溶液洗涤至中性，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压除去溶剂制8.26gg(70.3％)Boc-Arg(NO₂)-Gly。ESI-MS(m/e)：375[M-H]^-。

3)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl的制备

按照实施例2中1)的操作，由22.10g(68.30mmol)Boc-Asp(OBzl)，10.10g(75.13mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)，16.90g(81.90mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)及25.89g(68.30mmol)Tos·Val-OBzl制得18.28g(52.3％)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e)：513[M+H]⁺。

4)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl的制备

冰水浴下，18.28g(35.7mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl与36mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N)，室温搅拌反应2h，薄层层析TLC(二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸＝20∶1∶0.1)显示反应完成。减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复用少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢，制得14.61g(91.23％)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl。ESI-MS(m/e)：411[M-H]^-。

5)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl的制备

按照实施例2中1)的操作由7.53g(32.6mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly与14.60g(32.60mmol)HCl·Asp-(OBzl)-Val-OBzl制得9.81g(47.3％)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e)：771[M+H]⁺。

6)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl的制备

按照实施例2中4)的操作，由9.80gBoc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl制得7.74g(89.7％)。ESI-MS(m/e)：669[M-H]^-。

实施例3制备HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

1)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

方法同实施例2中1)。

2)Boc-Arg(NO₂)-Gly的制备

方法同实施例2中2)。

3)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的制备

按照实施例2中1)的操作，由22.10g(68.30mmol)Boc-Asp(OBzl)，10.10g(75.13mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)，16.90g(81.90mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)及30.39g(68.30mmol)Tos·Phe-OBzl制得18.28g(52.3％)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e)：561[M+H]⁺。

4)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl的制备

按照实施例2中4)的操作，由20.01g(35.74mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得16.77g(91.2％)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl。ESI-MS(m/e)：459[M-H]^-。

5)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的制备

按照实施例2中1)的操作，由14.59g(32.59mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly与18.16g(32.59mmol)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得13.47g(53.12％)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e)：819[M+H]⁺。

6)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的制备

按照实施例2中4)的操作，由13.47gBoc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得11.66g(94.25％)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。ESI-MS(m/e)：717[M-H]^-。

实施例4制备HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

1)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

方法同实施例2中1)。

2)Boc-Arg(NO₂)-Gly的制备

方法同实施例2中2)。

3)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的制备

按照实施例2中1)的操作，由22.10g(68.30mmol)Boc-Asp(OBzl)，10.10g(75.13mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)，16.90g(81.90mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)及16.74g(68.30mmol)Ser-OBzl制得14.17g(48.5％)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e)：501[M+H]⁺。

4)HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl的制备

按照实施例2中4)的操作，由14.17g(33.13mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl制得14.41g(93.65％)HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl。ESI-MS(m/e)：399[M-H]^-。

5)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的制备

按照实施例2中1)的操作，由7.17g(31.03mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly与14.41g(31.03mmol)HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl制得10.63g(45.21％)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e)：759[M+H]⁺。

6)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Serl-OBzl的制备

按照实施例2中4)的操作，由10.63g(14.03mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl制得8.64g(88.65％)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl。ESI-MS(m/e)：757[M-H]^-。

实施例5制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Val(3a)

1)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(2a)的制备

2.59g(13.80mmol)5-氟尿嘧啶-1-基乙酸用20mL无水DMF溶解于100mL反应瓶中，冰浴下加入2.13g(15.18mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)及3.41g(16.56mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌30min得到反应物A。另将7.74g(13.8mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl用20mL无水DMF溶解于100mL反应瓶，冰浴下缓慢滴加N-甲基吗啉(NMM)调节pH至9，得到反应物B。冰浴下，将反应物B加入反应物A中，缓慢滴加N-甲基吗啉(NMM)调节pH至9，室温下搅拌反应12h，薄层层析TLC(二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸＝8∶1∶0.1)显示反应完成。反应液过滤，减压除去溶剂，残留物柱层析分离(二氯甲烷-甲醇系统)，制得1.46g(15.21％)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl。ESI-MS(m/e)：841[M+H]⁺。

2)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Val(3a)的制备

冰浴下1.45g(2.09mmol)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(2a)溶解于20mL三氟乙酸中，得到的溶液加入4mL三氟甲磺酸(TFMSA)，搅拌反应1.5h，薄层层析TLC(二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸＝7∶1∶0.1)及(乙酸乙酯∶冰醋酸∶水＝5∶2∶2)显示反应完成。冰浴下，往反应化合物中加入大量无水乙醚，搅拌至有无色固体析出，过滤，滤饼用蒸馏水溶解，氨水(10％)调节pH至6，用C18进行柱分离，制得0.48g(23.1％)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Val。ESI-MS(m/e)：616.7[M+H]+.mp：192.3-193.0℃；[α]_D ²⁵＝-14.46(c＝0.2，CH₃OH).IR(KBr)：3323，3284，3265，3213，3203，2972，1714，1699，1558，1519，1506，1456，1419，1371，1246，1226，1176，1029，894，802cm^-1.¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.78(s，1H)，8.54-8.41(m，3H)，7.39-7.10(m，4H.48，)，4.49-4.26(m，4H)，4.07-4.04(m，1H)，3.18-2.99(m，3H)，2.04-2.00(m，1H)，1.89-1.84(m，1H)，1.57-1.46(m，3H)，0.83-0.82(m，6H).纯度：98.90％流动相∶CH₃OH∶H₂O∶冰醋酸＝95∶5∶0.1，保留时间：6.52min。

实施例6制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe(3b)

1)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(2b)的制备

按照实施例5中1)的操作，由3.07g(16.32mmol)5-氟尿嘧啶-1-基乙酸，2.4g(17.95mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)及4.03g(16.56mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，与11.66g(16.32mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，制得2.06g(14.3％)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(2b)，为无色固体。ESI-MS(m/e)：889[M+H]⁺。

2)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe(3b)的制备

按照实施例5中2)的操作，由2.06g(2.32mmol)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(2b)，制得0.424g(28％)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe(3b)，为无色固体，ESI-MS(m/e)：662[M-H]^-.mp：201.2-202.7℃；[α]_D ²⁵＝-28.98(c＝0.2，CH₃OH).IR(KBr)：3375，3317，3061，2929，1718，1662.64，1635，1616，1369，1246，1224，1029.，972，756，704cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝10.08(s，1H)，8.81(d，J＝6.0Hz1H)，8.52-8.40(m，1H)，8.02(d，J＝6.0Hz1H)，7.34-7.02(m，5H)，4.42-4.28(m，2H)，4.22-4.09(m，1H)，3.93-3.85(m，1H)，3.61-3.54(m，1H)，3.17-2.89(m，3H)，2.39-2.27(m，1H)，1.91-1.85(m，1H)，1.64-1.47(m，2H).纯度：99.21％流动相∶CH₃OH∶H₂O∶冰醋酸＝95∶5∶0.1，保留时间：8.45min。

实施例7制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser(3c)

1)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(2c)的制备

按照实施例5中1)的操作，由2.64g(14.03mmol)5-氟尿嘧啶-1-基乙酸，2.08g(15.43mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)及3.76g(18.24mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，与8.64g(14.03mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，制得1.19g(10.23％)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(2c)，为无色固体。ESI-MS(m/e)：851[M+Na]⁺.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.84(s1H)，8.49(d，J＝6Hz，2H)，8.35-8.29(m，3H)，8.00-7.87(m，2H)，7.40-7.30(m，10H)，5.16-5.03(m，4H)，4.81-4.74(m，1H)，3.80-3.51(m，4H)，3.14(s，2H)，2.89(s，1H)，2.79-2.72(m，1H)，2.00-1.90(m，2H)，1.69(s，1H)，1.52(s，3H)，1.23-1.15(m，1H)。

2)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser(3c)的制备

按照实施例5中2)的操作，由1.19g(1.44mmol)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(2c)，制得0.151g(17.5％)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser(3c)，为无色固体，ESI-MS(m/e)602.1[M-H]^-，mp：197.2-198.7℃；[α]_D ²⁵＝-29.70(c＝0.4，CH₃OH).IR(KBr)：3396，3284，3246，3192，2958，1734，1714，1558，1411，1375，1340，1244，1143，1031，972，906，802cm^-1.¹H-NMR(500MHz，DMSO∶D₂O＝4∶1)：δ/ppm＝7.76-7.74(m，1H)，4.18(m，2H)，3.95(m，1H)，3.87-3.78(m，3H)，3.58(m，3H)，3.05-3.00(m，3H)，2.42-2.35(m，2H)，1.76-1.39(m，7H).纯度：98.35％流动相∶CH₃OH∶H₂O∶冰醋酸＝95∶5∶0.1，保留时间：8.79min。

实验例1测定化合物3a-c的透射电镜照片

将化合物3a-c按照1×10^-5M的浓度配置化合物的纯水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图3。结果表明，化合物3a-c在水中均可形成纳米颗粒，直径在40-400nm。

实验例2测定化合物3a-c对细胞的细胞毒作用

1)本发明的化合物3a-c用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。

2)实验用的肿瘤细胞为HepG₂(人肝细胞癌细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，BEL-7402(人肝癌细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)，U-2OS(人骨肉瘤细胞)，S180(小鼠腹水瘤细胞)，L02(人正常肝细胞)和Haca-T(人表皮正常细胞株)。

3)实验方法HL-60，BEL-7402，MCF-7和S180细胞选用RPMI-1640培养基；HeLa，HepG₂，U-2OS，L02和Haca-T细胞选用DMEM培养基。培养基中均含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

贴壁细胞HepG₂，MCF-7，BEL-7402，HeLa，Haca-T，U-2OS和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

悬浮细胞HL60的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物3a-c与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养48小时。每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于条件为37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

按下式求出各个浓度下化合物3a-c抑制肿瘤细胞增殖的活性：

细胞增殖(％)＝(化合物3a-c组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

4)结果见表1和表2。结果表明，在体外细胞毒试验中，评价了化合物3a-c在仅在100和200μM的高浓度对BEL-7402，HepG₂，HL60，U-2OS，HeLa，S180，L02和Haca-T等9株肿瘤细胞显示弱的细胞毒作用。

表1体外细胞毒活性(IC₅₀，均值±SDμM)

表2体外细胞毒活性(IC₅₀，均值±SDμM)

实验例3评价化合物3a-c的体内抗肿瘤活性

1)本发明的化合物3a-c用生理盐水溶解，5-氟尿嘧啶用生理盐水溶解作为阳性对照，用生理盐水作为阴性对照；

2)化合物3a-c和生理盐水均灌胃给药，化合物3的给药剂量为10μmol/kg，生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g，5-氟尿嘧啶的给药剂量为10μmol/kg和的给药剂量为150μmol/kg，连续给药7天，共给药7次。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日口服化合物3a-c，5-氟尿嘧啶或生理盐水，剂量同上所述，连续给药7天，共给药7次。第8天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物3a-c组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以平均值±SDg表示。结果见表3。可以看出，在10nmol/kg的口服剂量下，10μmol/kg，生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g，5-氟尿嘧啶的给药剂量为10μmol/kg和的给药剂量为150μmol/kg，化合物3a-c治疗组小鼠的瘤重与生理盐水组及5-氟尿嘧啶(10μmol/kg)组比具有显著性差异，与5-氟尿嘧啶(150μmol/kg)组相比没有显著性差异。可见，化合物3a-c的有效剂量比5-氟尿嘧啶低15倍。

表3化合物3a-c对S180荷瘤小鼠瘤重的影响g

n＝12；a)与生理盐水组5-氟尿嘧啶(10μmol/kg)组比p＜0.01，与5-氟尿嘧啶(150μmol/kg)组比p＞0.05。

实验例4评价化合物3a-c的体外抗肿瘤细胞粘附活性

1)5-氟尿嘧啶和化合物3a-c用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为HepG₂。

3)Fn(人纤维连接蛋白)。

4)实验方法

用PBS将Fn配制成浓度为100μg/mL的溶液，按100μL/孔加入96孔培养板中，将培养板置于4℃冰箱过夜。次日，吸除未包被Fn溶液，用PBS洗1次，每孔加入含2％FBS的PBS溶液30μL封板，在37℃和5％CO₂的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长状态良好、处于对数生长期的HCCLM3细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中，每孔100μL，同时加入25μL化合物3a-c的溶液，使其终浓度为20nM，在37℃和5％CO₂培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测O.D.(吸光度)值。粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率(％)＝[1-(化合物3a-c组细胞的OD值/空白组细胞的OD值)]×100％；实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以均值±SD表示。

5)结果见表4。从结果中可以看出，化合物3a-c在20nM浓度时，明显抗HepG₂细胞与FN粘附。与发明人公开的RGDV，RGDF，RGDS抑制SACC-LM细胞与ECM及血小板粘附的有效浓度为1μM相比，化合物3a-c的有效浓度降低了50倍。

表4化合物3a-c的体外抗肿瘤细胞粘附评价

n＝3

实验例5评价化合物3a-c的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

1)5-氟尿嘧啶和化合物3a-c用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为HepG₂。

3)基质胶为matrigel。

4)实验方法

将冻存于-20℃冰箱的基质胶matrigel4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μLMatrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个，放入37℃和5％CO₂培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μLDMEM培养基，37℃和5％CO₂培养箱中孵育30min。

HepG₂细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×10⁵个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL5-氟尿嘧啶和化合物3a-c的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养48小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

5)结果见表5。可以看出，化合物3a-c在20nM的浓度下与空白对照组及5-氟尿嘧啶组相比，发生侵袭的细胞数具有显著性差异，说明在该条件下，化合物3a-c具有明显的抗HepG₂细胞侵袭作用。与发明人公开的RGDV，RGDF，RGDS抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1μM相比，化合物3a-c的有效浓度降低了50倍。

表5化合物3a-c的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

n＝9；a)与空白对照组和5-氟尿嘧啶组比p＜0.01.

实验例6评价化合物3a-c的体外抗肿瘤细胞迁移活性

1)5-氟尿嘧啶和化合物3a-c用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为HepG₂。

3)实验方法

HepG₂细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×10⁶个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL5-氟尿嘧啶和化合物3a-c的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养6小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

4)结果见表6。可以看出，在20nM浓度下化合物3a-c与空白对照组相比，发生侵袭的细胞数显著减少，说明在该条件下化合物3a-c具有明显的抗HepG₂细胞侵袭作用。与发明人公开的RGDV，RGDF，RGDS抑制SACC-LM细胞迁移的有效浓度为1μM相比，化合物3a-c的有效浓度降低了50倍。

表6化合物3a-c的体外抗肿瘤细胞迁移活性

n＝9；a)与空白对照组和5-氟尿嘧啶组比p＜0.01。

Claims (5)

1.下面结构的化合物5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGD四肽，式中RGD四肽为RGDS，RGDF和RGDV。

2.权利要求1的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGD四肽的制备方法，该方法由以下步骤构成：

(1)60℃5-氟尿嘧啶在溴乙酸乙酯溶液，30％NaOH水溶液中反应10h，然后在冰水浴，浓盐酸存在下形成5-氟尿嘧啶-1-基乙酸；

(2)采用液相合成制备R(NO₂)GD(OBzl)V-OBzl，R(NO₂)GD(OBzl)F-OBzl，R(NO₂)GD(OBzl)S-OBzl；

(3)将R(NO₂)GD(OBzl)V-OBzl，R(NO₂)GD(OBzl)F-OBzl，R(NO₂)GD(OBzl)S-OBzl与5-氟尿嘧啶-1-基乙酸偶联，制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)V-OBzl，5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)F-OBzl，5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)S-OBzl；

(4)将5-氟尿嘧啶-1-基乙酸偶联，制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)V-OBzl，5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)F-OBzl，5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-R(NO₂)GD(OBzl)S-OBzl脱保护，制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S。

3.权利要求1的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S的纳米结构。

4.权利要求1的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-RGDV/F/S在制备抗肿瘤细胞粘附迁移和侵袭药物中的应用。