CN105273054A - YIGSR修饰的β-咔啉，其制备，纳米结构，活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了下面结构的化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg，Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的正规简称是YIGSR。公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它的抗肿瘤作用，公开了它抗肿瘤细胞粘附、侵袭和迁移的作用，进一步公开了它的抗炎症和抗血栓作用，阐明了它在医学中的应用。

Description

YIGSR修饰的β-咔啉，其制备，纳米结构，活性和应用

技术领域

本发明涉及1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg。Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的正规简称是YIGSR。涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它的体内外抗肿瘤作用，涉及它抗肿瘤细胞粘附、侵袭和迁移的作用，进一步涉及它的抗炎和抗栓作用。本发明属于生物医药领域。

技术背景

恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，恶性肿瘤并发的炎症、血栓和转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90％以上的恶性肿瘤患者都是死于肿瘤转移。肿瘤转移依赖于4个因素：1)肿瘤细胞表面形成微血栓，逃避巨噬细胞吞噬，通过血液循环迁移到远端；2)迁移到远端的肿瘤细胞粘附到血管壁；3)细胞粘附到血管壁的肿瘤细胞通过侵袭出血管而进入正常组织；4)炎症使进入正常组织的肿瘤细胞成长为转移的新生肿瘤。

由于现有抗肿瘤药物不具备抗炎症、抗血栓和抗转移作用，所以疗效不理想。发明同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤转移作用的药物是临床的迫切需求。

RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素α_Vβ₃的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞粘附活性。层粘连蛋白-111(laminin-111)参与到肿瘤的生长、浸润、转移、粘附和血管生成等多个生理过程。Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR)序列位于层连蛋白-111的β1链上，申请人曾经报道在浓度为1μM时它可以抑制肿瘤细胞粘附和浸润。申请人曾经把它们与雌激素偶联，制备没有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把它们与四氢-β-咔啉-3-羧酸偶联制备高效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的β-咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。下面是发明人创造的结构类型的代表。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤粘附浸润和迁移作用的化合物。

发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将YIGSR与1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸偶联，形成的化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg会同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤粘附浸润和迁移作用。基于这个认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg。

本发明的第二个内容是提供1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的制备方法，该方法包括：

(1)在浓硫酸存在下，5-甲酰水杨酸在甲醇中微波90℃反应2h，生成5-甲酰水杨酸甲酯；

(2)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；

(3)在三氟醋酸存在下，在二氯甲烷中5-甲酰水杨酸和L-色氨酸苄酯缩合为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(4)在2，3-二氯-5，6-二腈基-1，4-苯醌(DDQ)的存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃(THF)中氧化为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(5)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯反应生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸；

(6)采用标准操作液相逐步缩合法，在DCC和HOBt存在下，在干燥THF中反应，得到全保护多肽序列Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl；

(7)在冰浴下氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)中，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl脱除Boc得到Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl；

(8)在DCC和HOBt存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸在无水THF中与Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl缩合为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl；

(9)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl反应得到化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg。

本发明的第三个内容是测定化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的纳米结构。

本发明的第四个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg体外抑制肿瘤细胞增殖的作用。

本发明的第五个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg对荷s180小鼠肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第六个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg体外抑制肿瘤细胞粘附、侵袭和迁移的作用。

本发明的第七个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的体内抗炎作用。

本发明的第八个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的抗血小板聚集和抗血栓作用。

附图说明

图1.发明人创造的抗血栓或抗肿瘤活性化合物的结构类型代表，式中AA为L-氨基酸或甘氨酸。

图2.化合物5的合成路线.i)CH₃OH，浓H₂SO₄，微波90℃；ii)多聚磷酸，苯甲醇，油浴75℃；iii)CH₂Cl₂，TFA；iv)THF，DDQ；v)CH₃OH，Pd/C，H₂；vi)DCC，HOBt，NMM，THF；vii)CH₃OH，2NNaOH；viii)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4M)。

图3.化合物5在纯水溶液中1×10^-7M浓度下的透射电镜照片。

图4.化合物5抑制肿瘤细胞增殖的活性。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备5-甲酰水杨酸甲酯

称取1.660g(10.0mmol)5-甲酰水杨酸于微波反应罐中，加入25mL甲醇及1mL浓H₂SO₄，于微波反应器中90℃反应2h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降至室温后，将反应液转移至100mL茄形瓶中，用浓氨水调pH值至7-8，将反应液减压浓缩至干后，加大量乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯层依次用饱和NaHCO₃、饱和NaCl各洗三遍，然后用无水Na₂SO₄干燥2h，过滤、减压浓缩至于，于室温放置过夜即有晶体析出，得1.635g(90.8％)目标化合物，为淡黄色针状晶体。ESI-MS(m/e)：181[M+H]⁺。

实施例2制备L-色氨酸苄酯

称取15.0g(44.4mmol)多聚磷酸于500mL茄形瓶中，加入80mL苯甲醇，使其在油浴50℃中溶解，待溶液温度上升至75℃后，称取10g(49.0mmol)L-色氨酸加入其中，75℃下反应48h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降温后，在冰浴搅拌下往反应瓶中倒入400mL无水乙醚，此时有白色固体析出，搅拌过夜后将之过滤，白色固体用200mL乙酸乙酯和10mL水悬浮，用三乙胺调溶液pH值至8左右，溶液变为澄清状，静置分液，将分离的酯层依次用饱和NaHCO₃、饱和NaCl各洗三遍，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥2h，过滤、减压浓缩至干，得12.85g(89.2％)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e)：295[M+H]⁺。

实施例3制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)

往250mL茄形瓶中加入100mLCH₂Cl₂及10mLTFA，搅拌均匀后称取11.76g(40.0mmol)L-色氨酸苄酯和7.92g(44.0mmol)5-甲酰水杨酸甲酯加入其中，数分钟后反应液变为微红色，2天后反应液变为黑色，在冰浴搅拌下缓慢滴加浓氨水将反应液调pH值至8，将反应液静置分液，将分离CH₂Cl₂层依次用饱和NaHCO₃、饱和NaCl各洗三遍，CH₂Cl₂层用无水Na₂SO₄干燥2h，过滤、减压浓缩至干，得14.59g(80％)目标化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：457[M+H]⁺。

实施例4制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)

称取1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯4.56g(10.0mmol)于250mL茄形瓶中，用干燥THF溶解，加入DDQ4.54g(20.0mmol)，数分钟后反应液变浑浊，4h后反应完全，过滤，滤出固体依次用饱和NaHCO₃、甲醇、乙醚洗，过滤，得3.75g(82.7％)目标化合物，为灰白色固体。ESI-MS(m/e)：453[M+H]⁺；Mp：190.4-191.0℃.¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝8.87(s，lH)，8.42(m，2H)，8.10(dd，J＝2.1Hz，J＝2.1Hz，1H)，7.69(d，J＝8.1Hz，1H)，7.57(m，3H)，7.37(m，3H)，7.04(d，J＝6.3Hz)，5.46(s，1H)，3.88(s，3H).¹³CNMR(75MHz，DMSO)：δ/ppm＝169.28，165.93，142.35，137.07，135.13，131.75，129.30，128.98，128.47，128.41，122.40，121.73，120.62，116.54，114.71，66.39，52.47.Elem.Anal：C₂₇H₂₀N₂O₅.C，71.67；H，4.46；N，6.19。

实施例5制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸(3)

将2.26g(5.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯混悬于120mL甲醇中，加入400mgPd/C，反应液先用真空水泵抽走空气，然后通入氢气，如此反复3次，室温下反应2天，利用TLC监测至原料斑点消失，常压过滤反应液，将反应液减压浓缩至干，得1.080g(59.7％)目标化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：361[M-H]^-；Mp：227.1-227.9℃.Elem.Anal：C₂₀H₁₄N₂O₅.C，66.30；H，3.89；N，7.73。

实施例6制备Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl

1)Boc-Tyr-Ile-OBzl的制备

将2.60g(9.3mmol)Boc-Tyr混悬于20mL干燥THF，室温搅拌下向溶液中加入1.36g(10.0mmol)HOBt，冰浴搅拌下加入2.266g(11mmol)DCC，得到反应液I，冰浴下搅拌30分钟。将3.64g(9.3mmol)Ile-OBzl混悬于20mL干燥THF中，然后逐渐加入NMM，调节pH至8-9，得到反应液II。将反应液II加入反应液I中，先在冰浴下搅拌1h，再在室温搅拌，TLC监测至原料点消失。后处理：减压过滤除去DCU，将滤液减压浓缩除去THF，残留物用150mLEA溶解，将得到的溶液置于250mL分液漏斗中，依次用5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液各洗3次，EA层用无水Na₂SO₄干燥30min，减压过滤，滤液减压浓缩至干，得3.90g(81％)标题化合物，为无色油状物。TLC条件：PE/EA，1.5∶1，R_f＝0.46.ESI-MS(m/e)：485[M+H]⁺。

2)Boc-Tyr-Ile的制备

将3.90g(8.1mmol)Boc-Tyr-Ile-OBzl溶于30mL甲醇，冰浴搅拌下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12，反应2h后，TLC监测原料点消失。后处理：用2N稀盐酸调节反应液pH至7，减压浓缩除去甲醇，残留物用2N稀盐酸调节pH至2，用EA萃取3次，合并EA层，用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水Na₂SO₄干燥30min，减压过滤，滤液减压浓缩至干，得3.14g(99％)标题化合物，为无色油状物。TLC条件：PE/EA，1.5∶1.ESI-MS(m/e)：395[M+H]⁺。

3)Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl的制备

按Boc-Tyr-Ile-OBzl的制备方法由3.14g(7.6mmol)Boc-Tyr-Ile和2.57g(7.6mmol)Gly-OBzl得4.08g(97％)标题化合物，为无色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH，30∶1，R_f＝0.27.ESI-MS(m/e)：542[M+H]⁺。

4)Boc-Tyr-Ile-Gly的制备

按Boc-Tyr-Ile的制备方法由3.99g(7.4mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl制得3.18g(96％)标题化合物，为无色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH，30∶1.ESI-MS(m/e)：453[M+H]⁺。

5)Boc-Ser-Arg(NO₂)-OBzl的制备

按Boc-Tyr-Ile-OBzl的制备方法由1.23g(6.0mmol)Boc-Ser和2.89g(6.0mmol)Arg(NO₂)-OBzl得1.15g(39％)标题化合物，为无色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH，15∶1，R_f＝0.25.ESI-MS(m/e)：498[M+H]⁺。

6)Ser-Arg(NO₂)-OBzl的制备

将1.15g(2.3mmol)Boc-Ser-Arg(NO₂)-OBzl置于50mg茄瓶中，冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中滴加11mL4NHCl/EA溶液，加干燥管，冰浴搅拌下反应2小时后TLC监测原料点消失，终止反应。后处理：搅拌下用水泵将反应液减压抽干，加EA溶解后再次用水泵减压抽干，重复三次；加无水乙醚充分混悬后静置，倾倒出乙醚，抽干产物，重复三次，得0.94g(94％)标题化合物，为无色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH，15∶1.ESI-MS(m/e)：398[M+H]⁺。

7)Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl的制备

按Boc-Tyr-Ile-OBzl的制备方法由1.17g(2.6mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly和1.13g(2.6mmol)Arg(NO₂)-OBzl得1.78g(82.4％)标题化合物，为无色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH，15∶1，R_f＝0.24.ESI-MS(m/e)：831[M+H]⁺。

8)Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl的制备

按Ser-Arg(NO₂)-OBzl的制备方法由1.78g(2.1mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl制得1.51g(94％)标题化合物，为无色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH，15∶1.ESI-MS(m/e)：731[M+H]⁺。

实施例7制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(5)

1)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl(4)的制备

按Boc-Tyr-Ile-OBzl的制备方法由0.36g(1.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸(3)和0.77g(1.0mmol)Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl得0.38g(35.8％)标题化合物，为淡黄色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH/HAc，3∶0.2∶0.1，R_f＝0.35.ESI-MS(m/e)：1074[M+H]⁺.¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝11.91(s，1H)，10.87(s，1H)，9.19(s，1H)，8.70(s，1H)，8.57(d，J＝8.1Hz，1H)，8.47(d，J＝2.1Hz，1H)，8.37(dd，J＝19.8Hz，J＝8.1Hz，2H)，8.19(m，3H)，7.95(d，J＝8.4Hz，2H)，7.68(d，J＝8.4Hz，1H)，7.60(t，J＝8.4Hz，1H)，7.34(m，7H)，7.10(d，J＝8.4Hz，2H)，6.62(d，J＝8.1Hz，2H)，5.10(s，2H)，4.81(m，2H)，4.31(m，3H)，3.98(s，3H)，3.81(m，2H)，3.57(m，2H)，3.11(m，5H)，1.90(s，1H)，1.77(m，2H)，1.66(m，1H)，1.52(m，3H)，1.17(m，1H)，0.86(m，6H).Elem.Anal：C₅₃H₅₉N₁₁O₁₄.C，59.27；H，5.54；N，14.34。

2)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(5)的制备将0.38g(0.36mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl溶于15mL甲醇中，室温搅拌下加入80mgPd/C，使用三通连接反应瓶和氢气袋，反应液先用真空水泵抽走空气，然后通入氢气，如此反复3次，室温搅拌下反应48h，利用TLC监测至原料斑点消失，减压过滤反应液，将反应液减压浓缩至干，得0.176g(52.1％)目标化合物，为灰白色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH/HAc/H₂O，2.5∶0.5∶0.25∶0.1，R_f＝0.46.HPLC：流动相(色谱乙腈/超纯水，0min，10∶90；2min，15∶85；5min，20∶80；8min，30∶70；10min，50∶50；12min，90∶10；30min，90∶10)，保留时间13.13min，纯度93.0％.ESI-MS(m/e)：940[M+H]⁺.Mp：189.3-190.2℃.IR(KBr)：3284.77，2964.59，1631.78，1444.68，1244.09，1087.85，748.38cm^-1.¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝11.91(D，1H)，10.87(s，lH)，9.19(s，1H)，8.70(s，1H)，8.57(d，J＝8.1Hz，1H)，8.47(d，J＝2.1Hz，1H)，8.37(dd，J＝19.8Hz，J＝8.1Hz，2H)，8.19(m，3H)，7.95(d，J＝8.4Hz，2H)，7.68(d，J＝8.4Hz，1H)，7.60(t，J＝8.4Hz，1H)，7.34(m，7H)，7.10(d，J＝8.4Hz，2H)，6.62(d，J＝8.1Hz，2H)，5.10(s，2H)，4.81(m，2H)，4.31(m，3H)，3.98(s，3H)，3.81(m，2H)，3.57(m，2H)，3.11(m，5H)，1.90(s，1H)，1.77(m，2H)，1.66(m，1H)，1.52(m，3H)，1.17(m，1H)，0.86(m，6H).Elem.Anal：C₄₆H₅₄N₁₀O₁₂.C，58.84；H，5.80；N，14.92。

实验例1测定化合物5的透射电镜照片

将化合物5按照1×10^-7M的浓度配置化合物的纯水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图3。结果表明，化合物5在水中均可形成纳米颗粒，直径在485nm左右。

实验例2测定化合物5对肿瘤细胞的细胞毒作用

1)本发明的化合物5用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。

2)实验用的肿瘤细胞为HepG₂(人肝细胞癌细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，Bel-7402(人肝癌细胞)，HT-29(人结肠癌细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)，A549(人肺癌细胞)，S180(小鼠腹水瘤细胞)和HCCLM3(人高转移肝癌细胞)。

3)实验方法HL-60，HT-29，Bel-7402，A549和S180细胞选用RPMI-1640培养基；HepG₂，HeLa和HCCLM3细胞选用DMEM培养基。培养基中均含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

贴壁细胞HepG2，HT-29，Bel-7402，A549，HeLa，HCCLM3和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

悬浮细胞HL60的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养48小时。每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于条件为37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

按下式求出各个浓度下化合物5抑制肿瘤细胞增殖的活性：

细胞增殖(％)＝(化合物5组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

4)结果见图4。结果表明，

在体外细胞毒试验中，评价了化合物5仅在100和200μM的高浓度对Bel-7402，HepG₂，HL60，HT-29，HeLa，S180，A549和HCCLM3等8株肿瘤细胞显示弱的细胞毒作用。

实验例3评价化合物5的体内抗肿瘤活性

1)本发明的化合物5含吐温80的生理盐水溶解，阿霉素用生理盐水溶解作为阳性对照，含吐温80的生理盐水作为阴性对照；

2)化合物5和含吐温80的生理盐水均灌胃给药，化合物5的给药剂量为10nmol/kg，含吐温80的生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g，连续给药7天，共给药7次；阿霉素腹腔给药，给药剂量为2μmol/kg，连续给药7天，共给药7次。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日口服化合物5，剂量为10nmol/kg。空白组小鼠每日口服0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素，剂量为2μmol/kg。实验进行至第8天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物5组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以表示。结果见表1。由表1可以看出，在10nmol/kg的口服剂量下，化合物5治疗组小鼠的瘤重与生理盐水组相比具显著性差异，与阿霉素组相比没有显著性差异。可见，化合物5的有效剂量比阿霉素低200倍。

表1化合物5的体内抗肿瘤活性.

n＝12；a)与生理盐水组比p＜0.01，与阿霉素组比p＞0.05。

实验例4评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞粘附活性

1)化合物3和5用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100nM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)Fn(人纤维连接蛋白)。

4)实验方法

用PBS将Fn配制成浓度为100μg/mL的溶液，按100μL/孔加入96孔培养板中，将培养板置于4℃冰箱过夜。次日，吸除未包被Fn溶液，用PBS洗1次，每孔加入含2％FBS的PBS溶液30μL封板，在37℃和5％CO₂的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长状态良好、处于对数生长期的HCCLM3细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中，每孔100μL，同时加入25μL化合物3或5的溶液，使其终浓度为20nM，在37℃和5％CO₂培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测O.D.(吸光度)值。粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率(％)＝[1-(化合物5组细胞的OD值/空白组细胞的OD值)]×100％；实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以均值±SD表示。

5)结果见表2。由表2可以看出，化合物5在20nM浓度下明显抑制HCCLM3细胞与FN粘附，粘附抑制率为24.2％。与发明人公开的YIGSR在抑制SACC-LM细胞与ECM及血小板粘附的有效浓度为1μM相比，化合物5的有效浓度降低了50倍。

表2化合物5的体外抗肿瘤细胞粘附活性

实验例5评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

1)化合物3和5用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100nM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)基质胶为matrigel。

4)实验方法

将冻存于-20℃冰箱的基质胶matrigel4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μLMatrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个，放入37℃和5％CO₂培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μLDMEM培养基，37℃和5％CO₂培养箱中孵育30min。

HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×10⁵个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物3或5的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养48小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

5)结果见表3。可以看出，在20nM浓度下化合物3与空白对照组相比，发生侵袭的细胞数显著减少，说明在该条件下化合物3具有明显的抗HCCLM3细胞侵袭作用。还可以看出，在20nM浓度下化合物5与化合物3相比，发生侵袭的细胞数也显著减少，说明在该条件下化合物5抗HCCLM3细胞侵袭作用明显比化合物3强。与发明人公开的YIGSR在抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1μM相比，化合物5的有效浓度降低了50倍。

表3化合物5的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

n＝9；a)与空白对照组和化合物3组比p＜0.01；b)与空白对照组比较p＜0.01。

实验例6评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞迁移活性

1)化合物3和5用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100nM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)实验方法

HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×10⁶个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物3或5的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养6小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

4)结果见表4。可以看出，在20nM浓度下化合物3与空白对照组相比，发生侵袭的细胞数显著减少，说明在该条件下化合物3具有明显的抗HCCLM3细胞侵袭作用。还可以看出，在20nM浓度下化合物5与化合物3相比，发生侵袭的细胞数也显著减少，说明在该条件下化合物5抗HCCLM3细胞侵袭作用明显比化合物3强。与发明人公开的YIGSR在抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1μM相比，化合物5的有效浓度降低了50倍。

表4化合物5的体外抗肿瘤细胞迁移活性

n＝9；a)与空白对照组和化合物3组比p＜0.01。

实验例7评价化合物5的体内抗炎活性

1)实验方法

18-22gICR雄性小鼠随机分为空白对照组、阳性用药组及给药组，小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次给药30分钟后往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.03mL)，2小时后将小白鼠颈椎脱臼处死。将小鼠的左，右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度。肿胀度＝左耳原片重量-右耳原片重量。

2)给药方法和剂量

灌胃给药。空白对照为生理盐水，给药剂量为0.2mL/20g。阳性对照为阿司匹林，给药剂量为1.11mmol/kg。化合物5的给药剂量为10nmol/kg.

3)统计方法

数据统计均采用t检验和方差分析，肿胀度以均值±SDmg表示。

4)结果见表5。可以看出，剂量为10nmol/kg时化合物5治疗组的鼠耳肿胀度与NS组相比具有显著性差异，说明化合物5可抑制小鼠发生炎症。剂量为10nmol/kg时化合物5治疗组的鼠耳肿胀度与剂量为1.11mmol/kg的阿司匹林治疗组的鼠耳肿胀度相比无显著性差异，说明化合物5的抗炎活性比阿司匹林强111000倍。

表5化合物5的抗炎活性

n＝12；a)与生理盐水组比p＜0.01，与阿司匹林组比p＞0.05。

实验例8评价化合物5的抗血小板聚集活性

1)花生四烯酸(AA)为血小板聚集诱导剂

2)SD雄性大鼠(清洁级)，体重250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

3)方法

大鼠用20％的乌拉坦麻醉后经颈动脉取血，加3.8％的枸橼酸钠(9∶1，v/v)抗凝，9mL全血中加1mL柠檬酸钠，以1000r/min的转速离心10分钟，取上清，即为富血小板血浆(PRP)；将剩余的全血以3000r/min的转速离心10分钟，取上清，即为贫血小板血浆(PPP)。

打开血小板聚集仪，将其系统温度调节为37℃，调节转速为1000转，预热30min。取一个玻璃小管，加入240μLPPP，放入仪器上标记有PPP的槽中。再取一个玻璃小管，放入转子，加入240μLPRP，放入仪器上标记有PRP的槽中。

打开程序，点击“runnewpatient”，输入样品名称，在用鼠标点击OK键的同时，左手按下血小板聚集仪上的侧面的黑色按钮，即可看到记录表中的曲线在上升，当曲线上升到零的时候，左手松开黑色按钮，此时可以看到随着时间的推移，曲线在基线附近稳步移动，实时描计血小板的聚集过程。

生理盐水为空白对照。待基线稳定走出1分钟左右，使用微量加样器一次性加入5μL生理盐水，可以观察到曲线在出现瞬间的上升后又继续在基线附近随时间缓缓移动，待曲线平稳后，使用微量加样器一次性加入5μL配好的AA溶液，可以观察到曲线在出现瞬间的上升后陡然下降，说明血小板在AA的诱导下发生了聚集。当曲线下降到一定程度后，出现平台期，表明血小板的聚集已经达到最大值，待曲线稳定后，记录血小板在6分钟之内的最大聚集率(仪器自动计算)，重复测定6次，求得AA作用下血小板聚集率的平均值；

化合物5为给药组。准备一管新的PRP，如上法放入仪器中，待基线稳定走出1分钟左右，使用微量加样器一次性加入5μL配好的化合物5的生理盐水溶液，可以观察到曲线在出现瞬间的上升后又继续在基线附近随时间缓缓移动，待曲线平稳后，使用微量加样器一次性加入5μL配好的AA溶液，可以观察到曲线在出现瞬间的上升后开始下降，说明血小板在AA作用下发生了聚集，当曲线下降到一定程度后，出现平台期，表明此条件下血小板的聚集已经达到最大值，待曲线稳定后，记录血小板在6分钟之内的最大聚集率(仪器自动计算)，重复测定6次，求得加入药物后，AA作用下血小板聚集率的平均值；

按以下公式计算化合物对AA诱导的血小板聚集的抑制率：抑制率＝(生理盐水组聚集率-给药组聚集率)/生理盐水组聚集率×100％；抗血小板聚集率以均值±SD表示。

4)结果见表6。可以看出，浓度为20nM时化合物5能显著的抑制AA诱导的血小板聚集。

表6化合物5的抗血小板聚集活性

n＝3；a)与生理盐水组比p＜0.01。

实验例9评价化合物5的抗血栓活性

1)实验材料

SD雄性大鼠(清洁级)，体重200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，随机分为3组，每组12只大鼠。给药方式为灌胃。空白对照为生理盐水，给药剂量为0.6mL/200g；阳性对照为阿司匹林，给药剂量为50μmol/kg。化合物5的给药剂量为10nmol/kg。

实验用插管由3段构成，中段长8.0cm，内径0.3cm，两端为相同的聚乙烯管，长10.0cm，内径0.1cm，外径0.2cm，该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或颈静脉)，3段管的内壁使用前均用1％的硅醚硅烷化。将提前称重的长6.0cm的丝线放入中段聚乙烯粗管内，粗管的两端分别与两根聚乙烯细管的未拉细端相套(其中一段将丝线压住0.5mm固定)。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。

2)模型与治疗

灌胃给予剂量为0.6mL/200g的生理盐水，或剂量为50μmol/kg的阿司匹林，或剂量为10nmol/kg的化合物530min后，将大鼠用20％的乌拉坦溶液(6mL/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离出大鼠的左侧颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将制备好的插管的未压线端尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，分离右侧颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线结扎固定。打开动脉夹，使血流通过旁路管道从颈动脉流向颈静脉。从开始循环时计时，15min后从旁路管道中取出挂有血栓的丝线，精确称重，丝线前后的质量差即为血栓湿重以均值±SDmg表示。数据统计均采用t检验和方差分析。

3)结果见表7。可以看出，化合物5治疗组大鼠的血栓湿重显著小于与生理盐水组大鼠的血栓湿重，说明化合物5在抗肿瘤生长的同时表现出了抗动脉血栓生成活性。

表7化合物5的抗血栓活性

n＝10；a)与生理盐水组比p＜0.01。

Claims (7)

1.下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg。

2.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的制备方法，该方法由以下步骤构成：

(1)在浓硫酸存在下，5-甲酰水杨酸在甲醇中微波90℃反应2h，生成5-甲酰水杨酸甲酯；

(2)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；

(3)在三氟醋酸存在下，在二氯甲烷中5-甲酰水杨酸和L-色氨酸苄酯缩合为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(4)在2，3-二氯-5，6-二腈基-1，4-苯醌(DDQ)的存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃(THF)中氧化为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(5)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯反应生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸；

(6)采用标准操作液相逐步缩合法，在DCC和HOBt存在下，在干燥THF中反应，得到全保护多肽序列Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl；

(7)在冰浴下氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)中，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl脱除Boc得到Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl；

(8)在DCC和HOBt存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸在无水THF中与Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl缩合为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl；

(9)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(NO₂)-OBzl反应得到化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg。

3.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的纳米结构。

4.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg在制备抗肿瘤细胞迁移、粘附和侵袭药物中的应用。

6.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg在制备抗炎症药物中的应用。

7.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg在制备抗血栓药物中的应用。