CN105273053A - Trp-Trp-Trp十肽修饰的β-咔啉,其制备,纳米结构,活性和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Trp-Trp-Trp十肽修饰的β-咔啉,公开了它的制备方法和纳米结构,涉及它的体内外抗肿瘤作用,涉及它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。因而本发明公开了Trp-Trp-Trp十肽修饰的β-咔啉在制备抗肿瘤药物、制备抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro。涉及它的制备方法,涉及它的纳米结构,涉及它的体内外抗肿瘤作用,涉及它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物、制备抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
技术背景
恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外,恶性肿瘤并发的炎症和转移进一步恶化患者的预后。例如,超过90%以上的恶性肿瘤患者都是死于肿瘤转移。
由于现有抗肿瘤药物不具备抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭作用,所以疗效不理想。发明同时具有抗肿瘤和抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭作用的药物是临床的迫切需求。
RGD四肽,即RGDS,RGDF和RGDV是整合素αVβ3的阻断剂,具有抗细胞粘附活性。申请人发现,Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro(LPNISKP)在1μM浓度下则能抑制HCCLM6的运动和侵袭。申请人曾经把它们与雌激素偶联,制备没有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把它们与四氢-β-咔啉-3-羧酸偶联制备高效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及1-位取代的β-咔啉-3-羧酸,包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的β-咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。下面是发明人创造的结构类型的代表。尽管发明人付出了大量研究精力,筛选了数百种化合物,一直没有得到同时具有抗肿瘤和抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭转移作用的化合物。
发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上,认识到将Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro与1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸偶联,形成的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro,会同时具有抗肿瘤和抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭作用。基于这个认识,发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供下面结构的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro。
本发明的第二个内容是提供1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的制备方法,该方法包括:
(1)在二氯亚砜(SOCl2)的存在下,L-色氨酸和甲醇反应,生成L-色氨酸甲酯;
(2)在三氟醋酸存在下,在水中4-异丙基苯甲醛(枯茗醛)和L-色氨酸甲酯缩合为(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯;
(3)在二氧化硒(SeO2)的存在下,(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯在二氧六环中氧化1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯;
(4)冰浴下在氢氧化钠的水溶液(2M)和甲醇中,1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸;
(5)采用逐步缩合法,在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下,在干燥四氢呋喃(THF)中反应,得到全保护多肽序列Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl;
(6)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4M),全保护多肽序列Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl脱除Boc得Trp-Trp-Trp-OBzl;
(7)在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下,1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸在无水四氢呋喃(THF)中与Trp-Trp-Trp-OBzl缩合为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl;
(8)冰浴下在氢氧化钠的水溶液(2M)和甲醇中,化合物1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp;
(9)采用逐步缩合法,在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下,在干燥四氢呋喃(THF)中反应,得到全保护多肽序列Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl;
(10)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4M),全保护多肽序列Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl脱除Boc得Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl;
(11)在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下,1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp在无水四氢呋喃中与Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl缩合为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl;
(12)冰浴下在氢氧化钠水溶液(2M)和甲醇中,化合物1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro。
本发明的第三个内容是测定1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的纳米结构。
本发明的第四个内容是评价1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的体外抑制肿瘤细胞增殖的作用。
本发明的第五个内容是评价1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro对荷S180小鼠肿瘤生长的抑制作用。
本发明的第六个内容是评价1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro抑制肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。
附图说明
图1.发明人创造的抗血栓或抗肿瘤活性化合物的结构类型代表,式中AA为L-氨基酸或甘氨酸。
图2.1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的合成路线.i)甲醇,氯化亚砜;ii)三氟醋酸,水;iii)二氧化硒,75℃;iv)氢氧化钠水溶液(2M),甲醇;v)苯并三氮唑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU),N-甲基吗啉,N,N-二甲基甲酰胺;vi)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC),N-羟基苯并三氮唑(HOBt),N-甲基吗啉,四氢呋喃;vii)氯化氢/乙酸乙酯(4M)。
图3.化合物8在纯水溶液中1×10-7M浓度下的透射电镜照片。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备L-色氨酸甲酯盐酸盐(1)
量100mL甲醇加入250mL茄瓶中,冰浴下向茄瓶中加入25.5mLSOCl2,塞上干燥管,搅拌30min后,加入称好的20.40g(100mmol)L-色氨酸。室温搅拌48h,TLC监测反应,当原料点消失后终止反应,减压浓缩除去溶剂,加入30mL甲醇,混匀后再次减压浓缩除去溶剂,重复操作2次。最后加入50mL乙醚,混悬30min后过滤,滤饼干燥后称量,得22.98g(90.2%)目标化合物,为灰色粉末。ESI-MS(m/e):219[M+H]+。
实施例2制备(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(2)
量100mL蒸馏水加入250mL茄瓶中,冰浴下加入10mL三氟乙酸,搅拌5min后加入20.320g(80mmol)L-色氨酸甲酯盐酸盐,搅拌至溶解,加入10.672g(88mmol)对异丙基苯甲醛,室温搅拌24h,TLC显示原料点消失,终止反应。反应物减压过滤,滤饼用乙酸乙酯溶解,用饱和NaHCO3水溶液调节pH至8。乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液萃洗3次,再用5%KHSO4水溶液萃洗1次,乙酸乙酯层静置,析出无色固体,干燥后用甲醇重结晶,得16.704g(60%)目标化合物,为无色晶状固体。ESI-MS(m/e):349.2[M+H]+。
实施例3制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯(3)
称13-92g(40mmol)(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯和5.772g(52mmol)二氧化硒加入到250mL茄瓶中,加入100mL二氧六环溶解,置于油浴中加热至75℃,反应10h,TLC监测原料点消失后终止反应。反应物冷却至室温,减压过滤,滤液减压浓缩至干,得12.384g(95%)目标化合物,为黄色固体。ESI-MS(m/e):345.2[M+H]+。
实施例4制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸(4)
称10.320g(30mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯加入250mL茄瓶中,用100mL甲醇溶解,滴加氢氧化钠水溶液(2M)至pH12,室温反应24h。TLC监测原料消失后终止反应。冰浴下,反应液用饱和硫酸氢钾水溶液调pH至7,减压浓缩除去溶剂,残留物加20mL蒸馏水溶解,再用饱和硫酸氢钾水溶液调pH至2,用乙酸乙酯萃取3次,合并的乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液萃洗3次。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥。减压过滤,滤液减压浓缩至干,得9.11g(92%)目标化合物,为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):329-2[M-H]-。
实施例5制备HCl·Trp-Trp-Trp-OBzl
1)制备L-色氨酸苄酯磷酸盐
向500mL茄瓶中依次加入16.900g(50mmol)多聚磷酸,80mL苯甲醇和10.200g(50mmol)L-色氨酸。置于油浴中加热至75℃,48h后TLC监测原料点消失,终止反应。反应物冷却至室温,加入300mL无水乙醚,冰浴下搅拌30min,过滤得15.96g(89%)目标化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):295[M+H]+。
2)制备Boc-Trp-Trp-OBzl
先后将3.344g(11mmol)Boc-L-Trp,1.782g(13.2mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)和2.719g(13.2mmol)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入250mL茄瓶中,冰浴下加入无水四氢呋喃,搅拌30分钟得到反应液。2.940g(10.0mmol)色氨酸苄酯磷酸盐用无水四氢呋喃溶解,用N-甲基吗啉(NMM)调pH至8,加入刚刚得到的反应液中,用N-甲基吗啉调节pH至9,0℃搅拌6小时,室温搅拌6小时,TLC监测原料点消失结束反应,反应液减压过滤,滤液减压浓缩,残留物加乙酸乙酯溶解,冰浴下搅拌1h。减压过滤,滤液依次用饱和NaHCO3水溶液,饱和NaCl水溶液,5%KHSO4水溶液,饱和NaCl水溶液,5%NaHCO3水溶液,饱和NaCl水溶液萃洗,各萃洗重复3次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥,过滤,滤液减压浓缩除去溶剂,残留物经硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1),得4.756g(82%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):581[M+H]+。
3)制备HCl·Trp-Trp-OBzl
将4.000g(6mmol)Boc-Trp-Trp-OBzl置于250mL茄瓶中,冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中滴加50mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M),冰浴搅拌下反应2小时后TLC监测原料点消失,终止反应。搅拌下用水泵将反应液减压抽干,加乙酸乙酯溶解后再次用水泵减压抽干,重复三次。残留物加无水乙醚充分混悬后静置,倾倒出乙醚,抽干产物,重复三次,得2.940g(95%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):481[M+H]+。
4)制备Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl
按制备Boc-Trp-Trp-OBzl的方法,由1.824g(6mmol)Boc-Trp和2.583g(5mmol)HCI·Trp-Trp-OBzl得3.14g(82%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e)767[M+H]+。
5)制备HCl·Trp-Trp-Trp-OBzl
按制备HCl·Trp-Trp-OBzl的方法,由3.14g(4.1mmol)Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl得2.74g(95%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):667[M+H]+。
实施例6制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl(5)
将1.19g(3.6mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸和1.629g(4.3mmol)苯并三氮唑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)加入250mL茄瓶中,冰浴下加入无水N,N-二甲基甲酰胺,搅拌30分钟,得到反应液。2.81g(4mmol)HCl·Trp-Trp-Trp-OBzl用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,用N-甲基吗啉(NMM)调pH至8,加入刚刚得到的反应液中,用N-甲基吗啉调节pH至9,0℃搅拌6小时,室温搅拌6小时,TLC显示原料点消失,结束反应。反应液减压过滤,滤液减压浓缩,残留物用乙酸乙酯溶解,冰浴下搅拌1h,减压过滤,滤液依次用饱和NaHCO3水溶液,饱和NaCl水溶液,5%KHSO4水溶液,饱和NaCl水溶液,5%NaHCO3水溶液,饱和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥,过滤,滤液减压浓缩,得到的无色固体经硅胶柱层析纯化(石油醚/丙酮=1∶1),得1.76g(45%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):979[M+H]+
实施例7制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp(6)
将0.98g(1mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl溶解在甲醇中,冰浴下滴加氢氧化钠水溶液(2M)至反应体系pH为12,搅拌4h后原料完全消失。反应化合物用5%KHSO4水溶液调节pH至中性,减压浓缩,残留物加入5mL蒸馏水溶解,溶液用5%KHSO4水溶液调节pH至4,用乙酸乙酯萃取三次,合并乙酸乙酯层。减压浓缩除去溶剂,得8.36g(95%)目标化合物,为灰白色固体。ESI-MS(m/e):889[M+H]+.
实施例8制备HCl·Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl
1)制备HCl·Pro-OBzl
量44mL苯甲醇倒入250mL茄瓶中,冰盐浴下滴加20mLSOCl2。搅拌30分钟后,向茄瓶中加入5.0g(43.5mmol)L-Pro,室温搅拌72小时。TLC显示原料完全消失,终止反应。反应化合物加入干燥石油醚,冰浴下搅拌30min,析出无色固体,减压过滤,滤饼用无水乙醚磨洗3次,得8.6g(82.0%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):206[M+H]+。
2)制备Boc-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl
将2.50g(6.6mmol)Boc-Lys(Fmoc),1.08g(8.0mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)和1.65g(8.0mmol)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入250mL茄瓶中,冰浴下加入无水二氯甲烷,搅拌30分钟,得到反应液。1.745g(7.2mmol)HCl·Pro-OBzl用无水DMF溶解,用N-甲基吗啉(NMM)调pH至8,加入刚刚得到的反应液中,用N-甲基吗啉调节pH至9,0℃搅拌6小时,室温搅拌6小时,TLC监测原料点消失,结束反应。反应混合物减压过滤,滤液减压浓缩,残留物用乙酸乙酯溶解,冰浴下搅拌1h,减压过滤,滤液依次用饱和NaHCO3水溶液,饱和NaCl水溶液,5%KHSO4水溶液,饱和NaCl水溶液,5%NaHCO3水溶液,饱和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥,过滤,滤液减压浓缩,残留物经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮=3∶1)纯化,得3.21g(86%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):568.1[M+H]+。
3)制备HCl-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl
将4.0g(7.0mmol)Boc-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl置于250mL茄瓶中,冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中滴加50mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M),加干燥管,冰浴搅拌2小时,TLC显示原料点消失,终止反应。搅拌下用水泵将反应液减压浓缩至干,残留物加乙酸乙酯溶解,再次用水泵减压浓缩至干。该操作重复三次。残留物加无水乙醚充分混悬后静置,倾倒出乙醚,沉淀减压抽干。该操作重复三次。得3.3g(93%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):468.1[M+H]+。
4)制备Boc-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl
按制备Boc-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl的方法,由1.6g(7.8mmol)Boc-Ser与3.5g(7.0mmol)HCl·Lys(Fmoc)-Pro-OBzl得2.2g(47%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):671.3[M+H]+。
5)制备HCl·Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl
按制备HCl·Lys(Fmoc)-Pro-OBzl的方法,由2.8g(6.7mmol)Boc-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl得到2.35g(93%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):571.3[M+H]+。
6)制备Boc-Leu-Pro-OBzl
按制备Boc-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl的方法,由3.0g(13mmol)Boc-Leu与2.9g(10.7mmol)HCl·Pro-OBzl得4.4g(89%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):419.3[M+H]+。
7)制备Boc-Leu-Pro
将2.8g(6.7mmol)Boc-Leu-Pro-OBzl溶于30mL甲醇中,室温搅拌下加入5.6mgPd/C,使用三通连接反应瓶和氢气袋,反应液先用真空水泵抽走空气,然后通入氢气,如此反复3次,室温搅拌48h,TLC显示原料点消失,反应液减压过滤,滤液减压浓缩至干,得2.1g(91%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):329.1[M+H]+。
8)制备Boc-Asn-Ile-OBzl
按制备Boc-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl的方法,由3.0g(13mmol)Boc-Asn与5.3g(13.6mmol)HCl·Ile-OBzl得2.8g(50.0%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):436.3[M+H]+。
9)制备HCl·Asn-Ile-OBzl
按制备HCl·Lys(Fmoc)-Pro-OBzl的方法,由2.8g(6.4mmol)Boc-Asn-Ile-OBzl得到2.1g(87%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):336.1[M+H]+。
10)制备Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl
按制备Boc-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl的方法,由1.8g(5.6mmol)Boc-Leu-Pro与2.1g(5.6mmol)HCl·Asn-Ile-OBzl得3.2g(89%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):646.3[M+H]+。
11)制备Boc-Leu-Pro-Asn-Ile
按制备Boc-Leu-Pro的方法,由4.4g(6.8mmol)Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl得3.5g(94%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):536.1[M+H]+。
12)制备Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl
按制备Boc-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl的方法,由3.7g(6.7mmol)Boc-Leu-Pro-Asn-Ile与4.7g(6.4mmol)HCl·Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl得7.4g(91%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1179.3[M+H]+。
13)制备HCl·Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl
按制备HCl·Lys(Fmoc)-Pro-OBzl的方法,由2.0g(1.7mmol)Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl得1.7g(91%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1079.1[M+H]+。
实施例9制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl(7)
将0.67g(0.8mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp,0.22g(1.6mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)和0.33g(1.6mmol)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入250mL茄瓶中,冰浴下加入无水二氯甲烷,搅拌30分钟,得到反应液。0.9g(0.8mmol)HCl·Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,用N-甲基吗啉(NMM)调pH至8,加入刚刚得到的反应液中,用N-甲基吗啉调节pH至9,0℃搅拌6小时,室温搅拌6小时,TLC显示原料点消失,结束反应。反应液减压过滤,滤液减压浓缩,残留物用入乙酸乙酯溶解,冰浴下搅拌1h,减压过滤,滤液依次用饱和NaHCO3水溶液,饱和NaCl水溶液,5%KHSO4水溶液,饱和NaCl水溶液,5%NaHCO3水溶液,饱和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥,过滤,滤液减压浓缩,得到的无色固体经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇=20∶1)纯化,得0.59g(38%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1951.7[M+H]+。
实施例10制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro(8)
将0.5g(0.4mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl溶解在甲醇中,冰浴下滴加氢氧化钠水溶液(2M)至pH为12,4h后原料完全消失,反应化合物用5%KHSO4水溶液调节pH至中性,减压浓缩,残留物加5ml蒸馏水溶解,用5%KHSO4水溶液调节pH至4,用乙酸乙酯萃取三次,合并的乙酸乙酯层减压浓缩,得0.4g(84%)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1638.6[M+H]+.Mp:223.0-225.9℃;(c=0.10,CH3OH).IR(KBr):3408.22,3232.70,3045.60,3001.24,2960.73,2929.87,2889.37,1759.08,1720.50,1670.35,1571.99,1519.91,1485.19,1444.68,1178.51,731.02,619.15cm-1.1HNMR(300MHz,DMSO-d6:δ/ppm=11.826(s,1H),10.848(s,1H),10.810(s,1H),10.783(s,1H),8.106(d,J=4.5Hz,2H),8.133(d,J=6.3Hz,2H),8.031-8.005(m,2H),7.989(d,J=7.8Hz,2H),7.604-7.467(m,7H),7.25-7.162(m,9H),7.039-6.843(m,7H),6.746(d,J=7.8Hz,1H)4.853(t,J=5.4Hz,1H),4.657-4.100(m,9H),3.700-3.300(m,9H),3.200-2.700(m,7H),2.650-2.350(m,2H),2.183(m,1H),1.947-1.791(m,7H),1.462-1.400(m,3H),1.400-1.200(m,10H),0.867(d,J=6.3Hz,6H),0.796(d,J=1.8Hz,6H)。
实验例1测定化合物8的透射电镜照片
将化合物8按照1×10-7M的浓度配置纯水溶液,均匀的铺在铜网上,在透射电镜(TEM,JEM-1230,JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图3。结果表明,化合物8在水中可形成纳米颗粒,直径为50-140nm。
实验例2测定化合物8对肿瘤细胞的细胞毒作用
1)本发明的化合物8用含0.1%DMSO的培养基配制成所需浓度。
2)实验用的肿瘤细胞为HepG2(人肝细胞癌细胞),HL60(人早幼粒细胞白血病细胞),Bel-7402(人肝癌细胞),HT-29(人结肠癌细胞),HeLa(人宫颈癌细胞),A549(人肺癌细胞),S180(小鼠腹水瘤细胞),H22(小鼠肝癌细胞),HCT-8(人结肠癌细胞),K562(人白血病细胞),MCF-7(人乳腺癌细胞),SH-sy5y(人神经质细胞瘤),U2OS(人骨肉瘤细胞)和HCCLM3(人高转移肝癌细胞)。
3)实验方法HL-60,HT-29,Bel-7402,A549,K562,HeLa,H22,HCT-8和S180细胞选用RPMI-1640培养基;MCF-7,SH-sy5y,U2OS,HepG2和HCCLM3细胞选用DMEM培养基。培养基中均含10%经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
贴壁细胞HepG2,HT-29,Bel-7402,A549,HeLa,HCCLM3,HCT-8,MCF-7,HCCLM3,SH-sy5y,U2OS和半贴壁细胞S180的培养:分别将生长状态良好,处于对数生长期的细胞以4×104个/mL的密度接种于96孔板,每孔100μL,置于37℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养4小时,然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物8与含0.1%DMSO的培养基配制成的溶液,每孔25μL,对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后,每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,置于37℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO,振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒),立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值,波长为570nm。
悬浮细胞HL60,K562的培养:分别将生长状态良好,处于对数生长期的细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板,每孔100μL,然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物8与含0.1%DMSO的培养基配制成的溶液,每孔25μL,对照组加入等体积的溶解样品的溶媒,置于37℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养48小时。每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,继续置于条件为37℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min,小心吸出上清液,每孔加入100μLDMSO,振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒),立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值,波长为570nm。
按下式求出各个浓度下化合物8抑制肿瘤细胞增殖的活性:
细胞增殖(%)=(化合物8组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100%,实验重复3次,以细胞增殖对药物浓度作图,按作图法求出IC50(半数有效抑制浓度)值。
4)结果见表1-3。结果表明,化合物8仅在100μM的高浓度对Bel-7402,HepG2,HL60,HT-29,HeLa,S180,A549和HCCLM3等8株肿瘤细胞显示弱的细胞毒作用。
表1化合物8对HCT-8,HeLa,K562,HL60和A549增殖的影响(IC50,均值±SDμM)
n=6
表2化合物8对SH-sy5y,MCF-7,Bel-7402,HCCLM3和S180增殖的影响(IC50,均值±SDμM)
n=6
表3化合物8对HepG2,U2OS,H22和HT-29增殖的影响(IC50,均值±SDμM)
n=6
实验例3评价化合物8的体内抗肿瘤活性
1)本发明的化合物8用含吐温80的生理盐水溶解,阿霉素和阿糖胞苷用生理盐水溶解作为阳性对照,含吐温80的生理盐水作为阴性对照;
2)化合物8和含吐温80的生理盐水均灌胃给药,化合物8的给药剂量为10nmol/kg,含吐温80的生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g,连续给药10天,共给药10次;阿霉素和阿糖胞苷腹腔给药,给药剂量分别为为2μmol/kg和8.2μmol/kg,连续给药10天,共给药10次。
3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级),体重20±2g,每组15只小鼠。
4)瘤源为小鼠S180肉瘤,购自北京大学医学部动物实验中心,自行传代维持。
5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液,用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合,将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2%台盼蓝染色,混匀后按白细胞计数方法计数,染蓝色者为死细胞,不染色者为活细胞,并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。
细胞浓度=4大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数=细胞数/mL
细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%
将存活率大于90%的瘤液用匀浆法制备成2.0×107个/mL的细胞悬液,于鼠腋皮下接种,0.2mL/只,制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后,治疗组小鼠每日口服化合物8,剂量为10nmol/kg。空白组小鼠每日口服0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素,剂量为2μmol/kg。实验进行至第8天,称小鼠体重,乙醚麻醉,脱颈椎处死小鼠,然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位,剪开皮肤,暴露肿瘤,钝性剥离,称重,按如下公式计算抑瘤率:抑瘤率%=(阴性对照组平均瘤重-化合物8组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100%。实验数据采用t检验和方差分析,瘤重以(均值±SDg)表示。结果见表4。由表4可以看出,在10nmol/kg的口服剂量下,化合物8治疗组小鼠的瘤重与生理盐水组相比具显著性差异,与阿糖胞苷组相比没有显著性差异。可见,化合物8的有效剂量比阿糖胞苷低820倍。
表4化合物8的体内抗肿瘤活性
n=15;a)与生理盐水组比p<0.01,与阿糖胞苷组比p>0.05。
实验例4评价化合物5和8的体外抗肿瘤细胞粘附活性
1)化合物5和8用含0.1%DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。
2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。
3)Fn(人纤维连接蛋白)。
4)实验方法
用PBS将Fn配制成浓度为100μg/mL的溶液,按100μL/孔加入96孔培养板中,将培养板置于4℃冰箱过夜。次日,吸除未包被Fn溶液,用PBS洗1次,每孔加入含2%FBS的PBS溶液30μL封板,在37℃和5%CO2的培养箱中孵育3小时,弃去各孔溶液。将生长状态良好、处于对数生长期的HCCLM3细胞以5×104个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中,每孔100μL,同时加入25μL化合物5或8的溶液,使其终浓度为20nM,在37℃和5%CO2培养箱中培养2小时,用PBS洗去未粘附的细胞,弃去PBS后每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,置于37℃和5%CO2培养箱中孵育4个小时,小心除去上清液后每孔加入100μLDMSO,振荡约10min溶解沉淀,立即于酶标仪570nm波长下检测O.D.(吸光度)值。粘附抑制率的计算公式如下:粘附抑制率(%)=[1-(化合物8组细胞的OD值/空白组细胞的OD值)]×100%;实验数据统计均采用t检验和方差分析,粘附抑制率以均值±SD表示。
5)结果见表5。由表5可以看出,在20nM浓度下化合物8明显抑制HCCLM3细胞与Fn粘附,粘附抑制率为32.7%。与发明人公开的Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro抑制SACC-LM细胞与ECM及血小板粘附的有效浓度为1μM相比,化合物8的有效浓度降低了50倍。
表5化合物5和8体外抗肿瘤细胞粘附活性
n=5;a)与化合物5组比p<0.01
实验例5评价化合物5和8的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
1)化合物5和8用含0.1%DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。
2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。
3)基质胶为matrigel。
4)实验方法
将冻存于-20℃冰箱的基质胶matrigel4℃过夜,变成液态;取720μL无血清DMEM培养基,加入180μLMatrigel,混匀,加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室,100μL/个,放入37℃和5%CO2培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体,每孔加入50μLDMEM培养基,37℃和5%CO2培养箱中孵育30min。
HCCLM3细胞消化之后,用无血清DMEM培养基洗3次,计数,配成细胞悬液,密度为5×105个/mL。每孔加入100μL细胞悬液,同时加入25μL同时加入25μL化合物5或8的溶液,使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1%DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基,在37℃和5%CO2培养箱中培养48小时。
用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后,用4%的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液,用PBS洗3次,用0.1%的结晶紫染液染色30min。吸除染色液,用PBS洗3次。
将Transwell上室放入含有LysisBuffer的6孔板中,室温放置20min,前后震荡使结晶紫充分溶解,用酶标仪测量混合液的O.D.(595nm)值。
侵袭抑制率=(1-给药组O.D.值/空白组O.D.值)×100%
实验数据统计均采用t检验和方差分析,侵袭抑制率以均值±SD%表示。
5)结果见表6。可以看出,在20nM浓度下化合物8可抑制HCCLM3细胞对ECM的侵袭,抑制率为45.10%。与发明人公开的Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1μM相比,化合物8的有效浓度降低了50倍。
表6化合物5和8的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
n=9;a)与化合物5组比p<0.01。
实验例6评价化合物5和8的体外抗肿瘤细胞迁移活性
1)化合物5和8用含0.1%DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。
2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。
3)实验方法
HCCLM3细胞消化之后,用无血清DMEM培养基洗3次,计数,配成细胞悬液,密度为2×106个/mL。每孔加入100μL细胞悬液,同时加入25μL同时加入25μL化合物5或8的溶液,使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1%DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基,在37℃和5%CO2培养箱中培养6小时。
用棉签擦去上室内的细胞之后,用4%的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液,用PBS洗3次,用0.1%的结晶紫染液染色30min。吸除染色液,用PBS洗3次。
在每个小室选取9个大致相同的视野观察,拍照,计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析,迁移的细胞数以均值±SD表示。
4)结果见表7。可以看出,在20nM浓度下,化合物8可抑制HCCLM3细胞迁移,抑制率为3088%。与发明人公开的Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro抑制SACCLM细胞迁移的有效浓度为1μM相比,化合物8的有效浓度降低了50倍。
表7化合物5和8的体外抗肿瘤细胞迁移活性
n=9;a)与化合物5组比p<001。
Claims (5)
1.下面结构的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro。
2.权利要求1的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的制备方法,该方法由以下步骤构成:
(1)在二氯亚砜(SOCl2)的存在下,L-色氨酸和甲醇反应,生成L-色氨酸甲酯;
(2)在三氟醋酸存在下,在水中4-异丙基苯甲醛(枯茗醛)和L-色氨酸甲酯缩合为(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯;
(3)在二氧化硒(SeO2)的存在下,(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯在二氧六环中氧化1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯;
(4)冰浴下在氢氧化钠的水溶液(2M)和甲醇中,1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸;
(5)采用逐步缩合法,在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下,在干燥四氢呋喃(THF)中反应,得到全保护多肽序列Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl;
(6)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4M),全保护多肽序列Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl脱除Boc得Trp-Trp-Trp-OBzl;
(7)在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下,1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸在无水四氢呋喃(THF)中与Trp-Trp-Trp-OBzl缩合为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl;
(8)冰浴下在氢氧化钠的水溶液(2M)和甲醇中,化合物1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp;
(9)采用逐步缩合法,在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下,在干燥四氢呋喃(THF)中反应,得到全保护多肽序列Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl;
(10)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)中,全保护多肽序列Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl脱除Boc得Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl;
(11)在N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下,1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp在无水四氢呋喃中与Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl缩合为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl;
(12)冰浴下在氢氧化钠水溶液(2M)和甲醇中,化合物1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro。
3.权利要求1的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的纳米结构。
4.权利要求1的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求1的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在制备抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移药物中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160127 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |