CN112010855B - 六环哌嗪二酮化合物，其制备、生物活性及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了下式所示的六环哌嗪二酮化合物：四氢‑β‑咔啉[3:4]并哌嗪‑2,5‑二酮并哌啶[4:5]并咪唑。公开了它的制备方法和用途。本发明的化合物除具有抗肿瘤增殖作用外，还可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，同时具有体内抗转移作用。

Description

六环哌嗪二酮化合物，其制备、生物活性及应用

技术领域

本发明涉及四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑，涉及它的制备方法，涉及它的抗肿瘤增长作用，进一步涉及它的抗肿瘤细胞迁移和侵袭以及抗肿瘤转移作用。因而本发明涉及下式的四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑在制备抗肿瘤药物，抗肿瘤转移药物及抗肿瘤和抗肿瘤转移双重作用药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

肿瘤已经成为严重威胁人类健康的常见病。例如2015年新增的肿瘤患者大约有392.9 万，其中有233.8万肿瘤患者死亡。平均每天有超过1万人被确诊为肿瘤。肿瘤转移，尤其是肿瘤向肺转移使得肿瘤死亡率逐年升高。肿瘤患者预后差的两个主要原因是:1)化疗药物的毒副作用严重；2)肿瘤转移尤其是向肺转移。目前，仍然没有能有效治疗肿瘤转移的药物用于临床。发明抗肿瘤药物，抗肿瘤转移药物及抗肿瘤和抗肿瘤转移双重作用药物是药物研究的前沿。

下式的四氢β-咔啉-3-羧酸是具有多种生物活性的药效团，下式的环组氨酸也是具有多种生物活性的药效团。发明人认识到,四氢β-咔啉-3-羧酸与环组氨酸两个药效团融合形成的下式的四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑可以是P-选择素抑制剂，应当具有抗肿瘤和抗肿瘤转移双重作用。根据这种认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下式的四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑。

本发明的第二个内容是提供制备四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑的方法，该方法包括：

(1)L-Trp在硫酸催化条件下与甲醛进行Pictet-Spengler反应，制备3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)；

(2)3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸在N,N-二甲基甲酰胺中与(Boc)₂O反应，制备3S-2- 叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)；

(3)L-His在硫酸催化条件下与甲醛进行Pictet-Spengler反应，制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑 [4:5]并哌啶-6-羧酸(3)；

(4)在甲醇和氯化亚砜条件下，制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯(4)；

(5)用3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(H)-酮作缩合剂，3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β- 咔啉-3-羧酸在无水四氢呋喃中与6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯偶联，制备2- 叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰-哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯(5)；

(6)2-叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰-哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯脱除叔丁基，加入甲醇溶解，加N-甲基吗啉调反应混合物pH为9，制备四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(6)。

本发明的第三个内容是评价四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑对 S180小鼠肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑对肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。

本发明的第五个内容是评价四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑抑制瘤向肺转移的作用。

附图说明

图1.四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑的合成路线。i)37％甲醛(HCHO), 98％浓硫酸,水,25％氨水溶液；ii)N,N-二甲基甲酰胺(DMF),(Boc)₂O,三乙胺；iii)甲醇 (MeOH),氯化亚砜(SOCl₂)；iv)四氢呋喃(THF),3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮 (DEPBT),三乙胺；v)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4M),甲醇(MeOH),N-甲基吗啉(NMM)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)

0℃及搅拌下向200mL蒸馏水中加入0.1mL浓硫酸(98％),之后加入2.04g(10.0mmol)L-Trp并搅拌至固体溶解,最后加入5mL甲醛水溶液(37％)并室温搅拌6h。TLC显示L-Trp完全消失。0℃及搅拌下向反应混合物中加入氨水溶液(25％)调pH为7。反应混合物室温静置30min,过滤收集生成的沉淀,得到2.03g(93％)标题化合物,为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):217[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝12.141(s,1H), 10.944(s,1H),7.436(s,1H),7.321(s,1H),7.032(d,2H),4.207(m,3H),2.822(m,2H)。

实施例2制备3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)

向0.972g(4.5mmol)3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)中加入10mL N,N-二甲基甲酰胺,搅拌使固体悬浮。0℃及搅拌下先往该悬浮液中加入1.275g(1.3mmol)(Boc)₂O,再加入三乙胺调pH为10。得到的溶液室温搅拌至TLC显示化合物1完全消失。反应混合物减压浓缩,得到的淡黄色油状物用40mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液先用5％硫酸氢钾水溶液洗(50mL×3)再用饱和氯化钠水溶液洗(50mL×3),乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h。过滤,滤液减压浓缩,得到的淡黄色固体在15mL二氯甲烷中超声,使固体均匀分散。过滤,得到1.106g(77％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):315[M-H]^-；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝12.769(s,1H),10.868(d,1H),7.416(d,J＝7.5Hz,1 H),7.283(m,1H),7.048(t,J＝7.2Hz,1H),6.966(t,J＝7.2Hz,1H),5.101(m,1H),4.716(t, J＝12.9Hz,1H),4.394(m,1H),3.297(d,J＝16.2Hz,1H),2.959(m,1H),1.461(d,J＝9.9 Hz,9H)。

实施例3制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸(3)

0℃及搅拌下向2.50g(16.1mmol)L-His与10mL蒸馏水的溶液中加入0.4mL浓硫酸(98％)使L-His逐渐溶解。向得到的溶液中加3mL甲醛水溶液(37％)并于60℃及加热6 h,TLC显示L-His完全消失。反应混合物于0℃搅拌,之后加25％氨水溶液调pH为7。室温静置30min,过滤。收集的固体用水及丙酮各洗三次,得到2.649g(98％)标题化合物, 为无色固体。ESI-MS(m/e):168[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝12.016(s, 1H),7.548(s,1H),5.040(d,J＝13.8Hz,1H),4.789(d,J＝14.1Hz,1H),4.277(m,1H), 3.761(m,2H)。

实施例4制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯(4)

0℃及搅拌下向120mL甲醇中滴加8mL氯化亚砜并搅拌40min。之后,加入5.01g(30mmol)6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸(3)。反应混合物室温搅拌至TLC显示化合物3完全消失。反应混合物减压浓缩,残留物用50mL甲醇溶解。溶液减压浓缩，残留物再用50mL甲醇溶解。该操作重复3次。固体用无水乙醚洗(30mL×3),得到7.129g (93％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):182[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆): δ/ppm＝12.667(s,1H),9.051(s,1H),4.710(m,1H),4.333(m,2H),3.819(s,3H),3.302(m, 1H),3.154(m,1H)。

实施例5制备2-叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰-哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯(5)

将2.212g(7.0mmol)3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2),2.134g(8.4 mmol)6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯(4)以及2.512g(8.4mmol)3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮用30mL四氢呋喃溶解。0℃与搅拌下向溶液中加3mL(21.0 mmol)三乙胺,室温搅拌至TLC显示化合物4完全消失。滤去不溶物,滤液减压浓缩。得到的棕黄色糖浆状物用80mL二氯甲烷溶解,溶液用10％的碳酸钠水溶液洗(50mL×3)及饱和氯化钠水溶液洗(50mL×3)。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥12h,过滤。滤液减压浓缩, 得到3.126g棕黄色固体。该固体经柱层析纯化,得到1.633g(52％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):502[M+Na]；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝11.917(s,1H), 10.823(s,1H),7.570(s,1H),7.436(m,1H),7.277(m,1H),7.068-6.911(m,2H), 5.682-5.397(m,2H),4.896-4.435(m,4H),3.966(m,1H),3.633(d,J＝5.7Hz,1H),3.477(s, 1H),3.396(s,1H),3.333(s,4H),3.186-2.813(m,5H),1.453-1.290(d,9H)；¹³C NMR(125 MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝171.27,171.08,154.94,136.39,135.69,135.40,131.09,126.91, 121.18,118.85,117.91,111.37,104.55,103.23,80.36,55.38,52.80,51.08,50.42,50.24,28.50, 28.44,28.35,28.19,21.80。

实施例6制备四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(6)

0℃及搅拌下将1.633g(3.4mmol)2-叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰哌啶[4:5]并咪唑 -6-羧酸甲酯(5)用25mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)溶解。得到的溶液在0℃搅拌4h, TLC显示化合物5完全消失。将反应混合物减压浓缩,残留物用20mL干燥的乙酸乙酯溶液溶解。得到的溶液再减压浓缩。该操作重复3次。得到的固体用无水乙醚洗(30mL×3),得到1.244g(95％)四氢-β-咔啉-3-甲酰哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯,为棕黄色粉末。 ESI-MS(m/e):380[M+H]⁺。

0℃及搅拌下将棕黄色四氢-β-咔啉-3-甲酰哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯粉末先用20 mL甲醇溶解,再加N-甲基吗啉调pH为9,室温搅拌至TLC显示棕黄色粉末完全消失。反应混合物减压浓缩,得到的深棕色糖浆状物通过硅胶柱层析纯化,得到0.854g(72％) 标题化合物,为淡黄色粉末。FT-ESI-MS(m/e):348.1447[M+H]⁺；Mp:210-211℃；¹H NMR (300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝12.003(s,1H),11.017(s,1H),7.565(s,1H),7.414(d,J＝ 7.8Hz,1H),7.345(d,J＝8.1Hz,1H),7.072(t,J＝7.5Hz,1H),6.978(t,J＝7.2Hz,1H), 5.427(d,J＝16.5Hz,1H),5.200(d,J＝15.6Hz,1H),4.493-4.455(m,2H),4.268(d,J＝16.5 Hz,1H),4.063(m,1H),3.251(m,1H),3.075(m,1H),2.816(t,J＝12.6Hz,2H)；¹³C NMR (125MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝164.88,164.52,136.42,135.25,130.18,126.76,121.61, 119.24,118.15,111.61,106.10,56.41,56.20,28.98,28.01。

实施例7评价化合物6对肿瘤细胞增殖的抑制作用

1)受试样品及化合物6

化合物6用含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液配制；阳性对照为阿霉素，用含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液配制；空白对照为含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液。

2)选用的肿瘤细胞：

A549(人非小细胞肺癌细胞)，95D(高转移人非小细胞肺癌细胞)，HCT-8(人结肠癌细胞)，HL-60(人白血病细胞)。这些细胞均用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基培养。L02(人正常肝细胞)用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养。

3)贴壁细胞的检测方法

选取处于对数生长期的细胞，弃去培养基并用磷酸缓冲盐溶液洗(1mL×3)。之后，往里加1ml胰蛋白酶-EDTA消化液，在5％CO₂孵箱中37℃孵育5min，显微镜下观察 80％细胞脱落。脱落的细胞加2ml完全培养基吹打混匀；3000rpm离心3min。弃上清，加入完全培养基重悬均匀，取少量细胞悬液计数。配制细胞密度为3～5×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100μL，孵育箱中孵育12h。之后，每孔或加入25μL 配制好的受试化合物溶液，或加入25μL配制好的阳性对照溶液，或加入25μL配制好的空白对照溶液，轻轻晃动96孔板混合均匀，放置孵箱中继续孵育48h。之后，每孔加入 25μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的磷酸缓冲盐溶液(5mg/mL)，继续孵育4h。弃上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，将96孔板置于细胞摇床上振摇直至整体染色均匀，用酶标仪在490nm波长处检测每孔的吸光值，利用EXCEL软件计算受试化合物对肿瘤细胞增殖的抑制率。

4)悬浮细胞的检测方法

直接制备细胞悬液。种板方法与贴壁细胞相同。加入3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的磷酸缓冲盐溶液孵育4h后，将96孔板3000rpm离心5min，吸去上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，放在细胞摇床上振摇直至整体染色均匀，用酶标仪在490nm波长处检测每孔的吸光值，利用EXCEL软件计算受试化合物对肿瘤细胞增殖的抑制率。

抑制率＝[(空白对照组平均吸光值-受试组平均吸光值)/空白对照组平均吸光值]×100％。每种测定重复三次，用GraphPad Prism软件计算IC₅₀。结果列入表1。化合物 6抑制5种肿瘤细胞增殖的IC₅₀均大于100μM，没有明显的细胞毒作用。

表1化合物6抑制肿瘤细胞增殖的IC₅₀(n＝3)

实施例8评价化合物6的抗肿瘤生长活性

1)体重20±2g的清洁级雄性ICR小鼠，购自北京维通利华动物实验技术有限公司。

2)实验分组:阳性对照为阿霉素，每组12只小鼠；空白对照为生理盐水，每组12只小鼠；受试化合物6，每组12只小鼠。

3)给药剂量与途径：阿霉素为2μmol/kg/天，按照小鼠体重0.1mL/10g腹腔注射；生理盐水，按照小鼠体重0.1mL/10g灌胃；化合物6为1μmol/kg/天，按照小鼠体重0.1mL/10 g灌胃。

4)实验方法：

采用移植性S180小鼠肉瘤模型进行评价，瘤源为小鼠S180肉瘤细胞，传自北京大学医学部动物实验中心。无菌条件下取出生长旺盛的小鼠S180腹水瘤液，1000r/min离心3min，弃上清，用生理盐水对残余物洗，再离心，弃上清。加生理盐水吹打使细胞悬浮均匀，取出少量细胞悬液，加0.2％的台盼蓝染液染色，可染色的死细胞计数，确保活细胞数目>90％。用生理盐水稀释细胞悬液制备密度为1～2×10⁷个/mL的细胞悬液，接种于小鼠右侧腋下，每只小鼠接种0.2mL。细胞数/mL＝(4大方格内活细胞数/4)×10⁴×稀释倍数，细胞存活率＝[活细胞数/(活细胞数+死细胞数)]×100％。

每日对种瘤小鼠进行观察，7天后小鼠右侧腋下长出绿豆大小的实体瘤，按照肿瘤体积将小鼠随机分组。之后连续给药10天，第十一天记录各组小鼠的体重。之后，麻醉，颈椎脱臼处死，钝性分离小鼠腋下肿瘤，称重并记录。

统计分析每组化合物的肿瘤重量，以均值±SD g表示，经t检验，p<0.05即表示具有统计学差异。实验结果列入表2。化合物6在1μmol/kg/天剂量下的抗肿瘤活性与2 μmol/kg/天剂量下阿霉素的抗肿瘤活性相当。

表2化合物6对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

n＝12；a)与生理盐水比p<0.01；b)与生理盐水比p<0.05，与阿霉素比p>0.05.

实施例9评价化合物6抗肿瘤细胞迁移的活性

1)受试样品及化合物6

化合物6用含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液配成浓度为500μM的溶液，经稀释加入96孔板，终浓度为20μM。阳性对照为RGDS四肽，用含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液配成浓度为500μM的溶液，经过稀释加入96孔板，终浓度为20μM。空白对照为含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液。

2)试剂

青霉素，链霉素及8％多聚甲醛试液均购自Solarbio公司。胎牛血清(FetalBovine Serum Australia Source，FBS)购自美国Corning公司。二甲基亚砜及胰蛋白酶-EDTA消化液购自Hyclone公司。用三蒸水将8.00g氯化钠，0.20g氯化钾，0.20g磷酸二氢钾及1.56g 十二水合磷酸氢二钠搅拌溶解，转移至1000mL容量瓶中加水定容，高压蒸汽灭菌锅灭菌即得磷酸缓冲盐溶液，备用。用三蒸水将60mg青霉素，100mg链霉素与一袋未开封的RPMI-1640培养基搅拌溶解，转移至1000mL容量瓶中加水定容即得RPMI-1640培养基，加入10％的胎牛血清并过0.22μm滤膜，瓶口处缠好密封膜，放置于4℃冰箱中保存备用。结晶紫染液购自碧云天公司。

3)实验细胞株为A549(人非小细胞肺癌细胞)，购自南京凯基公司。

4)实验方法

选取处于对数生长期的细胞，弃培养基，加磷酸缓冲盐溶液洗(1mL×3)。之后，加入1mL胰蛋白酶-EDTA消化液，在含5％CO₂的孵箱中37℃孵育5min，显微镜下观察到80％细胞脱落。脱落的细胞加入2mL完全培养基吹打，使细胞混匀混合。3000rpm离心3min，弃上清，用无血清培养洗三次，再重悬均匀。取少量细胞悬液计数，配制密度为4～6×10⁵个/mL的细胞悬液。小室上室中加入100μL细胞悬液，同时加入25μL配制好的受试化合物或化合物6的溶液，轻轻晃动使混合混匀，每板设置空白对照组及阳性对照组。小室下室加入600μL完全培养基，置于孵箱中孵育8h。

吸去上室剩余液体，加30μL磷酸缓冲盐溶液，用棉签擦去上室细胞，重复三次。吸去下室剩余液体，加入600μL4％多聚甲醛试液，固定细胞30min。取出小室，用蒸馏水清洗，吸去下室固定液，加入600μL结晶紫染液，细胞染色30min。取出小室，用蒸馏水洗净多余的结晶紫，用棉签擦净上室残余液体，晾干后拍照。

将晾干后的小室置于荧光倒置显微镜下拍照，每个小室选取9个不同的视野，固定角度与放大倍数，视野内的细胞应分布均匀，避免选取小室边缘处细胞视野，进行计数。用Image J软件对照片中的细胞数目进行统计，细胞数目以均值±SD个表示，经t检验，p<0.05即表示具有统计学差异。实验结果列入表3。在20μM的浓度下化合物6有效地抑制 A549细胞迁移。

表3化合物6对A549细胞迁移的影响

n＝3,a)与空白对照比p<0.01.

实施例10评价化合物6抑制肿瘤细胞侵袭的活性

1)受试样品及化合物6

化合物6用含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液配成500μM的浓度，经过稀释，加入96孔板后的终浓度为20μM。阳性对照为RGDS四肽，用含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液配成500μM的浓度，经过稀释，加入96孔板后的终浓度为20μM。空白对照为含0.5％二甲基亚砜的磷酸缓冲盐溶液。

2)试剂

青霉素，链霉素及8％多聚甲醛试液均购自Solarbio公司。胎牛血清及Matrigel(基质胶)购自美国Corning公司。二甲基亚砜及胰蛋白酶-EDTA消化液购自Hyclone公司。用三蒸水将8.00g氯化钠，0.20g氯化钾，0.20g磷酸二氢钾及1.56g十二水合磷酸氢二钠搅拌溶解即得磷酸缓冲盐溶液，转移至1000mL容量瓶中，加水定容，高压蒸汽灭菌锅灭菌后备用。用三蒸水将60mg青霉素，100mg链霉素与一袋未开封的RPMI-1640培养基搅拌溶解，转移至1000mL容量瓶中加水定容即得RPMI-1640培养基，加入10％的胎牛血清并过0.22μm滤膜，瓶口处缠好密封膜，放置于4℃冰箱中保存备用。结晶紫染液购自碧云天公司。

3)实验细胞株为A549(人非小细胞肺癌细胞)，购自南京凯基公司。

4)实验方法

将Matrigel基质胶从-20℃的冰箱中取出，于4℃冰箱中放置过夜使变为液态。用无血清培养基将Matrigel基质胶稀释10倍，加入Transwell小室的上室中，每孔加100μL，置于5％CO₂的孵箱中37℃孵育5h。

用移液枪将小室中的残余液体吸除，沿小室内壁加入50μL无血清的培养基，置于孵箱中孵育30min，之后吸去上室残余液体。

选取处于对数生长期的细胞，弃培养基，加磷酸缓冲盐溶液洗(1mL×3)。之后，加入1mL胰蛋白酶-EDTA消化液，置孵箱中孵育5min，显微镜下观察到80％细胞脱落。将脱落的细胞在2mL完全培养基中吹打混匀，3000rpm离心3min。弃上清，残留物用无血清培养基洗三次，再重悬均匀。取少量细胞悬液计数，配制成密度为4～6×10⁵个/mL 的细胞悬液。在每个小室上室中加入100μL细胞悬液，同时加入25μL配制好的受试化合物或化合物6的溶液，轻轻晃动使混合混匀，每板设置空白对照组及阳性对照组。小室下室加入600μL完全培养基，置于孵箱中孵育12h。

吸去上室剩余液体，加30μL磷酸缓冲盐溶液，用棉签擦去上室细胞，重复三次。吸去下室剩余液体，加入600μL4％多聚甲醛试液，固定细胞30min。取出小室，用蒸馏水清洗，吸去下室固定液，加入600μL结晶紫染液，细胞染色30min。取出小室，用蒸馏水洗净多余的结晶紫，用棉签擦净上室残余液体，晾干后拍照。

将晾干后的小室置于荧光倒置显微镜下拍照，每个小室选取9个不同的视野，固定角度与放大倍数，视野内的细胞应分布均匀，避免选取小室边缘处细胞视野，进行计数。用Image J软件对照片中的细胞数目进行统计，细胞数目以均值±SD个表示，经t检验，p<0.05即表示具有统计学差异。实验结果列入表4。在20μM浓度下化合物6有效地抑制 A549细胞侵袭。

表4化合物6对A549细胞侵袭的影响

n＝3；a)与空白对照比p<0.01

实施例11评价化合物6抑制肿瘤肺转移的活性

1)实验分组，给药剂量及途径

阳性对照为RGDS四肽，剂量为20μmol/kg/天，按照小鼠体重0.1mL/10g腹腔注射。空白对照为生理盐水，按照小鼠体重0.1mL/10g灌胃。化合物6的剂量为0.1μmol/kg/ 天，按照小鼠体重0.1mL/10g灌胃。

2)Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)购自ATCC。用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基对LLC传代培养，得到处于对数生长期的细胞。弃培养基，先加磷酸缓冲盐溶液洗(1mL×3)，再加入1mL胰蛋白酶-EDTA消化液，置5％CO₂的孵箱中37℃孵育1min，显微镜观察 80％细胞脱落。脱落的细胞加2mL含血清的培养基吹打均匀，3000rpm离心3min。弃上清，加生理盐水吹打，使细胞重悬均匀。取少量细胞悬液计数，配制细胞密度为2×10⁷个 /mL的细胞悬液，作为瘤液使用。

体重20±2g的清洁级雄性C57BL/6小鼠，购自北京维通利华动物实验技术有限公司。将瘤液接种于小鼠右侧腋下，每只小鼠接种0.2mL。每日观察～20天，可明显见到小鼠右侧腋下长出直径约为～2.0cm的实体瘤，作为瘤源备用。

3)Lewis肺癌转移模型

取出生长状况良好的瘤源鼠，经乙醚麻醉之后颈椎脱臼处死，用75％的乙醇溶液浸泡消毒，钝性分离瘤源鼠的实体瘤组织，置于无菌的表面皿中，加入4℃预冷的生理盐水，剔除坏死部分与浮血，剪碎剩余生长状况良好的瘤组织，按照体积比1:1加入生理盐水，转移至玻璃组织匀浆器内研磨，将研细后的组织液合并，用200目的尼龙筛网过滤两次，得到单细胞悬液，取少部分悬液加生理盐水稀释计数，配制密度为2×10⁷个/mL的细胞悬液，利用台盼蓝染色法，确保活细胞数目大于95％。

将细胞悬液接种于雄性C57BL/6小鼠右侧腋下，每只小鼠接种0.2mL。每日观察，至～15天可明显见到小鼠右侧腋下长出直径约为4～5mm的实体瘤，按照实体瘤的体积大小随机分组，每组12只小鼠，开始给药。连续给药10天，第十一天时，记录各组小鼠的体重，乙醚麻醉后颈椎脱臼处死，钝性分离小鼠肺部。

小鼠的肺部要求完整无损，统计肺上的转移瘤结数。瘤结数以均值±SD个表示，经t检验，p<0.05即表示具有统计学差异。实验结果列入表5。在0.1μmol/kg/天的剂量下化合物6有效地抑制肿瘤肺转移。可见，本发明有突出的技术效果。

表5化合物6抑制肿瘤肺转移活性

n＝12；a)与生理盐水比p<0.01；b)与生理盐水比p<0.01，与RGDS比p>0.05。

Claims (4)

1.下式的四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑的结构，

2.权利要求1的四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑的制备方法，该方法包括：

(1)L-Trp在硫酸催化条件下与甲醛进行Pictet-Spengler反应，制备3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

(2)3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸在N,N-二甲基甲酰胺中与(Boc)₂O反应，制备3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

(3)L-His在硫酸催化条件下与甲醛进行Pictet-Spengler反应，制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸；

(4)在甲醇和氯化亚砜条件下，制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯；

(5)3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(H)-酮作缩合剂，3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸在无水四氢呋喃中与6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯偶联，制备2-叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰-哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯；

(6)2-叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰-哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯脱除叔丁基，加入甲醇溶解，加N-甲基吗啉调反应混合物pH为9，制备四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑。

3.权利要求1的四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1的四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

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