CN112110987B - 天冬胺酰茶氨酸苯丙氨酸修饰的5-氟尿嘧啶,其合成,活性和应用 - Google Patents

天冬胺酰茶氨酸苯丙氨酸修饰的5-氟尿嘧啶,其合成,活性和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了下式的1‑[CH2CO‑Asp(Phe)‑The]‑5‑氟尿嘧啶。公开了它的制备方法,公开了它的抗肿瘤和抗肿瘤转移活性,因而本发明公开了它在制备抗肿瘤药物中的应用,在制备抗肿瘤转移药物中的应用和在制备抗肿瘤及抗肿瘤转移双重活性药物中的应用。
Figure DDA0002103338470000011

Description

天冬胺酰茶氨酸苯丙氨酸修饰的5-氟尿嘧啶,其合成,活性和应用
技术领域
本发明公开了1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶，涉及它的制备方法,涉及它的抗肿瘤活性和抗肿瘤转移活性,因而本发明公开了它在制备抗肿瘤药物中的应用,在制备抗肿瘤转移药物中的应用和在制备抗肿瘤及抗肿瘤转移双重活性药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
5-氟尿嘧啶(5-FU)是嘧啶类抗代谢的抗肿瘤药物,抗瘤谱较广。多用于治疗消化道肿瘤,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,肝癌。5-FU在临床应用中存在一些缺陷。例如口服首过效应明显,临床给药途径为静脉注射。静脉注射的半衰期不超过20min。为此,5-FU在临床应用中多采用静脉持续滴注。患者对静脉持续滴注依从性差。又例如5-FU的治疗剂量较大,对肿瘤的选择性差,会出现明显胃肠道反应(恶心,呕吐,腹泻)及骨髓抑制(血小板及白细胞数降低)等不良反应。这些缺陷限制了5-FU的临床应用。为了克服5-FU的缺陷,曾经完成了大量结构修饰。可是没有达到预期效果。发明人经过数年探索发现,在5-氟尿嘧啶的1位用CH2CO-Asp(Phe)-The修饰不仅可以在极低剂量下口服,可以避免骨髓毒性,可以增强抗肿瘤活性,而且可以获得抗肿瘤转移活性。根据这些发现,发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供下式的1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶。
Figure BDA0002103338450000011
本发明的第二个内容是提供1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶的合成方法,该方法包括：
(1)在KOH水溶液中5-氟尿嘧啶与溴乙酸60℃反应8h,然后0℃用浓盐酸处理,生成1-羧甲基-5-氟尿嘧啶；
(2)将1-羧甲基-5-氟尿嘧啶与Asp(OtBu)-OMe偶联,制备1-[CH2CO-Asp(OtBu)-OMe]-5-氟尿嘧啶；
(3)1-[CH2CO-Asp(OtBu)-OMe]-5-氟尿嘧啶在2N NaOH甲醇溶液中脱除甲酯保护基,得1-[CH2CO-Asp(OtBu)]-5-氟尿嘧啶；
(4)1-[CH2CO-Asp(OtBu)]-5-氟尿嘧啶与The-OBzl偶联,制备1-[CH2CO-Asp(OtBu)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶；
(5)1-[CH2CO-Asp(OtBu)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶在浓度为4N的氯化氢/乙酸乙酯试剂中脱除叔丁酯保护基,制备1-[CH2CO-Asp(OH)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶；
(6)1-[CH2CO-Asp(OH)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶与Phe-OBzl偶联得1-[CH2CO-Asp(Phe-OBzl)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶；
(7)1-[CH2CO-Asp(Phe-OBzl)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶经酸脱反应脱除保护基,制备1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶。
本发明的第三个内容是评价1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶的抗肿瘤活性。
本发明的第三个内容是评价1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶的抗肿瘤转移活性。
本发明的第四个内容是评价1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶的骨髓毒性。
附图说明
图1 1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶的合成路线.i)60℃,溴乙酸,浓盐酸；ii)二环己基碳二亚胺,1-羟基苯并三唑,N-甲基吗啉；iii)氢氧化钠水溶液(2M)；iv)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4M)；v)Pd/C,H2。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备1-(CH2CO2H)-5-氟尿嘧啶(1)
0℃将2.6g(20mmol)5-氟尿嘧啶(5FU)用氢氧化钾水溶液溶解。之后于60℃活化1小时。向内滴加4.14g(30mmol)溴乙酸水溶液,60℃搅拌8h。TLC检测反应完全后反应混合物冷却至室温。反应混合物于0℃用浓盐酸调节pH至5,搅拌30min。过滤,滤液滴加浓盐酸调节pH至2。0℃搅拌2.5h。过滤,滤渣用蒸馏水洗3次,晾干得3.05g(81％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e)：187[M-H]-。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.889(d,J＝2.7Hz,1H),8.069(d,J＝3.9Hz,1H),4.366(s,1H)。
实施例2制备1-[CH2CO-Asp(OtBu)-OMe]-5-氟尿嘧啶(2)
0℃将1.12g(6mmol)1-(CH2CO2H)-5-氟尿嘧啶(1)用无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解。向得到的溶液中依次加入810mg(6mmol)1-羟基苯并三唑和1.483g(7.2mmol)二环己基羰二亚胺。搅拌30min后,向反应液中加入1.57g(6.6mmol)Asp(OtBu)-OMe的DMF溶液。反应液于0℃滴加N-甲基吗啉,调节pH 8。反应液室温搅拌至TLC显示反应完全,过滤,滤饼用甲醇洗3次。将滤液减压浓缩,得淡黄色油状物。加入石油醚固化磨洗,得2.606g标题化合物,无色固体。ESI-MS(m/e)：372[M-H]-。
实施例3制备1-[CH2CO-Asp(OtBu)]-5-氟尿嘧啶(3)
将2.24g(6mmol)1-[CH2CO-Asp(OtBu)-OMe]-5-氟尿嘧啶(2)用甲醇溶解,用氢氧化钠溶液(2M)调节反应液pH值至13。持续0℃反应至TLC监测反应完全。反应用2N盐酸溶液调节pH值至中性。减压浓缩除去甲醇。0℃下继续滴加2N盐酸溶液调节pH值至2。溶液用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液洗至中性,加入无水硫酸钠干燥。过滤,滤液经减压浓缩除去溶剂,得2.00g(92％)标题化合物,无色固体。
ESI-MS(m/e)：358[M-H]-.
实施例4制备1-[CH2CO-Asp(OtBu)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶(4)
采用实施例2的方法从2.15g(6mmol)1-[CH2CO-Asp(OtBu)]-5-氟尿嘧啶(3)和1.80g(6mmol)The-OBzl,经硅胶柱层析得到2.01g(59％)标题化合物,无色固体。ESI-MS(m/e)：604[M-H]-；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.555(d,J＝8.1Hz,1H),8.437(d,J＝7.2Hz,1H),7.970(d,J＝6.6Hz,1H),7.741(s,1H),7.357(m,5H),5.105(s,2H),4.665(m,1H),4.330(s,2H),4.239(m,1H),3.040(m,2H),2.603(m,1H),2.373(m,1H),2.141(m,2H),1.988(m,1H),1.838(m,1H),0.980(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例5制备1-[CH2CO-Asp-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶(5)
0℃将363mg(0.6mmol)1-[CH2CO-Asp(OtBu)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶(4)溶于氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M),搅拌至TLC显示反应完全。之后,反应液37℃减压浓缩,使彻底除去游离氯化氢。得到的固体悬浮于5mL无水乙醚中,充分洗涤。收集沉淀,得345mg(98％)标题化合物,淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：548[M-H]-。
实施例6制备1-[CH2CO-Asp(Phe-OBzl)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶(6)
采用实施例2的方法从823mg(1.5mmol)1-[CH2CO-Asp(OH)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶(5)和704mg(1.6mmol)Phe-OBzl,经硅胶柱层析及DMF/乙醚重结晶,得754mg(64％)标题化合物,无色固体。ESI-MS(m/e)：785[M-H]-；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.848(s,1H),8.412(m,3H),7.935(d,J＝6.9Hz,1H)；7.687(s,1H),7.277(m,15H),5.073(m,4H),4.634(m,1H),4.504(m,1H),4.304(m,3H),3.052(m,4H),2.599(m,1H),2.506(m,1H)；2.131(t,J＝6.9Hz,2H),1.980(m,1H),1.852(m,1H),0.974(t,J＝7.2Hz,3H)。13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝171.9,171.8,171.3,169.6,166.9,158.0,157.8,150.2,138.7,137.3,136.3,136.1,131.3,129.8,129.6,129.1,128.8,128.7,128.4,128.2,128.1,127.0,66.4,66.3,63.8,54.4,52.9,52.3,49.9,49.8,42.9,37.4,37.3,33.8,31.9,27.0,15.1。
实施例7制备1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶(7)
将393mg(0.5mmol)1-[CH2CO-Asp(Phe-OBzl)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶(6)用二氯甲烷和甲醇混合溶液溶解并加入70mg Pd/C。之后,通入氢气,室温搅拌至TLC显示反应完全。过滤除去Pd/C,滤液减压浓缩至干。得到的固体用无水乙醚磨洗之后,用水溶解。水溶液用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8。之后,用C18柱层析纯化。收集组分冻干,得180mg(59％)标题化合物,无色固体。测定Mp:229.1～230.7℃,
Figure BDA0002103338450000041
ESI-MS(m/e)：605[M-H]-；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝9.905(s,1H),8.184(s,1H),7.990(s,1H),7.636(s,1H),7.556(d,J＝6.0Hz,1H),7.200(m,5H),4.433(m,1H),4.137(m,2H),3.822(m,1H),3.147(m,1H),3.006(m,2H),2.795(m,1H),2.417(m,2H),1.657(m,3H),1.814(m,1H),0.956(t,J＝7.2Hz,3H)。13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝176.2,174.9,173.2,170.0,169.5,168.2,162.7,140.6,129.4,129.3,128.3,126.1,57.4,54.5,51.3,37.5,36.2,33.6,32.2,31.2,29.0,15.1。
实施例8测定化合物7的抗肿瘤活性
1)化合物7以及阳性对照5-FU用生理盐水溶解,生理盐水作为空白对照。
2)化合物7,5-FU和生理盐水均灌胃,化合物7的剂量为1nmol/kg/天,5-FU的剂量为150μmol/kg/天,生理盐水的给药量为0.1mL/10g/天。
3)实验动物为清洁级ICR雄性小鼠,体重为20±2g。
4)移植性小鼠S180腹水型纤维肉瘤建模用的瘤源为S180小鼠腹水瘤细胞,购自北京大学医学部动物实验中心。取传代一周后,生长状态良好的ICR雄性小鼠(瘤源鼠),经麻醉后处死,无菌条件下取其腹腔中S 180瘤液,经1000rpm离心10min,弃去上清,残留物用少量4℃生理盐水洗涤,除去浮血和组织细胞碎片及其他非细胞成分。之后经台盼蓝染色,细胞计数并按公式计算活细胞浓度及细胞活力。
将细胞活力大于90％的瘤液用4℃生理盐水稀释,制成2×107个/mL的细胞悬液。以0.2mL/只瘤液接种于ICR小鼠右侧腋下(尽快完成接种)。每天观察小鼠腋下肿瘤生长情况。按照瘤体积进行均匀分组,每组12只。分组后小鼠,按照上面描述的剂量每天口服化合物7或5-FU或生理盐水,连续给药8天。第9天将各组小鼠称重,麻醉,眼球取血于含EDTA的取血管中,进行血常规计数,观察受试化合物对血常规细胞的影响。将小鼠处死,钝性分离小鼠腋下肿瘤组织,取出肉瘤后,称重。肿瘤重量以均值±SD g表示,用SPSS统计分析软件对实验数据进行统计学分析。结果见表1。可以看出,在1nmol/kg/天口服剂量下的化合物7能够有效抑制肿瘤的生长。可见,化合物7在低于5-FU 150000倍的剂量下仍具有抗肿瘤活性。本发明有显著的技术效果。
表1化合物7的抗肿瘤活性
Figure BDA0002103338450000051
a)与生理盐水比P<0.01,与5-氟尿嘧啶比P<0.05；n＝12.
实施例9测定化合物7的抗肿瘤细胞迁移活性
1)化合物7用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。
2)肿瘤细胞为A549(人非小细胞肺癌细胞)及95D(人高转移非小细胞肺癌细胞)均选用RPMI-1640培养基培养,培养基中均含有10％经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
3)将生长状态良好,处于对数生长期的A549细胞按照5×105个/mL的密度而95D细胞按照1×106个/mL的密度制备细胞悬液。使用无血清的培养基接种在Transwell的上室,每室加入100μL,加入化合物7(终浓度为20μM)。同时在下室加入600μL含有10％FBS的培养基,将Transwell小室放入24孔培养板中,于37℃的5％二氧化碳培养箱中培养48h,用棉签拭去上室的细胞,吸弃下室的培养基,用4％多聚甲醛固定液固定细胞0.5h,弃固定液,用PBS洗2次,用结晶紫染色10min,清水洗去浮色,用400倍显微镜观察。随机选取9个不同的视野观察细胞并计算迁移数。结果见表2。可以确认,在20μM浓度下化合物7有效地抑制肿瘤细胞迁移。此外,化合物7的活性与20μM浓度下Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)的活性无显著性差异。这是本发明的突出的技术效果。
表2化合物7对A549和95D细胞迁移的影响
Figure BDA0002103338450000052
Figure BDA0002103338450000061
a)与空白对照比P<0.01；b)与空白对照比P<0.01,与RGDS比P>0.05；n＝3.
实施例10测定化合物7的抗肿瘤细胞侵袭活性
1)化合物7用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。
2)肿瘤细胞为A549(人非小细胞肺癌细胞)及95D(人高转移非小细胞肺癌细胞)均选用RPMI-1640培养基培养,培养基中均含有10％经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
3)将生长状态良好,处于对数生长期的A549细胞按照5×105个/mL的密度而95D细胞按照1×106个/mL的密度使用无血清的培养基接种在Transwell的上室,每室加入100μL,加入化合物7(终浓度为20μM)同时在下室加入600μL含有10％FBS的培养基,将Transwell小室放入24孔培养板中,37℃的5％二氧化碳培养箱中培养48h,用棉签拭去上室的细胞,弃下室的培养基,用4％多聚甲醛固定液固定细胞0.5h,弃固定液,用PBS洗2次,用结晶紫染色10min,清水洗去浮色,用400倍显微镜观察。随机选取9个不同的视野观察细胞并计算侵袭数。结果见表3,可以看到,在20μM浓度下化合物7有效地抑制肿瘤细胞侵袭。这是本发明的突出的技术效果。
表3化合物7对A549和95D细胞侵袭的影响
Figure BDA0002103338450000062
a)与空白对照比P<0.01；b)与空白对照比P<0.01,与RGDS比P>0.05；n＝3.
实施例11测定化合物7的抗肿瘤转移活性
将本化合物7溶于生理盐水。Lewis小鼠肺癌细胞(LLC,购自ATCC)用含有10％FBS和1×105U·L-1青霉素和100mg·L-1链霉素的DMEM培养基培养。每天传代一次,富集细胞。待细胞处于对数生长期且生长状态良好时消化细胞。用生理盐水调整细胞密度至2×107个/mL。
体重为20±2g的近交系C57BL/6雄性小鼠用左手固定,用75％乙醇涂在小鼠右前肢腋窝皮肤处消毒,右手以1mL无菌注射器于消毒皮下处注射肿瘤细胞悬液,每只注射0.2mL,取接种10天生长状态良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠,乙醚麻醉后颈椎脱臼处死。用75％乙醇浸泡消毒10min,在超净台上操作剥离瘤体,选择生长良好的肿瘤组织,在无菌培养皿中剪碎,放置于玻璃组织匀浆器中研磨。研磨时按照瘤块重量(g)/生理盐水体积(mL)为1/3的比例加4℃预冷的生理盐水。研磨制得的细胞悬液用200目的尼龙网过滤,收集的细胞用生理盐水调浓度为2×107个/mL。取体重为20±2g的近交系C57BL/6雄性小鼠,左手固定小鼠,用75％乙醇涂在小鼠右前肢腋窝皮肤处消毒,右手以1mL无菌注射器于消毒皮下处注射肿瘤细胞悬液,每只注射0.2mL,接种后10天可以长成绿豆大小的肿瘤。测量肿瘤体积,肿瘤直径为4-6mm的小鼠随机分组。化合物7组小鼠每天一次口服给药,剂量为0.1nmol/kg/天,连续给10天。Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS,腹腔注射剂量为20μmol/kg/天,连续给10天)作阳性对照。空白组小鼠每日口服生理盐水,剂量为0.2mL/只/天,连续给10天。给药第11天称小鼠体重,乙醚麻醉,剖取各组小鼠的肺计算转移的瘤节数,并剖取各组小鼠的肿瘤称重。结果见表4。可以看到,化合物7有效地抑制肿瘤向肺转移。在0.1nmol/kg/天剂量下它抑制肿瘤向肺转移的活性与20μmol/kg/天剂量下RGDS的活性无显著性差异。可见,本发明有突出的技术效果。
表4化合物7的抗肿瘤转移活性
Figure BDA0002103338450000071
a)与空白对照比P<0.01,与RGDS比P>0.05；n＝10.
实施例12测定化合物7对S180小鼠的骨髓毒性
5-FU的骨髓抑制毒性主要表现在降低血液中白细胞和血小板计数。为了考察化合物7治疗的潜在骨髓毒性,本发明采用迈瑞全自动三分类血球分析仪BC3000测定了化合物7治疗的S180小鼠血液中白细胞和血小板计数。数据见表5。数据表明在1nmol/kg/天剂量下化合物7对S180小鼠血液中白细胞和血小板计数的影响与生理盐水没有差异。可见,化合物7治疗对S180小鼠没有骨髓毒性。相反,在150μmol/kg/天剂量下5-FU对S180小鼠血液中白细胞和血小板计数的影响与生理盐水有显著性差异。可见,5-FU对S180小鼠有骨髓毒性。在抗肿瘤活性与5-FU相同的前提下化合物7没有骨髓毒性,体现了本发明的突出技术效果。
表5化合物7对S180小鼠白细胞和血小板数的影响
Figure BDA0002103338450000081
a)与生理盐水比P<0.05；b)与生理盐水比P>0.05；n＝8。

Claims (5)

1.下式结构的1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶
Figure FDA0002103338440000011
2.权利要求1的1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶的制备方法,该方法包括：
(1)在KOH水溶液中5-氟尿嘧啶与溴乙酸60℃反应8h,然后0℃用浓盐酸处理,生成1-羧甲基-5-氟尿嘧啶；
(2)将1-羧甲基-5-氟尿嘧啶与Asp(OtBu)-OMe偶联,制备1-[CH2CO-Asp(OtBu)-OMe]-5-氟尿嘧啶；
(3)1-[CH2CO-Asp(OtBu)-OMe]-5-氟尿嘧啶在2N NaOH甲醇溶液中脱除甲酯保护基,得1-[CH2CO-Asp(OtBu)]-5-氟尿嘧啶；
(4)1-[CH2CO-Asp(OtBu)]-5-氟尿嘧啶与The-OBzl偶联,制备1-[CH2CO-Asp(OtBu)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶；
(5)1-[CH2CO-Asp(OtBu)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶在浓度为4N的氯化氢/乙酸乙酯试剂中脱除叔丁酯保护基,制备1-[CH2CO-Asp(OH)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶；
(6)1-[CH2CO-Asp(OH)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶与Phe-OBzl偶联得1-[CH2CO-Asp(Phe-OBzl)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶；
(7)1-[CH2CO-Asp(Phe-OBzl)-The-OBzl]-5-氟尿嘧啶经酸脱反应脱除保护基,制备1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶。
3.权利要求1的1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求1的1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
5.权利要求1的1-[CH2CO-Asp(Phe)-The]-5-氟尿嘧啶在制备具有抗肿瘤及抗肿瘤转移双重作用药物中的应用。
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