CN112010935B - 乙酰rgd修饰的六环哌嗪二酮, 其制备, 抗肿瘤活性及应用 - Google Patents

乙酰rgd修饰的六环哌嗪二酮, 其制备, 抗肿瘤活性及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了下式的1‑(CH2CO‑Arg‑Gly‑Asp‑AA)‑四氢‑β‑咔啉[3:4]并哌嗪‑2,5‑二酮并哌啶[4:5]并咪唑(式中AA为Ser残基,Phe残基及Val残基)。公开了它们的制备方法。公开了它们在制备抗肿瘤药物中的应用。
Figure DDA0002075323570000011

Description

乙酰RGD修饰的六环哌嗪二酮, 其制备, 抗肿瘤活性及应用
技术领域
本发明涉及1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5] 并咪唑。涉及它们的制备方法,涉及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
肿瘤已经成为严重威胁人类健康的常见病。例如2015年新增的肿瘤患者大约有392.9 万,其中有233.8万肿瘤患者死亡。平均每天有超过1万人被确诊为肿瘤。目前，临床应用治疗癌症的方法主要有放射疗法，化学疗法，抗体治疗和免疫治疗等。然而由于严重的副作用，药物治疗后产生多药耐药性以及昂贵的治疗价格，使得癌症的治疗再度陷入困境。发明新型的抗肿瘤药物是药物研究的前沿之一。
四氢-β-咔啉-3-羧酸是具有多种生物活性的药效团,环组氨酸也是具有多种生物活性的药效团。发明人发现,四氢-β-咔啉-3-羧酸与环组氨酸两个药效团融合形成的下式左的四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑是P-选择素抑制剂,具有抗肿瘤生长的作用。发明人认识到,在四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑的1位引入 CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA(式中AA为Ser残基,Phe残基及Val残基)生成的下式右的 1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑可具有更强的抗肿瘤作用。根据这种认识,发明人提出了本发明。
Figure BDA0002075323550000011
发明内容
本发明的第一个内容是提供下式的1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(式中AA为Ser残基,Phe残基及Val残基)。
Figure BDA0002075323550000012
本发明的第二个内容是提供制备1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(式中AA为Ser残基,Phe残基及Val残基)的方法,该方法包括:
(1)L-Trp在硫酸催化条件下与甲醛进行Pictet-Spengler反应,制备3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3- 羧酸(1)；
(2)在N,N-二甲基甲酰胺中1与(Boc)2O反应,制备3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3- 羧酸(2)；
(3)L-His在硫酸催化条件下与甲醛进行Pictet-Spengler反应,制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5] 并哌啶-6-羧酸(3)；
(4)在甲醇和氯化亚砜中由3制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯(4)；
(5)以3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(H)-酮作缩合剂,在无水四氢呋喃中2与4偶联制备2- 叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰-哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯(5)；
(6)脱除5的叔丁氧羰基保护基,溶于甲醇之后加N-甲基吗啉调pH为9制备四氢-β-咔啉[3:4] 并哌嗪-2,5-二酮并哌啶-[4:5]并咪唑(6)；
(7)在N,N-二甲基甲酰胺中6与溴乙酸苄酯反应,制备1-乙酸苄酯-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪 -2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(7)；
(8)7脱苄基制备1-乙酸-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(8)；
(9)在N,N-二甲基甲酰胺中8与Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-AA-OBzl偶联,制备1-[(CH2CO- Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-AA-OBzl]-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑 (9a-c,式中AA为Ser残基,Phe残基及Val残基)；
(10)9a-c脱保护制备1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶 [4:5]并咪唑(10a-c,式中AA为Ser残基,Phe残基及Val残基)。
本发明的第三个内容是评价1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5- 二酮并哌啶[4:5]并咪唑(式中AA为Ser残基,Phe残基及Val残基)对S180小鼠肿瘤生长的抑制作用。
附图说明
图1.1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(式中AA为Ser残基,Phe残基及Val残基)的合成路线。i)甲醛(37％),浓硫酸(98％),水,氨水溶液(25％)；ii)N,N-二甲基甲酰胺,(Boc)2O,三乙胺；iii)甲醇,氯化亚砜；iv)四氢呋喃, 3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮,三乙胺；v)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M),甲醇,N- 甲基吗啉；vi)N,N-二甲基甲酰胺,碳酸铯,溴乙酸苄酯；vii)二氯甲烷-甲醇,钯碳,氢气； viii)四氢呋喃,1-羟基苯并三唑,二环己基碳二亚胺,N-甲基吗啉；ix)甲醇,氢氧化钠水溶液(2M)；x)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)；xi)N,N-二甲基甲酰胺,2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐,N-甲基吗啉；xii)三氟醋酸,三氟甲磺酸。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl
0℃及搅拌下将1.595g(5.0mmol)Boc-L-Arg(NO2)溶于20mL四氢呋喃,然后加0.675g(5.0mmol)1-羟基苯并三唑和1.236g(6.0mmol)二环己基碳二亚胺,反应0.5h。之后加1.854g(5.5mmol)Tos·Gly-OBzl,最后反应液用N-甲基吗啉调pH为8。得到的溶液室温搅拌6h至TLC显示Boc-L-Arg(NO2)完全消失。反应混合物过滤,滤液减压浓缩,得到的淡黄色油状物用60mL乙酸乙酯溶解,得到的溶液依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗(20 mL×3),饱和氯化钠水溶液洗(20mL×3),5％硫酸氢钾水溶液洗(20mL×3),饱和氯化钠水溶液洗(20mL×3),饱和碳酸氢钠水溶液洗(20mL×3),饱和氯化钠水溶液洗(20mL×3),乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h,过滤,滤液减压浓缩,得到2.120g(90％)标题化合物, 为无色粉末,ESI-MS(m/e):467[M+H]+。
实施例2制备Boc-Arg(NO2)-Gly
0℃及搅拌下将2.120g(5.0mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl用15mL甲醇溶解,加氢氧化钠水溶液(2M)调pH为11,搅拌至TLC显示Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl完全消失。反应溶液先用饱和硫酸氢钾水溶液调pH为中性,减压浓缩,再用饱和硫酸氢钾水溶液调pH为 2,用乙酸乙酯萃取(50mL×3),合并乙酸乙酯层并用饱和氯化钠水溶液洗(30mL×3)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h,过滤,滤液减压浓缩得到1.542g(82％)标题化合物,为无色油状产物。ESI-MS(m/e):375[M-H]-。
实施例3制备Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
用实施例1的方法从1.615g(5.0mmol)Boc-L-Asp(OBzl)和1.271g(5.5mmol) L-Ser-OBzl得到2.520g(92％)标题化合物,为无色油状产物。ESI-MS(m/e):501[M+H]+。
实施例4制备Asp(OBzl)-Ser-OBzl
0℃及搅拌下将2.520g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl用30mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)溶解,搅拌4h,TLC显示Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl完全消失。反应混合物减压浓缩,残留物用20mL无水乙酸乙酯溶液溶解。得到的溶液再减压浓缩。该操作重复3次。得到的固体用无水乙醚洗(10mL×3),得到1.930g(88％)标题化合物,为淡黄色油状物。 ESI-MS(m/e):401[M+H]+。
实施例5制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
用实施例1的方法从1.542g(5.2mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和1.930g(5.0mmol) Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到2.450g(69％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):757 [M-H]-。
实施例6制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
用实施例4的方法从2.450g(3.2mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到 1.820g(85％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):659[M+H]+。
实施例7制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
用实施例1的方法从1.615g(5.0mmol)Boc-L-Asp(OBzl)和1.604g(5.5mmol) L-Phe-OBzl得到1.993g(69％)标题化合物,为无色油状产物。ESI-MS(m/e):561[M+H]+。
实施例8制备Asp(OBzl)-Phe-OBzl
用实施例4的方法从2.850g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到2.230g(88％) 标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):461[M+H]+。
实施例9制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
用实施例1的方法从1.542g(5.2mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和2.340g(5.0mmol) Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到2.924g(74％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):819 [M+H]+。
实施例10制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
用实施例4的方法从2.924g(3.6mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到 2.362g(92％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):719[M+H]+。
实施例11制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl
用实施例1的方法从1.615g(5.0mmol)Boc-L-Asp(OBzl)和1.342g(5.5mmol) L-Val-OBzl得到1.669g(65％)标题化合物,为无色油状产物。ESI-MS(m/e):513[M+H]+。
实施例12制备Asp(OBzl)-Val-OBzl
用实施例4的方法从2.560g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到1.978g(96％) 标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):413[M+H]+。
实施例13制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
用实施例1的方法从1.542g(5.2mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和2.060g(5.0mmol) Asp(OBzl)-Val-OBzl得到1.940g(62％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):771 [M+H]+。
实施例14制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
用实施例4的方法从1.940g(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到 1.589g(95％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):671[M+H]+。
实施例15制备3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)
0℃及搅拌下向200mL蒸馏水中加入0.1mL浓硫酸(98％),之后加入2.04g(10.0mmol)L-Trp并搅拌至固体溶解,最后加入5mL甲醛水溶液(37％)并室温搅拌6h。TLC显示L-Trp完全消失。0℃及搅拌下向反应混合物中加入氨水溶液(25％)调pH为7。反应混合物室温静置30min,过滤收集生成的沉淀,得到2.03g(93％)标题化合物,为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):217[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.141(s,1H), 10.944(s,1H),7.436(s,1H),7.321(s,1H),7.032(d,2H),4.207(m,3H),2.822(m,2H)。
实施例16制备3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)
向0.972g(4.5mmol)3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)中加入10mL N,N-二甲基甲酰胺,搅拌使固体悬浮。0℃及搅拌下先往该悬浮液中加入1.275g(1.3mmol)(Boc)2O,再加入三乙胺调pH为10。得到的溶液室温搅拌至TLC显示化合物1完全消失。反应混合物减压浓缩,得到的淡黄色油状物用40mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液先用5％硫酸氢钾水溶液洗(50mL×3)再用饱和氯化钠水溶液洗(50mL×3),乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h。过滤,滤液减压浓缩,得到的淡黄色固体在15mL二氯甲烷中超声，使固体均匀分散。过滤,得到1.106g(77％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):315[M-H]-；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.769(s,1H),10.868(d,1H),7.416(d,J＝7.5Hz,1 H),7.283(m,1H),7.048(t,J＝7.2Hz,1H),6.966(t,J＝7.2Hz,1H),5.101(m,1H),4.716(t, J＝12.9Hz,1H),4.394(m,1H),3.297(d,J＝16.2Hz,1H),2.959(m,1H),1.461(d,J＝9.9 Hz,9H)。
实施例17制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸(3)
0℃及搅拌下向2.50g(16.1mmol)L-His与10mL蒸馏水的溶液中加入0.4mL浓硫酸(98％)使L-His逐渐溶解。向得到的溶液中加3mL甲醛水溶液(37％)并于60℃及加热6 h,TLC显示L-His完全消失。反应混合物于0℃搅拌,之后加25％氨水溶液调pH为7。室温静置30min,过滤。收集的固体用水及丙酮各洗三次,得到2.649g(98％)标题化合物, 为无色固体。ESI-MS(m/e):168[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.016(s, 1H),7.548(s,1H),5.040(d,J＝13.8Hz,1H),4.789(d,J＝14.1Hz,1H),4.277(m,1H), 3.761(m,2H)。
实施例18制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯(4)
0℃及搅拌下向120mL甲醇中滴加8mL氯化亚砜并搅拌40min。之后,加入5.01g(30mmol)6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸(3)。反应混合物室温搅拌至TLC显示化合物3完全消失。反应混合物减压浓缩,残留物用50mL甲醇溶解。溶液减压浓缩，残留物再用50mL甲醇溶解。该操作重复3次。固体用无水乙醚洗(30mL×3),得到7.129g (93％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):182[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6): δ/ppm＝12.667(s,1H),9.051(s,1H),4.710(m,1H),4.333(m,2H),3.819(s,3H),3.302(m, 1H),3.154(m,1H)。
实施例19制备2-叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯(5)
将2.212g(7.0mmol)3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2),2.134g(8.4 mmol)6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯(4)以及2.512g(8.4mmol)3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮用30mL四氢呋喃溶解。0℃与搅拌下向溶液中加3mL(21.0 mmol)三乙胺,室温搅拌至TLC显示化合物4完全消失。滤去不溶物,滤液减压浓缩。得到的棕黄色糖浆状物用80mL二氯甲烷溶解,溶液用10％的碳酸钠水溶液洗(50mL×3)及饱和氯化钠水溶液洗(50mL×3)。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥12h,过滤。滤液减压浓缩, 得到3.126g棕黄色固体。该固体经柱层析纯化,得到1.633g(52％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):502[M+Na]；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.917(s,1H), 10.823(s,1H),7.570(s,1H),7.436(m,1H),7.277(m,1H),7.068-6.911(m,2H), 5.682-5.397(m,2H),4.896-4.435(m,4H),3.966(m,1H),3.633(d,J＝5.7Hz,1H),3.477(s, 1H),3.396(s,1H),3.333(s,4H),3.186-2.813(m,5H),1.453-1.290(d,9H)；13C NMR(125 MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝171.27,171.08,154.94,136.39,135.69,135.40,131.09,126.91, 121.18,118.85,117.91,111.37,104.55,103.23,80.36,55.38,52.80,51.08,50.42,50.24,28.50, 28.44,28.35,28.19,21.80。
实施例20制备四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(6)
0℃及搅拌下将1.633g(3.4mmol)2-叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰哌啶[4:5]并咪唑 -6-羧酸甲酯(5)用25mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)溶解。得到的溶液在0℃搅拌4h, TLC显示化合物5完全消失。将反应混合物减压浓缩,残留物用20mL干燥的乙酸乙酯溶液溶解。得到的溶液再减压浓缩。该操作重复3次。得到的固体用无水乙醚洗(30mL×3),得到1.244g(95％)四氢-β-咔啉-3-甲酰哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯,为棕黄色粉末。 ESI-MS(m/e):380[M+H]+。
0℃及搅拌下将棕黄色四氢-β-咔啉-3-甲酰哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯粉末先用20 mL甲醇溶解,再加N-甲基吗啉调pH为9,室温搅拌至TLC显示棕黄色粉末完全消失。反应混合物减压浓缩,得到的深棕色糖浆状物通过硅胶柱层析纯化,得到0.854g(72％) 标题化合物,为淡黄色粉末。FT-ESI-MS(m/e):348.1447[M+H]+；Mp:210-211℃；1H NMR (300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.003(s,1H),11.017(s,1H),7.565(s,1H),7.414(d,J＝ 7.8Hz,1H),7.345(d,J＝8.1Hz,1H),7.072(t,J＝7.5Hz,1H),6.978(t,J＝7.2Hz,1H), 5.427(d,J＝16.5Hz,1H),5.200(d,J＝15.6Hz,1H),4.493-4.455(m,2H),4.268(d,J＝16.5 Hz,1H),4.063(m,1H),3.251(m,1H),3.075(m,1H),2.816(t,J＝12.6Hz,2H)；13C NMR (125MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝164.88,164.52,136.42,135.25,130.18,126.76,121.61, 119.24,118.15,111.61,106.10,56.41,56.20,28.98,28.01。
实施例21制备1-乙酸苄酯-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(7)
将0.500g(1.4mmol)四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(6)用6mL N, N-二甲基甲酰胺溶解。之后,加入0.939g(2.8mmol)碳酸铯并搅拌20min。之后,加226μL (1.4mmol)溴乙酸苄酯。反应混合物室温搅拌5h,TLC显示化合物6完全消失。加50mL冰水猝灭反应,水层用乙酸乙酯萃取(30mL×3)。合并的乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液洗(20mL×3),用无水硫酸钠干燥12h。过滤,滤液减压浓缩,得到的棕黄色油状物经常压柱层析纯化,得到0.309g(43％)标题化合物。为无色粉末。ESI-MS(m/e):496[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.004(s,1H),7.595(s,1H),7.411-7.339(m,7H), 7.078(t,J＝7.4Hz,1H),6.987(t,J＝7.4Hz,1H),5.507(d,J＝16.7Hz,1H),5.341(d,J＝ 15.9Hz,1H),5.230(s,2H),5.095(m,2H),4.477(m,1H),4.384(m,1H),4.264(d,J＝16.6 Hz,1H),4.003(d,J＝16.0Hz,1H),3.260(m,1H),3.012(m,1H),2.890-2.685(m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝168.79,164.92,164.48,138.33,136.43,135.96,132.94,130.16,128.97,128.91,128.87,128.76,128.62,128.49,128.37,126.76,122.60,121.62,119.25, 118.15,111.63,106.09,67.11,56.50,56.40,46.17,38.20,30.89,28.06。
实施例22制备1-乙酸-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(8)
将0.536g(1.1mmol)1-乙酸苄酯-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑 (7)用20mL甲醇溶解。之后,加入6mg Pd/C,用水泵抽气3min除瓶内空气,通氢气。该操作重复三次。反应混合物室温通氢气8h至TLC显示化合物7完全消失。反应混合物滤除Pd/C,滤液减压浓缩,得到0.424g(96％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):404 [M-H]-；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.020(s,1H),7.672(s,1H),7.409(d,J＝ 7.5Hz,1H),7.348(d,J＝8.1Hz,1H),7.073(t,J＝7.5Hz,1H),6.979(t,J＝7.2Hz,1H), 5.431(d,J＝16.5Hz,1H),5.314(d,J＝15.6Hz,1H),4.851(m,2H),4.432(m,2H),4.256 (d,J＝16.5Hz,1H),4.017(d,J＝15.6Hz,1H),3.255(d,J＝13.8Hz,1H),3.019(d,J＝15.0 Hz,1H),2.782(m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝170.11,164.94,164.44, 138.10,136.42,132.21,130.13,126.74,122.78,121.62,119.25,118.16,111.63,106.08,56.39,46.49,38.13,30.59,28.04。
实施例23制备1-[CH2CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl]-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪 -2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(9a)
0℃及搅拌下将0.219g(0.4mmol)1-乙酸-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶 [4:5]并咪唑(8)用5mL N,N-二甲基甲酰胺溶解。之后加0.247g(0.6mmol)2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐及0.376g(0.5mmol) Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl,最后反应液用N-甲基吗啉调pH为8。得到的溶液室温搅拌6h至TLC显示8完全消失。反应液减压浓缩,得到的淡黄色油状物经常压柱层析纯化，得到0.181g(32％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):1068[M+Na]；1H NMR (300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.027(s,1H),8.578(d,J＝7.5Hz,1H),8.417(t,J＝5.6Hz, 1H),8.288(m,2H),7.933(s,2H),7.537(s,1H),7.342(m,13H),7.070(t,J＝7.3Hz,1H), 6.976(t,J＝7.1Hz,1H),5.427(d,J＝16.5Hz,1H),5.335(d,J＝15.8Hz,1H),5.120(m,5 H),4.787(m,3H),4.399(m,4H),4.250(d,J＝16.6Hz,1H),3.978(d,J＝15.8Hz,1H), 3.751(m,4H),3.275(d,J＝3.2Hz,1H),3.224(d,J＝3.5Hz,1H),3.220(d,J＝4.7Hz,2H), 2.997(d,J＝15.2Hz,1H),2.762(m,3H),2.579(m,1H),1.738(m,1H),1.566(m,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝171.94,171.01,170.62,170.30,169.10,167.09,164.90, 164.49,136.49,136.42,136.37,130.16,128.85,128.84,128.42,128.41,128.34,128.09,126.74, 122.60,121.61,119.23,118.14,111.63,106.07,66.42,66.16,61.53,56.43,56.39,55.52,52.92, 49.51,47.48,42.31,38.24,36.85,30.83,29.84,28.03。
实施例24制备1-[CH2CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪 -2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(9b)
用实施例23的方法从0.219g(0.4mmol)1-乙酸-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(8)及0.414g(0.5mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到0.259g(43％) 标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):1128[M+Na]；1H NMR(300MHz,DMSO-d6): δ/ppm＝11.006(s,1H),8.552(d,J＝7.8Hz,1H),8.410(d,J＝7.5Hz,1H),8.357(t,J＝5.7 Hz,1H),8.224(d,J＝8.1Hz,1H),7.887(s,2H),7.524(s,1H),7.415-7.178(m,19H),7.073 (t,J＝7.2Hz,1H),6.976(t,J＝7.2Hz,1H),5.427(d,J＝16.5Hz,1H),5.335(d,J＝15.6Hz, 1H),5.050(m,4H),4.710(m,3H),4.517-4.354(m,4H),4.249(d,J＝16.8Hz,1H),3.971 (d,J＝15.6Hz,1H),3.745(m,2H),3.345(m,7H),3.193(m,3H),3.011(m,3H),2.747(m, 3H),1.734(m,1H),1.565(m,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝171.88,171.46, 170.87,170.23,169.03,167.10,164.89,164.49,159.79,138.13,137.34,136.47,136.43,136.11, 132.51,130.17,129.59,129.15,128.86,128.82,128.77,128.48,128.44,128.36,128.33,127.07, 126.74,122.59,121.60,119.22,118.13,111.63,106.05,66.53,66.18,65.38,63.44,61.00,56.44, 56.40,54.38,52.96,49.47,47.49,42.28,38.25,36.96,36.75,30.85,29.85,28.04,15.63。
实施例25制备1-[CH2CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl]-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪 -2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(9c)
用实施例23的方法从0.385g(0.7mmol)1-乙酸-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(8)及0.543g(0.9mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到0.367g(36％) 标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):1080[M+Na]；1H NMR(300MHz,DMSO-d6): δ/ppm＝10.999(s,1H),8.541(d,J＝7.5Hz,2H),8.375(t,J＝5.4Hz,1H),8.256(d,J＝7.8 Hz,1H),8.174(d,J＝8.1Hz,1H),7.894(s,2H),7.515(s,1H),7.363(m,14H),7.072(t,J＝ 7.2Hz,1H),6.976(t,J＝7.2Hz,1H),5.425(d,J＝16.5Hz,1H),5.331(d,J＝15.6Hz,1H), 5.161(s,1H),5.077(m,4H),4.771(m,3H),4.481-4.277(m,4H),4.189(m,2H),3.971(d,J ＝15.4Hz,1H),3.753(m,2H),3.274(d,J＝3.5Hz,1H),3.220(d,J＝3.5Hz,1H),3.168(m, 2H),2.988(dd,J1＝14.9Hz,J2＝3.5Hz,1H),2.834-2.643(m,3H),2.574(d,J＝8.8Hz,1H), 2.061(m,1H),1.731(m,1H),1.560(m,3H),0.850(d,J＝6.3Hz,6H)；13C NMR(125MHz, DMSO-d6):δ/ppm＝171.85,171.53,171.10,170.25,169.18,167.13,164.89,164.51,159.79, 139.94,138.17,136.47,136.43,136.28,134.98,132.66,130.16,128.87,128.57,128.52,128.45, 128.36,126.74,122.50,121.61,120.09,119.23,118.14,111.63,106.07,70.24,66.42,66.18, 58.12,56.48,56.39,52.91,49.53,47.44,42.21,40.68,40.57,38.26,36.67,30.92,30.24,29.89, 28.03,19.38,18.58。
实施例26制备1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-Ser)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5] 并咪唑(10a)
0℃及搅拌下将0.077g(0.07mmol)1-[CH2CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl]-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(9)与1mL三氟乙酸和0.3mL三氟甲磺酸混合,搅拌0.5h至TLC显示9完全消失。反应混合物在0℃及搅拌下用水泵抽气5min,加 25mL冰冷的乙醚,溶液3000rpm离心5min,弃上清,再加25mL冰冷的乙醚,溶液3000rpm离心5min,弃上清,得到的墨绿色固体经C18纯化,得到16mg(26％)标题化合物,为黄色粉末。FT-ESI-MS(m/e):819.3206[M-H]-；Mp:191-192℃；1H NMR(300MHz, DMSO-d6):δ/ppm＝11.000(s,1H),10.179(s,1H),8.745(d,J＝8.0Hz,1H),8.679(m,2H), 7.557(s,1H),7.408(d,J＝7.8Hz,1H),7.333(m,2H),7.025(m,4H),5.424(d,J＝16.5Hz, 1H),5.329(d,J＝15.6Hz,1H),4.766(m,2H),4.472(m,1H),4.379(m,2H),4.322(m,1 H),4.256(d,J＝17.0Hz,1H),3.995(d,J＝15.9Hz,1H),3.907(m,1H),3.828(d,J＝5.7Hz, 1H),3.706(d,J＝5.6Hz,1H),3.629(m,1H),3.531(m,2H),3.282(m,9H),2.995(m,2H), 2.772(m,2H),2.601(m,1H),2.362(m,1H),1.975(m,1H),1.653(m,3H)；13C NMR(125 MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝175.52,173.47,172.69,170.98,169.01,167.17,164.90,164.54, 157.82,138.19,136.42,132.61,130.16,126.75,122.58,121.60,119.23,118.16,111.62,106.08, 62.79,56.51,56.39,55.71,52.99,50.35,47.45,43.03,41.03,38.30,38.15,30.93,30.65,28.05, 25.05；IR(cm-1):3204.94,3047.59,1644.82,1535.91,1455.21,1393.78,1333.45,1266.16, 1229.06,1190.30,1075.10,746.35,661.04。
实施例27制备1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-Phe)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5] 并咪唑(10b)
用实施例26的方法从0.089g(0.08mmol)1-[CH2CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(9)得到16mg(21％)标题化合物, 为黄色粉末。FT-ESI-MS(m/e):879.3611[M-H]-；Mp:187-188℃；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.110(s,1H),8.862(s,3H),7.544(s,1H),7.397(d,J＝7.8Hz,2H),7.339(d,J＝8.1Hz,2H),7.183-7.038(m,8H),6.970(t,J＝7.5Hz,1H),5.422(d,J＝16.5Hz,1H),5.288(d,J＝15.9Hz,1H),4.760(m,2H),4.607(t,J＝5.4Hz,1H),4.467(dd,J1＝11.7Hz,J2＝3.8Hz,1H),4.374(m,3H),4.256(d,J＝16.8Hz,1H),4.125(m,1H),3.989(d, J＝15.6Hz,2H),3.465(m,2H),3.408(m,3H),3.250(m,2H),3.149(m,1H),2.990(m,3 H),2.768(m,4H),2.251(m,1H),1.975(m,1H),1.693(m,1H),1.545(m,3H)；13C NMR (125MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝166.84,164.60,164.21,157.56,137.87,136.09,132.28, 130.19,129.87,129.54,128.17,127.85,126.72,126.40,125.74,122.22,121.25,119.20,118.88,117.80,111.31,105.68,72.79,72.47,72.28,71.22,70.88,70.56,70.23,69.91,69.59,60.64, 60.32,56.40,56.18,56.08,52.41,37.98,30.60,29.99,27.74,24.72；IR(cm-1):3261.14, 3053.21,2359.19,2339.52,1646.39,1558.45,1436.49,1397.99,1333.62,1263.35,1232.45, 1193.11,744.90,668.74。
实施例28制备1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-Val)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5] 并咪唑(10c)
用实施例26的方法从0.100g(0.09mmol)1-[CH2CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl]-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(9)得到16mg(20％)标题化合物, 为黄色粉末。FT-ESI-MS(m/e):831.3638[M-H]-；Mp:178-179℃；1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.996(s,1H),10.474(s,1H),9.848(s,1H),9.180(d,J＝8.1Hz,1H),8.879(s,1H),7.530(s,1H),7.396(d,J＝7.5Hz,1H),7.331(d,J＝7.8Hz,1H),7.083-6.944(m,5H),5.416(d,J＝16.5Hz,1H),5.282(d,J＝15.6Hz,1H),4.759(m,2H),4.373(m,3 H),4.226(m,2H),3.962(d,J＝15.9Hz,2H),3.818(m,1H),3.571(m,4H),3.299(m,7H), 2.913(m,2H),2.824-2.591(m,3H),2.180(m,2H),1.858(m,2H),1.633(s,2H),0.792(t,J ＝6.1Hz,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝176.17,174.45,170.24,168.78, 167.25,164.92,164.47,157.92,138.22,136.41,132.61,130.12,126.74,122.46,121.57,119.19,118.17,111.62,106.07,72.80,70.27,70.24,60.66,56.50,56.31,52.95,50.70,47.40,42.87, 41.03,38.29,38.08,31.74,30.86,30.49,28.05,25.01,19.86,18.67；IR(cm-1):3275.19, 3210.56,3058.83,2963.30,1644.87,1587.30,1464.19,1393.62,1333.44,1263.35,1228.19, 1193.11,745.80,672.59。
实施例29评价化合物10a-c的抗肿瘤生长活性
1)体重20±2g的清洁级雄性ICR小鼠,购自北京维通利华动物实验技术有限公司。
2)阳性对照为阿霉素及化合物6,各12只小鼠；空白对照为生理盐水,12只小鼠；化合物 10a-c,12只小鼠。
3)阿霉素腹腔注射,剂量为2μmol/kg/天,连续给药10天；化合物6口服,剂量为1 μmol/kg/天,连续给药10天；生理盐水口服,剂量为0.1mL/10g,连续给药10天；化合物 10a-c口服,剂量为0.1μmol/kg/天,连续给药10天。
4)采用移植性S180小鼠肉瘤模型进行评价,瘤源为小鼠S180肉瘤细胞,传自北京大学医学部动物实验中心。无菌条件下取出生长旺盛的小鼠S180腹水瘤液,1000r/min离心3min, 弃上清,残余细胞用生理盐水洗,再离心,弃上清。残余细胞用生理盐水吹打使悬浮均匀, 取出少量细胞悬液用台盼蓝染色(0.2％),可染色的死细胞计数,确保活细胞数>90％。用生理盐水稀释细胞悬液,制备密度为1～2×107个/mL的细胞悬液接种于小鼠右侧腋下,每只小鼠接种0.2mL。细胞数/mL＝大方格内活细胞数×104×稀释倍数,细胞存活率＝[活细胞数 /(活细胞数+死细胞数)]×100％。
每日对密度为1～2×107个/mL的细胞悬液接种小鼠观察,7天后小鼠右侧腋下长出绿豆大小的实体瘤,按照肿瘤体积将小鼠随机分组,使各组小鼠的肿瘤体积均匀分布。之后, 各组小鼠连续给药10天,第十一天记录各组小鼠的体重。之后麻醉,采血供测定P-选择素用。小鼠颈椎脱臼处死,钝性分离小鼠腋下肿瘤,统计各组小鼠的肿瘤重量,经t检验,p<0.05即有统计学差异。结果列入表1。可以看到,在0.1μmol/kg/天剂量下化合物10a-c治疗小鼠的瘤重显著小于生理盐水治疗小鼠的瘤重。此外,在0.1μmol/kg/天剂量下化合物10a-c治疗小鼠的瘤重与1μmol/kg/天剂量下化合物6治疗小鼠的瘤重及2μmol/kg/天剂量下阿霉素治疗小鼠的瘤重没有显著性差异。在口服剂量只有阿霉素腹腔注射剂量1/20时,化合物10a-c的抗肿瘤活性仍然与阿霉素同样优秀,说明本发明具有突出的技术效果。
表1化合物10a-c对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
Figure BDA0002075323550000121
a)与生理盐水比p<0.01；b)与生理盐水比p<0.01,与化合物6及阿霉素比p>0.05；n＝ 12.
实施例30评价化合物10a-c对S180荷瘤小鼠血清中P-选择素含量水平的影响
实施例29采集的S180小鼠的全血经1000rpm离心10min,收集血清,按照试剂盒描述的操作用小鼠P-选择素酶联免疫实验测定血清中的P-选择素含量。酶标包被板设P-选择素标准品孔,生理盐水治疗的小鼠血清孔,阿霉素治疗的小鼠血清孔和化合物6及10a-c 治疗的小鼠血清孔。标准品孔中加50μL不同浓度的P-选择素标准品(用来自试剂盒的标准品稀释制备)。在生理盐水治疗的小鼠血清孔,阿霉素治疗的小鼠血清孔和化合物6及 10a-c治疗的小鼠血清孔中先加40μL样品稀释液,再加10μL血清(最终稀释度为5倍)。各孔再加100μL酶标试剂,用封板膜封板,置37℃温育60min。试剂盒提供的洗涤液用蒸馏水稀释20倍,备用。小心揭掉封板膜,弃液体,甩干,各孔加满洗涤液,静置30s后弃去洗涤液。该操作重复5次,拍干。各孔先加试剂盒提供的50μL显色剂A,再加试剂盒提供的50μL显色剂B,轻轻震荡,使混匀,37℃避光显色15min。之后,各孔加50μL 试剂盒提供的终止液,终止显色反应(此时蓝色立转黄色),以空白孔为参照调零,在450 nm波长下测各孔的吸光度。测定时设空白对照孔。空白对照孔除不加样品及酶标试剂外, 其余各步操作不变。以P-选择素标准品的浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制P-选择素标准曲线,模拟直线回归方程。将生理盐水治疗的小鼠血清样品的吸光度,阿霉素治疗的小鼠血清样品的吸光度和化合物6及10a-c治疗的小鼠血清样品的吸光度代入方程式,计算血清样品中P-选择素浓度。数据以均值±SD pg/mL表示,经t检验,p<0.05即有统计学差异。结果列入表2。可以看出,化合物6及10a-c有效地降低S180小鼠血清中P-选择素含量,而阿霉素没有这种活性。可见,P-选择素是化合物6及10a-c显示抗肿瘤活性的靶点。这同样是本发明的突出的技术效果。
表2化合物10a-c对S180荷瘤小鼠血清P-选择素含量的影响
Figure BDA0002075323550000131
a)与生理盐水及阿霉素比p<0.05；b)与生理盐水及阿霉素比p<0.01；n＝12。

Claims (3)

1.下式的1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑，
Figure 509147DEST_PATH_IMAGE001
式中AA为Ser残基, Phe残基或Val残基。
2.权利要求1所述的1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑的制备方法, 该方法包括:
(1) L-Trp在硫酸催化条件下与甲醛进行Pictet-Spengler反应, 制备3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1);
(2)在N, N-二甲基甲酰胺中1与(Boc)2O反应, 制备3S-2-叔丁氧羰基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2);
(3) L-His在硫酸催化条件下与甲醛进行Pictet-Spengler反应, 制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸(3);
(4) 在甲醇和氯化亚砜中由3制备6S-4,5,6,7-四氢-咪唑[4:5]并哌啶-6-羧酸甲酯(4);
(5) 以3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(H)-酮作缩合剂,在无水四氢呋喃中2与4偶联制备2-叔丁氧羰基-四氢-β-咔啉-3-甲酰-哌啶[4:5]并咪唑-6-羧酸甲酯(5);
(6) 脱除5的叔丁氧羰基保护基, 溶于甲醇之后加N-甲基吗啉调pH为9制备四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶- [4:5]并咪唑(6);
(7) 在N, N-二甲基甲酰胺中6与溴乙酸苄酯反应, 制备1-乙酸苄酯-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(7);
(8) 7脱苄基制备1-乙酸-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(8);
(9) 在N, N-二甲基甲酰胺中8与Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-AA-OBzl偶联, 制备1-[(CH2CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-AA-OBzl]-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑(9a-c);
(10) 9a-c脱保护制备1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5]并咪唑。
3.权利要求1所述的1-(CH2CO-Arg-Gly-Asp-AA)-四氢-β-咔啉[3:4]并哌嗪-2,5-二酮并哌啶[4:5] 并咪唑在制备抗肿瘤药物中的应用。
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