CN113264978B - 一种新型基于脂毒性的分子靶向抗肿瘤氮杂甾体衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种新型基于脂毒性的分子靶向抗肿瘤氮杂甾体衍生物及其制备方法和用途 Download PDF

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CN113264978B CN202110026819.5A CN202110026819A CN113264978B CN 113264978 B CN113264978 B CN 113264978B CN 202110026819 A CN202110026819 A CN 202110026819A CN 113264978 B CN113264978 B CN 113264978B
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Abstract

本发明提供了一种新型基于脂毒性的分子靶向抗肿瘤氮杂甾体衍生物及其制备方法和用途，属于化学医药领域。该衍生物是式I所示的化合物、或其盐、或其立体异构体。本发明化合物对正常细胞毒性低或基本无毒，对肿瘤细胞系具有明显的抑制效果，特别是在体内对肝癌、肺癌等肿瘤细胞具有良好脂毒性的选择性，抑制效果显著；同时，本发明化合物可以有效通过激活SREBP1和PPARγ，抑制脂质转运MTTP，引起肿瘤细胞内脂质聚集，导致肿瘤细胞“脂毒性”。本发明化合物能够分子靶向用于治疗肝癌、肺癌等，且毒性低或者甚至于无毒，具有良好的应用前景。

Description

一种新型基于脂毒性的分子靶向抗肿瘤氮杂甾体衍生物及其 制备方法和用途
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及一种新型基于脂毒性的分子靶向抗肿瘤氮杂甾体衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
目前，在临床上应用的200多种抗肿瘤化学治疗药物中，大部分属于细胞毒性抗肿瘤药物，几乎都是以DNA或RNA作为作用靶点。这些抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时也影响正常细胞的生理生化功能，尤其是对那些增殖很快的正常细胞，例如造血细胞、消化道上皮细胞等，从而带来一系列严重毒副反应，再加上耐药性等问题成为限制这些药物应用的主要原因。药物学家和临床医生们越来越深刻地认识到，要克服这些化疗药物的不足或缺点，必须突破传统的以细胞毒为理论依据的抗肿瘤药物开发思路。
自1924年德国生理学家发现Warburg效应以来，经研究揭示了肿瘤细胞内存在一套比正常细胞更加旺盛的脂质代谢调控系统以维持肿瘤细胞的高速生长平衡，Yeh等人对手术切除结肠癌患者癌组织和癌旁组织对比研究表明，癌组织中与脂肪酸代谢相关的基因高表达。在体外研究中表明脂肪酸的加入能促进结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤细胞的增殖。一般而言，肿瘤细胞内复杂而精细的脂质代谢网络始终处于动态平衡状态。
近年来，大量研究发现，当切断肿瘤细胞生长所需脂质原料供应和能量供应时，肿瘤细胞会产生“脂饥饿”，从而抑制其生长，但当肿瘤细胞内脂质过度沉积时，也会干扰其生长甚至导致肿瘤细胞死亡，这就是肿瘤细胞内的脂毒性(Lipotoxicity)作用。为此，采取“脂饥饿”或者“脂毒性”方式，以单个基因或蛋白为靶点的抗肿瘤药物研究都受到严峻的挑战，与此同时临床实践也表明，以单个基因或蛋白为靶点的抗肿瘤药物容易影响正常组织及其细胞，且毒副作用较大，因此，开展以肿瘤细胞内脂代谢网络的多靶点非细胞毒性抗肿瘤药物研发，为新型非细胞毒性抗肿瘤药物研发提供了新的思路。
在申请人前期的中国发明专利CN95111450.6中披露了，一种全新的氮杂甾体化合物徳氮吡格(Tetrazanbigen,TNBG)，其结构如下所示：
Figure GDA0003892215720000021
TNBG是一种新型的氮杂甾体化合物，具有良好的体内外抗肿瘤活性，与其他常用抗肿瘤药物无交叉耐药性。生物学实验结果显示TNBG能激活过转录因子SREBP1(sterol-regulated element-binding protein)和氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，抑制脂质转运MTTP (microsomal triglyceride transfer protein)，引起肿瘤细胞内脂质聚集，导致肿瘤细胞“脂毒性”，为此，TNBG正是一个多靶点的以特异性引起肿瘤细胞内脂质聚集产生“脂毒性”抗肿瘤的新型非细胞毒性抗肿瘤药物。但是，TNBG脂溶性太强，水溶性质欠佳；影响使用、吸收、血药浓度以及组织浓度等，严重限制了其成药性。
发明内容
本发明，正是在TNBG的基础上，通过对其结构进行改造，创新性的得到了一系列全新的，具有良好成药性的，可用于抗肿瘤的氮杂甾体化合物。
本发明的目的是提供具有良好成药性的一种新型基于脂毒性的分子靶向抗肿瘤氮杂甾体化合物及其制备方法和用途。
本发明提供了一种式I所示的化合物、或其盐、或其立体异构体：
Figure GDA0003892215720000022
该种氮杂甾体化合物具有如下结构特点：母核结构为五个六元环，四个氮原子分别在A 环和B环的1位、4位、6位和9位。水溶性侧链主要在B环的6位、D环的16位和17位，以及E环上的R7和R8。
其中，
R1-R9选自氢、卤素、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、羟基、硝基、氨基、羧基、式II或式III；
Figure GDA0003892215720000031
n1选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000032
代表单键或双键；
R10和R11选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；以及具有取代基的甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；
n2选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000033
代表单键或双键；
n3选自1-2的整数，符号
Figure GDA0003892215720000034
代表单键或双键；
X选自氧、氮或碳；
R12选自氢、卤素、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基。
进一步地，
R1-R9选自氢、氯、溴、碘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、硝基、氨基、羧基、式II 或式III；
n1选自1-4的整数，符号
Figure GDA0003892215720000035
代表单键或双键；
R10和R11选自氢、甲基、乙基或丙基；
n2选自1-4的整数，符号
Figure GDA0003892215720000036
代表单键或双键；
n3选自1-2的整数，符号
Figure GDA0003892215720000037
代表单键或双键；
X选自氧、氮或碳；
R12选自氢或C1-C4烷基。
进一步地，所述化合物如式IV所示：
Figure GDA0003892215720000041
其中，
(1)R1-R5选自氢、氯、溴、碘、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羟基、硝基、氨基、羧基或式V；
Figure GDA0003892215720000042
n4选自1-4的整数，符号
Figure GDA0003892215720000043
代表单键或双键；
X选自氧、氮或碳；
R13-R14选自氢、甲基或乙基；
R13和R14选自1,2-乙二基、1,3-丙二基、1,4-丁二基或1,5-戊二基。
(2)R2和R5选自氢时，R1、R2和R3选自氢、氯、溴、碘、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羟基、硝基、氨基、羧基、式II或式III；
n1选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000044
代表单键或双键；
R10和R11选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；以及具有取代基的甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；
n2选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000045
代表单键或双键；
n3选自1-2的整数，符号
Figure GDA0003892215720000046
代表单键或双键；
X选自氧、氮或碳；
R10-R11选自氢、甲基或乙基；
R10和R11选自1,2-乙二基、1,3-丙二基、1,4-丁二基或1,5-戊二基。
R12选自氢、卤素、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基。
进一步地，所述化合物如式VI所示：
Figure GDA0003892215720000051
其中，
R1选自氢、式II或式III；
n1选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000053
代表单键或双键；
R10和R11选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；以及具有取代基的甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；
n2选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000054
代表单键或双键；
n3选自1-2的整数，符号
Figure GDA0003892215720000055
代表单键或双键；
X选自氧、氮或碳；
R10-R11选自氢、甲基或乙基；
R10和R11选自1,2-乙二基、1,3-丙二基、1,4-丁二基或1,5-戊二基。
R12选自氢、卤素、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基。
进一步地，所述化合物如式VII所示：
Figure GDA0003892215720000052
其中，
R2选自氢或C1-C3烷氧基；
R3选自氢、卤素、羟基或C1-C3烷氧基；
R4选自氢、羟基或C1-C3烷氧基；
R5选自氢或卤素；
R7选自氢、卤素、羟基、C1-C3烷基或C1-C2烷氧酰基；
R8选自氢、卤素、羟基、C1-C3烷氧基、哌嗪基、吗啡林基、氮杂环己烷基或吡唑基。
进一步地，所述化合物如式VIII所示：
Figure GDA0003892215720000061
其中，
R1选自氢、式II或式III；
R7选自硝基、氨基或-NHR13；
R8选自硝基、氨基或-NHR13；
R13选自式II或式III。
n1选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000063
代表单键或双键；
R10和R11选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；以及具有取代基的甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；
n2选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000064
代表单键或双键；
n3选自1-2的整数，符号
Figure GDA0003892215720000065
代表单键或双键；
X选自氧、氮或碳；
R12选自氢、卤素、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基。
进一步地，所述化合物如式IX所示：
Figure GDA0003892215720000062
其中，
R7选自-COR13或-CH2R13；
R13选自羟基、哌嗪基、吗啡林基、N,N-二甲氨基或N,N-二乙氨基。
进一步地，所述化合物如式X所示：
Figure GDA0003892215720000071
其中，
R1选自氢、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、式II或式III；
n1选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000073
代表单键或双键；
R10和R11选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；以及具有取代基的甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环丙基或环丁基；
n2选自1-8的整数，符号
Figure GDA0003892215720000074
代表单键或双键；
n3选自1-2的整数，符号
Figure GDA0003892215720000075
代表单键或双键；
X选自氧、氮或碳；
R12选自氢、卤素、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基。
进一步地，所述化合物为如下代表化合物之一：
Figure GDA0003892215720000072
Figure GDA0003892215720000081
Figure GDA0003892215720000091
本发明还提供了前述的化合物、或其盐、或其立体异构体在制备抗肿瘤药物中的用途。
进一步地，所述制备抗肿瘤药物是激活SREBP1或/和PPARγ而抑制脂质转运MTTP，引起肿瘤细胞内脂质聚集，导致脂毒性的药物。
进一步地，所述制备抗肿瘤药物是治疗癌症的药物；
优选地，所述癌症为肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、食道癌、子宫癌、结肠癌、直肠癌、鼻炎癌、淋巴癌和白血病等。
进一步地，所述的化合物、或其盐、或其立体异构体为活性成分，加上药物上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
本发明中提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS (化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
本发明中，卤素为氟、氯、溴或碘。
“烷基”是烷烃分子中少掉一个氢原子而成的烃基，例如甲基-CH3、乙基-CH2CH3等。C1～ C8烷基是指含有一个至八个碳原子的直链或支链的烃链。
“C1～C8烷氧基”是指含有一至八个碳原子的烷氧基。
本发明中，室温是25±5℃；过夜为12±2h。
本发明化合物在生物体内对正常细胞毒性低或者几乎基本无毒，对肿瘤细胞系具有明显的抑制效果，特别是对于肿瘤细胞具有良好选择性的脂毒性作用，抑制效果显著。本发明中氮杂甾体化合物是以外消旋体存在，可以有效激活SREBP1或/和PPARγ而抑制脂质转运 MTTP，引起肿瘤细胞内脂质聚集，导致脂毒性的药物。同时本发明化合物多靶点的以特异性引起肿瘤细胞内脂质聚集产生“脂毒性”抗肿瘤的新型非细胞毒性抗肿瘤药物对肝肿瘤、肺肿瘤、骨肉瘤、结肠癌等具有良好的药效。此外，本发明化合物对肿瘤具有良好的抑制活性和选择性，且毒性低或者几乎基本无毒；本发明还能用于制备脂毒性的分子靶向抗肿瘤药物，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1化合物16g对小鼠急性毒性实验LD50值曲线拟合。
图2心、肝、脾、肺、肾大体解剖图片。
图3空白和16g给药后组织HE染色结果。
图4体内抗肿瘤活性结果(Mean±SD，n＝5)。
图5化合物16g在HepG2细胞诱导周期阻滞。
图6流式细胞仪检测肝癌细胞HepG2凋亡(*P<0.05)。
图7化合物16g处理A549细胞(48h)后油红染色(×200)。
图8化合物16g对PPRE-TK转染Cos-7细胞报告基因荧光素酶水平的影响。
图9癌细胞HepG2的化合物16g蛋白印迹分析。
具体实施方式
除非另有说明，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明主要部分实验试剂：
Figure GDA0003892215720000111
Figure GDA0003892215720000121
本发明部分主要仪器：
Figure GDA0003892215720000122
Figure GDA0003892215720000131
本发明涉及制备氮杂甾体化合物的方法具有合成方便、条件温和等特点，且得到的化合物具有较强的生理和药理活性，是一种抗肿瘤，特别是实体瘤的药物。
通过下述实施例可以更好的理解本发明，但不限制本发明的内容。
实施例1：关键中间体6的合成
关键中间体6的合成路线如下：
Figure GDA0003892215720000132
其中，
1a，R2＝H，R3＝-OCH3，R4＝H，R5＝H；
1b，R2＝H，R3＝H，R4＝-OCH3，R5＝H；
1c，R2＝H，R3＝F，R4＝H，R5＝H；
1d，R2＝H，R3＝H，R4＝H，R5＝H；
2a，R2＝H，R3＝-OCH3，R4＝H，R5＝H；
2b，R2＝H，R3＝H，R4＝-OCH3，R5＝H；
2c，R2＝-OCH3，R3＝H，R4＝H，R5＝Cl；
2d，R2＝-OCH3，R3＝H，R4＝H，R5＝Br；
2e，R2＝H，R3＝F，R4＝H，R5＝H；
2f，R2＝H，R3＝H，R4＝H，R5＝H；
3a，R2＝H，R3＝-OCH3，R4＝H，R5＝H；
3b，R2＝H，R3＝H，R4＝-OCH3，R5＝H；
3c，R2＝-OCH3，R3＝H，R4＝H，R5＝Cl；
3d，R2＝-OCH3，R3＝H，R4＝H，R5＝Br；
3e，R2＝H，R3＝F，R4＝H，R5＝H；
3f，R2＝H，R3＝H，R4＝H，R5＝H；
4a，5a，6a，R2＝H，R3＝-OCH3，R4＝H，R5＝H；
4b，5b，6b，R2＝H，R3＝H，R4＝-OCH3，R5＝H；
4c，5c，6c,R2＝-OCH3，R3＝H，R4＝H，R5＝Cl；
4d，5d，6d，R2＝-OCH3，R3＝H，R4＝H，R5＝Br；
4e，5e，6e，R5＝H，R4＝H，R3＝F，R2＝H；
4f，5f，6f，R2＝H，R3＝H，R4＝H，R5＝H。
试剂和条件a为：氯乙酰氯，碳酸钠，二氯甲烷，0-10℃；
试剂和条件b为：酞酰亚胺钾，N,N-二甲基甲酰胺，回流；
试剂和条件c为：五氧化二磷,乙腈或二甲苯；
试剂和条件d为：醋酸硼氢化钠，甲醇/二氯甲烷，室温；
试剂和条件e为：水合肼，甲醇，回流；
试剂和条件f为：盐酸，乙醇，0℃。
具体制备方法如下：
(1)2-氯-N-(4-甲氧基苯乙基)乙酰胺(化合物2a)的合成：将无水碳酸钠(57g，0.538 mol，1.5eq)放入三口烧瓶中，加二氯甲烷190mL，于-5℃搅拌下加入氯乙酰氯(46mL，0.613mol，1.7eq)，用滴液漏斗将4-甲氧基苯乙胺(54g，0.359mol，1eq)溶于适量二氯甲烷中的溶液缓慢滴加到反应体系中，反应温度控制在0℃以下，反应5h，将反应液慢慢倒入水中，分出水层，用二氯甲烷萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤。减压浓缩得到淡黄色固体75g(化合物2a)，收率97％。
(2)2-(1,3-二氧异吲哚-2-基)-N-(4-甲氧基苯乙基)乙酰胺(化合物3a)的合成：将化合物2a(26.3g，0.116mol，1eq)和N,N-二甲基甲酰胺150mL置于圆底烧瓶中，搅拌下加入邻苯二甲酰亚胺钾(29g，0.157mol，1.3eq)，然后升温至110℃，反应5h，将反应液倒入冷水中，有大量白色固体析出，过滤，烘干，得到白色固体35.3g(化合物3a)，收率 90％。
(3)2-((7-甲氧基-3，4-二氢异喹啉-1-甲基)异吲哚-1，3-二酮(化合物4a)的合成：在圆底烧瓶中加入化合物3a(35.2g，0.104mol，1eq)、五氧化二磷(14.7g，0.104mol，1eq)、氯化锌(7.1g，0.052mol，0.5eq)、三氯氧磷(34.5g，0.226mol，2eq)和200mL 乙腈，搅拌下升温至90℃，反应完全后，减压蒸馏除去乙腈及三氯氧磷，将反应液倒入冰水中，用碱水调节pH值至弱碱性，析出黄色固体，抽滤，烘干得淡黄色固体32.2g(化合物 4a)，收率97％。
(4)2-((7-甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲基)异吲哚-1,3-二酮(化合物5a)的合成：在圆底烧瓶中加入化合物4a(50g，0.156mol，1eq)、100mL甲醇和250mL二氯甲烷，室温下搅拌，分批加入醋酸硼氢化钠(132g，0.448mol，4eq)，用TLC监测至反应完全，将反应液倒入水中，用氨水调pH值至碱性，出现部分固体，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，保留有机相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压除去溶剂，得到淡黄色固体35.2g(化合物5a)，收率70％。
(5)(7-甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-基)甲胺(化合物6a)的合成：向圆底烧瓶中加入化合物5a(25.1g，0.078mol，1eq)和甲醇100mL，80℃搅拌下加入80％水合肼(11mL，0.39mol，3eq)，用TLC监测至反应完全，静置冷却，过滤除去反应液中析出的絮状物，滤饼用甲醇洗涤，取母液浓缩后用饱和氯化钠溶液洗涤，加入二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩滤液得到油状物，加入无水乙醇，缓慢滴加浓盐酸调节pH值至3～4，室温下搅拌过夜，析出固体，过滤，干燥，得白色固体17.5g(化合物6a)，产率70％。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.72(s,3H),7.16(d,J＝8.5Hz, 1H),7.07(d,J＝2.5Hz,1H),6.91(dd,J＝8.5,2.6Hz,1H),4.91(d,J＝7.7Hz,1H),3.77(s,3H),3.74–3.70(m,1H),3.52–3.47(m,1H),3.41–3.35(m,2H),3.01–2.91(m,2H)。
实施例2：关键中间体9的合成
关键中间体9的合成路线如下：
Figure GDA0003892215720000161
7a，R6＝H，R7＝H，R8＝H，R9＝H；
7b，R6＝H，R7＝H，R8＝-CH3，R9＝H；
7c，R6＝H，R7＝-CH3，R8＝-CH3，R9＝H；
7d，R＝4；R6＝H，R7＝H，R8＝-Cl，R9＝H；
7e，R6＝H，R7＝-Cl，R8＝-Cl，R9＝H；
7f，R6＝H，R7＝-COOCH3，R8＝H，R9＝H；
7g，R6＝H，R7＝H，R8＝-OCH3，R9＝H；
7h，R6＝H，R7＝H，R8＝-Br，R9＝H；
7i，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000162
R9＝H；
7j，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000163
R9＝H；
7k，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000164
R9＝H；
8a，R6＝H，R7＝H，R8＝H，R9＝H；
8b，R6＝H，R7＝H，R8＝-CH3，R9＝H；
8c，R6＝H，R7＝-CH3，R8＝-CH3，R9＝H；
8d，R＝4；R6＝H，R7＝H，R8＝-Cl，R9＝H；
8e，R6＝H，R7＝-Cl，R8＝-Cl，R9＝H；
8f，R6＝H，R7＝-COOCH3，R8＝H，R9＝H；
8g，R6＝H，R7＝H，R8＝-OCH3，R9＝H；
8h，R6＝H，R7＝H，R8＝-Br，R9＝H；
8i，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000165
R9＝H；
8j，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000171
R9＝H；
8k，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000172
R9＝H；
8l，R6＝H，R7＝H，R8＝-NO2，R9＝H；
8m，R6＝H，R7＝-NO2，R8＝-NO2，R9＝H；
9a，R6＝H，R7＝H，R8＝H，R9＝H；
9b，R6＝H，R7＝H，R8＝-CH3，R9＝H；
9c，R6＝H，R7＝-CH3，R8＝-CH3，R9＝H；
9d，R＝4；R6＝H，R7＝H，R8＝-Cl，R9＝H；
9e，R6＝H，R7＝-Cl，R8＝-Cl，R9＝H；
9f，R6＝H，R7＝-COOCH3，R8＝H，R9＝H；
9g，R6＝H，R7＝H，R8＝-OCH3，R9＝H；
9h，R6＝H，R7＝H，R8＝-Br，R9＝H；
9i，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000173
R9＝H；
9j，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000174
R9＝H；
9k，R6＝H，R7＝H，
Figure GDA0003892215720000175
R9＝H；
9l，R6＝H，R7＝H，R8＝-NO2，R9＝H；
9m，R6＝H，R7＝-NO2，R8＝-NO2，R9＝H。
试剂和条件a为：草酸二乙酯，4mol/L盐酸，回流；
试剂和条件b为：三氯氧磷，N,N-二甲基甲酰胺，回流。
具体制备方法如下：
2,3-二羟基喹喔啉(化合物8a)的合成：在三口烧瓶中加入邻苯二胺54.0g、草酸二乙酯68.0mL和3mol/L盐酸250.0mL，搅拌，加热到70℃，温度维持在75～80℃，反应1.5h，缓慢冷却有析出白色固体。过滤，水洗，得白色针状晶体67.5g，收率83.4％，熔点﹥300℃。
7,8-硝基-2,3-二羟基喹喔啉(化合物8l)的合成：三口烧瓶中加入化合物8a24.3g，和96％硫酸160.0ml，搅拌，反应液冷却到0℃，迅速加入硝酸钾31.5g，反应液变成棕色并升温到50℃左右，随后缓慢降到0℃，反应30min后，升温度到室温，反应4h后，反应液变成深棕色，将反应液缓慢倒入搅拌的冰水中，冰水呈黄色浑浊状，有亮黄色粉末状固体析出。过滤，水洗涤，得黄深色粉末固体31.00g(化合物8l)，收率82.0％，熔点﹥300℃。
8-二硝基-2,3-二羟基喹喔啉(化合物8m)的合成：三口烧瓶中加入(化合物8a)24.3g，和96％硫酸190.0mL，搅拌，冰盐浴，冷却到0℃左右，迅速加入硝酸钾15.0g，反应液变成淡棕色并升温到30℃左右，随后缓慢降到0℃，反应30min，然后升温到室温，反应4h，反应液变成棕色。将反应液缓慢倒入搅拌的冰水中，冰水呈黄色浑浊状，有亮黄色粉末状固体沉淀。过滤，用水洗涤，得亮黄色粉末固体30.7g(化合物8m)，收率99％，熔点﹥300℃。
2,3-二氯喹喔啉(化合物9a)的合成：干燥的三口烧瓶中加入化合物8a 6.5g和三氯氧磷 12.00ml，搅拌油浴加热，滴加N,N-二甲基甲酰胺5.0mL，固体缓慢溶解。温度升到100℃左右开始回流，控制温度在105～110℃之间，继续回流1h后，停止加热，保持搅拌，反应液缓慢冷却，析出白色固体。将反应液慢慢倒入冰水中，产生白色烟雾并且急剧放热，渐渐地分散出大量白色固体，静置1h，过滤，用水洗涤，得灰白色固体18.8g(化合物9a)，产率92.8％，熔点147-149℃。
7,8-硝基-2,3-二氯喹喔啉(化合物9l)的合成：在三口烧瓶中加入化合物8l15.0g、三氯氧磷45.0mL和N,N-二甲基甲酰胺10.0mL，搅拌，加热到105℃左右，反应液呈红棕色，反应温度在105-110℃之间，反应135min，将反应液缓慢冷至室温，然后将其缓慢放入冰水中，搅拌，过滤，水洗，干燥后，用热氯仿溶解，抽滤，将滤液浓缩到30mL，有白色固体析出，过滤，得米白色颗粒状固体13.7g(化合物9l)，收率80.6％，熔点213～215℃。
8-二硝基-2,3-二氯喹喔啉(化合物9m)的合成：干燥的三口烧瓶中加入化合物8m9.0g、二噁烷50.0mL，N,N-二甲基甲酰胺2.0mL，二氯亚砜10.0mL。搅拌，加热升温到100℃左右，反应液呈棕色，反应4小时，将反应液缓慢冷至室温，旋转蒸发除去溶剂，得黄色固体7.5g (化合物9m)，收率71.4％，熔点146～148℃。
实施例3：TNBG类似物10a-s的合成
TNBG类似物10a-s的合成路线如下：
Figure GDA0003892215720000181
10a，R1＝H,R2＝H,R3＝-OCH3,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝H，R9＝H；
10b，R1＝H,R2＝H,R3＝-OH,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝H,R9＝H；
10c，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝-OCH3,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝H,R9＝H；
10d，R1＝H,R2＝-OCH3,R3＝H,R4＝H,R5＝Cl,R6＝H,R7＝H,R8＝H,R9＝H；
10e，R1＝H,R2＝-OH,R3＝H,R4＝H,R5＝Cl,R6＝H,R7＝H,R8＝H,R9＝H；
10f，R1＝H,R2＝-OCH3,R3＝H,R4＝H,R5＝Br,R6＝H,R7＝H,R8＝H,R9＝H；
10g，R1＝H,R2＝H,R3＝F,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝H,R9＝H；
10h，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝H,R9＝H；
10i，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝CH3,R9＝H；
10j，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝-CH3,R8＝CH3,R9＝H；
10k，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝Cl,R9＝H；
10l，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝Cl,R8＝Cl,R9＝H；
10m，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝-COOCH3,R8＝H，R9＝H；
10n，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝-OCH3，R9＝H；
10o，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝-OH，R9＝H；
10p，R1＝H,R2＝H,R3＝F,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝-OH，R9＝H；
10q，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,R8＝-Br，R9＝H；
10r，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,
Figure GDA0003892215720000191
R9＝H；
10s，R1＝H,R2＝H,R3＝H,R4＝H,R5＝H,R6＝H,R7＝H,
Figure GDA0003892215720000192
R9＝H；
试剂和条件a为：N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，110℃；
试剂和条件b为：40％溴化氢/醋酸溶液，回流；
试剂和条件c为：(dppf)PdCl2，碳酸钾，二氧六环/水，120℃，微波。
具体制备方法如下：
(1)3-甲氧基-4b,5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b]喹喔啉(化合物10a) 的合成：将化合物6a(1.0mmol，264mg)和化合物9a(1.0mmol，200mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺中。然后加入碳酸钾(4.0mmol，550mg)，将混合物加热至110℃，反应24h，然后冷至室温。除去溶剂，然后加入乙酸乙酯(50mL)，用水洗有机相，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩。得到黄色固体240mg(化合物10a)，产率76％，熔点193–195℃。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ7.87(d,J＝2.8Hz,1H),7.44(d,J＝7.3Hz,1H),7.36(d,J＝7.4Hz,1H), 7.21–7.15(m,3H),7.02(s,1H),6.84(d,J＝8.3Hz,1H),5.03–5.01(m,1H),4.77(d,J＝8.2Hz, 1H),4.04(d,J＝11.6Hz,1H),3.77(s,3H),3.29(t,J＝10.9Hz,1H),3.05–3.01(m,1H),2.91–2.81 (m,2H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ158.32,144.24,143.52,137.67,137.15,135.21,130.34,127.27,125.40,124.56,124.46,123.88,113.77,111.11,55.68,53.49,45.76,39.99,27.86.HRMS (ESI):Calcd for C19H19ON4[M+H]+319.1553,found 319.1554.
(2)3-氟-4b，5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b]喹喔啉(化合物10g)的合成：取化合物6e(0.6g，3.3mmol，1eq)碱化游离后，经DCM萃取，减压除去溶剂，加入N,N-二甲基甲酰胺5mL，搅拌状态下加入化合物9a(0.33g，1.67mmol，0.5eq)以及碳酸钠(0.35g，3.3mmol，1eq)，加热升温至110℃反应，反应2h，将反应液冷却，倒入水中，用二氯甲烷萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相减压除去溶剂，得到化合物10g(粗品)。粗品经柱层析分离纯化(展开剂：石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得到黄色固体0.38g(化合物 10g)，产率37.6％，熔点248–250℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.62–7.59(m,1H),7.50–7.47 (m,1H),7.33–7.28(m,2H),7.22–7.19(m,1H),6.99–6.93(m,2H),5.25–5.22(m,1H),4.83(dd,J ＝10.1,3.0Hz,1H),3.96(dd,J＝11.5,3.6Hz,1H),3.55–3.51(m,1H),3.15–3.10(m,1H),3.07–3.01(m,1H),2.89(d,J＝15.6Hz,1H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ161.43,143.11,137.49,136.40,134.84,131.10,130.93,130.88,125.61,125.11,124.88,124.30,114.58,112.06, 53.52,46.42,39.42,28.29.HRMS(ESI):Calcd for C18H16N4F[M+H]+307.1354,found 307.1356.
实施例4：TNBG类似物11a-e的合成
TNBG类似物11a-e的合成路线如下：
Figure GDA0003892215720000201
11a，
Figure GDA0003892215720000202
11b，
Figure GDA0003892215720000203
11c，
Figure GDA0003892215720000204
11d，
Figure GDA0003892215720000205
11e，
Figure GDA0003892215720000206
11f，
Figure GDA0003892215720000207
11g，
Figure GDA0003892215720000208
11h，
Figure GDA0003892215720000211
11i，
Figure GDA0003892215720000212
试剂和条件a为：N,N-二甲基甲酰胺，氢化钠，各种氯化脂肪烃，50℃。
具体制备方法如下：
4-(3-(4b,5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b]喹喔啉-6-基)丙基)吗啉(化合物11a)的合成：取TNBG(化合物10h，0.50g，1.7mmol，1eq)溶于N,N-二甲基甲酰胺10mL中，搅拌状态下加入0.2g质量分数为60％的氢化钠(0.27g，6.8mmol，4eq)，室温搅拌10min后，加入3-氯丙基吗啉(0.56g，3.4mmol，2eq)，然后升温至50℃反应，用TLC(展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：1,Rf＝0.2)监控反应完毕后，冷却至室温，倒入冷水中，用二氯甲烷萃取，用饱和食盐水洗涤，收集二氯甲烷，浓缩，加入乙酸乙酯和四氢呋喃重结晶，得淡黄色固体300mg(化合物11a)，产率44％，熔点124–127℃。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ7.44(d,J＝7.4Hz,2H),7.37(d,J＝7.86Hz,1H),7.29–7.16(m,5H),
4.99–4.97(m,1H),4.83(d,J＝9.5Hz,1H),4.10–4.07(m,1H),3.89–3.84(m,1H),3.59(m,4H), 3.45(t,J＝10.9Hz,1H),3.38(s,1H),3.09–3.05(m,1H),2.99–2.94(m,1H),2.87(d,J＝15.8Hz, 1H),2.33–2.35(m,6H),1.85–1.82(m,2H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ143.53,143.19,137.51, 136.63,135.43,133.93,129.48,127.44,126.81,126.10,125.26,124.94,124.66,123.97,66.66, 56.09,53.69,52.68,51.79,46.56,39.59,28.52,23.14.HRMS(ESI):Calcd for C25H30ON5[M+H]+ 416.2445,found 416.2449.
实施例5：TNBG类似物13a-d和14a-b的合成
TNBG类似物13a-d和14a-b的合成路线如下：
Figure GDA0003892215720000213
13a，
Figure GDA0003892215720000214
13b，
Figure GDA0003892215720000221
13c，
Figure GDA0003892215720000222
13d，
Figure GDA0003892215720000223
14a，
Figure GDA0003892215720000224
14b，
Figure GDA0003892215720000225
剂和条件a为：氢氧化锂，甲醇/水，85℃；
试剂和条件b为：N,N-二甲基甲酰胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)， 1-羟基苯并三唑(HOBT)，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温；
试剂和条件c为：LiAlH4，四氢呋喃，室温。
具体制备方法如下：
(1)4b，5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b]喹喔啉-10羧酸(化合物12)的合成：称取化合物10m(4g，11.6mmol)，用甲醇/水(V/V，4/1)50mL溶解，加入氢氧化锂(2g，47.6mmol)，反应4h，将反应液冷却，倒入水中，用盐酸溶液调制酸性，析出淡黄色固体，过滤，干燥，得到黄色固体(化合物12)，产率92％，熔点268–270℃。1H NMR (600MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.07(s,1H),7.85(d,J＝8.6Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz, 1H),7.44(d,J＝6.5Hz,1H),7.31–7.28(m,3H),5.07–5.01(m,1H),4.95–4.93(m,1H),4.26–4.23 (m,1H),3.44(t,J＝11.8Hz,1H),3.22–3.17(m,1H),3.04–2.94(m,2H).13C NMR(151MHz, DMSO-d6)δ167.24,144.26,141.80,134.97,133.96,132.48,129.46,128.11,127.79,127.16,126.64,126.58,126.41,126.22,118.63,52.17,45.89,39.52,28.24.HRMS(ESI):Calcdfor C19H17N4O2[M+H]+333.1346,found 333.1349.
(2)N,N-二甲基-4b，5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b]喹喔啉-10-羧酰胺 (化合物13a)的合成：取化合物12(1.0g，3mmol，1eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺15mL 中，加入EDCI(0.63g，3.3mmol，1.1eq)，HOBT(0.45g，3.3mmol，1.1eq)，DIEA(2g，15.5mmol，5eq)以及二甲胺盐酸盐(0.72g，10mmol，3eq)，反应2h，将反应液冷却，倒入水中，用DCM萃取，合并有机层，减压除去溶剂，得到油状物，加入饱和氯化钠溶液，析出白色固体，过滤得到化合物13a(粗品)。粗品经柱层析分离纯化(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝40：1)，得到白色固体0.45g(化合物13a)，产率41％，熔点221–224℃。1H NMR (600MHz,DMSO-d6)δ8.07(d,J＝3.8Hz,1H),7.45–7.43(m,2H),7.37(d,J＝8.2Hz,1H), 7.27–7.22(m,4H),5.03–4.99(m,1H),4.84(dd,J＝10.0,3.3Hz,1H),4.03–4.00(m,1H), 3.61–3.59(m,1H),3.33–3.30(m,1H),3.12–3.08(m,1H),2.99(s,6H),2.90(d,J＝15.9Hz,1H). 13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ170.79,144.79,143.98,138.37,136.28,135.36,134.04,131.52, 129.39,127.37,126.88,126.17,124.19,124.13,123.66,53.21,45.68,39.57,28.61,25.60.HRMS(ESI):Calcd for C21H22ON5[M+H]+360.1819,found 360.1821.
(3)N,N-二甲基-1-(4b，5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b]喹喔啉-2-基) 甲胺(化合物14a)的合成：将化合物13a(0.8g，2.22mmol)和四氢铝锂(0.7g，18.4mmol) 在冰浴下缓慢加入10mL四氢呋喃中，然后在室温下反应，用TLC监测至反应完全。将反应液浓缩后，用DCM萃取，得到化合物14a(粗品)。粗品经柱层析分离纯化(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1)，得到黄色固体0.23g(化合物14a)，产率26％，熔点145–147℃。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.80(d,J＝3.3Hz,1H),7.43(d,J＝6.9Hz,1H),7.35(s,1H), 7.30(d,J＝8.2Hz,1H),7.26–7.23(m,3H),7.15(d,J＝8.2Hz,1H),5.00(dd,J＝12.6,2.6Hz,1H),4.80(d,J＝7.3Hz,1H),3.99(dd,J＝7.9,3.7Hz,1H),3.45(s,2H),3.30(t,J＝10.8Hz,1H), 3.10–3.05(m,1H),3.00–2.95(m,1H),2.88(d,J＝15.8Hz,1H),2.17(s,6H).13C NMR(151MHz, DMSO-d6)δ144.10,143.56,136.79,136.73,135.42,134.30,134.24,129.39,127.32,126.84, 126.14,125.64,125.49,124.20,63.82,53.37,45.73,45.33,39.58,28.66.HRMS(ESI):Calcd for C21H24N5[M+H]+346.2026,found 346.2030.
实施例6：TNBG类似物15a-d的合成
TNBG类似物15a的合成路线如下：
Figure GDA0003892215720000231
15a，
Figure GDA0003892215720000232
15b，
Figure GDA0003892215720000233
15c，
Figure GDA0003892215720000234
15d，
Figure GDA0003892215720000241
试剂和条件a为：N,N-二甲基甲酰胺，氢化钠，各种氯化脂肪烃，50℃。
具体制备方法如下：
2-(3-(2-(二甲氨基)乙氧基)-4b，5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b]喹喔啉-6-基)-N，N-二甲基乙烷-1-胺(化合物15a)的合成：将化合物10b(0.5mmol，152mg) 溶于N,N-二甲基甲酰胺10mL中，加入氢化钠，在室温下搅拌0.5h，加入2-溴-N，N-二甲基乙烷-1-胺(1mmol，150mg)，用TLC监测至反应完全。除去溶剂，加入乙酸乙酯，用水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗品经柱层析纯化，得到白色固体147mg(化合物15a)，收率33％，熔点95–97℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.44(d,J＝7.3Hz,1H),7.39(d,J＝ 7.4Hz,1H),7.22–7.12(m,3H),7.06(s,1H),6.86(d,J＝8.4Hz,1H),5.00–4.98(m,1H),4.77(d,J＝8.9Hz,1H),4.21–4.19(m,1H),4.13–4.03(m,3H),3.63–3.60(m,1H),3.50(t,J＝10.9Hz,1H), 3.01(t,J＝10.7Hz,1H),2.91–2.80(m,2H),2.64–2.54(m,4H),2.22(d,J＝7.1Hz,12H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ157.54,143.53,143.09,137.45,136.60,134.91,130.42,127.26, 125.23,124.98,124.64,123.96,114.03,111.98,66.35,58.26,56.20,52.82,51.88,46.06,45.89, 45.73,39.57,27.69.HRMS(ESI):Calcd for C26H35N6O[M+H]+447.2867,found 447.2872.
实施例7：TNBG类似物16a-g的合成
TNBG类似物16a-g的合成路线如下：
Figure GDA0003892215720000242
16a，
Figure GDA0003892215720000243
16b，
Figure GDA0003892215720000244
16c，
Figure GDA0003892215720000245
16d，
Figure GDA0003892215720000246
16e，
Figure GDA0003892215720000247
16f，
Figure GDA0003892215720000251
16g，
Figure GDA0003892215720000252
试剂和条件a为：N,N-二甲基甲酰胺，氢化钠，各种氯化脂肪烃，50℃。
具体制备方法如下：
(1)4-(2-(9-(2-吗啉氧基)-4b，5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b]喹喔啉-6-基)乙基)吗啉二盐酸盐(化合物16a)的合成：称取化合物10o(0.50g，1.65mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺10mL溶解，加入氢化钠(0.65g，16.5mmol)。在室温和氮气保护下搅拌20min，加入1-氯乙基吗啉盐酸盐(1.2g，6.59mmol)，升温至50℃反应，用TLC监测至反应完全。将反应液倒入冷水中，用乙酸乙酯萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，粗产品经柱层析分离(展开剂：二氯甲烷/甲醇/三乙胺,200/10/1, V/V/V)，得到油状物。取2mL无水乙醇将油状物溶解，在冰浴中搅拌，缓慢加入1,4-二氧六环氯化氢溶液至体系呈酸性，得到浅橙色固体160mg(化合物16a)，产率17.8％，熔点269–271℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.86(s,1H),11.07(s,1H),7.78(s,1H),7.54(d,J＝7.4Hz,1H),7.35–7.30(m,3H),7.11(s,1H),7.02(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),5.16(d,J＝8.5Hz, 1H),4.95(dd,J＝8.7,3.8Hz,1H),4.78–4.08(m,8H),4.06–3.72(m,8H),3.66(t,J＝11.1Hz,2H), 3.58–3.50(m,5H),3.30–3.21(m,4H),3.07–2.95(m,2H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ 155.78,144.16,141.24,136.33,135.05,133.09,130.12,129.31,127.78,127.01,126.24,126.18, 114.98,107.47,63.59,63.44,63.11,55.25,53.52,53.23,52.14,50.73,42.59,40.52,39.56,28.26. HRMS(ESI):Calcd for C30H39O3N6[M+H]+531.3078,found 531.3084.
(2)3-(9-(3-(二甲氨基)丙氧基)-4b，5,14,15-四氢-6H-异喹啉[2'，1'：1,6]吡嗪[2,3-b] 喹喔啉-6-基)-N，N-二甲基丙烷-1-胺二盐酸盐(化合物16g)的合成：同化合物16a的合成方法。投料为化合物10o(0.5g，1.64mmol)，N,N-二甲基甲酰胺10mL，氢化钠(0.65g，16.25mmol)，2-(二甲氨基)乙基氯盐酸盐(0.95g，6.59mmol)，粗产品经柱层析分离(展开剂：二氯甲烷/甲醇/三乙胺,150/10/1,V/V/V)，产率68％，熔点253–258℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6,D2O)δ7.58(d,J＝8.8Hz,1H),7.47(d,J＝6.5Hz,1H),7.30(d,J＝9.4Hz,3H),7.21(s,1H),6.99(d,J＝8.7Hz,1H),4.99(d,J＝9.4Hz,1H),4.72(d,J＝9.5Hz,1H),4.21(d,J＝11.8 Hz,1H),4.10(t,J＝5.6Hz,2H),3.93–3.90(m,1H),3.85–3.76(m,1H),3.60(t,J＝11.3Hz,1H), 3.28–3.22(m,3H),3.17(t,J＝7.4Hz,2H),3.05–2.91(m,2H),2.79(d,J＝14.5Hz,12H), 2.16–2.11(m,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6,D2O)δ156.50,143.02,141.66,135.11,132.95, 129.43,127.76,126.98,126.28,114.88,65.71,54.43,42.51,42.47,42.39,29.49,28.30,24.32, 21.59.HPLC purity:98.60％,tR＝13.7min.HRMS(ESI):Calcd for C28H39ON6[M+H]+475.3180, found 475.3184.
以下通过具体的试验例证证明本发明的有益效果。
试验例1：本发明化合物的抗癌活性
该试验例所述部分材料及试剂如表
材料及试剂名称 生产单位
TNBG及其衍生物 由本课题组合成
索拉菲尼 重庆药友制药有限公司赠送
盐酸厄诺替尼 重庆礼邦制药有限公司赠送
灭菌PBS 重庆赛米克生物科技有限公司
DMEM培养基 Hyclone公司
标准胎牛血清 Hyclone公司
胰蛋白酶(0.25％)细胞消化液 重庆赛米克生物科技有限公司
青霉素钠 Hyclone公司
链霉素 Hyclone公司
CCK-8试剂盒 上海翊圣生物科技有限公司
DMSO Sigma公司
试验例所述主要仪器
Figure GDA0003892215720000261
Figure GDA0003892215720000271
实验细胞：人肺癌细胞株A549细胞、LOVO细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；人肝癌细胞株QGY-7701购自于武汉普诺赛生命科技有限公司；人肝癌细胞株HepG2由重庆医科大学病理生理教研室馈赠。
实验方法
取QGY-7701、HepG2二种人肝癌细胞株、人非小细胞肺癌A549、人结肠癌细胞LOVO，分别接种于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5％二氧化碳2孵箱内培养，细胞呈单层贴壁生长，传代至对数生长期时，备用。
分别取上述对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，添加10％胎牛血清的DMEM培养液中止消化，1000rpm条件下离心5min，弃去上清，必要时再用PBS重悬细胞，500rpm 条件下离心5min，弃去上清，然后用完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度为3×104～5×104个 /mL，在96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，即每孔含细胞3000～5000个，将接种细胞的 96板置于37℃/5％二氧化碳恒温培养箱中培养，待细胞贴壁长出形态后，向96孔板中加入8 个浓度梯度的药液100μL，使得每孔终浓度为(30、20、10、8、6、4、2和1μM)或(8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.06μM)，每个浓度下设3个平行孔。同时以TNBG、抗肿瘤药物索拉非尼和厄洛替尼作为阳性对照药物，每块96孔板设置6个细胞对照组，每个实验重复三次。给药后将96孔板置于37℃、5％二氧化碳孵箱内继续培养，72h后终止培养。取出 96孔板，弃去药液和培养基，每孔中加入新鲜培养基100μL和CCK-8溶液10μL，空白孔加等体积CCK8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1.5h后，用酶标仪在波长450nm处测定每孔吸光度值(A)。
不同药物浓度对肿瘤细胞的生长抑制作用按下式计算：
Figure GDA0003892215720000272
采用SPSS17.0软件以抑制率为响应频率，药物浓度为因变量，并将浓度做Logit转换，观测值汇总为总数100，作probit回归分析，计算IC50值。
本发明化合物10抗肿瘤细胞增殖活性(IC50值)
Figure GDA0003892215720000281
本发明化合物11抗肿瘤细胞增殖活性(IC50值)
Figure GDA0003892215720000282
本发明化合物12、13和14抗肿瘤细胞增殖活性(IC50值)
Figure GDA0003892215720000283
Figure GDA0003892215720000291
本发明化合物15和16抗肿瘤细胞增殖活性(IC50值)
Figure GDA0003892215720000292
试验例2：本发明代表化合物的体内药效学试验
化合物16g的体内药效学试验
实验动物
昆明小鼠，雌雄各半，18-22g，由重庆医科大学动物实验中心提供(SPF级)，动物合格证号：SCXK(渝)2012-0001，饲养于重庆医科大学动物实验中心IVC动物房“生命之窗”外置水平式笼盒，5只/笼。温度：20-25℃，日温差要小于3℃；相对湿度：40-70％；换气次数：20-60次。照明：每天早上8点开灯，晚上六点关灯，噪音：60dB以下。
BALB/C裸鼠，4-6周龄，雄性，16-20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2014-0004；饲养于重庆医科大学动物实验中心SPF级动物房，5只/盒。12h明暗交替，自由饮食饮水，每周更换垫料。
实验试剂
试剂与药品名称 生产单位
化合物16g 本课题组合成
注射用生理盐水 重庆迪康长江制药有限公司
4％甲醛 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司
灭菌注射用水 重庆药友制药有限责任公司
碳酸氢钠 成都市科龙化工试剂厂
苏木精 国药集团化学试剂有限公司
伊红 上海试剂三厂
DMEM培养基 Hyclone公司
标准胎牛血清 Hyclone公司
胰蛋白酶(0.25％)细胞消化液 重庆赛米克生物科技有限公司
灭菌PBS 重庆塞米克生物科技有限公司
实验仪器
仪器设备名称 生产单位
超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司
MCO-15AC二氧化碳培养箱 日本三洋生物医疗株式会社
正置显微镜 Nikon公司
倒置显微镜 Nikon公司
RTZ-10A-RT型婴儿体重秤 江苏衡新科技有限公司
无菌注射器 上海苏阳仪器有限公司
注射式滤膜型过滤器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司
实验药物与试剂配制：精密称取45mg化合物16g固体粉末加入灭菌注射用水5mL，振摇溶解，加碳酸氢钠调pH至中性，在超净工作台中，采用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得到9mg/mL的化合物16g溶液4mL。
化合物16g对小鼠急性毒性试验
取昆明小鼠60只，随机分成6组，每组10只，雌雄各半。根据预实验结果，以0.85为组距，将化合物16g的给药剂量分别设定为106mg/kg、125mg/kg、145mg/kg，170mg/kg 和200mg/kg。小鼠禁食不禁水12h一次性腹腔注射，对照组给予等体积的生理盐水，观察即时反应并连续观察14天并记录死亡数量。若有小鼠死亡，则将死亡小鼠解剖，纯化水清洗后，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等器官有无明显异常，并与生理盐水对照组进行比较。
将取出的心、肝、脾、肺、肾以4％福尔马林液固定24h。福尔马林固定后的器官经修块取材，逐级酒精脱水，石蜡包埋，滑动切片机切片，厚度约4μm，烤片2h，温度60℃，经苏木素-伊红(HE)染色后备用。用Nikon光学显微镜观察摄影，记录和分析各剂量组和对照组动物脏器组织的毒性病理变化，以了解化合物16g的剂量与毒性的关系。
根据死亡数量计算死亡率，采用Graph Pad软件绘制死亡率和剂量的线性回归方程，并用软件spss17.0计算小鼠的半数致死量。
肺癌A549裸鼠移植瘤抑瘤率测定
将人肺癌细胞A549细胞正常传代培养，培养至一定数量后，取对数生长期A549细胞，用胰酶消化，1000r/min离心5min后用PBS洗涤3次，收集细胞，用无菌PBS调整细胞浓度为3×107个/mL,立即置于冰上待用。在SPF级动物房，于超净工作台内取出经适应性培养的BALB/c裸鼠，用75％酒精消毒裸鼠背部皮肤，在裸鼠背部皮下接种上述细胞悬液0.1mL。裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长到50-100mm3后将裸鼠随机分成2组，化合物16g给药组和对照组，每组5只。根据急性毒性试验结果，剂量设置约为LD10值的 1/10，即10mg/kg。每天腹腔注射0.4mL化合物16g，对照组注射等体积的无菌生理盐水，连续腹腔给药18天。给药期间每隔3天用游标卡尺测量移植瘤最长径(a)和最短径(b)，并计算肝癌体积。按以下公式计算肿瘤体积：
V(cm3)＝a×b2×0.5，a为长径(cm)，b为短径(cm)
给药结束后，颈部脱臼处死裸鼠，剥离取出移植肺癌移植瘤，称重，拍照，立即保存于 10％甲醛溶液中。以各组肺癌平均重量
Figure GDA0003892215720000311
计算化合物16g对A549细胞的抑瘤率，按下式计算：
Figure GDA0003892215720000312
Figure GDA0003892215720000313
给药组平均瘤重；
Figure GDA0003892215720000314
阴性对照组平均瘤重。
实验结果
化合物16g腹腔注射小鼠急性毒性试验结果
小鼠一次性腹腔注射后，出现乏力、眯眼、俯卧、呼吸深快和自主活动减少等现象，偶见惊厥、抽搐、易受惊，给药当天禁食和饮水减少。随着时间延长，小鼠症状得以缓解，饮食回复正常，体重逐渐增加。观察结果见表1。经曲线拟合(图1)，给药后LD50为127.2mg/kg，其95％置信区间为117.2～137.2mg/kg。
表1腹腔内注射化合物16g对小鼠的急性毒性观察结果
Figure GDA0003892215720000321
化合物16g腹腔注射小鼠组织解剖和病理学结果
小鼠处死后对小鼠进行解剖，结果如图2所示，给药组和对照组相比，未见明显器官病变。各组心、肝、脾、肺和肾的HE染色结果见图3。心内膜和心外膜结构正常，未见炎症细胞浸润或异常出血，肌层细胞和肌纤维部分基本有序，心肌间质微血管轻度扩张充血，无炎症细胞浸润。肝实质细胞结构基本完整，肝板结构尚可，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，未见明显肝细胞水肿、坏死或纤维化等不可逆性病变；汇管区无炎细胞浸润。肾脏体积正常，被膜未见破裂。肾小球均匀分布，其毛细血管内皮细胞及间质细胞未见增生，无纤维化及硬化，球囊腔未见纤维蛋白及淋巴细胞渗出，肾小球毛细血管未见细胞增生与纤维化。肾小管上皮细胞未见异常，管腔内无嗜伊红物质。被膜结构正常，大多肺叶实质内的肺泡充气，未发现有炎症性实变病灶。各级支气管壁结构正常。肺泡壁及小叶间隔微血管扩张充血，部分区域间质细胞轻度增生，导致肺泡间隔明显增宽。高剂量组肺泡腔有少量红细胞，间质少量淋巴细胞浸润。脾被膜结构正常，未见纤维组织增生及炎细胞浸润。脾小梁结构正常，脾小体呈结节状散在分布。
体内抗肿瘤实验结果
试验结果如表2、表3和图4所示，经化合物16g治疗时，对照组裸鼠肺癌肿瘤体积随时间延长而不断增大，给药结束，对照组体积长至787.8+158.8mm3；经化合物16g治疗后肺癌生长变缓慢，给药结束时，给药组体积长至247.3±130mm3。给药结束后，给药组肺癌体积与对照组肺癌体积之间有显著性差异(P<0.05)，这表明化合物16g能显著抑制人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤的生长。剥离出肺癌组织称重，对照组肺癌重量达到0.459±0.165g，给药组肺癌体积只有0.173±0.061g，表明化合物16g对裸鼠肺癌A549肺癌的生长具有显著抑制作用，所有给药组瘤重与阴性对照组比较具有显著性差异(P<0.01)，按公式计算抑瘤率达到62％。
表2化合物16g裸鼠给药期间移植肺癌体积变化表(单位：mm3)
Figure GDA0003892215720000331
*:与对照组相比，P<0.05
表3化合物16g裸鼠给药结束后移植肺癌重量表(单位：g)
Figure GDA0003892215720000332
试验例2：本发明代表化合物的抗肿瘤活性初步机制研究
化合物16g的抗肿瘤活性初步机制研究
主要仪器
Figure GDA0003892215720000333
Figure GDA0003892215720000341
试剂
试剂名称 生产单位
TNBG及其衍生物 由本课题组合成
灭菌PBS 重庆赛米克生物科技有限公司
DMEM培养基 Hyclone公司
标准胎牛血清 Hyclone公司
胰蛋白酶(0.25％)细胞消化液 重庆赛米克生物科技有限公司
青霉素钠 Hyclone公司
链霉素 Hyclone公司
结晶紫粉末 成都格雷西亚试剂公司
油红O粉末 重庆赛米克生物科技有限公司
异丙醇 成都科龙试剂有限公司
4％甲醛 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司
Lipo2000转染试剂 美国life公司
PPRE×3TK质粒 上海联峰生物科技公司
PPARγ表达质粒 上海联峰生物科技公司
海肾素荧光素酶表达质粒 上海联峰生物科技公司
E1960双荧光素酶报告基因检测试剂盒 普洛麦格(北京)生物技术有限公司
实验细胞：人肺癌细胞株A549细胞中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；人肝癌细胞株HepG2由重庆医科大学病理生理教研室馈赠。Cos-7细胞购自上海酶联生物科技有限公司。
油红O染液的配制：称取油红O粉末0.5g，加入100mL异丙醇，采用磁力搅拌器充分搅拌，即得饱和油红O溶液，棕色瓶密封避光保存。临用前取饱和油红O溶液与水以3∶2 的比例稀释，静置10min，定性滤纸过滤，其滤液即为油红O染液。
实验方法
细胞周期检测
将对数生长的人肝癌细胞hepG2分别接种于6孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度的化合物16g处理，使每孔的终浓度为(0、0.60、0.90、1.5μM)继续培养；培养48h后取出6孔板，收集细胞，加入预冷的70％乙醇，混悬细胞，置于4℃冰箱过夜，固定细胞；细胞固定 24h后，用PBS洗涤细胞，用PI溶液(含RNase)处理细胞，37℃避光孵育30min；采用流式细胞仪进行细胞周期检测及分析。
细胞凋亡检测
将对数生长的人肝癌细胞hepG2和接种于6孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度的化合物 16g处理，使每孔的终浓度为(0、0.60、0.90、1.5μM)继续培养；培养48h后取出6孔板，将细胞收集至离心管中，加入4℃预冷的PBS重悬细胞，加入Annexin V/PI进行核双染。采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测及分析。
油红O染色
将对数生长期的人肝癌细胞HepG2分别接种于24孔板，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁后，实验组每孔中加入化合物16g溶液，使其终浓度为0、0.3、0.6和0.9μM，各实验组设置3个重复孔，空白对照孔加入等体积DMEM全培养基，将24孔板置于37℃、 5％二氧化碳孵箱内继续培养，72h后终止培养。取出24孔板，弃去培养基，加入PBS洗2次，完全吸出PBS，加入适量10％甲醛室温固定20-30min，吸尽甲醛溶液，加油红O工作液，室温反应20-30min，弃去染色液，用PBS洗去游离染液，倒置显微镜下观察、拍照。进行油红O染色。
荧光素酶报告基因检测PPARγ细胞转录活性
细胞转染及其处理
Cos-7细胞在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中生长至70％融合，经常规消化后，调整细胞密度为2×105/mL，以每孔200μL接种到96孔板中，置于二氧化碳培养箱内孵育24h后，将含有荧光素酶的100ng报告基因质粒(PPRE×3TK)、50ng全长PPARγ表达质粒(lipofectamine 2000，Invitrogen)和内对照10ng海肾荧光素酶表达质粒共转染Cos-7细胞，转染后24小时后弃上清，用pH值7.2的PBS洗涤细胞后，按以下分组加入处理因素：溶剂对照组(DMSO)；化合物给药组；罗格列酮组。化合物按1、3和10μM设置3个剂量，用参考药物罗格列酮和规定浓度的化合物处理细胞24h。弃上清，用pH值7.2的PBS洗涤细胞，每孔加入100μL细胞裂解液裂解细胞，收集细胞裂解产物进行报告基因检测。
报告基因荧光素酶活性检测
根据制造商的说明，取20μL细胞裂解产物，用Promega公司荧光素酶报告检测试剂盒使用Envision光度计(Perkin–Elmer)测定目的报告基因萤火虫荧光素酶活性及内对照海肾荧光素酶活性。PPARγ转录活性以萤火虫荧光素酶表达值与内对照海肾荧光素酶表达值的比值来表示。每个实验条件下重复3次实验。计算结果与溶剂双蒸水组比较，计算荧光素酶相对活性。
Western Bloting实验
将对数生长期的HepG2细胞接种于六孔板中，待细胞贴壁后，用化合物16g(0、0.9、1.2、1.5和1.8μM)处理HepG2细胞72h后，继续培养。72h后，终止培养，弃去培养基，每孔加入PBS小心清洗2遍。弃去PBS，将6孔板置于冰上，用BCA蛋白分析试剂提取总蛋白，并将其浓度平衡到相同水平，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质(20μg)，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含0.05％吐温20的1×Tris缓冲液(TBS) 对5％脱脂奶粉进行封闭室温下2h。然后在4℃下将膜与AKT、PTEN和PPARγ抗体孵育过夜，然后用二级辣根过氧化物酶结合兔抗IgG处理2h。在Clarity Western ECL底物中孵育2 min后，在CHEMIDOCXPST成像系统中最终扫描膜。
统计学处理
检测所得结果以平均值±标准偏差(x±SD)表示，实验数据采用SPSS19.0和GraphPad Prism 6.0处理计量资料，两组间差异比较采用t检验(*P<0.05，表示差异有统计学意义； **P<0.01和***P<0.001表示差异有显著统计学意义)。
试验结果
细胞周期阻滞结果
为了研究化合物16g诱导的细胞死亡模式，用碘化丙啶(PI)染色试剂盒检测了化合物 16g对细胞周期分布的影响。用化合物16g(0.9,1.2,1.5μM)或对照组处理HepG2细胞24h， PI染色，流式细胞仪分析。如图5所示，化合物16g导致HepG2细胞在S期阻滞，分别为18.41％(0.9μM)、23.12％(1.2μM)和30.95％(1.5μM)，使G1期细胞从72.40％减少到57.04％。说明化合物16g在浓度1.5μM时，能引起肝癌细胞S期周期阻滞。
细胞凋亡检测结果
Anenexin V/PI双参数流式细胞分析散点分布图四个象限的左上、左下、右上、右下分别代表坏死细胞、正常细胞、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞，细胞凋亡率以早期凋亡与晚期凋亡细胞数之和占总细胞数的百分比表示。为探讨化合物16g诱导HepG2细胞凋亡的机制，用 Annexin-V-FITC/PI-FACS法检测化合物16g是否具有诱导肝癌细胞和肝癌细胞凋亡的凋亡作用。结果如图6所示，化合物16g分别作用于0.9、1.2和1.5μM的HepG2细胞48h，凋亡率分别为3.95、10.01和23.48％，说明化合物16g诱导HepG2细胞凋亡呈剂量依赖性，结果表明，化合物16g对HepG2细胞有一定的诱导凋亡作用，进一步说明化合物16g诱导细胞凋亡是其抑制肺癌和肝癌的作用途径之一。
油红O染色检测结果
试验的数据表明，TNBG及其类似物TNBG-5602的抗癌作用归因于癌细胞中特异性的脂质积聚。因此，用化合物16g处理HepG2细胞，并用油红O染色来定量脂质的积累程度。如图7所示，与对照组相比，经化合物16g处理过的细胞胞浆中均出现不同程度红色物质聚集，随着化合物16g浓度的增加，积累的脂滴变得更清晰，体积也增大，说明化合物16g形成的脂滴积累呈现剂量反应方式。此外，化合物16g治疗引起的脂滴积聚可能演变成凋亡刺激，从而导致癌细胞死亡。
PARγ转录激活实验结果
PPARγ在控制脂质代谢活跃的细胞的脂质摄取、转运、贮存和处置中起着重要作用。 PPARγ活化与抑制恶性细胞分化和增殖有关。此外，由于PPARγ介导的脂滴的过度积累，一些化合物可以抑制癌细胞的生长。新近研究发现PPARγ激动剂通过激活PPARγ对胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等具有明显的抑制增殖、诱导凋亡和抑制肿瘤血管生成等作用。那么化合物16g是否通过激活PPARγ发挥的抗肿瘤作用呢？申请人通过PPARγ转录激活实验来验证PPARγ的转录激活作用。申请人首先在Cos-7细胞中用荧光素酶报告法，在1、3和10μM 的化合物浓度下，评估了不同浓度化合物16g对人类PPARγ亚型的激活活性。罗格列酮(Rosi) 作为经典的PPARγ受体激动剂，作为阳性对照。如图8所示，结果表明，在所选浓度下，化合物16g可增强Cos-7细胞中报告基因荧光素酶的表达活性，表现出一定的PPARγ激动活性，但是和阳性对照药物罗格列酮相比，激动作用较弱，说明该化合物是选择性PPARγ激动剂。
化合物对PPARγ蛋白表达结果
采用Western blotting方法测定了化合物16g处理HepG2细胞前后PPARγ的表达。如图9 所示，化合物16g以浓度依赖的方式显著上调两种受试细胞系中PPARγ的表达水平，提示16g 的抗癌作用可能与PPARγ水平的升高有关。同时，越来越多的证据表明PPARγ上调因子罗格列酮和曲格列酮通过激活PTEN的表达和抑制下游靶点AKT而发挥其抗增殖作用。在申请人的研究结果中，申请人观察到PTEN的表达随着化合物16g浓度的增加而增加，而且16g 剂量相关地抑制HepG2细胞中AKT磷酸化，并且在1.8μM浓度下几乎完全消除。

Claims (6)

1.一种式I至式V所示的化合物、或其盐、或其立体异构体，其结构如下：
Figure FDA0003892215710000011
2.根据权利要求1所述的化合物、或其盐、或其立体异构体在制备抗肿瘤药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述制备抗肿瘤药物是激活SERBP1或/和PPARγ而抑制脂质转运MTTP，引起肿瘤细胞内脂质聚集，导致脂毒性的抗肿瘤药物。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述制备抗肿瘤药物是治疗癌症的药物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述癌症包括肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、食道癌、子宫癌、结肠癌、直肠癌、鼻炎癌、淋巴癌和白血病。
6.一种药物，它是由权利要求1所述的化合物、或其盐、或其立体异构体为活性成分，加上药物上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
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