CN115353507B - 联苯吡嗪喹唑啉二胺,其合成、活性及应用 - Google Patents

联苯吡嗪喹唑啉二胺,其合成、活性及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有下式结构的联苯吡嗪喹唑啉二胺，即N2‑([1,1'‑联苯]‑3‑基)‑N4‑(吡嗪‑2基‑甲基)喹唑啉‑2,4‑二胺，公开了它的制备方法，公开了它的抗肿瘤活性、抗肿瘤转移和抑制p97表达的活性。此外，本发明还进一步公开了它在制备抗肿瘤药物中的应用、公开了它在制备抗肿瘤转移药物中的应用以及它在制备p97抑制剂中的应用。

Description

联苯吡嗪喹唑啉二胺,其合成、活性及应用
技术领域
本发明涉及一种N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺及其制备方法，涉及它的抗肿瘤生长作用、涉及它的抗肿瘤转移作用和涉及它对p97表达的抑制作用。此外，本发明涉及它在制备抗肿瘤药物中的应用、涉及它在制备抗肿瘤转移药物中的应用以及涉及它在制备p97抑制剂中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
下面结构的工具药DBeQ是ATP竞争性的p97抑制剂。依据p97蛋白活性口袋的特征发明人推测，在用联苯-3-基替换DBeQ的苯甲基的同时用吡嗪-2基-甲基替换DBeQ的苯甲基(这两个替换导致本案的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺)，可以得到更优秀的p97抑制剂，进而可以得到优秀的抗肿瘤剂及抗肿瘤转移剂。
为了从理论是支撑推测的科学性，本案首先将DBeQ和N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺分别与p97蛋白活性口袋对接。完成了基于分子对接的理论设计。基于分子对接的理论设计表明，DBeQ和N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺二者都可进入p97蛋白活性口袋。基于分子对接的理论设计进一步表明，N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺比DBeQ更适应p97蛋白活性口袋得分显著高(见附图2)。DBeQ的对接得分-CDOCKER Interaction Energy为34.84kcal/mol-CDOCKER Interaction Energy 34.84kcal/mol。N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的对接得分为联苯吡嗪喹唑啉-2胺的对接得分-CDOCKER Interaction Energy为45.07kcal/mol。后者显著高。基于分子对接的理论设计表明，N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺有价值实施实验研究。发明人的实验研究发现，在抑制p97，抗肿瘤生长及抗肿瘤转移三个层面N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺都比DBeQ优秀。根据在分子对接的理论设计中的发现及在实验研究中的发现，发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有下式结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺，
本发明的第二个目的是提供具有上述结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的制备方法,该方法包括:
1)合成2-氯-N4-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺；
2)合成N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺。
本发明的第三个目的是评价具有上述结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的抗肿瘤作用。
本发明的第四个目的是评价具有上述结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的抗肿瘤转移作用。
本发明的第五个目的是评价具有上述结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对p97的抑制作用。
附图说明
图1为N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的合成路线图ⅰ)2-胺甲基吡嗪，乙腈；ⅱ)3-胺基联苯，碳酸铯，2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯，三二亚苄基丙酮二钯，乙腈，95℃。
图2为DBeQ和N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺分别与p97蛋白活性口袋对接图。其中，A为DBeQ对接到p97蛋白活性口袋中的形貌,-CDOCKERInteraction Energy 34.84kcal/mol；B为N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对接到p97蛋白活性口袋中的形貌,-CDOCKER Interaction Energy45.07kcal/mol。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备2-氯-N4-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺
称取66.0mg(0.33mmol)的2,4二氯喹唑啉用乙腈溶解，0℃下加入96μL(1.0mmol)2-甲氨基吡嗪，室温反应过夜，TLC监测2,4二氯喹唑啉消失。反应混合物过滤，滤饼用乙腈复发淋洗，得到的黄色固体用柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)，最终得67.0mg(74％)标题化合物，为淡黄色固体。TLC(二氯甲烷/甲醇，10/1；紫外显色；Rf＝0.3)，ESI-MS(m/e)：272[M+H]+，1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝9.42(t,1H),8.73(d,J＝1.0Hz,1H),8.63–8.58(m,1H),8.55(d,J＝2.5Hz,1H),8.33(d,J＝7.9Hz,1H),7.83(t,J＝7.1Hz,1H),7.65(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(t,J＝7.6Hz,1H),4.88(d,J＝5.7Hz,2H)。
实施例2制备N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺
称取575.9mg(3.4mmol)的3-氨基联苯及3195.0mg(9.8mmol)碳酸铯用乙腈溶解，95℃回流20分钟得到反应液A；称取275.0mg(0.58mmol)2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯，528.0mg(0.58mmol)三二亚苄基丙酮二钯及813.0mg(3.0mmol)2-氯-N-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺与乙腈混悬得到混悬液B。将混悬液B与反应液A混合，95℃回流反应。3小时后TLC显示2-氯-N-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺消失。反应液趁热过滤，用乙腈淋洗滤饼，用二氯甲烷及甲醇多次淋洗滤饼至滤饼为灰白固体。滤液减压浓缩，得到的棕黑色浆状物经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20/1～10/1)，最终得到297.0mg(25％)标题化合物,为乳白色固体。TLC(二氯甲烷/甲醇/冰醋酸，15/1/1滴；紫外显色；Rf＝0.3)，HPLC(％)：95.86，Mp:205-206℃，IR(cm-1)：3388,3278,3052,1572,1538,1520,1466,1447,1403,1326,1127,1018,754,697,678，FT-MS(m/e)：405.18439[M+H]+，1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝9.16(s,1H),8.85(s,1H),8.74(s,1H),8.61(s,1H),8.54(d,J＝2.4Hz,1H),8.16(d,J＝7.8Hz,2H),7.82(d,J＝7.6Hz,1H),7.69–7.56(m,3H),7.46(dd,J＝7.9,5.0Hz,3H),7.39–7.31(m,1H),7.31–7.13(m,3H),4.94(d,J＝5.3Hz,2H)，13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝160.63,156.95,154.65,144.52,144.12,143.71,142.09,141.12,140.82,133.42,129.35,127.75,127.00,123.36,122.35,119.66,118.27,117.55,112.03,55.38,40.81,40.53,40.25,39.97,39.69,39.42,39.14。
实施例3评价N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺抑制肿瘤细胞增殖活性
1)DBeQ购自MedChemExpress，PBS及培养基均购自江苏凯基生物技术股份有限公司，胎牛血清(FBS)购自CORNING，二甲基亚砜(DMSO)购自上海阿拉丁生化科技有限公司，四噻唑蓝(MTT)购自Solarbio：溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，过滤除菌后使用，避光保存；
2)受试细胞系：S180(小鼠肉瘤细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、RPMI8226(多发性骨髓瘤细胞)
3)MCF-7细胞选用RPMI-1640培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素；S180细胞选用DMEM培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素；RPMI8226细胞选用DMEM培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
4)贴壁细胞MCF-7：将生长状态良好且处于对数生长期的贴壁细胞用PBS洗3次，胰酶消化至大部分细胞从瓶壁脱落，加入相应培养基终止消化，吹打至细胞完全脱落，转移至15mL离心管中，使用1000rpm离心3min,弃去上清液，加培养基吹打重悬，计数，细胞密度为3～4×104个/mL，接种于96孔板(Corning 3599)中，每孔加入100μL(96孔板外围每孔加100μL PBS液封)；加DBeQ或者N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺培养：在条件为37℃、5％CO2的孵箱中孵育6小时，观察细胞贴壁情况，当贴壁率达到50％以上时每孔加25μL样品液，轻轻晃动均匀。孵箱培养48小时后，每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，孵育4小时，吸去上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡15分钟充分溶解沉淀，5分钟内用酶标仪于570nm和490nm波长下测定每孔的吸光度。实验设置5个复孔，以抑制率对DBeQ或者N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的浓度作图，计算IC50值。
对于悬浮细胞S180及RPMI8226：将生长状态良好且处于对数生长期的悬浮细胞转移至15mL离心管中，使用1000rpm离心3min,弃去上清液，加培养基吹打重悬，计数，细胞密度为3～4×104个/mL，接种于96孔板(Corning 3799)中，每孔加入100μL(96孔板外围每孔加100μL PBS液封)，每孔加25μLDBeQ或者N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的溶液，轻轻晃动均匀。在孵箱中培养48小时后,每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,孵育4小时,3000rpm离心10分钟，吸去上清液，每孔加入100μL DMSO,振荡15分钟充分溶解沉淀，5分钟内使用酶标仪于570nm和490nm波长下测定各孔的吸光度。实验设置5个复孔，以抑制率对DBeQ或者N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的浓度作图，计算IC50值。
5)结果见表1
结果表明DBeQ和N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对于三种肿瘤细胞增殖显示近似的抑制作用。该结果说明依据DBeQ设计的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺不是前药。
表1 DBeQ及联苯吡嗪喹唑啉-2胺抑制肿瘤细胞增殖活性(IC50±S DμM)*
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺,n＝5。
实施例4评价N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的抗肿瘤生长活性
DBeQ购自MedChemExpress，阿霉素购自国药集团化学试剂有限公司。SPF级ICR品系雄性小鼠(20±2g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验采用移植性小鼠S180肉瘤模型。
DBeQ的口服剂量为180μmol/kg/天，N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的口服剂量为90μmol/kg/天，阳性对照阿霉素的腹腔注射剂量为2μmol/kg/天，阴性对照为生理盐水。
S180小鼠肉瘤作为肿瘤模型是常规实验中一种普遍习惯，因此，发明人使用S180小鼠肉瘤实验例数据为代表来评价本发明的抑制肿瘤生长的活性。移植性小鼠S180肉瘤模型用的瘤源为S180小鼠肉瘤细胞，购自北京大学医学部动物实验中心，按悬浮细胞培养方法自行传代保留。取传代一周的荷S180腹水瘤SPF级雄性ICR小鼠，适量乙醚麻醉后断颈处死，浸泡于75％酒精中消毒1分钟，剖开腹腔，取腹水S180瘤液,离心，弃上清液，残留物以少量经冷却的生理盐水洗去非细胞碎片，组织及浮血，活细胞计数，将活细胞悬浮于冷却的生理盐水中，使细胞密度为2×107个/mL，尽快用于接种。接种时左手固定小鼠，右手持1mL注射器刺入小鼠右侧腋下约2mm至皮下，轻轻钝性分离出一小空腔，注入0.2mL活细胞悬液。
接种后每日观察小鼠，至大部分小鼠腋下可见绿豆粒大小实体瘤时分组，每组12只小鼠，连续给DBeQ10天或者N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺10天或者阿霉素10天或者生理盐水10天。第11天称各组小鼠称重，以乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，固定小鼠腋下实体瘤生长部位，取剪刀剪开皮肤，充分暴露瘤体，沿皮肤上肢钝性分离取出肉瘤称重。原位瘤重以均值±SD g表示,SD值先经SPSS软件进行方差分析,检验方差齐性,采用t-test检验,进行组间统计学比较。表2的数据说明，在剂量降为1/2时N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺抑制肿瘤生长的活性与DBeQ没有显著性差异。本发明有突出技术效果。
表2 DBeQ及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对肿瘤生长的抑制作用
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与生理盐水比P＜0.05；b)与生理盐水比P＜0.01，与DBeQ比P＞0.05；n＝11。
实验例5评价N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对淋巴细胞及血小板的影响
淋巴细胞数及血小板数都影响肿瘤患者的免疫功能。为考察N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对淋巴细胞及血小板的影响，本发明采用迈瑞全自动三分类血球分析仪BC3000测定了实验例4的S180小鼠血液中淋巴细胞及血小板数计数。表3的数据说明，DBeQ显著性减少S180小鼠血液中淋巴细胞数量，N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺不减少S180小鼠血液中淋巴细胞数量。该结果说明依据DBeQ设计的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺避免了DBeQ降低免疫功能的副作用。本案有突出的技术效果。表3的数据还说明，DBeQ显著性升高S180小鼠血液中血小板数量，N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺不升高S180小鼠血液中淋巴细胞数量。该结果说明依据DBeQ设计的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺避免了DBeQ对免疫功能的影响。本案有突出的技术效果。
表3 DBeQ及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对血小板及淋巴细胞计数的影响
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与生理盐水比P＜0.05；n＝5。
实验例6评价N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对肿瘤细胞迁移的影响
DBeQ购自MedChemExpress，PBS及培养基均购自江苏凯基生物技术股份有限公司，胎牛血清(FBS)购自CORNING，二甲基亚砜(DMSO)购自上海阿拉丁生化科技有限公司。受试细胞系为A549(人肺癌细胞)。DBeQ和N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的浓度为5μM。
在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞生长良好，形态延展饱满且折光性良好，均贴壁且无漂浮物，当细胞生长铺满培养瓶底面积的80％时视细胞处于对数生长期，在此状态下的细胞能够满足于实验要求。采用此时的细胞进行实验，弃去瓶内原有的培养基，每瓶加入1mL PBS缓冲液洗涤残留培养基2次后，加入1mL的胰蛋白酶-EDTA消化液放入孵箱中进行消化，在倒置显微镜下观察细胞形态，直至大部分细胞变圆并能够从瓶壁上脱落时，加入1mL培养基终止消化，沿壁反复吹打细胞使其脱落并分散，转移到经过灭菌的15mL的离心管中，在1000rpm条件下离心3min，离心结束后弃去上清液，加入5mL不完全培养基，用吸管基吹打细胞使其均匀分散，吸取10μL细胞悬浮液于红细胞计数板上在倒置显微镜下进行计数，最后稀释细胞悬液使其分散均匀，使细胞浓度为2.5×105个/mL，然后将细胞悬液均匀接种于已在底部画好辅助线的六孔板中，各孔分别加入2mL细胞悬液，然后将六孔板置于孵箱中，先在37℃、5％CO2的孵箱中孵育12小时。
当细胞贴壁数量达到80％以上，用枪头和尺子对底部进行划线，每孔划3条直线，吸除培养基，用PBS洗去划掉的细胞，清洗两次，然后分别在不同孔中加入2mL含有DBeQ和N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的不完全培养基，各设2个复孔，每板均设置阳性对照及阴性对照孔。置于37℃5％CO2的细胞孵箱内培养，在0小时划痕。然后在孵育0小时，12小时和孵育24小时三个时间点取出进拍照。用ImageJ对迁移面积进行统计，对同一视野的3个时刻的结果进行统计比较。表4的数据说明，N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺抑制A549细胞迁移活性显著性强于DBeQ。本案有突出的技术效果。
表4 DBeQ及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对A549细胞迁移的影响
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与培养基比P＜0.01，与DBeQ组比P＜0.05；n＝5。
实验例7评价N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对肿瘤细胞侵袭活性
DBeQ购自MedChemExpress，PBS及培养基均购自江苏凯基生物技术股份有限公司，胎牛血清(FBS)购自CORNING，二甲基亚砜(DMSO)购自上海阿拉丁生化科技有限公司，4％多聚甲醛固定液购自索莱宝，结晶紫购自beyotime。DBeQ和N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的浓度为5μM。
将matrigel基质胶从-20℃取置4℃化成液态之后取150μL matrigel基质胶，加入1350μL的不完全培养基稀释，每孔上室加入100μL稀释液，将Transwell板放入37℃、5％CO2培养箱中培养5小时。吸除上室液体，加入50μL不完全培养基，将Transwell板放入37℃、5％CO2培养箱中培养30分钟。
采用处于生长对数期的细胞进行实验，弃去瓶内原有的培养基，每瓶加入1mL PBS缓冲液洗涤残留培养基2次后，加入1mL的胰蛋白酶-EDTA消化液放入孵箱中进行消化，在倒置显微镜下观察细胞形态，直至大部分细胞变圆并能够从瓶壁上脱落时，加入1mL培养基终止消化，沿壁反复吹打细胞使其脱落并分散，转移到经过灭菌的15mL的离心管中，在1000rpm离心3分钟，弃上清液，加入5mL不完全培养基，用吸管吹打细胞使其均匀分散，在1000rpm离心3分钟，弃上清液，再加入5mL不完全培养基，用吸管吹打细胞使其均匀分散，吸取10μL细胞悬浮液于红细胞计数板上在倒置显微镜下进行计数，最后稀释细胞悬液使其分散均匀，使细胞浓度为2.5×105个/mL；吸除上室液体，在上室每孔加入100μL细胞液，下室加入600μL完全培养基。在相应的上室中加DBeQ或N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺溶液25μL(两个复孔)，孵育15～18小时。将上室的液体吸出，加入100μL PBS清洗，棉签擦拭，重复2次，将下室液体吸出，加入600μL 4％的多聚甲醛固定液于4℃固定细胞30分钟后，吸出下室液体，清洗后，加入600μL结晶紫溶液，室温染色15分钟。染色后，回收结晶紫，将上室用蒸馏水清洗后晾干。
在每个小室中选出细胞数目均一的9个视野拍照，用ImageJ数出9个视野内的细胞数，得到迁移的平均细胞数和SD，对其进行数据统计。数据见表5.
表5 DBeQ及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对A549细胞侵袭的影响
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与培养基比P＜0.01；b)与DBeQ组比P＜0.01；n＝9。
实验例8评价N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对血清p97蛋白含量的影响
小鼠含缬酪肽蛋白(VCP)酶联免疫分析(ELISA)购自凡科维；小鼠血清为实施例4给药10天后的S180荷瘤小鼠。标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，设置两个复孔。样品孔中加入40μL样品稀释液，空白孔不加，依次向样品孔中加入10μL血清或者肿瘤蛋白，空白孔不加。每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育60分钟。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。表6的数据说明，在剂量降低至DBeQ的1/2时N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺治疗的S180小鼠血清p97蛋白含量仍然显著地低。可见，本发明有突出的技术效果。
表6 DBeQ及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对S180小鼠血清p97含量的影响
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与健康小鼠比P＜0.01；b)与生理盐水比P＜0.05；c)与DBeQ比P＜0.05；n＝9。

Claims (5)

1.一种具有下式结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2-基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺，
2.权利要求1所述结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2-基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的制备方法,其特征在于，所述方法包括以下步骤:
1)合成2-氯-N4-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺；
2)合成N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2-基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺。
3.权利要求1所述结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2-基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求1所述结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2-基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
5.权利要求1所述结构的N2-([1,1'-联苯]-3-基)-N4-(吡嗪-2-基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺在制备p97抑制剂中的应用。
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