CN105884861B - LDV修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，其制备，纳米结构，活性及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了下面结构的Leu‑Asp‑Val(LDV)修饰的1‑乙酰基‑β‑咔啉酰‑色氨酸，公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它抗肿瘤细胞粘附的作用，公开了它抗肿瘤细胞侵袭的作用，公开了它抗肿瘤细胞迁移的作用，公开了它的抗肿瘤作用，进一步公开了它抑制肿瘤向肺转移的作用。因而本发明公开了它们在医学中的应用。

Description

LDV修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，其制备，纳米结构，活 性及应用

技术领域

本发明涉及Leu-Asp-Val修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它抗肿瘤细胞粘附的作用，涉及它抗肿瘤细胞侵袭的作用，涉及它抗肿瘤细胞迁移的作用，涉及它的抗肿瘤作用，进一步涉及它抑制肿瘤向肺转移的作用。因而本发明涉及它们在医学中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

人们从天然的植物中提取了β-咔啉类化合物，这是一类吲哚类生物碱。其具有多种生物学活性，具有明确的抗肿瘤活性。用于肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌症的治疗。然而β-咔啉类化合物作为传统的细胞毒性化合物，其对于肿瘤细胞的选择性较差。随着基因学和分子生物学的研究深入在分子水平筛选对肿瘤细胞选择性高，特异性强的低毒药物成为了抗肿瘤药物发展的新方向。近年来人们对β-咔啉类化合物做了大量的修饰工作，合成了许多β-咔啉类化合的衍生物。然而这些修饰效果都不显著。其中1位引入乙酰基，3位引入色氨酸苄酯得到的化合物，其体内抗肿瘤活性和体外细胞毒活性显著优于单纯平面环的β-咔啉类化合物。然而，该类化合物对正常细胞毒性较大，水溶性差，对肿瘤细胞的特异性杀伤能力有限。因此，这种修饰的局限性仍是十分明显的。

RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素α_vβ₃的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞粘附活性。LDV三肽也通过阻断整合素家族的其他受体对肿瘤细胞的粘附转移起到明显的抑制作用。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤和抗肿瘤粘附浸润和迁移作用的化合物。发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将Leu-Asp-Val(LDV)与1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸偶联，形成的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val会同时具有抗肿瘤和抗肿瘤细胞粘附浸润和迁移作用。基于如此认识，发明人提出本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构的LDV修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸。

本发明的第二个内容是提供LDV修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的制备方法，该方法由以下步骤构成：

(1)室温下，L-Trp-OMe与1，3-二羟基丙酮在稀盐酸条件下反应48h，过滤得到滤饼。滤饼溶解于二氧六环，得到的溶液在冰盐浴下用2N的NaOH水溶液调节pH至12，反应10h，得到1-乙酰基-β-咔啉酰-3-羧酸；

(2)1-乙酰基-β-咔啉酰-3-羧酸与L-Trp-OBzl反应并皂化制备1-乙酰基-β-咔啉酰-3-色氨酸；

(3)将Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl与1-乙酰基-β-咔啉酰-3-色氨酸偶联，制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(4)将1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl脱保护，制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val。

本发明的第三个内容是评价1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val的抗细胞增殖活性。

本发明的第四个内容是评价1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val的体外抗肿瘤细胞粘附，侵袭和迁移作用。

本发明的第六个内容是评价1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val的体内抗肿瘤细胞迁移作用。

附图说明

图1.1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val的合成路线.i)CH₃OH，SOCl₂；ii)DHA，HCl；iii)2N NaOH，二氧六环；iv)Trp-OBzl，DCC，HOBt，NMM；v)2N NaOH，THF；vi)DCC，HOBt，NMM；TFA/TFSA。

图2.1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val在纯水溶液中1×10^-9M浓度下的透射电镜照片。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸甲酯

称取5g L-Trp-OMe于100ml茄瓶中，加入10ml 37℃温水搅拌溶解，加入3.3g 1，3-二羟基丙酮。室温反应36h，离心，弃去水层，沉淀晾干，得到1g(收率20％)标题化合物，为棕色固体，待用。ESI-MS(m/e)：257[M+H]⁺。

实施例2制备1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸

称取5g1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸甲酯于250ml茄瓶中，加入二氧六环溶解，冰浴缓慢加入2N NaOH水溶液调节pH12，反应13h。反应液用饱和KHSO₄水溶液调节pH8，减压浓缩。残留物用饱和KHSO₄调节pH2，有机层用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得到4g(80％)标题化合物，为棕黄色固体。ESI-MS(m/e)：241[M-H]^-。

实施例3制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸苄酯

称取2g1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸，用10ml无水THF溶解，冰浴下加入2g DCC，1.2gHOBt，搅拌30min，得溶液A。3.2g Trp-OBzl溶于15ml无水THF，缓慢加入N-甲基吗啉调节溶液pH9，得溶液B。冰浴下将B液缓慢加入A液当中，用N-甲基吗啉调节pH9，反应12h，TLC显示原料消失(石油醚：丙酮＝4∶1)。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得到的4.38g糖浆状产物用石油醚/丙酮体系干柱层析纯化(石油醚/丙酮＝4/1)得到2g(46％)标题化合物，为黄色固体产率。ESI-MS(m/e)：531[M+H]⁺。

实施例4制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸

称取2g1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp-OBzl，无水THF溶解。冰浴下加入2N NaOH水溶液，调节pH12，反应1.5h。TLC显示原料点消失(石油醚/丙酮＝2/1)，反应液用饱和KHSO₄水溶液调节pH8，减压浓缩，残留物用饱和KHSO₄调节pH2，有机层用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得到1.5g(90％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：529[M-H]^-。

实施例5制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例3的方法由3.8g(11.8mmol)Boc-Asp(OBzl)和4.7g(12.4mmol)TosH·Val-OBzl得3.9g(65％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：513.5[M+H]⁺。

实施例6制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

将3.9g(7.6mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl置于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下加入120ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，瓶口加干燥管，冰浴搅拌1小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。减压抽干反应液，加少量干燥乙酸乙酯，再抽干，重复3次；加少量无水乙醚，减压抽干，重复3次，制得3g(97％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：413[M+H]⁺。

实施例7制备Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例3的方法由9.5g(41.12mmol)Boc-Leu和17.5g(39.06mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl，得14.62g(61％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：625[M+H]⁺。

实施例8制备HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例6的方法由14.62g(23.4mmol)Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl得12.36g(94％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：525.3[M+H]⁺。

实施例9制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例3的方法由670mg1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp和1gHCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl得200mg(15％)标题化合物.ESI-MS(m/e)：948[M+H]⁺。

实施例10制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val(2)

称取50mg1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-色氨酸-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下依次加入4ml三氟甲磺酸和1ml三氟乙酸，冰浴搅拌1小时，反应结束。冰浴搅拌下加入50ml无水乙醚，析出黄色絮状固体，离心，乙醚洗3次，得黄色固体，冰浴下2NNaOH水溶液调pH＝12，反应1.5h，减压过滤除去不溶物，滤液减压浓缩，残留物经C18柱层析纯化(甲醇/水＝8/1)，得30mg(75％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：765[M-H]^-；Mp：174-175.3℃；[α]_D ²⁵＝-23.6(c＝0.08，CH₃OH)；¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.19(s，1H)，10.89(s，1H)，9.04(s，1H)，8.64(m，1H)，8.53(d，J＝9.0Hz，1H)，8.44(d，J＝9.0Hz，2H)，8.39(m，1H)，7.83(d，J＝9.0Hz，1H)，7.66(d，J＝9.0Hz，1H)，7.62(d，J＝9.0Hz，1H)，7.35(m，4H)，7.03(m，1H)，6.90(m，1H)，4.87(m，1H)，4.64(m，1H)，4.44(m，1H)，4.11(m，1H)，2.75(s，1H)，2.67(s，3H)，2.18(d，J＝9.0Hz，1H)，2.06(m，1H)，1.60(m，3H)，1.34(m，2H)，1.24(m，2H)，0.90-0.79(m，12H)；HPLC纯度97％，甲醇/水＝6/4。波长280nm，流速1ml/min。

实验例1测定化合物2的透射电镜照片

将1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val(2)按照1×10^-9M的浓度配置水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图2。结果表明，化合物2在水中均可形成纳米颗粒，直径为100-150nm。

实验例2测定化合物2的细胞毒作用

1)本发明的化合物2用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度；

2)实验用的肿瘤细胞为SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)，S180(鼠腹水瘤细胞)和HeCaT(人永生化表皮细胞)；

3)实验方法其中HL60和S180细胞株采用RPMI-1640培养基进行培养。HeLa、SH-SY5Y、HeCaT三株细胞采用DMEM培养基进行培养。培养基中均含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素；

4)贴壁细胞的培养方法分别将处于对数生长期且生长状态良好的HeLa，SH-SY5Y，HeCaT细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，37℃、5％CO₂培养箱中培养10h，按预设的浓度梯度加入预先灭菌的化合物2，对照组加入等体积的溶解样品的溶剂，继续培养48h，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4个小时，排枪小心吸去上清液后每孔加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长490nm。

5)悬浮细胞的培养方法分别将处于对数生长期且生长状态良好的HL60和S180细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，37℃，5％CO₂培养箱中培养10h，按预设的浓度梯度加入预先灭菌的化合物2，对照组加入等体积的溶解样品的溶剂，继续培养48h，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4h，3000rpm离心5min，小心吸去上清液后，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长490nm。

按照以下计算公式求出每个浓度下化合物2对肿瘤细胞的抑制率，每个浓度下实验重复三次，取平均值。平均抑制率对药物浓度作图，并求出IC₅₀值(半数有效抑制浓度)。结果列入表1。化合物2抑制5种肿瘤细胞增殖的IC₅₀均大于100μM，没有细胞毒作用。

生长抑制率＝[(空白组O.D.值-化合物2组平均O.D.值)/空白组平均O.D.值]×100％

表1化合物2抗肿瘤细胞增殖的IC₅₀值

实验例3测定化合物2的抗肿瘤活性

受试化合物化合物2；

阳性对照阿霉素；

实验动物雄性ICR小鼠，体重20±2g，购自北京维通利华动物实验技术有限公司，化合物2组每组12只小鼠，空白及阳性对照组每组各12只小鼠；

瘤源小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心提供，自行传代维持；

溶剂化合物2悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠溶液，阿霉素溶于生理盐水；

化合物2口服给药，剂量为0.1μmol/kg，每天给药一次，连续给药10天；

阴性对照口服生理盐水，剂量为0.2mL/只，每天给药一次，连续给10天；阳性对照腹

腔注射阿霉素，剂量为2μmol/kg，每天给药一次，连续给药10天；

采用自行传代的S180腹水瘤模型小鼠，取小鼠腹水S180瘤液，离心、去除杂质后，接种于健康小鼠腋下，构建S180实体瘤模型：在无菌条件下，处死腹水瘤小鼠，于75％酒精中浸泡10min消毒，取出小鼠于表面皿中晾干酒精，打开腹腔，抽取接种7天后生长旺盛S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(瘤液∶生理盐水＝1∶2)的液体，混合，离心5min(1000转)，去除细胞碎片，取细胞液于生理盐水中，用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL；

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％；

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1×10⁷个/mL的细胞悬液，于健康小鼠腋皮下接种0.2mL/只，小鼠体重为20±2g；

每天观察各组小鼠的自主活动能力，精神状态，毛发颜色，呼吸状态，饮食情况和粪便性状；

小鼠连续给药7天后，于第8天称取小鼠体重，乙醚麻醉并脱颈椎处死，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤使肿瘤完全暴露，钝性剥离，称瘤重，以表示，结果列入表2。数据统计均采用t检验和方差分析。可以看出，阿霉素的给药剂量为2μmol/kg和化合物2的给药剂量为0.1μmol/kg，化合物2治疗组小鼠的瘤重与生理盐水组比具有显著性差异。化合物2治疗组小鼠的瘤重与阿霉素(2μmol/kg)组比不具有显著性差异可见。化合物2在0.1μmol/kg剂量下具有一定的抗肿瘤作用。

表2化合物2对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

n＝12；a)与生理盐水组比P＜0.01，与阿霉素比P＞0.05

实验例4化合物2抗肿瘤细胞粘附的活性

1)受试样品

化合物2用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。

2)细胞株

高转移的HCC-LM3细胞。

3)主要试剂

DMEM培养基干粉：购自Gibco公司；

PBS缓冲液：每1L溶液中含有NaCl 8.2g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO₄0.2g，PH值7.4；

胎牛血清：购自Hyclone公司；

0.25％胰酶溶液：购自Hyclone公司；

青霉素、链霉素：购自石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；

MTT(四噻唑蓝)：购自solarbio公司，溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，过滤除菌后使用，避光保存；

DMSO(二甲基亚砜)：购自Hyclone公司；

Fn(人纤维连接蛋白)：购自Sigma公司。

4)实验方法

用PBS配制100μg/mL的Fn溶液，按100μL/孔加入96孔培养板中，将培养板置于4℃冰箱过夜。次日，吸除未包被的Fn溶液，用PBS洗一次，每孔加入含2％FBS的PBS溶液30μL封板，在37℃和5％CO₂的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长状态良好、处于对数生长期的HCC-LM3细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中，每孔100μL，同时加入化合物2 25μL，使其终浓度为20nM，在37℃、5％CO₂培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测O.D.(吸光度)值。粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率(％)＝[1-(化合物2组细胞OD值/空白组细胞OD值)]×100％；实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以表示。

6)实验结果

化合物2的抗细胞粘附实验结果列入表3。从结果中可以看出，化合物2在2μM时有较弱的抗HCC-LM3细胞与FN粘附的作用，当浓度增大到20μM时，化合物2抗HCC-LM3细胞与FN粘附的作用明显增强。

表3化合物2的体外抗肿瘤细胞粘附评价

实验例5化合物2抗肿瘤细胞侵袭的活性

1)化合物2用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为高转移HCC-LM3。

3)基质胶为matrigel。

4)实验方法

将冻存于-20℃冰箱的基质胶matrigel 4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μL Matrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个，放入37℃和5％CO₂培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μL DMEM培养基，37℃和5％CO₂培养箱中孵育30min。

HCC-LM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×10⁵个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL化合物2的溶液，使其终浓度为20μM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养48小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

5)结果见表4。可以看出，化合物2的浓度为20μM时与空白对照组相比，具有明显的抗HCC-LM3细胞侵袭作用。与发明人公开的Lys-Glu抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1mM相比，化合物2的有效浓度降低了50倍。

表4化合物2的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

n＝9；a)与空白对照组比p＜0.01。

实验例6化合物2抗肿瘤细胞迁移的活性

1)化合物2用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为高转移HCC-LM3。

3)实验方法

HCC-LM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×10⁵个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物2的溶液，使其终浓度为20μM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养8小时。

用棉签擦去上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

4)结果见表5。可以看出，在20μM浓度下化合物2与空白对照组比，发生迁移的细胞数均显著减少，说明在该条件下化合物2具有明显的抗HCC-LM3细胞迁移作用。与发明人公开的Lys-Glu抑制HCC-LM3细胞迁移的有效浓度为1mM相比，化合物2的有效浓度降低了50倍。

表5化合物2的体外抗肿瘤细胞迁移活性

n＝9；a)与空白对照组组比p＜0.01.

实验例7化合物2的抗肿瘤转移活性

受试化合物化合物2

阳性对照药阿霉素

实验动物C57BL/6小鼠，SPF级，雄性C57BL小鼠，体重18-20g，6-8周，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。接种C57BL/6小鼠的瘤源为Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，由体外细胞培养，自行传代维持。

化合物2加入少量的吐温80润湿助溶，逐渐加入0.5％CMCNa水溶液至所需要浓度即可。

化合物2组小鼠口服给药。每天给药一次，给药剂量为0.1μmol/kg，连续给药10天。阴性对照组小鼠口服生理盐水。每天给药一次，剂量为0.2mL/只，连续给10天。阳性对照剂量为以腹腔注射阿霉素。每天给药一次，给药剂量为2μmol/kg，连续给药10天。

动物模型

1)Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，购自ATCC。选用DMEM培养，其中含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素培养LLC细胞。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次，富集细胞。

2)待细胞生长状态良好、处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至1×10⁷/mL，胎盘蓝(Tryanblue)拒染实验示活细胞数＞95％。取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持ImL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL/只(含肿瘤细胞数约为2×10⁶/mL)。接种后8-10天可以生长成绿豆粒大的肿瘤，给药备用。

3)取接种8-10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，颈椎脱臼，用75％乙醇浸泡消毒10min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重(g)∶生理盐水体积(mL)为1∶3的比例加入4℃预冷的生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×10⁷/mL，胎盘蓝(Tryanblue)拒染试验示活细胞数＞95％。

4)取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL(含肿瘤细胞数约为2×10⁶/mL)。接种后8-10天可以生长成绿豆粒大的肿瘤，测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积分组进行给药。

5)每天观察各给药组小鼠的自主活动能力、精神状态、毛发颜色、呼吸状态、饮食情况、粪便性状。

6)每组连续给药10天后，于第11天称取小鼠体重，乙醚麻醉并脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤使肿瘤完全暴露，钝性剥离，称重。

7)用镊子固定小鼠右腋部位，剪开皮肤使双肺完全暴露，钝性剥离双肺，称重，并迅速放入生理盐水中保存。统计双肺的瘤节转移数和转移例数。

8)实验结果列入表6和表7。从表6可知，在0.1μmol/kg的给药剂量下，化合物2除有效地抑制Lewis瘤生长。剂量比阿霉素低20倍时，化合物2抑制Lewis瘤生长的活性与阿霉素没有统计学差异。可见，化合物2抑制Lewis瘤生长的活性是阿霉素的20倍。从表7可知，在0.1μmol/kg的给药剂量下，化合物2除有效地减少瘤节转移例数和转移个数。

表6化合物2在Lewis肺癌转移模型中的抑瘤率

n＝12；a)与生理盐水组比P＜0.01，与阿霉素组比P＞0.05.

表7化合物2在Lewis肺癌转移模型中的转移瘤节和转移例数

n＝12；a)与生理盐水组比，P＜0.01。

Claims (6)

1.下面结构的Leu-Asp-Val(LDV)修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸

2.权利要求1的Leu-Asp-Val修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的制备方法,该方法由以下步骤构成:

(1)室温下,L-Trp-OMe与1,3-二羟基丙酮在稀盐酸条件下反应48h,过滤得到滤饼，滤饼溶解于二氧六环,得到的溶液在冰盐浴下用2N的NaOH水溶液调节pH至12,反应10h,得到1-乙酰基-β-咔啉酰-3-羧酸；

(2)1-乙酰基-β-咔啉酰-3-羧酸与L-Trp-OBzl反应并皂化制备1-乙酰基-β-咔啉酰-3-色氨酸；

(3)将Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl与1-乙酰基-β-咔啉酰-3-色氨酸偶联,制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(4)将1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl脱保护制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Leu-Asp-Val。

3.权利要求1的Leu-Asp-Val修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的纳米颗粒。

4.权利要求1的Leu-Asp-Val修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1的Leu-Asp-Val修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸在制备抗肿瘤细胞粘附、迁移和侵袭药物中的应用。

6.权利要求1的Leu-Asp-Val修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸在制备抗肿瘤转移药物中的应用。