CN112107574A

CN112107574A - 柳穿鱼黄素在制备抗食管癌药物中的应用

Info

Publication number: CN112107574A
Application number: CN202011054487.3A
Authority: CN
Inventors: 刘康栋; 董子钢; 朱芳丽; 郭智萍; 刘鑫宁; 赵继敏; 赵四敏; 江亚南; 董子明
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2020-12-22

Abstract

本发明公开一种柳穿鱼黄素在制备抗食管癌药物中的应用，柳穿鱼黄素，名称为：5,7‑二羟基‑4’,6‑二甲基甲酰胺，本发明验证了柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞的抑制作用；验证了柳穿鱼黄素在人源化移植模型（PDX）上预防和治疗食管癌的显著效果。研究结果表明：柳穿鱼黄素能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖及抑制食管鳞癌细胞克隆形成；经柳穿鱼黄素处理的小鼠的肿瘤体积与对照组比较具有显著的统计学差异。从而显示了柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞有显著的抑制效果和预防、治疗食管癌的显著效果。因此，柳穿鱼黄素能够作为一种现有的临床使用药物起到对食管鳞癌的预防及治疗作用。

Description

柳穿鱼黄素在制备抗食管癌药物中的应用

技术领域

本申请属于癌症生物医药领域，具体涉及柳穿鱼黄素在制备抗食管癌药物中的应用。

背景技术

食管癌（Esophageal cancer，EC）是威胁人类生命安全的主要癌症之一。在亚洲的部分国家以及一些低收入国家如南非等，食管癌都严重影响了人们的生命。食管癌的主要病理分型为食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma，EAC）。在中国地区，食管鳞癌的发病率占食管癌发病率的90%以上，尤其是一些平原地区，如河南，河北。由于缺乏有效的早期诊断，食管癌诊断往往都处于中晚期，导致预后不良。目前手术仍然是治疗食管癌的主要方式，但是术后复发率很高。研究表明，手术后应用化学预防药物可以很好的预防肿瘤的复发，因此急需发现低毒高效的药物来延缓食管癌的复发，提升患者的生存率。目前针对食管癌、胃癌使用多学科综合治疗的治疗原则，包括手术，放射治疗、化学治疗、靶向治疗等，首选手术治疗的方法。尽管诸如手术、放化疗等综合治疗的手段不断进步，但食管癌患者的预后及5年生存率仍然较差。

强调肿瘤的早期发现和治疗，忽视肿瘤的预防是不可取的。肿瘤的化学预防是指利用天然、合成或生物物质来阻止、减缓或者逆转癌症发生发展过程，从而降低癌症发生率和死亡率的方法策略。目前已有两千三百余种化合物用于肿瘤的化学预防，经体外实验、动物试验或人体初步应用证明有较好效果的约为20-30种。

PDX(patient derived xenograft)模型是利用癌症患者的癌组织在免疫缺陷小鼠身上建立的皮下移植瘤模型,依靠小鼠提供的微环境进行生长，该模型生物学稳定,保持了原代肿瘤的特点，异种移植的模型可能是最接近目前人类癌症特点。选择自发性肿瘤通常比用试验方法诱发的肿瘤与人类所患的肿瘤更为相似，有利于将动物实验结果推用到人。与人癌细胞系建立的动物模型相比，PDX模型减少了体外处理过程,能更好地保持患者临床肿瘤组织的原有生物学特性和组织学特征，并且PDX模型取材于不同的患者,可以保留了患者肿瘤的异质性，不仅可以检测治疗功效，也是符合癌症生物学治疗基本原则的一种工具和手段，还可以帮助测试新的抗肿瘤药物的疗效，同时也为肿瘤发生发展的机制研究提供了新的方法，为一对一的个体化抗癌治疗提供了可能。

发明内容

本发明目的在于提供柳穿鱼黄素在制备抗食管癌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

柳穿鱼黄素是一种黄酮类化合物，广泛存在于水果、蔬菜和中草药植物中，具有明显的抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性，Pectolinarigenin，分子式：C₁₇H₁₄O₆，分子量：314.29，CAS号：520-12-7。

本发明提供了一种化合物在抑制食管鳞癌细胞增殖及对食管鳞癌进行化学预防的应用，即柳穿鱼黄素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖及对食管鳞癌进行化学预防药物中的应用。

进一步的，柳穿鱼黄素在浓度为1-20 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450增殖及抑制食管鳞癌细胞克隆形成，以及诱导细胞凋亡。柳穿鱼黄素在药物剂量为2-10 mg/kg/天时在人源化移植模型（PDX）上明显抑制食管癌LEG110的肿瘤体积的生长。

本发明经研究发现：柳穿鱼黄素能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖及抑制食管鳞癌细胞克隆形成，以及诱导细胞凋亡。也就是发现了柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞生长的抑制作用。柳穿鱼黄素对食管癌产生抑制作用的适宜浓度为：1-20 μM。柳穿鱼黄素在药物剂量为2-10 mg/kg/天时在人源化移植模型（PDX）上明显抑制食管癌LEG110的肿瘤体积的生长。柳穿鱼黄素按剂量2-10mg/kg/天（其他动物使用剂量请使用相应换算公式）用于预防食管鳞癌病变。

附图说明

图1为柳穿鱼黄素的化学结构式；

图2为柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞的毒性作用，其中，柳穿鱼黄素在浓度范围为:2.5 μM-80 μM时对食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450有明显的毒性作用；

图3为柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞的抑制作用，其中，柳穿鱼黄素在浓度范围为:1 μM-20 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450的增殖；图中为加药不同浓度在不同时间点的食管鳞癌细胞细胞增殖曲线；图中为已加药组与对照组数量之间的统计结果：*p<0 .05 ，**p<0 .01，***p<0 .001；

图4为柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成。其中，随着加药浓度的增加，克隆数显著降低；图中为已加药组以及对照组克隆数量的统计结果；*p<0 .05 ，** p<0 .01， ***p<0 .001；

图5为柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成。其中，随着加药浓度的增加，克隆数显著降低，并且克隆明显变小；图中为相应组的克隆照片；

图6为来源于患者食管鳞癌组织的异种移植肿瘤模型小鼠加药处理21天，小鼠体内肿瘤体积统计结果；*p<0 .05 ， **p<0 .01 ，***p<0 .001；

图7为来源于患者食管鳞癌组织的异种移植肿瘤模型小鼠加药处理21天，每只小鼠体内肿瘤体积统计结果；

图8为来源于患者食管鳞癌组织的异种移植肿瘤模型小鼠加药处理21天，小鼠体重变化统计结果；*p<0 .05 ， **p<0 .01 ， ***p<0 .001；

图9为来源于患者食管鳞癌组织的异种移植肿瘤模型小鼠加药处理21天，小鼠处死后肿瘤块拍照对比结果；*p<0 .05 ， **p<0 .01 ， ***p<0 .001；

图10为来源于患者食管鳞癌组织的异种移植肿瘤模型小鼠加药处理21天，小鼠处死后肿瘤块称量统计结果；*p<0 .05， **p<0 .01 ，***p<0 .001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用试验

材料与方法

1 .材料

1 .1试剂

柳穿鱼黄素购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度为98%；4 %多聚甲醛购自郑州派尼化学试剂厂；戊巴比妥钠购自国药集团化学试剂有限公司；生理盐水购自辰欣药业股份有限公司；DMSO购自美国sigma-aldrich公司；琼脂粉购自北京索来宝科技有限公司；BasalMedium Eagle购自美国sigma-aldrich公司；L-谷氨酰胺购自北京索莱宝科技有限公司；NaHCO3 购自天津市凯通化学试剂有限公司；胎牛血清购自以色列Biological Industries公司；青霉素和链霉素购自华北制药股份有限公司；RPMI-1640、DEME培养基购自以色列Biological Industries公司；F-12K培养基购自美国Gibco公司；Fetal Bovine Serum购自以色列Biological Industries公司；DAPI购自北京索莱宝科技有限公司；0.25%胰酶购自上海碧云天生物技术有限公司。

1 .2仪器与耗材：

细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；电子天平（德国Eppendorf公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；倒置显微镜（日本尼康公司）；超净工作台（苏州净化有限公司）；高内涵细胞成像分析系统（GE Healthcare）；6孔板、96孔板（无锡耐思生物科技有限公司）；5ml、15ml移液管（广州洁特生物过滤股份有限公司）；手动移液器（法国Gilson(吉尔森)公司）；电动移液器（北京大龙兴创实验仪器）；多道移液器（德国Eppendorf公司）；15ml离心管（美国 Corning 公司）；10 cm 细胞培养皿（无锡耐思生物科技有限公司）。

1 .3细胞系：

人食管鳞癌细胞系KYSE150、KYSE450，均来自于郑州大学基础医学院病理学与病理生理学系。食管鳞癌细胞系KYSE150采用10% FBS/ RPMI-1640培养基，KYSE450采用10%FBS/DMEM，培养箱内37℃恒温、5% CO₂条件下培养、备用。

1.4肿瘤组织：

本发明使用了1例人食管癌组织标本，模型编号为LEG110。LEG110来源于河南省肿瘤医院。本发明LEG110模型为第6代。

1.5实验动物：

本实施例中Cb-17 SCID免疫缺陷小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公可。许可证编号为:SCXK(京)2012- -0001 ，SPF级，5- 6周龄，体重16-18g ，雌鼠。小鼠饲料购于北京华阜生物科技股份有限公司。实验动物饲养于郑州大学基础医学院实验动物室，在恒温(25-27℃ )、恒湿(45%-50%)、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌( SPE级)饲养室条件下饲养，每个饲养盒内饲养8只动物，经无菌处理的饲料供动物自由摄入,高温消毒的垫料每三天更换一次，笼具及饮水每三天高温消毒一次，饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。将实验动物在12:12小时光照/黑暗循环下饲养，可以自由接近食物和水。

1.6药品的制备：

细胞实验所用药品用DMSO溶解成相应浓度；动物实验所用化合物用生理盐水（5%DMSO增加溶解度）溶解后腹腔注射。

2方法

2 .1 细胞毒性实验

食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450，培养至3-6代，显微镜下观察，细胞形态和状态良好，汇合度为90%左右，无杂质，无污染，用于做实验。种于96孔板，每孔分别8000、12000个细胞，同样的96孔板铺2块，分别为24 h和48 h，培养箱内37℃恒温、5% CO₂条件下培养，16-24h细胞贴壁后，加入相应浓度的含柳穿鱼黄素的培养基100μl（柳穿鱼黄素在培养基中的终浓度依次为2.5 μM 、5 μM、 10 μM、20 μM、40 μM、80 μM），每个浓度有五个复孔，并设置空白对照。于24 h、48 h后依次取出相应的96孔板，加入100 μl含4%多聚甲醛的溶液对细胞在室温下固定30 min，再加入100 μl DAPI染液（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）在37℃，5% CO₂的培养箱培养30 min，利用高内涵细胞成像分析系统对板中细胞进行拍照和计数。

2 .2 细胞增殖实验

食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450，显微镜下观察，细胞形态和状态良好，汇合度为90%左右，无杂质，无污染，用于做实验。种于96孔板，每孔分别3000、5000个细胞，同样的96孔板铺5块，分别为0h、24 h、48 h、72h和96h，培养箱内37℃恒温、5% CO₂条件下培养，16-24h细胞贴壁后，取出0h的96孔板，并固定、染色、计数，其余板加入相应浓度的含柳穿鱼黄素的培养基100μl（柳穿鱼黄素在培养基中的终浓度依次为1 μM、5 μM、10 μM、20 μM），每个浓度有五个复孔，并设置空白对照。于24 h、48 h、72h、96h后依次取出相应的96孔板，加入100 μl含4%多聚甲醛的溶液对细胞在室温下固定30 min，再加入100 μl DAPI染液（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）在37℃，5% CO₂的培养箱培养30 min，利用高内涵细胞成像分析系统对板中细胞进行拍照和计数。

2 .3软琼脂克隆形成实验

将下层胶与相应浓度的柳穿鱼黄素混匀，使其终浓度达到0 μM、1 μM、5 μM、10 μM、20μM后，将配制好的含药下层胶依次加入6孔板中，每孔铺3 ml，每个药物浓度铺3个复孔，在超净工作台中静置1 h。消化3-6代的食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450，用配置出的10%FBS-BME稀释后加入上层胶，将上层胶与相应浓度的柳穿鱼黄素混匀，使其终浓度达到0、1 μM、5μM、10 μM、20 μM后，将上述配置好的上层胶，贴壁加入6孔中，每孔加入1 ml，此时每孔有8000个细胞，静置2 h后放入5% CO₂、37℃的培养箱中。在培养箱内37℃恒温、5% CO₂条件下培养5-14天。待显微镜下观察趋势明显，可利用高内涵细胞成像分析系统对板中克隆进行拍照和计数。其中胶体配方如下：

2.4人源性食管鳞癌移植瘤模型

将新鲜肿瘤组织取出坏死组织，剪成直径为3立方毫米左右，塞入6周龄、18g左右的雌性小鼠的背部皮下。将小鼠放入小鼠IVC系统饲养。等待肿瘤形成约I5mm左右，无菌切除皮下肿瘤，选择实性肿块，取材剪成3立方毫米小块，移植于另外小鼠。颈椎脱臼处死小鼠，肿瘤周围皮肤用75%酒精消毒，用溶药针扎开一个小口，用镊子撑开后取出肿瘤放到小鼠皮下。

用上述方法进行肿瘤传代，至第三代小鼠，小鼠皮下移植瘤均出现且肿瘤大小差异不大。再移植至免疫缺陷小鼠皮下，传三代。分别记录每一次皮下移植瘤小鼠肿瘤生长情况及成瘤率。

2.5实验动物的治疗研究

接种后一周或者两周后，小鼠背部肿瘤结节长到100立方毫米左右时开始分组，即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，每组分10只以上。3组小鼠分别按照以下剂量自由饮水。当对照组小鼠肿瘤长到1000立方毫米左右时，终止实验，取下背部皮下肿瘤并称重。

A对照组:不处理；

B柳穿鱼黄素低剂量组：每天以2mg/kg小鼠体重腹腔注射；

C柳穿鱼黄素高剂量组：每天以10mg/kg小鼠体重腹腔注射；

每周两次记录小鼠体重以及肿瘤体积，当对照组小鼠肿瘤体积长到1000立方毫米左右(约30天)，终止实验，取出肿瘤组织，称量肿瘤重量以及拍照。

实验结果

柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞具有毒性作用，其中，柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450产生毒性作用的浓度范围为：2.5 μM-80 μM（见图2）。图2为以对照组为100%时加药不同浓度在不同时间点的细胞存活率。当柳穿鱼黄素浓度为20μM时，KYSE150细胞存活率24h和48h分别为49.20 %，26.73 %，KYSE450细胞存活率24h和48h分别为48.44 %，35.12 %。

柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞具有抑制作用，其中，柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖的浓度范围为：1 μM-20 μM（图3）；图中为加药不同浓度在不同时间点的食管鳞癌细胞细胞增殖曲线；图中为已加药组与对照组数量之间的统计结果：*p<0 .05 ，**p<0 .01 ，***p<0 .001；具体地，柳穿鱼黄素在浓度为1 μM-20 μM时，在培养72h后对KYSE150、KYSE450细胞的增殖抑制效果显著。

柳穿鱼黄素能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成。其中，随着加药浓度的增加，克隆数显著降低（图4）；图中为已加药组以及对照组克隆数量的统计结果；*p<0 .05 ，**p<0 .01 ，***p<0 .001；具体地，柳穿鱼黄素在浓度为5 μM-20 μM时，显著抑制KYSE150细胞克隆形成，在浓度为10μM-20 μM时，显著抑制KYSE450细胞克隆形成。

柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成(图5)。其中，随着加药浓度的增加，克隆数显著降低，并且克隆明显变小；图中为相应组的克隆照片。

柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌PDX小鼠肿瘤的生长（图6）。给药组与对照组相比有统计学意义，随着给药天数的增加，对照组与给药组（2mg/kg、10mg/kg）小鼠体内肿瘤的体积差异逐渐增大；*p<0 .05 ，**p<0 .01 ，***p<0 .001；

柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌PDX小鼠肿瘤的生长，为了更加直观观察肿瘤生长情况，做出对照组、低剂量（2mg/kg）、高剂量（10mg/kg）组中每只小鼠体内肿瘤体积统计结果（图7）；

柳穿鱼黄素打药组与对照组相比不影响小鼠的体重（图8）；说明柳穿鱼黄素对小鼠无明显的毒性作用。

柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌PDX小鼠肿瘤的生长，将小鼠打麻药颈椎脱臼处死后取出肿瘤块拍照进行对比（图9），其中低剂量（2mg/kg）、高剂量（10mg/kg）组小鼠肿瘤体积明显较对照组小；

柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌PDX小鼠肿瘤的生长，将小鼠打麻药颈椎脱臼处死后取出肿瘤块并进行称量统计（图10）；*p<0 .05 ，**p<0 .01 ，***p<0 .001。

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。

Claims

1.柳穿鱼黄素在制备抗食管癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，柳穿鱼黄素在制备抑制食管鳞癌细胞生长和转化药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，柳穿鱼黄素在浓度为1μM~20μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，柳穿鱼黄素在制备抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤生长药物的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，柳穿鱼黄素在浓度2 mg/kg/天-10 mg/kg/天时能抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤的生长。