CN111821301A

CN111821301A - 盐酸罗拉匹坦在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN111821301A
Application number: CN202010921659.6A
Authority: CN
Inventors: 刘康栋; 杨宁; 董子钢; 赵继敏; 江亚南; 张静; 董子明
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2020-10-27

Abstract

本申请公开盐酸罗拉匹坦在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物医药技术领域。所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。本申请通过对食管癌细胞、胃癌细胞进行药物处理，对盐酸罗拉匹坦抑制食管癌、胃癌、以及其他肿瘤增殖的效果做了具体评价。研究结果表明：盐酸罗拉匹坦能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖、克隆的形成，以及胃癌细胞AGS、HGC27的增殖，从而显示了盐酸罗拉匹坦对于癌症细胞有显著的抑制效果。因此，对于盐酸罗拉匹坦应用到对肿瘤的预防、治疗和预防复发过程中，用来制备抗肿瘤药物有一定的可行性。

Description

盐酸罗拉匹坦在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及盐酸罗拉匹坦在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)的统计，每年有超过1400万新确诊癌症病人，并有800万死亡病例与癌症相关。消化道肿瘤占据全球肿瘤发病率第二位，每年新发90万例，死亡17万例，多为50岁以上者，但低龄化趋势明显，40岁以下人群的发病率在上升。

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是世界上癌症死亡的第六大原因，全球约有70%的食管癌发生在中国。食管癌主要分为两种组织学类型：食管鳞状细胞癌和食管腺癌。在中国，食管癌是癌症相关死亡的第五大原因，每年约有25万人因食管癌死亡，其中大部分（> 90%）为食管鳞状细胞癌。食管鳞状细胞癌病因复杂，早期不易诊断，中晚期患者治疗后复发率高，五年生存率不足20%。

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率呈明显上升趋势。我们发现对消化道癌症的化学预防药物的研究变得尤为重要。

老药新用，即利用已知的药物来治疗非适应症等疾病，随着科学家们研究的深入，其常常会在研究中偶然发现有些药物可以用来治疗一些别的人类疾病，且效果还非常理想，副作用低。因此，本申请在众多药物中筛选出盐酸罗拉匹坦这一化疗止吐药物，发现了其抑制肿瘤细胞增殖的功能。盐酸罗拉匹坦，是一种长效NK-1受体拮抗剂，已获FDA批准，联合其他止吐剂用于预防致吐性癌症化疗（包括但不限于高度致吐性癌症化疗）初次或多次治疗相关的迟发性恶心及呕吐。本发明经研究发现：盐酸罗拉匹坦对肿瘤细胞的增殖、克隆有抑制作用，结合其本身的化疗止吐药的作用，这一发现将对癌症病人的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种盐酸罗拉匹坦在制备抗肿瘤药物中的应用。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

盐酸罗拉匹坦在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。

盐酸罗拉匹坦，分子式：C₂₅H₂₉ClF₆N₂O₃，分子量：554.953，CAS号为：914462-92-3，结构式如下：

。

所述的治疗食管癌和胃癌及其它肿瘤药物中含有盐酸罗拉匹坦和其药用盐中的至少一种。

所述的抗肿瘤药物的体外剂量范围为2.5-20 μM，其临床应用的成人的剂量为0-30mg/kg/天。

所述的抗肿瘤药物，所述的治疗食管癌和胃癌及其它肿瘤药物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型。

所述的抗肿瘤药物可以制备成片剂、胶囊、粒剂、片剂、注射溶液的形式。

所述的治疗食管癌和胃癌及其它肿瘤药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂。

所述的抗肿瘤药物，所述的治疗食管癌和胃癌及其它肿瘤药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。

盐酸罗拉匹坦在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用，盐酸罗拉匹坦在浓度为2.5μM~10μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。

进一步地，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞。

进一步地，盐酸罗拉匹坦在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用。

进一步地，盐酸罗拉匹坦在浓度为5μM~10μM时能够抑制胃癌细胞的增殖，所述胃癌细胞为HGC27细胞和/或AGS细胞。

盐酸罗拉匹坦在制备抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用，进一步地，盐酸罗拉匹坦在浓度25mg/kg—100mg/kg时能抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。

本申请通过对食管癌细胞、胃癌细胞进行药物处理，对盐酸罗拉匹坦抑制食管癌、胃癌、以及其他肿瘤增殖的效果做了具体评价。研究结果表明：盐酸罗拉匹坦能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖，克隆的形成，以及胃癌细胞AGS、HGC27的增殖，从而显示了盐酸罗拉匹坦对于癌症细胞有显著的抑制效果。因此，对于盐酸罗拉匹坦应用到对肿瘤的预防、治疗和预防复发过程中，用来制备抗肿瘤药物有一定的可行性。

附图说明

图1为盐酸罗拉匹坦在对食管鳞癌及胃癌细胞的毒性实验结果。

图2盐酸罗拉匹坦在对食管鳞癌及胃癌细胞不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线，(*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001)。

图3盐酸罗拉匹坦抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450克隆形成。小图中为相应组的克隆显微照片以及对照组克隆数量的统计结果 (*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001)。

图4为经盐酸罗拉匹坦处理后小鼠瘤组织体积和重量的变化，*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001。

具体实施方式

材料与方法

1 材料与试剂

盐酸罗拉匹坦上海芮晖化工科技有限公司（纯度99%）

食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450以及胃癌细胞HGC27、AGS来自郑州大学基础医学院病理生理学教研室

青霉素华北制药股份有限公司

链霉素山东鲁抗医药股份有限公司

FBS 以色列 Biological Industries 公司

RPMI-1640 培养基以色列 Biological Industries 公司

DMEM 培养基以色列 Biological Industries 公司

F12K（Gibco）

0.25%胰酶上海碧云天生物科技有限公司

无血清细胞冻存液苏州新赛美生物科技有限公司

DAPI 北京索莱宝科技有限公司

琼脂粉美国 B&D 公司

PBS 粉末北京索莱宝科技有限公司

BME 粉末美国 SIGMA-ALDRICH

L-谷氨酰胺北京索莱宝科技有限公司

NaHCO₃天津市凯通化学试剂有限公司

多聚甲醛粉天津市光复精细化工研究所

胎牛血清美国 BI 公司

仪器与器材：

1.5ml 离心管美国 Axygen 公司

15ml 离心管美国 Corning 公司

96 孔细胞培养板无锡耐思生物科技有限公司

10 cm 细胞培养皿无锡耐思生物科技有限公司

15 cm 细胞培养皿美国 Thermo Fisher Scientific 公司

一次性移液管广州洁特生物过滤股份有限公司

In Cell Analyzer 6000高内涵细胞成像分析系统美国 GE 公司

移液器美国 Gilson 公司

超净工作台（苏州净化有限公司）

干燥 CO2 培养箱上海一恒科学仪器有限公司

高速低温离心机德国 Eppendorf 公司

真空抽吸泵海门市其林贝尔仪器制造有限公司

倒置显微镜德国 Carl Zeiss Jena 公司

雪花制冰机日本 SANYO 公司

Mili-Q 纯水仪美国 Millipore 公司

本发明使用了1例人食管癌组织标本，编号为EG20。患者来源于河南省肿瘤医院，男性，46岁，病例分期T2N0M0II，中分化。

2方法

细胞悬液的制备：显微镜下观察细胞生长状态，当细胞状态良好，且细胞数量符合实验要求时，抽掉原来的培养基，用1×PBS洗2次，尽量洗去残留的完全培养基以免影响消化，每个10 cm 培养板中加入1 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动使胰酶均匀铺满整个培养板，放入培养箱进行消化，消化结束后，显微镜下观察细胞，当细胞变圆时，轻轻拍打培养板边缘使细胞脱落，加入5 mL完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞呈单细胞状态，将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000 rpm离心3 min，抽去上清，向细胞沉淀中加入12 mL完全培养基，轻轻吹打使细胞分散均匀；

细胞计数：取干净的计数杯，加入19.5 mL计数液，抽取0.5 mL细胞悬液加入其中，轻轻吹打使细胞分散均匀，计数仪计数。重复计3次，求平均值，因计数前细胞悬液被稀释了40倍，故平均值乘以40即为细胞浓度；

细胞毒性实验

铺板及加药：将食管鳞癌细胞、胃癌细胞种于96孔板，HGC27每孔约6000个细胞，KYSE150及AGS每孔约8000个细胞，KYSE450每孔约12000个细胞，放入37℃，5% CO₂的培养箱进行培养12-16 h（KYSE150细胞：10%FBS/ RPMI-1640；KYSE450细胞：10%FBS/DMEM；HGC27细胞：10%FBS/ RPMI-1640；AGS细胞：10%FBS/F12K）。之后分别加入不同量盐酸罗拉匹坦，使药物在培养基中的终浓度分别为0、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM，处理24 h和48 h。取出后加入100 μl含4%多聚甲醛的溶液对细胞在室温下固定30 min。

DAPI染色及统计：根据实验需要配制所需量的DAPI工作液（DAPI储存液：1×PBS=1:3000，北京索莱宝科技有限公司），每孔加入100 μl，避光，放入37℃培养箱中孵育20min，倒掉DAPI工作液，用温和的1×PBS洗2次后，每孔加入100 μl 新的1×PBS。用高内涵细胞成像分析系统拍照分析，统计细胞数，绘制折线图，实验结果如图1所示。

细胞增殖实验

铺板及加药：将食管鳞癌细胞、胃癌细胞种于96孔板，KYSE150、HGC27及AGS每孔约3000个细胞，KYSE450每孔约5000个细胞（KYSE150细胞：10%FBS/ RPMI-1640；KYSE450细胞：10%FBS/DMEM；HGC27细胞：10%FBS/ RPMI-1640；AGS细胞：10%FBS/F12K），放入37℃，5% CO₂的培养箱进行培养12-16 h。之后分别加入不同量盐酸罗拉匹坦，使药物在培养基中的终浓度分别为0、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM，分别在0、24、48、72、96 h加入100 μl 4%多聚甲醛的溶液对细胞在室温下固定30 min。

DAPI染色及统计：根据实验需要配制所需量的DAPI工作液（DAPI储存液：1×PBS=1:3000），每孔加入100 μl，避光，放入37℃培养箱中孵育20 min，倒掉DAPI工作液，用温和的1×PBS洗2次后，每孔加入100 μl 新的1×PBS。用高内涵细胞成像分析系统拍照分析，统计细胞数。每个药物浓度做一条曲线，以时间为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制折线图，统计72 h和96 h各浓度之间的差异，结果如图2所示。

锚定非依赖性生长实验

将BME培养基（含10% FBS和 0.5%琼脂）铺于6孔板，3ml/每孔，待培养基凝固后，铺入混悬有KYSE150细胞（8000个/每孔）；KYSE450细胞的（8000个/每孔）上层胶（1ml的含药BME培养基，培养基总含10%FBS和0.33%的琼脂，培养基中的药物终浓度分别为0 μM、2.5 μM、5 μM、7.5 μM、10 μM），37℃、5%CO₂培养7天，待克隆形成后取出，利用机器拍照，统计细胞克隆数，结果如图3所示。

食管癌动物模型的构建（PDX免疫缺陷小鼠模型）

选用6-8 周龄雌性SCID小鼠，按5只/笼标准条件饲养，恒温（22～25℃），恒湿（40～60%），麻醉后背部植入来自河南省肿瘤医院的中分化的食管鳞癌EG20肿瘤组织。在肿瘤组织离体后的90 min内，置于无血清的1640培养基中冷藏运送至实验室。在进行组织接种前，肿瘤组织需要用含有青霉素链霉素的PBS（PBS:双抗 50:1）冲洗后置于冰上，等待接种。小鼠腹腔注射0.4%的戊巴比妥钠使其进入麻醉状态后，将组织切成10-15 mm³的小块，用镊子种植于小鼠颈背部皮下，等待小鼠麻醉苏醒后送回无菌饲养室。待小鼠生长状态正常，将荷瘤小鼠随机分成3 组，第一组为对照组（饮用无菌蒸馏水），第二组为盐酸罗拉匹坦低剂量组（25 mg/kg/d，溶剂为10v%DMSO的生理盐水），第三组为盐酸罗拉匹坦高剂量组(100 mg/kg/d，溶剂为10v%DMSO的生理盐水)，按照此分组开始每天灌胃口服盐酸罗拉匹坦，每周称重两次并测量一次瘤体积，瘤体积=（长径×短径×短径）/2。当对照组小鼠瘤组织达到1000mm³时，处死小鼠并取出瘤组织，称量瘤重并按照瘤组织大小顺序依次排列，拍照留图。将实验所得数据绘图及SPSS分析，计算是否有差异且是否有统计学意义，结果如图4所示。

实验结果

1. 图1的结果表明盐酸罗拉匹坦在浓度范围为6.25-50μM时对食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450以及胃癌细胞HGC27、AGS的细胞有一定毒性作用（对照组为100%时加药不同浓度在不同时间点的细胞存活率）。

2. 图2的结果表明，盐酸罗拉匹坦在浓度为2.5-10μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450以及胃癌细胞HGC27、AGS的增殖能力，具体地，其中，盐酸罗拉匹坦在浓度为5μM时，在培养96h后对KYSE150细胞的抑制作用显著，浓度为7.5μM时在培养72h后对KYSE150细胞的抑制作用显著，在浓度为10μM时，在培养48h后对KYSE150细胞的抑制作用显著，盐酸罗拉匹坦在浓度为7.5μM时，在培养72h后对KYSE450细胞的抑制作用显著，在浓度为10μM时，在培养48h后对KYSE450细胞的抑制作用显著；盐酸罗拉匹坦在浓度为5μM时，在培养96h后对AGS细胞的抑制作用显著，在浓度为7.5μM、10μM时，在培养72h后对AGS细胞的抑制作用显著；盐酸罗拉匹坦在浓度为5μM时，在培养96h后对HGC27细胞的抑制作用显著，在浓度为7.5μM、10μM时，在培养72h后对HGC27细胞的抑制作用显著，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

3. 图3为食管癌细胞增殖实验和软琼脂克隆形成实验，表明随着盐酸罗拉匹坦浓度的增加，对食管鳞癌细胞增殖能力和软琼脂克隆形成能力的抑制作用增强，在浓度为2.5μM~10μM时，克隆数显著降低，并且克隆明显变小（*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001）。

综上可以看出：本发明经研宄发现盐酸罗拉匹坦能够抑制食管鳞癌KYSE150、KYSE450细胞的增殖，克隆的形成以及抑制胃癌HGC27，AGS细胞的增殖。

4. 图4为经盐酸罗拉匹坦处理后小鼠瘤组织体积和重量的变化。经过毒性实验发现，口服盐酸罗拉匹坦后，高剂量组和低剂量组（25 mg/kg/d,100 mg/kg/d），小鼠体重均未发生明显变化，说明盐酸罗拉匹坦对小鼠无明显的毒性作用，且高剂量组在肿瘤体积和肿瘤重量上显著优于低剂量组。其中，盐酸罗拉匹坦浓度在成人正常口服剂量（换算为小鼠口服剂量为25 mg/kg/d）时，可以明显抑制SCID 食管鳞癌PDX模型小鼠肿瘤的增长，瘤组织体积和重量均有明显降低，由此表明盐酸罗拉匹坦在体内可抑制食管鳞癌的增殖。（*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001）

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。

Claims

1.盐酸罗拉匹坦在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，盐酸罗拉匹坦在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，盐酸罗拉匹坦在浓度为2.5μM~10μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，盐酸罗拉匹坦在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，盐酸罗拉匹坦在浓度为5μM~10μM时能够抑制胃癌细胞的增殖。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胃癌细胞为HGC27细胞和/或AGS细胞。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，盐酸罗拉匹坦在制备抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，盐酸罗拉匹坦在浓度25mg/kg—100mg/kg时能抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。