CN113384591B

CN113384591B - 栓菌酸与索拉非尼联用药物及在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN113384591B
Application number: CN202110720717.3A
Authority: CN
Inventors: 汪鋆植; 万雨莲; 邓改改; 颜华玲; 高谦; 黄永梅; 袁圆; 张亭亭
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113384591A

Abstract

本发明提供一种栓菌酸与索拉非尼在体内体外联合用药在抗癌中的应用，为保证索拉非尼对多种肿瘤治疗效果并克服索拉非尼耐药提供方法，对治疗索拉非尼耐药、改善晚期癌症患者疗效提供治疗方案。1、TAB和索拉非尼联用，具有协同抑制肿瘤作用。在体内外均能增强对消化、呼吸系统多种肿瘤细胞增殖抑制。2、TAB和索拉非尼联用，可克服索拉非尼耐药，用于索拉非尼耐药肿瘤治疗。3、TAB和索拉非尼联用可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活及下调c‑RAF激酶、VEGFR‑2蛋白的表达，增强对索拉非尼的敏感性。

Description

栓菌酸与索拉非尼联用药物及在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种栓菌酸与索拉非尼联用药物，并将其应用于多种肿瘤细胞的治疗药物中。

背景技术

癌症是严重影响人类健康的重大疾病，靶向治疗是目前最好的治疗手段之一。但靶向药物的耐药越来越受到关注。分子靶向药物索拉非尼(Sorafenib)是一种多靶点抗肿瘤药物，它可通过阻断由RAF/MEK/ERK介导的细胞信号通路来直接抑制肿瘤细胞的增殖，还可通过抑制酪氨酸激酶受体如血管内皮生长因子受体(VEGFR)和血小板衍生生长因子受体 (PDGFR)而阻断肿瘤新生血管的形成，具有抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤新生血管形成的双重作用。可治疗晚期肝癌等多种肿瘤。Sorafenib的不良反应较轻，但大部分患者使用Sorafenib数个月后就会出现获得性耐药，使病情恶化直至死亡；因此，如何耐药已成为提高靶向药物治疗疗效的关键。Sorafenib耐药可分为原发性和获得性两种，其机制尚不完全清楚，其中PI3K/AKT/mTOR信号通路在Sorafenib耐药机制中起重要作用。

中医药在肿瘤的防治中具有重要价值，临床研究表明，中药在增强放化疗的疗效，防治恶性肿瘤的发生，降低术后转移和复发，改善化疗药物的耐药，减轻放化疗的副作用，延长生存期等方面具有很大的优势。栓菌酸是茯苓、硫磺菌、桦褐孔菌等多种菌物药的共有成分。具有良好抗癌作用，能抑制肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌多种癌细胞的增殖；能有效地逆转人乳腺癌对紫杉醇的耐药性，与紫杉醇有药物协同作用。

本发明发现栓菌酸能有效地逆转肝癌细胞对Sorafenib耐药，栓菌酸与Sorafenib在治疗人肝细胞癌HepG2、胃癌细胞SGC7901、肺癌细胞A549、结直肠癌细胞SW480、耐受索拉非尼的HepG2/Sora等多种肿瘤中具有协同作用。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种栓菌酸与索拉非尼联用的药物，栓菌酸的质量浓度为5-10μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1-20μg/mL。

作为优选方案，栓菌酸的质量浓度为5μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL中的任意一种。

作为另一优选方案，栓菌酸的质量浓度为10μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL中的任意一种。

本发明还提供一种含所述的栓菌酸与索拉非尼联用的药物，其特征在于，该药物还包括药学上可接受的赋形剂。

本发明的又一技术方案中，栓菌酸、或索拉非尼在制备治疗人肝细胞癌HepG2、胃癌细胞SGC7901、肺癌细胞A549、结直肠癌细胞SW480、耐受索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞的药物中的应用，其中，耐受索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞包括耐受2-7μg/mL 索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞。

本发明还提供一种栓菌酸与索拉非尼联合用药在制备治疗人肝细胞癌HepG2、胃癌细胞 SGC7901、肺癌细胞A549、结直肠癌细胞SW480、耐受索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞的药物中的应用，其中，耐受索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞包括耐受2-7μg/mL索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞。

所述的栓菌酸的质量浓度为5-10μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1-20μg/mL。

所述的栓菌酸的质量浓度为5μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1.25μg/mL、2.5μ g/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL中的任意一种。

所述的栓菌酸的质量浓度为10μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1.25μg/mL、2.5μ g/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL中的任意一种。

本发明提供的低剂量索拉非尼持续诱导方法建立索拉非尼耐药的人肝细胞癌(HCC)细胞株HepG2/Sora。

MTT法检测TAB、索拉非尼单用和联用对肝癌细胞株HepG2、耐药细胞株 HepG2/Sora，胃癌细胞株SGC7901、肺癌细胞株A549和结肠癌细胞株SW480的细胞毒活性，并用Compulsyn软件计算出联合用药指数CI值，判断其联用是否具有协同作用。

本发明将TAB和索拉非尼对裸鼠HepG2细胞移植瘤抑制作用：培养HepG2肝癌细胞，建立裸鼠肝癌移植瘤模型，分别连续给予索拉非尼组、TAB组、联用组治疗21天，每天观察移植瘤体积及裸鼠基本情况，给药结束后，处死裸鼠，解剖出肿瘤称重记录。

针对TAB对人肝细胞癌HepG2/Sora耐药细胞的的抗肿瘤作用机制：通过蛋白质印迹法检测PI3K/AKT上下游蛋白及介导肿瘤细胞增殖的RAF/MEK/ERK细胞信号，阻断肿瘤新生血管的酪氨酸激酶受体血管内皮生长因子受体(VEGFR2)蛋白表达的变化。

采用本发明的技术方案成功建立了HCC对索拉非尼耐药细胞株HepG2/Sora。

通过MTT实验，TAB和索拉非尼联合用药对消化系统肿瘤细胞的抑制作用明显大于TAB和索拉非尼单独用药，且CI值均小于1，具有协同作用。

通过移植瘤实验发现索拉非尼和TAB单用均可在裸鼠体内抑制肝癌细胞生长，联用后能够加强对肿瘤的抑制作用，其体积和质量均明显下降，抑瘤率分别为55.8％和53.2％。

TAB通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活及下调c-RAF激酶、VEGFR-2蛋白的表达，增强HCC对索拉非尼的敏感性，与索拉非尼具有较好的协同作用。

附图说明

图1为索拉非尼作用于各组细胞的生长抑制曲线。

图2为显微镜下观察索拉非尼诱导的耐药细胞形态变化，A为HepG2，B为 HepG2/SoraVI。

图3为HepG2与HepG2/Sora两种细胞中AKT等相关蛋白表达情况。

图4为TAB对HepG2/Sora细胞内各组蛋白的表达变化差异。

具体实施方式

本发明实施方式所涉及到的细胞株及动物如下：

人肝细胞癌株HepG2购于南京科佰生物有限公司，胃癌细胞株SGC7901、肺癌细胞株 A549和结直肠癌细胞株SW480购于中国科学院细胞库。

SPF级BALB/c-nu裸鼠，雌雄各半，4-6周龄，体重18-22g，北京维通利华实验动物技术有限公司试验动物，实验动物生产许可证号为SCXK(京)2016-0011，饲养于三峡大学动物中心SPF级动物实验室，小鼠适应环境1周后即进行成瘤实验，实验单位使用许可证号为SYXK(鄂)2017-0061。

本发明实施方式所涉及到的药物及主要试剂如下：

栓菌酸(以下称TAB)，由本实验室提供，纯度98％，从茯苓中分离提取。细胞实验时，使用DMSO∶无水乙醇＝1∶9的溶液溶解TAB，0.22μm微孔水滤膜过滤，最终制成 10mg/mL初始质量浓度的TAB，再用培养基稀释至所需浓度进行细胞实验。

索拉非尼(规格100mg，批号1017R021，纯度99％)，购于北京索莱宝生物科技有限公司。

胎牛血清(批号1907301)，购于以色列Biological Industries生物科技公司。MEM培养基粉(批号2225320)，购于美国Gibco公司。

胰蛋白酶，购于美国Gibco公司。

Sodium Pyruvate(批号C10242348)，Non Essential Amino Acids(NEAA，批号C11090104)，购于上海麦克林生化科技有限公司。

G418(neomicina)，购于北京索莱宝科技有限公司。

MTT(批号K0063)，购于美国Sigma公司。

一抗(AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR、c-RAF、VEGFR-2)，购于美国Cell Signaling 公司、Abcam公司。

BCA法蛋白定量试剂盒(批号090120201211)，购于碧云天生物技术有限公司。

ECL化学发光底物试剂盒购于biosharp公司。

本发明所涉及到的仪器如下：

单面双人超净工作台，购于苏州净化设备有限公司。

XDX-1B倒置显微镜，购于重庆光学仪器厂。

水套式CO2培养箱，购于上海三腾仪器有限公司。

医用低温冰箱，购于中科都菱商用电器股份有限公司。

-20℃冰箱，购于海尔公司。

5415R小型台式高速冷冻离心机，购于德国艾本德股份公司。

低速离心机，购于长沙平凡仪器仪表有限公司。

艾科浦超纯水系统，购于美国艾科浦国际有限公司。

各种量程的移液枪，购于德国普兰德股份公司。

立式压力蒸汽灭菌锅，购于日本HIRAYAMA公司。

实施例1

细胞培养

将人肝细胞癌HepG2细胞株培养在含有100U/mL链霉素、100U/mL青霉素和10％胎牛血清的MEM培养基中，胃癌细胞株SGC7901接种于1640培养基，肺癌细胞株A549和结肠癌细胞株SW480接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基。上述细胞系均置于5％CO₂、恒温37℃、饱和湿度条件下的培养箱中无菌培养。

肝癌索拉非尼耐药细胞的建立

采用浓度梯度递增法建立肝癌对索拉非尼耐药的获得性耐药细胞株。以浓度为1μg/mL 的索拉非尼作为初始诱导浓度，逐步进行浓度上升。根据细胞的状态调整培养时间，当细胞能够稳定生长时再逐渐提高索拉非尼的浓度，每次提高1μg/mL，历时9个月，最终得到稳定的能耐受7μg/mL索拉非尼的HepG2/Sora耐药细胞株。并将加药浓度提高到2、4、6、7μg/mL获得的耐药细胞株依次命名为HepG2/SoraI、HepG2/SoraII、HepG2/SoraIII和HepG2/SoraIV。将耐药细胞株置于含有2μg/mL索拉非尼的培养基中培养，以维持其耐药性。于实验前1周左右，将耐药细胞恢复正常培养基中培养，进行后续实验。

MTT法检测索拉非尼对肿瘤细胞的增殖-毒性作用

收集处于对数生长期的HepG2及HepG2/SoraI、HepG2/SoraII、HepG2/SoraIII、HepG2/SoraIV细胞，按照1×10⁵个/mL浓度接种于96孔板，每孔100μL，外围用PBS液封，置于5％CO₂、恒温37℃、饱和湿度培养箱中孵育过夜，待细胞贴壁后加入浓度为1.25、2.5、 5、10、20μg/mL的索拉非尼，每孔终体积为200μL，并设置空白对照组，每组设3个复孔。培养24h后每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，避光孵育4h后，弃上清，每孔加入150μL的 DMSO，低速震荡10min，酶标仪490nm波长处测光密度(OD)值，按公式(1)计算生长抑制率，重复实验3次，采用GraphPad Prism软件计算细胞对药物的IC₅₀值，并根据公式 (2)计算耐药指数RI。同时检测索拉非尼对肿瘤细胞SGC7901、A549和SW480的增殖-毒性作用，实验方法及步骤同上。

细胞生长抑制率IR(％)＝(1－实验组OD值/对照组OD值)×100％(1)

耐药指数(RI)＝耐药细胞IC₅₀/亲本细胞IC₅₀(2)

MTT法检测不同浓度的索拉非尼对亲本细胞HepG2及HepG2/SoraI、HepG2/SoraII、HepG2/SoraIII、HepG2/SoraIV四个阶段耐药细胞作用24h的抑制率(如图1所示)，结果显示索拉非尼对HepG2及四个阶段耐药细胞的IC50值分别为10.22±0.98μg/mL， 18.30±1.10μg/mL(p<0.01)，25.96±1.13μg/mL(p<0.01)，34.51±2.49μg/mL(p<0.01)， 48.04±1.02μg/mL(p<0.01)。根据公式计算四个阶段耐药细胞的RI值分别为1.79±0.06、 2.54±0.11、3.37±0.17、4.70±0.23。结果显示，索拉非尼的半数抑制浓度IC50及RI值均随着诱导阶段的逐步递增而升高，HepG2/SoraIV 其耐药指数达到了4.70±0.23，认为肝癌索拉非尼耐药细胞建立成功。选取HepG2/SoraIV为最终的耐药细胞，相比亲本细胞对索拉非尼具有更好的耐受性。耐药细胞株培养至最终浓度 7μg/mL时，细胞形态已经发生了显著性变化，由抱团饱满的鹅卵石状(如图2左所示)变为长梭形，有突起，边界模糊不规则(如图2右所示)。

索拉非尼对肿瘤细胞的增殖抑制作用

索拉非尼作用各肿瘤细胞24、48h后，其增殖-毒性作用如下表1所示。结果表明索拉非尼对消化、呼吸系统多种肿瘤均具有抑制作用，且呈浓度、时间依赖性。经GraphPadPrism软件计算，索拉非尼作用HepG2、HepG2/Sora、SGC7901、A549、SW480细胞24h后的IC50值分别为10.22±0.98、48.04±1.02、138.0±0.70、136.4±0.90、79.19±0.95μg/mL；作用48h后的IC50值分别为5.44±0.97、7.96±0.97、16.14±0.90、20.75±0.96、 20.13±0.97μg/mL。

表1索拉非尼作用24h、48h对HepG2细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

表2索拉非尼作用24h、48h对HepG2/Sora细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

表3索拉非尼作用24h、48h对SGC7901细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

表4索拉非尼作用24h、48h对A549细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

表5索拉非尼作用24h、48h对SW480细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

实施例2

MTT法检测TAB对肿瘤细胞的增殖-毒性作用

检测TAB对肿瘤细胞HepG2、HepG2/Sora、SGC7901、A549和SW480的增殖-毒性作用，实验方法及步骤如实施例1，设置TAB作用浓度分别为5、10、20、40、60、80μg/mL，并计算出IC₅₀值。

TAB对肿瘤细胞增殖抑制作用

TAB作用各肿瘤细胞24、48h后，细胞存活率影响如图4所示，结果表明TAB具有一定细胞毒性，在低浓度10μg/mL以下对细胞的抑制作用小，细胞存活率在90％以上， 20μg/mL浓度以上具有明显的抑制作用，且抑制作用随着TAB浓度的增加而升高。经 GraphPadPrism软件进行计算，TAB对HepG2、HepG2/Sora、SGC7901、A549、SW480细胞24h后的IC50值分别为52.65±0.97、39.89±1.16、75.38±0.94、127.3±1.14、 113.9±1.22μg/mL，作用48h后的IC50值分别为21.63±0.97、18.88±0.96、40.52±0.87、 63.37±1.10、59.53±1.17μg/mL。实验选择5、10μg/mL两个低毒剂量作为TAB联合用药剂量，作用时间为24h。

表6 TAB不同浓度对HepG2细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

表7 TAB不同浓度对HepG2/Sora细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

表8 TAB不同浓度对SGC7901细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

表9 TAB不同浓度对A549细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

表10 TAB不同浓度对SW480细胞增殖的影响(

n＝3)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

实施例3

MTT法及Compulsyn软件检测TAB与索拉非尼联合应用对肿瘤细胞增殖的影响

根据MTT法检测TAB对肿瘤细胞的增殖-毒性作用的实验结果，选取低细胞毒性TAB剂量，将索拉非尼和TAB联合作用于肿瘤细胞，设置索拉非尼(1.25、2.5、5、10、 20μg/mL)单独用药组、TAB(5、10μg/mL)单独用药组、索拉非尼与TAB联合用药组，即分别固定TAB浓度(5、10μg/mL)，依次增加索拉非尼的浓度(1.25、2.5、5、10、 20μg/mL)进行混合，组成联合用药组，并设置空白对照组，每组设3个复孔，检测对肿瘤细胞的增殖抑制作用。余实验步骤同MTT法检测索拉非尼对肿瘤细胞的增殖-毒性作用的相关实验，实验重复3次。计算两药联合作用的IC₅₀值，并用CompuSyn软件计算联合用药指数(Combination Index,CI)，当CI＞1，表明两者具有拮抗作用；当CI＝1时，表明两者有加和作用，0.7＜CI＜1为轻微协同作用，0.3＜CI＜0.7为协同作用，CI＜0.3为强协同作用。 Western Blot法检测TAB对索拉非尼治疗肝细胞癌作用的影响及其机制的研究

取对数生长期细胞，用预冷的PBS洗两遍后，置于冰上加入细胞裂解液(RIPA：磷酸酶抑制剂：PMSF＝100:1:1)提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。加入一定量的蛋白样品与SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜后，5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗3次，每次10min，放入相应一抗置于4℃冰箱摇床孵育过夜，TBST洗3次，每次10min，二抗孵育1h，再用 TBST洗3次，每次10min，最后用ECL超敏发光液显影。用ImageJ软件对目的蛋白条带进行灰度分析，定量蛋白质表达水平。

索拉非尼联合低细胞毒性TAB对肿瘤细胞的抑制作用

MTT法检测TAB和索拉非尼是否具有协同作用。根据实验结果，选取低细胞毒性TAB(5、10μg/mL)与索拉非尼联用，加药处理24h后，检测各组细胞生长抑制情况，计算药物抑制率，并用Compusyn软件计算两药联合作用指数CI值，结果如下表所示，各组CI值均小于1，表明TAB(5μg/mL、10μg/mL)和索拉非尼(1.25、2.5、5、10、20μg/mL)联用对消化、呼吸系统多种肿瘤细胞均具有良好的协同作用。

表11 TAB与索拉非尼联用24h对HepG2/Sora细胞增殖的影响及其联合用药指数 (

n＝3)

与索拉非尼单独用药组相比；*P＜0.05**P＜0.01

表12 TAB与索拉非尼联用24h对SGC7901细胞增殖的影响及其联合用药指数 (

n＝3)

与索拉非尼单独用药组相比；*P＜0.05**P＜0.01

表13 TAB与索拉非尼联用24h对A549细胞增殖的影响及其联合用药指数 (

n＝3)

与索拉非尼单独用药组相比；*P＜0.05**P＜0.01

表14 TAB与索拉非尼联用24h对SW480细胞增殖的影响及其联合用药指数 (

n＝3)

与索拉非尼单独用药组相比；*P＜0.05**P＜0.01

实施例4

药物对裸鼠移植瘤的影响

TAB对索拉非尼治疗肝癌HepG2细胞瘤裸鼠的影响

培养HepG2细胞，对数生长期细胞制备成单细胞悬液，调整密度为1×10⁷个/mL，裸鼠于右侧前腿背部皮下注射0.2mL/只单细胞悬液，注射局部可观察到出现明显皮丘，注射后观察一周。测量肿瘤体积，待瘤体长至大于100mm³时，进行实验。裸鼠预先全部第天灌胃给予索拉非尼(5mg/kg)2个月，形成索拉非尼耐药，然后将裸鼠随机分成四组：模型组、索拉非尼剂量组(20mg/kg)、TAB组(80mg/kg)、TAB(40mg/kg)和索拉非尼(10mg/kg)联用组，组每组5只，分组后第2d开始给药，每组小鼠灌胃给予相应的药物，联用组同时给予两种药物，模型组灌胃给予相应的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，每天同一时间给药，连续灌胃21天。给药治疗过程中，隔天测量1次裸鼠体重，并每天观察裸鼠的基本情况，包括肿瘤生长情况、精神状态、反应、活动力、大便形态等。分组后第2d用卡尺测量，记录各组移植瘤的长度(L)和宽度(W)，每2d测量1次，肿瘤体积(V)＝(L×W²)/2。给药21天后，使用脱颈法处死裸鼠。裸鼠处理之后，取出移植瘤组织，并根据瘤体称重，计算抑瘤率。

药物对HepG2细胞移植瘤裸鼠的一般情况的影响

用TAB、索拉非尼及联用治疗后，各组裸鼠的进食、饮水及大小便均正常，活动正常，反应灵敏，精神状态良好，皮肤颜色正常，移植瘤组织没有出现溃烂。

药物对裸鼠的体重影响

如表15所示，随着肿瘤移植时间的延长，模型组裸鼠的体重明显下降，索拉非尼、TAB给药组的裸鼠也出现不同程度的体重下降，联用组裸鼠体重下降的速率较为缓慢。

表15裸鼠体重随时间变化表(g) (

n＝5)

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

细胞接种3天后，部分裸鼠右侧前腿背部出现肉眼可见移植瘤，接种一周后每组5只小鼠全部成瘤，开始给药。用药前，四组裸鼠间移植瘤体积经测量计算无显著性差异。如表 16，模型组的移植瘤生长迅速，给予索拉非尼、TAB药物治疗后昆明小鼠虽然其肿瘤体积仍在增长，但其增长速度较模型组相比明显缓慢，联用组肿瘤增长速率最缓，其抑瘤率达到55.8％。如表17，且第21d处理小鼠称取瘤重，计算抑瘤率，计算得索拉非尼组抑瘤率为53.2％，TAB组的抑瘤率为45.8％，联用组的抑瘤率为57.8％。可见索拉非尼和TAB单用均可在体内抑制肿瘤细胞生长，联用后能够加强对肿瘤的抑制作用，其体积和质量均明显下降。

表16裸鼠移植瘤体积随时间变化表(mm²) (

n＝5)

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

表17裸鼠移植瘤质量及抑瘤率 (

n＝5)

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

耐药细胞HepG2/Sora内AKT、p-AKT、c-RAF、VEGFR-2相关蛋白的表达变化

如图3(图3中与HepG2对照组相比*P<0.05,**P<0.01)结果显示，与亲本细胞HepG2相比， HepG2/Sora细胞中p-AKT、c-RAF、VEGFR-2表达水平显著上调(P<0.01，图3C、D、E所示)，AKT蛋白表达水平无明显差异(图3B所示)。表明HepG2细胞产生耐药后，AKT蛋白磷酸化水平上升，AKT/mTOR、RAS/RAF信号通路被激活，导致下游的血管生长因子VEGF 及受体VEGFR-2表达增加。

TAB对HepG2/Sora细胞内AKT、p-AKT、c-RAF激酶、VEGFR-2相关蛋白表达的影响通过上述数据分析，推测TAB可增加HepG2/Sora细胞对索拉非尼的敏感性，为研究其作用机制，我们检测了相关蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、c-RAF激酶、VEGFR-2的变化。收集空白组1、经过不同浓度索拉非尼(5、10μg/mL)单用组2和3、TAB (20μg/mL)单用组4、索拉非尼(5μg/mL)+TAB(20μg/mL)联用组5、索拉非尼 (10μg/mL)+TAB(20μg/mL)联用组6处理的HepG2/Sora细胞，提取蛋白，Western Blot 法检测各组细胞内几种蛋白的表达变化，结果如图4(图4中与HepG2/Sora对照组1相比 *P<0.05,**P<0.01)。

与空白组1相比，TAB、索拉非尼单独作用HepG2/Sora后，细胞内AKT、p-AKT、 mTOR、p-mTOR、c-RAF激酶、VEGFR-2蛋白的表达量均相对降低，且TAB与索拉非尼联用后各蛋白下降趋势较单用组更为显著。

统计学处理

所有实验数据以均数±标准差

表示，统计学分析软件使用spss25.0软件，组间比较用One-Way ANOVA分析，P﹤0.05为具有显著性差异，P﹤0.01说明差异具有极显著性。

Claims

1.栓菌酸与索拉非尼联用的药物，其特征在于，栓菌酸的质量浓度为5-10μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1-20μg/mL。

2.根据权利要求1所述的栓菌酸与索拉非尼联用的药物，其特征在于，栓菌酸的质量浓度为5μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的栓菌酸与索拉非尼联用的药物，其特征在于，栓菌酸的质量浓度为10μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL中的任意一种。

4.一种含权利要求1-3任一项所述的栓菌酸与索拉非尼联用的药物，其特征在于，该药物还包括药学上可接受的赋形剂。

5.栓菌酸与索拉非尼联合用药在制备治疗人肝细胞癌HepG2、胃癌细胞SGC7901、肺癌细胞A549、结直肠癌细胞SW480、耐受索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞的药物中的应用，其中，耐受索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞包括耐受2-7μg/mL 索拉非尼的HepG2/Sora耐药癌细胞，栓菌酸的质量浓度为5-10μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1-20μg/mL。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，栓菌酸的质量浓度为5μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL中的任意一种。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，栓菌酸的质量浓度为10μg/mL，索拉非尼的质量浓度为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL中的任意一种。