WO2013075607A1

WO2013075607A1 - 绿原酸的抗癌新用途

Info

Publication number: WO2013075607A1
Application number: PCT/CN2012/084861
Authority: WO
Inventors: 张洁; 杨华蓉; 黄英; 田晨煦
Original assignee: 四川九章生物化工科技发展有限公司
Priority date: 2011-11-22
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2013-05-30
Also published as: CN102488682A

Abstract

本发明提供了绿原酸在制备治疗肾癌的药物中的用途，还提供了一种治疗肾癌的药物组合物，它是以有效量的绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药剂，还提供了绿原酸与紫杉类药物在制备治疗肾癌的联合用药物中的用途和一种治疗肾癌的联合用药物。本发明提供的绿原酸具有抑制肾癌细胞的作用，对正常细胞无细胞毒性，有良好的药用价值。

Description

绿原酸的抗癌新用途技术领域

本发明涉及绿原酸的新用途，属于生物医药领域。

背景技术

绿原酸广泛存在于各种药用植物，如金银花中，目前对它的化学结构研宄己经清楚，己有人对其进行药用研宄，报道了绿原酸可以应用于治疗肿瘤等疾病。

绿原酸（chlorogenic acid) 是一种从双子叶植物（如忍冬叶、咖啡豆、向日葵）的叶和果实分离得到的酚类，也是许多中草药（如杜仲、金银花、茵陈等）及中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分，目前己成为中草药制剂质量控制的主要指标之一。绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。它是一种由咖啡酸 (caffeic acid)与奎尼酸（鸡纳酸， quinic acid, 即 1_羟基六氢没食子酸) 缩合而成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，化学名 3-0-咖啡酰奎尼酸

(3-0-caffeoylquinic acid) , 分子式为 C₁₆H₁₈0₉，分子量： 354. 31，半水合物为针状晶体，在 110°C时变为无水化合物，易溶于甲醇、乙醇，丙酮中溶解，略溶于水，微溶于乙酸乙酯，常温下呈淡黄色固体。绿原酸的结构式如下：

植物中绿原酸的生物合成包括了一系列的酶促反应。在酶的催化下，葡萄糖转化成莽草酸（shikimic acid) , 后者再转化成苯丙氨酸，最后经合成酶作用得绿原酸。绿原酸在植物中分布广泛，从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道，但含量较高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬属

(Lonicera) , 菊科蒿属（Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金银花、向日葵、咖啡、可可树。由于绿原酸是极性较强的有机酸，易溶于醇，水中略溶，几乎不溶氯仿、乙醚，因此绿原酸的提取方法较多，有醇（甲醇、乙醇）溶法、水提醇沉、醇提铅沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱层析法等。现己经报道的绿原酸有多种药理作用，如申请号： PCT/CN2006/001795 , 发明名称：绿原酸在制备具有增加骨髓细胞功效的药物中的用途的专利申请中公开了绿原酸在制备骨髓细胞功效的药物中的用途。关于绿原酸对癌症的治疗用途仅限于宫颈癌、肺癌和肝癌，如，刘洁等， "绿原酸抗肿瘤及阿霉素联系用药后的增敏作用研宄"，中药药理与临床， 2009， 25 ( 2 ) 第 43-45页报道了绿原酸对肺癌的抑制作用。

肿瘤的致病机制复杂，针对不同的肿瘤细胞，其诱导凋亡的机制不尽相同，根据绿原酸能治疗其他癌症不能得知绿原酸对肾癌有抑制作用，且现有文献中未见绿原酸治疗肾癌的报道。

发明内容

本发明提供了绿原酸治疗癌症的新用途。

首先，本发明提供了绿原酸在制备治疗肾癌的药物中的用途。

本发明还提供了一种治疗肾癌的药物组合物，它是以有效量的绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药剂。

其中，所述的药剂中每制剂单位含有绿原酸 l〜3000mg。

其中，所述的药剂是口服制剂或者注射剂。

本发明还提供了绿原酸与紫杉类药物在制备治疗肾癌的联合用药物中的用途。

其中，所述绿原酸与紫杉类药物的重量配比为：绿原酸 10〜1280份，紫杉类药物 64份。

其中，所述紫杉类药物为多西他赛。

本发明最后提供了一种治疗肾癌的联合用药物，它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或者依次给绿原酸与紫杉类药物，以及药学上可接受的载体。

紫杉类药物是从紫杉树皮或针叶中提取或半合成的新型抗肿瘤药物，是一种具有独特结构和独特作用机制的抗肿瘤药物，紫杉醇和多西紫杉醇 (多西他赛）均是典型的紫杉类药物。

联合用药（drug combination) 是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先后应用。本发明绿原酸与紫杉类药物联合用于治疗肾癌的效应为相加（ + )，且绿原酸具有提高机体免疫力和改善肝肾功能的效用，与紫杉类药物联合使用可降低紫杉类药物的毒副作用。根据绿原酸的抑癌机理，申请人认为绿原酸可与其他细胞毒类抗癌药物联用，不会影响绿原酸和其他细胞毒类抗癌药物的抑瘤效果，且可以降低其他细胞毒类抗癌药物的毒副作用。所述绿原酸与紫杉类药物的重量配比为：绿原酸 10〜1280份，紫杉类药物 64份。

所述紫杉类药物为多西他赛。

本发明绿原酸可抑制肾癌细胞的增殖，具有治疗肾癌的作用，而且，本发明绿原酸是非细胞毒类药物，具有非细胞毒类药物的共同特点： 1. 具有调节作用和细胞稳定作用（Cytostatic ); 2. 临床治疗不一定需达到剂量性毒性（DLT) 和最大耐受量（MTD); 3. 直接针对引起癌变分子机制，比传统化疗更有选择性和疗效； 4. 与常规治疗（化疗、放疗）合用有更好的疗效。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一歩的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图 1 绿原酸及多西他赛对人肾癌细胞（A498) 的剂量效应曲线图 2 绿原酸及多西他赛对人肾癌细胞（ACHN) 的剂量效应曲线图 3 绿原酸及多西他赛对人肾癌细胞（GRC-1 ) 的剂量效应曲线图 4 绿原酸及多西他赛对小鼠肾癌细胞（RenCa) 的剂量效应曲线图 5 绿原酸对 A498人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响图 6 绿原酸对 A498人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用图 7 绿原酸对 ACHN人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响图 8 绿原酸对 ACHN人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用图 9 绿原酸对 GRC-1人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响图 10 绿原酸对 GRC-1人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用具体实施方式

试验例 1 绿原酸抑制肾癌的作用

一、体外实验

1、试验材料

1. 1受试药物

绿原酸：由四川九章生物化工科技发展有限公司提供，批号为 100211，含量为 99. 6%；

阳性对照药：多西他赛注射液（Docetaxel injection), 江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为 10112611，规格 20mg/支。

1.2主要试剂

培养基及试剂：培养基 RPML1640(Gibco 公司），小牛血清（兰州民海），青霉素（华北制药股份有限公司）、硫酸链霉素（华北制药股份有限公司）， WST-1 (美国 Roche公司）。

1.3主要仪器

二氧化碳细胞培养箱（日本 SANYO), 1X70 倒置相差荧光显微镜（日本 Olympus), 生物安全柜（美国 NUAIRE), μ -Quant微孔板测定仪（BioTek 公司），培养器皿： 96孔培养板，培养瓶（BD公司）。

1.4细胞株

细胞株共 4株，见表 1。

表 1 绿原酸抗肿瘤作用体外实验研究用细胞株

2.试验方法

2.1药物及试剂配制

2.1.1绿原酸的配制

取绿原酸适量，用生理盐水溶解配成 6.4mg/ml的储备溶液，经 0.22 m Millipore 无菌过滤器无菌过滤除菌。

2.1.2多西他赛注射液的配制

取多西他赛 1支，用专用溶剂配成 10mg/ml，然后用灭菌生理盐水稀释成 1.28 mg/ml的储存溶液。

2.1.3培养液配制

RPML1640细胞培养基溶解于超纯水（1000ml) 中，搅拌溶解，加 2.2gNaHC0₃和 lOmlHEPES搅拌溶解，再加青霉素适量（终浓度为 100U/ml) 和链霉素适量（终浓度为 100 g/ml)，充分混合后，用 0.22μπι滤膜无菌过滤，分装，于 -20°C冻存，此为基础培养基。临用前 37°C水浴解冻，加 10%的小牛血清，调整培养液 pH为 7.2〜7.4，此为完全培养基。

2.1.4细胞增殖检测试剂

Cell Proliferation Reagent (WST-1) (Roche 11644807001) 试剂按要求冷藏。 2. 2细胞复苏及接种

2. 2. 1细胞复苏

将冻存细胞株从 _152°C超低温冰柜中取出， 40°C水浴解冻，离心并用基础培养基洗涤后用完全培养基悬浮细胞，转移到细胞培养瓶内，静置于 5%C0₂细胞培养箱中 37°C培养，每 2〜3天换液。细胞生长铺满细胞瓶后用 0. 25%胰蛋白酶消化传代培养至实验所需细胞数量。

2. 2. 2细胞接种

取对数生长期细胞， 0. 25%胰蛋白酶消化，用基础培养基洗涤离心 ( lOOOrpm 5min 两次），用完全培养基悬浮细胞并调整细胞浓度为 6 X lOVml , 接种细胞于 96孔板内，每孔 50 μ 1 (细胞数量 6 Χ 10³/孔），每个药物浓度接种 3个复孔，并设正常对照组（肿瘤细胞 +完全培养基）和空白对照组（完全培养基），每组 3个复孔。

2. 2. 3加药

次日细胞贴壁后按以下分组加药，静置培养 48小时。

( 1 )绿原酸组用完全培养基将 6. 4mg/ml绿原酸储存溶液配制成 256 μ g/ml的溶液，然后用完全培养基按对倍稀释法逐歩稀释，得含绿原酸 256、 128、 64、 32、 16、 8、 4和 2 μ g/ml的完全培养基，备用；取 50 μ 1上述含不同浓度绿原酸的完全培养基到己接种细胞的 96孔板中，使绿原酸终浓度分别为 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2和 l g/ml，每个浓度 3复孔。

(2)多西他赛组用完全培养基将多西他赛 1. 28mg/ml储存溶液稀释成 25. 6 μ g/ml的溶液，然后用完全培养基按对倍稀释法逐歩稀释得到含多西他赛 25. 6、 12. 8、 6. 4、 3. 2、 1. 6、 0. 8、 0. 4和 0. 2 μ g/ml的完全培养基，备用；取 50 μ ΐ上述含不同浓度多西他赛的完全培养基到己接种细胞的 96孔板中，使多西他赛终浓度分别为 12. 8、 6. 4、 3. 2、 1. 6、 0. 8、 0. 4、 0. 2和 0. 1 μ g/ml , 每个浓度 3复孔。

(3) 绿原酸 +多西他赛组测定绿原酸对多西他赛的增效作用，初歩考察绿原酸对多西他赛 6. 4 μ g/ml浓度组的增效情况作用。在己接种的 96 孔板中，分别加入 25 μ 1浓度为 25. 6 μ g/ml的多西他赛溶液，使多西他赛终浓度为 6. 4 μ g/ml ,再加入 25 μ 1不同浓度绿原酸培养基溶液，使绿原酸的终浓度分别为 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2和 1 g/ml，每个浓度 3复孔。

(4)正常对照组设肿瘤细胞正常对照组孔，不加药物处理，只加等量（ΙΟΟ μ Ι ) 完全培养基，与上述 3个组别同歩实验。

(5)空白对照组每孔不接种细胞，只加等量（ΙΟΟ μ Ι )完全培养基，设 3个复孔作为空白对照。 2.2.4测定

加药后细胞培养 48小时，在上述 3个实验组、正常对照组和空白对照组孔内加入 10 μ 1WST-1溶液，置 37°C细胞培养箱继续孵育 4小时后，在 μ -Quant微孔板测定仪上测定不同药物组、正常对照组和空白对照组 440nm 波长处的吸收值。

2.2.5数据处理：

(1) 计算 /(生长抑制率） = (l-OD_M/OD_w) X 100%

(2) 以同一药物不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图，可得到剂量效应曲线。

(3)根据药物浓度及对应的肿瘤细胞抑制率，采用 Logit法 IC₅。计算软件计算半数抑制浓度 ac₅。值）。

( 4 )联合用药以公式 Q=E (a+b) / ( Ea+Eb-Ea X Eb )计算有无协同作用。其中 E(a+b)为两药合用的抑制率，即实验合并效应， Ea和 Eb为两药单用时的抑制率，分母（Ea+Eb-EaXEb)为期望合并效应， Q为两者比值。 Q值在 0.85〜1.15时，两药合并效应为相加（ + )，Q值在 1.15〜20时为协同（++)， 0值>20时为明显协同（+++)， Q值在 0.05〜0.85时为拮抗， 0值<0.05 为明显拮抗。

3.试验结果

3.1绿原酸对人肾癌细胞（A498) 的体外抑瘤作用

3.1.1细胞形态观察结果

各组加药处理 48小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态，与正常对照组比较，绿原酸（l〜128 g/ml) 对细胞生长有一定的影响，部分细胞变圆、脱落、悬浮；而多西他赛处理过的细胞，低浓度时即有大量细胞死亡，有大量细胞碎片；联合用药各组细胞死亡亦明显，大量细胞变圆、脱落、悬浮。

3.1.2绿原酸对人肾癌细胞（A498) 的抑制率、半数抑制浓度（IC₅。）和剂量效应曲线

绿原酸及多西他赛对人肾癌细胞（A498)的抑制率和半数抑制浓度（IC₅。) 分别见表 2和表 3，剂量效应曲线见图 1。

表 2 绿原酸对人肾癌细胞（A498) 的抑制率和半数抑制浓度（IC₅。） 0D值

分组抑制率（％) IC50

1 2 3 平均 SD

对照 1. 789 2. 483 2. 566 2. 279 0. 43

1 1. 993 2. 221 2. 316 2. 177 0. 17 4. 49

2 2. 048 1. 943 2. 013 2. 001 0. 05 12. 18

4 1. 898 1. 792 1. 946 1. 879 0. 08 17. 57 绿原酸 8 1. 816 1. 654 1. 772 1. 747 0. 08 23. 33

78. 65

( μ g/ml ) 16 1. 675 1. 771 1. 597 1. 681 0. 09 26. 24

32 1. 398 1. 638 1. 451 1. 496 0. 13 34. 37

64 1. 253 1. 101 1. 355 1. 236 0. 13 45. 75

128 0. 911 0. 847 1. 214 0. 991 0. 20 56. 53 表 3 多西他赛对人肾癌细胞（A498 ) 的抑制率和半数抑制浓度（IC50)

由表 2〜3和图 1可见，不同浓度绿原酸（l〜128 g/ml )对人肾癌细（A498) 的生长有抑制作用。

3. 1. 3绿原酸与多西他赛联合用药对人肾癌细胞（A498) 抑制作用表 4 绿原酸与多西他赛（6.4yg/ml) 联合用药对人肾癌细胞（A498) 的抑制作用

由表 4可见，绿原酸（l〜32 g/ml) 与多西他赛（6.4 g/ml) 联合用药的 Q值在 0.85〜1.15，两药合并效应为相加（ + )，无拮抗作用；绿原酸（64〜128 g/ml) 与多西他赛（6.4 μ g/ml) 联合用药的 Q值在 0.05〜 0.85范围内，拮抗作用较弱。

3.2绿原酸对人肾癌细胞（ACHN) 的体外抑瘤作用

3.2.1细胞形态观察结果

3.2.2绿原酸对人肾癌细胞（ACHN) 的抑制率、半数抑制浓度（IC₅。）和剂量效应曲线

绿原酸及多西他赛对人肾癌细胞（ACHN)的抑制率和半数抑制浓度（IC₅。) 分别见表 5和表 6，剂量效应曲线见图 2。表 5绿原酸对人肾癌细胞（ACHN) 的抑制率和半数抑制浓度（IC₅₀)

由表 5〜6和图 2可见，不同浓度绿原酸（l〜128 g/ml)对人肾癌细（ACHN) 的生长有抑制作用。

3.2.3绿原酸与多西他赛联合用药对人肾癌细胞（ACHN) 抑制作用表 7 绿原酸与多西他赛（6.4yg/ml) 联合用药对人肾癌细胞（ACHN) 的抑制作用

由表 7可见，不同浓度绿原酸（ 1 128 μ g/ml )与多西他赛（6.4 μ g/ml ) 联合用药的 Q值在 0.85 1.15，两药合并效应为相加（ + )，无拮抗作用。

3.3绿原酸对人肾癌细胞（GRC-1) 的体外抑瘤作用

3.3.1细胞形态观察结果

各组加药处理 48小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态，与正常对照组比较，绿原酸（l 128 g/ml) 对细胞生长有一定的影响，部分细胞变圆、脱落、悬浮；而多西他赛处理过的细胞，低浓度时即有大量细胞死亡，有大量细胞碎片；联合用药各组细胞死亡亦明显，大量细胞变圆、脱落、悬浮。

3.3.2绿原酸对人肾癌细胞（GRC-1) 的抑制率、半数抑制浓度（IC₅。) 和剂量效应曲线

绿原酸及多西他赛对人肾癌细胞（GRC-1) 的抑制率和半数抑制浓度 (IC₅₀) 分别见表 8和表 9，剂量效应曲线见图 3

表 8 绿原酸对人肾癌细胞（GRC-1) 的抑制率和半数抑制浓度（IC₅。)

表 9 多西他赛对人肾癌细胞（GRC-1) 的抑制率和半数抑制浓度（IC₅。）

由表 8〜9和图 3可见，不同浓度绿原酸（l〜128 g/ml)对人肾癌细胞（GRC-1) 的生长有一定的抑制作用。

3.3.3绿原酸与多西他赛联合用药对人肾癌细胞（GRC-1) 抑制作用表 10 绿原酸与多西他赛（6.4yg/ml) 联合用药对人肾癌细胞（GRC-1) 的抑制作用

由表 10可见，不同浓度绿原酸（l〜128 g/ml) 与多西他赛（6.4μ g/ml) 联合用药的 Q值在 0.85〜1.15，两药合并效应为相加（ + )，无拮抗作用。

3.4绿原酸对小鼠肾癌细胞（RenCa) 的体外抑瘤作用

3.4.1细胞形态观察结果

3. 4. 2绿原酸对小鼠肾癌细胞（RenCa)的抑制率、半数抑制浓度（IC₅。）和剂量效应曲线

绿原酸及多西他赛对小鼠肾癌细胞（RenCa)的抑制率和半数抑制浓度 ( IC₅₀) 分别见表 11和表 12，剂量效应曲线见图 4。

表 11 绿原酸对小鼠肾癌细胞（RenCa) 的抑制率和半数抑制浓度（IC₅。)

由表 11〜12和图 4可见，不同浓度绿原酸（l〜128 g/ml ) 对小鼠肾癌细胞（RenCa) 的生长有一定的抑制作用。

3. 4. 3绿原酸与多西他赛联合用药对小鼠肾癌细胞（RenCa) 抑制作用表 13绿原酸与多西他赛（6.4 μ g/ml) 联合用药对小鼠肾癌细胞（RenCa) 的抑制作用

由表 13可见，绿原酸（l〜2 g/ml) 与多西他赛（6.4 μ g/ml) 联合用药的 Q值在 0.50〜0.85范围内，两者有很弱的拮抗作用；绿原酸（4〜 128 μ g/ml) 与多西他赛（6.4 μ g/ml) 联合用药的 Q值在 0.85〜1.15，两药合并效应为相加（ + )，无拮抗作用。

4.结论

不同浓度绿原酸（l〜128 g/ml) 对人肾癌细胞（A498)、人肾癌细胞（ACHN)、人肾癌细胞（GRC-1) 和小鼠肾癌细胞（RenCa) 的生长均有抑制作用。

绿原酸半数抑制浓度（IC₅。）均大于 10 g/ml，属于非细胞毒类药物，对正常细胞无毒；不同浓度绿原酸（ 1〜128 μ g/ml)与多西他赛（6.4 μ g/ml) 联合用药 Q值均在 0.5〜1.15范围内，其中多数在 0.85〜1.15之间，表明在体外实验中两药合用无明显拮抗作用，可联合使用。

此外，绿原酸对人肾癌细胞（A498) 的 IC₅。为 78.65 g/ml，对人肾癌细胞（ACHN)的 IC₅。为 59.084_§/011，对人肾癌细胞（0 -1)的 IC₅。为 112.81 g/ml, 对小鼠肾癌细胞 (RenCa) 的 IC₅。为 53.70 μ g/ml， IC₅。均大于 10 g/ml, 因此属于非细胞毒类药物，不具有细胞毒作用。（根据《抗肿瘤药物药效学指导原则》，若合成化合物或植物提取纯品的 IC₅。<10 g/ml时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用，药物属于细胞毒类药）。二、体内实验

(一）绿原酸 ip对小鼠移植性肿瘤的抑制作用

1 试验材料

1.1药物受试药物名称：绿原酸（含量 99.6%) 规格： 30mg/支批号： 100211 提供单位：四川九章生物化工科技发展有限公司

配制方法：使用前，用生理盐水溶解，分别配成 2、 1、 O mg l—¹浓度，用 0. 22μπι孔径的微孔滤膜除菌过滤，分别作为绿原酸高（40mg/kg)、中 ( 20mg/kg)、低 ( lOmg/kg) 剂量组的供试品溶液。

对照药物名称：阿霉素（ADM) 规格： 10mg/支批号： 091001 厂家：浙江海正药业有限公司

配制方法：取 1支用 10ml生理盐水溶解配制 lmg•ml—¹浓度，临用时用生理盐水稀释 10倍供试验用。

1. 2动物

C₅₇BL/6小鼠， 50只，体重 13-20g，雌雄各半，由四川大学试验动物中心提供，动物级别： SPF级，许可证号：第 9号。动物使用设施许可证号：第 113号（IVC屏障系统）。

饲料：颗粒饲料，由四川大学动物室提供；

饲养条件：空调房间，温度 18-24^flC ，相对湿度 70%。

1. 3细胞系

鼠肾癌 RenCa细胞株接种于小鼠腋窝皮下而建立。细胞接种量为 I X 10⁶，接种形成移植瘤后再在小鼠体内传 3代后使用。

2实验研宄的主要内容

研宄绿原酸腹腔注射对小鼠移植瘤 RenCa的抑制作用。

3实验方法和步骤

3. 1 给药途径腹腔注射（ip)

3. 2 给药周期

按移植性肿瘤研宄法接种鼠肾癌 RenCa细胞悬液，于接种后的第二日腹腔注射（ip) 给药，每日一次， ADM连续给药 8次，其余各组连续给药 12次。待阴性组平均瘤重大于 l. Og (瘤体积约为 0. 5cm³) 时停止试验，处死小鼠，剥取肿瘤。

3. 3 剂量设置共设 5组，每组 10只

空白对照组（生理盐水）

阿霉素 (ADM): 2 mg/kg

绿原酸： 40 mg/kg, 20 mg/kg, 10mg/kg

3. 4 给药体积 0. 2ml/10g

3. 5 实验方法

取生长旺盛期的瘤组织剪切成 1. 5 mm³左右，在无菌条件下匀桨后制备成 I X 107ml细胞悬液。取上述规格小鼠 50只，以 0. lml细胞悬液接种于小鼠右侧腋窝皮下。于接种后的第二日，称重，并按体重随机分 5组，每组 10只，腹腔注射（ip) 给药，容量为 0. 2ml · lOg—¹, 每日一次， ADM连续给药 8次，其余各组连续给药 12次。于接种后第 6日开始间日测量肿瘤体积（V=0. 52 X移植瘤长径 LX移植瘤最短径 W²)，每周称小鼠重量两次。待阴性组平均瘤重大于 l. Og (瘤体积约为 0. 5cm³) 时停止试验，脱颈椎处死小鼠并称重，剥取肿瘤，计算抑瘤率。

4 实验结果：

绿原酸腹腔注射对小鼠移植瘤 RenCa的抑制作用

PO.05 **P<0.01 与空白对照组比较

由表 14可知，与空白对照组相比，绿原酸（40， 20， 10mg /kg) 组及 ADM (2mg /kg) 组均可显著地抑制 RenCa的肿瘤生长 (P〈0. 01 )。

(二）、绿原酸 i_P对裸鼠移植性肿瘤的抑制作用

1 试验材料

1.1药物

受试药物名称：绿原酸（含量 99. 6%) 规格： 30mg/支批号： 100211 提供单位：四川九章生物化工科技发展有限公司

配制方法：使用前，用生理盐水溶解，分别配成 2、 1、 O^mg ^ ml—¹浓度，用 0. 22μπι孔径的微孔滤膜除菌过滤，分别作为绿原酸高（40mg/kg)、中 (20mg/kg)、低 ( lOmg/kg) 剂量组的供试品溶液。

1. 2动物：

裸鼠， 90只，年龄 35-40天，体重 18-22g，雌雄各半，由四川大学试验动物中心提供，动物级别： SPF级，许可证号：第 9号。动物使用设施许可证号：第 113号（IVC屏障系统）。

1. 3细胞系

由人肾癌 A498、ACHN及 GRC-1细胞株接种于裸鼠腋窝皮下而建立。细胞接种量为 I X 10⁶，接种形成移植瘤后再在裸鼠体内传 3代后使用。

2实验研宄的主要内容

2. 1 绿原酸 i_P对裸鼠人肾癌 A498移植性肿瘤的抑制作用

2. 2绿原酸 ip对裸鼠人肾癌 ACHN移植性肿瘤的抑制作用

2. 3绿原酸 ip对裸鼠人肾癌 GRC-1移植性肿瘤的抑制作用

3实验方法和步骤

3. 1 给药途径腹腔注射（ip)

3. 2 剂量设置每个项目设 5组，每组 6只

空白对照组（生理盐水）

阿霉素 (ADM): 2 mg/kg

绿原酸： 40 mg/kg, 20 mg/kg, 10mg/kg

3. 3给药体积 0. 2ml/10g

3. 4 实验方法

取生长旺盛期的肿瘤组织剪切成 1. 5 mm³左右，在无菌条件下匀桨后制备成 I X 107ml细胞悬液，以 0. lml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至 100mm³后将动物随机分组，每组 6只。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。绿原酸以 40， 20, lOmg/kg, 腹腔注射给药，每天给药一次，连续给药 14天；阿霉素以 2mg/kg腹腔注射给药，每天给药一次，连续给药 14天。肿瘤直径的测量次数为隔天测一次。给药体积为 0. 2ml/10g o阴性对照组腹腔注射等量生理盐水溶液。给药 14天后，裸鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积（tumor volume ， TV)的计算公式为:

TV = l/2 X aX b²

其中 a、 b分别表示长宽。

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume, RTV), 计算公式为： RTV = Vt/V。。其中 V。为分笼给药时（即 d。)测量所得肿瘤体积， V_t为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率 T/C (%)，计算公式如下：

T/C(%) = ^^x l00 T_RTV: 治疗组 RTV ； CRTV: 阴性对照组 RTV。

4结果和讨论

4. 1绿原酸对人肾癌 A498裸鼠移植瘤的作用

绿原酸对人肾癌 A498裸鼠移植瘤的实验性治疗结果见表 15-17。绿原酸以 40mg/kg， 20mg/kg, 10mg/kg腹腔注射给药，每天给药一次，连续给药 14天时，对人肾癌 A498裸鼠移植瘤的 T/C (%)分别为 21. 0%， 27. 4%， 54. 3%, 抑瘤率达 73. 0%， 68. 1%, 45. 6%。同样条件下阿霉素以 2mg/kg腹腔注射时对人肾癌 A498裸鼠移植瘤的 T/C (%)为 17. 8%，抑瘤率为 77. 5 %。实验说明绿原酸对人肾癌 A498裸鼠移植瘤的生长有显著的抑制作用。

表 15 绿原酸对 A498人肾癌裸鼠异种移植肿瘤 0-6天生长体积变化的影响 (X士 SD， n=6，单位: mm³)

与空白对照组比较， *P<0.05， **P<0.01 ;

^ 表 16 绿原酸对 A498人肾癌裸鼠异种移植肿瘤 6-14天生长体积变化的影响 (X士 SD， n=6, 单位： mm³)

与空白对照组比较， *P<0.05 , **P<0.01 :

表 17 绿原酸对 A498人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用 (X士 SD)

与空白对照组比较， <0.05

4. 2绿原酸 ip对裸鼠人肾癌 ACHN移植性肿瘤的抑制作用绿原酸对人肾癌 ACHN裸鼠移植瘤的实验性治疗结果见表 18-20。绿原酸以 40mg/kg， 20mg/kg, 10mg/kg腹腔注射给药，每天给药一次，连续给药 14天时，对人肾癌 ACHN裸鼠移植瘤的 T/C (%)分别为 22. 6%， 30. 3%, 36. 3%, 抑瘤率达 76. 0%， 66. 4%， 53. 1%。同样条件下阿霉素以 2mg/kg腹腔注射时对人肾癌 ACHN裸鼠移植瘤的 T/C (%) 为 24. 8%，抑瘤率为 62. 2 %。实验说明绿原酸对人肾癌 ACHN裸鼠移植瘤的生长有显著的抑制作用。

表 18 绿原酸对 ACHN人肾癌裸鼠异种移植肿瘤 0-6天生长体积变化的影响 (X士 SD， n=6, 单位: mm³)

与空白对照组比较， *P<0.05, "P<0.01;

表 19 绿原酸对 ACHN人肾癌裸鼠异种移植肿瘤 6-14天生长体积变化的影响 (X士 SD， n=6, 单位： mm³)

与空白对照组比较， *P<0.05, "P<0.01:

表 20 绿原酸对 ACHN人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用 (X士 SD)

与空白对照组比较， <0.05

4. 3绿原酸 ip对裸鼠人肾癌 GRC-1移植性肿瘤的抑制作用绿原酸对人肾癌 GRC-1裸鼠移植瘤的实验性治疗结果见表 21-23。实验结果显示，绿原酸对人肾癌 GRC-1裸鼠移植瘤有显著的生长抑制作用。绿原酸以 40mg/kg， 20mg/kg, 10mg/kg腹腔注射给药，每天给药一次，连续给药 14天时，对人肾癌 GRC-1裸鼠移植瘤的 T/C (%)分别为 24. 05%, 30. 91%， 39. 02%,抑瘤率达 66. 4%， 59. 5%， 48. 6%。同样条件下阿霉素以 2mg/kg腹腔注射时对人肾癌 GRC-1裸鼠移植瘤的 T/C (%)为 30. 04%，抑瘤率为 64. 8 %。实验说明绿原酸对人肾癌 GRC-1裸鼠移植瘤的生长有显著的抑制作用。

表 21 绿原酸对 GRC-1人肾癌裸鼠异种移植肿瘤 0-6天生长体积变化的影响 (X士 SD， n=6, 单位: mm³)

与空白对照组比较， *P<0.05， **P<0.01 ;

表 22绿原酸对 GRC-1人肾癌裸鼠异种移植肿瘤 6-14天生长体积变化的影响 (X士 SD， n=6, 单位： mm³)

与空白对照组比较， *P<0.05 , "P<0.01 :

表 23 绿原酸对 GRC-1人肾癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用 (X士 SD)

与空白对照组比较， <0.05

5、结论

实验说明绿原酸各剂量组均可显著地抑制鼠肾癌 RenCa肿瘤、人肾癌 A498裸鼠移植瘤、人肾癌 ACHN裸鼠移植瘤和人肾癌 GRC-1裸鼠移植瘤的生长均有显著抑制作用。

试验例 2 绿原酸对正常小鼠机体的影响试验

1.试验材料

1.1动物

来源、种系、品系： BALB/c小鼠

年龄、体重： 35-40天； 18-22g

性别：雌性

动物数量：每组 10只

提供单位：由四川大学实验动物中心提供（实验动物生产许可证：第 9 号；实验动物使用设施许可证：第 113号（IVC屏障系统））。

1. 2 药物

名称：绿原酸（含量 99. 6%) 批号： 100211

提供单位：四川九章生物化工科技发展有限公司

配制方法：使用前，用生理盐水溶解，分别配成 2、 1、 O mg r¹浓度，用 0. 22μπι孔径的微孔滤膜除菌过滤，分别作为绿原酸高（40mg/kg)、中 (20mg/kg)、低 ( lOmg/kg) 剂量组的供试品溶液。

2.试验方法

按体重随机分 4组，分别为绿原酸高（40mg/kg)、中（20mg/kg)、低 ( lOmg/kg)剂量组和空白对照组。空白组注射生理盐水外，其余各组均腹腔注射给药，容量为 0. 2ml Og—¹, 连续给药 14天，于试验最后一日对动物实施取血及胸腺，脾脏等，测定各组血液及生化指标。

3.试验结果

表 24 绿原酸对小鼠血液指标的影响

网织红细胞（Ret) 是反映造血功能的敏感指标，小鼠血液中白细胞 (WBC)和网织红细胞（Ret) 明显升高，表明绿原酸能明显提高机体的造血功能。

表 25 绿原酸对小鼠血液生化指标的影响

试验结果表明，绿原酸对小鼠肝肾功能有一定促进和改善作用。

表 26 绿原酸对小鼠脏器系数和体重的影响

试验结果表明，绿原酸对小鼠免疫器官（胸腺、脾）的脏器系数和体重无明显影响。

上述试验例 1体外药效学实验表明，绿原酸为非细胞毒类抗肿瘤药物，本试验例进一歩通过体内试验证实，绿原酸对机体无毒副作用。综上，绿原酸可有效抑制肾癌细胞的增殖，且对机体无毒副作用，为临床治疗肾癌提供了一种新的选择，同时也为传统抗肾癌药物的联合用药物提供了一种新的选择，具有良好的市场应用前景。工业应用性

本发明绿原酸对肾癌的疗效确切，为非细胞毒类药物，比传统化疗具有更好的疗效，是一种新的、安全有效的肾癌药物，为临床肾癌的治疗提供了一种新的选择，具有极好的临床应用和工业化前景。

Claims

权利要求书

1、绿原酸在制备治疗肾癌的药物中的用途。

2、一种治疗肾癌的药物组合物，其特征在于：它是以有效量的绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药剂。

3、根据权利要求 2所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂中每制剂单位含有绿原酸 l〜3000mg。

4、根据权利要求 2或 3所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂是口服制剂或者注射剂。

5、绿原酸与紫杉类药物在制备治疗肾癌的联合用药物中的用途。

6、根据权利要求 5所述的用途，其特征在于：所述绿原酸与紫杉类药物的重量配比为：绿原酸 10〜1280份，紫杉类药物 64份。

7、根据权利要求 5所述的用途，其特征在于：所述紫杉类药物为多西他赛。

8、一种治疗肾癌的联合用药物，其特征在于：它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或者依次给绿原酸与紫杉类药物，以及药学上可接受的载体。

9、根据权利要求 8所述的联合用药物，其特征在于：所述绿原酸与紫杉类药物的重量配比为：绿原酸 10〜1280份，紫杉类药物 64份。

10、根据权利要求 8或 9所述的联合用药物，其特征在于：所述紫杉类药物为多西他赛。