CN113876946B - 一种pd-1抗体和绿脓杆菌的联合制药用途及药物组合物 - Google Patents
一种pd-1抗体和绿脓杆菌的联合制药用途及药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了PD‑1抗体和绿脓杆菌在制备肿瘤药物中的应用，将PD‑1抗体和绿脓杆菌共同作用于肿瘤，使绿脓杆菌注射液和PD‑1抗体针对肿瘤的治疗效果得到了提升。本发明提供的方法能有效抑制肿瘤大小，并提高小鼠的CD4+T细胞TNF‑α的表达，以及巨噬细胞中MHC‑Ⅱ的水平。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种PD-1抗体和绿脓杆菌的联合制药用途及药物组合物。
背景技术
肿瘤作为严重威胁人类生存健康的重大疾病之一，现有技术对其治疗方法的研究十分广泛，但目前肿瘤的治疗进入了瓶颈阶段，在不断革新传统的肿瘤治疗方法时，应积极寻求新的肿瘤治疗手段。
肿瘤免疫治疗已成为与手术、放疗和化疗并列的肿瘤第四大治疗模式，正在表现出对抗肿瘤的巨大潜力。
肿瘤免疫治疗的常用方法有如下几种：一，免疫检查点抑制剂，比如针对于黑色素瘤，以及非小细胞肺癌和消化道肿瘤的帕博丽珠单抗、阿特珠单抗、尼沃单抗等等，已经有大量的临床医学证据表明在PDL-1高表达或TMB高表达的肿瘤患者中这些免疫检查点抑制剂的疗效要远远的优于化疗。二，CAR-T细胞治疗，CAR-T是利用体外扩增，细胞培养，将自体的淋巴细胞回输体内以杀死癌细胞，是针对于血液系统恶性肿瘤非常有前景，也有很好效果的免疫治疗方法，这种治疗方法目前已经用于消化道肿瘤的临床实验当中。三，其他的免疫治疗方法还包括有生物治疗，以及细胞治疗等等。
PD-1单抗是针对PD-1的单克隆抗体。PD-1即程序性死亡受体1（programmed celldeath-1），它是肿瘤细胞表面表达的一种细胞免疫抗原，它可以与肿瘤特异性淋巴细胞表面的PD-L1配体相结合诱导淋巴细胞死亡，从而使肿瘤细胞逃避抗肿瘤淋巴细胞的攻击，这在临床上叫做肿瘤细胞的免疫逃逸。PD-1单克隆抗体则可以封闭肿瘤细胞表面PD-1与淋巴细胞PD-L1相结合，从而抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，增强抗肿瘤免疫功能。以PD-1单抗为代表的免疫治疗，明显改善了恶性肿瘤的疗效，是目前最热门的免疫治疗方法之一。
中国专利201810485125.6中公开了一种新型PD-1肿瘤免疫抑制剂及其药物制备方法，该免疫抑制剂由如下重量份数原料制成：30-45份PD-1单抗、2-6份生物碱、4-7份抗生素、3-9份烷化剂、1-5份铂剂、5-9份代谢拮抗剂组成；其中，生物碱由紫杉醇、长春新碱、多西他塞中的一种或多种组成；抗生素由表柔比星、伊达比星、丝裂霉素中的一种或多种组成；烷化剂为异环磷酰胺、达卡巴嗪中的一种或两种；铂剂为顺铂、奥沙利铂中的一种或两种；代谢拮抗剂为吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟中的一种或多种；该免疫抑制剂能够阻断肿瘤细胞上表达的PD-L1分子与活化T细胞上的受体的相互作用，而抑制活化T细胞的凋亡，提高对肿瘤细胞的杀伤能力。但该发明提供的药物成分过于复杂，且成本较高。
中国专利202011385436.9公开了基于喹啉衍生物与PD-1单抗的组合及其在抗消化道肿瘤、泌尿系统肿瘤、神经内分泌肿瘤中的用途。该药物组合包含酪氨酸激酶抑制剂以及人类PD-1抗体，可用于治疗肿瘤。
“绿脓杆菌”又称“铜绿假单胞菌”（学名：Pseudomonas aeruginosa），是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，为需氧菌，能产生多种与毒力有关的物质，如内毒素、外毒素a、弹性蛋白酶、胶原酶、胰肽酶等。
目前尚未有技术将绿脓杆菌和PD-1抗体联合应用于肿瘤的治疗。
发明内容
本发明中，术语“PD-1”是扩增的CD28/CTLA-4家族T细胞调节剂，具有与术语“程序性死亡受体1”相同的含义。
本发明中，术语“抗体”是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，能与抗原特异性结合。
本发明中，术语“PD-1抗体”指机体由于PD-1为抗原刺激产生的抗体。
本发明中，术语“抗肿瘤”是指对肿瘤具有一定的治疗效果，肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤。
本发明中，“具有一定的治疗效果”是指对肿瘤的发生或发展起到抑制作用而达到治疗目的。
本发明中，术语“应用量”是指联合用药时对个体的药物施用量，也是治疗有销量。
“治疗有效量”、“有效量”或“有效剂量”是在对象中产生期望的治疗效果（例如预防或治疗目标病症或减轻与该病症相关的症状）的治疗剂的量。精确的治疗有效量是在给定对象中在治疗效果方面产生最有效结果的组合物的量。这个量取决于多种因素会有所不同，这些因素包括但不限于，治疗化合物的特点（包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度）、对象的生理条件（包括年龄、性别、疾病的类型和阶段、总体身体状况、对给定的剂量的反应和药物的类型）、制剂中的药学可接受的载体或载体的性质以及给药途径。
本发明中，术语“抗体或其功能性片段”是指与特定抗原或抗原决定簇特异性结合或发生免疫反应的免疫球蛋白分子，包括多克隆和单克隆抗体。抗体一词包括基因工程或以其他方式修饰的免疫球蛋白，例如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和杂抗体（例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体）。
本发明中，“治疗”或对病症（例如癌症）的“治疗”可指阻止该病症、减缓该病症的发生或发展 速度、降低该病症的发展危险、阻止或延缓与该病症相关症状的发展、减少或终止与该疾病相关的症状、产生该病症的全部或部分消退，或它们的任何组合。
本发明中，术语“注射液”指药物制成的供注入体内的无菌溶液（包括乳浊液和混悬液）以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液。
本发明中，术语“双抗”指青链霉素混合液，青链霉素混合液双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。
一方面，本发明提供了PD-1抗体和绿脓杆菌在制备肿瘤药物中的应用。
所述的PD-1抗体和绿脓杆菌共同作用于肿瘤；所述的PD-1抗体为抗体本身或其功能片段。
具体地，所述的绿脓杆菌的应用量为1×109-1×1011个/kg体重。
所述的绿脓杆菌的应用量为1×109-2×109个/kg体重、2×109-3×109个/kg体重、1×109-1×1010个/kg体重、1×109-2×1010个/kg体重、1×109-3×1010个/kg体重、1×109-4×1010个/kg体重、4×109-4×1010个/kg体重、4×109-1×1011个/kg体重、1×109-1.8×1010个/kg体重、2×109-1.8×1010个/kg体重、1.8×1010-1×1011个/kg体重、4×109-1.8×1010个/kg体重。
优选地，所述的绿脓杆菌的应用量为4×109-1.8×1010个/kg体重。
所述的绿脓杆菌的应用量为4×109-1×1010个/kg体重、5×109-1.8×1010个/kg体重、5×109-1.2×1010个/kg体重、8×109-1×1010个/kg体重、9×109-1.5×1010个/kg体重。
进一步优选地，所述的绿脓杆菌的应用量为1.8×1010个/kg体重。
具体地，所述的PD-1抗体的应用量为10-15mg/kg体重。
所述的PD-1抗体的应用量为11-15mg/kg体重、12-15mg/kg体重、13-15mg/kg体重、14-15mg/kg体重、11-12mg/kg体重、11-13mg/kg体重、11-14mg/kg体重、12-14mg/kg体重、12-13mg/kg体重。
优选地，所述的PD-1抗体的应用量为12-13mg/kg体重。
所述的PD-1抗体的应用量为12.1-12.9mg/kg体重、12.2-12.9mg/kg体重、12.3-12.9mg/kg体重、12.5-12.9mg/kg体重、12.2-12.3mg/kg体重、12.2-12.5mg/kg体重、12.5-12.8mg/kg体重、12.5-12.7mg/kg体重、12.5-12.6mg/kg体重、12.6-12.9mg/kg体重、12.7-12.9mg/kg体重、12.7-12.8mg/kg体重。
进一步优选地，所述的PD-1抗体的应用量为12.5mg/kg体重。
优选地，所述的绿脓杆菌的应用量为1×109-1×1011个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为10-15mg/kg体重；所述的绿脓杆菌的应用量为1×109-2×109个/kg体重、2×109-3×109个/kg体重、1×109-1×1010个/kg体重、1×109-2×1010个/kg体重、1×109-3×1010个/kg体重、1×109-4×1010个/kg体重、4×109-4×1010个/kg体重、4×109-1×1011个/kg体重、1×109-1.8×1010个/kg体重、2×109-1.8×1010个/kg体重、1.8×1010-1×1011个/kg体重、4×109-1.8×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为11-15mg/kg体重、12-15mg/kg体重、13-15mg/kg体重、14-15mg/kg体重、11-12mg/kg体重、11-13mg/kg体重、11-14mg/kg体重、12-14mg/kg体重、12-13mg/kg体重。
进一步优选地，所述的绿脓杆菌的应用量为4×109-1.8×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为12-13mg/kg体重；所述的绿脓杆菌的应用量为4×109-1×1010个/kg体重、5×109-1.8×1010个/kg体重、5×109-1.2×1010个/kg体重、8×109-1×1010个/kg体重、9×109-1.5×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为12.1-12.9mg/kg体重、12.2-12.9mg/kg体重、12.3-12.9mg/kg体重、12.5-12.9mg/kg体重、12.2-12.3mg/kg体重、12.2-12.5mg/kg体重、12.5-12.8mg/kg体重、12.5-12.7mg/kg体重、12.5-12.6mg/kg体重、12.6-12.9mg/kg体重、12.7-12.9mg/kg体重、12.7-12.8mg/kg体重。
在一些实施例中，所述的绿脓杆菌的应用量为4×109-1.8×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为12.5mg/kg体重。
所述的PD-1抗体可以是人源或鼠源。
优选地，所述的PD-1抗体为InVivoMAb anti-mouse PD-1。
所述的肿瘤包括但不限于：肺癌、骨癌、膀胱癌、脑癌、乳癌、泌尿道癌、癌、子宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、肝细胞癌、肝癌、淋巴瘤和白血病、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂体癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌和子宫癌组成的组中的癌症。
给药途径可为本领域中已知的任何给药途径，包括但不限于，经肠、经鼻、经皮。“肠道外”指的是通常与注射相关的给药途径，包括眶下、输液、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、被膜下、皮下、经粘膜或经气管。
优选地，给药方式为注射。
优选地，所述的绿脓杆菌为绿脓杆菌注射液，所述的PD-1抗体为PD-1抗体注射液。
所述的绿脓杆菌和PD-1抗体可以同时使用，也可顺序使用。
所述的绿脓杆菌和PD-1抗体在顺序使用时，先使用绿脓杆菌，再使用PD-1抗体。
所述的绿脓杆菌和PD-1抗体在顺序使用时，先使用PD-1抗体，再使用绿脓杆菌。
所述的绿脓杆菌可以是：CCTCC AB 2012006、CCTCC AB 2013115、CCTCC AB2013246、CGMCC 1.15148、CGMCC 1.10712、CGMCC 1.10612、CGMCC 1.10452、CGMCC1.10274、CGMCC 1.596、CGMCC 1.12483、CGMCC 1.7418。
所述的绿脓杆菌也可以是成品绿脓杆菌注射液。
在一些实施例中，特定制剂的治疗有效剂量可能等于或低于标准剂量。在一个优选的实施例中，治疗有效剂量低于标准剂量。根据本文中所述的实施例使用的特定制剂的治疗有效剂量可以是该特定制剂的标准剂量的比例或百分比的剂量。在一些方面，特定制剂的治疗有效剂量可以在标准剂量的约1％和99％之间、在标准剂量的约1％和90％之间、在标准剂量的约1％和80％之间、在标准剂量的约1％和70％之间、在标准剂量的约1％和60％之间、在标准剂量的约1％和50％之间、在标准剂量的约1％和40％之间、在标准剂量的约1％和30％之间、在标准剂量的约1％和20％之间、在标准剂量的约5％和20％之间、在标准剂量的约1％和10％之间或低于标准剂量的约10％。在一个方面，特定制剂的治疗有效剂量可以为标准剂量的约10％、标准剂量的约1％或低于标准剂量的1％。但在又一个方面，特定制剂的治疗有效剂量可以在标准剂量的约0.1％和1％之间、在标准剂量的约0.01％和1％之间或在标准剂量的约0.001％和1％之间。
另一方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物。
所述的药物中包括PD-1抗体和绿脓杆菌。
所述的绿脓杆菌的含量为1×108个/mL-1×1010个/mL。
所述的绿脓杆菌的含量为1×108-2×108个/mL、2×108-3×108个/mL、1×108-1×109个/mL、1×108-2×109个/mL、1×108-3×109个/mL、1×108-4×109个/mL、4×108-4×109个/mL、4×108-1×1010个/mL、1×108-1.8×109个/mL、2×108-1.8×109个/mL、1.8×109-1×1010个/mL、4×108-1.8×109个/mL。
优选地，所述的绿脓杆菌的含量为4×108个/mL-1.8×109个/mL。
所述的绿脓杆菌的含量为4×108-1×109个/mL、5×108-1.8×109个/mL、5×108-1.2×109个/mL、8×108-1×109个/mL、9×108-1.5×109个/mL。
进一步优选地，所述的绿脓杆菌的含量为4×108个/mL或1.8×109个/mL，更进一步为1.8×109个/mL。
所述的PD-1抗体的含量为1-2g/L。
所述的PD-1抗体的含量为1-2g/L、1-1.8g/L、1-1.5g/L、1.2-2g/L、1.2-1.8g/L、1.4-1.6g/L。
优选地，所述的PD-1抗体的含量为1-1.5g/L。
所述的PD-1抗体的含量为1-1.45g/L、1-1.4g/L、1-1.35g/L、1.1-1.5g/L、1.2-1.5g/L、1.1-1.3g/L、1.1-1.2g/L。
进一步优选地，所述的PD-1抗体的含量为1.25g/L。
优选地，所述的抗肿瘤药物中包括绿脓杆菌1×108个/mL-1×1010个/mL和PD-1抗体的含量为1-2g/L；所述的绿脓杆菌的含量为1×108-2×108个/mL、2×108-3×108个/mL、1×108-1×109个/mL、1×108-2×109个/mL、1×108-3×109个/mL、1×108-4×109个/mL、4×108-4×109个/mL、4×108-1×1010个/mL、1×108-1.8×109个/mL、2×108-1.8×109个/mL、1.8×109-1×1010个/mL、4×108-1.8×109个/mL；所述的PD-1抗体的含量为1-2g/L、1-1.8g/L、1-1.5g/L、1.2-2g/L、1.2-1.8g/L、1.4-1.6g/L。
进一步优选地，所述的抗肿瘤药物中包括绿脓杆菌4×108-1.8×109个/mL和PD-1抗体1-1.5g/L；所述的绿脓杆菌的含量为4×108-1×109个/mL、5×108-1.8×109个/mL、5×108-1.2×109个/mL、8×108-1×109个/mL、9×108-1.5×109个/mL；所述的PD-1抗体的含量为1-1.45g/L、1-1.4g/L、1-1.35g/L、1.1-1.5g/L、1.2-1.5g/L、1.1-1.3g/L、1.1-1.2g/L。
在一些实施例中，所述的抗肿瘤药物中包括绿脓杆菌1.8×109个/mL和PD-1抗体1.25g/L。
在一些实施例中，所述的抗肿瘤药物中包括绿脓杆菌4×108个/mL和PD-1抗体1.25g/L。
所述的PD-1抗体可以是人源或鼠源。
优选地，所述的PD-1抗体为InVivoMAb anti-mouse PD-1。
所述的抗肿瘤药物中还包括其他药学上可接受的载体或赋形剂，合适的药物载体、赋形剂和/或稀释剂的例子在本领域熟知并包括磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂如油/水乳剂、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这种载体的组合物可通过熟知的常规方法制成。这些药物组合物能以合适的剂量施用给受试者。施用合适的组合物可通过不同方式实现，如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部、皮内、鼻内或支气管内施用。发明组合物也可直接施用到靶位点，如通过弹导传递到外部或内部靶位点。剂量方案由参与的医师和临床因素确定。如医学领域熟知的，任何病人的剂量取决于许多因素，包括病人体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、总体健康和其它同时施用的药物。
所述的抗肿瘤药物中还可能包括佐剂，所述的佐剂用于增强药物作用，所述的佐剂包括但不限于：维生素C、维生素A、维生素E、维生素B-6、类胡萝卜素和β胡萝卜素、硒、锌、类黄酮和生物类黄酮、铁螯合剂、辅酶Q10、赖氨酸肉毒碱、含有谷胱甘肽的化合物、ω-3脂肪酸、催乳素、生长激素、α-硫辛酸、香菇多糖、多糖-K(MC-S)、合成的胞苷磷酸-鸟苷(CpG)、寡脱氧核苷酸、白细胞介素(例如IL-2或IL-12)、肿瘤坏死因子α或β(TNF-α或-β)、富脯氨酸的多肽、β-葡聚糖、肿瘤抗原、杀灭肿瘤细胞治疗、表达细胞因子的基因治疗载体、T细胞共刺激分子或其他适合的免疫刺激分子。
所述的抗肿瘤药物的剂型包括但不限于：输液剂，注射剂等液体药剂。
所述的抗肿瘤药物针对的病症包括但不限于：肺癌、骨癌、膀胱癌、脑癌、乳癌、泌尿道癌、癌、子宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、肝细胞癌、肝癌、淋巴瘤和白血病、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂体癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌和子宫癌组成的组中的癌症。
优选地，所述的抗肿瘤药物的给药方式为注射。
优选地，所述的绿脓杆菌注射液每三天施用一次，与PD-1抗体隔天给药，共治疗21天。
在一些实施例中，当首次施用药物记为D1，之后每日记为D2、D3、D4……D1、D4、D7、D10、D13、D16、D19施用绿脓杆菌注射液，D3、D6、D9、D12、D15、D18、D21施用PD-1抗体。
再一方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物的制备方法。
所述的制备方法中包括添加绿脓杆菌和PD-1抗体。
所述的绿脓杆菌的添加量为1×108-1×1010个/mL，所述的PD-1抗体的添加量为1-2g/L。
所述的绿脓杆菌的添加量为1×108-2×108个/mL、2×108-3×108个/mL、1×108-1×109个/mL、1×108-2×109个/mL、1×108-3×109个/mL、1×108-4×109个/mL、4×108-4×109个/mL、4×108-1×1010个/mL、1×108-1.8×109个/mL、2×108-1.8×109个/mL、1.8×109-1×1010个/mL、4×108-1.8×109个/mL；所述的PD-1抗体的添加量为1-2g/L、1-1.8g/L、1-1.5g/L、1.2-2g/L、1.2-1.8g/L、1.4-1.6g/L。
优选地，所述的绿脓杆菌添加量为4×108个/mL-1.8×109个/mL，所述的PD-1抗体添加量为1-1.5g/L。
所述的绿脓杆菌的添加量为4×108-1×109个/mL、5×108-1.8×109个/mL、5×108-1.2×109个/mL、8×108-1×109个/mL、9×108-1.5×109个/mL；所述的PD-1抗体的添加量为1-1.45g/L、1-1.4g/L、1-1.35g/L、1.1-1.5g/L、1.2-1.5g/L、1.1-1.3g/L、1.1-1.2g/L。
在一些实施例中，所述的绿脓杆菌添加量为1.8×109个/mL，所述的PD-1抗体添加量为1.25g/L。
在一些实施例中，所述绿脓杆菌添加量为4×108个/mL，所述的PD-1抗体添加量为1.25g/L。
所述的制备方法中还包括药物制备过程中所需要的其他必要步骤。
所述的必要步骤包括但不限于：分离、浓酸、纯化、去杂质、药物检验、过滤、混合、分装等。
所述的制备方法中可能还包括PD-1的制备方法，其通过生物工程技术制备而成的方法，其通过载体表达制备的方法，其通过免疫反应制备的方法等。
所述的PD-1的制备方法中可以包括载体的构建，转染细胞，细胞表达等。
所述的载体的构建通过将表达PD-1的基因插入载体完成；所述的载体包括但不限于pEGFP-N1载体、pEGFP-C1载体、pCMVp-NEO-BAN 载体、pBAD载体、pSV质粒、pEG载体、pCDNA3.1(+)。
所述的转染细胞中的细胞包括但不限于： HEK293T细胞、CHO细胞。
所述的制备方法中可能还包括绿脓杆菌注射液的制备方法，其通过生物工程技术制备而成的方法，其通过微生物培养制备的方法，其通过自然筛选制备的方法。
所述的绿脓杆菌可以是该菌种下的任一菌株，所述的绿脓杆菌注射液可以是该菌种下任一菌株通过生物工程技术制备的注射液。
所述的绿脓杆菌注射液的制备方法中可能包括：稀配法或浓配法；所述的稀配法为原料质量好，一次配成；所述的浓配法：先配浓原料再稀释。
所述的绿脓杆菌注射液的制备方法中可能包括：菌种活化，接种，扩大培养等。
所述的绿脓杆菌注射液中所选用的绿脓杆菌可以是：CCTCC AB 2012006、CCTCCAB 2013115、CCTCC AB 2013246、CGMCC 1.15148、CGMCC 1.10712、CGMCC 1.10612、CGMCC1.10452、CGMCC 1.10274、CGMCC 1.596、CGMCC 1.12483、CGMCC 1.7418。
又一方面，本发明提供了前述抗肿瘤药物在治疗肿瘤病症中的应用。
所述的肿瘤病症包括但不限于：肺癌、骨癌、膀胱癌、脑癌、乳癌、泌尿道癌、癌、子宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、肝细胞癌、肝癌、淋巴瘤和白血病、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂体癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌和子宫癌组成的组中的癌症。
具体地，所述的抗肿瘤药物在应用时：绿脓杆菌的应用量为1×109-1×1011个/kg体重。
所述的抗肿瘤药物在应用时：绿脓杆菌的应用量为1×109-2×109个/kg体重、2×109-3×109个/kg体重、1×109-1×1010个/kg体重、1×109-2×1010个/kg体重、1×109-3×1010个/kg体重、1×109-4×1010个/kg体重、4×109-4×1010个/kg体重、4×109-1×1011个/kg体重、1×109-1.8×1010个/kg体重、2×109-1.8×1010个/kg体重、1.8×1010-1×1011个/kg体重、4×109-1.8×1010个/kg体重。
优选地，所述的抗肿瘤药物在应用时：绿脓杆菌的应用量为4×109-1.8×1010个/kg体重。
所述的抗肿瘤药物在应用时：绿脓杆菌的应用量为4×109-1×1010个/kg体重、5×109-1.8×1010个/kg体重、5×109-1.2×1010个/kg体重、8×109-1×1010个/kg体重、9×109-1.5×1010个/kg体重。
进一步优选地，所述的抗肿瘤药物在应用时：绿脓杆菌的应用量为1.8×1010个/kg体重。
具体地，所述的抗肿瘤药物在应用时：PD-1抗体的应用量为10-15mg/kg体重。
所述的抗肿瘤药物在应用时：PD-1抗体的应用量为11-15mg/kg体重、12-15mg/kg体重、13-15mg/kg体重、14-15mg/kg体重、11-12mg/kg体重、11-13mg/kg体重、11-14mg/kg体重、12-14mg/kg体重、12-13mg/kg体重。
优选地，所述的抗肿瘤药物在应用时：PD-1抗体的应用量为12-13mg/kg体重。
所述的抗肿瘤药物在应用时：PD-1抗体的应用量为12.1-12.9mg/kg体重、12.2-12.9mg/kg体重、12.3-12.9mg/kg体重、12.5-12.9mg/kg体重、12.2-12.3mg/kg体重、12.2-12.5mg/kg体重、12.5-12.8mg/kg体重、12.5-12.7mg/kg体重、12.5-12.6mg/kg体重、12.6-12.9mg/kg体重、12.7-12.9mg/kg体重、12.7-12.8mg/kg体重。
进一步优选地，所述的抗肿瘤药物在应用时：PD-1抗体的应用量为12.5mg/kg体重。
优选地，所述的抗肿瘤药物在应用时：所述的所述的绿脓杆菌的应用量为1×109-1×1011个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为10-15mg/kg体重；所述的绿脓杆菌的应用量为1×109-2×109个/kg体重、2×109-3×109个/kg体重、1×109-1×1010个/kg体重、1×109-2×1010个/kg体重、1×109-3×1010个/kg体重、1×109-4×1010个/kg体重、4×109-4×1010个/kg体重、4×109-1×1011个/kg体重、1×109-1.8×1010个/kg体重、2×109-1.8×1010个/kg体重、1.8×1010-1×1011个/kg体重、4×109-1.8×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为11-15mg/kg体重、13-15mg/kg体重、13-15mg/kg体重、14-15mg/kg体重、11-12mg/kg体重、11-13mg/kg体重、11-14mg/kg体重、12-14mg/kg体重、12-13mg/kg体重。
进一步优选地，所述的抗肿瘤药物在应用时：绿脓杆菌的应用量为4×109-1.8×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为12-13mg/kg体重；所述的绿脓杆菌的应用量为4×109-1×1010个/kg体重、5×109-1.8×1010个/kg体重、5×109-1.2×1010个/kg体重、8×109-1×1010个/kg体重、9×109-1.5×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为12.1-12.9mg/kg体重、12.2-12.9mg/kg体重、12.3-12.9mg/kg体重、12.5-12.9mg/kg体重、12.2-12.3mg/kg体重、12.2-12.5mg/kg体重、12.5-12.8mg/kg体重、12.5-12.7mg/kg体重、12.5-12.6mg/kg体重、12.6-12.9mg/kg体重、12.7-12.9mg/kg体重、12.7-12.8mg/kg体重。
在一些实施例中，所述的抗肿瘤药物在应用时：绿脓杆菌的应用量为4×109-1.8×1010/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为12.5mg/kg体重。
所述的抗肿瘤药物在应用时，给药途径可为本领域中已知的任何给药途径，包括但不限于，经肠、经鼻、经皮。“肠道外”指的是通常与注射相关的给药途径，包括眶下、输液、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、被膜下、皮下、经粘膜或经气管。
优选地，给药方式为注射。
优选地，所述的抗肿瘤药物在应用时绿脓杆菌为绿脓杆菌注射液，所述的PD-1抗体为PD-1抗体注射液。
所述的绿脓杆菌和PD-1抗体可以同时使用，也可顺序使用。
所述的绿脓杆菌和PD-1抗体在顺序使用时，先使用绿脓杆菌，再使用PD-1抗体。
所述的绿脓杆菌和PD-1抗体在顺序使用时，先使用PD-1抗体，再使用绿脓杆菌。
优选地，所述的绿脓杆菌注射液每三天施用一次，与PD-1抗体隔天给药，共治疗21天。
在一些实施例中，当首次施用药物记为D1，之后每日记为D2、D3、D4……D1、D4、D7、D10、D13、D16、D19施用绿脓杆菌注射液，D3、D6、D9、D12、D15、D18、D21施用PD-1抗体。
在一些实施例中，所述的抗肿瘤药物在应用时，治疗有效剂量可能等于或低于标准剂量。在一个优选的实施例中，治疗有效剂量低于标准剂量。根据本文中所述的实施例使用的特定制剂的治疗有效剂量可以是该特定制剂的标准剂量的比例或百分比的剂量。在一些方面，特定制剂的治疗有效剂量可以在标准剂量的约1％和99％之间、在标准剂量的约1％和90％之间、 在标准剂量的约1％和80％之间、在标准剂量的约1％和70％之间、在标准剂量的约1％和60％之间、在标准剂量的约1％和50％之间、在标准剂量的约1％和40％之间、在标准剂量的约1％和30％之间、在标准剂量的约1％和20％之间、在标准剂量的约5％和20％之间、在标准剂量的约1％和10％之间或低于标准剂量的约10％。在一个方面，特定制剂的治疗有效剂量可以为标准剂量的约10％、标准剂量的约1％或低于标准剂量的1％。但在又一个方面，特定制剂的治疗有效剂量可以在标准剂量的约0.1％和1％之间、在标准剂量的约0.01％和1％之间或在标准剂量的约0.001％和1％之间。
在本发明的一些方案中，主体先前未接受过系统化疗。在一些方案中，主体先前已接受手术治疗、放射治疗、诱导化疗和/或辅助化疗，或者主体接受同期的化疗。在一些具体实施方式中，主体先前未接受过系统化疗，但是接受过手术治疗、放射治疗、诱导化疗和/或辅助化疗或者将接受同期的化疗。在一些具体实施方式中，主体经手术治疗、放射治疗、诱导化疗、同期的化疗和/或辅助化疗后，获完全缓解后再次出现疾病进展。在一些具体实施方式中，主体经手术治疗、放射治疗、诱导化疗、同期的化疗和/或辅助化疗后，未能完全缓解或未能部分缓解。在一些具体实施方式中，主体经手术治疗、放射治疗、诱导化疗、同期的化疗和/或辅助化疗后癌症发生转移。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一种联合用药的方法，使绿脓杆菌注射液和PD-1抗体针对肿瘤的治疗效果得到了提升；
2、联合给药（PD-1抗体和铜绿假单胞菌注射液）能有效抑制肿瘤大小，并提高小鼠的CD4+T细胞TNF-α的表达，以及巨噬细胞中MHC-Ⅱ的水平。
附图说明
图1为THP-1细胞来源的M0巨噬细胞与铜绿假单胞菌注射液或LPS+IFN-γ共培养24h后的倒置显微镜影像。A：对照组；B：铜绿假单胞菌注射液（108个/mL）共培养组；C：LPS（20ng/mL）+IFN-γ（20ng/mL）共培养组。
图2为流式细胞仪检测THP-1细胞来源的M0巨噬细胞与不同浓度铜绿假单胞菌注射液（0、106、107、108个/mL）或LPS+IFN-γ（20ng/mL）共培养48h后，CD14+细胞CD86和TNF-α的表达。需要特别说明的是，图2中相关数据已标出，本领域技术人员可以根据标出的数据判断本申请技术效果。
图3为Western-blot法检测铜绿假单胞菌注射液对THP-1来源的巨噬细胞NF-κ-B以及p-NF-κB水平的影响。
图4为MTT法检测不同浓度铜绿假单胞菌注射液（0、106、107、108个/mL）或LPS+IFN-γ（20ng/mL）与THP-1细胞源性巨噬细胞共培养48h所制备的条件培养基对H1975细胞增殖活力的影响。
图5为PD-1抗体和铜绿假单胞菌注射液（图中缩写为PA-MSHA）联合用药减小肿瘤大小。A：肿瘤生长曲线。实验鼠分群及数量：Control，n=6；PD-1抗体（250μg/只），n=6；PA-MS-HIGH（1.8×109个/mL），n=6；PA-MS-LOW（4×108个/mL），n=6；PD-1抗体（250μg/只）+PA-MS-HIGH（1.8×109个/mL），n=6；PD-1抗体（250μg/只）+ PA-MS-LOW（4×108个/mL），n=6。B：小鼠体重，实验鼠分群及数量：Control，n=6；PD-1抗体（250μg/只），n=6；PA-MS（4×108个/mL），n=6；PD-1抗体（250μg/只）+PA-MS（4×108个/mL），n=6。C-D：小鼠取材后肿瘤体重及照片。E：活体小鼠肿瘤成像，LUC-LLC细胞在C57小鼠接受第20天治疗的活体成像图。*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。
图6为肿瘤浸润性免疫细胞检测结果和血及脾中免疫细胞检测结果，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中，术语“细胞系”指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。也指可长期连续传代的培养细胞。
本发明中，术语“培养基”是指供给微生物、植物或动物（或组织）生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等几大类物质。
本发明中，术语“注射液”指药物制成的供注入体内的无菌溶液（包括乳浊液和混悬液）以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液。
本发明中，术语“双抗”指青链霉素混合液，青链霉素混合液双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。
本发明中，术语“LPS”指脂多糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是由脂质和多糖构成的物质（糖脂质）。
本发明中，术语“IFN-γ”指Ⅱ型干扰素，又称γ-IFN或免疫干扰素，是由有丝分裂原刺激T淋巴细胞产生。干扰素是一种高效的抗病毒生物活性物质，又是一种具有广泛免疫调节作用的淋巴因子。
本发明中，术语“Brefeldin A”是一种常用的蛋白转运抑制剂，特异性地可逆地阻断蛋白质从内质网(ER)转运到高尔基体(Golgi)。
本发明中，“PMA”为佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，是一种PKC活化剂，PKC（蛋白激酶C）是蛋白激酶的家族，其通过磷酸化这些蛋白上的丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基的羟基参与控制其他蛋白的功能。 PKC酶又通过诸如二酰基甘油（DAG）或钙离子（Ca2+）浓度增加的信号激活。因此，PKC酶在几种信号转导级联中起重要作用。PKC参与受体脱敏，调节膜结构事件，调节转录，介导免疫应答，调节细胞生长，以及学习和记忆。这些功能通过PKC介导的其他蛋白质的磷酸化来实现。本申请中PMA通过活化PKC调节THP-1细胞的生长。
本发明中，“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如，非人抗体的“人源化形式”，是指已经经历人源化的抗体。
本发明中，“一抗”是指能和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。
本发明中，“二抗”是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。一抗可以特异结合底物，识别检测对象。一抗和底物结合与否通过二抗和一抗结合体现，二抗并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。
本发明中，“辅助治疗”也称为附加治疗，通常是手术后给予的治疗，以消灭体内任何仍然残余的癌细胞。给予辅助治疗以降低肿瘤复发或向其他部位播散的可能性。辅助治疗可能包括放疗、化疗、激素治疗或进一步手术治疗。
本发明中，“生物工程技术”是以生物学(特别是其中的微生物学、遗传学、生物化学和细胞学)的理论和技术为基础，结合化工、机械、电子计算机等现代工程技术，充分运用分子生物学的最新成就，自觉地操纵遗传物质，定向地改造生物或其功能，短期内创造出具有超远缘性状的新物种，再通过合适的生物反应器对这类“工程菌”或“工程细胞株”进行大规模的培养，以生产大量有用代谢产物或发挥它们独特生理功能一门新兴技术。本发明中的生物工程技术包括对绿脓杆菌的培养和PD-1的制备。本发明中绿脓杆菌的培养通过以微生物学为基础的生物工程技术完成；PD-1的制备依托以分子生物学和细胞学为基础的生物工程技术完成。
本发明中，“巨噬细胞”也称组织细胞（histocyte），是由血液中的单核细胞穿出血管后分化而成的。单核细胞进入结缔组织后，体积增大，内质网和线粒体增生，溶酶体增多，吞噬功能增强。巨噬细胞的寿命因所在组织器官而异，一般可存活数月或更长。巨噬细胞可以被PA-MSHA激活，从而对肿瘤有抑制作用。
本发明中“THP-1细胞”广泛用于单核细胞和巨噬细胞相关的机制、信号通路以及营养和药物运输等研究中。相对于U937、HL-60、ML-2等白血病细胞系，THP-1更有类似人原代单核细胞的形态和功能特征（包括细胞分化标记）。相对于人外周血单核细胞（PBMC），THP-1更易在实验室中培养和扩增，且具有更稳定的基因背景，不存在PBMC的个体差异性问题，利于实验结果的重现。因此，THP-1是常用的急性单核细胞白血病细胞系，是研究免疫和炎症的理想工具。
本发明中，“激活”一般指细胞激活，是指细胞在一定条件的刺激下，由休眠状态转变为活性状态的过程。PA-MSHA激活巨噬细胞，即PA-MSHA使巨噬细胞发挥肿瘤抑制作用。
本发明中，“自然杀伤”是指自然杀伤细胞的杀伤功能，自然杀伤细胞(naturalkiller cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。
本发明中，“T细胞活化”即T细胞活化技术，属于细胞免疫，细胞免疫（cellularimmunity）T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。T细胞是细胞免疫的主要细胞。
本发明中，“模型”可以是细胞模型或小鼠模型，具体参考实施例内容确定。其中，细胞模型是指用于研究特定药物功效的细胞系，如本发明中用于研究铜绿假单胞菌注射液功效的THP-1细胞。动物模型是指用于研究特定药物功效的动物，一般来说，动物模型经过一定的处理，使之具有能够作为药物功效标志的特点，如本发明中注射LUC-LLC细胞和去生长因子基质胶的混合物的肿瘤小鼠模型，用于研究PD-1抗体和绿脓杆菌联合用药对肿瘤的影响。
本发明中，“模型”可以是炎症模型，即THP-1被佛波酯(PMA)诱导分化为巨噬细胞，并且再通过脂多糖(LPS)和IFN-γ诱导M1极化，释放出TNF-α、IL-6等细胞因子，这是典型的炎症模型。
本发明中，“经典活化”是指巨噬细胞的极化类型的一种。巨噬细胞按照其表型和分泌的细胞因子可以分为两种极化类型,即经典活化（Classically activated）的M1型和选择性活化（Alternatively activated）的M2型巨噬细胞。其中M1型往往表现对肿瘤的抑制作用，M2型往往表现对肿瘤的促进作用。
本发明中，“促炎反应”即巨噬细胞通过脂多糖(LPS)和IFN-γ诱导M1极化，释放出TNF-α、IL-6等细胞因子的过程。
本发明中，“宿主”是能给病原体提供营养和场所的生物，包括人和动物。
本发明中，“病原体”是指可造成人或动植物感染疾病的微生物（包括细菌、病毒、立克次氏体、真菌）、寄生虫或其他媒介（微生物重组体包括杂交体或突变体）。
本发明中，“蛋白酶抑制剂”指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。
本发明中，“10% SDS-PAGE电泳”为丙烯酰胺浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。
本发明中，“NC膜”为硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，可作为免疫反应的发生处。
本发明中，“孵育”指抗体孵育，在一定的稀释度、一定的温度环境下，一抗与二抗、抗体与抗原发生孵育反应，即抗体与抗原的结合或一抗与二抗的结合反应。
本发明中，“MTT”即MTT法，又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法用于生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
本发明中，“吸亮度值”即光吸收值，也叫吸光度值，指光线通过溶液或物质前的入射光强度与光线通过溶液或某一物质后的透射光强度的比值（I0/I1）的以10为底的对数（即lg(I0/I1)），其中I0为入射光强，I1为透射光强，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。
本发明中，“OD(给药组细胞)”指给药组细胞的吸亮度值。
本发明中，“OD(未处理组细胞)”指未处理组细胞的吸亮度值。
本发明中，“单向方差分析”应用于当有三个或更多个独立组和仅有一个独立变量时。它同时检验这些组平均数之间的差别显著性。单向方差分析的目标是求出这些组平均数之间的变化是否也是偶然的原因。单向方差分析是一种方式分组的方差分析，单因子析因试验数据的统计分析。单向方差分析的基本问题估计和比较多个等方差正态总体的均值。用于单个实验变量中两种处理以上的独立随机样本，叫做完全随机设计(单向)，在这种设计中的F检验，即为单向方差分析。
本发明中，“Dunnett检验”是一种方差分析检验方法，适用于k-1个实验组与一个对比组均数差别的多重比较。
本发明中，“学生t检验”即student t检验（Student's t test）主要用于样本含量较小（例如n<30），总体标准差σ未知的正态分布。t检验是用t分布理论来推论差异发生的概率，从而比较两个平均数的差异是否显著。
本发明中，“共培养”即细胞共培养技术，是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，具有更好地反映体内环境的优点。
本发明中，“贴壁性”指细胞具有的贴壁生长的特性，贴壁生长是指细胞贴附在一定的固相表面进行的生长。贴壁生长是某些细胞的一种特性，贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。贴壁生长的细胞要经过游离期、吸附期、繁殖期和退化期。贴壁生长的细胞可以用蛋白酶等洗脱下来。与贴壁生长相对的是悬浮培养。
本发明中，“细胞伪足”的产生是细胞迁移的标志，细胞迁移 (cell migration)也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
本发明中，“浓度依赖性增高”即铜绿假单胞菌注射液浓度愈高，M1型巨噬细胞标志CD86以及细胞因子TNF-α的表达愈高。
本发明中，“western-blot”实验即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
本发明中，“浓度依赖性抑制”铜绿假单胞菌注射液浓度越高，巨噬细胞条件培养基对H1975细胞的增殖活力越低。
本发明中，“LUC-LLC细胞”为小鼠肺癌荧光素酶标记细胞，用于注射至健康小鼠从而构建小鼠肿瘤模型（小鼠肺腺癌模型）。
本发明中，“去生长因子基质胶”即不含生长因子的基质胶，基质胶是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。
在室温条件下，可模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。
本发明中，适当的光照、温度、湿度指在一般条件下，即常规条件。
本发明中，“单细胞悬液”指切碎的动物组织或器官后用胰蛋白酶处理后得到细胞悬液。
本发明中，“FC阻断剂”用于封闭抗体的FC端和细胞上的受体结合。使用荧光抗体是用其特异性的Fab端识别特异性的抗原（细胞表面标记），如果非特异性的Fc端也和细胞发生结合，就产生了非特异性信号。FC阻断剂可以减少流式细胞术中非特异性信号的产生。
本发明中，“肿瘤浸润性免疫细胞”主要包括四类,肿瘤浸润性淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞、树突状细胞和骨髓来源的抑制性细胞。肺癌微环境中的肿瘤浸润性免疫细胞能够调控肿瘤的生长、转移和血管生成,对肿瘤的发展起到重要的调节作用。
本发明中，“MHC-Ⅱ”即MHC-Ⅱ类分子（MHC class Ⅱ），大多位于抗原提呈细胞（APC）上，如巨噬细胞等。这类提供则是细胞外部的情况，像是组织中有细菌侵入，则巨噬细胞进行吞食后，把细菌碎片利用MHC提示给辅助T细胞，启动免疫反应。
本发明实施例中，小鼠体重均以20g计。
以下实施例中所用的细胞及试剂来源信息如下：
THP-1细胞系，H1975细胞系，带荧光素酶LLC（LUC-LLC）细胞系均购自ATCC。
RPMI-1640 培养基、DMEM培养基、胎牛血清和双抗（青霉素/链霉素）均购自Gibco(Carlsbad, CA, USA)。
铜绿假单胞菌注射液(北京万特尔生物制药有限公司)；
InVivoMAb anti-mouse PD-1 (CD279，BioCell，BE0146)；
PMA(Sigma)；
LPS(Sigma)；
IFN-γ(Sigma)；
Brefeldin A（Biolegend）；
去生长因子基质胶（Corning，354230）；
PE-CyTM7 mouse anti-human CD14(BD)；
FITC anti-human CD86 antibody(BioLegend)；
APC anti-human CD206(MMR) antibody(BioLegend)；
PE/DazzleTM594 anti-human TNF-α antibody(BioLegend)；
APC-H7 AVI(Biolegend，117308)；
PerCP anti-mouse CD45(Biolegend，103130)；
PE-Cy7 anti-mouse CD45(Biolegend，103114)；
APC anti-mouse CD3(Biolegend，100204)；
PE-CF594 anti-mouse CD4(Biolegend，100410)；
PE-CY7 anti-mouse CD8(Biolegend，100722)；
PE-CF594 anti-mouse TNFα(Biolegend，506346)；
PE-CF594 anti-mouse IFN-γ(Biolegend，505846)；
FITC anti-mouse CD86(Biolegend，105006)；
PerCP anti-mouse CD11B(Biolegend，101230)；
PE-CF594 anti-mouse MHC-‖(Biolegend，107648)；
PE-Cy5 anti-mouse F4/80(Biolegend，123112)；
PE anti-mouse CD11C(Biolegend，117308)；
NF-κB p65(D14E12)XP rabbit mAb (CST)；
phospho-NF-κB p65(Ser536) (93H1) rabbit mAb (CST)；
β-Actin (D6A8) rabbit mAb（CST）。
实施例1铜绿假单胞菌注射液对培养THP-1细胞的影响
铜绿假单胞菌注射液是以铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株（Pseudomonasaeruginosa-mannose-sensitive hemagglutinin，PA-MSHA）为载体，经生物工程技术制备而成。其安全性好，不良反应低，可提高肿瘤患者机体免疫力，预防感染，降低感染程度，已被国家药品监督管理局批准用于恶性肿瘤的辅助治疗。PA-MSHA可以激活Th1型免疫反应，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞，促进T细胞活化，从而对肿瘤有抑制作用。
THP-1细胞广泛应用于研究单核/巨噬细胞的功能、机制、信号通路，营养与药物运输，该细胞系是研究单核和巨噬细胞活性最常用的模型。
经典活化（M1型）巨噬细胞参与促炎反应，在宿主防御病原体感染中发挥核心作用。而在肿瘤微环境中，不同于助力肿瘤生长的M2型肿瘤相关巨噬细胞，M1型巨噬细胞往往表现为对肿瘤的抑制作用。
按以下步骤进行：
（1）细胞培养及处理
THP-1细胞和H1975细胞均用RPMI 1640培养基（10% FBS，1% PS）培养于37℃，5%CO2培养箱。THP-1细胞以1×106个/mL接种，用PMA（150nM）刺激24h贴壁，然后吸除培养基，PBS洗涤2次，加入新鲜培养基静息24h，此时THP-1细胞诱导为M0细胞。
（2）Western blot实验
诱导为M0的细胞吸除旧培养基，加入含铜绿假单胞菌注射液（0个/mL，108个/mL）的新鲜培养基，用LPS（100ng/mL）作为阳性对照，继续培养48h。吸除培养上清液，用PBS洗涤2次，吸除上清液。用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白。用10% SDS-PAGE电泳分离总蛋白，然后转至NC膜，5%脱脂牛奶封闭1小时。5%BSA稀释1000倍的NF-κBp65(D14E12)XP rabbit mAb (CST)，phospho-NF-κB p65(Ser536) (93H1) rabbit mAb(CST)，β-Actin (D6A8) rabbit mAb一抗孵育过夜。5%BSA稀释2000倍的Anti-rabbit IgG，HRP-linked antibody(CST)二抗孵育1小时。HRP化学发光底物显影(absin)，AmershamImager 600曝光。
（3）流式细胞检测
诱导为M0的细胞吸除旧培养基，加入含铜绿假单胞菌注射液（0个/mL，106个/mL，107个/mL，108个/mL）的新鲜培养基，用LPS（20ng/mL）+IFN-γ（20ng/mL）作为阳性对照，继续培养48h。
为了测定TNF-α的表达，各组细胞先用蛋白质转运抑制剂Brefeldin A（5μg/mL）处理4h。然后用胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤2次后离心去上清。PE-CyTM7 mouse anti-human CD14(BD)，FITC anti-human CD86 antibody(BioLegend)，APC anti-human CD206(MMR) antibody(BioLegend)用PBS稀释200倍混合，取100μL混合液加入细胞沉淀中混匀后4℃避光孵育30min，离心去上清，加入1%PFA固定1h后离心去上清，PE/DazzleTM594 anti-human TNF-α antibody(BioLegend)用破膜液稀释200倍，加入细胞沉淀混匀后4℃避光孵育30min。用BECKMAN COULTER CytoFLEXTM Flow Cytometer检测，FlowJo10.6分析数据。
（4）条件培养基的制备
THP-1细胞（1×106个/mL）接种于10cm培养皿，并用PMA（150nM）刺激24h使细胞贴壁，然后吸除培养基，用PBS洗涤2次，加入新鲜培养基静息24h，然后加入含有不同浓度的铜绿假单胞菌注射液（0个/mL，106个/mL，107个/mL，108个/mL）的新鲜培养基，用含有LPS(20ng/mL)+IFN-γ(20ng/mL)的新鲜培养基作为阳性对照，继续培养48h。
收集培养上清液，300g离心10min，弃掉沉淀，2500g离心10min。转移上清液至新的离心管，然后用0.2μm的过滤器（PALL，4652）过滤上清液。并将其转移到超滤浓缩离心管（Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter，100KD，Merck）中，5000g离心10min，最终获得约200μL浓缩液，于-80℃保存备用。
（5）MTT实验
H1975细胞（3000个/孔）接种于96孔板，过夜贴壁后，吸除原培养基，加入100μL经超滤浓缩的条件培养基，继续培养72h。然后加入10μL MTT溶液（5mg/mL），于培养箱孵育4h，吸除上清液，加入100μL DMSO，振荡10min使结晶完全溶解，使用Tecan microplate reader(Tecan US, Inc., Morrisville, NC, USA)于490nm检测吸亮度值。细胞活力采用OD(给药组细胞)/OD(未处理组细胞)×100%计算。
所有实验数据均以三个个体的平均值±标准差（SD）表示。通过Graph Pad Prism6.0进行统计分析软件。单向方差分析（ANOVA）用于分析组之间的差异（两个以上）和Dunnett检验被选择为比较不同的群体。学生t检验用于比较两组。差异被认为具有统计学意义*表示 P<0.05； **表示P<0.01； *** 表示P<0.001。
体外实验结果及分析：
1、铜绿假单胞菌注射液诱导THP-1来源巨噬细胞向M1型极化
为了确定铜绿假单胞菌注射液是否促进THP-1来源的巨噬细胞极化，在PMA（150nM）诱导THP-1细胞分化为M0细胞以后，用铜绿假单胞菌注射液与THP-1细胞来源的M0细胞共培养。如图1所示，与对照组（图1中的A）比较，铜绿假单胞菌注射液共培养组（图1中的B）以及LPS+IFN-γ共培养组（图1中的C）中，细胞的贴壁性更佳，有明显的细胞伪足生成（箭头所示）。用流式细胞仪检测M1型巨噬细胞标志CD86以及TNF-α表达，结果（图2）显示，经PMA诱导后CD14+ THP-1来源的巨噬细胞与不同浓度铜绿假单胞菌注射液或LPS+IFN-γ共培养后，M1型巨噬细胞标志CD86以及细胞因子TNF-α的表达较未给药组（PA-MSHA 0）呈浓度依赖性增高。
2、铜绿假单胞菌注射液增强THP-1来源巨噬细胞磷酸化NF-κB的表达
为进一步探究铜绿假单胞菌注射液促进THP-1来源巨噬细胞向经典活化（M1型）巨噬细胞极化所激活的信号通路，将铜绿假单胞菌注射液与THP-1来源的M0巨噬细胞共培养48h，提取总蛋白后，进行western-blot实验。结果显示（图3），与未共培养组比较，铜绿假单胞菌注射液（108）共培养组与阳性对照LPS组（100ng/mL）均明显增强p-NF-κB的表达。
3、THP-1细胞源性巨噬细胞来源的条件培养基对H1975细胞增殖活力的影响
为明确铜绿假单胞菌注射液促进THP-1来源的巨噬细胞极化后巨噬细胞对肿瘤细胞增殖的影响，用铜绿假单胞菌注射液与THP-1来源的巨噬细胞共培养后，收集培养上清液制备成条件培养基，用此条件培养基培养H1975细胞。MTT检测结果（图4）显示，与非条件培养基培养组比较，铜绿假单胞菌注射液共培养所制备的巨噬细胞条件培养基对H1975细胞的增殖活力呈浓度依赖性抑制。
实施例2PD-1抗体和铜绿假单胞菌注射液的联合制药用途
本实施例为联合制药用途的体内实验，按以下步骤进行：
1、LUC-LLC细胞用DMEM培养基（10% FBS，1% PS）培养于37℃，5% CO2培养箱。所有动物研究获得澳门科技大学动物伦理委员会批准，在C57（6-8周）后右侧注射1×106个/mLLUC-LLC细胞和去生长因子基质胶的混合物，等肿瘤生长至100 mm3左右，小鼠随机分为四组：空白组（200μLPBS），PD-1抗体(InVivoMAb anti-mouse PD-1，250μg/只，200μL/只，三天一次)，低剂量铜绿假单胞菌注射液(4×108个/mL, 200μL/只，三天一次)，低剂量联合用药（PD-1和低剂量铜绿假单胞菌注射液三天一次，两药之间隔天给药），高剂量铜绿假单胞菌注射液（1.8×109个/mL，200μL/只，三天一次），高剂量联合用药（PD-1和高剂量铜绿假单胞菌注射液三天一次，两药之间隔天给药）。小鼠治疗21天，肿瘤大小及体重每三天测量一次。肿瘤大小计算公式为：体积=（长×宽2）/2，所有的小鼠都饲养在适当的光照、温度、湿度，最后通过小鼠眼球取血，分离肿瘤、脾。
2、流式细胞仪
制备单细胞悬液，细胞用FC阻断剂孵育15分钟，在4℃孵育以下抗体：活染APC-H7AVI，PerCP anti-mouse CD45，PerCP anti-mouse，PE-Cy7 anti-mouse CD45，APC anti-mouse CD3，PE-CF594 anti-mouse CD4，PE-CY7 anti-mouse CD8，PE-CF594 anti-mouseTNFα，PE-CF594 anti-mouse IFN-γ，FITC anti-mouse CD86，PerCP anti-mouse CD11B，PE-CF594 anti-mouse MHC-‖，PE-Cy5 anti-mouse F4/80，PE anti-mouse CD11C。
3、活体小鼠肿瘤成像
用Bruker in-vivo Xtreme imaging System(BMSE-033)检测肿瘤大小。在LUC-LLC C57小鼠（n = 4）的腹腔注射Luciferin150μL，五分钟后，腹腔注射1%戊巴比妥钠100μL，待麻醉后，进行成像检测。获得荧光信号以评估肿瘤大小。
所有实验数据均以三个个体的平均值±标准差（SD）表示。通过Graph Pad Prism6.0进行统计分析软件。单向方差分析（ANOVA）用于分析组之间的差异（两个以上）和Dunnett检验被选择为比较不同的群体。学生t检验用于比较两组。差异被认为具有统计学意义*, P<0.05; **, P<0.01; *** , P<0.001。
体内实验结果及分析：
1、PD-1抗体和铜绿假单胞菌注射液组合疗法抑制肿瘤
为了检验联合用药可降低肿瘤大小，使用不同剂量的铜绿假单胞菌注射液和PD-1抗体单用或联合对小鼠进行治疗，我们发现联合用药能有效的抑制肿瘤大小。有趣的是，我们注意到联合用药低剂量与高剂量肿瘤大小差异无统计学意义(图5中的A)，联合用药的体重与对照无差异（图5中的B），接着我们选用低剂量来进行活体肿瘤小鼠成像及取材后肿瘤拍照及称重，取材后发现联合用药能有效抑制小鼠肿瘤(图5中的C-D)，联合用药肿瘤荧光信号较其他组别弱（图5中的E）。
2、联合用药提高肿瘤浸润的免疫细胞
为了检测联合用药的潜在机制，我们在高剂量组和低剂量组都分别检测了肿瘤浸润性免疫细胞。已有文献报道巨噬细胞可以通过抗原呈递细胞来激活T细胞，MHC‖的表达与T细胞相互作用。我们数据显示PA-MSHA铜绿假单胞菌注射液增加了巨噬细胞中MHC‖，值得注意的是，联合用药后MHC‖比单一用药明显增多（图6中的B）。接著，我们检测肿瘤浸润性免疫细胞，联合用药组CD4+ T细胞TNF-α的表达相对单一用药组显著增高(图6中的A)。且联合用药中高剂量组和低剂量组之间没有统计学意义。总而言之，这些结果暗示了，联合用药低剂量组在肿瘤治疗中更有优势且都能提高肿瘤浸润的免疫细胞。
3、联合用药提高血及脾的免疫细胞
为了进一步证实联合用药能够提高CD4+T细胞TNF-α的表达，我们检测了低剂量组血细胞及脾细胞。我们发现在小鼠血液中，不仅提高了CD4+T细胞TNF-α的表达（图6中的C），CD8+ T细胞TNF-α的表达和IFN-γ的表达也提高了(图6中的D-E)。在小鼠脾脏中，检测到和血液一样的结果，此外，流式细胞仪检测到脾CD8+T细胞联合用药后有所提高（图6中的F-H）。
根据实施例1和实施例2的记载：体外实验表明，铜绿假单胞菌注射液具有诱导巨噬细胞向经典活化（M1型）巨噬细胞极化，促进细胞分泌杀肿瘤细胞因子的潜能，而诱导的M1型巨噬细胞对H1975细胞的增殖具有浓度依赖性抑制作用。体内实验也证实了铜绿假单胞菌注射液能有效的抑制肿瘤生长，PD-1抗体和铜绿假单胞菌注射液联合治疗提高小鼠T细胞的活化。
铜绿假单胞菌注射液共培养组的细胞贴壁性能更佳，生长出伪足（图1），而进一步的流式分析显示（图2），标志M1型巨噬细胞的标志物CD86在给药组增加，尤其是高剂量组最为明显。由此表明，铜绿假单胞菌注射液有诱导巨噬细胞向经典活化（M1型）巨噬细胞分化的潜能。
在本研究中，流式分析的结果显示（图2），铜绿假单胞菌注射液共培养组的细胞表达TNF-α也明显增高，进一步暗示细胞对肿瘤抑制作用的潜能。Western-blot的结果显示（图3），铜绿假单胞菌注射液共培养组p-NF-κB的水平明显增高，表明细胞炎性通路的激活，与代表着促炎性表型的M1型巨噬的极化一致，但仍需进一步检测相关炎性细胞因子（如IL-6）的表达情况，以验证受铜绿假单胞菌注射液诱导的巨噬细胞极化表型抑制肿瘤增殖的潜能。
在用铜绿假单胞菌注射液与THP-1来源的巨噬细胞共培养48小时后，我们收集细胞培养上清液，经过超滤浓缩离心，制备成条件培养基，以期观察铜绿假单胞菌注射液诱导THP-1细胞来源的巨噬细胞所产生的分泌因子，对肿瘤细胞增殖的影响。MTT实验结果显示（图4），用条件培养基与H1975细胞进行共培养以后，铜绿假单胞菌注射液处理组的条件培养基对H1975的增殖活力呈浓度依赖性抑制。进一步证实了铜绿假单胞菌注射液所诱导的THP-1细胞来源的巨噬细胞所产生的分泌因子对H1975的抑制作用。
在体内，我们发现无论在小鼠活体成像还是实际测量肿瘤大小，都显示出联合用药对肿瘤的抑制作用。由于高浓度和低浓度的联合用药对小鼠肿瘤大小并无剂量依赖性，以及流式检测两者之间肿瘤浸润淋巴细胞并无统计学意义，故选用4×108个/mL铜绿假单胞菌注射液作为后续检测体内功能研究的浓度。PD-1抗体和铜绿假单胞菌注射液单一用药并没有显示出显著的抗肿瘤作用，而联合给药（PD-1抗体和铜绿假单胞菌注射液）能有效抑制肿瘤大小，并提高小鼠的CD4+T细胞TNF-α的表达，以及巨噬细胞中MHC-Ⅱ的水平。
Claims (17)
1.PD-1抗体和铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株在制备治疗肺癌药物组合物中的应用，其特征在于，PD-1抗体和铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株共同作用于肿瘤；所述的PD-1抗体为抗体本身或其功能片段；所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株为铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株注射液，所述的PD-1抗体为PD-1抗体注射液。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的应用量为1×109-1×1011个/kg体重。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的应用量为4×109-1.8×1010个/kg体重。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的应用量为4×109个/kg或1.8×1010个/kg体重。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PD-1抗体的应用量为10-15mg/kg体重。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的PD-1抗体的应用量为12-13mg/kg体重。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的PD-1抗体的应用量为12.5mg/kg体重。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的应用量为1×109-1×1011个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为10-15mg/kg体重。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的应用量为4×109-1.8×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为12-13mg/kg体重。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的应用量为4×109个/kg或1.8×1010个/kg体重；所述的PD-1抗体的应用量为12.5mg/kg体重。
11.一种治疗肺癌药物组合物，其特征在于，所述的治疗肺癌药物组合物中包括PD-1抗体和铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株。
12.根据权利要求11所述的治疗肺癌药物组合物，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的含量为1×108-1×1010个/mL。
13.根据权利要求12所述的治疗肺癌药物组合物，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的含量为4×108-1.8×109个/mL。
14.根据权利要求13所述的治疗肺癌药物组合物，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株的含量为4×108个/mL或1.8×109个/mL。
15.根据权利要求11所述的治疗肺癌药物组合物，其特征在于，所述的PD-1抗体的含量为1-2g/L。
16.根据权利要求15所述的治疗肺癌药物组合物，其特征在于，所述的PD-1抗体的含量为1-1.5g/L。
17.根据权利要求16所述的治疗肺癌药物组合物，其特征在于，所述的PD-1抗体的含量为1.25g/L。
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