JP7357347B2 - 細胞外のPKCδを標的とする肝癌細胞増殖抑制剤及びそれを含む新規肝癌治療薬 - Google Patents
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Description
肝癌の分子標的薬としてはソラフェニブが知られているが、肝癌診療に関するガイドラインによると(非特許文献2)、この分子標的薬の適用を推奨する1つの指標としては、例えば腫瘍数4個以上である場合等が挙げられる。しかしながら、上記ガイドラインに従って分子標的薬を投与した場合であっても、分子標的薬による治療効果は不十分であることが多く、治療成績を向上させる治療薬の開発は喫緊の課題であった。
することを見出し、細胞外に局在するPKCδを高精度な肝癌診断のためのマーカーとして使用できることを見出した(特願2018-095674)。
[1]抗PKCδ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、肝癌細胞増殖抑制剤。
[2]前記抗体が、細胞外におけるPKCδの作用を中和する抗体である、[1]に記載の肝癌細胞増殖抑制剤。
[3]前記抗体が、配列番号1のアミノ酸番号114~289で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープを認識する抗体である、[1]又は[2]に記載の肝癌細胞増殖抑制剤。
[4]前記抗体が、配列番号1のアミノ酸番号114~289で表されるアミノ酸配列との配列同一性が95%以上であるアミノ酸配列に含まれるエピトープを認識する抗体である、[3]に記載の肝癌細胞増殖抑制剤。
[5]前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、[1]~[4]の何れかに記載の肝癌細胞増殖抑制剤。
[6]前記抗原結合フラグメントが、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFab、scFv、ジアボディ、トリアボディ又はミニボディである、[1]~[5]の何れかに記載の肝癌細胞増殖抑制剤。
[7][1]~[6]の何れかに記載の肝癌細胞増殖抑制剤を有効成分として含む、肝癌治療薬。
抗体が有する上記のような作用や活性を増強させるために、または抗体に別の作用や活性を付与するために、必要に応じて、抗体上の任意の位置に任意の化合物を結合させてもよい。その化合物は、薬剤であってもよい。
ここで、PKCδタンパク質の作用とは、例えばPKCδタンパク質の肝癌細胞に対する作用であり、PKCδタンパク質が肝癌細胞表面の糖鎖や受容体などのタンパク質に作用することにより、細胞増殖に関わるシグナル伝達物質を活性化させ、肝癌細胞の細胞増殖を亢進すること等をいう。
さらにヒトの治療に用いるためには、抗原性の低くする観点から、抗PKCδ抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体であることが好ましい。
抗体を作成する方法は、例えば、モノクローナル抗体の場合、PKCδを抗原としてマウス等の動物に免疫を行い、PKCδ抗原タンパク質に対する抗体を産生する細胞を回収し、回収した細胞を同種又は異種の骨髄腫細胞と融合させ、抗PKCδモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することによって、そのハイブリドーマ細胞の培養上清中から得ることが出来る。
さらに、上記のハイブリドーマ細胞をさらに改変させることによって、キメラ抗体又はヒト化抗体を得ることが出来る。具体的には、例えば、上記のハイブリドーマ細胞から抽出した遺伝子において、当業者に公知の方法である遺伝子組換え技術によって、この遺伝子中のFc領域をコードする部分を、ヒトのFc領域をコードする遺伝子で置き換える等の操作をすることによって、目的の抗体を得ることができる。
また、抗PKCδ抗体の完全ヒト抗体は、当業者に公知の方法であるファージディスプレイ法を用いることによっても作製することができる。
肝癌治療薬の投与量は、有効成分である肝癌細胞増殖抑制剤が、肝癌細胞の増殖を抑制させ、肝癌治療効果を発揮する量であればよい。投与量は、投与対象の年齢、性別、体重、症状、治療効果、治療部位の面積、投与方法等に応じて適宜調節することが出来るが、例えば、約60kgの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、1日当たり0.01mg~5000mg程度が好ましく、0.1mg~500mg程度がより好ましい。1日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
Not ebook」(J.E. Cellis編、1998年)Academic出版;「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubel ら編、1987年);「Short Protocols in Molecular Biology」(Wiley、Sons著、1999年);「Introduction to Cell and Tissue Culture」(J.P. Mather、P.E.Roberts著、1998年)Plenum出版;「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編、1987年;「C
ell and Tissue Culture:Laboratory Procedures」(A.Doyle、J.B.Griffiths、D.G.Newell編、1993年‐1998年)J.Wiley and sons;「Handbook of Experimental Immunology」(F.M.Ausubelら編、1987年);「Current Protocols in Immunology」(J.E.Coliganら編、1991年);「Methods in Enzymology」(Academic Press)などの文献で十分に説明されている。
細胞培養
肝癌細胞株(HepG2およびHep3B)および胃癌細胞株AGSをDMEMまたはRPMI1640培地(ナカライ(Nacalai))に、10%ウシ胎仔血清(FBS)(Gibco BRL)、ペニシリン(100units/ml)、およびストレプトマイシン(100μg/ml)(ナカライ(Nacalai))を含む条件で培養した。全ての細胞株は、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所の細胞バンク(JCRB)から入手し、加湿された5%CO2、37℃の条件下で生育した。
全細胞溶解液の調製は他に記載されているように行った(非特許文献1)。タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS‐PAGE)で展開し、ニトロセルロース膜に転写した。その後、対応する抗体で特異的抗原を反応させ、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合の二次IgG(サンタクルズ(Santacruz))と反応させた。洗浄後のニトロセルロース膜を増強化学発光法(ECL法)により可視化した。
2×103個のHepG2細胞を超低接着表面6ウェルプレート(コーニング(corning))に播種した。培地は、DMEM‐Ham’s F‐12(ナカライ(Nacalai))に、EGF(組換えヒト上皮細胞増殖因子)、FGF(組換えヒト線維芽細胞増殖因子)、組換えヒトインスリン、およびB27無血清サプリメント(サーモ(Thermo))を添加したものを用いた。スフェロイド形成は、5日後に位相差顕微鏡を用いて確認した。
総体積100μl(1ウェルあたり3×103個の細胞)の培養液中で、細胞をマウス抗PKCδモノクローナル抗体(1μg/ml)(BD、クローン14)もしくはアイソタイプマウスコントロールIgG(1μg/ml)(サンタクルズ(Santacruz))の存在下で生育させた。48時間後、MTS試薬(プロメガ(Promega))を各ウェルに加え、30分間インキュベーションし、生体還元により生じる水溶性ホルマザン染料をマイクロプレートリーダーで測定した。全てのサンプルを4つの重複する系で試験し、一回の測定値は、4つの重複するウェルの平均値とした。
プロテインキナーゼCデルタ(PKCδ)は約78キロダルトンの細胞内シグナル伝達キナーゼとして周知されているが、細胞外での機能は知られていない。また細胞外で検出される細胞内タンパク質のいくつかは、細胞膜に局在することも知られている(非特許文献1および特許文献1)。本発明者らは肝癌細胞株を用いて、肝癌細胞株の培養上清中にPKCδのリコンビナントタンパク質を添加し、細胞外に局在するPKCδリコンビナントタンパク質による肝癌細胞株の細胞増殖への影響を調べた。その結果、PKCδのリコンビナントタンパク質処理細胞で細胞増殖の有意な亢進が観測された(図1)。さらに、
細胞外に局在するPKCδが細胞内シグナル伝達系に与える影響を調べるため、リン酸化プロテインアレイを施行したところ、PKCδのリコンビナントタンパク質処理細胞においてSTAT3やERK1/2のリン酸化が亢進していることが分かった(データ示さず)。この結果を検証するため、PKCδのリコンビナントタンパク質処理後の経時的なリン酸化状態をウェスタンブロット法で検証したところ、処理後5分から10分にかけてSTAT3やERK1/2のリン酸化の増強が確認された(図2)。特にERK1/2は細胞増殖に直接関わる細胞内シグナル因子であることから、細胞外に局在するPKCδが肝癌細胞の細胞増殖に寄与していることが示唆された。
細胞外に局在するPKCδが肝癌細胞の増殖に関与するかを調べるため、アイソタイプマウスコントロールIgGおよびマウス抗PKCδモノクローナル抗体(BD、クローン14)を用いた細胞増殖アッセイを施行した。その結果、細胞外へのPKCδの放出が多い肝癌細胞株(HepG2、Hep3B)において有意な細胞増殖抑制効果を確認できた(図3)。その一方で、細胞外へのPKCδの放出がほとんどない胃癌細胞株AGSでは、抗PKCδモノクローナル抗体処理による有意な細胞増殖抑制効果は見られなかった。次に、ウェスタンブロット法によって、細胞増殖シグナル因子の活性化を調べたところ、マウス抗PKCδモノクローナル抗体(BD、クローン14)処理HepG2細胞においてERK1/2のリン酸化の減少が観測された(図4)。このことから、細胞外に局在するPKCδが肝癌細胞の増殖機構に寄与しており、抗体等で細胞外に局在するPKCδをターゲットにすることで、肝癌治療に利用できることが示された。
細胞外に局在するPKCδが肝癌細胞の腫瘍形成能に関与するかを調べるために、HepG2細胞を用いてスフェロイド形成実験を行った。アイソタイプマウスコントロールIgG処理群と比べて、マウス抗PKCδモノクローナル抗体処理群の方が、形成されるスフェロイドの大きさが小さいことより、スフェロイド形成能が減弱する傾向があることが確認できた(図5)。また細胞増殖アッセイを行ったところ、アイソタイプマウスコントロールIgG処理群と比べて、マウス抗PKCδモノクローナル抗体処理群で有意な細胞増殖率の減少が確認された(図6)。このことから、細胞外に局在するPKCδが腫瘍形成能に直接的に関与している可能性が示唆された。
Claims (5)
- 抗PKCδ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む肝癌細胞増殖抑制剤を有効成分として含む、肝癌治療薬であって、
前記肝癌が、細胞外にPKCδを放出する肝癌であり、
前記抗体が、細胞外におけるPKCδの作用を中和する抗体である、肝癌治療薬。 - 前記抗体が、配列番号1のアミノ酸番号114~289で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープを認識する抗体である、請求項1に記載の肝癌治療薬。
- 前記抗体が、配列番号1のアミノ酸番号114~289で表されるアミノ酸配列との配列同一性が95%以上であるアミノ酸配列に含まれるエピトープを認識する抗体である、請求項2に記載の肝癌治療薬。
- 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項1~3の何れか一項に記載の肝癌治療薬。
- 前記抗原結合フラグメントが、Fab、Fab’、F(ab’) 2 、scFab、scFv、ジアボディ、トリアボディ又はミニボディである、請求項1~4の何れか一項に記載の肝癌治療薬。
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