CN111803484A

CN111803484A - 奥替溴铵在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN111803484A
Application number: CN202010923255.0A
Authority: CN
Inventors: 刘康栋; 包卓; 董子钢; 赵继敏; 江亚南
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN111803484B

Abstract

本发明公开奥替溴铵在制备抗肿瘤药物中的应用，奥替溴铵（Otilonium Bromide），化学名称：N,N‑二乙基‑N‑甲基‑2‑[[4[[2‑(辛基)苯甲酰]氨基]苯甲酰]氧基]乙烷铵溴化物，CAS号为26095‑59‑0，分子式为C₂₉H₄₃BrN₂O₄，分子量为563.56。所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。本申请通过实验证实奥替溴铵用于食管鳞状细胞癌细胞（KYSE150细胞、KYSE450细胞）或胃癌细胞（HGC27细胞、AGS细胞）时，能够起到抑制食管鳞状细胞癌细胞或胃癌细胞生长和转化的作用，且奥替溴铵能够抑制食管鳞状细胞癌细胞或胃癌细胞增殖和转化的适宜浓度为2.5μM~20μM。

Description

奥替溴铵在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗和预防技术领域，具体涉及奥替溴铵在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症严重威胁人类健康。近年来癌症的发病率持续上升，成为仅次于心脑血管疾病的第二大致死性疾病。癌症治疗是当前世界难以攻克的疑难杂症之一，不但难以完全治愈，而且病人的生存期的提高也存在很多困难。

癌症已成为中国首位死亡原因，是严重的公共卫生问题。据统计结果显示，中国食管癌和胃癌是最常见的癌症类型，也是最多见的癌症死亡原因。

在全球范围内，食管癌的发病率在恶性肿瘤中居第八位，死亡率为第六位，每年新增病例约为456000例，食管癌具有一定的种族及地域性特点，东亚、东非及南非、欧洲南部发病率较高，其中近70%的食管癌发生在中国。食管癌在中国导致癌症死亡最常见的肿瘤中，位居第六位，预后非常差，五年生存率仅为15-20%。食管鳞状细胞癌（esophagealsquamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）是食管癌的两个主要组织学类型。ESCC是发展中国家最常见的亚型，但在美国和其他西方国家食管癌主要是EAC。食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也不能咽下。

胃癌（gastric carcinoma）是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是世界上一种重要的癌症，2018年新发病例超过100万例，估计有78.3万例死亡。在中国癌症中，胃癌的发病率位于第二位，死亡率位于第三位。胃癌发病有明显的地域性差别，在中国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。

近年来，尽管食管癌和胃癌的早期诊断、早期发现技术有了很大进步，标准的化疗和放疗已在临床上应用了几十年，但大多数临床中晚期病人的整体生存率仍无明显改善，提示了仅强调肿瘤早期发现和治疗而忽视肿瘤预防，结果收效甚微。

虽然应对癌症的治疗方案在迅速发展，但是药物毒副作用和耐药性引起的术后复发给治疗带来巨大的挑战。因此新的更安全有效的治疗选择是非常迫切需要的。随着“老药新用”概念的提出( Liu Q .Editorial:Old Drugs Learn New Tricks:Advances andApplications for Drug Repurposing .Curr Top Med Chem 2016；16:3627-3628 .)，越来越多医生和科学家认为若能在基础和临床得到验证，即可探究已被普及应用的临床非抗肿瘤药物开发为新的抗癌药物。这既可以节约新药的开发成本和时间，也在药物的物化、药代和安全性得到一定的保证。

奥替溴铵是一种抗毒蕈碱，可作为镇痛、抗炎、抑制子宫收缩剂。奥替溴铵对于消化道平滑肌具有选择性和强烈的解痉挛作用，因此适用于所有的运动功能亢进，不同原因和不同部位以及由于平滑肌纤维病理性萎缩引起的痉挛反应。该药可用于胃肠道痉挛和运动功能障碍(肠易激综合征，胃炎，胃十二指肠炎，肠炎，食管病变)。然而，该药在抑制食管癌和胃癌等消化道肿瘤增殖生长的作用方面目前无报道，也无相关的专利申请。

发明内容

本发明的目的在于提供奥替溴铵在医药技术领域中的新用途，即奥替溴铵在制备抗肿瘤药物中的应用。尤其是其用作食管癌和胃癌治疗和预防药物在临床治疗中的应用。

基于上述目的，本发明采取如下述技术方案：

奥替溴铵在制备抗肿瘤药物方面的应用。奥替溴铵（Otilonium Bromide），化学名称：N,N-二乙基-N-甲基-2-[[4[[2-(辛基)苯甲酰]氨基]苯甲酰]氧基]乙烷铵溴化物，CAS号为26095-59-0，分子式为C₂₉H₄₃BrN₂O₄，分子量为563.56，结构式为：

。所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。

所述的抗肿瘤药物制成药用剂型，所述剂型包括糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、散剂、酒剂、配剂、滴剂、注射液、粉针剂、乳膏剂、缓释剂、靶向剂等，用作预防、治疗和预防复发的癌症药物。

所述抗肿瘤药物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。

所述“抗肿瘤药物”可应用于预防肿瘤发生、治疗肿瘤、预防肿瘤复发。

具体的，奥替溴铵在治疗和预防食管癌或胃癌药物方面的应用，通过细胞毒性实验、细胞增殖实验和软琼脂克隆形成实验，使用食管癌细胞系KYSE150、KYSE450和胃癌细胞系HGC27、AGS，将临床非抗癌应用药物奥替溴铵处理细胞，发现了奥替溴铵在25 μM时对食管鳞状细胞KYSE150细胞和KYSE450以及胃癌细胞系HGC27、AGS细胞有毒性作用，奥替溴铵在浓度为2.5-20 μM时具有抑制食管癌细胞株增殖及克隆形成能力的功能，在浓度为2.5-20 μM时具有抑制胃癌细胞株增殖及克隆形成能力的功能。

进一步的，本发明利用食管癌PDX ( patientderivedxenograft )模型，即利用癌症患者的癌组织在免疫缺陷小鼠身上建立的依靠小鼠提供的微环境进行生长的皮下移植瘤模型，显示出显著的抗肿瘤生长效果，能够起到食管癌复发预防的效果。本发明中，奥替溴铵在SCID小鼠的体内肿瘤治疗浓度为5g/kg-20mg/kg，对小鼠的体重无明显影响，为其可接受的安全药物浓度，且在该浓度范围内能抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。

本发明的有益效果在于：本发明首次公开了奥替溴铵可以用于治疗和预防食管癌和胃癌及其它肿瘤，抑制食管癌和胃癌细胞生长、增殖，抑制体外克隆形成，并且对食管癌人源化移植瘤模型(PDX)预防有显著效果。本发明的实施拓宽了奥替溴铵的医药用途，对人类食管癌和胃癌及其它肿瘤的治疗提供新的思路，对肿瘤的治疗、预防和复发具有重要意义。

附图说明

图1是奥替溴铵对食管癌细胞的作用结果图；A是奥替溴铵对食管癌细胞KYSE150、KYSE450毒性的实验结果图；B是奥替溴铵对食管癌细胞KYSE150、KYSE450增殖活性影响分析图；

图2是奥替溴铵对食管癌细胞KYSE150、KYSE450体外克隆形成能力影响的结果图；

图3是奥替溴铵对胃癌细胞的作用结果图；A是奥替溴铵对胃癌细胞HGC27、AGS毒性的实验结果图；B是奥替溴铵对胃癌细胞HGC27、AGS的增殖活性影响分析图；

图4是奥替溴铵在食管癌编号EG20小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果，A是食管鳞癌患者肿瘤组织的PDX小鼠模型经奥替溴铵处理，给药期间小鼠体重变化趋势图；B是食管鳞癌患者肿瘤组织的PDX小鼠模型经奥替溴铵处理，给药期间小鼠肿瘤体积变化趋势图；C是食管鳞癌患者肿瘤组织的PDX小鼠模型经奥替溴铵处理，小鼠处死后称量出肿瘤的重量统计结果；

D是食管鳞癌患者肿瘤组织的PDX小鼠模型经奥替溴铵处理，小鼠处死后对照组与给药组的肿瘤图片；

图1至4中，*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为商业购买。

材料与方法

材料

食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450以及胃癌细胞HGC27、AGS来自郑州大学基础医学院病理生理学教研室

细胞株：KYSE150 细胞株，细胞株采用含10%FBS的1640培养基，37℃恒温、5% CO₂条件下培养、备用。

KYSE450细胞株，细胞株采用含10%FBS的DMEM培养基，37℃恒温、5% CO₂条件下培养、备用。

HGC27细胞株，细胞株采用含10%FBS的1640培养基，37℃恒温、5% CO₂条件下培养、备用。

AGS细胞株，细胞株采用含10%FBS的F12K培养基，37℃恒温、5% CO₂条件下培养、备用。

肿瘤组织

本发明使用了1例人食管癌组织标本，编号为EG20 (来自河南省肿瘤医院，患者，男，46岁，住院号2042083，T2N0M0Ⅱ，中分化）。

实验动物

本实施例中SCID CB-17小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号为：SCXK(京)2012—0001。SPF级，SCID小鼠为6—8周龄，体重16g—18g，雌鼠。小鼠饲料购于北京科澳协力饲料有限公司。许可证号为SCXK(京)2014—0010。

试剂

RPMI-1640培养基、DMEM培养基500ml一瓶（Biological Industries）；F12K（Gibco）；FBS（Biological Industries）；Trypsin-EDTA胰酶消化液（上海碧云天生物技术有限公司）；PBS（北京索莱宝科技有限公司）；细胞培养皿；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）：称量戊巴比妥钠溶解于无菌蒸馏水中过滤；双抗：青霉素和链霉素购自华北制药股份有限公司，两者浓度均为500U/ml；生理盐水500ml/瓶（辰欣药业股份有限公司）；奥替溴铵：体外实验用药购于MCE公司，体内实验用药购于德国柏林化学股份公司。

仪器与器材

海尔医用保温冰箱；电子天平；Thermo超净工作台；电子天平；细胞培养箱，眼科剪，手术镊，无菌培养皿，手术刀，溶药针，注射器。

实施例1 奥替溴铵抑制食管癌细胞增殖的体外实验

细胞毒性实验

实验过程为：KYSE150细胞以8×10³个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/1640，37℃，5% CO₂），KYSE450细胞以1.2×10⁴个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/DMEM，37℃，5% CO₂），14-16小时后，更换新鲜培养基并加入奥替溴铵（DMSO配制成溶液），使奥替溴铵在培养基中的终浓度为0 μM、3.125 μM 、6.25 μM、 12.5μM、25 μM、50 μM、75 μM、100 μM，分别培养24和48小时后，将细胞从培养箱中拿出，倒掉原有培养基，1×PBS清洗两遍。然后弃去PBS，加入4%多聚甲醛100μL/孔，固定30分钟，弃去多聚甲醛，1×PBS清洗两遍。然后弃去PBS，用DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）染色，100μL/孔，37℃孵育20分钟后，统计各个孔的细胞数。

实验结果如图1A所示。从图1A中可以看出，当奥替溴铵浓度为25μM时，细胞存活率为48％（KYSE150，48 h）、78％（KYSE450，48 h），表现出一定的细胞毒性，筛选出安全的药物浓度，浓度确定为0 μM、2.5 μM 、5 μM、10 μM、20 μM，进行进一步的增殖实验。

细胞增殖实验

实验过程为：KYSE150细胞以3×10³个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/1640，37℃，5% CO₂），KYSE450细胞以5×10³个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/DMEM，37℃，5%CO₂），14-16小时后，更换新鲜培养基并加入奥替溴铵（DMSO配制成溶液），使奥替溴铵在培养基中的终浓度为0 μM、2.5 μM 、5 μM、10 μM、20 μM，分别在培养0、24、48、72和 96小时后，将细胞从培养箱中拿出，倒掉原有培养基，1×PBS清洗两遍。然后弃去PBS，加入4%多聚甲醛100μL/孔，固定30分钟，弃去多聚甲醛，1×PBS清洗两遍。然后弃去PBS，用DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）染色，100μL/孔，37℃孵育20分钟后，统计各个孔的细胞数。

实验结果如图1B所示。从图1B中可以看出，奥替溴铵对食管癌细胞具有抑制作用，并且呈现具有时间和剂量依赖性。奥替溴铵浓度为10μM、20μM时，在培养72h、96h对于KYSE150细胞的增殖抑制效果显著，奥替溴铵浓度为10μM、20μM时，在培养72h、96h对于KYSE450细胞的增殖抑制效果显著。

实施例2 奥替溴铵抑制食管癌细胞克隆形成能力的体外实验

实验过程为：在6孔板上每孔铺入3 mL BME培养基（含10% FBS和 0.5%琼脂），待凝固后铺入混悬有食管癌细胞（KYSE150：8×10³个/孔或KYSE450：8×10³个/孔）的上层胶（上层胶中含有1 mL BME培养基，培养基中含 10% FBS 和0.33% 琼脂，培养基中的药物终浓度分别为0μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20μM），在培养箱（37℃，5% CO₂）培养7-14天后或根据细胞情况，待克隆形成，利用IN Cell Analyzer 3000进行克隆计数（图2为培养10天所得结果）。

实验结果如图2所示。从图2中可以看出，奥替溴铵处理后细胞克隆数目减少，细胞单菌落大小也明显变小，说明奥替溴铵能够抑制食管癌细胞体外克隆形成能力，奥替溴铵浓度为2.5μM、5μM、10μM、20μM时，对于KYSE150细胞的克隆形成具有抑制作用，奥替溴铵在5μM、10μM、20μM时，对于KYSE150细胞的克隆形成抑制作用显著，奥替溴铵浓度为10μM、20μM时，对于KYSE450细胞的克隆形成抑制作用显著。

实施例3 奥替溴铵抑制胃癌细胞增殖的体外实验

细胞毒性实验

实验过程为：HGC27细胞以6×10³个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/1640，37℃，5% CO₂），AGS细胞以8×10³个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/F12k，37℃，5%CO₂），14-16小时后，更换新鲜培养基并加入奥替溴铵（DMSO配制成溶液），使奥替溴铵在培养基中的终浓度为0 μM、3.125 μM 、6.25 μM、 12.5 μM、25 μM、50 μM、100 μM），分别培养24和48小时后，将细胞从培养箱中拿出，倒掉原有培养基，1×PBS清洗两遍。然后弃去PBS，加入4%多聚甲醛100μL/孔，固定30分钟，弃去多聚甲醛，1×PBS清洗两遍。然后弃去PBS，用DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）染色，100μL/孔，37℃孵育20分钟后，统计各个孔的细胞数。

实验结果如图3A所示。从图3A中可以看出，当奥替溴铵浓度为25μM时，细胞存活率为61％（HGC27，48 h），84%（AGS，48 h），表现出一定的细胞毒性，筛选出安全的药物浓度，浓度确定为0 μM、2.5 μM 、5 μM、10 μM、20 μM，进行进一步的增殖实验。

细胞增殖

实验过程为：HGC27细胞以3×10³个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/1640，37℃，5% CO₂），AGS细胞以3×10³个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/F12k，37℃，5%CO₂），14-16小时后，更换新鲜培养基并加入奥替溴铵（DMSO配制成溶液），使奥替溴铵在培养基中的终浓度为0 μM、2.5 μM 、5 μM、10 μM、20 μM），分别在培养0、24、48、72和 96小时后，将细胞从培养箱中拿出，倒掉原有培养基，1×PBS清洗两遍。然后弃去PBS，加入4%多聚甲醛100μL/孔，固定30分钟，弃去多聚甲醛，1×PBS清洗两遍。然后弃去PBS，用DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）染色，100μL/孔，37℃孵育20分钟后，统计各个孔的细胞数。

实验结果如图3B所示。从图3B中可以看出，胃癌细胞的增殖活性随着奥替溴铵浓度的增加而减弱，并且随着处理时间延长，这种影响更加显著。奥替溴铵浓度为5μM、10μM、20μM时，在培养72h后对于HGC27细胞的增殖抑制效果显著，奥替溴铵浓度为2.5μM 、5μM、10μM、20μM时，在培养96h对于HGC27细胞的增殖抑制效果显著，奥替溴铵浓度为5μM、10μM、20μM时，在培养72h、96h对于AGS细胞的增殖抑制效果显著，*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。

实施例4 人食管癌免疫缺陷鼠种植瘤模型的建立

将病人新鲜的肿瘤组织（编号为EG20，来自河南省肿瘤医院，患者，男，46岁，住院号2042083，T2N0M0Ⅱ，中分化）取出，将组织修剪成适当大小，进行组织接种前，用含有青霉素链霉素的PBS（PBS:双抗 50:1）冲洗后置于冰上，等待接种。选用6-8 周龄雌性SCID小鼠，麻醉后用溶药针扎开一个小口，用镊子撑开后将肿瘤组织放到小鼠皮下，等待小鼠麻醉苏醒后送回无菌饲养室。约3-5天后小鼠颈背部伤口愈合后，每隔固定时间测量一次小鼠肿瘤体积，待肿瘤体积达到1000 mm³时，处死小鼠并取出肿瘤组织。以同样的方式传代至新的SCID小鼠皮下（第2代）。当移植瘤被稳定传至3代后，则证明食管癌移植瘤模型成功建立。

实施例5奥替溴铵抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤生长

接种一周或者两周后，小鼠背部肿瘤结节长到200立方毫米左右时开始分组，即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，每组分10只以上。3组小鼠分别灌胃：生理盐水（对照组），5 mg/kg奥替溴铵（低剂量组），20 mg/kg奥替溴铵（高剂量组），奥替溴铵溶于生理盐水制成所需药物浓度。每周称重两次并测量一次瘤体积。当对照组小鼠肿瘤体积长到1000立方毫米左右，终止实验（约25天），取出肿瘤组织，称量肿瘤重量以及拍照。

实验结果如图4所示。从图4中可以看出，经奥替溴铵处理后，小鼠瘤组织的体积和重量均有明显降低，而小鼠体重无明显变化，即无毒副作用；与对照组相比，奥替溴铵在食管癌PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果显著，并对小鼠体重没有明显影响。奥替溴铵浓度为20mg/kg处理后可以显著抑制肿瘤生长。

Claims

1.奥替溴铵在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，奥替溴铵在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，奥替溴铵在浓度为2.5μM~20μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖及克隆形成的数量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，奥替溴铵在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，奥替溴铵在浓度为2.5μM~20μM时能够抑制胃癌细胞的增殖。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胃癌细胞为HGC27细胞和/或AGS细胞。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，奥替溴铵在制备抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，奥替溴铵在浓度5mg/kg—20mg/kg时能抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。