CN112138008A - 洛美他派在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种洛美他派在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物医药技术领域，本发明通过细胞增殖实验，首次验证了N‑(2,2,2‑三氟乙基)‑9‑(4‑[4‑[4’‑(三氟甲基)[1,1’‑联苯]‑2‑甲酰氨基]哌啶‑1‑基]丁基)‑9H‑芴‑9‑甲酰胺(洛美他派Lomitapide CAS号：182431‑12‑5分子式：C₃₉H₃₇F₆N₃O₂分子量：693.720)在食管癌细胞系(KYSE150,KYSE450)，胃癌(HGC27，AGS)细胞系中的抑制效果，可为临床研究预防和治疗肿瘤的药物提供新的思路和依据。

Description

洛美他派在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及洛美他派在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

全球范围内，每年约有140万上消化道恶性肿瘤（食管癌和胃癌）新发病例，死亡约112万人，仅次于肺癌。在上消化道恶性肿瘤新发病例中，74.36%发生在欠发达地区，44.60%发生在中国。食管癌在世界上是最常见的恶性肿瘤之一，在导致癌症死亡最常见的肿瘤中，位 居第六位，预后差，五年生存率仅为8~12%。食管鳞状细胞癌（esophageal squamouscell carcinoma，ESCC)和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC)是食管癌的两个主要组织学类型。ESCC是发展中国家最常见的亚型，但在美国和其他西方国家食管癌主要是EAC。 近年来，尽管食管癌早期筛查、早期诊断技术有了进步，标准的化疗和放疗己在临床上应用 了几十年，但大多数临床中晚期病人的生存率仍无明显改善，提示了仅强调肿瘤早期发现 和治疗而忽视肿瘤预防，结果收效甚微。

一些癌症是可以预防的，早在20世纪80年代中期，世界卫生组织(WHO)就己经明确地提出了3个1/3的观点，即1/3的癌症可以预防，1/3的癌症患者可以治愈，1/3的患者积极治疗后可以提高生活质量，延长生存期。现有研究发现食管癌变是一个多阶段进行性发展过程(正常一基底细胞增生一不典型增生一原位癌一食管鳞状细胞癌），并确立了癌前病变的概念。食管癌前病变呈现明显的双向发展的不稳定特性，即这些病变可向癌的方向发展，也可逆转到较轻度的病变，或维持同一状态多年不变。食管癌癌前病变的这一特点提示如果在早期介入干预，癌前病变可能被逆转或发展过程被阻断，从而抑制食管癌的发生和发展。更好地了解食管癌癌前病变的基因和/或癌前病变会对确定癌前病变发展的关键分子起决定作用，因此，需要开发针对这些关键基因的安全、有效的靶向药物，进而逆转，抑制，或停止癌前病变进一步进展为癌症。

“治疗”是指疾病或病况已经开始发展滞后减轻其病征或症状的治疗性干预。如本文使用的，关于疾病或病况的术语“减轻”是指治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可以例如通过易感受试者中疾病的临床症状的延迟发作、疾病的部分或全部临床症状的严重度降低、疾病的较慢进展、受试者总体健康或幸福的改善或者通过对于特定疾病特异的本领域熟知的其他参数所证实。如本文使用的，关于疾病或病况的术语“预防”是指在处于发展疾病的风险。癌症的化学预防是指利用天然或合成的化学物质来阻止、减缓或者逆转癌症发生发展过程，从而降低癌症发生率和死亡率。

癌症的化学预防作为肿瘤预防研究的新兴领域，近些年针对该领域的研究取得了较快的发展。寻找毒性反应小、治疗效果好，且作用机制明确的具有化学预防效果的药物是当前癌症化学预防的主要任务。

胃癌是全球常见的恶性肿瘤，据国际癌症研究机构发布的全球癌症患病现状调查，2012年中国GC发病例数占全球GC发病例数的42.6%，其死亡率（45.0%)居第六位。中国国家癌症中心于2018年2月发布了最新的全国癌症统计数据，胃癌在中国男性和女性的发病构成比中，分列第2位和第4位，死亡构成比中列第3位和第2位。目前，手术仍是治疗早期胃癌的主要手段，而对于进展期胃癌，则需要更多的综合治疗，包括化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等。

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，预后差，往往在初诊时已属中晚期。近年 来，随着越来越多新药研发和大型临床试验的开展，胃癌治疗方面实现了很多进展和突破。早期胃癌可通过手术治疗根治，进展期胃癌则需新辅助治疗以缩小肿瘤、抑制潜在转移，达到降期目的，从而争取手术治疗机会，延长患者生存期。

癌症的化学预防是指利用天然或合成的化学物质来阻止、减缓或者逆转癌症发生发展过程，从而降低癌症发生率和死亡率。

发明内容

本发明目的在于提供洛美他派在制备抗肿瘤药物中的应用。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

具体的，本发明发现了洛美他派在制备抑制人食管鳞癌细胞和胃癌细胞增殖药物中的应用，即其对食管鳞癌细胞和胃癌细胞具有抑制作用。

进一步的，洛美他派在浓度为0.125-2 μM时能够抑制食管鳞癌细胞（如KYSE150，KYSE450等）的增殖、克隆形成的数量及大小。在浓度为0.25-2 μM时能够抑制胃癌细（如HGC27，AGS等）的增殖。洛美他派在制备抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤生长药物的应用，其中，洛美他派在浓度10 mg/kg/天-40 mg/kg/天时能抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤的生长。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的化合物和药用载体。本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和有效量，例如，治疗有效

量(包括预防有效量)的本发明的前述化合物或其盐中的一种或多种。

药用载体可以常规使用的且仅受化学-物理考虑如溶解度和缺乏与所述化合物的反应性以及受施用途径限制的那些中的任何载体。

本文所述的药用载体，例如，媒介物、辅剂、赋形剂或稀释剂，对本领域技术人员是熟知的并且对公众易于获得。优选的是，药用载体是对于活性化合物为惰性的载体以及在

使用的条件下不具有有害副作用或毒性的载体。

载体的选择将部分地由具体活性剂以及由用来施用组合物的具体方法决定。因此，存在广泛各种各样的本发明的药物组合物的合适制剂。如用于经口、气溶胶、胃肠外、皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内、直肠和阴道施用的制剂。

综上，洛美他派能够作为一种现有的临床使用药物起到对肿瘤的预防及治疗作用。本发明为洛美他派在肿瘤治疗及预防提供了新用途。

附图说明

图1为洛美他派结构式。

图2为洛美他派在食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450中的毒性作用；

图3为洛美他派在对食管鳞癌细胞抑制作用，其中，洛美他派在浓度范围为:0.125-2 μM 时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450的增殖；图中为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线；

图4为洛美他派抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成。其中，随着加药浓度增加，克隆数显著降低；图中为对加药以及对照组克隆数量的统计结果，图中为相应组的克隆显微照片；

图5为洛美他派在胃癌细胞（AGS,HGC27）中的毒性作用；

图6为洛美他派在对胃癌细胞抑制作用，其中，洛美他派在浓度范围为:0.25-2 μM能够抑制胃癌细胞HGC27的增殖；在浓度范围为:0.25 μM -2 μM时能够抑制胃癌细胞AGS的增殖；图中为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线；

图7 为食管鳞癌患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠经洛美他派处理30天后，小鼠处死后肿瘤块拍照对比结果；

图8 为食管鳞癌患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠经洛美他派处理30天后，小鼠处死后肿瘤块称量统计结果；

图9为食管鳞癌患者肿瘤组织的异种移植食管癌模型小鼠经洛美他派处理30天后，小鼠体内肿瘤体积统计结果；

*p <0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用试验

材料与方法

1.材料

1.1食管癌细胞系

本发明中使用的食管癌细胞系和胃癌细胞系，来自郑州大学基础医学院病理生理学教研室。

1.2 试剂

青霉素 华北制药股份有限公司

链霉素 山东鲁抗医药股份有限公司

RPMI-1640 培养基 以色列 Biological Industries 公司

DMEM 培养基 以色列 Biological Industries 公司

0.25%胰酶 上海碧云天生物科技有限公司

无血清细胞冻存液 苏州新赛美生物科技有限公司

DAPI 北京索莱宝科技有限公司

琼脂粉 美国 B&D 公司

PBS 粉末 北京索莱宝科技有限公司

BME 粉末 美国 SIGMA-ALDRICH

L-谷氨酰胺 北京索莱宝科技有限公司

NaHCO₃ 天津市凯通化学试剂有限公司

多聚甲醛粉 天津市光复精细化工研究所

胎牛血清 美国 BI 公司

洛美他派粉末 上海拓青化工有限公司

0.4％戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）；

生理盐水500ml 瓶（辰欣药业股份有限公司）；

1.3仪器与器材：

1.5ml 离心管 美国 Axygen 公司

15ml 离心管 美国 Corning 公司

96 孔细胞培养板 无锡耐思生物科技有限公司

10 cm 细胞培养皿 无锡耐思生物科技有限公司

15 cm 细胞培养皿 美国 Thermo Fisher Scientific 公司

一次性移液管 广州洁特生物过滤股份有限公司

In Cell Analyzer 6000 美国 GE 公司

移液器 美国 Gilson 公司

干燥 CO2 培养箱 上海一恒科学仪器有限公司

高速低温离心机 德国 Eppendorf 公司

真空抽吸泵 海门市其林贝尔仪器制造有限公司

倒置显微镜 德国 Carl Zeiss Jena 公司

雪花制冰机 日本 SANYO 公司

Mili-Q 纯水仪 美国 Millipore 公司

眼科剪，手术镊，手术刀，溶药针，注射器；

1.4实验动物

4-5周龄的SCID小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，并饲养于昼夜12 h交替的恒温恒压环境中。小鼠体重约为18-20 g时，方可进行实验。实验动物饲养于郑州大学癌症化学预防河南省协同创新中心的动物设施内，在恒温(25-27℃)、恒湿(45%-50%)、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌(SPF级）饲养室条件下饲养，经无菌处理的饲料供动物自由摄入，高温消毒的垫料每三天更换一次，笼具及饮水每三天紫外线消毒一次，饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。

1.5实验方法

1.5.1细胞毒性实验：将食管鳞癌细胞、胃癌细胞种于96孔板，HGC27每孔约6000个细胞，KYSE150及AGS每孔约8000个细胞，KYSE450每孔约12000个细胞，放入37℃，5% CO₂的培养箱进行培养12-16 h。之后分别加入不同浓度的洛美他派，即将洛美他派溶于DMSO后加入相应培养基中，在食管癌细胞系的培养基中的终浓度依次为0.625 μM、 1.25 μM、2.5 μM、5μM、7.5μM 、10μM，在胃癌细胞系的培养基中的终浓度依次为3.125 μM 、6.25 μM、 12.5 μM、25 μM、50 μM，处理24 h和48 h。取出后加入100μL/孔含4%多聚甲醛的溶液对细胞在室温下固定30 min，再加入100μL/孔DAPI染液（DAPI:PBS=1:5000）在37℃，5% CO₂的培养箱培养30 min。用高内涵细胞成像分析系统统计细胞的数量，并分析其统计结果，结果见图2和图5。

1.5.2细胞增殖实验研宄

将食管鳞癌细胞、胃癌细胞种于96孔板，KYSE150、HGC27及AGS每孔约3000个细胞，KYSE450每孔约5000个细胞，放入37℃，5% CO₂的培养箱进行培养12-16 h。之后分别加入不同浓度的洛美他派，洛美他派在 KYSE150、KYSE450细胞培养基中的终浓度依次为0 μM 、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2 μM，洛美他派在 HGC27、AGS细胞培养基中的终浓度依次为0μM 、0.25μM、0.5μM、1μM、2 μM，分别在0、24、48、72、96 h加入4%多聚甲醛溶液100μL /孔对细胞在室温下固定30 min，再加入DAPI，100μL /孔（DAPI:PBS=1:5000）染液在37℃，5% CO₂的培养箱培养30 min。用高内涵细胞成像分析系统统计细胞的数量，并分析其统计结果，结果详见图3和图6。

1.5.3软琼脂克隆形成实验

将细胞（每孔8000个细胞）接种在6孔平板上，下层胶为琼脂胶加入相应浓度的洛美他派（下层胶中洛美他派浓度依次为0 μM 、0.25μM、0.5μM、1μM、2 μM），上层胶为琼脂胶加入相应浓度的洛美他派（上层胶中洛美他派浓度依次为0 μM 、0.25μM、0.5μM、1μM、2 μM）以及食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450。然后将固化的琼脂置于37℃，5% CO₂的培养箱中培养7-14天。用高内涵细胞成像分析系统统计细胞克隆的数量，并分析其统计结果，结果详见图4。

1.5.4人食管癌免疫缺陷鼠种植瘤模型的建立

食管鳞癌组织选取标准为：手术前未接受过任何放疗或者化疗治疗的病人的新鲜肿瘤组织（编号：EG20，分期T2N0M0Ⅱ，中分化鳞癌，患者来源于河南省肿瘤医院)，在肿瘤组织离体后的90 min内，置于无血清的1640培养基中冷藏运送至实验室。在进行组织接种前，肿瘤组织需要用含有青霉素链霉素的PBS（PBS:双抗 50:1）冲洗后置于冰上，等待接种。先给小鼠注射0.4%的戊巴比妥钠使小鼠进入麻醉状态后，将组织切成10-15 mm3的小块，用镊子种植于小鼠颈背部皮下，等待小鼠麻醉苏醒后送回无菌饲养室。约3-5天后小鼠颈背部伤口愈合后，每隔固定时间测量一次小鼠肿瘤体积，待肿瘤体积达到1000 mm³时，处死小鼠并取出肿瘤组织。以同样的方式传代至新的SCID小鼠皮下（第2代）。当移植瘤被稳定传至3代后，则证明食管癌移植瘤模型成功建立。

1.5.5洛美他派抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤生长

接种一周或者两周后，小鼠背部肿瘤结节长到200立方毫米左右时开始分组，即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，每组分10只以上。将洛美他派溶于10%DMSO+90%生理盐水的混合物中，配成相应剂量即10 mg/kg，40 mg/kg的药物溶液。随后 3组小鼠分别灌胃生理盐水，10 mg/kg洛美他派，40 mg/kg洛美他派。每4天记录小鼠肿瘤体积。当对照组小鼠肿瘤体积长到1000立方毫米左右，终止实验，取出肿瘤组织，称量肿瘤重量以及拍照。

1.6实验结果

本发明选取了食管癌细胞系，因此首先对食管癌细胞系进行细胞毒性实验，结果见图2。图2表明该化合物对食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450产生抑制作用的浓度范围为:0.625μM-10 μM。

洛美他派对食管鳞癌细胞具有抑制作用（见图3、图4)。其中，图3的结果表明：洛美他派在浓度范围为：0.125μM-2μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450的增殖。图4为洛美他派抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE450克隆形成。其中，随着加药浓度增加克隆数显著降低，克隆明显变小。图4为对加药以及对照组克隆数量的统计结果及相应组的克隆显微照片。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。具体地，洛美他派在浓度为0.125μM-2μM时，在培养72h能够显著抑制KYSE150细胞的增殖，在浓度为1μM-2μM时，在培养96h能够显著抑制KYSE150细胞的增殖，在浓度为1μM-2μM时，培养72h能够显著抑制KYSE450细胞的增殖，在浓度为0.125μM-2μM时，培养96h能够显著抑制KYSE450细胞的增殖。在浓度为0.5μM-2μM时能够显著抑制KYSE150细胞的克隆形成，在浓度为0.25μM-2μM时能够显著抑制KYSE450细胞的克隆形成。

本发明选取了胃癌细胞系，因此首先对胃癌细胞系进行细胞毒性实验，结果见图5。图表明该化合物对胃癌细胞AGS，HGC27产生抑制作用的浓度范围为:3.125-50 μM。细胞存活率为HGC27，24h为48.92%，48h为8.05%。AGS，24h为9.43%，48h为0.14%。

洛美他派对胃癌细胞具有抑制作用(见图6)。图6为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线。图6表明该化合物对胃癌细胞AGS，HGC27产生抑制作用的浓度范围为:0.25-2 μM。具体地，洛美他派在浓度为0.25μM-2μM时，在培养72h能够显著抑制AGS细胞的增殖，在浓度为0.5μM-2μM时，在培养96h能够显著抑制AGS细胞的增殖，在浓度为1μM-2μM时，培养72h能够显著抑制HGC27细胞的增殖，在浓度为0.5μM-2μM时，培养96h能够显著抑制HGC27细胞的增殖。

图7至图9为洛美他派在人食管癌PDX模型上对肿瘤的治疗效果。如图7所示，小鼠肿瘤图片可观察到高低剂量组洛美他派的肿瘤生长与对照组相比得到明显抑制。如图8所示，洛美他派高剂量 (40mg/kg)组小鼠肿瘤重量下降。图9可观察到低剂量组（10mg/kg）、高剂量 (40mg/kg)洛美他派组的肿瘤体积和对照组相比得到明显的抑制。由此得出，10mg/kg/天~40mg/kg/天洛美他派在食管癌PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果显著。

综上，通过细胞增殖实验，验证了洛美他派在食管癌和胃癌细胞系中的抑制效果。本发明首先通过细胞毒性实验，确定给药的安全浓度；再在食管癌和胃癌细胞系中给予化合物洛美他派处理，并在处理后的0h、 24h、48h、72h、96h检测细胞的增殖情况，确定该化合物洛美他派对食管癌和胃癌细胞系有抑制作用。通过软琼脂克隆形成实验，表明洛美他派能够抑制食管鳞癌KYSE150，KYSE450细胞的克隆的形成。在食管癌PDX模型中，洛美他派对食管癌移植瘤小鼠有显著肿瘤治疗效果，为临床研宄预防和治疗，预防和复发，食管癌，胃癌及其他肿瘤药物提供帮助。

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。

Claims (9)

1.洛美他派在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，洛美他派在制备抑制食管鳞癌细胞生长和转化药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，洛美他派在浓度为0.125μM~2μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，洛美他派在制备抑制胃癌细胞生长和转化药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，洛美他派在浓度为0.25μM~2μM时能够抑制胃癌细胞的增殖和转化。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胃癌细胞为HGC27细胞和/或AGS细胞。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，洛美他派在制备抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤生长药物的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，洛美他派在浓度10 mg/kg/天-40 mg/kg/天时能抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤的生长。

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