CN114224880B - 5,7,4`-三甲氧基黄酮在制备预防和治疗抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种5,7,4'‑三甲氧基黄酮(5,7,4'‑Trimethoxyflavone:TMF,分子式:C18H16O5,分子量:312.32)在制备预防和治疗抗肿瘤(如食管癌、结肠癌、胃癌、肺癌或肝癌等)药物中的应用。本发明通过细胞增殖实验,首次验证了5,7,4'‑三甲氧基黄酮在食管癌细胞系(KYSE70,KYSE410,KYSE450,KYSE510)和食管癌病人异种移植瘤小鼠模型中的抑制效果,可为临床研究治疗和预防食管癌及其他肿瘤的药物提供新的思路和依据。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种化合物5,7,4'-三甲氧基黄酮在制备预防和治疗抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
食管癌是一种侵袭性恶性肿瘤,发病率不断上升,预后不良。食管癌在组织学上分为两大类:腺癌和鳞状细胞癌。腺癌和鳞状细胞癌在分子上是不同的,因此治疗应反映各自的组织学亚型。食管鳞状细胞癌约占每年45.6万例食管癌发病率的90%。发病率高的地区包括中亚东部、东非大裂谷沿线和南非。经济社会可持续发展的原因有很多,各地区的原因各不相同。食管鳞状细胞癌的一些危险因素,包括来自各种来源的多环芳烃、高温食物、饮食、口腔健康和微生物群落等等。
化学药物预防与治疗在抑制肿瘤发展过程中有着重要的作用,癌症的化学“治疗”是指疾病或病况已经开始发展之后减轻其病征或症状的治疗性干预。癌症的化学“预防”是指利用天然或合成的化学物质来阻止、减缓或者逆转癌症发生发展的过程,从而降低癌症的发生率和死亡率。目前,尚未有关于化合物5,7,4'-三甲氧基黄酮在预防和治疗抗肿瘤中的相关报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷,提供一种化合物5,7,4'-三甲氧基黄酮在制备预防和治疗抗肿瘤药物中的新应用,即本申请发现了已知化合物5,7,4'-三甲氧基黄酮的一种新用途。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了已知化合物5,7,4'-三甲氧基黄酮在制备预防和治疗抗肿瘤药物中的应用,即其在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。所述肿瘤为所有哺乳动物的肿瘤。
5,7,4'-三甲氧基黄酮(5,7,4'-Trimethoxyflavone:TMF),分子式:C18H16O5,分子量:312.32,CAS号:5631-70-9,结构式如下所示:
上述的应用,所述肿瘤可以为食管癌、结肠癌、胃癌、肺癌或肝癌等等。
5,7,4'-三甲氧基黄酮能够预防肿瘤复发、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移或者杀灭肿瘤细胞,即其可以作为预防肿瘤发生、治疗肿瘤、预防肿瘤复发、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移以及杀灭肿瘤细胞等的药物。
上述的应用中,5,7,4'-三甲氧基黄酮与药学上可接受的载体或赋形剂复配制成具有抗肿瘤抗癌的复方制剂,复方制剂的给药方式包括口服、注射、喷雾、植入、外用或吸入等等。该复方制剂能够预防肿瘤发生、治疗肿瘤、预防肿瘤复发、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移以及杀灭肿瘤细胞等。
本发明研究了5,7,4'-三甲氧基黄酮的抗肿瘤生长活性,尤其是在预防及临床治疗食管癌中的应用,即其在制备抑制食管癌细胞增殖和肿瘤生长药物中的应用。具体的,本发明发现了5,7,4'-三甲氧基黄酮在制备抑制人食管鳞癌细胞增殖和肿瘤生长药物中的应用,即其对食管鳞癌细胞和肿瘤生长具有抑制作用。
进一步的,5,7,4'-三甲氧基黄酮在浓度为20-80 μM时能够抑制食管鳞癌细胞(如KYSE70,KYSE410,KYSE450,KYSE510等)的增殖、克隆形成的数量及大小。
和现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明发现:5,7,4'-三甲氧基黄酮在利用新鲜肿瘤组织接种于免疫缺陷NOD/SCID小鼠皮下建立的食管癌PDX模型上有显著的抗肿瘤生长效果,本发明中,小鼠体内肿瘤治疗浓度为50-100 mg/kg/day。发明中利用抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长药物中5,7,4'-三甲氧基黄酮在食管癌的预防及治疗中的作用,显著提高了食管癌的预防及治疗效果。实验发现:5,7,4'-三甲氧基黄酮在治疗食管癌上具有显著的效果。
附图说明
图1为5,7,4'-三甲氧基黄酮对食管鳞癌细胞的抑制作用。其中,5,7,4'-三甲氧基黄酮在浓度范围为:20 - 80 μM 时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE70,KYSE410,KYSE450和KYSE510的增殖(A)和克隆形成(B和C)。图中为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线及克隆数量的统计结果和图片(*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001);
图2为5,7,4'-三甲氧基黄酮的急性毒性试验,小鼠经5,7,4'-三甲氧基黄酮处理10天后,小鼠体重(A)及脾脏(B)的结果;
图3为5,7,4'-三甲氧基黄酮在食管PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果:其中,A为给药期间小鼠肿瘤体积变化趋势图;B为实验结束后,处死小鼠,称量出肿瘤的重量;C为对照组与给药组的肿瘤图片(与对照组相比,差异有统计学意义,*表示P<0.05,**表示P<0.01)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍,但本发明的保护范围并不局限于此。
材料与方法
1.材料
1.1食管癌细胞系
本发明中使用的食管癌细胞系,来自中美(河南)荷美尔肿瘤研究院。
1.2 试剂
5,7,4'-三甲氧基黄酮:MCE公司;
青霉素:华北制药股份有限公司;
链霉素:山东鲁抗医药股份有限公司;
RPMI-1640培养基:以色列 Biological Industries 公司;
DMEM培养基:以色列 Biological Industries 公司;
0.25%胰酶:上海碧云天生物科技有限公司;
无血清细胞冻存液:苏州新赛美生物科技有限公司;
DAPI:北京索莱宝科技有限公司;
琼脂粉:美国 B&D 公司;
PBS粉末:北京索莱宝科技有限公司;
BME粉末:美国 SIGMA-ALDRICH;
L-谷氨酰胺 北京索莱宝科技有限公司;
NaHCO3 天津市凯通化学试剂有限公司;
多聚甲醛粉:天津市光复精细化工研究所;
胎牛血清:美国 BI 公司;
盐酸苄达明粉末:百灵威;
0.4%戊巴比妥钠:国药集团化学试剂有限公司;
生理盐水500ml 瓶:辰欣药业股份有限公司。
1.3仪器与耗材:
1.5ml离心管:美国 Axygen 公司;
15ml离心管:美国 Corning 公司;
96孔细胞培养板:无锡耐思生物科技有限公司;
10 cm细胞培养皿:无锡耐思生物科技有限公司;
15 cm细胞培养皿:美国 Thermo Fisher Scientific 公司;
一次性移液管:广州洁特生物过滤股份有限公司;
In Cell Analyzer 6000:美国 GE 公司;
移液器:美国 Gilson 公司;
干燥CO2培养箱:上海一恒科学仪器有限公司;
高速低温离心机:德国 Eppendorf 公司;
真空抽吸泵:海门市其林贝尔仪器制造有限公司;
倒置显微镜:德国 Carl Zeiss Jena 公司;
雪花制冰机:日本 SANYO 公司;
Mili-Q纯水仪:美国 Millipore 公司;
Thermo超净工作台;眼科剪,手术镊,手术刀,溶药针,注射器。
1.4实验动物
4 - 5周龄的SCID小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司,并饲养于昼夜12 h交替的恒温恒压环境中。小鼠体重约为18 - 20 g时,方可进行实验。小鼠饲料购自于北京华阜生物科技股份有限公司。实验动物饲养于中美(河南)荷美尔肿瘤研究院的动物设施内,在恒温(25-27℃)、恒湿(45% - 50%)、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌(SPF级)饲养室条件下饲养,动物先放于有机塑料盒内(苏州市冯氏实验动物设备有限公司),再置于IVC系统饲养,经无菌处理的饲料供动物自由摄入,高温消毒的垫料每三天更换一次,笼具及饮水每三天紫外线消毒一次,饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。将实验动物在12/12小时光照/黑暗循环下饲养,可以自由接近食物和水,室温控制在25℃。
1.5实验方法
1.5.1细胞增殖实验
将食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE410、KYSE450、KYSE510接种于96孔板,每孔约4000个细胞,放入37 ℃,5% CO2的培养箱培养过夜。然后分别加入20 - 80 μM不同浓度的5,7,4'-三甲氧基黄酮处理0 h、24 h、48 h、72 h。取出后加入MTT孵育2 h,弃掉上清,加入100 μLDMSO,在570 nm波长下测其吸光度值,并分析其统计结果。
1.5.2平板克隆形成实验
将食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE410、KYSE450、KYSE510(每孔600个细胞)接种在6孔平板中,并加入相应浓度的5,7,4'-三甲氧基黄酮,然后置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养约两周,拍照统计细胞克隆的数量,并分析其统计结果。
1.5.3 化合物5,7,4'-三甲氧基黄酮在小鼠体内的急性毒性试验
将小鼠随机分成3组,每组小鼠分别灌胃含10% DMSO的生理盐水,50 mg/kg/day5,7,4'-三甲氧基黄酮和100 mg/kg/day 5,7,4'-三甲氧基黄酮。每天记录小鼠体重,共记录10天。第10天称重后处死小鼠,取出脾脏并拍照。
1.5.4人食管癌免疫缺陷鼠种植瘤模型的建立
食管鳞癌组织选取标准为:手术前未接受过任何放疗或者化疗治疗的病人的新鲜肿瘤组织,在肿瘤组织离体后的90 min内,置于无血清的1640培养基中冷藏运送至实验室。在进行组织接种前,肿瘤组织需要用含有青霉素链霉素的PBS(PBS:双抗=50:1)冲洗后置于冰上,等待接种。先给小鼠注射0.4%的戊巴比妥钠使小鼠进入麻醉状态后,将组织切成10 -15 mm3的小块,用镊子种植于小鼠颈背部皮下,等待小鼠麻醉苏醒后送回无菌饲养室。约3- 5天后小鼠颈背部伤口愈合后,每隔固定时间测量一次小鼠肿瘤体积,待肿瘤体积达到1000 mm3时,处死小鼠并取出肿瘤组织。以同样的方式传代至新的SCID小鼠皮下(第2代)。当移植瘤被稳定传至3代后,则证明食管癌移植瘤模型成功建立。
1.5.5化合物5,7,4'-三甲氧基黄酮高剂量抑制人食管癌异种移植小鼠肿瘤的生长
接种一周或者两周后,小鼠背部肿瘤结节长到200立方毫米左右时开始分组,即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组,每组9只。3组小鼠分别灌胃含10% DMSO的生理盐水,50 mg/kg/day 5,7,4'-三甲氧基黄酮和100 mg/kg/day 5,7,4'-三甲氧基黄酮。每4天记录小鼠肿瘤体积。当对照组小鼠肿瘤体积长到1000立方毫米左右,终止实验,取出肿瘤组织,称量肿瘤重量并拍照。
实验结果
图1给出了5,7,4'-三甲氧基黄酮对食管鳞癌细胞的生长抑制情况。其中,图1中A为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖柱形图,图1的结果表明:20 - 80 μM 5,7,4'-三甲氧基黄酮能够抑制食管鳞癌细胞KYSE70,KYSE410,KYSE450、KYSE510的增殖,且浓度为80 μM时抑制率最高。图1中B为5,7,4'-三甲氧基黄酮抑制食管鳞癌细胞KYSE70,KYSE410,KYSE450、KYSE510克隆形成的克隆数统计。图1中C为克隆形成图片,随着加药浓度的增加,克隆数显著降低,表明5,7,4'-三甲氧基黄酮能够抑制食管癌细胞的克隆形成。(*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)。
图2给出了5,7,4'-三甲氧基黄酮的急性毒性试验对小鼠体重及脾脏的影响结果,其中,图2中A为小鼠的体重统计图,结果表明,50 mg/kg/day 5,7,4'-三甲氧基黄酮和100mg/kg/day 5,7,4'-三甲氧基黄酮对小鼠的体重没有影响;图2中B为小鼠的脾脏图片,结果表明,50 mg/kg/day 5,7,4'-三甲氧基黄酮和100 mg/kg/day 5,7,4'-三甲氧基黄酮对小鼠的脾脏没有影响。由此说明:5,7,4'-三甲氧基黄酮无明显的毒副作用。
图3给出了5,7,4'-三甲氧基黄酮在人食管癌异种移植瘤小鼠模型上的肿瘤生长效果。图3中A为给药过程中肿瘤体积的统计图,图3中B为给药结束后取出的肿瘤重量的统计图,图3中C为取出的肿瘤的图片,结果显示:50 mg/kg/day低剂量与100 mg/kg/day高剂量的5,7,4'-三甲氧基黄酮能明显抑制肿瘤的体积和重量,表明:5,7,4'-三甲氧基黄酮能显著抑制人食管癌异种移植瘤小鼠模型肿瘤的生长,在食管癌异种移植瘤小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果显著。
综上所述,本发明通过细胞增殖实验验证了5,7,4'-三甲氧基黄酮在食管癌细胞系中的抑制效果。本发明在食管癌细胞系中给予化合物5,7,4'-三甲氧基黄酮处理,并在处理后的0 h、24 h、48 h、72 h检测细胞的增殖情况,确定该化合物对食管癌细胞系有抑制作用。通过平板克隆及软琼脂克隆形成实验,表明5,7,4'-三甲氧基黄酮能够抑制食管鳞癌KYSE70、KYSE410、KYSE450及KYSE510细胞克隆的形成。在食管癌PDX模型中,5,7,4'-三甲氧基黄酮对食管癌移植瘤小鼠有显著肿瘤治疗效果,为临床研究预防和治疗、预防复发食管癌等肿瘤及其他肿瘤药物提供帮助。
Claims (5)
1.5,7,4'-三甲氧基黄酮在制备预防和治疗抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述肿瘤为食管癌。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,5,7,4'-三甲氧基黄酮能够抑制肿瘤生长或者杀灭肿瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,5,7,4'-三甲氧基黄酮在浓度为20-80μM时能够抑制食管癌细胞增殖、克隆。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述食管癌细胞为KYSE70、KYSE410、KYSE450或KYSE510。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,5,7,4'-三甲氧基黄酮与药学上可接受的载体复配制成具有抗肿瘤的复方制剂,复方制剂的给药方式包括口服、注射、喷雾或吸入。
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