CN114366749B - 整合素抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种整合素抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的用途。与现有技术相比，本发明的整合素抑制剂对多种肾癌细胞都有较强的抑制作用，因此有望将来用于制备抗肾癌药物。

Description

整合素抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种整合素抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的用途。
背景技术
肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。近年我国肾癌发病率和死亡率呈现逐年上升趋势。肾癌对放化疗不敏感，免疫治疗个体差异大，有效率仅有约20％，且伴随较大的细胞毒性。手术治疗是主要的治疗方法。然而，20-25％的患者初诊时已经发生转移，错过手术最佳时机。即便RCC患者行根治术后，仍有25-40％的患者发生远端转移。针对晚期及转移性肾癌患者，目前国际上采用免疫治疗和系统靶向治疗的手段，如索拉菲尼、舒尼替尼和依维莫司，以及最新的免疫检查点抑制剂如，纳武单抗、易普利姆玛(伊匹单抗)等，但疗效有限且伴随较大的毒副作用，因而晚期和转移性肾癌的患者预后依然很差，因此急需探索能够影响肾癌靶向治疗的新方法。
整合素(整联蛋白)普遍存在于脊椎动物细胞表面，是细胞表面受体的主要家族。主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互黏附，并介导细胞与细胞外基质之间的双向信号传导。整合素是由α和β两个亚单位形成的异二聚体。目前已发现18种α单位和9种β亚单位。它们按不同的组合构成20余种整合素。
整合素(Integrin)属于细胞表面受体，在许多肿瘤细胞中调节失调，从而促进肿瘤生长、存活和浸润。整合素在肿瘤血管生成中也有重要作用。
目前一些整合素已经应用于一些肿瘤的治疗，但是现有技术中尚无整合素用于肾癌治疗的研究。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种整合素抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的用途。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1、一种整合素抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的用途。
2、根据项1所述的用途，其特征在于，所述整合素抑制剂为整合蛋白αvβ3的抑制剂。
3、根据项2所述的用途，其特征在于，所述整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和/或西仑吉肽，
其中S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸的结构如式(I)所示，西仑吉肽的结构如式(II)所示。
Figure BDA0003306638120000021
4、根据项3所述的用途，其特征在于，所述整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸。
5、根据项3所述的用途，其特征在于，所述整合素抑制剂为西仑吉肽。
6、一种治疗肾癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括整合素抑制剂及其药学上可接受的载体。
7、根据项6所述的药物组合物，其特征在于，所述整合素抑制剂为整合蛋白αvβ3的抑制剂。
8、根据项7所述的药物组合物，其特征在于，所述整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和/或西仑吉肽，
其中S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸的结构如式(I)所示，西仑吉肽的结构如式(II)所示。
Figure BDA0003306638120000031
所述整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸其结构如式(I)所示。
9、根据项8所述的药物组合物，其特征在于，所述整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸。
10、根据项8所述的药物组合物，其特征在于，所述整合素抑制剂为西仑吉肽。
与现有技术相比，本发明的整合素抑制剂对多种肾癌细胞都有较强的抑制作用，因此有望将来用于制备抗肾癌药物。
附图说明
图1显示S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
(1)本发明的化合物
本发明的化合物为整合素抑制剂。
优选地，本发明的整合素抑制剂为整合蛋白α合蛋白的抑制剂。
优选地，所述整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和/或西仑吉肽，即所述整合素抑制剂可以为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸、西仑吉肽或者S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和西仑吉肽的混合物。
当所述整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和西仑吉肽的混合物时，S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和西仑吉肽可以任意比例混合。
在一个具体的实施方式中，本发明的整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸。
在一个具体的实施方式中，本发明的整合素抑制剂为西仑吉肽。
在一个具体的实施方式中，本发明的整合素抑制剂为S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和西仑吉肽，其中S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和西仑吉肽可以任意比例混合。
其中，S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸是一种有效的整合素抑制剂，是整合蛋白αvβ3(玻连蛋白受体)的非肽拮抗剂，对整合蛋白αvβ3和αVβ5的Ki值分别为1.2nM的和0.3nM。S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸的结构如式(I)所示。
Figure BDA0003306638120000051
αvβ3在多种细胞类型中均有表达，通过与配体结合，参与肿瘤的血管生成，侵袭转移、炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程。据报道，整合素在多种肿瘤和新生血管内皮细胞中高表达，在肿瘤血管生成过程中起重要作用，其中αvβ3的作用较为重要。因此，整合素αvβ3成为许多抗肿瘤血管生成药物的靶点。S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸抑制αvβ3介导的细胞粘附，IC50为3nM，抑制内皮细胞迁移，IC50为1.8nM，抑制破骨细胞介导的骨吸收，IC50为11nM。在体外，S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸抑制人破骨细胞介导的骨吸收。在包含MDA-MB-231细胞的血液中，该化合物与lamifiban结合抑制肿瘤细胞黏附到血管细胞外基质上。在骨吸收和骨质疏松大鼠模型中，该化合物抑制甲状腺素刺激的血钙反应，抑制骨损失。在佐剂型关节炎大鼠体内，可显著减少佐剂诱导的关节炎症状。在大鼠主动脉和肾动脉中，引起血管平滑肌急性暂时性坏死。该化合物可引起小鼠主动脉的直接的化学性血管损伤。在怀孕小鼠内，可降低Th2细胞的生成及其衍生的IL-10增加，可逆转Th1细胞产生的白介素-2水平的下降。体内实验结果表明该化合物可显著抑制小鼠胚胎植入，导致小鼠异常妊娠。此外，孕鼠注射该化合物后自然杀伤细胞增加，血清中γ干扰素水平升高。
在人类神经干细胞和小鼠大脑中，应用该化合物抑制整合素αVβ5后，可减轻zikv感染和减轻zikv诱导的病毒感染。S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸在表达高farp1基因的胃癌细胞中阻碍细胞运动。S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸对C6胶质瘤细胞talin、survivin蛋白表达及其磷酸化起负向调节作用。体外实验表明该化合物可降低乳腺癌细胞与血管细胞外的间质黏附。S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸可增强抗GD2小鼠单克隆抗体14G2a对神经母细胞瘤细胞的抑制作用。该化合物减少神经母细胞瘤细胞的附着水平。值得注意的是，S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸对SK-N-SH细胞系具有高度的细胞毒性。在人恶性黑色素瘤细胞A375中，抑制mTOR信号途径后，加入该化合物可进一步抑制其下游AKT通路的活性。
西仑吉肽(Cilengitide)是一个含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列的生物活性环肽,化学名称为环(L-精氨酰甘氨酰-L-天冬氨酰-D-苯丙氨酰-N-甲基-L-缬氨酰)，分子式C27H40N8O7，分子量588.66，密度：1.41g/cm3，其结构式如式(II)所示。
Figure BDA0003306638120000061
西仑吉肽是一种选择性抑制整合素αvβ3和αvβ5的抑制剂，在1999年，由德国默克雪兰诺公司研发并命名。在1/2期临床试验中，对于新诊断或复发的胶质瘤，西仑吉肽和替莫唑胺联合能起到很好的抑制肿瘤的作用，西仑吉肽能够通过阻断细胞与微环境中RGD模体结合，抑制新生血管的生成和血管内皮细胞的增长并在人体肿瘤异种移植中抑制肿瘤的增长。在体内模型中，西仑吉肽通过抑制整合素αv有效减少功能血管的密度，抑制肿瘤的生长和转移。西仑吉肽不仅能在肿瘤微环境中抑制新生血管的生成，而且能直接抑制肿瘤细胞的增殖。
(2)药物组合物
本发明提供了一种治疗肾癌的药物组合物，以及本发明还提供了药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途，其中，所述药物组合物包括整合素抑制剂及其药学上可接受的载体。
优选地，本发明的整合素抑制剂为整合蛋白αvβ3的抑制剂。
进一步优选地，所述药物组合物包含如上所述的式(I)和/或式(II)的化合物及其药学上可接受的载体。即所述药物组合物包含S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和/或西仑吉肽及其药学上可接受的载体。
在一个具体的实施方式中，所述药物组合物包含S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸及其药学上可接受的载体。
在一个具体的实施方式中，所述药物组合物包含西仑吉肽及药学上可接受的载体。
在一个具体的实施方式中，所述药物组合物包含S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸、西仑吉肽及其其药学上可接受的载体。其中，S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸和西仑吉肽可以任意比例混合。
药物组合物能够针对特定的给药途径进行配制，例如口服给药、肠胃外给药和直肠给药等。此外，本发明的药物组合物能够以固体形式(非限制性地包括胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、粉末剂或栓剂)或以液体形式(非限制性地包括溶液剂、混悬剂或乳剂)制成。药物组合物能够经历常规的制药操作(例如灭菌)和/或能够含有常规的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂以及辅料，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。
通常，药物组合物是片剂或胶囊，其包含活性成分以及
a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、甘氨酸等；
b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂也包含
c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要，还有
d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾混合物；和/或
e)吸收剂、着色剂、调味剂和增甜剂。
根据本领域中已知的方法，片剂可以是薄膜包衣或肠溶包衣的。
用于口服给药的合适的组合物包括有效量的式(I)和/或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其为片剂、锭剂、水或油混悬液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂的形式。根据本领域中已知的用于制备药物组合物的任意方法制备用于口服使用的组合物，并且为了提供精制和适口的制剂该组合物能够含有一种或多种选自增甜剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂。片剂可以含有与适合于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合在一起的活性成分。这些赋形剂是例如惰性的稀释剂(例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)；成粒剂和崩解剂(例如玉米淀粉、或海藻酸)；粘合剂(例如淀粉、明胶或阿拉伯胶)；和润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉)。片剂是未经包衣的或者通过已知的技术进行包衣从而延缓在胃肠道的崩解和吸收，从而在较长的时期内提供持久的作用。例如，能够使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服的制剂能够以硬明胶胶囊呈递，其中活性成分与惰性的固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者以软明胶胶囊呈递，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
某些可注射的组合物是等渗水溶液或混悬液，栓剂有利地由脂肪乳或混悬液制得。所述的组合物可以进行灭菌和/或含有辅料，例如防腐、稳定、润湿或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，其也可以含有其他的治疗上有价值的物质。所述的组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣法进行制备，并且含有大约0.1-75％或含有大约1-50％的活性成分。
由于水可能促进某些化合物的降解，本发明还提供无水的药物组合物和剂型，其包含作为活性成分的本发明化合物。
使用无水或低水含量的成分和低水含量或低湿度的条件能够制备本发明的无水的药物组合物和剂型。可以制备和贮存无水的药物组合物以便保持其无水的性质。因此，使用已知防止与水接触的材料包装无水的组合物以便其能够包含于合适的配方药盒中。合适的包装的实例非限制性地包括气密的箔、塑料、单位剂量容器(例如管形瓶)、泡罩包装和条带包装。
本发明进一步提供药物组合物和剂型，其包含1种或多种降低作为活性成分的本发明化合物的分解速率的试剂。该试剂(其在本文中称作“稳定剂”)非限制性地包括抗氧化剂(例如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂等。
对于大约50-70kg的个体，本发明的药物组合物或组合产品能够是大约1-1000mg活性成分的单位剂量，或者大约1-500mg或大约1-250mg或大约1-150mg或大约0.5-100mg、或大约1-50mg活性成分。化合物、药物组合物或其组合产品的治疗有效剂量取决于个体的物种、体重、年龄和个体情况、其正在接受治疗的病症或疾病或其严重程度。普通技术的内科医生、临床医师或兽医能够容易地确定为了预防、治疗或抑制病症或疾病的发展所需的每一种活性成分的有效量。
(3)治疗用途
在一些实施方式中，提供了一种整合素抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的用途。
在一些实施方式中，提供了一种整合蛋白α一些实的抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的用途。
在一些实施方式中，提供了如上所述的式(I)和/或式(II)的化合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。
在一个具体实施方式中，提供了如上所述的式(I)的化合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。
在一个具体实施方式中，提供了如上所述的式(II)的化合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。
在一个具体实施方式中，提供了如上所述的式(I)和式(II)的化合物在制备治疗肾癌的药物中的用途。
在一些实施方式中，提供了一种药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途，所述药物组合物包括整合素抑制剂及其药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，提供了一种药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途，所述药物组合物包括整合蛋白αvβ3的抑制剂及其药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，提供了一种药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途，所述药物组合物包括式(I)的化合物及其药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，提供了一种药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的用途，所述药物组合物包括式(II)的化合物及其药学上可接受的载体。
实施例1
S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸抗肾癌细胞增殖的活性测试
为测试S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸对肾癌细胞的抑制效果，将S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸加入含有人类肾癌细胞的培养液中，进行肿瘤细胞活性测试。细胞存活性测试采用CCK8试剂检测，786-O、ACHN、MRCC和NRCC为人肾透明细胞癌细胞系，SRCC为人肾肉瘤样癌细胞系。
CCK8检测基本原理为：该试剂中含有WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。
材料：
S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸购自(SB273005，Selleckchem,CatalogNo.S7540)；
CCK8检测试剂盒购自(Cell Counting Kit-8，Dojindo Laboratories,Lot.PR654)；
ACHN和786-O购自美国American type cμlture collection(ATCC)；
MRCC和NRCC来源于中国汉族人中的肾透明细胞癌细胞，由海军军医大学流行病学教研室自行建立，于液氮中储存备用。SRCC来源于中国汉族人肾肉瘤样癌细胞，由海军军医大学流行病学教研室自行建立，于液氮中储存备用，具体的建立方法参见ZL201110202556.5和US9386762B2。
方法：
(1)细胞培养
本实验涉及细胞为贴壁细胞。786-O细胞在含有10％胎牛血清和1％抗生素(100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)的PRMI1640细胞培养液中培养，ACHN、MRCC、NRCC、SRCC细胞在含有10％胎牛血清和1％抗生素(100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)的DMEM细胞培养液中培养。786-O和ACHN细胞均放置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。MRCC、NRCC和SRCC于8％CO2，37℃恒温培养箱中培养。
(2)细胞传代
细胞生长至85％-95％单层时，对细胞施行传代。弃去原培养基后以2.5-5ml的PBS缓冲液清洗细胞2次，加入1-2ml细胞消化液(0.01％EDTA+0.25％胰酶)浸润细胞后，吸出，5％CO2，37℃恒温培养箱中消化2-4分钟，显微镜下观察细胞变圆时，加入适量完全培养加吹打中和消化液并稀释细胞密度，接种于新的培养瓶中继续扩增培养，或进行细胞计数用以后续实验。
(3)CCK8检测细胞活性：
对数生长期细胞进行胰酶消化后，加入10ml培养基中和消化，并细胞计数，调整细胞浓度为30000cell/ml，96孔板每个孔接种100μl的细胞悬液，每孔3000个细胞。将培养板在培养箱中，37℃培养箱中培养过夜。将培养基中加入不同浓度的S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸(SB273005)(0，0.1nM，1nM，10nM，50nM，100nM，1μM，10μM，50μM，100μM)，每个样本做5个复孔。于培养箱中培养48小时。弃去培养液，每孔加入含100μl含10μl CCK8溶液的培养液(注意不要在孔中生成气泡)。继续培养箱中培养1小时。用酶标仪测定450nm处的吸光度。并计算细胞抑制率，结果如表1，及其生长半抑制率所需浓度(即IC50值)，其结果如表2所示：
按照下述公式计算抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/OD对照×100％(其中OD对照、OD实验为已经扣除OD空白的实验数值)。
表1肾癌细胞抑制率
Figure BDA0003306638120000121
其中，依维莫斯和索拉菲尼均为现有的治疗肾癌的药物。
表2肾癌细胞IC50值
肾癌细胞 IC50
786-O 20.061μM
ACHN 3.076μM
MRCC 369.8nM
NRCC 36.99nM
SRCC 7.935μM
结论：测试结果表明整合素抑制剂(S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸)对肾癌肿瘤细胞系(ACHN、786-O、MRCC、NRCC、SRCC)可降低存活率，具有抑制作用。因此该化合物可应用于肾癌肿瘤细胞的生长抑制上，进一步可能用于肾癌的治疗。
综合以上，本发明提出S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸，可有效抑制肾癌肿瘤细胞生长。该化合物可用以制备抗肾癌药物。
实施例2
西仑吉肽抗肾癌细胞增殖的活性测试
为测试西仑吉肽对肾癌细胞的抑制效果，将西仑吉肽加入含有人类肾癌细胞的培养液中，进行肿瘤细胞活性测试。细胞存活性测试采用CCK8试剂检测，786-O、ACHN、MRCC为人肾透明细胞癌细胞系,SRCC为人肾肉瘤样癌细胞细胞系。
CCK8检测基本原理为：该试剂中含有WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。
材料：
西仑吉肽购自(Cilengitide,Selleckchem,CatNo.S7077)；
CCK8检测试剂盒购自(Cell Counting Kit-8，Dojindo Laboratories,Lot.PR654)；
ACHN和786-O购自美国American type cμlture collection(ATCC)；
MRCC来源于中国汉族人中的肾透明细胞癌细胞，由海军军医大学流行病学教研室自行建立，于液氮中储存备用。SRCC来源于中国汉族人肾肉瘤样癌细胞，由海军军医大学流行病学教研室自行建立，于液氮中储存备用，具体的建立方法参见ZL201110202556.5和US9386762B2。
方法：
(2)细胞培养
本实验涉及细胞为贴壁细胞。786-O细胞在含有10％胎牛血清和1％抗生素(100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)的PRMI1640细胞培养液中培养，ACHN、MRCC、SRCC在含有10％胎牛血清和1％抗生素(100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)的DMEM细胞培养液中培养。786-O和ACHN细胞均放置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。MRCC和SRCC于8％CO2，37℃恒温培养箱中培养。
(2)细胞传代
细胞生长至85％-95％单层时，对细胞施行传代。弃去原培养基后以2.5-5ml的PBS缓冲液清洗细胞2次，加入1-2ml细胞消化液(0.01％EDTA+0.25％胰酶)浸润细胞后，吸出，5％CO2，37℃恒温培养箱中消化2-4分钟，显微镜下观察细胞变圆时，加入适量完全培养加吹打中和消化液并稀释细胞密度，接种于新的培养瓶中继续扩增培养，或进行细胞计数用以后续实验。
(3)CCK8检测细胞活性：
对数生长期细胞进行胰酶消化后，加入10ml培养基中和消化，并细胞计数，调整细胞浓度为30000cell/ml，96孔板每个孔接种100μl的细胞悬液，每孔3000个细胞。将培养板在培养箱中，37℃培养箱中培养过夜。将培养基中分别加入不同浓度的西仑吉肽(0，1μg/ml，5μg/ml，50μg/ml)，每个样本做4个复孔。于培养箱中培养48小时、索拉菲尼(5μM)、依维莫斯(0.05μM)。弃去培养液，每孔加入含100μl含10μl CCK8溶液的培养液(注意不要在孔中生成气泡)。继续培养箱中培养1小时。用酶标仪测定450nm处的吸光度。并计算细胞抑制率，其结果表3所示：
按照下述公式计算抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/OD对照×100％(其中OD对照、OD实验为已经扣除OD空白的实验数值)。
表3肾癌细胞抑制率
Figure BDA0003306638120000141
其中，依维莫斯和索拉菲尼均为现有的治疗肾癌的药物。
结论：整合素抑制剂西仑吉肽对肾癌细胞增殖具有抑制作用，且存在剂量效应关系。
实施例3
S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸对荷瘤小鼠抑瘤作用的实验
为测试S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸对荷瘤小鼠的肿瘤的抑制效果，将S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸配置成溶液，进行小鼠荷瘤实验。SRCC为人肾肉瘤样癌细胞系。
材料：
S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸购自(SB273005，Selleckchem,CatalogNo.S7540)；
SRCC来源于中国汉族人肾肉瘤样癌细胞，由海军军医大学流行病学教研室自行建立，于液氮中储存备用，具体的建立方法参见ZL201110202556.5和US9386762B2。
实验动物及瘤株：裸鼠(n＝24)，6-8周龄，每只20g左右，购自海军军医大学动物中心。所有动物实验均按照海军军医大学伦理委员会会规定的动物福利标准执行。
方法：
(1)细胞培养及传代
本实验涉及细胞为贴壁细胞。SRCC细胞在含有10％胎牛血清和1％抗生素(100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)的DMEM细胞培养液中,于8％CO2，37℃恒温培养箱中培养。细胞生长至85％-95％单层时，对细胞施行传代。弃去原培养基后以2.5-5ml的PBS缓冲液清洗细胞2次，加入1-2ml细胞消化液(0.01％EDTA+0.25％胰酶)浸润细胞后，吸出，5％CO2，37℃恒温培养箱中消化2-4分钟，显微镜下观察细胞变圆时，加入适量完全培养加吹打中和消化液并稀释细胞密度，接种于新的培养瓶中继续扩增培养，或进行细胞计数用以后续实验。
(2)裸鼠成瘤及给药
建立小鼠SRCC细胞系动物模型，将体外培养的指数生长期的SRCC细胞以1×107个/ml浓度的单细胞悬液0.22ml注射于小鼠左腋皮下(每只裸鼠细胞注射总量为2.2×106个)，制备荷瘤鼠，肿瘤接种完成后每两天用卡尺测量肿瘤体积，肿瘤长径约6mm时，将小鼠随机分为3组，每组8只，进行给药实验。用生理盐水稀释S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸,浓度为1.5μg/μl。三组小鼠：对照组，100μl给药组，200μl给药组。其中对照组给予200μl生理盐水，每天灌胃给药1次，连续49天。
(3)观察指标
肿瘤体积，并计算肿瘤体积相对值。分组给药后每4天用游标卡尺测量肿瘤长径a及短径b，按公式：瘤体积(V)＝a×b2/2计算瘤体积。计算与给药第一天时的肿瘤体积相对值。如:第4天肿瘤体积相对值＝V4/V1,连续观察49天。
结果：
S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响如图1所示。自给药实验25天开始，与对照鼠小鼠相比，给药200μl(1.5μg/μl)组的肿瘤体积相对值均显著低于对照组(P<0.005)。

Claims (1)

1.S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸在制备治疗肾癌的药物中的用途，
其中S-2-(8-(2-(6-(甲氨基)吡啶-2-基)乙氧基)-3-羰基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氢化-1H-苯并[c]氮杂卓-4-基)乙酸的结构如式(I)所示：
Figure FDA0004258313890000011
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101687039A (zh) * 2007-07-17 2010-03-31 默克专利有限公司 工程化抗αν-整联蛋白杂合抗体
CN108514639A (zh) * 2018-04-26 2018-09-11 武汉迈德森医药科技股份有限公司 一种用于抗肿瘤的联合药物以及其制剂和应用

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