CN115501231B - 预防和/或治疗肝癌的联用药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗肝癌的联用药物组合物及其应用，所述的联用药物组合物含有西达本胺和肝癌分子靶向药物，本发明通过将西达本胺与肝癌分子靶向药物配伍后，能够对肝癌细胞产生协同抑制效果，实现协同预防和/或治疗肝癌的效果，即两药联用时对肝癌细胞的抑制作用强于两药单独使用时所发挥的抑制作用之和，为临床肝癌的预防和/或治疗提高了新的思路。

Description

预防和/或治疗肝癌的联用药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种预防和/或治疗肝癌的联用药物组合物及其应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是是一种高死亡率的原发性肝癌，其病因尚未清楚，HCC分子发病机制及其复杂，涉及多条信号通路：(1)信号传导途径异常导致细胞异常增生及存活(如EGFR，Raf/MEK/ERK，PI3K/AKT，Wnt等途径)；(2)新生血管异常增生(如VEGFR途径)，促进肿瘤生长及进展。已有研究表面其主要发生在慢性肝脏炎症的环境中，并且与慢性病毒性肝炎感染(乙型肝炎或丙型肝炎)、酒精或毒素(如黄曲毒素)等接触相关性极高。某些疾病，如血色素沉着症和α1-抗胰蛋白酶缺乏症，也会显著增加发展为肝细胞癌的风险。代谢综合症和非酒精性脂肪肝也被越来越多地认定为肝细胞癌的危险因素。同其他任何癌症一样，肝细胞癌的治疗和预后根据肿瘤组织学特征、大小、癌细胞扩散程度以及整体健康状况而有所不同。

靶向治疗或靶向分子治疗(Targeted Therapy、Molecularly Targeted Therapy)是一种以干扰癌变或肿瘤增生所需的特定分子来阻止癌细胞增长的一种药物疗法，目前被认为是比当今其他疗法更加有效，并且对正常细胞伤害更小的疗法。目前原发性肝癌诊疗规范指南指出一线治疗肝癌分子靶向药物主要包括多纳非尼、索拉非尼、仑伐替尼等。但单用肝癌分子靶向药物虽然能够在一定程度上延长晚期肝癌患者的生存期，疗效仍然有限。

西达本胺是一种新型的组蛋白去乙酰化酶(HADC)抑制剂，作为MS-275(人工苯甲酰胺衍生物)的结构类似物，西达本胺可靶向作用于HDAC1、2、3、10。其适应症包括(1)用于既往至少接受过一次全身化疗的复发或难治的外周T细胞淋巴瘤(PTCL)患者；(2)联合芳香化酶抑制剂用于激素受体阳性、人表皮生长因子受体-2阴性、绝经后、经内分泌治疗复发或进展的局部晚期或转移性乳腺癌患者。西达本胺的结构稳定，半衰期长，细胞毒性相对较小，是新兴的抗肿瘤药物。针对目前可利用的肝癌治疗方案对于绝大多数晚期肝癌患者仍不适用，反应率较低，而且副作用相对较大，严重影响患者生命健康的问题，亟需探索联合制剂，增强肝癌分子靶向药物治疗疗效，减轻不良反应，延缓耐药的发生进而提高肝癌患者的生存期。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种预防和/或治疗肝癌的联用药物组合物，通过将西达本胺与肝癌分子靶向药物配伍，能够实现协同预防和/或治疗肝癌的效果。

为了实现上述目的，本发明提供了一种预防和/或治疗肝癌的联用药物组合物，所述联用药物组合物含有西达本胺和肝癌分子靶向药物。

西达本胺作为一种新型的组蛋白去乙酰化酶(HADC)抑制剂，经其作用后的肝癌细胞增殖情况受阻，且大部分细胞停留在G1期。此外，西达本胺通过上调p21的表达促进癌细胞凋亡，并且这种调控作用不受p53基因状态的影响。西达本胺的结构稳定且能在常温下保存，其半衰期长，在人体内的毒性小。肝癌分子靶向药物临床已经证明其是比较有效的一种抗肿瘤治疗手段，且对正常细胞伤害更小。本发明创造性地将西达本胺与肝癌分子靶向药物联用，通过低剂量的西达本胺和肝癌分子靶向药物配伍后，在抑制肝癌细胞增殖、杀伤肝癌细胞上，具有良好的协同作用，能够更好的抑制肝癌的发展。

进一步方案，所述的肝癌分子靶向药物为多纳非尼、仑伐替尼、索拉非尼、瑞戈非尼中的至少一种。

进一步方案，所述西达本胺与肝癌分子靶向药物的质量比为1:1-4。

进一步方案，所述西达本胺与肝癌分子靶向药物的质量比为1:1。

进一步方案，所述肝癌分子靶向药物为多纳非尼。多纳非尼与其他肝癌分子靶向药物相比，可以明显改善晚期肝癌患者的生存期，具有良好的安全性和耐受性。多纳非尼可以同时抑制VEGFR、PDGFR等多种受体酪氨酸激酶的活性，也可直接抑制各种Raf激酶，抑制下游Raf/MEK/ERK信号传导通道，抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤血管形成，发挥双重抑制、多靶点阻断的抗肝癌作用。故，优选地，将西达本胺与多纳非尼进行配伍，能够发挥出更好的协同预防和/或治疗肝癌的效果。

本发明进一步提供了如前所述的预防和/或治疗肝癌的联用药物组合物在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。

本发明进一步提供了一种预防和/或治疗肝癌的药物，其含有如前所述的联用药物组合物。

进一步方案，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。其中，所述的载体和/或辅料可为任意药学上可接受的组成，包括但不限于填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂等，具体根据药物剂型的不同，对载体和/或辅料进行相应的选择，这里不再具体阐述。

进一步方案，所述药物中含有效量的西达本胺以及有效量的肝癌分子靶向药物。

进一步方案，所述西达本胺的应用浓度范围为2.5μM-5μM，所述肝癌分子靶向药物的应用浓度范围为2.5μM-10μM。

本发明具有以下有益效果：

本发明中提出的一种预防和/或治疗肝癌的联用药物组合物，通过将西达本胺与肝癌分子靶向药物配伍后联用，能够对肝癌细胞产生协同抑制效果，也就是说，两药联用时对肝癌细胞的抑制作用强于两药单独使用时所发挥的抑制作用之和。并且，通过在裸鼠肝癌模型上验证了西达本胺与肝癌分子靶向药物联用后的协同预防和/或治疗肝癌的药效。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度西达本胺单药、多纳非尼单药对不同肝癌细胞系的细胞的CCK8试验结果；

图2和图3为实施例2中西达本胺、多纳非尼及其联用组对不同肝癌细胞系的CCK8试验结果；

图4为实施例3中采用流式细胞术检测的多纳非尼、西达本胺及其联用组对细胞凋亡的作用结果；

图5为实施例3中多纳非尼、西达本胺及其联用组对细胞生长情况测试结果；

图6为实施例4中西达本胺与不同浓度的肝癌分子靶向药物配伍后对不同肝癌细胞系的增殖影响；

图7和图8为实施例5中西达本胺与多纳非尼联用组对不同肝癌细胞生长的影响；

图9为实施例6中裸鼠肝癌PDX模型的结果示意图；

图10为实施例7中体内免疫正常小鼠皮下瘤模型的结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。

需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。

术语解释

本文所述的“联用”或“联合用药”等指的是两种或两种以上活性物质可以各自作为单一制剂同时地、或各自作为单一制剂以任何顺序依次地施用于受试者。

本文所述的“有效量”指的是包含足以预防或治疗医学病症的症状或疾病的量。在用于特定患者或医学受试者以后，可以产生以下变化：待治疗的病症、患者/受试者的总体健康情况得到改善。有效量还可以是至避免显著副作用或毒性作用的最大剂量以下的剂量方案。

实验材料

多纳非尼Donafenib，购自苏州泽璟生物制药股份有限公司；西达本胺Tucidinostat或Chidamide(购自MCE公司，HY-109015)；索拉非尼Sorafenib(购自MCE，货号Bay 43-9006)；仑伐替尼Lenvatinib(购自MCE，货号E7080)；瑞戈非尼Regorafenib(购自MCE，货号BAY73-4506)。

人源肝癌细胞PLC/PRF/5、HCCLM3、SNU449以及Hep1-6小鼠肝癌细胞，购自中科院上海细胞库。

实施例1

采用CCK8方法检测不同浓度西达本胺(0.5μMol/L、1μMol/L、2.5μMol/L、5μMol/L、10μMol/L、20μMol/L、40μMol/L)和多纳非尼(0.5μMol/L、1μMol/L、2.5μMol/L、5μMol/L、10μMol/L、20μMol/L、40μMol/L)对不同肝癌细胞系PLC/PRF/5和HCCLM3增殖影响，具体步骤为：将处于指数级增长期的PLC/PRF/5细胞(人源，上皮样贴壁生长)和HCCLM3(人源，上皮样贴壁生长)，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到96孔培养板中。在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，加入上述不同浓度的西达本胺和多纳非尼，分别作用48h后终止培养，每孔加入10μl CCK8(5mg/mL)，37℃避光孵育4h，在酶标仪450nm波长下测定细胞光密度值，并按照下式计算细胞生存率：

结果如图1中所示的。从图1a中可以看出，人肝癌细胞系HCCLM3和PLC/PRF/5中，西达本胺单药均显现出一定的抑制肝癌细胞增殖作用和抑制肝癌细胞活性的作用，且随着西达本胺浓度的增加，上述两种肝癌细胞系的细胞活性逐渐下降；其中，西达本胺单药引起人肝癌细胞系HCCLM3和PLC/PRF/5的IC50分别为15μM和25μM。从图1b中可以看出，人肝癌细胞系HCCLM3和PLC/PRF/5中，多纳非尼单药均显现出一定的抑制肝癌细胞增殖作用和抑制肝癌细胞活性的作用，且随着多纳非尼浓度的增加，上述两种肝癌细胞系的细胞活性逐渐下降；其中，多纳非尼单药引起人肝癌细胞系HCCLM3和PLC/PRF/5的IC50分别为10μM和8μM。

实施例2

采用同实施例1的CCK8方法检测多纳非尼单药、西达本胺单药及其联用组对人肝癌细胞系PLC/PRF/5和HCCLM3的抑制作用，具体步骤为：将西达本胺单药、多纳非尼单药及其联用组分别处理上述两种肝癌细胞系，测定其细胞活性。

表1图2中多纳非尼和西达本胺的浓度

结果如图2和图3中所示的。从图2中可以看出，在人肝癌细胞系HCCLM3及PLC/PRF/5中，多纳非尼和西达本胺联用组与单药相比，肝癌细胞的细胞活性明显下降，这说明多纳非尼和西达本胺的联用组与单药相比更能促进肝癌细胞的死亡。

进一步的，从图3中可以看出，联用组中随着多纳非尼剂量的增加，对上述两种肝癌细胞系的抑制功能也增强。说明在低剂量多纳非尼作用时，西达本胺即能够促进多纳非尼对肿瘤细胞的杀伤作用。

实施例3

采用流式细胞术检测凋亡细胞百分比，检测多纳非尼(5μMol/L)、西达本胺(5μMol/L)单药及其联用组(多纳非尼5μMol/L+西达本胺5μMol/L)对细胞凋亡的作用。具体步骤为：将处于指数增长期的PLC/PRF/5细胞(人源，上皮样贴壁生长)和HCCLM3(人源，上皮样贴壁生长)分别用多纳非尼、西达本胺以及联用组处理48小时后，收集上清；然后加入胰酶将细胞消化下来，随后与上清也混在一起；离心分离出细胞团块，PBS溶液清洗一遍；然后新鲜的PBS溶液重悬，将重悬液细胞计数，放置到EP管中(5x10⁵个细胞)；每个EP管中加入1μl的AnnexinⅤ溶液，处理1h后离心洗涤；然后每管加入1μl的PI溶液，5min后离心洗涤，PBS重悬后上机，结果如图4中所示的。此外，在光学倒置显微镜下观察培养基中细胞的生长情况，结果见图5。

通过图4中测试结果可以看出，分别经多纳非尼、西达本胺和联用组处理后的肝癌细胞的凋亡细胞百分比，联用组凋亡细胞百分数显著增加，并且在图4a中显示，**P<0.05vs对照组，***P<0.01vs多纳非尼组。

通过图5中的观察结果可以看出，联用组的培养基中贴壁细胞显著减少，大量凋亡细胞漂浮在上清中，表明了联用组与单药相比，能够引起更多的肝癌细胞凋亡。

实施例4

通过CCK8的方法，检测出西达本胺(5μMol/L)和不同浓度索拉非尼(2.5μMol/L、5μMol/L、10μMol/L)，西达本胺(5μMol/L)和不同浓度仑伐替尼(2.5μMol/L、5μMol/L、10μMol/L)，西达本胺(5μMol/L)和不同浓度瑞戈非尼(2.5μMol/L、5μMol/L、10μMol/L)相配伍对不同肝癌细胞系PLC/PRF/5和HCCLM3增殖影响。

具体步骤为：将处于指数级增长期的PLC/PRF/5细胞(人源，上皮样贴壁生长)和HCCLM3(人源，上皮样贴壁生长)，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到96孔培养板中；在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，加入不同浓度的西达本胺和肝癌分子靶向药物(索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼)，在分别作用一定时间(24h、48h、72h)后终止培养，每孔加入10μl CCK8(5mg/mL)，37℃避光孵育4h，在酶标仪450nm波长下测定细胞光密度值，并计算细胞生存率。结果见图6。

通过图6中的测试结果可以看出，西达本胺联合多种肝癌分子靶向药物可协同抑制肝癌细胞的生长。西达本胺分别与仑伐替尼、索拉非尼和瑞戈非尼联合处理肝癌细胞PLC/PRF/5，随着肝癌分子靶向药物的剂量增加，相同时间点的细胞活性逐渐下降，说明西达本胺可以与多种酪氨酸激酶联合用药。此外，在HCCLM3肝癌细胞系中的CCK8结果显示，西达本胺与仑伐替尼、索拉非尼和瑞戈非尼联合用药后，西达本胺增强了肝癌分子靶向药物对肝癌细胞的杀伤作用。可以看出西达本胺与不同肝癌分子靶向药物联合用药的效果均优于单药效果，其显著促进了肝癌分子靶向药物对细胞活性的抑制作用。

同时，对上述试验结果进行了联合指数分析，其中联合指数(CI)即两种药物抑制浓度的分式之和，其计算公式为CI＝C_50A/IC_50A+C_50B/IC_50B；

式中，C_50A和C_50B分别指A、B两种药物联用达到50％抑制时的药物浓度，IC_50A和IC_50B分别指单用某一药物达到50％抑制时的药物浓度。

当CI＜1时，则两药联用具有协同作用；当CI＝1时，则两药联用具有相加作用；当CI＞1时，则两药联用具有拮抗作用。

如下表2-表5中示出了西达本胺与多纳非尼、仑伐替尼、索拉非尼和瑞戈非尼联合用药72h后的联合指数分析结果：

表2西达本胺与多纳非尼联用72h后联合指数分析结果

Fractional effect

表3西达本胺与仑伐替尼联用72h后联合指数分析结果

Fractional effect

表4西达本胺与瑞戈非尼联用72h后联合指数分析结果

Fractional effect

表5西达本胺与索拉非尼联用72h后联合指数分析结果

Fractional effect

通过表2-表5中的结果可以看出，西达本胺与不同肝癌分子靶向药物联用后，其CI均＜1，说明西达本胺与不同肝癌分子靶向药物配伍后具有明显的协同效应，能够更好的抑制肝癌细胞的增殖或活性。

实施例5

采用细胞克隆实验检测西达本胺及其与多纳非尼联用组对不同肝癌细胞生长的影响。具体步骤为：将处于指数级增长期的SNU449、PLC/PRF/5和HCCLM3，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，取1000细胞接种到6孔培养板中；在培养箱中培养48h后，分别加入不同浓度多纳非尼单药、西达本胺单药及联用组，分别作用10天后终止培养，弃掉上清培养液，用PBS冲洗一次，加入0.25％结晶紫溶液，静置15min后用流水冲洗，待干拍照，然后进行克隆计数分析。结果见图7。

采用上述相同的步骤，采用细胞克隆实验检测将西达本胺与不同浓度的仑伐替尼，索拉非尼和瑞戈非尼配伍后，对肝癌细胞系HCCLM3增殖的影响。结果见图8。

通过图7和图8中的结果可以看出，西达本胺与多种肝癌分子靶向药物联用可协同抑制肝癌细胞生长。图7中的结果表明，在不同的肝癌细胞系中，联用组比单药更能抑制肝癌细胞的增殖，说明西达本胺与肝癌分子靶向药物的联用组可适用于多种类型的肝癌。图8中的结果表明，在HCCLM3肝癌细胞系中，西达本胺与不同肝癌分子靶向药物作为联用组处理，发现联用组均比单药处理更能够抑制肝癌细胞的增殖，从而说明西达本胺与多种肝癌分子靶向药物均具有很好的协同作用。

综上，西达本胺与多纳非尼的联合用药能够抑制不同肝癌细胞的增殖，说明其具有普适性。此外，西达本胺与其他肝癌分子靶向药物联用也可以有效的抑制肝癌细胞的增殖情况，说明其在临床上可以与多种肝癌分子靶向药物进行配伍。

实施例6

建立裸鼠肝癌PDX模型，具体步骤为：取手术切除新鲜肝癌组织(来源于安徽省立医院肝胆外科肝癌病人手术切除废弃标本，已签署知情同意)，经PBS/培养液清洗并修剪为直径2-3mm移植瘤块，P1代时将移植瘤种植于NSG小鼠四肢后侧(腋下及腹股沟处)，一般接种2-4个点；从P2代开始只接种一个点，左下肢腹股沟；传代时肿瘤大小应该在400-600mm³为宜；在P3代将肿瘤转移至裸鼠左下肢腹股沟，待肿瘤长至200mm³后分别给予对照溶剂、多纳非尼(10mg/kg)、西达本胺(10mg/kg)、多纳非尼(10mg/kg)联合西达本胺(10mg/kg)药物进行灌胃治疗，每周进行6次灌胃治疗，每5天监测肿瘤体积，20天后处死裸鼠，解剖并完整取出肿瘤后进行拍照，同时称量裸鼠体重、肿瘤质量及体积。结果如图9中所示的。

其中，图9a中示出了采用西达本胺单药、多纳非尼单药以及联用组后裸鼠人肝癌PDX肿瘤大体示意图，可以看出，联用组可显著抑制人肝癌PDX肿瘤的生长；图9b示出了裸鼠人肝癌PDX肿瘤连续体积测量曲线，可以看出，联用组相较于单药组能够更显著的抑制人肝癌PDX肿瘤的生长；图9c示出了裸鼠体重的变化曲线，可以看出，无论是单药组还是联用组对裸鼠的体重均无明显影响。

实施例7

将Hep1-6小鼠肝癌细胞种于10cm的培养皿中，待细胞融合度达到70-85％后消化细胞、离心，用PBS洗涤1-2次后用PBS重悬计数，最后需达到2×10⁶个细胞/150μl，用1ml细针注射器分别将150μl肝癌细胞注射至C57BL/6右侧腋窝。7d后分别给予对照溶剂、多纳非尼(10mg/kg)、西达本胺(10mg/kg)、多纳非尼(10mg/kg)联合西达本胺(10mg/kg)药物进行灌胃治疗，每周进行6次灌胃治疗，每5天监测肿瘤体积，20天后处死小鼠，解剖并完整取出肿瘤后进行拍照，同时称量小鼠体重、肿瘤质量及体积。结果如图10中所示的。

其中，图10a示出了小鼠(C57BL/6小鼠：免疫功能正常小鼠)肝癌细胞hep1-6来源的皮下瘤给予药物联合或单药处理的示意图，可以看出，联用组可显著抑制小鼠肝癌肿瘤的生长；图10b示出了小鼠连续肿瘤体积测量曲线，可以看粗，联用组能够更显著的抑制小鼠肝癌肿瘤的生长过程；图10c示出了小鼠体重的变化曲线，可以看出，无论是单药组还是联用组的小鼠体重均未见明显变化。

通过实施例6和实施例7的实验，表明多纳非尼和西达本胺联用组与单药相比可显著抑制肝癌的生长。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.联用药物组合物在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用，其特征在于，所述联用药物组合物含有西达本胺和肝癌分子靶向药物，所述肝癌分子靶向药物为多纳非尼、仑伐替尼、索拉非尼、瑞戈非尼中的至少一种；所述联用药物组合物中，所述西达本胺与肝癌分子靶向药物的质量比为1：1-4。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述西达本胺与肝癌分子靶向药物的质量比为1：1。

3.如权利要求1所述的应用，所述肝癌分子靶向药物为多纳非尼。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上任意可接受的载体和/或辅料。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中含有效量的西达本胺及有效量的肝癌分子靶向药物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述西达本胺的应用浓度为5μM，所述肝癌分子靶向药物的应用浓度为2.5μM、5μM或10μM。