CN100450545C - 肌肉生长抑制素在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肌肉生长抑制素在制备抗肿瘤药物中的应用。实验证明经Myostatin处理的人前列腺癌、宫颈癌、肺腺癌和肝癌等肿瘤细胞呈现出典型的凋亡细胞特性：1)具有Caspase活性的细胞的比例显著升高；2)Caspase 3和Caspase9被激活；3)细胞色素C由线粒体释放到胞浆中。因而可以Myostatin为活性成分制备抗肿瘤药物，该药物具有以下优点：1)疗效显著；2)安全性高；3)主要用药途径为口服，用药方便；4)Myostatin价格低廉，制备该药物的成本较低，从而可减轻病人的经济负担。本发明为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。

Description

肌肉生长抑制素在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及细胞因子的新用途，特别是涉及肌肉生长抑制素(Myostatin)在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤问题是当今科学界悬而未解的难题之一。肿瘤组织生长快速不受控制，能够侵袭或转移到任何其它器官并形成新的病灶，严重影响器官的正常生理功能，过快生长的肿瘤还能消耗营养与能量造成恶病质，并且容易复发，难以治愈。这些特性使得肿瘤成为当今威胁人们健康和生命的几大杀手之一。因此迫切需要能够杀死肿瘤细胞，并可治愈由肿瘤导致的涉及多器官和系统的疾病的药物。

细胞凋亡是指由基因严格调控的细胞自杀的过程。许多细胞就因丢失了正常的凋亡机制而不停生长，导致肿瘤形成。因此诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的关键。

人体内的细胞因子是指由机体各种细胞合成及分泌的具有多种生理活性并参与病理反应的小分子可溶性蛋白质，它们对于不同的细胞具有不同的生理功能。许多肿瘤细胞由于其内部的分析信号紊乱，都会特异性地高表达某些细胞因子，其中某种特定的细胞因子还会产生不同于正常细胞的反应。比如TGF-beta是一种在人体各种类型的组织细胞中都广泛表达的细胞因子，正常的上皮细胞的生长会受到TGF-beta的抑制，但上皮来源的肿瘤细胞非但不会受抑，外源加入TGF-beta还可能促进其生长，然而同样的处理却能导致肝细胞癌Hep3B凋亡。正因为细胞因子具有这种特性，理论上讲，我们就能应用某种特定的细胞因子来特异性地诱导某种肿瘤细胞凋亡，并使正常细胞不受影响，减轻病人的痛苦与身体其它系统的消耗。

1997年，McPherron等从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆到一个新基因，该基因编码由376个氨基酸残基组成的蛋白质(Mcpherron A C，L.A.M.，Lee S J(1997)Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member.Nature 387：83-90.)。蛋白质结构分析结果表明该细胞因子具有TGF-β超家族成员结构上共同的特点，因而将其列为TGF-β超家族中的一类新因子，即Growth andDifferentiation Factor-8(GDF-8)。GDF-8基因主要在骨骼肌中表达，该基因敲除鼠的骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上，因GDF-8对骨骼肌生长具有抑制作用，后将其正式命名为肌肉生长抑制素(Myostatin)。1998年，Gonzalez-Cadavid等克隆了人的Myostatin基因组基因，人Myostatin基因全长7.7kb，由3个外显子和2个内含子构成，内含子1和内含子2的长度分别为1.8kb和2.4kb，3个外显子编码的氨基酸序列长度分别为125aa，124aa和126aa(Gonzalez-Cadavid，N.F.，et al.(1998)Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men andHIV-infected men with muscle wasting.Proc Natl Acad Sci USA 95(25)：14938-14943.)。

利用基因敲除技术研究Myostatin基因的功能发现，纯合突变型小鼠的体重要比杂合体或野生型小鼠重约30％(与性别、年龄无关)。突变纯合体小鼠肩和臀部的肌肉明显肥大，移去皮肤发现整个身体的骨骼肌都比野生型的小鼠大很多，单块肌肉的重量约为野生型小鼠的2-3倍。研究这种突变型小鼠肌肉肥大的原因，发现既有肌细胞的增生(Hyperplasia)，也有肌纤维的肥大(Hypertrophy)，即“双肌现象”。同时，Myostatin功能丧失与双肌牛的关系也已被实验验证(Grobet et al.(1997)Adeletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype incattle.Journal 17(Issue)：71-74)。

2004年，英国科学家报道：一名出生不久的男婴大腿和上臂的肌肉都非常突出。在他四岁半时，已经可以平举3kg的哑铃了。经遗传学调查分析发现，编码Myostatin的基因在第一个内含子上由于剪接位点的突变(由GT//gtaagt突变为GT//gtaaat)导致mRNA不能正确剪接，产生无功能的Myostatin(Schuelke et al.(2004)Myostatinmutation associated with gross muscle hypertrophy in a child.Journal350(Issue)：2682-2688)。现有的研究结果表明Myostatin在人体中的作用与在鼠和牛中一样，抑制骨骼肌的生长发育。不仅如此，Myostatin在成体的骨骼肌中也持续表达，也同样能抑制成体肌肉的增生与肥大，甚至促进肌肉萎缩与消耗。有一项研究表明Myostatin基因的表达水平在由HIV感染引起的骨骼肌萎缩而消瘦的病人中高于正常人。

此外，经研究发现Myostatin还与脂肪代谢有关。Myostatin具有抑制前脂肪细胞分化的功能，这一调控过程可能与C/EBP-alpha和PPAR-gamma的信号传导有关；还发现Myostatin基因敲除小鼠表现出脂肪形成能力降低，最终导致瘦蛋白(Leptin)的分泌水平下降。

发明内容

本发明的目的是提供肌肉生长抑制素(Myostatin)的新用途，即在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的应用是以肌肉生长抑制素为活性成分在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述肌肉生长抑制素尤其适用于制备抗恶性肿瘤药物，如前列腺癌，宫颈癌，肺腺癌和肝癌等。

需要的时候，在本发明所述应用中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂及色素等。

本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成片剂、粉剂、粒剂、口服液、注射液、等多种药物形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

该药物的成人口服用量一般为400mg/kg/d，可以一次或多次使用，疗程为10至20天。

本发明提供了一种肌肉生长抑制素的新用途，即在制备抗肿瘤药物的应用。实验证明经Myostatin处理的人前列腺癌、宫颈癌、肺腺癌和肝癌等肿瘤细胞呈现出典型的凋亡细胞特性：1)具有Caspase活性的细胞的比例显著升高；2)Caspase 3和Caspase9被激活；3)细胞色素C由线粒体释放到胞浆中。因而可以Myostatin为活性成分制备抗肿瘤药物，该药物具有以下优点：1)疗效显著；2)安全性高；3)主要用药途径为口服，用药方便；4)Myostatin价格低廉，制备该药物的成本较低，从而可减轻病人的经济负担。本发明为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为添加Myostatin后Du-145、Hela和AGZY-83a贴壁细胞的生长情况

图2为不同浓度Myostatin下A549、AGZY-83a和HepG2细胞的凋亡比例

图3为利用DAPI染色法观察到的经Myostatin处理后凋亡肿瘤细胞的细胞核形态

图4A为经Myostatin处理不同时间后具有Caspase活性的细胞所占百分比的流式细胞仪检测结果

图4B为经Myostatin处理不同时间后具有Caspase活性的细胞所占百分比统计结果的柱状图

图5A为经Myostatin处理不同时间的Hela细胞的Caspase3激活情况的Westernblot检测结果

图5B为经Myostatin处理不同时间的Hela细胞的Caspase9激活情况的Westernblot检测结果

图6A为经Myostatin处理后的A549细胞线粒体及胞浆中细胞色素C的免疫荧光技术检测结果

图6B为经Myostatin处理后的Hela细胞线粒体及胞浆中细胞色素C的免疫荧光技术检测结果

图7为经Myostatin处理后的Hela细胞线粒体及胞浆中细胞色素C的Westernblot检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、观察Myostatin对肿瘤细胞生长情况的影响

以人前列腺癌细胞系Du-145、人宫颈癌细胞系Hela和人肺腺癌细胞系AGZY-83a为例观察Myostatin对肿瘤细胞生长情况的影响，实验方法为：将在相同条件下贴壁培养的Du-145、Hela和AGZY-83a细胞的培养液中添加Myostatin 1ug/mL，以PBS为对照，然后在相同条件下继续培养12h，观察细胞的生长情况。

培养结束后上述细胞的生长情况如图1所示(A.Du-145PBS组，B.Du-145Myostatin组，C.Hela PBS组，D.Hela Myostatin组，E.AGZY-83a PBS组，F.AGZY-83aMyostatin组)，添加Myostatin后，贴壁的Du-145、Hela和AGZY-83a细胞逐渐皱缩、脱壁，而对照细胞正常生长，表明Myostatin对肿瘤细胞具有杀灭作用。

实施例2、检测不同浓度Myostatin下肿瘤细胞的凋亡情况

以人肺腺癌细胞系A549、AGZY-83a和人肝癌细胞系HepG2为例检测不同浓度Myostatin下肿瘤细胞的凋亡情况，实验方法为：对在相同条件下贴壁培养的A549、AGZY-83a和HepG2细胞用流式细胞术结合Annexin V-FITC/PI荧光染色的方法进行活细胞计数，然后向培养液中添加不同浓度的Myostatin(对照、50、100、200、500、1000ng/mL)，再在相同条件下继续培养12h，培养结束后用相同方法对凋亡细胞计数，计算凋亡细胞的比例，其中流式细胞术结合Annexin V-FITC/PI荧光染色的细胞计数方法包括以下步骤：

1)消化及收集细胞：吸出培养液，由于死亡细胞已经悬起，因此将培养液一并转入离心管中(如吸出培养液体积较大，可用另一离心管保存。离心后同经胰酶消化的细胞合并)；分别加0.2％(W/V)胰酶消化2-3min，吸出胰酶(如悬浮细胞可省)；添加新鲜含15％小牛血清的RPMI-1640培养液(Gibco产品)，洗下细胞，转入离心管(如悬浮细胞可省)；4℃、1000rpm用大离心机离心10分钟；吸出培养液，再用冷无血清的培养液洗一次，转入EP管；4℃、1000rpm用小离心机离心10分钟。

2)Annexin V-FITC/PI荧光染色：将经步骤1)处理的细胞用结合缓冲液(10mmol/LHEPES/NaOH，pH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl₂)洗涤后再重悬于200μl结合缓冲液中；转移入流式管(每个时间点为双样品)，加入5μl Annexin V-FITC(购自北京宝赛生物技术有限公司)，室温下暗处放置10-15分钟；补加300μl结合缓冲液(可根据细胞密度，酌量加减结合缓冲液的添加量)；上流式细胞仪测定前1分钟加入5或10μl PI(购自北京宝赛生物技术有限公司)，然后用流式细胞仪对凋亡细胞进行计数(200-300细胞/秒)。

细胞凋亡比例的统计结果如图2所示，表明Myostatin可诱导肿瘤细胞凋亡，并呈现浓度依赖趋势，随Myostatin浓度升高，凋亡细胞的比例也逐渐增加。

实施例3、DAPI染色观察经Myostatin处理后凋亡细胞细胞核的形态

将在相同条件下贴壁培养的AGZY-83a、HepG2、A549和Hela的培养液中添加Myostatin 1ug/mL，然后在相同条件下继续培养12h，培养结束后用利用DAPI染色法观察经Myostatin处理后凋亡细胞细胞核的形态，染色方法如下：

先用与实施例2相同的方法用消化及收集细胞，然后对细胞进行固定及DAPI染色：用3.7％甲醛溶液悬浮细胞，冰上固定5分钟后，4℃、3000rpm离心10分钟；弃上清，将细胞沉淀用冷PBS洗涤，用0.2％(V/V)Triton在37℃下处理15分钟；再用冷PBS洗涤，加入DAPI染色液(将DAPI溶解于磷酸盐缓冲液中，工作浓度为1ug/mL)，4℃、3000rpm离心10分钟，弃上清；将细胞用封片剂悬起滴于载玻片上，盖上盖玻片，用指甲油封片，干燥后置于荧光显微镜下观察并拍照。

DAPI染色结果如图3所示(A.AGZY-83a，B.HepG2，C.A549，D.Hela；箭头指示的是凋亡细胞的细胞核)，表明Myostatin诱导凋亡的肿瘤细胞具有典型凋亡细胞的核形态。

实施例4、用流式细胞仪检测经Myostatin处理不同时间的Hela细胞的Caspase总活性变化情况

Caspase激活是细胞凋亡的标志事件之一，现用下述方法检测经Myostatin处理不同时间的Hela细胞的Caspase活性的变化情况，具体方法为：向贴壁培养的Hela的培养液中添加Myostatin 1ug/mL，然后分别培养12h、18h、24h、36h、48h，培养结束后用CaspACETM FITC-VAD-FMK In Situ Marker试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司)及流式细胞仪检测经Myostatin处理不同时间后具有Caspase活性的细胞所占的百分比。

经Myostatin处理不同时间后具有Caspase激活细胞所占的百分比如图4A所示，统计结果的柱状图如图4B所示(Control为对照)，表明经Myostatin处理后肿瘤细胞的Caspase总活性升高，具有凋亡细胞的特性，并呈现时间依赖趋势，随Myostatin作用时间延长，具有Caspase活性的细胞比例也逐渐增加。

实施例5、Western blot检测经Myostatin处理不同时间的Hela细胞的Caspase3和Caspase9的激活情况

研究表明，细胞发生凋亡时Caspase3和Caspase9将被激活，是细胞凋亡的标志物之一，现用下述方法检测经Myostatin处理不同时间的Hela细胞的Caspase3和Caspase9的激活情况，具体方法如下：

一、Caspase3的激活情况

向贴壁培养的Hela细胞的培养液中添加Myostatin 1ug/mL，然后分别培养12h、18h、24h、36h、48h，培养结束后用Western blot检测经Myostatin处理不同时间的Hela细胞的Caspase3的激活情况，一抗为Cleaved Caspase-3(Asp175)Antibody(购自Cell Signaling公司)，二抗为山羊抗兔的抗体(购自中杉金桥生物技术有限公司)。以β-actin为内参(一抗购自Santa Cruz生物技术公司；二抗为兔抗山羊抗体，购自中山金桥生物技术有限公司)。

经Myostatin处理24h、36h后的Western blot检测结果如图5A所示，表明Caspase3在用Myostatin处理24h、36h后的Hela细胞中被激活，进一步证明Myostatin可诱导肿瘤细胞凋亡。

二、Caspase9的激活情况

用与步骤一相同的方法检测经Myostatin处理不同时间的Hela细胞的Caspase9的激活情况，一抗为特异性识别人的全长和切割形式的Caspase 9的抗体(Caspase 9Abtibody(human specific)购自Cell Signaling公司)，二抗为山羊抗兔的抗体(购自中杉金桥生物技术有限公司)。以β-actin为内参(一抗购自Santa Cruz生物技术公司；二抗为兔抗山羊抗体，购自中杉金桥生物技术有限公司)。

经Myostatin处理12h、18h、24h后的Western blot检测结果如图5B所示，表明Caspase 9在用Myostatin处理24h后的Hela细胞中被激活，进一步证明Myostatin可诱导肿瘤细胞凋亡。

实施例6、检测经Myostatin处理后的A549和Hela细胞线粒体及胞浆中的细胞色素C

研究表明，细胞发生凋亡时线粒体中的细胞色素C释放到胞浆中，能够启动内源性的凋亡途径，并激活Caspase9。现用下述方法检测经Myostatin处理不同时间后的A549和Hela细胞线粒体中细胞色素C的释放情况，具体方法如下：

一、A549细胞线粒体及胞浆中细胞色素C的免疫荧光检测

向贴壁培养的A549细胞的培养液中添加Myostatin 1ug/mL，然后分别培养12h、18h、24h、36h、48h，培养结束后对A549细胞线粒体及胞浆中的细胞色素C(CytochromeC)进行免疫荧光检测，一抗为PURIFIED MOUSE ANTI-CYTOCHROME C MONOCLONALANTIBODY(购自BD公司)，二抗为FITC标记的山羊抗兔抗体(购自中杉金桥生物技术有限公司)。

经Myostatin处理24h、36h后的A549细胞线粒体及胞浆中的细胞色素C免疫荧光检测结果如图6A所示(图中A列为特异性标记线粒体的Mitotracker-Red，B列为FITC标记的细胞色素C，C列为细胞核的DAPI染色结果，D列为A和B叠加图，E为A、B和C的叠加图)，表明经Myostatin处理后A549细胞线粒体中的细胞色素C被释放到胞浆中，证明Myostatin可通过激活内源性途径诱导肿瘤细胞凋亡。

二、Hela细胞线粒体及胞浆中细胞色素C的免疫荧光检测

用与步骤一相同的方法检测经Myostatin处理后Hela细胞线粒体及胞浆中的细胞色素C进行免疫荧光检测。

经Myostatin处理24h后的A549细胞线粒体及胞浆中的细胞色素C免疫荧光检测结果如图6B所示(图中A列为FITC标记的细胞色素C，B列为特异性标记线粒体的MitoTracker-Red，C列为A和B叠加图，D列为细胞核的DAPI染色结果，E为A、B和D的叠加图)，表明经Myostatin处理后Hela细胞线粒体中的细胞色素C被释放到胞浆中，证明Myostatin可诱导肿瘤细胞凋亡。

三、Hela细胞线粒体及胞浆中细胞色素C的Western blot检测

用Western blot法对经Myostatin处理后Hela细胞线粒体及胞浆中的细胞色素C进行检测，一抗为PURIFIED MOUSE ANTI-CYTOCHROME C MONOCLONAL ANTIBODY(购自BD公司)，二抗为山羊抗小鼠的抗体(购自中杉金桥生物技术有限公司)。

经Myostatin处理12h、18h、24h后的Western blot检测结果如图7所示，经Myostatin处理24h后Hela细胞线粒体中的细胞色素C被释放到胞浆中，从而进一步证明Myostatin可诱导肿瘤细胞凋亡。

实施例7、毒性试验

1)一般毒性试验

采用猫和大鼠试验模型(购自军事医学科学院)，用猫(24只，雌、雄各半，体重2.4-3.7Kg，分为4组，每组6只，用药剂量分别为0.05、50、120mg/Kg)试验，观察Myostatin对血压、呼吸频率、心率等影响；用鼠(40只，雌、雄各半，体重18-20g，分为4组，每组10只，用药剂量分别为0.05、30、50mg/Kg)试验，观察Myostatin对大鼠自主活动情况的影响。试验结果表明，三个剂量的Myostatin对猫的血压、呼吸频率与幅度、心率、心律均无明显影响，对大鼠的自主活动次数也无明显影响。

2)急性毒性试验

采用小鼠试验模型(购自军事医学科学院)，昆明种小鼠(40只，分为空白对照组和Myostatin组，每组各20只)，一次最大灌胃口服给药量10.63g/Kg，相当于临床拟用量(3.75mg/Kg)的2834倍，观察28天，包括小鼠体重增减率、活动情况及死亡情况，试验结果如表1所示：

表1 Myostatin对小鼠的急性毒性试验结果

试验结果表明，一次灌胃口服最大给药量10.63g/Kg，相当于临床给药量的2834倍，但试验动物均未发生急性毒性反应，仅见雄性小鼠体重的增长率高于雌性小鼠，说明Myostatin的毒性很小。

3)长期毒性试验

采用大鼠试验模型，SPF级Wistar大鼠(购自军事医学科学院，176只，体重90-100g，分为空白对照组及Myostatin三个剂量组(93.75、187.5及375mg/Kg)，共四组，每组44只大鼠，空白对照组给予同剂量的生理盐水，每日灌胃给药一次，连服6个月，观察指标包括试验动物的一般生理指标及外周血相、血液生化、肝功、肾功等主要脏器器官指数及组织病理学检查检查等的变化，试验结果表明，大鼠口服不同剂量(93.75、187.5及375mg/Kg)的Myostatin，分别为临床用药量的25、50及100倍，连续给药6个月，未见各项指标异常，不同剂量组间也无明显差异(ρ＞0.05)，说明长期服用Myostatin是安全的，无毒性的累积效应。

Claims (1)

1、肌肉生长抑制素在制备抗前列腺癌，宫颈癌，肺腺癌和肝癌药物中的应用。

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