CN1384757A - 下调gdf－8活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过免疫接种抗生长分化因子8(GDF－8,氯化筒箭毒碱)的方法增加肌肉重量的新方法。影响免疫接种的优选方法是通过使用能诱导抗同源GDF－8抗体产生的GDF－8类似物。尤其优选的免疫原是通过引入一种或多种外源、免疫显性以及有前途的T细胞表位,同时保留同源GDF－8的三级结构的修饰的同源GDF－8。本发明还公开了抗GDF－8的核酸疫苗和使用活疫苗的疫苗,以及有利于接种的方法和手段。所述的方法和手段包括识别有用的免疫原性GDF－8类似物的方法,制备类似物和制药学配方的方法,以及核酸片段、载体、转化细胞、多肽和制药学配方。

Description

下调GDF-8活性的方法
发明领域
本发明主要涉及动物和禽类的养殖以及人类医药领域。特别是，本发明致力于改善调控和增加肌肉的生长，尤其是肉食饲养动物。因此，本发明提供了增加肉食动物肌肉生长的新方法和新手段。
发明背景
目前，有两种不同的医疗手段用于提高饲养动物的生长速度：一方面是给饲养动物使用抗生素或抗生素类化合物；另一方面是给予生长激素。
给饲养动物(尤其是猪)使用抗生素和抗生素类的化合物以促进其生长的方法近年来已引起了许多问题。这些化合物中有一些在化学结构上与治疗人类疾病所用的抗生素密切相关，已有越来越多的证据表明，饲养动物大量应用此类化合物会引起人类致病微生物对人用抗生素的交叉抗药性。而且，使用这些化合物只能取得约1-3％的相对较低的生长率提高。
饲养动物给予生长激素是非常昂贵的，由于生长激素的半衰期相对较短，因此必须在相当短的间期内重复使用这些激素。而且，由于经过该处理得到的动物肉中残留一定的生长激素，所以引起了欧洲的消费者的特别关注。GDF-8
GDF-8，或称氯化筒箭毒碱是1997年5月发现的，作为一种选择性下调平滑肌生长的生长调节因子(McPherron等，Nature，387，83-90，1997)。GDF-8的表达仅限于发育期胚胎体节的肌节腔隙，但在成年动物全身许多肌肉组织中也有表达。
GDF-8敲除小鼠表现平滑肌重量显著增加，平滑肌重量的增加广泛存在于机体各部分，从GDF-8阴性小鼠分离的肌肉重量比野生型小鼠的肌肉重约2-3倍还多。基因敲除小鼠的总体重比野生型小鼠约高35％，而缺乏GDF-8基因小鼠的肌纤维含量比正常小鼠高80％还多。然而，在基因敲除小鼠体内观察到的平滑肌重量明显增加不仅仅是因为其肌纤维数量的增多，还与其肌纤维明显肥大有关。GDF-8敲除小鼠的横切面肌肉面积按照肌肉类型的不同增加了约14-49％。
有趣的是，与成年非转基因鼠比较，成年转基因鼠的肌肉重量增加速率更快。而且，所有GDF-8阴性小鼠均可存活且能生育。
1997年11月，首次发现GDF-8的作者又发表了两种比利时蓝及皮埃蒙特牛，具有肌肉重量增加的显著特征，而其GDF-8编码序列是突变的，这正是它们肌肉增强的原因(McPherron及Se-Jin Lee，1997，PNAS 94，12457-12461)。这种“双重肌肉”(“double muscling”)的现象在过去190年中的许多头牛身上都发现过，这些动物的肌肉重量平均增加20-25％，其喂养效率也明显增加，但仍然产生高质量的牛肉。
然而与GDF-8敲除小鼠不同，比利时蓝牛的大多数其它器官的重量也减轻。这种“敲除牛”同样也有雌性生育能力降低，后代存活率降低以及性成熟延迟的问题。
“敲除牛”肌肉重量相对增加并不象在基因敲除小鼠身上观察到的那样明显，实际上，它与在小鼠身上观察到的肌肉肥大的程度相关。McPherron等推测一种解释可能是正常牛在经过选择饲养生育之后可能比鼠更接近于肌肉体积的上限(同样也更接近于肌纤维数目的上限)。并没有作者发表关于牛类肌纤维增生与肥大数量关系的资料，但基于这个假设以及在基因敲除小鼠身上观察到的肌肉肥大，在诸如比利时蓝牛身上观察到的肌肉重量及生长速率的提高很大程度上归因于肌肉肥大，而不是肌肉增生。GDF-8的生理功能
GDF-8的表达高度局限于骨骼肌。有脂肪组织中也有低水平表达，但值得注意的是在心肌中没有表达。在成年个体中GDF-8的生理功能仍不清楚，尽管看起来GDF-8可能作为骨骼肌生长的特异负调节因子在起作用。关于其生理功能的推测大都集中于其在诱导肌肉肥大的训练或在肌肉损伤后的再生中的重要作用。然而GDF-8也可能抑制脂肪组织的生长。至于GDF-8在动物生长过程中是局部还是全身性起作用仍不清楚。GDF-8的结构
GDF-8属于转化生长因子β(TGF-β)超家族，该家族包括一系列与胚胎发育有关的结构相关的蛋白。人及牛的GDF-8以长约375个氨基酸的前体蛋白形式存在。正如其他TGF-β超家族蛋白一样，GDF-8可能需经过蛋白水解产生一更短的约109个氨基酸的C末端片段，并由二硫键连接形成同源二聚体。该同源二聚体可能是GDF-8的生理活性形式。
小鼠、大鼠、人、狒狒、牛、猪、绵羊、鸡及火鸡GDF-8的氨基酸序列是已知的，而且GDF-8分子是高度保守的(McPherron及Se-JinLee，PNAS，94，12457-12461，1997)。小鼠、大鼠、人、猪、鸡及火鸡GDF-8的序列在C-末端区域是100％相同的，这个区域可能包含GDF-8的生理活性功能域。牛及绵羊的GDF-8与人的GDF-8在C-末端区域内仅有两个氨基酸残基不同。牛GDF-8在356-357位的序列为-Glu-Gly-，而不是-Lys-Glu-，而绵羊GDF-8则有两处保守的替代(在316位有一个Val，在333位有一个Arg，而不是Leu及Lys)。所有已知的GDF-8蛋白在它们的活性C-末端区域都不含有潜在的N-糖基化位点。
本发明目的
本发明的一个目的是提供一种重组治疗疫苗，它能够有效下调生长分化因子8(GDF-8)(也称作氯化筒箭毒碱myostatin)以增加饲养动物的肌肉生长率。另一个目的是提供一种免疫动物的方法以提高其肌肉生长速率。另外提供GDF-8的变异体也是一个目的，它能纠正抗自体GDF-8的自身耐受性。本发明的再一个目的是提供核酸片段，载体以及转化细胞，它们均可用于制备疫苗及GDF-8变异体。发明概要
鉴于以上关于转基因GDF-8敲除动物及比利时蓝以及皮埃蒙特牛所述的发现，本发明的发明者建立了如下理论：在动物中通过诱导一有效的高度协调的抗GDF-8的免疫应答以下调GDF-8活性是可能的。因此，本发明提供了一种最基本的方法和手段，它可以从免疫学角度下调GDF-8的活性，有效增加动物肌肉的重量。本方法与其它已知的促进饲养动物生长的方法相比有如下优点。首先，当使用本方法时，避免了微生物病原体的交叉耐受。其次，本方法处理的动物的肉中将不会残留外源给予的生长激素。最后，通过动物出生后(即仅在成熟个体)才下调其GDF-8水平，完全避免了喂养及生产诸如比利时蓝及皮埃蒙特牛(许多牛借助于剖腹产手术出生，且伴随其它器官体积减小)的伦理学问题。——实际上，肌肉重量增加的动物根本不必繁殖后代，因此本措施可以用于那些以肉食为目的的动物。
由于肌纤维的数量及类型在胚胎时期就已经确定了，所以一种抗GDF-8疫苗似乎不太可能增加成年饲养动物体内的肌纤维数量。因此抗GDF-8疫苗可以将GDF-8抑制至与GDF-8敲除动物一样的水平是极不肯定也不太可能的。这可能也不是我们所希望的，因为它有可能对肉的质量，饲养性能以及脂肪比例有负面影响。然而，由于注射疫苗后使动物出生以后肌肉肥大，使其生长速度和/或最大体重增加5-25％(一个看起来很有可能的数字范围)在牛、猪及家禽的肉类生产中仍是值得关注的。
GDF-8与其它TGF-β家族成员在氨基酸水平上的序列一致性仅占30-40％。这种较低的序列一致性将不会产生针对GDF-8诱导的抗体的交叉反应问题。
因此，就其本身最广泛及最普遍的范围而言，本发明涉及一种在动物，包括人类，体内下调生长分化因子8(GDF-8)活性的方法，该方法包括影响提呈至动物免疫系统的，免疫学水平上有效用量的
-至少一种GDF-8多肽或其亚序列(subsequence)，已经被制成制剂，使用该GDF-8多肽或其亚序列(subsequence)免疫动物诱导产生抗GDF-8多肽的抗体，和/或
-至少一种GDF-8类似物，其中在GDF-8氨基酸序列的至少一处修饰插入结果，导致用该类似物免疫动物时可以诱导抗GDF-8多肽的抗体产生。
依据本发明可以预计每年给动物注射1-4次免疫源性组合物将足以产生预期的效果，而应用生长激素和抗生素的动物则需要更多的使用次数。
本发明还涉及GDF-8类似物以及编码一系列这样的序列的核酸片段。包含类似物或核酸片段的免疫源性组合物也是本发明的一部分。
本发明还涉及一种识别免疫源上有效的GDF-8类似物的方法，以及制备含有GDF-8类似物组合物的方法。
图表说明：
图1：GDF-8来源的自身免疫构建模型。深灰色的伸展分别是将用P2及P30发生替代的部分。
A：P2表位插入的单体构建。“1”指P2替代了GDF-8的C-末端109个氨基酸片段的18-32位氨基酸残基，“2”指P2替代了GDF-8的C末端109个氨基酸片段的52-66位氨基酸残基，“3”指P2替代了GDF-8的C-末端109个氨基酸片段的83-97位氨基酸残基。
B：P30表位插入的单体构建。“1”指P30替代了GDF-8的C-末端109个氨基酸片段的第21-41位氨基酸残基；“2”指P30替代了GDF-8的C-末端109个氨基酸片段的第49-69位氨基酸残基；“3”指P30替代了GDF-8的C-末端109个氨基酸片段的第79-99位或第84-104位氨基酸残基。
C：P2及P30替代进入GDF-8的C-末端160个氨基酸片段的延伸单体构建。
D：两个GDF-8的C-末端109片段之间的P2及P30表位序列连接的二聚体构建。
图2：TGF-β蛋白的预计三维结构。该模型基于TGF-β蛋白的一个类似的结构域(TGJ-1)。β-片层用箭头表示，螺旋用圆柱体表示。
发明的详述
定义
接下来，为了明确该发明的公认范围，我们对本说明书和权利要求中使用的一些术语给予了详细的定义与解释。术语“T-淋巴细胞”和“T-细胞”对那些胸腺来源的淋巴细胞来说是可以互换使用的概念，这些淋巴细胞负责许多细胞介导的免疫反应，在体液免疫反应中起辅助作用。同样地，术语“B-淋巴细胞”和“B-细胞”对生成抗体的淋巴细胞来说是可以互换使用的。
这里的“GDF-8多肽”是指具有上述来源于许多动物的GDF-8蛋白的氨基酸序列(或其与完整GDF-8具有相同数量B细胞表位的缩短物)的多肽，该术语还包括与其他物种分离出的这两种蛋白的外源类似物相同氨基酸顺序的多肽。通常情况下，使用这个术语时是指其生物活性形式，例如，人类的C-末端肽具有109个氨基酸长度。原核系统制备的非糖基化形式的GDF-8也在本术语的范围之内，如由于使用酵母或其他非哺乳动物真核表达系统所产生的可变的O-糖基化的形式。然而，值得注意的是，当我们使用“一个GDF-8多肽”这一术语时，是指它通常对所要处理的动物是非免疫原性的。换句话说，GDF-8多肽是自身蛋白，或者是在一般情况下不会引起对GDF-8多肽产生免疫反应的自身蛋白的一种外源类似物。
一个“GDF-8类似物”是指一级结构已经发生改变的GDF-8多肽。这种改变可能例如，是以GDF-8多肽与合适的融合配体作用的融合形式(例如，一级结构上的一个改变，不包括C-末端和/或N-末端附加的氨基酸残基)和/或可能是在GDF-8多肽氨基酸序列中插入和/或缺失和/或替代的形式。术语“GDF-8类似物”还包括衍生的GDF-8分子，见下面对GDF-8修饰的讨论。
应该注意的是，人GDF-8的犬科类似物作为疫苗在人类使用时能够对GDF-8产生预期的免疫。这类外源类似物用作免疫反应也被认为是上述定义的“GDF-8类似物”的一种。
术语“多肽”在本文中不但指2～10个氨基酸残基的小肽、11～100个氨基酸残基的寡肽，还包括超过100个氨基酸残基的多肽。甚至也包括蛋白质，例如至少包括一个多肽的功能生物分子；至少有两个多肽组成的复合物，它们之间既可共价连接又可非共价连接。蛋白质中的多肽可以是糖基化和/或脂化和/或包括辅基。
术语“亚序列”(subsequence)表示任何至少三个氨基酸的连续片段或，相对应的，至少三个核苷酸，分别直接来源于天然存在的GDF-8氨基酸序列或核苷酸序列。
术语“动物”在本文中通常指一个动物物种(优选哺乳动物)，如人类、家犬等，并不指单个动物。然而，该术语也指这样一个动物品种的群体，因为根据本发明方法被免疫的个体实际上全部包含相同的GDF-8，使动物被相同的免疫原免疫是很重要的。例如，如果另外一个群体GDF-8发生遗传变异，为了打破这些群体对GDF-8的自身耐受性，在这些群体中就必须使用不同的免疫原。对于本领域技术人员来说，能够很清楚认识到在本文上下文中一个动物就是一个有免疫系统的生物。尤其是指脊椎动物，如哺乳动物。
至于“体内GDF-8活性下调”这个术语，在这里是指生物体中GDF-8和它的受体之间(或者GDF-8和该分子的其它可能的重要生物结合配体之间)相互作用的数目下降。下调通过几种机制实现：所有机制中最简单的就是通过抗体结合简单干扰GDF-8的活性位点。但是，抗体结合导致清除细胞(如巨噬细胞和其它吞噬细胞)清除GDF-8也在本发明的范围之内。
“影响提呈……给免疫系统”的表述意指动物的免疫系统通过可控制的方式被一种免疫原刺激。像下面的公开材料中出现的，这种免疫系统的刺激可受到多种方式影响，最重要的是用多肽“药物疫苗”(如用于治疗或减轻所患疾病的疫苗)或核酸“药物疫苗”进行接种。取得的重要成果是，动物中的合适免疫细胞以免疫学有效的方式接受抗原，而取得这样成果的精确模式与本发明中的创造性的方法相比就不那么重要了。
名词“免疫有效量”在本领域中有其通用意义，如，一定数量的免疫原能够诱导一种免疫反应，能够和与免疫原有共同免疫学特征的病原体发生显著的反应。
当使用GDF-8被“修饰”的表达时，这里意味着对构成GDF-8骨架的多肽进行化学修饰，这种修饰可以是GDF-8序列上这类氨基酸残基的衍生作用(如烷化作用、酰化作用、酯化等)，但是就如下面的公开的内容所提出的，优选的修饰包括GDF-8氨基酸序列一级结构的改变(或添加)，例如，那些通过改变一级结构产生GDF-8类似物的修饰作用。
讨论“GDF-8的自身耐受”时应该将其理解为：因为GDF-8在将被接种的人群中是一种自身蛋白，正常的个体不会增加对GDF-8的免疫反应性；尽管不能排除偶尔动物种群中某些个体能够产生天然GDF-8的抗体，如自身免疫紊乱的一部分。无论如何，一种动物通常只对自身的GDF-8产生自身耐受，但是也不能排除所述动物对其它物种来源的或具有不同GDF-8表型的该物种另一群体来源的GDF-8类似物的耐受情况。
“外源T细胞表位”(或者“外源T淋巴细胞表位”)是指能与MHC分子结合的肽，刺激动物种属的T细胞。该发明优选的外源T-细胞表位是“随意性”表位，例如，在一种动物种群中能够和特定类型MHC分子的实质片段结合的表位。只有非常有限的几个这样的表位被认识并将在下面详细讨论。应该注意的是，为了使根据本发明使用的免疫原在尽可能大的动物群中有效，有必要1)在相同的GDF-8类似物中插入几个外源性T细胞表位或者2)准备几种GDF-8类似物，其中每一种类似物有一种不同的随意性表位插入。还应该注意的是，外源性T细胞表位的概念也包括隐蔽性T细胞表位，例如，来源于自身蛋白的表位和当以分离形式而不是作为问题中自身蛋白的一部分存在时，才发挥免疫原行为的表位。
一种“外源T辅助淋巴细胞表位”(一种外源TH表位)是能结合MHC II分子，并且能被提呈在抗原提呈细胞(APC)表面与MHC II分子结合的外源T细胞表位。
一个生物分子“功能部分”在本上下文中意指能够负责整个分子的至少一种生化或生理功能的部分。众所周知，许多酶和其它效应分子都有一个活性位点来负责执行该分子的功能。分子的其它部分起稳定或者提高溶解性的作用，因此，如果这些作用与本发明的具体实例不相关的话，那么这些部分就可以略去。例如，在GDF-8分子中利用一些特定的其他细胞因子作为一种修饰部分是可能的(详述如下)，并且在这样一个实例中，稳定性问题就可以说是不相关的，因为和GDF-8的偶联已提供了稳定性。
术语“佐剂”在疫苗技术领域中有其通用意义，例如，一种物质或一种组合物1)本身不能对疫苗中的免疫原产生免疫反应，但是2)它却能增强对免疫原的免疫反应。或者，换句话说，仅用佐剂接种不能引起对免疫原的免疫反应，用免疫原接种也许会或者也许不会增强对免疫原的免疫反应，但免疫原和佐剂的联合接种会引起比单用免疫原强得多的免疫反应。
分子的“靶向”在本上下文中意指这样一种情形：引入动物的一种分子将优先出现在一定组织中，或与一定的细胞或细胞类型优先关联。这种效果通过许多方式获得：包括组合物易化靶向中的分子的配方或易化靶向基团分子的引入。这些将在下面详细讨论。
“免疫系统的刺激作用”意指一种物质或组合物表现出的一般的、非特异性的免疫刺激效应。许多佐剂和推定的佐剂(如一些细胞因子)都有刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激制剂的结果是提高了免疫系统的“敏感性”，这意味着与免疫原同时或随后使用诱导的免疫反应比单独使用免疫原要更有效。
GDF-8活性下调的优选方案
在本发明的方法中优选用作免疫原的GDF-8多肽是一种修饰的分子，其中在GDF-8氨基酸序列上至少存在一处改变，因为这一改变很大程度上促进了首要的GDF-8自身耐受打破的获得机会。需要指出的是，这并不排除在配方中使用这种修饰的GDF-8的可能性，该配方进一步促进了对GDF-8自身耐受的打破，如含有以下会详细讨论的的佐剂的配方。
有人指出正常个体中生理上存在潜在的自反应性B淋巴细胞识别自身蛋白(Dalum Iet.al，1996，J Immunol.157：4796-4804)。然而，为了诱导这些B淋巴细胞确实产生对相关自身蛋白反应的抗体，需要产生细胞因子的T-辅助淋巴细胞(TH-细胞或者TH-淋巴细胞)的帮助。一般来讲，这种帮助并不会发生，因为T-淋巴细胞一般不会识别抗原提呈细胞(APCs)提呈的来源于自身蛋白的T-细胞表位。但是，通过在自身蛋白上引入一个“外来”成分，(即通过引入一种免疫学上显著的修饰)，就会激活T细胞识别该外来成分，识别APC上的外来表位(例如，最初是一个单核细胞)。能够识别修饰的自身蛋白上的自身表位的多克隆B型淋巴细胞(它们也是特殊的APCs)也能够使抗原表现出来，随后提呈抗原的外源T-细胞表位，活化的T-淋巴细胞随后提供细胞因子，帮助这些自身反应的多克隆B淋巴细胞。由于这些多克隆B淋巴细胞产生的抗体可以与修饰多肽上的不同表位反应，包括天然多肽中存在的表位，因此可能诱发抗体与非修饰自身蛋白的交叉反应。总之，T-淋巴细胞似乎与多克隆B型淋巴细胞识别整个的外来抗原一样起作用，但实际上对宿主来说，仅有插入的表位是外源的。这样，诱导产生了能够与非修饰自身抗原交叉反应的抗体。
本技术领域中已经知道了几种为了克服自身耐受修饰肽自身抗原的方法。因此，本发明的修饰包括：
-引入至少一个外源T-细胞表位，和/或
-引入至少一个第一部分基团，影响修饰分子对抗原提呈细胞(APCs)的靶向作用，和/或
-引入至少一个第二部分基团，刺激免疫系统，和/或
-引入至少—个第三部分基团，优化修饰GDF-8多肽对免疫系统的提呈。
但是，所有这些修饰都应该在下述前提下进行，即：维持活化GDF-8中足够比例的初始B型淋巴细胞表位。因为，这样就提高了B型淋巴细胞对这些天然分子的识别。
在一个优选的实例中，以共价或者非共价的方式引入侧链基因(以外来T-细胞表位的形式或者上述第一、第二和第三部分基团形式)。这就表明来源于GDF-8的氨基酸残基支链衍生物并没有改变一级氨基酸顺序，或者说至少链上每个氨基酸之间的肽键没有发生改变。
另外一种优选的实例利用氨基酸替代和/或缺失和/或插入和/或增加(这可以通过重组或者多肽合成的方法实现。较长氨基酸链的修饰可以产生融合多肽)。本实例的一个特别优选的文本是WO 95/05849描述的技术，他公开了一种通过与自身蛋白类似物进行免疫反应以下调自身蛋白的方法，其中一些氨基酸序列已经被相应数目的含有一个外源免疫显性T-细胞表位的氨基酸序列取代，而同时又保存了类似物中自身蛋白的整体三级结构。基于本发明的目的，如果修饰(插入，增加，删除或者替代一个氨基酸)增加了外源T-细胞表位，同时又能保留一定数目的GDF-8中B-细胞表位就足够了。然而，为获得最大效率诱的导免疫反应，优选保留修饰分子中的整体三级结构。
下述通式描述了此项发明中涵概的GDF-8构建物：
MOD1)S1(GDF-8e1)n1(MOD2)S2(GDF-8e2)n2…(MODx)SX(GDF-8ex)nx(I)
-其中GDF-8e1-GDF-8ex是GDF-8亚序列包含的X个B细胞表位，互不依赖，或者相同，或者不同，或者含有外源侧链基团或者不含有外源侧链基团，X是≥3的整数，n1-nx是X个≥0(至少有1个，≥1)的整数，，MOD1-MODx是保守的B细胞表位中引入的X个修饰结构，S1-Sx是X个≥0的整数(至少一个是≥1，如果在GDF-8e序列中没有引入侧链基团的话)。因此，考虑到构建物免疫原性的一般功能的限制，本发明允许所有原始GDF-8序列的变换，以及所有的修饰。因此，本发明还包括了通过省略部分在体内具有相反作用基团的GDF-8序列修饰获得的GDF-8，或通过省略增加非预期免疫反应基团的GDF-8序列修饰获得的GDF-8。
可以有几种途径获得这里描述的修饰一种蛋白的足够比例的B-细胞表位或整体三级结构的保留。一种是简单制备直接抗GDF-8的多克隆抗血清(例如用兔制备的抗血清)，随后将这种抗血清作为一种检测试剂(例如用于竞争性ELISA)，检测生成的修饰蛋白。与GDF-8反应具有相同程度的抗血清反应的修饰产物视为与GDF-8具有相同的整体三级结构，然而与抗血清表现出有限的(但仍是显著并且特异的)反应性的类似物则视为保留了实质的原始B-细胞表位部分。
或者，可以选择性制备与GDF-8上独特表位反应的单抗，并将其作为检验模板。该方法有以下好处：1)可以给出GDF-8表位图谱，并且，2)制备的类似物上保持了表位图谱。
当然，另外一种方法能够解决GDF-8的三维结构或其具有生物学活性的截尾类似物(上述)，并将此与制备的类似物的三级结构进行比较。三维结构可以通过X-线衍射法和NMR光谱法获得。进一步与三级结构有关的信息，可以通过圆二色谱法在一定程度上获取，这种检验方法的好处是只需要纯化的多肽(X-线衍射法需要提供多肽晶体，而NMR光谱法需要提供多肽不同的同位素异构体)就可以获得检定分子的有关三级结构的有益的信息。然而，最终仍需用X-线衍射法和/或NMR光谱法给出结论性的数据，因为圆二色谱法只能通过二级结构成分的信息间接地给出正确的三级结构的证据。
本发明的一个优选的实例利用了GDF-8 B淋巴细胞表位的多重提呈(即公式I，其中至少一个B型细胞表位在两个位置存在)。这种作用可以通过不同的方法实现，例如，通过简单制备含有(GDF-8)m结构的融合多肽，其中m是≥2的整数，随后将这里讨论的修饰体导入至入一个GDF-8序列，或者插入至少两个GDF-8氨基酸序列间。优选导入的修饰体包括至少一个B-淋巴细胞表位的复制体和/或引入一个半抗原。
如上所述，引入外源T-细胞表位可以通过引入至少一个氨基酸插入、添加、缺失或者替代等方式完成。当然，通常情况下将在氨基酸序列中引入超过一处的改变(例如，完整T-细胞表位的插入或替代)，但是，要达到的重要目的是，当GDF-8类似物被抗原提呈细胞(APC)提呈时，增加了APC表面MCH II类分子上存在的外源显性T-细胞表位。因此，如果GDF-8氨基酸序列在合适位置上含有一些氨基酸残基，而这些氨基酸残基也存在于外源TH表位的话，那么，外源TH表位的引入可以通过氨基酸的插入、添加、缺失和替代等方法提供外源表位的氨基酸残基来完成。换言之，就是不需要用插入或者替代的方法引入一个完整的TH表位。
优选的氨基酸插入、缺失、替代或者增加的数目是至少2个，如3，4，5，6，7，8，9，，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20和25个插入、替代、增加或者缺失。更优选的是插入、替代、增加或者缺失的氨基酸数目不超过150个，例如最多100个，最多90个，最多80个，最多70个。更优选的的是，替代、插入、删除或增加的次数不超过60次，优选的次数是不超过50次甚至不超过40次。最优选的次数是不超过30次。需要指出的是，关于氨基酸增加的情况，如果产生的构建体是以融合多肽的形式存在，那么通常要远远大于150。
本发明优选的实例包括通过引入至少一个外源免疫显性TH表位的修饰方法。大家知道，一个TH表位的免疫显性问题依赖于所采用的动物种属。在此，术语“免疫显性”仅指该表位在接种个体体内能够产生显著的免疫反应，但是一个众所周知的事实是，TH表位在一个个体体内表现为免疫显性，但不一定在另一个相同种属体内表现为免疫显性，尽管这在后者个体中它可能与MHC-II分子结合。
另一重要的控制点是TH表位的MHC限制问题。总的来讲，自然产生的TH表位是MHC限制的，即：由一定的肽组成的TH表位只能与一种MHC II型分子亚型有效结合。相应的，这就会产生以下结果：大多数情况下使用一种特定的TH表位会产生一种疫苗成分，它只对整体中的某一部分有效，其效应依赖于这一部分的大小，因此有必要在同一个分子中尽可能多地包含TH表位，或者是制备多组分疫苗，其中的组分是GDF-8的变型，它们彼此之间由于引入的TH表位本质不同而不同。
如果所使用的T-细胞MHC限制性是完全未知的(例如所接种动物的MHC组成限定较差的情况下)，那么动物群体中被一种特定疫苗组分所覆盖的部分可以利用下述公式计算：
Figure A0081061400221
-其中pi是疫苗组分中存在的对第i个外源T-细胞表位起反应的群体频数，n是疫苗组分中外源T-细胞表位的总数。因此，一个含有3个外源T-细胞表位的疫苗组分，它们对群体的反应频数分别为0.8，0.7和0.6，会产生：
              1-0.2×0.3×0.4＝0.976
-即群体的97.6％在统计学上会参与MHC-II介导的疫苗的反应。
上述公式不适用于所使用多肽MHC限制方式已知的情形。举例如下：如果一个多肽，仅与HLA-DR等位基因DR1，DR3，DR5和DR7编码的MHC-II分子结合，那么将此肽与由HLA-DR等位基因编码的MHC-II分子的剩余部分结合的另一个多肽联合使用，将能达到对所讨论群体的100％覆盖。类似的，如果第二个肽仅与DR3和DR5结合，加入此肽根本不会提高覆盖率。如果我们将计算整体反应的基础仅仅定位于疫苗中T-细胞表位的MHC限制性上，那么一个特定疫苗组分覆盖的群体部分可以用以下公式进行计算：
Figure A0081061400231
其中，j是编码MHC分子的等位基因单倍型群体的频数总和，该分子能与疫苗中的任何一个T-细胞表位结合，属于3个已知HLA位置(DP，DR和DQ)中的第j个；在实际应用时，首先测定哪种MHC分子识别的疫苗中的每一种T-细胞表位，并将这些MHC分子按类型列出(DP，DR和DQ)-然后，将所列不同的等位单倍型每一反应频率按类型进行归纳加和，即可得到ф1，ф2和ф3。
公式II中的pi值有可能超过相应的理论值πi： π i = 1 - Π j = 1 3 ( 1 - v j ) 2 - - - ( IV )
其中，Vj是编码MHC分子的等位基因单倍型群体的频数总和，该分子能与疫苗中第i个T-细胞表位结合，属于3个已知HLA位置(DP，DR和DQ)中的第j个。这表明，在群体的1-πi中有一个效应子的反应频率是f残基I＝(pi-πi)/(1-πi)。因此，公式III可以调整为公式V：
其中，1-f残基I如果是负值就调整为零。需要指出的是，公式V要求所有的表位都需进行单倍型图谱确认，避免相同的单倍型。因此，在选择T-细胞表位以引入IL5类似物时，了解所有已知表位的情况十分重要，该表位是否：1)对群体中每一表位的反应频率；2)MHC限制数据，3)群体中相关单倍型的频率。
有时在一个动物种类或动物群体中的大部分个体中存在许多天然的“有前途的”活性T-细胞表位，优选将它们引入疫苗中，以降低对相同疫苗中大量不同GDF-8类似物的需求。
根据本发明所述，有前途的表位可以是自然产生的人T-细胞表位，如破伤风类毒素(例如，P2和P30表位)，白喉类毒素，流感病毒白凝素(HA)和P.falciparumCS抗原等来源的表位。当然，如果用在接种除人之外的其它动物时，应该有意利用自然产生的所述动物的有前途的T-细胞表位。
在过去的几年里已经识别了一些其它的有前途的T-细胞表位。特别是能够结合大部分由不同HLA-DR等位基因编码的HLA-DR分子的肽已经被识别，根据本发明，这些是引入所用的GDF-8类似物中所有可能的T-细胞表位。参看下列参考文献中所讨论的表位，以下文献在此引入以供参考：WO 98/23635(Frazer IH等，Queensland大学)；Southwood S等，1998，J Immunol.160：3363-3373；Sinigaglia F等，1988，Nature 336：778-780；Chicz RM等，1993，J Exp Med 178：27-47；Hammer J等，1993，Cell 74：197-203；和Falk K等，1994，Immunogenetics 39：230-242。以后的文献也涉及HLA-DQ和-DP配体。这5篇文章所列的所有表位都与本发明中所使用表位相关，是候选的天然表位，它们之间具有相同的操纵子。
另外，所述的表位可以是任何能够与大部分MHC II型分子结合的人工合成的T-细胞表位在此上下文中WO 95/07707以及相关的论文Alexander J等，1994，Immunity 1：751-761(这两篇公开本均在此引入以供参考)中描述的全部DR表位肽(“PADRE”)，按照本发明的观点，都是令人感兴趣的候选表位。需要指出，这些文章中公开的最有效的PADRE肽在C和N末端都具有D-氨基酸，以提高给药时的稳定性。但是，由于本发明主要定位于引入相关的表位，并作为修饰GDF-8的一部分，它随后在APCs的溶酶体内被酶降解，继之提呈给所述的MHC-II型分子，因此，在本发明使用的表位中整合入D-氨基酸并不合适。
一种优选的的PADRE肽具有AKFVAAWTLKAAA的氨基酸序列或者其免疫有效序列。该PADRE肽以及其它具有相同的MHC限制缺失的表位是优选的T-细胞表位，在该发明中应该在GDF-8类似物中存在。这种具有“卓越前途”的表位可以将本发明的最简单实例，其中仅有单个修饰的GDF-8，提呈给接种动物免疫系统。
如上所述，GDF-8的修饰也可以包括引入第一部分基团(firstmoiety)，它可以将修饰的GDF-8指引至APC或者B型淋巴细胞。例如，第一部分基团可以是B淋巴细胞特异表面抗原或APC特异表面抗原的特异结合配体。在本领域中许多这样的特异抗原已经被人所知。例如，这一基团可以是糖类，在B-淋巴细胞或者是APC上有其受体(如甘露聚糖和甘露糖)。或者是，第二部分基团是一个半抗原。同样能够特异识别APCs或者淋巴细胞表面分子的抗体片段也可以作为第一部分基团(例如表面分子可以是巨噬细胞和单核细胞的FC口受体，如FC口RI，或，另外任何一种其它特异表面标志物，像CD40或者CTLA-4)等。需要指出的是，所有举例的这些靶向分子同样都可以用做佐剂的一部分，参看以下。
为将修饰的GDF-8多肽靶向引至某些类型的细胞，增强免疫反应，作为一种替代或者补充，可以将上述提及的第二部分基团(secondmoiety)引进，刺激免疫系统，提高免疫系统的反应水平。该第二部分基团的典型例证是细胞因子和热休克蛋白，及其效应部分。
根据本发明，所用的合适细胞因子在疫苗组合物中通常应该具有佐剂的功能，即，例如，干扰素γ(IFN-γ)，Flt 3L，白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素4(IL-4)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素12(IL-12)，白细胞介素13(IL-13)，白细胞介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；另外，细胞因子分子的功能部分足以作为第二部分基团。关于细胞因子作为佐剂的用法，参考以下讨论。
根据发明，适于用作第二部分基团的热休克蛋白可以是HSP70，HSP90，HSC70，GRP94(也称为gp96，参考Wearsch PA等，1998，Biochemistry 37：5709-197)，和钙网硬蛋白CRT(calreticulin)。
另外，第二部分基团可以是毒素，如listeriolycin(LLO)，脂质A和不耐热肠毒素。而且，一些分支杆菌衍生物，像MDP(muramyl二肽)和海藻糖二酯TDM和TDE都是比较合适的候选物。
同时，引入第三部分基团(third moiety)，使其增加修饰GDF-8对免疫系统的提呈，也是本发明的一个重要实例。本领域的技术人员已经出具了这一原理的几个实例。例如，已知包柔氏螺旋体菌burgdorferi蛋白OspA上软脂酰脂化抗基可以用于提供自我辅助多肽(参考见WO 96/40718)。脂化蛋白质似乎形成了微团样结构，其核心由多肽的脂化抗基部分组成，分子的其他部分从此处突出，形成了抗原决定簇的多样呈现。因此，本发明实例优先使用了这种方法及其相关方法，采用不同的脂化抗基(如十四烷基基团，十四烷基基基团，法呢基基团，香叶基-香叶基基团，GPI-抗基和N-乙酰二甘油脂基团)，尤其是由于重组产生的蛋白质提供了脂化抗基，使这一方法更加直接，只需要利用诸如自然产生的信号序列作为融合配体用于修饰的GDF-8多肽。另一种可行的方法是利用补体因子C3的C3d片段或者是C3本身(参考Dempsey等，1986，Science 271，348-350。和Lou & Kohler，1998，Nature Biotechnology，16，458-462)。
本发明另一个实例，产生优化的多拷贝(≥2)GDF-8重要表位区域对免疫系统的提呈，是将GDF-8及其亚序列或者变异体通过共价或非共价键与一定的载体分子偶联起来。例如：可以使用聚合体，像糖类，如葡聚糖，参考见LeesA等，1994，Vaccine 12：1160-1166；LeesA等，1990，J Immunol.145：3594-3600，但甘露聚糖和甘露糖也是较好的替代品。像从大肠杆菌和其它细菌分离的膜嵌蛋白也是非常有用的结合体，传统的载体分子像匙孔碱血蓝素(KLH)，破伤风类毒素，白喉毒素和牛血清白蛋白(BSA)都是优选有用的结合体。
天然GDF-8的一定区域被认为非常适合进行修饰。有人推测，在GDF-8 C末端的下列亚序列的至少一处进行修饰都可以产生合适的免疫源分子：序列信号为11或12的残基18-41，49-69或79-104，或者不同来源的除了人，牛，猪，鸡或者火鸡相应亚序列。选择这些区域的理由是：a)B细胞表位的保守性；b)二级、三级和四级结构的保守性等。从任何角度上讲，正如此处所说，筛选一系列修饰的GDF-8分子(已经在不同位点引入T-细胞表位)都非常容易，用它们与天然GDF-8抗体进行免疫反应。优选的修饰是通过利用至少一个相等或不等长度含有外源TH表位的氨基酸序列替代原有氨基酸序列。这类构建物的理论基础在实例中有详细讨论。同样优选的还有在GDF-8片段的C末端的环区或者是游离末端(残基1-12，18-30，42-51，82-86和105-109)进行插入(或者替代)。
GDF-8以及修饰的GDF-8多肽的配制
当通过给动物使用GDF-8多肽或修饰的GDF-8多肽以观察其在动物免疫系统的呈现形式时，多肽的配制原则在本领域的技术人员中是公知的。
含有肽片段作为活性成分的疫苗的制备方法在本技术领域是已知的，如U.S.专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792及4,578,770，在此引入以供参考。通常，将此疫苗制备成溶液或混悬液以作注射剂用，也可将它制备成适合形成溶液或混悬液的固态。也可将它制成乳化剂。活性免疫成分通常与药物活性上可以接受并可共存的活性成分混合，适合的成分有，例如：水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物及其组合物。此外，如果需要的话，此疫苗可以含有少量的辅料如湿化或乳化剂、pH缓冲剂、或者增强疫苗效应的佐剂，参考以下关于佐剂的详细描述。
该疫苗通常通过消化道以外的其他方式给药，如通过注射，例如或者皮下注射，皮内注射，真皮内注射，真皮下或肌肉注射。适合其他给药途径的一些剂型包括栓剂和，在一些实例中，如：口服，口腔内(buccal)，舌下，腹膜内，阴道内，肛门，硬膜外，脊髓及颅骨内剂型。对于栓剂来说，传统的结合剂和转运载体包括，如，polyalkalene乙二醇或甘油三酯；这些栓剂由含0.5％到10％，优选1-2％活性成分的混合物形成。口服剂型包括一些常用的赋形剂如：甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。这些组分以溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉末的形式出现，其中含有10-95％，优选25-70％的活性成分。对于口服剂型来说，霍乱毒素是一种很有趣的剂型辅助剂(也可能作为一种结合辅助剂)。
多肽可以以中性或盐的形式配成疫苗中。药学上可接受的盐类包括酸添加盐(与肽的自由胺基形成)以及由无机酸如：盐酸或磷酸，或这样的有机酸如醋酸，草酸，酒石酸，苯乙醇酸等形成的盐。由自由羧基基团形成的盐类也可以来源于无机碱，如：钠，钾，铵，钙，或氢氧化三铁和这样的有机碱如异丙胺，三甲胺，2-乙胺基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。
这种疫苗通过与剂量配方相适应的途径给药，这种剂量将是治疗有效的和致免疫作用的。给药的剂量随着不同的治疗对象而有变化，包括，例如：能够产生免疫反应的个体免疫系统能力和预期的保护程度。合适的剂量范围是每一疫苗中的几百微克的活性成分，优选的范围是大约0.1μg～2000μg(甚至可以考虑1-10mg的更高的剂量范围)，如在0.5μg～1000μg之间，优选的范围是在1μg～500μg间，尤其是在10μg～100μg的剂量范围内。初始的给药途径及加强剂量的给药方案也会变化，但是通常在最初的给药途径后加以预防注射或其他给药途径。
应用方式可以有很大的变化。任何传统的疫苗给药方式都是可行的，其中包括口服给予生理可接受的固体碱或胶体溶液，胃肠外的注射液等等。疫苗的剂量依赖于用药的方法，根据接受疫苗接种的人的年龄以及抗原的配方的不同而变化。
疫苗中的某些多肽足以能够产生免疫反应，但是如果疫苗中加入一些佐剂，其他的一些多肽所产生的免疫反应会增强。
我们已经知道了许多不同的在疫苗中加入佐剂从而增强其作用的方法。一般的原则及方法在“佐剂的理论和实际应用”，1995，DuncanE.S.Stewart-Tull(ed.)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN0-471-95170-6中，以及在“疫苗：新的免疫佐剂的产生”，1995，Gregoriadis G等.(eds)，Plenum Press，New York，ISBN0-306-45283-9中，有详细的描述，这两份文献在此引入以供参考。
优选使用的佐剂是能够帮助消除对自身抗原而产生的自身耐受性；事实上，应用未经修饰的GDF-8作为自身疫苗的活性成分时必需要用佐剂。合适佐剂的非限定性实例选自基团包括免疫靶向佐剂；如免疫调节佐剂如毒素，细胞素和分枝杆菌衍生物；油剂；聚合物；微团形成佐剂；皂甙；免疫刺激复合基质(ISCOM Matrix)；微粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉和胶囊佐剂。总之，我们应注意到，上述公开涉及类似物中用作第一部分，第二部分和第三部分基团的化合物和试剂，是指它们在本发明疫苗佐剂中使用的mutatis mutandis。
佐剂的应用通常包括应用某些试剂，例如：氢氧化铝或磷酸铝，在缓冲盐溶液中一般加入0.05％到0.1％，并且与合成的0.25％的糖聚合物(如：卡波普)相混合，通过在70℃-101℃间加热3秒～2分钟的热处理将疫苗中的蛋白质聚集，也可以通过交联试剂达到此目的。也可应用以下方法聚集，将胰酶处理过的抗体(Fab片段)与白蛋白反应，将细菌细胞如C.parvum或革兰氏阴性菌内的内毒素或脂多糖成分相混合，用生理上可接受的油性载体进行乳化，如甘露醇单油酸酯(Aracel A)或者也可以应用20％Perfluorocarbon(Fluosol-DA)作为阻断取代物来进行乳化，也常与角鲨烯及IFA等油剂混合。
根据本发明，DDA(二-甲基二-十八烷基溴化铵)与DNA和γ-菊粉同样是一种有趣的佐剂候选物，但弗罗因德的完全和不完全的佐剂以及皂树皂苷如QuilA和QS21都是与RIBI相同的有趣的佐剂，此外，还有单磷酰酰脂A(MPL)，以上提过的C3和C3d，胞壁酰二肽(MDP)。
脂质体也有佐剂的作用，所以根据本发明常优选脂质体佐剂。
根据本发明也优先选用免疫刺激复合基质(ISCOM Matrix)佐剂，尤其是因为这种佐剂可以通过APCs来上调MHC II类的表达。ISCOM基质包含(随意分离)的皂皮树中的皂角甙(三萜烯酯)，胆固醇和磷脂。当与免疫激发蛋白相混合后形成的微粒制剂就是ISCOM基质，其中含皂角甙60-70％w/w，胆固醇及磷脂10-15％w/w，蛋白质10-15％w/w。关于免疫刺激复合物的具体组成成分和使用方法细节可以在上述关于佐剂的手册中查到，下列文献也提供了有关制备完全免疫刺激复合物的有用介绍：Morein B et al.，1995，Clin.Immunother.3：461-475，以及Barr IG和Mitchell GF，1996，Immunol.和Cell Biol.74：8-25(在此引入以供参考)
另外一种十分有趣的(因此，也是优选的)获得佐剂效果的方法是应用在Gosselin et al.，1992中描述的技术(在此引入以供参考)。简而言之，将抗原与单核细胞/巨噬细胞上的Fcγ受体的抗体(或结合于抗体片段上的抗原)结合后可以增强相关抗原如本发明抗原的提呈。抗原与抗FcγRI的结合尤其可以增加疫苗的免疫激发活性。
其它可能的佐剂包括使用上述靶向及免疫调节物质(如细胞因子)作为修饰GDF-8中一级及二级基团的侯选物。在连接过程中，也可以应用如Poly I：C的合成细胞因子诱导剂。
可以从包括胞质二肽，完全弗罗因德佐剂，RIBL和海藻糖二酯如TDM和TDE等基团中选择适合的分枝杆菌衍生物。
可以从包括CD40配体及CD40抗体或其特殊结合片段(参考上述讨论)，甘露糖，Fab片段，及CTLA-4基团中选择适合的免疫靶向佐剂。
可以从包括碳水化合物如葡聚糖，PEG，淀粉，甘露聚糖和甘露糖；以及含有塑料聚合物及胶乳(如胶乳珠)的团体中选择适合的聚合物佐剂。
另外一种调节免疫反应的方法包括在“人工虚拟淋巴结”(Virtual Lymph Node，VLN)(由Immuno Therapy，Inc.开发的一种医疗器械，360 Lexington Arenue，New York，NY 10017-6501)中的GDF-8免疫原(可与佐剂和药学上可接受的载体任意结合)。VLN(一种细管装置)能够模拟淋巴结的结构及功能，将VLN埋入皮下可产生富含细胞因子及趋化因子的无菌炎性区域。T细胞和B细胞以及APCs对危险信号快速作出反应，游走到炎症部位并且在VLN的多孔基质中聚集。我们已经知道应用了VLN后，为了对抗原产生免疫反应所需的抗原剂量减小，并且应用VLN进行的疫苗接种所产生的免疫保护作用超过了传统的应用Ribi作为佐剂的免疫化作用。该技术在Gelber C等人.1998.“使用名叫人工虚拟淋巴结的新医疗仪器对小量免疫原诱发出巨大的细胞和激素免疫反应”，“从实验到临床(From the Laboratoryto the clinic)，摘要手册，October 12th-15th 1998，SeascapeResort，Aptos，California”中有简单描述。
预期的接种应至少一年使用一次，如一年至少1，2，3，4，5，6，和12次。特别是，对一个有需要的个体来说，每年1-12次是可以接受的，如一年1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12次。以前曾有报道，根据本发明使用的优选自体接种诱导的记忆免疫并不持久，因此，免疫系统需要定期用类似物进行接种。
由于遗传差异，不同的个体对同一多肽产生的免疫反应强度会有差别。因此本发明中的疫苗包含几种不同的多肽，以增强免疫反应(同样参见上述提及的关于选择性引入外源T细胞抗原表位的讨论)。疫苗中可能包括两种或两种以上的多肽，其中所有的多肽上面已经介绍过。
所以，本疫苗中可能包括3-20种已修饰的或未修饰的不同多肽，如3-10种不同多肽。但通常多肽的种类将尽可能减少到1或2种。
核酸疫苗
作为传统多肽疫苗的替代品，核酸疫苗技术(亦称为“核酸免疫接种”、“遗传免疫接种”、“基因免疫接种”)具有一些优点。
首先，与传统的疫苗接种方法相比，核酸疫苗勿需大规模生产免疫原(如微生物工业发酵生产修饰的GDF-8)。其次，免疫原勿需仪器设备纯化和重折叠过程。最后，由于核酸疫苗依赖于被接种者自身的生化过程来产生引入的核酸的表达产物，表达产物会得到充分的翻译后加工，这对一点对自体疫苗而言尤其重要，因此，如上所述，在修饰分子中原来GDF-8 B细胞抗原表位中的重要组分必须保留，而且，原则上B细胞抗原表位可由任何(生物)分子(如糖类、脂类和蛋白质)中的某些部分组成。因此，免疫原的天然糖基化和脂化方式对其总免疫原性十分重要，而让宿主自行产生免疫原可以确保这一点。
由此，本发明的一个优选实例包括向动物细胞中导入编码修饰型GDF-8的核酸并在其中得以表达，进而影响免疫系统对修饰型GDF-8的抗原提呈过程。
在该实例中，导入的核酸优选是DNA，其形式可以是裸露的DNA、与带电荷或不带电荷脂类配方的DNA、脂质体中配方的DNA、病毒载体中的DNA、与转染易化蛋白或多肽配方的DNA、与靶向蛋白或多肽配方的DNA、与Ca2+沉淀剂配方的DNA、与插入载体分子偶联的DNA以及与佐剂配方的DNA。在上下文中值得注意的是实际上所有适用于传统疫苗配方的佐剂方法都适用于DNA疫苗配方。因此，这里公开的涉及对适用于多肽疫苗的免疫佐剂适用方法做了必要的修正，使之也适用于核酸疫苗技术。
前面已详细讨论过多肽疫苗的给药途径和给药方案，它们也同样适用于本发明中的核酸疫苗，并且已对其作了必要的修正，使之也适用于核酸疫苗。应该补充的是核酸疫苗也适于静脉或动脉给药。另外，本领域的技术人员都知道也可使用所谓的“基因枪”来给药，因此，这一点和相同的用药方法也被认为是本发明的一部分。最后，已有报道表明使用人工虚拟淋巴结(VLN)对核酸给药也可产生良好的效果，因此这种特殊给药方法尤其可取。
此外，作为免疫接种制剂的核酸可含有第1、2或(和)3种基团的编码区，如上面提到过的各种形式的免疫调节剂，其中细胞因子是一种有效的佐剂。该优选的实例包括抗原类似物和免疫调节剂各自的编码区有不同的读码框或者至少是受不同的启动子控制，这样可避免抗原类似物或者抗原表位与免疫调节剂表达为融合蛋白。另外，也可将这两种不同的核酸分开使用，但这种方法并不可取，因为当这两种编码区包含在同一核酸分子中时才可以保证共表达。
因此，本发明还涉及一种组合物，它可以诱导GDF-8抗体产生，该组合物包括：
-本发明的一段核酸片段或者载体(参见下面对载体的说明)。
-一种药学和免疫学上可接受的运载工具和/或载体和/或上面已
讨论过的免疫佐剂。
通常情况下，GDF-8变体的编码核酸以载体方式导入，其表达置于病毒启动子控制之下。本发明中对载体和DNA片段的详细说明请参见下面的讨论。另外，对核酸疫苗的制备和用法也有详细的公开说明，参见Donnelly JJ等人.1997，Annu.Rev.Immunol.15：617-648和Donnelly JJ等人.1997，生命科学(Life Science)60：163-172.这两篇文献在此引入以供参考。
活疫苗
第三种可影响修饰型GDF-8向免疫系统提呈过程的替代方法是使用活疫苗技术。在动物接种活疫苗时，通过给予用修饰型GDF-8编码核酸片段或携带该核酸片段的载体转化的非致病微生物，影响其对免疫系统的抗原提呈过程。非致病微生物可以是任何合适的减活菌株(可通过改变微生物侵入方式或利用重组DNA技术除去致病表达产物而减活)，例如，牛属结核分支杆菌BCG、非致病性链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌属、霍乱弧菌和志贺氏菌属等。有关活疫苗当前制备水平的综述请参见Saliou P，1995，Rev.Prat.45：1492-1496和WalkerPD，1992，Vaccine 10：977-990，这两篇文献在此引入以供参考。有关在这些活疫苗中所用的核酸片段和载体的细节请参见下面的论述。
作为细菌活疫苗的替代品，可以将下面论及的核酸片段整合到非致病性病毒疫苗载体如牛痘病毒株或者其他任何合适的痘病毒当中去，感染要接种的动物。
通常对动物一次性给予非致病性微生物或病毒即可，但在某些情况下为了维持保护性免疫，一生中需要不止一次给予微生物。在使用活疫苗或者病毒疫苗时仔细考虑采用类似前述多肽疫苗的免疫接种方案是有益的。
另外，接种活疫苗或者病毒疫苗前后可合并使用多肽疫苗和/或核酸疫苗。例如，初次免疫接种时用活疫苗或病毒疫苗，然后用多肽或者核酸疫苗进行强化免疫接种是可行的。
可以给微生物或者病毒转化含有第1、2或(和)3种基团编码区的核酸，如以上面提到过的免疫调节剂的形式，如细胞因子被认为是一种有效的佐剂。该实例的优选部分包括抗原类似物和免疫调节剂各自的编码区有不同的读码框或者至少是受不同的启动子控制。因此可避免抗原类似物或者抗原表位与免疫调节剂表达为融合蛋白。另外，这两种不同的核酸片段可以分别用于转化。当然，将第1和/或第2和/或第3种基团置于同一读码框中可以产生一种表达产物，即本发明的类似物，而根据本发明，这样的实例是优选的。
本发明方法在肉类生产和疾病治疗中的应用
正如以上所讨论的内容一样，本发明方法通过下调GDF-8活性刺激动物骨骼肌生长。因此，本发明下调GDF-8活性方法的一个重要方案包括增加动物骨骼肌质量的方法，该方法包括根据本发明方法将GDF-8活性下调至，与具有正常GDF-8活性的正常动物比较，骨骼肌质量具有统计学显著增加(达到95％可信限)至少5％的程度。
骨骼肌质量的增加可能会更高，如至少达到增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或甚至45％，参见在转基因小鼠和天然GDF-8缺陷鼠动物身上观察到的骨骼肌质量的增长。
肌肉质量可用该领域内任何方便的方法测定，如评估整个肌肉质量和/或相关肌肉质量。
抗GDF-8疫苗可能可用于特定人类疾病如癌症恶病质的治疗，此疾病已报道有肌肉萎缩现象，它在其他肌肉萎缩性疾病的治疗或改良中也具有可行性。最近有报道称GDF-8抑制有助于治疗急性和慢性心脏衰竭。
肽、多肽以及本发明的组合物
通过以上的叙述显而易见：本发明是基于个体对GDF-8抗原进行免疫以提高肌肉生长率。优选的获得这样免疫的方法是运用修饰的GDF-8，因此就提供了本领域先前未公开的分子。
一般认为本文讨论的修饰的GDF-8分子是其自身有创造性的，因此本发明的一个重要部分在于定位于来源于动物GDF-8的GDF-8类似物，其中GDF-8引入了一种修饰，从而导致用该类似物免疫动物得到的抗体能与未修饰GDF-8多肽链特异的作用。优选的，当使用修饰的GDF-8讨论本发明方法的不同技术方案时，该修饰特征符合上述的修饰类型。因此这里展示的任何与GDF-8分子有关的公开都与本发明描述GDF-8类似物的目的有关，任何公开都作了修订以描述这些类似物。
值得注意的是优选的GDF-8分子修饰体包括那些获得与GDF-8序列至少70％相同或其亚序列的氨基酸链长度至少10个氨基酸相同的肽链的修饰。优选更多的序列相同，如至少75％、甚至80％、85％相同的修饰体。核苷酸和蛋白质的序列同一性可以用如下公式计算：(Nref-Ndif)×100/Nref，其中Ndif表示两个序列在序列对比中不一致的残基数，Nref表示一个序列中的总残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的同一性(Ndif＝2 Nref＝8)。
本发明同时涉及对运用本发明的方法有用的组合物。因此本发明还涉及到作为一种免疫原组合物包括一种免疫有效数量的GDF-8多肽，该多肽是一种动物自身蛋白。所述GDF-8多肽与免疫学上可以接受的佐剂共同配方以阻断动物对GDF-8多肽的自体耐受性，该组合物还进一步包括药学和免疫学上可以接受的媒介和/或载体。换句话说，本发明的该部分涉及天然GDF-8多肽的制剂，GDF-8多肽已经在本发明方法的实例中有描述。
本发明还涉及免疫源组合物，包括上述免疫活性量的GDF-8类似物，所述组合物进一步包括药学和免疫学上可以接受的稀释液和/或媒介和/或载体和/或赋形剂以及佐剂。换句话说，本发明的此部分包括GDF-8修饰体的配方，其本质已在前面阐释。佐剂、载体以及媒介的选择已在前面有关经修饰或未经修饰的GDF-8制剂在本发明下调GDF-8方法有讨论。
本发明的多肽依据已知的方法制备。长些的多肽通常通过基因重组技术制备，包括将编码GDF-8类似物多肽的核酸序列导入一个合适的载体，然后用这个载体转染合适的宿主细胞，表达这段核酸序列，从宿主细胞或培养上清液中回收表达产物，后续纯化以及进行进一步的修饰如再折叠及衍生化作用。
稍短一些的肽优选通过已知的技术，如固相或液相多肽合成的方法来制备。然而，最近这方面技术已经发展到能够制备全长的多肽或蛋白质产品。因此，用合成方法制备长链结构也在本发明的范围之内。
本发明的核酸片段和载体
从以上的公开中可以知道：修饰的GDF-8多肽可以通过基因重组技术或化学合成或半合成来制备，当修饰位于与蛋白质载体(如KLH、白喉类毒素、破伤风毒素、BSA)和非蛋白质分子如碳水化合物聚合体偶联处时，后两种选择更适宜。同时，当修饰体包含在多肽衍生肽链上附加侧链基团时，后两种选择也是适宜的。
出于重组基因的目的，当然也是出于核酸免疫的目的，编码GDF-8修饰体的核酸片段是十分重要的化学产物。因此，编码GDF-8类似物的核酸片段也是本发明一个重要的组成部分，如一条由GDF-8衍生而来的多肽包括天然的GDF-8序列，经加入或插入融合部分，或者优选一条由GDF-8衍生而来的多肽，其中经插入和/或附加，优选经替代和/或删除方法导入一个外来的T细胞表位。本发明涉及到的核酸片段可以是DNA，也可以是RNA片段。
本发明的核酸片段通常被插入适宜的载体中以形成携带该核酸片段的克隆和表达载体；这样的新载体同时也是本发明的一部分。关于本发明这些载体构建将在下面有关转染细胞或转染微生物的篇幅中详细描述。依据应用的目的和类型的不同，载体可以是如下形式：质粒、噬菌体、粘粒、微染色体或病毒，同时，那些仅能在特定细胞中短暂表达的裸露DNA也是重要的载体。本发明中的优选的克隆和表达载体具有自主复制能力，因此它们能达到较高的拷贝数以获得高水平表达或亚克隆的高水平复制。
通常本发明的载体按5’→3’方向及可操作的连接具有以下基本特征：用于启动本发明中核酸片段表达的启动子、编码前导肽的核酸序列，以使多肽片段能够分泌(分泌到细胞外或者进入细菌周质)或整合到多肽片段的膜上、本发明中核酸片段、编码终止子的核酸序列。在生产菌株或细胞系中用表达载体时，应考虑到转染细胞的基因稳定性，优选的载体是当导入宿主细胞时是整合入宿主基因组中的载体。相反，当载体用于动物体内表达(如在DNA疫苗中使用载体)，出于安全的原因，优选的载体是不能整合入宿主细胞基因组的载体；通常在这种情况下使用裸DNA或非整合病毒载体。这些选择对于本领域的技术人员来说是已知的。
本发明的载体用于转染宿主细胞以产生本发明中的GDF-8多肽修饰体，这些经传染的细胞(也是本发明的一部分)可以是培养的细胞或细胞系，用于产生本发明的核酸片段和载体；或用于生产本发明重组的GDF-8多肽修饰体。另外，转染的细胞可以是合适的活疫苗菌株，其中的核酸片段(单拷贝或多拷贝)已经插入菌株，以此来影响GDF-8修饰体的分泌和整合入细胞膜或细胞壁。
本发明优选的转染细胞是微生物，例如：细菌(埃希杆菌如大肠杆菌、杆菌如枯草杆菌、沙门菌属、或分枝杆菌优选非致病菌株如M.bovis BCG)、酵母(如酿酒酵母)和原生动物。另外，转染细胞可以来源于多细胞生物体如霉菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。最近有研究显示利用可以商品化得到果蝇melanogaster细胞系(S2细胞系及载体系统可从Invitrogen公司买到)重组生产本发明的IL-5类似物，因此，优选利用这种表达载体也是本发明的目的。
出于克隆和/或优化表达的目的，优选的转染细胞是能复制本发明核酸片段。表达该核酸片段的细胞是本发明优选的有用实例；它们可以用来小量或大量制备GDF-8修饰体，或者对于非致病细菌，可以作为活疫苗的疫苗组成部分。
当利用转染细胞方法制备本发明的GDF-8修饰体时，表达产物无论是外排到培养基中还是转运到转染细胞表面都是十分方便的(尽管这并不是不可缺少的)。
如果鉴定了一个有效的生产细胞，在此基础上，优选建立一个携带本发明载体，表达编码GDF-8修饰体核酸片段的稳定细胞系。优选的，该稳定细胞系可以分泌或携带本发明的GDF-8类似物，因此可以有利于纯化。
通常，含有来源于与宿主细胞具有种属相容性种属的复制子和调控序列的质粒载体可以用于与宿主间连接。该载体通常携带一个复制位点及可以在转染细胞中提供表性选择的标志序列。如大肠杆菌通常用pBR322(来源于一个大肠杆菌种属的质粒)质粒转染(见，Bolivar等人.1997)。pBR322质粒含有氨苄抗性基因和四环素抗性基因，这就为鉴定转化细胞提供了方便简单的方法。pBR质粒或其他微生物质粒或噬菌体必须包含，或经修饰后含有，用于在原核生物中表达的启动子。
通常最多被用于重组DNA构建的启动子包括：β-内酰胺酶(青霉素酶)及乳糖启动子系统(Chang等人.1978；Itakura等人.1977；Goeddel等人.1979；)和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人.1979；EP-A-0 036 776)。虽然以上启动子通常是应用最多的，同时也发现和利用了其他微生物启动子，关于它们的核酸序列的详细资料均已发表，该领域熟练的技术人员能将其有效的与载体连接(Siebwenlist等人.1980)。来源于原核细胞的特定基因可以以自己的启动子序列在大肠杆菌中有效地表达，而不需要额外通过人工的方法加入其他启动子。
除了原核细胞，真核微生物如酵母也可以应用于这方面，在这里，启动子应该具有启动表达的能力。在真核微生物中，尽管也经常用到其他一些细胞株，但酿酒酵母和baker’s酵母是最常用的。对于在酵母中的表达，例如，质粒YRp 7是经常用到的，(Stinchcomb等人.1979；Kingsman等人.1979；Tschemper等人.1980；)这个质粒已含有tryl基因，它可以对不能在色氨酸中生长的酵母突变菌系提供一个选择标志，例如ATCC 44076号或PEP4-1(Jones，1977)。当酵母在缺乏色氨酸的环境中生长时，存在trpl损伤作为一个酵母宿主细胞基因组的特征，为探测转化提供了有效的环境。
在酵母载体中适宜的启动子序列包括3-磷酸甘油激酶启动子(Hitzman等人.1980)或其它甘油酶的启动子(Hess等人.1968；Holland等人.1978)，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖磷酸激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、；葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油醛变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶。在构建适宜的表达载体时，与这些基因相关的末端序列与序列3’端表达载体相连，提供mRNA的多聚腺苷酸化和终止信号。
其它具有被生长条件调控的转录活性的启动子包括以下启动子区：乙醇脱氢酶2、细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、上述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖、半乳糖利用的酶。任何包含酵母相容性的启动子、复制起点、以及终止序列的载体都是适合应用的。
除了微生物，从多细胞生物体分离得到的培养细胞也可被用作宿主。原则上，所有这样的细胞都是可用的，无论其来自于脊椎动物或非脊椎动物。然而，我们最感兴趣的是脊椎动物细胞，脊椎动物细胞培养增殖最近几年已有固定的方法(组织培养，1973)。这种宿主细胞的例子是VERO和HELa细胞、中国仓鼠卵巢细胞系CHO、W138、BHK、COS-7 293、果蝇melanogaster细胞和草地夜蛾(SF)细胞(完全的表达系统可以从蛋白科学(Protein Science)，1000 Research Parkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和Invitrogen购买)和MDCK细胞系。在本发明中，尤其优选的细胞系是S2细胞和SF21细胞购自invitrogene，PO Box 2312，9704 CH Groningen，The Netherlands。
细胞的表达载体一般包括(如果需要的话)：复制起点、位于要表达基因前面的启动子，以及必要的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点、转录终止序列。
当一个表达载体要用于哺乳动物细胞表达时，其控制功能序列常来自病毒。例如，通常的启动子来自多形瘤，腺病毒2，最经常的是来自猿猴病毒(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子尤其有用，因为二者作为一个片段均非常容易的从SV40病毒中获得，该片段也包含SV40病毒的复制起点。也可以使用更大或更小一些的SV40片段，只要其包括病毒复制起点上的HindIII位点到Bgl I位点的大约250bp的序列。而且，利用启动子或正常与期望基因序列相关的控制序列也是可能的，并且经常是期望的，只要这段调控序列能与宿主细胞系统相容。
复制起点既可以来自于构建的载体中包含的一个外源起点，如来自于SV40或其它病毒(如多形瘤，腺病毒，VSV，BPV)，也可以由宿主细胞本身的复制机制提供。如果载体被整合入宿主细胞染色体，仅用后者就足够了。
GDF-8类似物的鉴定
在本领域的技术人员都知道，并不是所有天然GDF-8的变体或修饰体在动物体内都能产生与天然形式有交叉反应的抗体。然而，建立一个高效的标准筛选方法来筛选具有免疫活性的GDF-8修饰体，以满足这里讨论的免疫反应的最小需要量并不难。因此，本发明的另一个方面涉及到鉴定GDF-8多肽修饰体的方法，该方法能够在动物体内诱导产生抗未修饰的GDF-8的抗体，其中未修饰的GDF-8是一种自身蛋白，筛选方法包括：-  通过多肽合成或基因工程的方法制备一系列彼此不同的GDF-8
多肽修饰体，其中的氨基酸被增加、插入、删除或者替代进入这些动物的GDF-8多肽氨基酸中，因此增加了该系列中的氨基酸序列，而这些序列具有与动物本身不同的T细胞表位，
-  检测这一系列成员的诱导动物产生抗未修饰GDF-8的抗体的能
 力；和
-  分离明显诱导动物体内抗未修饰GDF-8的抗体的系列成员。
 上文中“一系列彼此不同的GDF-8多肽修饰体”是指一系列不同一的修饰的GDF-8多肽，它们的选择基于上述标准(如与圆二色法、NMR光谱、和/或X-衍射成像研究结合)。这一系列可能只包含几个成员，但预期该系列可包含几百个成员)。
这一系列多肽可以通过体内方法“制备”一种可以使用的系统是制备编码这些成员的核酸片段，然后将此片段用于我们这里所描述的核酸免疫来检测表达产物是否具有免疫原性。因此，该系列成员的检测可以在体内进行，但也可以应用一些体外检测，这些方法缩小了修饰的GDF-8分子的数量，从而能够符合本发明的目的。
既然引入外源的T细胞表位是为了支持T细胞辅助的B细胞反应，首要决定条件是GDF-8修饰体能够诱导T细胞的增殖。T细胞的增殖可以在体外用标准的增殖实验来检测。简言之，富含T细胞的样品可以从受试者获得并随后培养保存。培养的T细胞与受试者的ARCs反应，该受试者以前曾接受过修饰的分子，将它提呈至T细胞表位。我们检测T细胞的增殖，与合适的对照比较(如培养的T细胞与曾经过完整，天然的GDF-8处理的APCs反应)。另外，可以通过检测T细胞识别外源T细胞时释放的相关细胞因子的浓度监测细胞的增殖。由于该系列至少有一种GDF-8修饰体能诱导抗GDF-8抗体产生的的高度的可能性，因此制备一种含有至少一种GDF-8修饰体多肽的免疫源组合物也是可能的，该多肽能诱导动物产生抗未修饰的GDF-8的抗体，其中该未修饰的GDF-8多肽是自身蛋白，该方法包括将能在动物体内显著诱导对抗GDF-8的抗体产生的该系列成员与合适的药学和免疫学上可以接受的载体和/或运载工具和/或稀释剂和/或赋型剂混合使用，选择性与至少一种药学和免疫学上可以接受的佐剂结合使用。
以上本发明的各个方面可以方便的通过以下方法实现：开始制备一定数量的彼此不同的本发明核酸序列和载体；将它们插入合适的表达载体；用载体转染适宜的宿主细胞；表达本发明所约定的核酸序列。接着可以分离表达产物。优选的核酸序列和/或载体是通过包括应用分子扩增技术如PCR或核酸合成方法制备的。
实施例的引言：
GDF-8的C端109个氨基酸残基与N端组氨酸尾巴形成的融合蛋白已经从大肠杆菌中表达得到，纯化的融合蛋白已经被用于免疫兔子。全长的GDF-8已在CHO中表达，可以分别以加工过的GDF-8二聚体和未加工过的GDF-8二聚体形式分泌(McPherron等人.自然杂志(Nature)387，83-90，1997)。因此，以下所讨论的GDF-8自体疫苗的结构是不存在问题的。最常应用于GDF-8自体疫苗构建的表达系统有大肠杆菌、酵母P.pastoris、CHO细胞、以及昆虫细胞如我们上面提到的果蝇细胞。
实施例一
疫苗设计
本发明的基本原则是用外源或人工合成的T细胞表位取代靶蛋白中氨基酸残基的侧链，如破伤风毒素T细胞表位P2和P30。优选的这些取代仅仅最低程度打乱了靶蛋白的三维空间结构。
这里所指的靶蛋白是指GDF-8 C端的109个氨基酸残基，其同源二聚体形式被认为是GDF-8的生物活性形式。GDF-8这一区域的三维结构目前仍未知，但根据同源TGF-β蛋白结构，单体GDF-8的模型见图2，此结构预期接近于真正结构。在野生型GDF-8模型中，α-螺旋呈现圆筒形，β-片层呈现箭型。半胱氨酸残基和相对应的二硫键在结构中位置很靠近。
值得注意的是在GDF-8 C端的109个氨基酸残基中有相对较多数量的半胱氨酸(9个)以及因此形成的二硫键，限制了外源T细胞表位所能处的可能的位置。
除了制备无替代的GDF-8 C端的109个氨基酸残基(即第1-10个序列号中残基267-375)，下列GDF-8自身疫苗结构也需指出：
GDF-8 P2-1(序列号15)：GDF-8 C端的109个氨基酸残基18-32被P2取代。
GDF-8 P2-2(序列号16)：GDF-8 C端的109个氨基酸残基52-66被P2取代。
GDF-8 P2-3(序列号17)：GDF-8 C端的109个氨基酸残基83-97被P2取代。
GDF-8 P30-1(序列号18)：GDF-8 C端的109个氨基酸残基21-41被P30取代。
GDF-8 P30-2(序列号19)：GDF-8 C端的109个氨基酸残基49-69被P30取代。
GDF-8 P30-3A(序列号20)：GDF-8 C端的109个氨基酸残基79-99被P30取代。
GDF-8 P30-3B(序列号21)：GDF-8 C端的109个氨基酸残基84-104被P30取代。
GDF-8二聚体(序列号22)：两个GDF-8 C端的109个氨基酸残基通过P2和P30表位共价键连接。换句话说，此分子包括两半，一半是GDF-8 C端的109个氨基酸残基的P2融合入其C端，另一半是GDF-8 C端的109个氨基酸残基的P30融合入其N端。
GDF-8 ext(序列号23)包括GDF-8 C端的160个氨基酸残基的第16-36残基被P30取代，第37-51残基被P2取代。这个结构是将GDF-8C端的109个氨基酸残基在它的N端都含有P2和P30表位。
在所有可以模仿的结构中，除了最后第二种，都是企图通过产生变体，其中以丝氨酸Ser取代半胱氨酸Cys 73，以避免通过二硫键形成二聚体。在GDF-8 ext中也企图在相应位置(即Cys 124→Ser124)实现类似的取代。
实施例2
体外模型
我们预期最初用上述纯化的GDF-8变体来免疫小鼠。在例如三次免疫以后，以未经修饰的GDF-8分子做抗原用ELISA方法测定。做这些预实验的主要理由是想证明AUTOVACTM技术可以用于产生抗GDF-8交叉反应自身抗体，更重要的是确定一个最佳剂量和免疫治疗方案。然而，利用当前技术不能产生抗GDF-8的抗体将是十分奇怪的，因为这一反应的基本免疫机制更象是与已经证实了的TNFα相同(WO98/46642及WO 95/05849)。
实施例3
体内模型
每组小鼠用实例1中描述的不同结构的多肽免疫，小鼠在第4周开始免疫，因为此时小鼠对疫苗具有可免疫性。实验要用到弗罗因德的完全佐剂，或者也可以用到类似AdjuphosTM的铝佐剂，该佐剂以前曾成功地应用于TNFα自身疫苗构建的混合物中。AdjuphosTM铝剂既可用于人类又可用于动物。在整个免疫阶段，要定期对GDF-8免疫的小鼠及对照组小鼠的体重进行监测。当小鼠接近16周龄时，处死并测定肌肉重量。
因为小鼠处于可免疫但又不是完全成熟的时期相对较短，在这些动物体内证明抗GDF-8的疫苗的效果可能十分困难。如果发生这种情况时，可以尝试用大鼠代替，或其它大点的动物如猪、牛等。
那些能够显著增加动物生长率和/或显著增加肌肉的最大重量的GDF-8修饰体可以选择性的用于向临床发展。
                                    序列表<110>M&E生物工程A/S<120>下调GDF-8活性的方法<130>AutoVacGDF-8 DK 1<160>23<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>375<212>PRT<213>人类<400>1Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile1               5                  10                  15Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
         20                  25                  30Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr
     35                  40                  45Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu
 50                  55                  60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu65                  70                  75                  80Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
             85                  90                  95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
        100                 105                 110Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu
    115                 120                 125Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130                 135                 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145                 150                 155                 160Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
            165                 170                 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
        180                 185                 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
    195                 200                 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210                 215                 220Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225                 230                 235                 240Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
            245                 250                 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
        260                 265                 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
    275                 280                 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
290                 295                 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305                 310                 315                 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
            325                 330                 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
        340                 345                 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
    355                 360                 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370                 375<210>2<211>362<212>PRT<213>Meleagris gallopavo<400>2Met Gln Ile Leu Val His Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro1               5                  10                  15
                                         -Thr Glu Asn Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg
         20                  25                  30Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu
     35                  40                  45Ser Lys Leu Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile
 50                  55                  60Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln65                  70                  75                  80Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp
             85                  90                  95Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser
        100                 105                 110Asp Phe Leu Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys
    115                 120                 125Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp
130                 135                 140Ile Tyr Leu Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile145                 150                 155                 160Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile
            165                 170                 175Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser
        180                 185                 190Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser
    195                 200                 205Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Asn Gly Arg Asp Leu
210                 215                 220Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu225                 230                 235  -              240Glu Val Arg Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly
            245                 250                 255Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro
        260                 265                 270Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro
    275                 280                 285Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe
290                 295                 300Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg305                 310                 315                 320Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn
            325                 330                 335Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro
        340                 345                 350Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
    355                 360<210>3<211>375<212>PRT<213>Gallus sp.<400>3Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile1               5                  10                  15Ala Val Asp Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn
         20                  25                  30Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr
     35                  40                  45
                                         -Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu
 50                  55                  60Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu65                  70                  75                  80Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
             85                  90                  95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
        100                 105                 110Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu
    115                 120                 125Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130                 135                 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145                 150                 155                 160Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
            165                 170                 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
        180                 185                 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
    195                 200                 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210                 215                 220Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Thr Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr225                 230                 235                 240Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg
            245                 250                 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
        260                 265          -      270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
    275                 280                 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
290                 295                 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305                 310                 315                 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
            325                 330                 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
        340                 345                 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
    355                 360                 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370                 375<210>4<211>376<212>PRT<213>小家鼠<400>4Met Met Gln Lys Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu1               5                  10                  15Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu
         20                  25                  30Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn
     35                  40                  45Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys
 50                  55                  60
                                         -Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln65                  70                  75                  80Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp
             85                  90                  95Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr
        100                 105                 110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe
   115                  120                 125Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser
130                 135                 140Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr145                 150                 155                 160Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg
            165                 170                 175Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser
        180                 185                 190Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp
    195                 200                 205Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu
210                 215                 220Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val225                 230                 235                 240Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val
            245                 250                 255Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp
        260                 265                 270Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr
    275                 280              -  285Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg
290                 295                 300Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln305                 310                 315                 320Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser
            325                 330                 335Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu
        340                 345                 350Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met
    355                 360                 365Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370                 375<210>5<211>375<212>PRT<213>Bos taurus<400>5Met Gln Lys Leu Gln Ile Ser Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile1               5                  10                  15Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
         20                  25                  30Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr
     35                  40                  45Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu
 50                  55                  60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu65                  70                  75                  80
                                         -Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gln Phe Asp Val
             85                  90                  95Gln Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
        100                 105                 110Ala Arg Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu
    115                 120                 125Thr Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130                 135                 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145                 150                 155                 160Arg Pro Val Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
            165                 170                 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
        l80                 185                 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
    195                 200                 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210                 215                 220Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225                 230                 235                 240Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys
            245                 250                 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
        260                 265                 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
    275                 280                 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
290                 295                 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305                 310                 315                 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
            325                 330                 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
        340                 345                 350Phe Asn Gly Glu Gly Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
    355                 360                 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370                 375<210>6<211>375<212>PRT<213>Ovis sp.<400>6Met Gln Lys Leu Gln Ile Phe Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Leu1               5                  10                  15Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
         20                  25                  30Val Glu Lys Lys Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Gln Asn Asn
     35                  40                  45Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile G1n Ile Leu Ser Lys Leu
 50                  55                  60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu65                  70                  75                  80Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
             85                  90                  95
                                         -Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
        100                 105                 110Val Thr Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu
    115                 120                 125Ala Glu Val Gln Glu Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130                 135                 140Lys Ile Gln His Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145                 150                 155                 160Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
            165                 170                 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
        180                 185                 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
    195                 200                 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210                 215                 220Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225                 230                 235                 240Phe Pro Glu Pro Gly Glu Glu Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
            245                 250                 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
        260                 265                 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
    275                 280                 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
290                 295                 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Leu Phe Leu Gln Lys305                 310                 315  -              320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala
            325                 330                 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
        340                 345                 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val
    355                 360                 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370                 375<210>7<211>376<212>PRT<213>褐鼠<400>7Met Ile Gln Lys Pro Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu1               5                  10                  15Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala
         20                  25                  30Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn
     35                  40                  45Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys
 50                  55                  60Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln65                  70                  75                  80Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp
             85                  90                  95Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr
        100                 105          -      110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe
    115                 120                 125Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser
130                 135                 140Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr145                 150                 155                 160Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg
            165                 170                 175Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser
        180                 185                 190Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp
    195                200                  205Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu
210                 215                 220Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val225                 230                 235                 240Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val
            245                 250                 255Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp
        260                 265                 270Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr
    275                 280                 285Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg
290                 295                 300Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln305                 310                 315                 320Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser
            325                 330                 335Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu
        340                 345                 350Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met
    355                 360                 365Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370             375<210>8<211>375<212>PRT<213>Sus scrofa<400>8Met Gln Lys Leu Gln Ile Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile1               5                  10                  15Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
         20                  25                  30Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Met Trp Arg Gln Asn Thr
     35                  40                  45Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu
 50                  55                  60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu65                  70                  75                  80Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
             85                  90                  95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
        100                 105                 110Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu
    115                 120              -  125Met Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130                 135                 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145                 150                 155                 160Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
            165                 170                 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
        180                 185                 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
    195                 200                 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210                 215                 220Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225                 230                 235                 240Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
            245                 250                 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
        260                 265                 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
    275                 280                 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
290                 295                 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305                 310                 315                 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
            325                 330                 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
        340                 345                 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
    355                 360                 365val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370                 375<210>9<211>374<212>PRT<213>Danio rerio<400>9Met His Phe Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala Cys1               5                  10                  15Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Ala His Gln Gln Pro Ser Thr
         20                  25                  30Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gln His
      35                 40                  45Ser Lys Leu Met Arg Leu His Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys
 50                  55                  60Leu Arg Leu Lys Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gln65                  70                  75                  80Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp
             85                  90                  95Val Leu Gly Asp Asp Ser Lys Asp Gly Ala Val Glu Glu Asp Asp Glu
        100                 105                 110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro
    115                 120                 125Ile Val Gln Val Asp Arg Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser
130                 135                 140Pro Lys Ile Gln Ala Asn Arg Ile Val Arg Ala Gln Leu Trp Val His145                 150                 155                 160Leu Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile Ser Arg
            165                 170                 175Leu Met Pro Val Lys Asp Gly Gly Arg His Arg Ile Arg Ser Leu Lys
        180                 185                 190Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Thr Ser Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys
    195                 200                 205Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gln Pro Glu Thr Asn Arg Gly Ile
210                 215                 220Glu Ile Asn Ala Tyr Asp Ala Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser225                 230                 235                 240Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys Ile
            245                 250                 255Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp
        260                 265                 270Glu Asn Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp
    275                 280                 285Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys
290                 295                 300Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Gln Lys Tyr305                 310                 315                 320Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly
            325                 330                 335Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe
        340                 345                 350Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val
    355                 360                 365Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370<210>10<211>375<212>PRT<213>狒狒hamadryas<400>10Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile1               5                  10                  15Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
         20                  25                  30Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr
     35                  40                  45Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu
 50                  55                  60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu65                  70                  75                  80Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
             85                  90                  95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
        100                 105                 110Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu
    115                 120                 125Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130                 135                 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145                 150                 155  -              160Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
           165                  170                 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
        180                 185                 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
    195                 200                 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210                 215                 220Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225                 230                 235                 240Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
            245                 250                 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
        260                 265                 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
    275                 280                 285Asp Phe Glu Ala Leu Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
290                 295                 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305                 310                 315                 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
            325                 330                 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
        340                 345                 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
    355                 360                 365
                                         -Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370             375<210>11<211>109<212>PRT<213>人类<220><22l>肽<222>(1)..(109)<223>与序列号1的残基267-375相同<400>11Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
 50                  55                  60Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly
             85                  90                  95Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>12<211>109<212>PRT<213>Bos taurus<220><22l>肽<222>(1)..(109)<223>与序列号5的残基267-375相同<400>12Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
 50                  55                  60Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Glu Gly Gln Ile Ile Tyr Gly
             85                  90                  95Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>13<211>15<212>PRT<213>破伤风梭菌<400>131               5                  10                  15<210>14<211>21<212>PRT<213>破伤风梭菌<400>14Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1               5                  10                  15Ala Ser His Leu Glu
         20<210>15<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><221>诱变剂<222>(18)..(32)<223>破伤风类毒素P2表位(序列号13)<220><221>相似<222>(1)..(17)<220><221>相似<222>(33)..(109)<223>与序列号1的残基299-375相同<220><221>位点<222>(73)<223>Cys or Ser<220><221>位点<222>(90)..(91)<223>Lys Glu or Glu Gly<400>15Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
 50                  55                  60Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly
             85                  90                  95Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>16<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><221>诱变剂<222>(52)..(66)<223>破伤风类毒素P2表位(序列号13)<220><221>相似<222>(1)..(51)<223>与序列号1的残基267-317相同<220><221>相似<222>(67)..(109)<223>与序列号1的残基333-375相同<220><22l>位点<222>(73)<223>Cys or Ser<220><221>位点<222>(90)..(91)<223>Lys Glu or Glu Gly<400> 16Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
 50                  55                  60Glu Leu Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly
             85                  90                  95Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>17<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><221>诱变剂<222>(83)..(97)<223>破伤风类毒素P2表位(序列号13)<220><221>相似<222>(1)..(82)<223>与序列号1的残基267-348相同<220><221>相似<222>(98)..(109)<223>与序列号1的残基364-375相同<220><221>位点<222>(73)<223>Cys or Ser<220><221>位点<222>(90)..(91)<223>Lys Glu or Glu Gly<400>17Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
 50                  55                  60Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
             85                  90      -           95Leu Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>18<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><221>诱变剂<222>(21)..(41)<223>破伤风类毒素P30表位(序列号14)<220><221>相似<222>(42)..(109)<223>与序列号1的残基307-375相同<220><221>相似<222>(42)..(109)<223>与序列号1的残基308-375相同<220><221>位点<222>(73)<223>Cys or Ser<220><221>位点<222>(90)..(91)<223>Lys Glu or Glu Gly<400>18Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
         20                  25          -       30Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
 50                  55                  60Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly
             85                  90                  95Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>19<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><221>诱变剂<222>(49)..(69)<223>破伤风类毒素P30表位(序列号14)<220><221>相似<222>(1)..(48)<223>与序列号1的267-314残基相同<220><221>相似<222>(70)..(109)<223>与序列号1的336-375残基相同<220><221>位点<222>(73)<223>Cys or Ser<220><221>位点<222>(90)..(91)<223>Lys Glu or Glu Gly<400>19Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
 50                  55                  60Ala Ser His Leu Glu Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly
             85                  90                  95Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>20<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><221>诱变剂<222>(79)..(99)<223>破伤风类毒素P30表位(序列号14)<220><221>相似<222>(1)..(78)<223>与序列号1的267-345残基相同<220><221>相似<222>(100)..(109)<223>与序列号1的366-375残基相同<220><221>位点<222>(73)<223>Cys or Ser<220><221>位点<222>(90)..(91)<223>Lys Glu or Glu Gly<400>20Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
 50                  55                  60Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Phe Asn65                  70                  75                  80Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser
             85                  90                  95His Leu Glu Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>21<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><221>诱变剂<222>(84)..(104)<223>破伤风类毒素P30表位(序列号：14)<220><221>相似<222>(1)..(83)<223>与序列号1的267-349残基相同<220><221>相似<222>(105)..(109)<223>与序列号1的371-375残基相同<220><221>位点<222>(73)<223>Cys or Ser<220><221>位点<222>(90)..(91)<223>Lys Glu or Glu Gly<400>21Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
 50                  55                  60Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro
             85                  90                  95Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Cys Gly Cys Ser
        100                 105<210>22<211>254<212>PRT<213>人工序列<220><221>相似<222>(110)..(124)<223>破伤风类毒素P2表位(序列号：13)<220><221>相似<222>(125)..(145)<223>白喉类毒素P30表位(序列号：14)<220><221>相似<222>(1)..(109)<223>人和牛GDF-8的109 C-末端残基
 (在序列号：1的残基267-375)<220><222>(146)..(254)<223>人和牛GDF-8的109 C-末端残基
 (在序列号：1的残基267-375)<220><221>位点<222>(90)..(91)<223>Lys Glu or Glu Gly<220><221>位点<222>(235)..(236)<223>与(90)..(91)相同<400> 22Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1               5                  10                  15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
         20                  25                  30Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
     35                  40                  45Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
 50                  55                  60Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65                  70                  75                  80Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly
             85                  90                  95Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser Gln Tyr Ile
        100                 105                 110Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe
    115                 120                 125Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu
130                 135                 140Glu Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys145                 150                 155                 160Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp
            165                 170      -          175Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys
        180                 185                 190Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln
    195                 200                 205Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met
210                 215                 220Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr225                 230                 235                 240Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
            245                 250<210>23<211>160<212>PRT<213>人工序列<220><221>诱变剂<222>(16)..(36)<223>破伤风类毒素P30表位(序列号：14)<220><221>诱变剂<222>(37)..(51)<223>破伤风类毒素P2表位(序列号：13)<220><221>相似<222>(1)..(15)<223>与序列号：1的残基216-230相同<220><221>相似<222>(52)..(160)<223>与序列号：1的残基267-375相同<220><221>位点<222>(124)<223>Cys or Ser<220><221>位点<222>(141)..(142)<223>Lys Glu or Glu Gly<400> 23Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Phe1               5                  10                  15Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
         20                  25                  30Ser His Leu Glu Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
     35                  40                  45Thr Glu Leu Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser
 50                   55                 60Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp65                  70                  75                  80Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly
             85                  90                  95Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val
        100                 105                 110His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr
    115                 120                 125Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile
130                 135                 140Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser145                 150                 155  -          160

Claims (52)

1.一种在体内下调动物包括人类生长分化因子8(GDF-8)活性的方法，所述的方法包括给动物免疫系统有效提呈免疫上有效数量的
-  至少一种GDF-8多肽或其亚序列，用GDF-8多肽或其亚序
列免疫动物能诱导产生抗GDF-8多肽抗体，和/或
-  至少一种GDF-8类似物，其中在GDF-8氨基酸序列上至少
引入一个修饰，使用该类似物免疫动物会诱导产生抗GDF-8多肽
的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对GDF-8氨基酸序列进行至少一个修饰产生的GDF-8类似物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的修饰的结果是保留GDF-8的B-细胞表位的实质部分和
-  至少引入一个外源T辅助淋巴细胞表位(TH表位)，和/或
-  至少引入一个第一部分基团，影响修饰的分子与抗原提呈细胞(APC)或B-淋巴细胞靶向作用，和/或
-  至少引入一个第二部分基团，激活免疫系统，和/或
-  至少引入一个第三部分基团，以更好地向免疫系统提呈被修饰的GDF-8多肽。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的修饰包括通过共价或非共价键与GDF-8或其亚序列上适宜的化学基团相连，引入作为侧基团的外源TH表位和/或第一和/或第二和/或第三部分基团。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述的修饰包括氨基酸的替代和/或缺失和/或插入和/或添加。
6.根据权利要求5所述的的方法，其中所述的修饰的结果是产生一个融合多肽。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述引入的氨基酸替代和/或缺失和/或插入和/或添加，其结果实质上是要保留GDF-8的整体三级结构。
8.根据权利要求2-7的任何一项所述的方法，其中所述的修饰包括复制至少一个GDF-8 B-细胞表位和/或引入一个半抗原。
9.根据权利要求3-8的任何一项所述的方法，其中所述的外源T-细胞表位在动物中是免疫显性的。
10.根据权利要求3-9的任何一项所述的方法，其中所述的外源T-细胞表位是混杂的，同自然混杂的T-细胞表位以及人工MHC-II结合肽序列一样。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的自然T-细胞表位选自破伤风类毒素表位如P2或P30，白喉毒素表位，流感病毒血球凝集素毒素，和P.falciparum CS表位。
12.根据权利要求3-11中的任一项所述的方法，其中所述的第一部分基团实质上是一个对B淋巴细胞特异的表面抗原或是对APC特异的表面抗原特异结合的配体，例如一个半抗原或是碳水化合物，在B淋巴细胞或APC上有一个它们的受体，如甘露聚糖或甘露糖。
13.根据权利要求3-12中的任一项所述的方法，其中所述的第二部分基团选自细胞因子，激素或热休克蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的细胞因子选自下列因子或是作为下列因子的有效成分：干扰素γ(IFN-γ)，F1t3L，白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素4(IL-4)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素12(IL-12)，白细胞介素13(IL-13)，白细胞介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；其中所述的热休克蛋白是从包括HSP70，HSP90，HSC70，GRP94和钙网硬蛋白(calreticulin(CRT))，或有效成分中选择。
15.根据权利要求3-14中的任一项所述的方法，其中所述的第三部分基团是脂质性质的，如棕榈酰基，肉豆寇基，法尼基，香叶-香叶基，GPI锚，以及一个N-乙酰双甘油酯基。
16.根据上述权利要求中的任何一项所述的方法，其中所述的GDF-8亚序列或GDF-8类似物来源于GDF-8的C末端，活性形式的GDF-8如亚序列或类似物可以选自牛，猪，人，鸡，羊或火鸡的GDF-8多肽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的GDF-8多肽可通过以下修饰：在序列号为11或12处的氨基酸序列至少有一个被一相同或不同长度的含有外源TH表位的氨基酸序列所替代；其中被替代的氨基酸序列包括序列号为11或12的残基1-12，18-41，43-48，49-69或79-104；或其中GDF-8多肽可由插入至少一个含有外源TH表位的氨基酸序列修饰，其中所述的插入在序列号为11或12中的位置1-12，18-30，42-51，82-86和105-109中的任一个进行。
18.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的对免疫系统的提呈是通过至少两份GDF-8多肽，或其亚序列或修饰的GDF-8多肽与一个可以有效地提呈多备份抗原决定簇的载体分子共价非共价相连拷贝来完成的。
19.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的给予动物以有效剂量的GDF-8多肽或GDF-8多肽类似物的方法选自肠道外途径，如真皮内，真皮下，皮内，皮下和肌内；腹膜；口服；口腔；舌下；硬脑膜；脊髓；肛门；和颅骨内。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的GDF-8多肽，其亚序列或其类似物的有效剂量为0.5μg到2000μg之间。
21.根据权利要求19或20所述的方法，包括每年服用GDF-8多肽或类似物至少一次，如每年至少2次，至少3次，至少4次，至少6次和至少12次。
22.根据权利要求19-21中的任何一项所述的方法，其中所述的GDF-8多肽，其亚序列，或GDF-8修饰体可选择性的与药学上及免疫学上可接受的载体和/或工具配方，也可与促进打破对自身抗原的自身耐受性的佐剂配方，如选自以下基团的佐剂包括免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂如毒素，细胞因子以及一种分支杆菌衍生物；油性制剂；聚合体；胶粒形成的佐剂；皂甙；免疫刺激复合物基质(一种ISCOM基质)；微粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉以及包裹佐剂。
23.根据权利要求20-22中的任一项所述的方法，其中所述的GDF-8多肽或类似物包含在一种虚拟淋巴结(VLN)装置中。
24.根据权利要求1-18中的任一项所述的方法，其中将编码修饰的GDF-8的核酸导入动物细胞以及由此获得的导入核酸在细胞内的表达影响所述的修饰GDF-8对免疫系统的提呈。
25.根据权利要求24所述的方法，其中导入的核酸选自裸DNA，DNA与带电荷或不带电荷的脂质形成的复合物，DNA与脂质体形成的复合物，病毒载体中包含的DNA，DNA与一种转染易化蛋白或多肽形成的复合物，DNA与靶向蛋白或多肽形成的复合物，DNA与钙沉淀试剂形成的复合物，DNA偶联于一种惰性载体分子，DNA与几丁质或脱乙酰几丁质形成的复合物以及DNA与一种佐剂形成的复合物。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述的核酸是通过动脉内，静脉内或权利要求19所述的方法给药。
27.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述的核酸包含于一种虚拟淋巴结(VLN)装置中和/或按照权利要求22所述的方法配制。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，包括每年给予至少一次核酸，如每年给予至少2次，至少3次，至少4次，至少6次以及至少12次。
29.一种以增加动物肌肉质量为目的方法，该方法包括依据权利要求1-28中任一项所述的方法下调GDF-8活性，与表现正常GDF-8活性的动物相比，使肌肉重量至少增加至5％的程度，如至少增加10，15，20，25，30，35，40及45％的情况。
30.衍生于动物GDF-8多肽的一种GDF-8类似物，其中引入一处修饰，该类似物免疫动物诱导产生抗GDF-8多肽的抗体，如权利要求1-18中的任一项所述的修饰。
31.一种免疫源性组合物，包括免疫有效量的某种动物自身的GDF-8多肽，该GDF-8多肽与一种免疫学上可以接受的佐剂一起配方以打破动物对GDF-8多肽的自身耐受性，该组合物还含有药学和免疫学上可以接受的的载体和/或工具。
32.一种免疫源性组合物包含权利要求29所述的一种免疫有效量的GDF-8类似物，该还含有制药学及免疫学上可以接受的的载体和/或工具以及适当的佐剂。
33.根据权利要求31或32所述的免疫源性成分，其中所述的佐剂选自权利要求22所述的佐剂群体。
34.根据权利要求29所述的编码GDF-8类似物的核酸片段。
35.一种携带根据权利要求34所述的核酸片段的载体，如一种能自主复制的载体。
36.根据权利要求35所述的载体选自质粒，噬菌体，粘粒，微染色体及病毒。
37.根据权利要求35或36所述的载体，包含，在5’→3’方向的可操作的连接上，一个启动子以启动权利要求34的核酸片段的表达，可选用的一段编码前导肽的，分泌或整合进入多肽片段生物膜的核酸序列，如权利要求34所述的核酸序列以及可选用的终止子。
38.根据权利要求41-44中的任何一项所述的载体，当导入宿主细胞时，或者可以整合进入宿主细胞基因组或者不能整合进入宿主细胞基因组。
39.根据权利要求37或38所述的载体，其中所述的启动子启动真核细胞或原核细胞内的表达。
40.一种携带权利要求35-39中任一项所述载体的转化细胞，如能复制权利要求34所述的核酸片段的转化细胞。
41.根据权利要求40所述的转化细胞，是一种微生物体，来自于细菌，比如埃希杆菌(优选大肠杆菌)，芽胞杆菌，沙门菌或分支杆菌(优选非致病性分支杆菌细胞，如M.bovis BCG)，酵母，原生动物或者来自于多细胞有机体的细胞如真菌，昆虫细胞如S2或SF细胞，植物细胞以及哺乳动物细胞。
42.根据权利要求40或41所述的转化细胞，能表达权利要求34所述的核酸片段，如在其表面分泌或携带权利要求30所述GDF-8类似物的转化细胞。
43.根据权利要求1-18任何一项所述的方法，其中给予携带编码及表达GDF-8多肽或类似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒会影响对免疫系统的提呈。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述的病毒是一种无致病力的痘病毒，如牛痘病毒，或其中所述的微生物是细菌，如权利要求41所述的细菌。
45.根据权利要求43或44的任何一项所述的方法，其中所述非致病性微生物或病毒单次给予动物。
46.一种诱导抗GDF-8抗体产生的组合物，该组合物包含：-  如权利要求34所述的核酸片段，或如权利要求35-39任一项所述的的载体，以及-  药学及免疫学上可以接受的载体和/或工具和/或佐剂。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述的核酸片段根据权利要求25或27配制的。
48.一种携带权利要求35-39任一项所述载体的细胞系，它表达权利要求34所述的核酸片段，在其表面选择性分泌或携带如权利要求30所述的GDF-8类似物。
49.一种制备根据权利要求40-42的任何一项所述的细胞的方法，该方法包括用权利要求34所述的核酸片段或权利要求35-39中任一个所述的载体转化宿主细胞。
50.一种鉴定修饰的GDF-8多肽的方法，该多肽可以在动物体内诱导抗非修饰GDF-8的抗体，该动物体内非修饰GDF-8多肽是自体蛋白，该方法包括：-  通过多肽合成或基因工程技术制备一系列各不相同的修饰的GDF-8多肽，其中将特定氨基酸添加，插入，缺失或替代入某种动物GDF-8多肽氨基酸序列，从而增加该系列含外源性T细胞表位多的氨基酸序列，-  检测该系列成员的诱导特定动物的抗未修饰GDF-8多肽抗体产生   的能力，以及-  分离可以显著诱导针对特定动物的抗未修饰GDF-8多肽抗体产生的该系列成员。
51.一种制备免疫源性组合物的方法，该免疫源性组合物包含至少一种修饰的GDF-8多肽，它可以诱导某种动物产生抗未修饰GDF-8的抗体，对这种动物来说未修饰GDF-8多肽是自体蛋白，该方法包括：-  通过多肽合成或基因工程技术制备一系列各不相同的修饰的GDF-8多肽，其中将特定氨基酸添加，插入，缺失或替代入某种动物GDF-8多肽氨基酸序列从而增加该系列含外源性T细胞表位多的氨基酸序列，-  检测该系列成员的诱导特定动物的抗非修饰GDF-8多肽抗产生的能力，以及-  将可以显著诱导某种动物产生可与GDF-8起反应的抗体的该系列成员与药学及免疫学上可以接受的载体和/或工具混合，可选用与至少一种药学及免疫学上可以接受的佐剂结合。
52.根据权利要求50或51指出的方法，其中所述的制备该系列成员包括制备各不同突变的核酸序列，每段序列都如权利要求34所指，将该核酸序列插入适当的表达载体，用该载体转化合适的宿主细胞并表达该核酸序列，接着分离该表达产物。
CN00810614A 1999-07-20 2000-07-20 下调gdf－8活性的方法 Pending CN1384757A (zh)

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