CN1294264C - 莫拉氏菌的高分子量的主要外膜蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种经分离和纯化的分子量约为200kDa的莫拉氏菌株、特别是粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质。这种约为200kDa的外膜蛋白质以及编码该物质的核酸分子在诊断应用和免疫原性组合物中很有用，尤其是对在体内向一个宿主给药从而保护其以防由细菌病原体引起疾病是特别有用的，其中的细菌病原体可以生产约为200kDa的外膜蛋白质或者可以生产一种能够在宿主体内诱导与约为200kDa的外膜蛋白质特异反应的抗体的蛋白质。
Description
发明领域
本发明涉及免疫学领域并且特别涉及莫拉氏菌属(Moraxella)的外膜蛋白质、其生产方法、编码这种蛋白质的基因及其用途。
参考的有关申请
本申请为1995年6月7日提交的美国专利申请08/478,370的共同未决的部分延续，而后者又为1995年5月1日提交的美国专利申请08/431,718的部分延续。
发明背景
中耳炎为一种幼儿最常见的疾病，在七岁之前所有儿童中约有70％都患过至少一次中耳炎。慢性中耳炎能够导致儿童的听力、语言和认识的损伤。这种疾病是由肺炎链球菌(大约50％)、不可分型的流感嗜血杆菌(大约30％)以及粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏球菌)(大约20％)的细菌感染引起的。仅在美国，每年治疗中耳炎所使用的抗生素以及诸如扁桃体切除、增殖腺切除和插入鼓室探查管的手术方法需花费10亿至20亿美元。由于中耳炎发生在一生当中语言能力快速发育的时间里，因此已有资料证明在频繁患中耳炎的青少年中存在与学习和听觉极其相关的发育不全。
粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)主要在呼吸道中定植且是占优势的粘膜病原体。采用由鼓室穿刺术(tympanocentesis)得到的中耳液的培养物进行的研究已表明粘膜炎莫拉氏菌引起大约20％的中耳炎(参考文献1-在本发明中，不同的参考文献均在圆括弧中表示，以便于更完整地描述与本发明有关的现有技术的状况。在本说明书的末尾、权利要求书之前即可以找到每篇引用文献的完整的提录信息。这些参考文献的公开文件插入本公开文本，仅供参考)。
由粘膜炎莫拉氏菌引起的中耳炎的发病率在不断地增加。由于已经研制了防止由肺炎链球菌和不可分型的流感嗜血杆菌引起中耳炎的方法，所以期望进一步引起中耳炎的粘膜炎莫拉氏菌的重要性增加。
粘膜炎莫拉氏菌也是成年人下呼吸道感染、尤其是慢性支气管炎和气肿开始时的重要病因(参考文献2，3，4，5，6，7和8)。粘膜炎莫拉氏菌也能引起儿童和成年人的窦炎(参考文献9，10，11，12和13)并且偶尔也能引
(c)编码如图6所示的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的DNA序列或其互补序列；以及
(d)在严格条件下，与在(a)、(b)或(c)中定义的任意一个序列发生杂交的核苷酸序列。
15.权利要求14的核酸分子，其中在(d)中定义的核苷酸序列与在(a)、(b)或(c)中定义的任意一个序列之间具有至少大约90％的序列相同性。
16.一种适用于转化宿主的，包括权利要求10或14的核酸分子的载体。
17.一种适用于转化宿主的，包括权利要求10或14的核酸分子的以及有效地偶联到该用于通过所说的莫拉氏菌株的外膜蛋白质或者该外膜蛋白质的片段或类似物的宿主表达的核酸分子上的表达工具。
18.权利要求17的表达载体，其中该表达工具包括一个编码用于从所说外膜蛋白质或者该外膜蛋白质的片段或类似物的宿主中分泌的前导序列的核酸部分。
19.权利要求17的表达载体，其中该表达工具包括一个编码用于从所说外膜蛋白质或者该外膜蛋白质的片段或者类似物的脂质化形式的宿主中表达的一个脂质化信号的核酸部分。
20.一种含有如在权利要求17中所要求保护的表达载体的转化宿主。
21.一种可以通过权利要求20的转化宿主生产的重组的外膜蛋白质或其片段或者类似物。
22.一种用于向宿主送递分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质或其片段或者类似物的活的载体，其中该活的载体包括一种含有权利要求10或14的核酸分子的载体。
23.权利要求21的活的载体，其中该载体选自由大肠杆菌、沙门氏菌、分枝杆菌、腺病毒、痘病毒、痘苗以及脊髓灰质炎病毒所组成的组中
24.一种具有不少于6个氨基酸且不多于150个氨基酸并且含有仅与通过SDS-PAGE测定分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质或该外膜蛋白质的片段或者类似物的部分对应的氨基酸序列的肽。
25.权利要求24的肽，其中所说的莫拉氏菌株为粘膜炎莫拉氏菌。
26.权利要求25的肽，其中所说菌株为粘膜炎莫拉氏菌4223。
27.权利要求24的肽，其中所说的肽具有粘膜炎莫拉氏菌株4223的氨基酸序列 NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-似物的核酸分子。由该核酸分子编码的蛋白质可以包括来自粘膜炎莫拉氏菌菌株4223的氨基酸序列NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys-x-Gln-Gly-Ile(SEQ ID NO：5)、其中的x特别为Lys(SEQ ID NO：10)的蛋白质或者含有来自其它莫拉氏菌株的相应氨基酸序列的蛋白质。
本发明的另一方面提供了一种经纯化和分离的具有选自由下面的序列组成的组中的序列的核酸分子：(a)如图6所示的DNA序列(SEQ ID Nos：1或2)或其互补序列；(b)编码约为200kDa的莫拉氏菌株的并且含有氨基酸序列NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys-x-Gln-Gly-Ile(SEQ ID NO：5)、特另是其中x为Lys(SEQID NO：10)的蛋白质的DNA序列(SEQ ID NO：10)或其互补序列；(c)编码如图6所示的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的DNA序列或其互补序列；以及(d)在严格条件下，与在(a)、(b)或(c)中定义的任意一个序列发生杂交的核苷酸序列。在(d)中优选定义的核酸与在(a)、(b)或(c)中定义的任意一个序列间至少具有大约90％的序列相同性。
本文所提供的核酸分子可以包括在一种适用于转化宿主的载体中。本文所提供的核酸分子也可以包括在适于转化宿主的表达载体中，其中的表达载体伴有有效地偶联到该用于由宿主表达约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质或者该外膜蛋白质的片段或类似物的核酸分子上的表达装置上。在本发明中包括了一种含有该表达载体的转化的宿主以及可以通过该转化的宿主生产的重组的外膜蛋白质或其片段或类似物。
该表达装置可以包括编码用于该外膜蛋白质或者该外膜蛋白质的片段或类似物从宿主中分泌的前导序列的核酸部分。该表达装置可以包括编码用于该外膜蛋白质或其片段或者类似物以脂质化形式在宿主中表达的脂质化信号的核酸部分。
本发明还包括一种用于送递本发明的外膜蛋白质或其片段或者类似物的活的载体，这种活的载体包括一种含有本文所提供的核酸分子的载体。上述活的载体可以选自由大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、BCG、腺病毒、痘病毒、痘苗以及脊髓灰质炎病毒所组成的组中。
本发明另一方面提供了一种具有不少于6个氨基酸且不多于150个氨基酸并且含有与本发明的外膜蛋白质或其片段或者类似物的仅一部分对应的氨基酸序列的肽。上述肽可以是一种具有粘膜炎莫拉氏菌4223菌株的氨基酸序列NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys-Lys-Gln-Gly-Ile(SEQ ID No：10)或者其它莫拉氏菌株对应的肽的氨基酸序列的肽。
本发明也提供了一种包括具有免疫有效量的活性组分以及该活性组分的药物可接受的载体的免疫原性组合物，其中的活性组分可以是本文所提供的外膜蛋白质或其片段或者类似物，核酸分子，重组的外膜蛋白质、片段或其类似物，活的载体和/或肽，从而当向宿主、其中的宿主可以是灵长类动物、特别是人类给药时产生免疫应答。
该免疫原性组合物可以配制成一种用于向宿主体内给药的疫苗从而保护其以防由细菌病原体引起疾病，其中的病原体可以产生约为200kDa的外膜蛋白质或者产生一种能够在宿主体内诱导与约为200kDa的外膜蛋白质特异反应的抗体的蛋白质。具体地讲，该细菌病原体为莫拉氏菌属的一个菌株、具体为粘膜炎莫拉氏菌。
该免疫原性组合物可以配制成一种微粒、胶囊、ISCOM或者脂质体制剂。该免疫原性组合物可以同用于向免疫系统的具体的细胞、诸如向粘膜表面送递的导向分子结合使用。一些导向分子包括维生素B12、如在WO 92/17167(生物技术澳大利亚Pty.有限公司)中所述的细菌毒素的片段以及如在美国专利5,194,254(Barber等人)中所述的单克隆抗体。本发明的免疫原性组合物(包括疫苗)还可以包括至少一种其它的免疫原性或者免疫刺激性物质并且该免疫刺激性物质至少可以是一种佐剂。
在本发明中使用的合适的佐剂包括(但并不限于)磷酸铝，氢氧化铝，QS21，Quil A，衍生物及其组分，ISCOM基质，磷酸钙，氢氧化钙，氢氧化锌，糖脂类似物，一种氨基酸的十八烷基酯，胞壁酰二肽，POLYPHOSPHAZENE，ISCOPREP，DC-chol，DDBA以及脂蛋白。在1994年6月16日提交的申请号为08/261,194以及1995年6月7日提交的申请号为08/483,856的已委托代理人的共同未决的美国专利申请中描述了佐剂的有益的组合并在本文中插入其公开文本仅供参考。本发明还包括一种对本文所提供的外膜蛋白质具有特异性的抗体，其中该抗体可以通过使用本文提供的免疫原性组合物免疫接种宿主而制备。
本发明另一方面提供了一种在宿主体内引起免疫应答的方法，该方法包括把本文所提供的免疫有效量的免疫原性组合物给药至该宿主。免疫应答可以是体液或者细胞介导的免疫应答。这种免疫应答可以保护宿主以防由细菌病原体引起的疾病，其中的病原体可以产生约为200kDa的外膜蛋白质或者产生一种能够在宿主体内诱导与约为200kDa的外膜蛋白质特异反应的抗体的蛋白质。具体地讲，该病原体为包括粘膜炎莫拉氏菌的莫拉氏菌属的菌株。进行了预防疾病保护的宿主包括灵长类动物，其中包括人类，
本发明另一方面还提供了一种生产疫苗的方法，该方法包括把本文所提供的免疫原性组合物向测试宿主给药以测定该活性成分给药的数量及频率，从而保护宿主以防由细菌病原体引起的疾病，其中的病原体可以产生约为200kDa的外膜蛋白质或者产生一种能够在宿主体内诱导与约为200kDa的外膜蛋白质特异反应的抗体的蛋白质，并且根据所说的经测定的给药量及频率以适于向一个治疗的宿主给药的形式和数量来配制该活性成分。具体地讲，该病原体为包括粘膜炎莫拉氏菌的莫拉氏菌属的菌株。治疗的宿主可以是人类。
本发明另一方面提供了一种测定在样品中编码通过SDS-PAGE测定分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质或其片段或者类似物的核酸分子存在的方法，该方法包括以下步骤：
(a)把该样品与本文所提供的核酸分子接触，从而形成包括该核酸分子和编码存在于该样品中的外膜蛋白质并且可以与上述核酸分子特异杂交的任意所说核酸分子的双螺旋；以及
(b)测定该双螺旋的形成。
本发明另一方面提供了一种测定在样品中与分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质特异反应的抗体存在的方法，该方法包括以下步骤：
(a)把该样品与本文所提供的外膜蛋白质接触，从而生成包括该外膜蛋白质和存在于该样品中可以与该外膜蛋白质特异反应的任意所说抗体的复合物；以及
(b)测定该复合物的生成。
本发明另一方面还提供了一种测定在样品中具有分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质存在的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使用本文所提供的免疫原性组合物免疫接种一个受试者，从而生成对该外膜蛋白质具有特异性的抗体；
(b)把该样品与该抗体接触，从而生成包括存在于该样品中的任意的外膜蛋白质和所说外膜蛋白质的特异抗体的复合物；以及
(c)测定该复合物的生成。
该外膜蛋白质可以是粘膜炎莫拉氏菌株的一部分。
在另一方面，本发明提供了一种用于测定样品中编码通过SDS-PAGE测定分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质或其片段或者类似物的核酸存在的诊断试剂盒，该试剂盒包括：
(a)本文所提供的核酸分子；
(b)用于将该核酸和样品接触、从而形成包括该核酸分子和存在于该样品中并且与该核酸分子可以杂交的任意所说核酸的双螺旋的装置；以及
(c)用于测定该双螺旋的形成的装置。
本发明另一方面提供了一种用于测定样品中可以与通过SDS-PAGE测定分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质特异反应的抗体存在的诊断试剂盒，该试剂盒包括：
(a)本文所提供的外膜蛋白质；
(b)用于将该外膜蛋白质和样品接触、从而生成包括该外膜蛋白质和存在于该样品中的任意所说抗体的复合物的装置；以及
(c)用于测定该复合物的生成的装置。
本发明也提供了一种用于检测样品中分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质存在的诊断试剂盒，该试剂盒包括：
(a)本文所提供的对约为200kDa的外膜蛋白质具有特异性的抗体；
(b)用于接触该抗体和样品、从而生成包括该外膜蛋白质和外膜-特异的抗体的复合物的装置；以及
(c)用于测定该复合物的生成的装置。
本发明另一方面提供了一种生产经分离和纯化的通过SDS-PAGE测定分子量约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供莫拉氏菌株的细胞群；
(b)破碎该细胞群，从而得到细胞裂解物；
(c)分级分离该细胞裂解物，从而得到含有该外膜蛋白质而基本上不含其它细胞裂解成分的部分，以及
(d)回收所说的外膜蛋白质。
细菌菌株可以为粘膜炎莫拉氏菌。该细胞裂解物可以通过凝胶电泳分级分离。
在本申请中，术语“约为200kDa的蛋白质”可以用于定义一族分子量介于约160kDa至230kDa之间的莫拉氏菌的外膜蛋白质并且包括在氨基酸序列中发生了变化的蛋白质，其中的变化包括在莫拉氏菌属的不同菌株中自然发生的变化。包括编码本发明的约为200kDa蛋白质的基因的经纯化和分离的DNA分子也包括那些编码约为200kDa蛋白质的功能类似物的基因。在本申请中，如果第一蛋白质在免疫学上与第二蛋白质有关和/或与第二蛋白质具有相同功能的话，那么第一蛋白质为第二蛋白质的一种“功能类似物”。例如这种功能类似物可以是该蛋白质的一个片段或者是其取代、添加、缺失突变体或者是和第二蛋白质的融合体，
本发明的优点包括：
—一种用于分离纯化的约为200kDa的莫拉氏菌株的外膜蛋白质的方法，其中的菌株可以生产上述外膜蛋白质，该菌株包括粘膜炎莫拉氏菌；
—一种编码约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的基因；
—一种可以从莫拉氏菌株分离的经分离和纯化的约为200kDa的外膜蛋白质；以及
—用于特异性鉴定莫拉氏菌以及由该菌感染的宿主的诊断试剂盒和免疫试剂。
附图的简要说明
图1A和1B表示通过SDS-PAGE进行的粘膜炎莫拉氏菌的细胞蛋白质的分析。在下面的实施例2中给出了泳道的鉴定以及蛋白质的来源。
图2表示通过SDS-PAGE分析来比较和分析来自许多粘膜炎莫拉氏菌株的细胞蛋白质并且该图表明在不同的莫拉氏菌株中约为200kDa的蛋白质的分子量的可变性。在下面的实施例4中给出了泳道的鉴定以及蛋白质的来源。
图3表示通过SDS-PAGE来分析经分离和纯化的约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质；
图4表示通过抗-肽抗血清特异地识别约为200kDa的外膜蛋白质。在下面的实施例8中给出了泳道的鉴定以及抗血清。
图5表示含有编码约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的基因克隆的限制性酶切图。采用阴影(shaded)的方框表示约为200kDa的外膜蛋白质的开放读框。限制性位点为Sal：SalI，N：NcoI，B：BglII，K：KpnI，Xh：XhoI，RV：EcoRV。
图6表示编码约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质基因的核苷酸序列(SEQ ID No：1-完整序列，SEQ ID No：2-编码序列)以及推导的氨基酸序列(SEQ ID No：3-鉴定的GTG起始密码子，SEQ ID No：4-推定的ATG起始密码子)。采用下划线标记肽1(SEQ ID No：11)和肽2(SEQ ID No：12)。
图7A为编码约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的基因(SEQID No：1)的限制性酶切图，该图表明单一切割的限制性酶。
图7B为编码约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的基因(SEQID No：1)的限制性酶切图，该图表明双重切割的限制性酶。
图8表示通过表达编码约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的C-末端截短的基因来鉴别GTG起始密码子。限制性位点为N：NcoI，K：KpnI，H：HindIII，Hp：HpaI，RV：EcoRV，Sal：SalI；
图9表示通过利用对约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的N-末端肽具有特异性的抗血清来鉴别GTG起始密码子。限制性位点为N：NcoI，K：KpnI，H：HindIII，RV：EcoRV，Sal：SalI；
图10表示通过抗肽血清来识别200kDa的蛋白质；
图11表示构建用于从大肠杆菌中表达约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的载体。Nco：NcoI，Pst：PstI，Pvu：PvuII，Sca：ScaI，Sal：SalI；
图12表示采用细菌噬菌体T7启动子在大肠杆菌中表达约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质N-末端截短形式；
图13表示在大肠杆菌中表达与LacZ-α-肽融合的约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质；以及
图14表示与其它的细菌相比，通过豚鼠的抗-200kDa的特异性抗血清来特异性地鉴定可以表达约为200kDa的外膜蛋白质的粘膜炎莫拉氏菌。在下面显示有对泳道和细菌的鉴定。
发明综述
参照图1A和1B以及图2来说明对分子量约为200kDa的来自粘膜炎莫拉氏菌不同菌株的新的外膜蛋白质进行的分离。表I表明在许多粘膜炎莫拉氏菌株中都存在这种约为200kDa的蛋白质并且特别是在从患有中耳炎的病人分离出来的菌株中几乎普遍存在上述蛋白质。图3表示经分离和纯化的外膜蛋白质。
纯化的蛋白质从凝胶中洗脱并用在豚鼠中生成抗体。该抗体特异性地仅仅识别可以生产该外膜蛋白质的粘膜炎莫拉氏菌的菌株(表I的下面)
参照图4表明通过在豚鼠中生成的抗体来识别约为200kDa的外膜蛋白质该抗体针对约为200kDa蛋白质的内部片段对应的合成肽。合成肽的氨基酸序列为NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys(SEQ ID No：6)。
参照图5表明含有编码约为200kDa的外膜蛋白质的基因克隆的限制性酶切图。在图5中，把约为200kDa的基因的开放读框显示成一个实心的方框并表示出GTG起始密码子。在图6中显示出编码约为200kDa的外膜蛋白质的基因的核苷酸序列(SEQ ID No：1和2)以及该蛋白质的推导的氨基酸序列(SEQ ID No：3)。在图7(A)和7(B)中显示出编码约为200kDa的蛋白质的基因的限制性酶切图。约为200kDa的蛋白质的氨基酸的组成示于表III中。
在本发明的一个实例中，本文所提供的经分离和纯化的约为200kDa的外膜蛋白质对生成可用于特异性地区分引起中耳炎和其它疾病的粘膜炎莫拉氏菌和其它的细菌病原体的抗体是很有用的。因此参照图14说明了表明豚鼠的单特异性抗-200kDa外膜蛋白质的抗血清的特异性反应的免疫印迹，其中抗血清是通过采用本文所提供的经纯化的约为200kDa的外膜蛋白质免疫接种小鼠而生产的。经分析细菌裂解物如下：
泳道 细菌 来源
1 分子量基准物
2 粘膜炎莫拉氏菌4223 中耳液
3 粘膜炎莫拉氏菌RH408 非丛生的菌株4223的变种
4 流感嗜血杆菌MinnA菌株 脑膜炎分离物
5 不可分型的流感嗜血杆菌SB12菌株 中耳炎分离物
6 不可分型的流感嗜血杆菌SB33菌株 中耳炎分离物
7 6型肺炎链球菌 ATCC 6306
8 14型肺炎链球菌 ATCC 6314
9 铜绿假单胞菌
10 大肠杆菌DH5α
图14中所示的结果清楚地表明本文所提供的外膜-特异性抗血清在区分产生具有相似临床症状的疾病的细菌病原体中的用处。
本发明另一方面提供了一种抗莫拉氏菌的疫苗，该疫苗包括免疫有效量的本文所提供的外膜蛋白质及其生理可接受的载体、这种外膜蛋白质也可以用作半抗原、多糖或者肽的一种载体蛋白质，从而制成一种抗与约为200kDa的外膜蛋白质无关的抗原决定簇的缀合疫苗(conjugatevaccine)。
本文所提供的约为200kDa的外膜蛋白质可以用作一种诊断试剂、一种制备抗-外膜蛋白质的抗体的抗原或者一种用于接种疫苗以防由莫拉氏菌引起的疾病或检测由莫拉氏菌感染的抗原。
在本发明另外的实例中，本文所提供的约为200kDa的外膜蛋白质可以用作一种载体分子，从而制备出抗包括荚膜化细菌在内的病原体细菌的嵌合分子以及缀合疫苗(包括糖缀合物)。因此，例如本发明的糖缀合物可以用于提供保护以防由具有包括脂寡糖(LOS)和多核糖磷酸(PRP)在内的多糖抗原的任意细菌引起的疾病和感染。例如，这样的细菌病原体可以包括流感嗜血杆菌，肺炎链球菌，大肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，伤寒沙门氏菌，变异链球菌，新型隐球酵母，克雷白氏杆菌，金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌。在委托了代理人的已公开的PCT申请WO 94/12641中描述了可以缀合到外膜蛋白质上的具体抗原以及实现这种缀合的方法并在本文中插入其公开文本仅供参考。
在另一个实例中，例如可以将该外膜蛋白质的载体功能用于诱导出针对肿瘤细胞的异常多糖的免疫性或者用于生产出可以偶联到化学治疗或者生物活性物质上的抗-肿瘤的抗体。
本发明延伸至本文所提供的核酸分子及蛋白质作为一种药剂的用途以及这种用于治疗莫拉氏菌感染的药剂的生产。
在本发明的一个具体的实例中提供了一种重组的约为200kDa的莫拉氏菌的外膜蛋白质或其片段或类似物，或者提供了一种可以通过至少含有编码约为200kDa的蛋白质的基因的一部分转化宿主来生产融合蛋白。参照图11表示用于生产上述蛋白质的重组载体。在图11中，填满的方框表示200kD蛋白质的基因的1.9kb和4.8kb的C-末端区，可以把该区域插入到载体pT7-7中，处于细菌噬菌体T7启动子的控制下。小的开放方框表示在同一读框中来自该载体的7个N-末端氨基酸。阴影的方框表示200kD蛋白质的5.5kb的C-末端区，该区域含有非常靠近N-末端的ATG密码子。把该基因片段融合到lacZα肽基因中，(以填满的方框表示)处于lacZ启动子的控制下。在画影线的方框中显示出起始于GTG的全长的基因。
参照图12表示出这种N-末端截短的约为200kDa的蛋白质在大肠杆菌中的表达。在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中培育携带有质粒pKS94的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pLysS至早指数期，然后加入IPTG 在培养2个多小时后，收获并裂解细菌。在Western印迹上采用抗-200kD蛋白质的豚鼠血清作为第一抗体来分析该裂解物。其它的步骤如图5所示。泳道1：预染色的分子量标准参照物，泳道2：具有一个不正确插入的携带pT7-7的BL21(DE3)/pLysS，泳道3：携带pKS94的L21(DE3)/pLysS。
参照图13表示包括β-半乳糖苷酶α肽以及约为200kDa的蛋白质的一部分的融合蛋白标记物在大肠杆菌中的表达。大肠杆菌菌株DH5α携带pKS140。质粒pKS140携带200kD蛋白质的基因的C-末端5.5kb的片段，其中的片段位于同一读框中LacZ-α-肽的N-末端部分之后。将该大肠杆菌菌株培育至稳定期、收获并随后裂解。通过Western印迹来分析该裂解物。泳道1：预染色的分子量标准参照物，泳道2：携带pKS140的DH5α(完全蛋白质，0.5μg)，泳道3：粘膜炎莫拉氏菌株4223的超声处理物(sonicate)(完全蛋白质，10μg)。
对于本领域普通技术人员来说，本发明的许多实例在接种疫苗、诊断、治疗莫拉氏菌的感染以及生产免疫试剂的领域中有许多的用途是显而易见的。下面将进一步给出上述用途的更深入而绝非限制性的讨论。
1.疫苗制剂及用途
包括那些适于用作疫苗在内的免疫原性组合物都可以从本文所提供的约为200kDa的外膜蛋白质及其免疫片段或者融合体进行制备，它们可以从细菌中纯化或通过重组技术进行生产。上述疫苗诱导在生产抗体的受试者体内的免疫应答，其中的抗体包括抗-200kDa的外膜蛋白质的抗体以及具有调理作用或者杀菌作用的抗体。如果接种后的受试者受到生产蛋白质的莫拉氏菌或者其它的能够生产出特异识别200kDa的外膜蛋白质的抗体细菌攻击的话，那么该抗体将结合到该细菌上并且使其灭活。此外，具有调理或者杀菌作用的抗-200kDa的外膜蛋白质的抗体也可以通过另一种机理提供保护。
包括疫苗在内的免疫原性组合物可以制成可注射的比如液体溶液或者乳状液。这种约为200kDa的外膜蛋白质可以和与该蛋白质相容的药物可接受的赋形剂混合。上述赋形剂可以包括水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇及其混合物。该免疫原性组合物以及疫苗还可以包括诸如润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂或者佐剂这样的辅助物质以增强其效果。免疫原性组合物和疫苗可以非经肠而通过皮下或者肌内注射进行给药。另一方面，可以通过在粘膜表面引起免疫应答的方式来配制并送递这种根据本发明所生成的免疫原性组合物。因此，可以通过例如鼻或者口(胃内的)的途径把该免疫原性组合物给药至粘膜表面。另一方面，包括栓剂以及口服配方的其它的给药模式可能也是理想的。对于栓剂而言，粘合剂和载体例如可以包括聚亚烷基二醇或三甘油酯。口服配方可以包括通常使用的赋形剂，例如药用级别的糖精、纤维素和碳酸镁。上述组合物可以采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或者粉末的形式并含有大约1至95％的约为200kDa的外膜蛋白质。该免疫原性制剂以及疫苗可以通过与剂量的配方相容的方式给药，其中的给药量应当在治疗上有效、具有保护性和免疫原性。给药量取决于待治疗的受试者，例如，包括个体的免疫系统合成抗体并且如果需要的话产生一种细胞介导的免疫应答的能力。给药时所需的活性成分的精确的数量取决于医生的判断。但是，本领域普通技术人员可以容易地确定合适的剂量范围并且该范围可以为微克数量级的约200kDa的外膜蛋白质。适于初次给药以及加强免疫剂量的方法也是可变的，但是可以包括一次初次给药、随后再进行给药。上述剂量也取决于给药的途径并根据宿主的大小而发生变化。
这种包括疫苗在内的免疫原性制剂可以包括一种作为免疫刺激物质的核苷酸载体，而该载体至少包括一部分编码约为200kDa的蛋白质的基因或者至少包括一部分可以直接用于免疫接种的基因。
在本发明的免疫原性组合物中，约为200kDa的外膜抗原的浓度通常大约为1至95％。仅含有一种病原体的抗原物质的疫苗为单价疫苗。含有几种病原体的抗原物质的疫苗为联合疫苗并且也属于本发明之内。这种联合疫苗例如含有来自不同病原体或来自同一病原体的不同菌株或来自不同病原体的组合的物质。
如果把抗原与在磷酸缓冲的盐水溶液中通常以0.05至0.1％使用的佐剂进行共同给药的话，则可以显著提高免疫原性。佐剂增强了抗原的免疫原性而其自身却不必须是免疫原性的。通过将该抗原就地地保留在给药位点附近，佐剂可以起到产生一种促进抗原向免疫系统的细胞缓慢、持续地释放的储藏效果的作用。佐剂也可以吸引免疫系统的细胞至抗原的储藏地点并且刺激这些细胞诱导免疫应答。
免疫刺激剂或者佐剂已多年用于增强宿主、例如对疫苗的免疫应答。诸如脂多糖这样的内源佐剂通常是当作为疫苗时而被杀死或者减毒的细菌的成分。外源的佐剂一般为非共价地连接到抗原上并进行配制的免疫调制剂，从而来增强宿主的免疫应答。因此，已经证实佐剂可以增强对不经肠道传递的抗原的免疫应答。但是，这些佐剂中有一些是有毒的并且会引起不希望有的副反应，这使得上述佐剂不适用于人类和许多动物。的确，仅有氢氧化铝和磷酸铝(总体说来一般称作明矾)为在人体和兽类疫苗中常规使用的佐剂。在增强对白喉以及破伤风类毒素的抗体的应答中明矾的功效得到了很好的证实并且已采用明矾来辅助HBsAg疫苗。当在一些应用中已很好地证实了明矾的实用性的同时，明矾仍有局限性。例如，明矾对流感的免疫接种没有效果并且不能持续诱导细胞介导的免疫应答。
宽范围的外源佐剂可以引起对抗原潜在的免疫应答。上述佐剂包括复合到膜蛋白抗原上的皂角苷(免疫刺激性复合物)，含有矿物油的pluronic聚合物，矿物油中杀死的分枝杆菌，弗氏完全佐剂，诸如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)之类的细菌产物以及脂质A和脂质体。
为了有效地诱导体液免疫应答(HIR)以及细胞介导的免疫(CMI)。通常是在佐剂中乳化免疫原。许多佐剂是有毒的，它们会引起肉芽肿、急性和慢性炎症(弗氏完全佐剂)FCA、细胞溶解(皂角苷和pluronic聚合物)和热原性、关节炎及前眼色素层炎(LPS和MDP)。尽管FCA是一种很好的佐剂并且广泛地应用于研究当中，但是由于它的毒性所以FCA还未获准用于人类或兽类的疫苗中。
人们希望的理想的佐剂的特征包括：
(1)缺少毒性；
(2)刺激持续长时间的免疫应答的能力；
(3)制备简单并且在长期储存时稳定；
(4)如果需要的话，对以不同方式给药的抗原同时具有诱导CMI和HIR的能力；
(5)与其它佐剂的协同作用；
(6)选择性地与抗原递呈细胞(APC)的群体相互作用的能力；
(7)特异性地诱导合适的、对TH1或者TH2细胞具有特异性的免疫应答的能力；以及
(8)选择性地提高抗抗原的合适的抗体同种型含量(例如IgA)的能力。
于1989年8月8日授权的美国专利4,855,283(Lockhoff等人，该专利插入本文仅供参考)指出包括N-糖基酰胺、N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯在内的糖脂类似物可以用作免疫调制剂或者佐剂，其中上述每种类似物均通过氨基酸在糖残基上进行取代。因此，Lockhoff等人(美国专利4,855,283，参考文献27)报道与天然存在的如糖磷脂和糖基甘油脂糖脂这样的糖脂具有结构相似性的N-糖脂类似物，能够在单纯疱疹病毒疫苗和假狂犬病毒疫苗中诱导强烈的免疫应答。有些糖脂已从长链的烷基胺和脂肪酸中合成出来，其中的烷基胺和脂肪酸通过端基异构的碳原子直接与糖连接，从而模仿天然存在的脂残基的功能。
已授权给Moloney的美国专利4,258,029(该专利委托有代理人并且插入本文仅供参考)指出当十八烷基酪氨酸盐酸化物(OTH)与破伤风类毒素和福尔马林灭活的I、II和III型脊髓灰质炎病毒疫苗复合时，OTH可以起到佐剂的作用。而且Nixon-George等人(参考文献24)报道到与重组的乙型肝炎表面抗原复合的芳香族氨基酸的十八烷基酯可以提高宿主对乙型肝炎病毒的免疫应答。
合成肽的脂化作用也已用于提高其免疫原性。因此Wiesmuller(参考文献25)描述了一种与口蹄疫病毒蛋白质具有序列同源性的肽，其中该肽被偶联到佐剂三棕榈基-S-甘油基-半胱氨酰丝氨酰丝氨酸上并且成为一种来自革兰氏阴性细菌的脂蛋白N-末端部分的合成类似物。而且，Deres等人(参考文献26)报道到采用合成的脂肽疫苗在体内引发对病毒具有特异性的细胞毒性的T淋巴细胞，其中该脂肽疫苗包括通过连接到脂肽N-棕榈基-S-2，3-双(palmitylxy)-(2RS)-丙基-[R]-半胱氨酸(TPC)上而从流感病毒核蛋白得到的修饰的合成肽。
2.免疫测定
在用作一种用于生成抗-200kDa外膜蛋白质的抗体的免疫原以及在免疫测定中用作抗原方面，本发明的约为200kDa的外膜蛋白质是有用的，其中免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、RIAs以及其它非酶连接的抗体结合的测定或者在本领域中已知的用于检测抗-细菌、抗-莫拉氏菌和抗-200kDa外膜蛋白质的抗体的方法。在ELISA中，把约为200kDa的外膜蛋白质固定在一个挑选出来的表面上，例如该表面为一种能够结合蛋白质的表面(诸如聚苯乙烯微量滴定板的孔)。在洗涤以除去没有完全吸附的约为200kDa的外膜蛋白质后，可以把一种非特异性的蛋白质，诸如对测试样品而言已知呈抗原中性的牛血清白蛋白(BSA)的溶液结合到该挑选出来的表面上。这样便可以封闭在固定化表面上非特异性的吸附位点并从而减少由抗血清在该表面上的非特异性结合而引起的本底值。
然后通过有助于生成免疫复合物(抗原/抗体)的方式使该固定化表面与诸如临床或者生物材料之类的待测样品接触。上述方法可以包括采用如BSA、小牛γ球蛋白(BGG)的溶液和/或磷酸盐缓冲盐水(PBS)/吐温这样的稀释剂稀释该样品。然后比如按照约20℃至37℃顺序的温度下使该样品温育2至4小时。温育后洗涤已接触过样品的表面以除去非免疫复合的物质。洗涤步骤可以包括采用诸如PBS/吐温或者硼酸盐缓冲溶液这样的溶液进行洗涤。在该测试样品与结合的约为200kDa的外膜蛋白质之间会生成特异性的免疫复合物并且经过随后的洗涤后，生成免疫复合物的发生乃至数量都可以通过使该免疫复合物结合到对第一抗体具有特异性的第二抗体上来加以测定。如果该测试样品是来自人类的，则第二抗体为一种对人的免疫球蛋白具有特异性的抗体通常是IgG。为了提供检测方法，该第二抗体可以具有如酶活性这样的辅助活性，例如当与一种合适的显色底物温育的时该活性会产生显色作用。然后例如通过使用一种可见光分光光度计来测量颜色形成的程度便可以实现定量测定。
3.使用序列作为杂交探针
现在，包括约为200kDa蛋白质的基因在内的本发明的核苷酸序列可以鉴别和克隆来自莫拉氏菌的任何一个种的约为200kDa蛋白质的基因。
由于包括本发明的约为200kDa蛋白质的基因序列在内的核苷酸序列具有选择性地与其它约为200kDa蛋白质的基因的互补序列形成双螺旋分子的能力，所以上述核苷酸序列是有用的。取决于应用，可以使用多种杂交条件来实现改变探针对其它基因选择性的程度。对于高度选择性而言使用相对严格的条件来形成双螺旋，诸如低盐和/或高温条件，比如说提供0.02M至0.15M的NaCl、温度介于约50℃至70℃之间。对于一些应用而言则需要不太严格的杂交条件，诸如0.15M至0.9M的盐、温度范围介于约20℃至55℃之间。通过加入增加含量的甲酰胺也可以使该杂交条件更为严格，从而使该杂交的双螺旋不稳定。因此可以容易地控制具体的杂交条件并且通常会产生一种取决于所需结果的选择的方法。一般说来，在有50％甲酰胺存在下便利的杂交温度为：对于和目标片段具有95至100％同源性的探针而言为42℃，对90至95％同源性而言为37℃且对85至90％同源性而言为32℃。
在一个临床诊断的实例中，本发明的约为200kDa蛋白质的基因的核酸序列可以与诸如标记物这样的合适的方法结合使用来测定杂交。在本领域中已知有很多种类的合适的指示剂，它们包括可以产生可检测到信号的放射性的、酶的或者其它的配体，例如亲和素/生物素以及洋地黄毒苷-标记配体。在一些诊断实例中可以使用如脲酶、碱性磷酸酶或者过氧化物酶这样的酶标记物而不是放射性标记物。在使用酶标记物的情况下已知比色分析的指示剂底物可以用于生成一种人眼或者经分光光度计可看到的物质，从而鉴别与含有约为200kDa蛋白质的基因序列的样品的特异性杂交。
本发明的约为200kDa蛋白质的基因的核酸序列可以在溶液杂交以及采用固相方法的实例中作为杂交探针。在涉及固相方法的实例中，把来自样品的测试DNA(或者RNA)吸附或粘贴在一个挑选出来的基质或表面上，其中该样品比如为包括溢泌物、体液(例如血清，羊膜液，中耳溢出物，痰，支气管肺泡灌洗液)或者乃至组织的临床样品。然后在所需的条件下使固定的单链核酸与选出的探针进行特异性杂交，其中该探针包括本发明编码基因的约为200kDa蛋白质或其片段或者类似物的核酸序列。所选择的条件取决于随所需的具体标准而定的具体环境，例如G+C的含量、目标核酸的类型、核酸的来源、杂交探针的大小等等。在洗涤杂交表面以除去非特异性结合的探针分子之后，检测该特异性杂交或者甚至于通过标记的方式定量分析特异性杂交。优选的是选择在莫拉氏菌种中保守的核酸序列部分。挑选出来的探针至少可以为18bp并且可以在约30至90bp的范围内。
4.表达约为200kDa的蛋白质的基因
含有从与宿主细胞相容的菌种得到的复制子和控制序列的质粒载体可以用于在表达系统中表达编码约为200kDa的蛋白质的基因。该载体通常携带一个复制位点以及在转化的细胞中可以提供表型选择的标记序列。例如，可以使用含有氨苄青霉素和四环素抗性基因的pBR322来转化大肠杆菌并因而提供出用于鉴别转化细胞的容易的方法。上述质粒或者噬菌体也必须包含或者必须经修饰后包含可以被用来表达其自身蛋白质的宿主细胞所使用的启动子。
此外，含有与该宿主相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作一种与宿主有关的转化载体。例如在λGEMTM-11中的噬菌体可以用于制备重组的噬菌体载体，而该噬菌体载体可以用于转化如大肠杆菌LE392这样的宿主细胞。
在重组DNA的构建中通常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统以及如在美国专利4,952,496中所述的T7启动子系统等其它的微生物启动子。关于启动子的核苷酸序列的详细情况是已知的，这就使得一个熟练的工人可以将上述启动子与基因在功能上相连接。所使用的具体的启动子通常随人们所希望的结果而进行选择。适于表达这种约为200kDa蛋白质的基因或其片段、类似物或者变体的宿主可以包括大肠杆菌、芽孢杆菌的菌种、嗜血杆菌、真菌、酵母、博德特氏杆菌或者可以使用杆状病毒的表达系统。
根据本发明，优选通过重组的方法来制备蛋白质，特别是在当从一种莫拉氏菌的培养物中纯化出来的天然存在的约为200kDa的蛋白质包含痕量的毒性物质或者其它杂质时更应如此。通过使用在异源系统中经重组生产的蛋白质可以避免这一问题，其中重组方法是以在纯化的物质中使杂质最少的方式从宿主中分离出蛋白质的。在这一方面，特别想要的用于表达的宿主包括不含有LPS并因而不含有内毒素的革兰氏阳性细菌。上述宿主包括芽孢杆菌的菌种并且对于生产无热源的约为200kDa的蛋白质或其片段或者类似物是特别有用的。
生物的保藏
遵照布达佩斯条约以及37 CFR 1.808并于本申请提交之前已经把含有具有本发明基因的开放读框的部分基因的某些质粒保藏在位于美国马里兰州(20852)罗克维尔市帕克劳恩道12301号的美国典型培养物保藏中心，其中上述基因编码本文中所述并命名为粘膜炎莫拉氏菌株4223的约为200kDa的外膜蛋白质。存在于这些质粒中的基因的各个部分的鉴别示于图5中。
在该美国专利申请授权的基础上，公众将会得到保藏质粒的样品由于保藏的实例的目的仅仅用于解释本发明，所以本文中所述的以及要求保护的本发明并不限于所保藏的质粒的范围。任意一种编码如本申请中所述的类似或者相当的抗原的相当或者类似的质粒均在本发明的范围之内。
质粒 ATCC命名 保藏日期
pKS47 97，111 1995年4月7日
pKS5 97，110 1995年4月7日
pKS9 97，114 1995年4月18日
实施例
以上公开的内容概括地描述了本发明。通过参考以下具体的实施例可以达到更加完整的理解。描述这些实施例仅仅是出于解释的目的而并不打算限制本发明的范围。由于环境可以暗示或者提供出权宜之计，所以应仔细考虑形式的变化以及等同物的替代。尽管本文中已使用了一些具体的术语，但是这些术语仅用于描述意义而并非出于限制的目的。
在本公开文本以及实施例中使用却未明确描述的分子遗传学、蛋白质生物化学以及免疫学的方法在科技文献中均有详细的报道并且上述方法恰好在本领域普通技术人员的能力范围之内。
实施例1
本实施例说明了一种非丛生的粘膜炎莫拉氏菌株(RH408)的产生
将粘膜炎莫拉氏菌株4223、即一种丛生的菌株(莫拉氏菌株的一般性质)接种至几个含有20mL脑心浸液(BHI)肉汤的烧瓶中并于37℃下在摇动(170rpm)中温育该培养物过夜。把5mL的每种过夜的培养物转移至5个独立的1mL试管中并在室温下保持上述试管静止3至8小时以使细菌沉淀。将100μl的每种培养物澄清的上相用来接种25mL的BHI肉汤并且如上所述在37℃下温育该培养物过夜。对每种过夜的培养物使用25μl的澄清培养物来接种25mL的BHI，重复该步骤6次。通过以每隔3小时的时间测量吸光值A578从而比较传代菌株和最初的粘膜炎莫拉氏菌株4223的培养物的沉降速率，便可以鉴别非丛生的细菌培养物。在3小时内，包括粘膜炎莫拉氏菌RH408在内的非丛生的突变体不发生聚集。在BHI琼脂板上，菌株RH408具有所有非丛生的菌株典型的菌落形态。与美国专利申请08/328,589有关的菌株RH408事先已按照布达佩斯条约于1994年12月13日保藏在ATCC，保藏号为55637。
实施例2
本实施例说明了约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的鉴定。
在脑心浸液(BHI)肉汤中培育粘膜炎莫拉氏菌株4223，RH408，51918185，M2，M5，ATCC 25240，3，56，135，585。于37℃下采用通气温育该培养物过夜。
超声处理粘膜炎莫拉氏菌的细胞并采用BCA测定系统(PierceRockford，IL)来测定完全蛋白质。将10μg的完全蛋白质与含有0.3M Tris-HCl(pH 8.0)、50％甘油、10％SDS、20％β-巯基乙醇以及0.01％溴酚蓝的SDS-PAGE样品的缓冲溶液混合，煮沸5分钟并且装载在SDS-PAGE凝胶(0.75mm厚，7.5％的丙烯酰胺)的每一泳道上。在200V下操作该凝胶1小时。通过含有包括0.13％考马斯亮蓝、10％醋酸和45％甲醇溶液的染色凝胶可以看到蛋白质。使用含有5％乙醇和7.5％醋酸的脱色溶液除去过量的染色剂。
通过上述方法分离的不同莫拉氏菌的蛋白质示于图1A和1B中。测试的粘膜炎莫拉氏菌株如下：
图1A
泳道 细菌菌株 来源
1. 分子量标准物
2. 大肠杆菌
3. 无样品
4. 粘膜炎莫拉氏菌4223 中耳液
5. 粘膜炎莫拉氏菌RH408 非丛生的4223的变种
6. 粘膜炎莫拉氏菌5191 中耳液
7. 粘膜炎莫拉氏菌8185 鼻咽
8. 粘膜炎莫拉氏菌M2 痰
9. 粘膜炎莫拉氏菌M5 痰
10. 粘膜炎莫拉氏菌25240 ATCC 25240
图1B
泳道 细菌菌株 来源
1. 大肠杆菌
2. 无样品
3. 分子量大小的标准参照物
4. 粘膜炎莫拉氏菌4223 中耳液
5. 粘膜炎莫拉氏菌RH408 非丛生的4223的变种
6. 粘膜炎莫拉氏菌3 痰
7. 粘膜炎莫拉氏菌56 痰
8. 粘膜炎莫拉氏菌135 中耳液
9. 粘膜炎莫拉氏菌585 血液
在所有中耳炎的菌株(粘膜炎莫拉氏菌4223，5191，135)、一株从鼻咽分离出来的菌株(8185)以及一株从痰分离出来的菌株(M2)中可以清楚地看到约为200kDa的外膜蛋白质。但是，在从痰得到的三个分离物(3.56，M2)以及一株来源不明的菌株(ATCC 25240)中却检测不到这种约200kDa的蛋白质。在来自菌血症病人的血液的分离物(585)中发现了一条非常窄的带并且在免疫印迹上通过一种抗-200kDa的特异的豚鼠血清来识别这条带。菌株RH408是一种从菌株4223分离出来的(参见实施例1)非丛生的自发突变体并且发现该菌株不表达约为200kDa的蛋白质
随跑胶时间的延长，该凝胶便显示出在不同的粘膜炎莫拉氏菌株中约为200kDa的外膜蛋白质的表观分子量的不均一性(图2)。在图2中分析的菌株如下：
泳道 细菌菌株 来源
1. 分子量大小的标准参照物
2. 粘膜炎莫拉氏菌H04 中耳液
3. 粘膜炎莫拉氏菌H12 中耳液
4. 粘膜炎莫拉氏菌PO34 中耳液
5. 粘膜炎莫拉氏菌PO51 中耳液
6. 粘膜炎莫拉氏菌E-07 中耳液
7. 粘膜炎莫拉氏菌E-22 中耳液
8. 粘膜炎莫拉氏菌E-23 中耳液
9. 粘膜炎莫拉氏菌RH4223 中耳液
10. 粘膜炎莫拉氏菌RH408 非丛生的4223的变种
菌株H12(泳道3)是一种来自中耳液的天然分离物但却不生产约为200kDa的蛋白质。
在约200kDa的范围内至少可以存在三种不同大小的蛋白质。但是，能引起抗来自一种粘膜炎莫拉氏菌株(4223)的约为200kDa的外膜蛋白质的抗体却可以识别所有存在于不同粘膜炎莫拉氏菌株中待测试的约为200kDa的蛋白质。然而可能在具体的免疫原性组合物(例如疫苗)以及具体的诊断实例中需要这种来自多种粘膜炎莫拉氏菌分离物(包括在免疫原性方面具有多样性的分离物)的约为200kDa的外膜蛋白质。
实施例3
本实施例说明对血清中约为200kDa的外膜蛋白质具有特异性的抗体的检测，其中的血清是从已经由粘膜炎莫拉氏菌引起的中耳炎中恢复的康复病人得到的。
经SDS-PAGE分离后，于4℃下在70V的恒定电压下将细菌蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至已制好的PVDF(聚偏氟乙烯；Millipore)膜上，其中该操作是在由每升3克Tris，14.4克甘氨酸以及200ml甲醇组成的缓冲溶液系统中花费1.5小时来实现的。在室温下采用在TBS(01M Tris，0.15M NaCl)中稀释的封闭剂(来自Boehringer Mannheim)来封闭带有转化蛋白质的膜30分钟。在室温下将该印迹暴露到在含有0.1％吐温20的封闭剂/TBS中以1∶500稀释的康复病人的抗血清中2小时。该病人患有中耳炎并且从其耳液中分离出来的粘膜炎莫拉氏菌株为粘膜炎莫拉氏菌CJ7。然后在含有吐温的封闭剂/TBS中洗涤印迹2次，每次洗涤15分钟采用含有吐温的封闭剂/TBS以1∶4000的比例来稀释报道分子的偶联物、即连接到蛋白质G上的辣根过氧化物酶(HRP)并在室温下使用该偶联物浸泡洗涤了的膜30分钟。如上洗涤印迹两次，随后再用TBS洗涤，使用如生产厂家所述的LumiGlo(Kirkegaard和Perry)化学发光检测系统来检测结合的抗体。将处理过的印迹在X-射线胶片上曝光。在这种与粘膜炎莫拉氏菌CJ7的约为200kDa的外膜蛋白质反应的康复病人的血清中检测抗体。这些结果表明约为200kDa的外膜蛋白质是一种粘膜炎莫拉氏菌的免疫原性蛋白质，该蛋白质可以在由粘膜炎莫拉氏菌自然感染的过程中引起免疫应答。
实施例4
本实施例说明约为200kDa的外膜蛋白质的分离和纯化。
通过在2,000rpm下离心10分钟来收获粘膜炎莫拉氏菌4223的细胞并进行冷冻。融化冷冻的细胞、将其重新悬浮于20mM的磷酸钠缓冲溶液(pH 7.2)中并进行超声处理直至细胞破碎。在含有4％SDS和0.2mMEDTA的20mM Tris缓冲溶液(pH 8)中通过煮沸5分钟也可以裂解冷冻-融化的细胞以生成细胞裂解物。将细胞超声处理物以及细胞裂解物悬浮在SDS-丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)样品缓冲溶液中，煮沸5分钟并且在凝胶(1.5mm厚，7.5％的丙烯酰胺)上经SDS-PAGE进行分离。切下约为200kDa的蛋白质在凝胶上所估计的位置并且采用与SDS-PAGE操作缓冲溶液相同的缓冲溶液通过电洗脱从凝胶中提取出蛋白质。正如在图3中所看到的，SDS-PAGE显示出这种经分离的约为200kDa的外膜蛋白质为一条均质且单一的带。图3中分析的样品如下：
泳道 样品
1.分子量大小的标准参照物
2.经分离和纯化的200kDa的外膜蛋白质
在图3中所示的经分离和纯化的粘膜炎莫拉氏菌的200kDa外膜蛋白质的纯度至少为70％。至少以95％的纯度制备出约为200kDa的外膜蛋白质是可以容易地实现的。
实施例5
本实施例说明采用来自粘膜炎莫拉氏菌的纯化的约为200kDa的蛋白质免疫接种豚鼠。
将大约30至40μg的约为200kDa的蛋白质与弗氏完全佐剂(FCA)混合并经皮下注射给豚鼠，其中的蛋白质是通过电洗脱从粘膜炎莫拉氏菌株4223中分离出来的。两周后，采用大约相等数量的溶于不完全弗氏佐剂(IFA)中的约为200kDa的蛋白质加强免疫该动物。两周后，从这些豚鼠中收集血液并得到了抗血清。
在Western印迹中检验一种抗血清与存在于54种不同的粘膜炎莫拉氏菌株中的约为200kDa的蛋白质的反应性，其中的菌株是在全世界不同的地理位置上(加拿大，美国以及芬兰)分离出来的(参见下面的表1)。在所有的菌株中通过该抗血清来识别约为200kDa的蛋白质，其中这种约为200kDa的蛋白质条带的存在是在用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上检测的。这些结果表明约为200kDa的蛋白质的一般表位存在于所有的含有该蛋白质的粘膜炎莫拉氏菌株中。正如以前所指出的，这种蛋白质并非存在于所有的粘膜炎莫拉氏菌株中，但是几乎所有从患有中耳炎的病人的中耳液中分离出来的菌株都含有这一蛋白质(表1)。
实施例6
本实施例说明采用抗-200kDa蛋白质的豚鼠血清通过ELISA测定来特异性地识别粘膜炎莫拉氏菌株4223(参见下面的表2)。
在60mL的BHI肉汤中培养粘膜炎莫拉氏菌株4223，RH408(200kDa蛋白质的负突变体)和H-12过夜。在60mL的肉汤中培养大肠杆菌菌株BL21(DE3)过夜。将该培养物分散到3个试管中并进行离心。粘膜炎莫拉氏菌株4223在1,500rpm下离心10分钟，H-12在2,000rpm下离心10分钟，RH408和大肠杆菌菌株BL21(DE3)在3,000rpm下离心15分钟。将在一支试管中的小片悬浮在20ml的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)中并采用pH 9.6的包被(coating)缓冲溶液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液)稀释至1/500。在每个孔中放置100μl的细菌悬浮液并在室温下温育1小时。向每个孔中加入100μl 0.2％的戊二醛并在室温下温育10分钟从而使细胞固定在孔上。采用含有0.1％吐温20和0.1％BSA(洗涤缓冲溶液)的PBS洗涤该孔，然后在室温下采用含有0.1％BSA的PBS封闭30分钟。在采用洗涤缓冲溶液洗涤5次经10秒钟后，向孔中加入采用洗涤缓冲溶液连续稀释的豚鼠抗血清并于室温下持续温育60分钟。洗涤后，在1/20,000的稀释率下向每个孔中加入与辣根过氧化物酶连接的山羊抗-豚鼠IgG。在室温下温育60分钟后洗涤这些孔，然后使用3，3-5，5-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢进行显色反应。
ELISA平板孔也可以采用含有溶于包被缓冲溶液中的10μg/ml总蛋白质的超声处理物进行涂覆，不经固定步骤而加以封闭，然后如上所述进行分析测定。
表2中所示的结果表明对约为200kDa的外膜蛋白质具有特异性的豚鼠抗血清可以特异性地识别生产这种约为200kDa蛋白质的粘膜炎莫拉氏菌的菌株。这种抗血清所具有的识别整个细胞的能力表明该蛋白质存在于该细菌细胞的表面上。
实施例7
本实施例描述了200kDa外膜蛋白质的内部氨基酸序列的测定。
如上所述，约为200kDa的外膜蛋白质是通过电洗脱从粘膜炎莫拉氏菌4223中分离出来的。该蛋白质经CNBr降解、蛋白酶解消化、经SDS-PAGE并转移至PVDF膜上。从该膜上切下迁移至与约40kDa对应位置处的肽的条带并测定其N-末端的氨基酸序列。在另一个实验中，使约为200kDa蛋白质的CNBr降解产物不经过SDS-PAGE的分离而直接进行N-末端氨基酸序列的测定。两种分析方法均给出了相同的含有20个氨基酸的N-末端序列，其中在第17位置处具有一个未鉴定的氨基酸。这种200kDa外膜蛋白质的内部序列为：
NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-
Lys-X-Gln-Gly-Ile(SEQ ID NO：5)
实施例8
本实施例描述了采用一种与约为200kDa外膜蛋白质的内部片段对应的肽来免疫接种豚鼠以及对所生成的抗血清的分析。
如上所述，在测定约为200kDa外膜蛋白质的内部片段的氨基酸序列的基础上使用标准方法来合成一条长度为16个氨基酸的肽，该肽的序列为：
NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-
Lys(SEQ ID NO：6)
采用Imject马来酰亚胺活化的KLH(Pierce，Rockford，IL)将这种16-聚件肽连接到KLH上并采用与上述相同的免疫接种和加强免疫方案把大约500μg的偶联物注射给豚鼠。这种引起抗16-聚件内部氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的豚鼠抗血清通过免疫印迹进行检验并且发现上述抗血清可以特异性地识别在粘膜炎莫拉氏菌4223的细胞超声处理物中的200kDa外膜蛋白质。该结果示于图4并表明这种抗-肽的豚鼠抗血清可以特异性地识别粘膜炎莫拉氏菌4223的200kDa蛋白质。在图4中分析的样品如下：
泳道 样品 抗血清
1.分子量标准参照物
2.纯化的200kDa的外膜蛋白质 抗-200kDa蛋白质
3.粘膜炎莫拉氏菌的细胞超声处理物 抗-肽1∶5000
4.粘膜炎莫拉氏菌的细胞超声处理物 抗-肽1∶1000
5.粘膜炎莫拉氏菌的细胞超声处理物 抗-肽1∶500
6.粘膜炎莫拉氏菌的细胞超声处理物 预免疫血清
得到的结果证实与SEQ ID Nos：5和6对应的肽是从该200kDa的外膜蛋白质得到的。
实施例9
本实施例描述了粘膜炎莫拉氏菌的基因组文库的制备。
染色体DNA分离如下：
将粘膜炎莫拉氏菌的细胞小片重新悬浮于pH 7.5的20mL Tris-EDTA(TE)中。加入链霉蛋白酶(最终浓度为500μg/mL)和SDS(最终浓度为1％)并在37℃下温育该悬浮物2小时。通过依次以苯酚提取1次、以苯酚-氯仿(1∶1)提取2次并且再以氯仿-异戊醇(24∶1)提取1次来分离DNA。在4℃下把提取出来的DNA用1M NaCl透析4小时。接下来在4℃下用pH 7.5的TE缓冲溶液透析48小时(更换三次缓冲溶液)用乙醇从透析液中沉淀DNA。尺寸大的DNA可以通过绕在玻璃棒上加以收集、经空气干燥并溶解于3mL水中。进行染色体DNA(最终体积为10μl)的小规模Sau3A(新英格兰生物实验室)的限制性消化，从而确定了获得了尺寸范围为15-23kb的最大量的染色体DNA所需的条件。一旦确定了最佳的消化条件便可以制备出大规模的消化物。大规模的消化物由50μL染色体DNA(290μg/mL)、33μL水、10μL Sau3A缓冲溶液(新英格兰生物实验室)、1μL BSA(10mg/mL，新英格兰生物实验室)以及6.3μL Sau3A(0.4U/μL)所组成并在37℃下温育15分钟，通过加入10μL 10X加样缓冲溶液(100mM Tris-HCl pH 8，10mM EDTA，0.1％溴酚蓝，50％甘油)来终止反应。将消化了的DNA加入0.5％的琼脂糖凝胶(在Tris-醋酸盐-EDTA(TAE)中制备)中并根据其尺寸在50V下分离6小时。从凝胶中切除包含有尺寸为15-23kb的DNA的凝胶区域并将其放置到含有3mL TAE的透析管(BRL)中。在1V/cm的场强下，从凝胶-切片中电洗脱DNA过夜。把在TAE中经电洗脱的DNA用苯酚提取1次、再用苯酚-氯仿(1∶1)提取2次并用乙醇沉淀。将干燥的DNA小片溶解在5μL水中。使用T4DNA连接酶把按大小分级分离的染色体DNA与BamHI切口EMBL3臂(Promega)连接，得到最终的体积为9μL。按照生产厂家的使用说明采用一个商业的包装试剂盒(Amersham)把上述整个连接反应包装进噬菌体λ中。
在固体培养基上扩增包装的DNA文库。这是通过在37℃下温育0.1ml悬浮在含有15-25μL包装DNA文库的10mM MgSO4中的大肠杆菌菌株NM539的铺平板细胞15分钟来实现的。。使用3mL的BBL顶层-琼脂糖(除用0.6％的琼脂糖代替琼脂以外均与BBL平板相同)把含有吸附噬菌体的细菌铺在BBL平板(每升10g BBL胰酶消化胨，5g NaCl以及15g琼脂)上并在37℃下温育该平板过夜。通过向该平板加入3mL SM缓中溶液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，8mM MgSO4，100mM NaCl，0.01％明胶)从上述顶层-琼脂糖中洗脱噬菌体并在4℃下保留7小时。从平板中收集含有噬菌体的SM缓冲溶液，将其转移到一个带有螺纹盖的试管中并于4℃下在氯仿中储存。
实施例10
本实施例描述了编码粘膜炎莫拉氏菌的200kDa外膜蛋白质的基因的克隆。
使用一种抗-200kDa蛋白质的豚鼠抗血清来筛选在噬菌体λEMBL3中的粘膜炎莫拉氏菌的基因组文库。通过使用对约200kDa的外膜特异的抗血清进行噬菌体裂解物的免疫印迹测定便可以证实表达这种约200kDa蛋白质的λ噬菌体克隆8II。
制备出这种重组噬菌体的平板裂解物的培养物。按照生产厂家的指示，使用一种Wizardλ制备DNA纯化系统(Promega公司，麦迪逊，WI)来从该平板裂解物中提取DNA。该噬菌体克隆携带有一段大小约为16kb的DNA插入片段(图5所示为其限制性酶切图)。采用限制性内切酶SalI和XhoI的混合物来消化噬菌体DNA并经琼脂糖凝胶电泳加以分离。从该凝胶中分别切除两个尺寸约为5kb和11kb的DNA条带并且按照生产厂家的指导使用一种基因清除试剂盒(BIO 101公司，LaJolla，CA)进行提取。
将较小的5kb片段连接到事先已用SalI和XhoI消化的质粒载体pBluescript II SK +/-(Stratagene克隆系统，LaJolla，CA)上以生成质粒pKS5。较大的11kb片段则连接到质粒载体pSP72(Promega公司，麦迪逊，WI)上以生成质粒pKS9。所有连接的质粒均用于转化大肠杆菌菌株DH5α。
λ噬菌体的DNA也使用XhoI和KpnI的混合物进行消化并且如上所述在琼脂糖凝胶分离后分离出约为1.2kb的片段。将这种1.2kb的片段连接到质粒载体pGE-72f(+)(Promega公司，麦迪逊，WI)以生成质粒pKS47。图5中显示了质粒克隆的限制性酶切图。
实施例11
本实施例描述了对编码粘膜炎莫拉氏菌的约为200kDa外膜蛋白质的基因进行的测序。
使用一种实用生物系统测序仪来对编码约为200kDa外膜蛋白质的基因进行测序。在使用“删除一个碱基的系统”(Promega公司，麦迪逊，WI)构建一组嵌套缺失后来对质粒pKS5中插入的一条链进行测序质粒pKS5先经XhoI和KpnI消化，用外切核酸酶III处理以便在插入片段中生成一组嵌套缺失，然后根据生产厂家的指示进行重新环化。使用含有按照上述方法生成的缺失的一系列质粒来转化大肠杆菌DH5α。使用Quiagenmidi质粒分离试剂盒(Quiagen)从该转化体中分离出质粒并且在限制性内切酶消化后通过琼脂糖凝胶电泳来检验质粒的大小。使用细菌噬菌体T7启动子序列作为引物来对具有缺失的质粒的插入片段进行序列。
在序列的基础上合成核苷酸引物。使用合成的核苷酸引物来测定由“删除一个碱基的系统”未测出的序列缺口。
质粒pKS47和pKS71中插入片段的序列是使用合成的核苷酸引物从它们的末端进行测定的。如图6所示(SEQ ID No：2)，该基因的核苷酸序列具有一个编码约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的基因的开放读框。该序列包括一个核苷酸序列：
5′-AATGTCAAATCAGTCATTAACAAAGAACAAGTAAATGATGCCAATAAAAAGCAAGGCATC-3′(SEQ ID No：7)
该核苷酸序列编码以上所测定的约为200kDa的外膜蛋白质的内部氨基酸序列(SEQ ID No：5)。这一结果证实了克隆的基因具有一个编码约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质的基因的开放读框。如以下的表III所示，该基因编码一种具有1992个氨基酸、计算分子量为204,677的蛋白质以及一种计算的氨基酸的组成。该蛋白质的推导的氨基酸序列示于图6中(SEQ ID No：3)。
实施例12
本实施例描述了对编码粘膜炎莫拉氏菌的约200kDa的基因的起始密码子的鉴定。
为了鉴定这种200kDa蛋白质的基因的翻译起始密码子和启动子区域，从pKS5和pKS47中构建质粒pKS80(图5)。从位于上游的ATG开始算起，该构建体含有大约DNA的250个碱基对。用KpnI和XhoI消化质粒pKS5。在0.8％琼脂糖凝胶上分离该消化物，从该凝胶中切去约为8kb的DNA片段并进行提取。也使用上述两种酶来消化另一质粒pKS47并且提取约为1.1kb的DNA片段。将1.1kb的片段连接到8kb片段上以构建pKS80。采用抗-200kD蛋白质的豚鼠血清的Western印迹不能检测出在携带有pKS80的转化体的裂解物中的200kD蛋白质。
为了验证构建体是否太长以致于不能在大肠杆菌中表达，如图8所示构建了三种不同大小的C-末端截短物。首先通过KpnI和BamHI消化来切除pKS80中整个的插入片段，然后将该插入片段插入到事先已用相同的两种酶消化过的另一载体质粒pGEM7Zf(+)(Promega，麦迪逊，WI)中。得到的质粒pKS105进一步使用下述酶中的任一种进行消化，其中使用的酶为：(1)HindIII，(2)HpaI和SmaI或者(3)EcoRV，并经凝胶纯化，然后使其重新环化从而分别生产出pKS130、pKS136和pKS144。当使用抗-200kD蛋白质的豚鼠血清在Western印迹上进行检验时，含有pKS130、pKS136或pKS144中任意一种质粒的大肠杆菌DH5α转化体不生产任意一种的截短蛋白质。
接下来为了研究起始密码子是否为GTG以及进一步研究是否该启动子区域位于GTG更远的上游，使用ApaI和KpnI从pKS71中切除约0.9kb的片段并将该片段连接到事先已用ApaI和KpnI消化的pKS130、pKS136或pKS144上。这种来自pKS71的0.9kb的片段携带有包含可能的起始密码子GTG的NcoI-KpnI片段以及起始于GTG约700bp的上游区域(图8)。得到的构建体pKS159、pKS149和pKS155生产出可以在Western印迹上通过抗-200kDa蛋白质的豚鼠血清识别的截短蛋白质。将ApaI和KpnI的片段也连接到不具有C-末端截短的pKS105上以生成pKS164。携带pKS164的转化体生产出一种在Western印迹上可以通过同样的抗血清识别的全长的200kDa蛋白质。上述结果表明对于在大肠杆菌中表达来自其自身启动子的约200kDa蛋白质的基因而言，含有GTG密码子的基因的5’-区域及其上游序列是必须的，并且该结果也暗示出约200kDa蛋白质的基因的翻译起始密码子为GTG。
为了证实该基因的起始密码子为GTG，如图9所示按照从图6中的核苷酸序列推导的氨基酸序列合成出两种肽。肽1(SEQ ID No：11)包括从GTG起始密码子开始的30个氨基酸。肽2(SEQ ID No：12)为接下来的具有30个氨基酸的肽。在图6中通过下划线来标记上述肽。在豚鼠中生成抗这两种肽的抗血清并且得到抗血清。正如在图10中所看到的通过Western印迹，所生成的抗这两种肽的抗血清可以明确地识别来自粘膜炎莫拉氏菌株4223的200kDa蛋白质。超声处理粘膜炎莫拉氏菌株4223。超声处理物中的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上分离并将其转移至PVDF膜上。将该膜切割成小条并采用或者抗-肽1或者抗-肽2的豚鼠血清作为第一抗体进行处理。第二抗体为与辣根过氧化物酶(杰克逊免疫研究实验室公司，West Grove，PA)连接的山羊的抗-豚鼠IgG。为了形成颜色，最后使用CN/DAB底物(Pierce，Rockford，IL)处理上述膜。泳道1：预染色的分子量标准参照物，泳道2：抗-200kD的蛋白质血清，泳道3：来自1号豚鼠的抗-肽1的血清，泳道4：来自1号豚鼠的在前出血的(prebleed)血清，泳道5：来自2号豚鼠的抗-肽1的血清，泳道6：来自2号豚鼠的在前出血的血清，泳道7：来自3号豚鼠的抗-肽2的血清，泳道8：来自3号豚鼠的在前出血的血清，泳道9：来自4号豚鼠的抗-肽2的血清，泳道10：来自4号豚鼠的在前出血的血清。图10中所示的结果表明GTG为编码约为200kDa蛋白质的基因的翻译起始密码子
在GTG处开始的约为200kDa蛋白质的基因的编码序列有5976个碱基对并且编码一种含1992个氨基酸、计算分子量为204，677的蛋白质。图5中显示出这种200kDa蛋白质的基因的位置。在NcoI和SalI之间的序列及其氨基酸的翻译示于图6中。约200kDa蛋白质的计算的氨基酸的组成示于表III中。
为了构建处在T7启动子的控制下两种不同大小的N-末端截短基因(如图11所示)，将携带约200kDa蛋白质的基因的约1.9kb的3’-区域的ScaI-SalI片段从pKS5中切去并从pKS80中切去携带约4.8kb的3’-区域的PvuII-SalI片段。将两个片段连接到事先已用SmaI和SalI消化的质粒pT7-7上，从而分别生成pKS94和pKS91。这种连接反应导致1.9kb和4.8kb的3’-区域与来自该载体的7个N-末端氨基酸的融合。当采用IPTG诱导带有pKS94或者pKS91的大肠杆菌菌株的转化体BL21(DE3)/pLysS时，上述转化体生产出大量N-末端截短的200kDa蛋白质。图12表示了一个Western印迹，该印迹表明通过一种携带pKS94质粒的转化体来表达截短蛋白质。
如图11所示为一种约200kDa蛋白质的基因的3’-5.5kb片段的LacZ融合基因。将含有约200kDa蛋白质的基因的3’-5.5kb区域的5.8kb片段经PstI消化而从pKS80中切除并通过凝胶纯化，然后将该片段连接到事先已用相同的酶消化过的pGEM5Zf(+)(Promega，麦迪逊，WI)中。通过限制性内切酶分析来选择大肠杆菌DH5α克隆，其中该克隆携带在方向和读框上与LacZα相同的基因。如图13所示，上述克隆构建表达上述融合蛋白质。
公开内容的摘要
在上述公开内容的摘要中，本发明提供了一种经分离和纯化的分子量约为200kDa的莫拉氏菌株、特别是粘膜炎莫拉氏菌的外膜蛋白质以及经分离和纯化的编码该外膜蛋白质的DNA分子。本发明也提供了与该外膜蛋白质的某些部分对应的类似物、截短物和肽。对于诊断、免疫接种以及生产诊断和免疫试剂而言，从中得到的蛋白质、DNA序列、重组蛋白质以及肽是有用的。在本发明的范围内可做多种的改动。
表I
在不同的粘膜炎莫拉氏菌的分离物中
约为200kDa的外膜蛋白质的存在
| 临床分离物的种类 | 检验的分离物的数量 | 含有200kDa外膜蛋白质的分离物1的数量 |
| 中耳炎痰/痰/支气管分泌物血液鼻咽未知 | 3713211 | 366210 |
1通过使用一种单特异性的豚鼠抗-200kDa蛋白质的抗血清进行的免疫印迹分析来测定这种约为200kDa外膜蛋白质的存在。
表II
通过单特异性的抗-200kDa外膜的豚鼠抗血清来检测
粘膜炎莫拉氏菌的约为200kDa的外膜蛋白质
| 菌株 | 样品 | 相互反应性滴度 |
| 4223RH408H12大肠杆菌BL214223RH408H12大肠杆菌BL214223RH408H12大肠杆菌BL21 | 全部细胞未固定全部细胞未固定全部细胞未固定全部细胞未固定全部细胞固定全部细胞固定全部细胞固定全部细胞固定超声处理物超声处理物超声处理物超声处理物 | 800＜200＜200＜2003200200＜200＜20012,800800800200 |
表III
粘膜炎莫拉氏菌的约为200kDa外膜
蛋白质的氨基酸的组成
| 残基 | 数量 | 百分数(MW) |
| N-天冬酰胺T-苏氨酸K-赖氨酸D-天冬氨酸A-丙氨酸V-缬氨酸I-异亮氨酸S-丝氨酸G-甘氨酸L-亮氨酸Q-谷氨酰胺E-谷氨酸F-苯丙氨酸R-精氨酸Y-酪氨酸H-组氨酸P-脯氨酸M-蛋氨酸W-色氨酸B-天冬氨酸天冬酰胺C-半胱氨酸 | 196221159147219148116150222111835540342724307300 | 10.910.910.08.37.67.26.46.46.26.15.23.52.92.62.21.61.4.4.3.0.0 |
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Claims (25)
1.一种经分离和纯化的通过SDS-PAGE测定表观分子量约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌株(Moraxella caterrhalis)4223的外膜蛋白，含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：3是图6所示的推导的氨基酸序列。
2.权利要求1的蛋白的水溶液。
3.权利要求1的蛋白，该蛋白可以被一种对具有氨基酸序列NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys(SEQ ID NO：6)的肽有特异性的抗体制剂识别。
4.权利要求1的蛋白，该蛋白具有如表III所示的氨基酸组成。
5.一种经纯化和分离的编码一种通过SDS-PAGE测定分子量约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌株(Moraxella caterrhalis)4223的外膜蛋白的核酸分子，含有SEQ ID NO：2的核酸序列，其中SEQ ID NO：2是图6所示的编码序列。
6.权利要求5的核酸分子，其中被编码的蛋白含有氨基酸序列NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys-Lys-Gln-Gly-Ile(SEQ ID NO：10)。
7.一种经纯化和分离的核酸分子，该核酸分子具有选自下列的核苷酸序列：
(a)如图6所示的核苷酸序列(SEQ ID No：1或2)或其互补序列；和
(b)编码粘膜炎莫拉氏菌株4223的200kDa蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述蛋白含有SEQ ID No：3的氨基酸序列；
其中SEQ ID NO：1是图6所示的完整核苷酸序列，SEQ ID NO：2是图6所示的编码序列；SEQ ID NO：3是图6所示的推导的氢基酸序列。
8.一种适用于转化宿主的载体，它包含具有下列核苷酸序列的核酸分子：
(a)图6给出的核苷酸序列(SEQ ID No：1或2)或其互补序列；和
(b)编码粘膜炎莫拉氏菌株4223的200kDa蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述蛋白含有氨基酸序列SEQ ID No：3；
其中SEQ ID NO：1是图6所示的完整核苷酸序列，SEQ ID NO：2是图6所示的编码序列；SEQ ID NO：3是图6所示的推导的氨基酸序列。
9.一种适用于转化宿主的表达载体，它包含具有下列核苷酸序列的核酸分子：
(a)图6给出的核苷酸序列(SEQ ID No：1或2)或其互补序列；和
(b)编码粘膜炎莫拉氏菌株4223的200kDa蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述蛋白含有SEQ ID No：3的氨基酸序列；
以及有效地偶联到用于宿主表达粘膜炎莫拉氏菌株4223的外膜蛋白的核酸分子上的表达工具，所述外膜蛋白通过SDS-PAGE测定分子量约为200kDa；
其中SEQ ID NO：1是图6所示的完整核苷酸序列，SEQ ID NO：2是图6所示的编码序列；SEQ ID NO：3是图6所示的推导的氨基酸序列。
10.权利要求9的表达载体，其中表达工具包括一个编码用于使所说外膜蛋白从宿主中分泌的前导序列的核酸部分。
11.权利要求9的表达载体，其中表达工具包括一个编码用于从宿主中表达脂质化形式的外膜蛋白的脂质化信号的核酸部分。
12.一种含有如在权利要求10中所要求保护的表达载体的转化宿主。
13.一种可以通过权利要求12的转化宿主生产的重组的外膜蛋白。
14.一种用于向宿主送递分子量约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌株4223的外膜蛋白的活的载体，其包括一种包含具有下列核苷酸序列的核酸分子的载体：
(a)图6给出的核苷酸序列(SEQ ID No：1或2)或其互补序列；和
(b)编码粘膜炎莫拉氏菌株4223的200kDa蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述蛋白含有氨基酸序列SEQ ID No：3；
其中SEQ ID NO：1是图6所示的完整核苷酸序列，SEQ ID NO：2是图6所示的编码序列；SEQ ID NO：3是图6所示的推导的氨基酸序列。
15.权利要求14的活的载体，其选自大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、分枝杆菌(Mycobacteria)、腺病毒、痘病毒、痘苗以及脊髓灰质炎病毒。
16.一种分离的肽，所述肽具有氨基酸序列NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys-Lys-Gln-Gly-Ile(SEQ ID NO：10)或NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys(SEQ ID NO：6)。
17.一种分离的肽，其中所说的肽具有氨基酸序列NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys-x-Gln-Gly-Ile(SEQ ID NO：5)。
18.一种免疫原性组合物，该组合物包括至少一种选自下列的活性成分以及一种可药用载体，
(A)一种经分离和纯化的通过SDS-PAGE测定分子量约为200kDa的粘膜炎莫拉氏菌株4223的外膜蛋白，该蛋白含有氨基酸序列SEQ IDNo：3，其中SEQ ID NO：3是图6所示的推导的氨基酸序列；
(B)具有氨基酸序列NH2-Asn-Val-Lys-Ser-Val-Ile-Asn-Lys-Glu-Gln-Val-Asn-Asp-Ala-Asn-Lys(SEQ ID NO：6)的肽；
当向宿主给药时所述至少一种活性成分产生免疫应答。
19.权利要求18的免疫原性组合物，其中的组合物配制成一种微粒、胶囊、ISCOM或者脂质体制剂。
20.权利要求18的免疫原性组合物，其中该组合物与一个用于向免疫系统的特异性细胞或者向粘膜表面送递的导向分子相组合。
21.权利要求18的免疫原性组合物，其中该组合物还包括至少一种其它的免疫原性或免疫刺激性物质。
22.权利要求21的免疫原性组合物，其中至少一种其它的免疫刺激性物质为至少一种佐剂。
23.权利要求22的免疫原性组合物，其中所说的至少一种佐剂选自：磷酸铝，氢氧化铝，QS21，Quil A，衍生物及其组分，ISCOM基质，磷酸钙，氢氧化钙，氢氧化锌，糖脂类似物，氨基酸的十八烷基酯，胞壁酰二肽，polyphosphazene，ISCOPREP，DC-chol，DDBA以及脂蛋白。
24.权利要求23的免疫原性组合物，其中产生免疫应答的宿主为灵长类动物。
25.权利要求24的免疫原性组合物，其中所说的灵长类动物为人类。
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