CN1192241A - Hsp70家族的链球菌热休克蛋白 - Google Patents

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Abstract

描述了表观分子量为70—72kDa的肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌的新热休克蛋白(HSP)、免疫相关多肽、肺炎链球菌HSP72的核苷酸和衍生氨基酸序列(SEQ ID NO∶4;SEQ ID NO∶5)化脓链球菌HSP70的核苷酸和衍生氨基酸序列(SEQ ID NO∶19;SEQ ID NO∶20)、无乳链球菌HSP70的核苷酸和衍生氨基酸序列(SEQ ID NO∶21;SEQID NO∶22)、与HSP结合的抗体和用于生产HSP和免疫相关多肽的重组DNA方法。本发明的多肽、DNA序列和抗体提供了用于诊断、预防和/或治疗链球菌疾病的新方法。

Description

HSP70家族的链球菌热休克蛋白
技术领域
本发明涉及肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌的新热休克蛋白和免疫相关多肽，提供了在治疗、预防和诊断疾病中有用的免疫治疗、预防和诊断剂的基础。更具体地说，本发明涉及肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌的热休克蛋白，它们是HSP70家族的成员，表观分子量为7072kDa，本发明还涉及相应的核苷酸和衍生的氨基酸序列、生产HSP70/HSP72和免疫相关多肽的重组DNA方法、与这些HSP结合的抗体以及诊断、预防和治疗因肺炎链球菌和有关细菌如化脓链球菌和无乳链球菌引起的疾病的方法和组合物。发明背景
肺炎链球菌是人，特别是婴幼儿和老年人以及免疫受损者的重要致病因素。从世界范围内来看，是患有侵袭性疾病菌血症/败血症、肺炎、脑膜炎的患者和高发病率和死亡率的患者中经常分离出来的一种细菌。尽管抗微生物药物的发现降低了肺炎球菌疾病的死亡率，但抗性肺炎球菌生物是目前世界上的主要问题。有效地肺炎球菌疫苗对于与肺炎链球菌疾病有关的发病率和死亡率有很大的影响。所述疫苗还可有效地用于预防婴幼儿中的中耳炎。
显然，许多肺炎球菌因素在致病机制中都是很重要的[G.J.Boulnois，遗传微生物学杂志，138，pp249-259(1992)；C.J.Lee等，Crit.Rev.Microbiol.，18，pp89-114(1991)]。肺炎球菌的荚膜尽管没有毒性，但认为是使肺炎球菌具有毒性的必要条件。以抗原差异为基础，鉴定了80多种肺炎球菌荚膜血清型。抗体是保护机制，而且已经明确了抗荚膜抗体对于宿主抵御肺炎链球菌是非常重要的[R.Austrian，美国医学杂志，67，pp547-549(1979)]。然而，目前可得到的肺炎球菌疫苗含有最经常引起疾病的23种荚膜多糖，但这些疫苗有明显的缺陷如荚膜多糖的致免疫性差，血清型多种多样，而且在时间、地理区域和年龄组中，血清型的分布不同。具体地说，现有疫苗不能保护幼童抵御多种血清型的缺陷促使人们评估其他肺炎链球菌组分。不断有迹象表明，特定的肺炎球菌蛋白质可能在保护和致病性方面均很重要[J.C.Paton，微生物研究年报，47，pp89-115(1993)]。但到目前为止，只研究了很少的肺炎链球菌蛋白质。这可能是由于缺少蛋白质特异性抗体而造成的，缺少抗体就很难研究蛋白质抗原在保护和致病性方面的作用。认为肺炎球菌蛋白质抗原没有很强的致免疫性，而大多数抗体应答是针对磷酸胆碱和荚膜多糖[L.S.McDaniel等，J.Exp.Med.，160，pp386-397(1984)；R.M.Krause，Adv.Immunol.，12，pp1-56(1970)；D.G.Braun等，J.Exp.Med.，129，pp809-830(1969)]。在使用X连锁免疫缺陷性小鼠(这种小鼠对碳水化合物抗原和磷酸胆碱的反应差，但对蛋白质抗原的反应相对正常)所进行的研究中，得到与肺炎球菌蛋白质抗原有反应性的单克隆抗体的频率不到10％，因此表明肺炎链球菌蛋白质不是好的免疫原[McDaniel等，同上文]。
无乳链球菌也称为B型链球菌(GBS)，是脓毒症(血液感染)和新生儿脑膜炎的最常见的病因。GBS也是新生儿肺炎的常见病因。在美国每年约有8000个婴儿患GBS病，5％-15％的患儿死亡。存活下来的婴儿，特别是患脑膜炎的那些，会遗留下长期问题，如丧失听觉或视觉或失去学习能力。在怀孕的妇女中，GBS会引起尿道感染、子宫感染(羊膜炎，子宫内膜炎)和死产。在未怀孕的妇女和男性中，GBS引起的最常见的疾病是血液感染、皮肤和软组织感染以及肺炎。约20％患GBS疾病的未怀孕妇女和男性死于这种疾病。在新生儿和成年人中的GBS感染通常通过静脉内施用抗生素(如青霉素或氨苄青霉素)来治疗。大部分新生儿中的GBS病可通过在分娩时给孕妇静脉内施用抗生素而得到预防。正在研制预防GBS病的疫苗。在将来，期望接种了的妇女都能产生可通过胎盘的抗体，从而在出生和婴儿早期能够保护婴儿。
自1980年以来，也称为A组链球菌(GAS)的化脓链球菌作为严重疾病的病因再次出现，这可能是由于生物体的毒性增加而引起的。GAS可引起咽炎，通常称为strep throat，和皮肤感染(脓疱病、丹毒/蜂窝组织炎)。strep throat和脓疱病导致肾小球肾炎(肾损伤)。约3％的strep throat感染导致风湿性发烧(游走性关节炎)，其并发症包括舞蹈病(神经症状)，50％的情况下，有心内膜炎的风湿性心脏病(心脏瓣膜损伤)可能是长期结果。重要的是用抗生素治疗脓疱病和“strep throat”以预防并发症的发展。由产生毒素的菌株而引起的感染会导致猩红热(diffuse rash和发热)或极严重的链球菌中毒性休克征(TSS；GAS也称为“吃肉细菌”)，其特征在于会迅速发生休克和多器官系统衰竭。尽管有包括除去细菌感染病灶的攻击性治疗和抗生素治疗，但TSS仍有30-70％的死亡率。TSS的发病率为每100,000有10到20个。目前还没有抗GAS的疫苗。
热休克或应激蛋白(“HSP”)是自然界中最高度保守的，而且丰富的蛋白质[F.C.Neidhardt等，遗传学研究年鉴，18，pp.295-329(1984)；S.Lindquist生物化学研究，55，pp.1151-1191(1986)]。它们是由应答各种生理和非生理刺激的所有细胞生产的。其中突然增加温度会诱导合成HSP的热休克反应是研究最多的应激反应。其他环境条件如低pH、铁缺乏或过氧化氢也会诱导HSP。通过其大小限定HSP，hsp90、hsp70和hsp60家族中的成员是在所有原核和真核细胞中所发现的主要HSP。这些蛋白质通过帮助蛋白质折叠和组装以及辅助跨膜转位来完成侣伴蛋白功能[C.Georgopoulos and W.J.Welch，细胞生物学研究年鉴，9，pp.601-634(1993)；D.Ang.等，生物化学杂志，266，pp.24233-24236(1991)]。HSP可能作为分子侣伴蛋白或通过其它机制参与保护细胞免于应激的不利影响。通过环境条件调节多种毒性因素的事实表明了HSP在微生物致病性中的作用[J.J.Mekalanos，细菌学杂志，174，pp.1-7(1992)；P.J.Murray and R.A Young，细菌学，174，pp.4193-4196(1992)]。在那方面，最近对沙门氏菌种的研究表明应激反应可能是与引发和保持感染细胞内病原体的能力非常相关的[N.A.Buchmeir and F.Heffron，科学，248，pp.730-732(1990)；K.Z.Abshire andF.C.Neidhardt，细菌学杂志，175，pp.3734-3743(1993)；B.B.Finlay等，科学，243，pp.940-943(1989)]。其他人表明在热休克条件下，可诱导单核细胞增生利斯特氏菌中的必需的毒性因子lysteriolysin[Z.Sokolovic andW.Goebel，Infect.Immun.57，pp.295-298(1989)]。
越来越多的证据表明HSP是许多病原体的主要抗原。hsp60家族的成员因其与大肠杆菌GroEL蛋白质的相似性也称为GroEL蛋白，是各种细菌病原体的主要抗原[D.Young等，Proc.Acad.Sci.USA，85，pp.4267-4270(1988)]，所述病原体包括麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌[D.Young等，Proc.Acad.Sci.USA，85，pp.4267-4270(1988)]、嗜肺军团杆菌[B.B.Plikaytis等，J.Clin.Microbiol.，25，pp.2080-2084(1984)]、布氏疏螺旋体[B.J.Luft等，J.Immunol.，146，pp.2776-2786(1991)]和砂眼衣原体[E.A.Wager等，J.Infect.Dis.，162，pp.922-927(1990)]。该抗原是遍在“共同抗原”的同系物，而且认为其存在于各个细菌中[J.E.Thole等，Microb.Pathogen，4，pp71-83(1988)]。还已就多种细菌和寄生虫感染描述了抗hsp70家族成员或DnaK-相关蛋白的抗体[Young等，同上文；Luft等，同上文；S.M.Engman等，J.Immunol.，144，pp.3987-3991(1990)；N.M.Rothstein等，Molec.Biochem.Parasitol.，33，pp.229-235(1989)；V.Nussenzweig andR.S.Nussenzweig，Adv.Immunol.，45，pp.283-334(1989)]。HSP还会引发强B和T细胞反应，而且表明用结核分枝杆菌接种之小鼠的20％的CD4+T淋巴细胞只与hsp60蛋白质反应[S.H.E.Kaufman等，Eur.J.Immunol，17，pp.351-357(1987)]。相似的，总共24个抗麻风分枝杆菌蛋白的单克隆抗体中的7个识别hsp60上的决定基[H.D.Engers等，Infect.Immun.，48，pp.603-605(1985)]。看起来对应激蛋白的免疫应答在抵御感染方面起重要作用。这与微生物HSP有反应性的抗体和T细胞可以表现出中和和保护活性的结果一致[A.Noll等，Infect.Immun.，62，pp.2784-2791(1994)；和S.L.Danilition等，Infect.Immun.，58，pp.189-196(1990)]。应激蛋白的免疫特性使它们可作为疫苗组分，而且目前认为数种HSP可用于预防微生物感染并治疗癌症。但是，到目前为止，研究集中于细胞内病原体入分枝杆菌、沙门氏菌、衣原体和数种寄生虫。有关细胞外革兰氏阳性菌中热休克蛋白抗原的报道很少。在肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌中，既未鉴定热休克蛋白，也未鉴定其基因结构。
                      本发明公开
本发明通过提供来自肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌的新热休克蛋白和免疫相关多肽而述及了上述问题。还提供了编码前述多肽的DNA序列，含所述多肽的载体、用那些载体转化的单细胞宿主以及制备基本纯的重组多肽的方法。还提供了前述多肽特异性的抗体。本发明的多肽、DNA序列和抗体为用于检测、预防和治疗疾病的新方法和组合物提供了基础。特别是，本发明提供了以对链球菌菌株有特异性的这些多肽片段为基础的新疫苗。
新热休克蛋白是肺炎链球菌的约72kDa热休克蛋白(“HSP72”)(SEQ ID NO：5)、化脓链球菌的约70kDa的热休克蛋白(“HSP70”)(SEQ ID NO：20)和无乳链球菌的约70kDa的热休克蛋白(“HSP70”)(SEQ ID NO：22)，包括其类似物、同系物和衍生物和含有至少一个致免疫表位之前述多肽的片段。优选的HSP70/72片段包括HSP70/72多肽的C-末端部分。更具体地说，包括C末端169个残基的片段(“C-169”)(残基439-607，SEQ ID NO：5)C末端151个残基的片段(“C-151”)(残基457-607，SEQ ID NO：5)，以及由C-169区中的肽表位组成的小片段。HSP72之C-169区内的特别优选片段包括肽序列GFDAERDAAQAALDD(SEQ ID NO：5的残基527-541)和AEGAQATGNAGDDVV(SEQ ID NO：5的残基586-600)，这是肺炎链球菌的HSP72所专有的。更优选的是在人宿主中引发抗肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌的免疫反应，但不会引起自身免疫反应的片段。所述片段可以选自下列肽：CS870、CS873、CS874、CS875、CS876、CS877、CS878、CS879、CS880、CS882、MAP1、MAP2、MAP3和MAP4(见表5，同上文)。
本发明优选的抗体是F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4单克隆抗体(“MAb”)，它们都是HSP72特异性的。
更优选的抗体是具有HSP70和HSP72特异性的F2-Pn3.2和F2-Pn3.4单克隆抗体。更优选的是肺炎链球菌特异性的F1-Pn3.1。
本发明的优选多肽和抗体为用于检测、预防和治疗肺炎球菌病的新方法和组合物提供了基础。
                       附图描述
图1是荧光图谱，描述了热休克蛋白对肺炎链球菌蛋白合成的影响。在A中的细胞提取物是肺炎链球菌6型菌株64。在B中的细胞提取物是肺炎链球菌4型菌株53。将奇数道的细胞提取物在37℃保温。将偶数道的细胞提取物在45℃保温5分钟。然后用[35S]甲硫氨酸将细胞提取物标记10分钟(道1、2和7、8)，30分钟(道3、4和9、10)或60分钟(道5、6)。在左边列出了以kDa计的分子量标记。在各组的右手用箭头表示HSP80、HSP72和HSP62的位置。
图2图示比较说明在与热休克蛋白接触(----)或不接触(----)的条件下，肺炎链球菌中的[35S]甲硫氨酸-标记蛋白质的电泳图。通过测量相对光密度(Y轴)对标记蛋白带的迁移率(X轴)来确定光密度示踪(densitometric tracing)。在图1的道1和2中列出了SDS-PAGE的光密度扫描。
图3是一荧光图谱，它表示用来自经去垢剂可溶的肺炎链球菌蛋白质提取物免疫之小鼠的血清免疫沉淀的肺炎链球菌蛋白质抗原。来自在37℃生长并在37℃温育(道3、5、7和9)或45℃热休克(道4、6、8和10)的肺炎链球菌的[35S]甲硫氨酸-标记蛋白质用来自小鼠1(道3到6)或小鼠2(道7-10)的血清免疫沉淀，然后用SDS-PAGE和荧光照相术分析。在第一(道3、4和7、8)与第二(道5、6和9、10)次免疫后，检测血清。在道1和2中分别说明来自[35S]甲硫氨酸-标记的非热休克和热休克肺炎链球菌的细胞溶解产物。在荧光图谱的左侧用箭头标明了HSP的位置。
图4是荧光图谱，它表示用来自经热杀死的肺炎链球菌蛋白质提取物免疫之小鼠的血清免疫沉淀的肺炎链球菌蛋白质抗原。来自在37℃生长并在37℃温育(道3、5和7)或45℃热休克(道4、6和8)的肺炎链球菌的[35S]甲硫氨酸-标记蛋白质用来自小鼠1(道3、4)或小鼠2(道5、6)或小鼠3(道7、8)的血清免疫沉淀，然后用SDS-PAGE和荧光照相术分析。只在第二次免疫后，检测血清。在道1和2中分别说明来自[35S]甲硫氨酸-标记的非热休克和热休克肺炎链球菌的细胞溶解产物。在荧光图谱的左侧用箭头标明了HSP的位置。
图5是照片，表示用Western印迹分析检测的肺炎链球菌抗原。用来自经热杀死的肺炎链球菌免疫之15只小鼠的血清(道1-15)检测全细胞提取物。道16表示用MAbF1-Pn3.1检测的HSP72蛋白质。A组中，在第二次免疫后检测血清。B组中表明了第一次免疫后，检测15个血清中的4个血清的反应。在左侧用短划标出了53.5kDa和47kDa蛋白质带的位置。在各组的右侧，用箭头标出了HSP72的位置。
图6是说明MAb F1-Pn3.1对HSP72之特异性的荧光图谱。在不进行(道1、3和5)或进行(道2、4和6)热休克的条件下，肺炎链球菌的[35S]甲硫氨酸-标记蛋白质用IgG2a-对照MAb(道3、4)或F1-Pn3.1(道5、6)进行免疫沉淀，然后用SDS-PAGE和荧光照相术分析。在道1和2中分别为来自[35S]甲硫氨酸-标记非热休克和热休克肺炎链球菌的细胞溶解产物。在荧光图谱的左侧用箭头标明了HSP(所有3种)的位置。
图7，A组是一免疫印迹，说明热休克和非热休克[35S]甲硫氨酸-标记的肺炎链球菌细胞提取物与MAb F1-Pn3.1的反应。道1含有热休克的细胞溶解产物(45℃)。道2含有非热休克细胞溶解产物(37℃)。B组是A组免疫印迹的荧光图谱。
图8是一Western印迹，说明肺炎链球菌HSP72的亚细胞定位。在SDS-PAGE上电泳含15ug膜组分蛋白(道1)和胞质组分蛋白(道2)的样品，然后转移到硝酸纤维素上，用MAb F1-Pn3.1检测。
图9是免疫印迹的照片，说明含肺炎链球菌HSP72的C-169区的重组融合蛋白与MAb F1-Pn3.1的反应性。道1含来自肺炎链球菌菌株64的全细胞提取物，用HSP72特异性MAb F1-Pn3.1检测。道2和3含有存在(+)或不存在(-)IPTG条件下培养的来自λJBDl7感染之大肠杆菌的噬菌体溶解产物，然后用HSP72特异性MAb F1-Pn3.1检测。道4和5含有存在(+)或不存在(-)IPTG条件下培养的来自λJBD7感染之大肠杆菌的噬菌体溶解产物，然后用HSP72特异性MAb F1-Pn3.1检测。在左侧是分子量标记。在左、右侧分别标出了74kDa和160kDa反应性蛋白质的位置。
图10图示说明HSP72(DnaK)和Fuc座位和重组克隆插入片段的限制图谱。说明了它们之间DNA片段间的关系。图10A和10C分别是HSP72(DnaK)和Fuc座位的限制图谱。图10B是实施例3中所述各种噬菌体和质粒的插入片段。H(HindIII)；E(EcoRI)；V(EcoRV)；P(PstI)；和X(XhoI)说明限制核酸内切酶位点的位置。标明了HSP72/DnaK座位上(■)、Fuc座位上(///)的DNA片段；以及用作Southern印迹分析探针的片段(
Figure A9619589100171
)。
图11是重组74kDa蛋白质的SDS-PAGE和Western印迹分析。在存在(+)或不存在(-)IPTG条件下培养的，对用质粒pJBDl79(道1)、pJBDf51(道2和3)和pJBDf62(道4和5)转化的大肠杆菌的全细胞提取物进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后用考马斯兰染色(A)或使用HSP特异性MAb F1-Pn3.1的Western印迹肉眼观察蛋白质。左侧为以kDa计的分子量。各组左侧的箭头表示74kDa蛋白质标记。
图12描述用Western印迹分析检测天然和重组HSP72抗原。对来自用质粒pJBDk51(道1和3)和pJBDk291(道2)转化的大肠杆菌的全细胞溶解产物和来自肺炎链球菌64(道4)的细胞溶解产物进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转移到硝酸纤维素上。用HSP特异性MAbF1-Pn3.1检测免疫印迹。
图13A-13D比较了肺炎链球菌HSP72开放阅读框架的预测氨基酸序列与以前报道的下列HSP70/DnaK蛋白质：ECOLI，大肠杆菌；BORBU，Borrelia burgdorferi；BRUOV，羊型布鲁菌；CHLPN，肺炎衣原体；BACME，巨大芽胞杆菌；BACSU，枯草芽胞杆菌；STAAU，金黄色葡糖球菌；LACLA，Lactococcus lactis；和MYCTU，结核分枝杆菌。只标明了错配的氨基酸。相同的和保守的氨基酸分别用框框起来和阴影表示。
图14是SDS-PAGE的照片，说明用亲和层析纯化的重组肺炎链球菌HSP72。来自大肠杆菌(JBDK51)溶解产物的上清液(道2)和20ug免疫亲和纯化的HSP72rec(道3)经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后通过考马斯兰染色来肉眼观察蛋白质。道1表示分子量标准(106 kDa，80 kDa，49.5kDa，32.5kDa，27.5kDa和18.5kDa)的迁移。
图15是SDS-PAGE照片，说明通过增溶包含体而纯化的重组肺炎链球菌C-169片段。将不同量的纯化C-169蛋白质(道1，5ug；道2，2.5ug；道3，1ug)和来自用质粒pDELTA1(道4)和pJBDΔ1(道5)转化之大肠杆菌的全细胞溶解产物进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后通过考马斯兰染色来肉眼观察蛋白质。
图16图示说明通过用HSP72rec接种，而使Balb/c小鼠免于肺炎链球菌感染的存活曲线。以每组10只小鼠，在14天的存活百分比表示数据。
图17图示说明通过用C-169rec接种，而使Balb/c小鼠免于肺炎链球菌感染的存活曲线。以每组10只小鼠，在14天的存活百分比表示数据。
图18是质粒pURV3的图谱，该质粒含有C-151rec，即肺炎链球菌HSP72的羧基末端151个氨基酸的编码区；AmpiR，即氨苄青霉素抗性编码区；ColE1 ori，即复制原点；cI857，即噬菌体λcI857温度敏感性阻遏基因；λPL，噬菌体λ转录启动子；T1，T1转录终止子。箭头表示转录的方向。BglII和BamHI是用于插入肺炎链球菌C-151rec编码区的限制位点。
图19说明在来自用HSP72rec免疫的Balb/c小鼠血清中，抗肺炎链球菌滴定度的分布情况。在第一、第二和第三次注射1ug(O)或5ug(·)HSP72rec后，收集血清，分别用ELISA评估抗肺炎链球菌抗体。滴定度的定义为A410值比背景值高0.1的最高稀释度，平线表示各组小鼠相互滴度倒数的中位值，而折线表示免疫前血清的中位值。
图20说明在来自用C-169rec免疫的Balb/c小鼠血清中，抗肺炎链球菌滴定度的分布情况。在第一、第二和第三次注射1ug(O)或5ug(·)C-169rec后，收集血清，分别用ELISA评估抗肺炎链球菌抗体。滴定度的定义为A410值比背景值高0.1的最高稀释度，平线表示各组小鼠抗体滴度倒数的中位值，而折线表示免疫前血清的中位值。
图21说明在来自用C-151rec免疫的Balb/c小鼠血清中，抗肺炎链球菌滴定度的分布情况。在第一、第二和第三次注射0.5ugC-151rec后，收集血清，分别用ELISA评估抗肺炎链球菌抗体。滴定度的定义为A410值比背景值高0.1的最高稀释度，平线表示各组小鼠抗体滴度倒数的中位值，而折线表示免疫前血清的中位值。
图22说明用重组HSP72抗原免疫的弥猴的抗体反应。由2只猴子组成的组分别在第1天、第22天和第77天用HSP72rec或C-169rec蛋白质接种。在接种过程中，有规律地收集血清，然后用Western印迹分析单个评估肺炎球菌HSP72特异性抗体。将滴度定义为可肉眼观察到HSP72带的最高稀释度。
图23说明在固相ELISA中，超免疫血清与肽的结合。检测来自用HSP72rec或C-169rec蛋白质免疫的兔、小鼠和猴血清与肽的反应性。用1∶100稀释的血清得到光密度值，而对应于兔血清与肽MAP2和鼠血清与肽MAP2和MAP4之反应性的值是使用以1∶1000稀释的血清得到的。
图24描述从肺炎链球菌(spn-orf)、化脓链球菌(sga-orf)和无乳链球菌(sgb-orf)的hsp70/dnak开放阅读框架的DNA序列得到的共有序列，并说明各种特异性的核苷酸取代和插入。
图25描述从肺炎链球菌(spn-prot)、化脓链球菌(sga-prot)和无乳链球菌(sgb-prot)的HSP70蛋白质序列得到的共有序列，并说明各个种特异性的氨基酸取代和插入。
图26是荧光图，说明热休克对无乳链球菌蛋白质合成以及用MabF2-Pn3.4免疫沉淀无乳链球菌蛋白质的影响。用SDS-PAGE和荧光照像术分析源于生长于37℃，且在37℃温育(奇数道)或在43℃(偶数道)热休克的无乳链球菌〔35S〕甲硫氨酸标记蛋白的细胞溶解物。道3和道4显示了用Mab F2-Pn3.4获得的免疫沉淀。本发明详述
根据本发明的一个方面，我们提供了肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌的新热休克蛋白，和含至少一个免疫原性表位的其类似物、同系物、衍生物片段。如本文所用的“热休克蛋白”是在热应激条件下，抑制优先转录的天然蛋白质。本发明的热休克蛋白可以是天然的，或可以通过重组DNA技术或常规化学合成技术得到。
如本文所用的，“免疫原性”指具有引发免疫反应的能力。本发明新的热休克蛋白的特征在于其引发抗链球菌感染，具体地说，抗致死性肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌的保护性免疫反应之能力。
本发明具体提供约72kDa(HSP 72)的肺炎链球菌热休克蛋白质(SEQID NO：5为其推测的氨基酸序列)，含至少一个免疫原性表位的其类似物、同系物、衍生物片段。
如本文所用的，HSP72的“类似物”是其中HSP氨基酸序列(SEQ IDNO：5)中的一个或多个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代的肺炎链球菌蛋白质，条件是保持所述类似物蛋白质的总功能性和免疫原性。所述类似物可以是天然的，或可以是合成或通过重组DNA技术，例如通过HSP72序列诱变而产生的。HSP72的类似物拥有至少一种能够引发抗体的抗原，所述抗体与HSP72，如脓链球菌和无乳链球菌反应。
如本文所用的，HSP72的“同系物”是，来自除肺炎链球菌、脓链球菌和无乳链球菌以外的链球菌种或链球菌之外的属的蛋白质，其中HSP氨基酸序列(SEQ ID NO：5)中的一个或多个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，条件是保持所述同系物蛋白质的总功能性和免疫原性。所述同系物可以是天然的，或可以是合成或通过重组DNA技术而产生的。HSP72的同系物拥有至少一种能够引发抗体的抗原，所述抗体与HSP72，如粪肠球菌反应。
如本文所用的，“衍生物”是其中已改变了一种或多种物理、化学或生物学特性的多肽。所述改变包括，但不限于：氨基酸取代、修饰、增加或缺失；脂化、糖基化或磷酸化模式的改变；游离氨基、羧基或在多肽氨基酸残基中的羟基侧基团与其他有机和无机分子的反应；以及任何可导致一级、二级或三级结构发生改变的其他改变。
本发明的“片段”至少有一个免疫原性表位。“免疫原性”表位在引发免疫反应的过程中，是功能性的表位。本发明优选的片段可以引发免疫反应，从而足以预防感染或降低感染，如肺炎链球菌感染的严重程度。HSP72的优选片段包括所述多肽的C末端区。更优选的片段包括C末端的169个残基的片段(“C-169”)(SEQ ID NO：5，残基439-607)、C末端的151个残基的片段(“C-151”)(SEQ ID NO：5，残基457-607)和C-169区内，组成肽表位的较小片段。HSP72 C-169区内，特别优选的片段包括肽序列GFDAERDAAQAALDD(SEQ ID NO：5的残基527-541)和AEGAQATGNAGDDVV(SEQ ID NO：5的残基586-600)，它们是肺炎链球菌专有的HSP72，或对应于化脓链球菌或无如链球菌的简并片段(见图25)。甚至更优选的是引发抗链球菌菌株之特异性免疫反应的片段。所述片段可选自下列肽：CS870、CS873、CS874、CS875、CS876、CS877、CS878、CS879、CS880、CS882、MAP1、MAP2和MAP3、MAP4(见表5，同上文)或其同系物。
在本发明的另一方面，我们提供了与HSP70/72免疫学相关的多肽。如本文所用的，“免疫学相关的”多肽是特征在于有下列的一种或多种特性：
(a)它们与通过用肺炎链球菌细胞感染哺乳动物而产物的抗体有免疫反应性，所述抗体与HSP72(SEQ ID NO：5)和HSP70(SEQ ID NO：20和SEQID NO：22)有免疫反应性；
(b)它们能够引发与HSP72(SEQ ID NO：5)和HSP70(SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22)有免疫反应性的抗体；
(c)它们与用HSP72(SEQ ID NO：5)免疫哺乳动物而产生的抗体有免疫反应性。
根据定义，HSP70/72的类似物、同系物和衍生物是免疫学相关的多肽。此外，所有免疫学相关的多肽均含有至少一个HSP70/72抗原。因此，“HSP70/72”在HSP70/72本身中或免疫学相关多肽中找到。
在本发明的另一方面，我们提供了与HSP72免疫学相关的多肽。。如本文所用的，“免疫学相关的”多肽是特征在于有下列的一种或多种特性：
(a)它们与通过用肺炎链球菌细胞感染哺乳动物而产物的抗体有免疫反应性，所述抗体与HSP72(SEQ ID NO：5)有免疫反应性；
(b)它们能够引发与HSP72(SEQ ID NO：5)有免疫反应性的抗体；
(c)它们与用HSP72(SEQ ID NO：5)免疫哺乳动物而产生的抗体有免疫反应性。
根据定义，HSP72的类似物、同系物和衍生物是免疫学相关的多肽。此外，所有免疫学相关的多肽均含有至少一个HSP72抗原。因此，“HSP72”在HSP72本身中或免疫学相关多肽中找到。
如本文所用的，“相关细菌”是具有能够引发与HSP72反应之抗体的抗原。有关细菌的实例包括肺炎链球菌、化脓链球菌、变异链球菌、血链球菌、无乳链球菌和粪肠球菌。
通过本发明的下列实施例应理解，本领域专业人员无需过分试验即可确定特定的类似物、同系物、衍生物、免疫学相关多肽、或片段是否可用于诊断、预防或治疗疾病。有用的多肽和片段将会诱导与HSP72发生免疫反应的抗体(实施例4)。优选的，有用的多肽和片段表明了诱导抗致死细菌感染之保护性免疫反应的能力(实施例5)。
还包括本发明多肽的聚合形式。这些聚合形式包括例如，与交联剂如链霉亲和素/生物素、戊二醛或二甲基suberimidate进行了交联的一种或多种多肽。所述聚合形式还包括含有两个或多个串联或反向相连的连续的蛋白质序列，这是通过重组DNA技术而得到的多顺反子mRNA而产生的。
本发明提供了基本上纯的HSP72和免疫学相关多肽。术语“基本上纯的”指本发明的多肽、编码它们的DNA序列基本上不含有细菌源的其他蛋白质。基本上纯的蛋白质制品可通过各种常规方法，如在实施例3和5中描述的方法得到。
在另一方面，本发明第一次提供了编码肺炎链球菌热休克蛋白质，具体地说，是HSP72的DNA序列(SEQ ID NO：4，核苷酸682-2502)。
本发明的DNA序列还包括编码HSP72之多肽类似物和同系物的DNA序列、编码免疫学相关多肽的DNA序列、任何前述DNA序列的简并DNA序列、以及任何前述DNA序列的片段。很容易理解，在鉴定并分离了所述多肽后，用常规的DNA测序技术，本领域专业人员可以确定本发明任何多肽的DNA序列。
还可以用衍生于编码本发明多肽之基因的寡核苷酸引物和其他核酸探针来分离并克隆来自肺炎链球菌和相关细菌的其他相关蛋白质，所述相关细菌可能含有与本发明DNA序列同源的细菌DNA区。另外，可将本发明的DNA序列用于PCR反应以检测在生物样品中是否存在肺炎链球菌或相关细菌。
本发明的多肽可以用各种方法来制备，例如从适宜的细胞提取物中进行蛋白质分级分离、使用常规的分离技术如离子交换和凝胶色谱和电泳，或通过重组DNA技术。重组DNA技术的使用特别适合于制备本发明基本上纯的多肽。
因此，根据本发明的另一方面，我们提供了生产HSP72、免疫相关多肽、和其片段的方法，所述方法包括步骤(1)培养用载体转化的单细胞宿主生物，所述载体含有编码所述多肽或片段的DNA序列以及一种或多种与所述DNA序列可操作相连的表达控制序列，和(2)回收基本上纯的多肽或片段。
如本领域熟知的，为了在宿主中高水平表达转染的基因，必需将基因与所选的表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列可操作相连。优选地，将表达控制序列和所需基因包含在表达载体中，所述载体还可含有细菌选择性标记和复制原点。如果表达宿主是真核细胞，表达载体还应含有一用于真核表达宿主的表达标记。
编码本发明多肽的DNA序列可编码或不编码一信号序列。如果表达宿主是真核，通常优选的是应编码一信号序列以便可从真核宿主中分泌出成熟蛋白质。
在本发明的表达多肽上可以有也可以没有氨基末端的甲硫氨酸。如果表达宿主不切除末端甲硫氨酸，则如果需要的话，可通过标准技术化学除去。
可以用各种表达宿主/载体组合来表达本发明的DNA序列。用于真核宿主的有用的表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒和反转录病毒之表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括细菌质粒，如来自大肠杆菌的那些，包括pBluescript、pGEX2T、pUC载体、col E1、pCR1、pBR322、pMB9和其衍生物，更宽范围的质粒如RP4、噬菌体DNA，如噬菌体λ的大量衍生物，如λgt10和λgt11、NM989和其他噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。用于酵母细胞的有用的表达载体包括2μ质粒和其衍生物。用于昆虫细胞的有用的载体包括pVL941。
另外，可将各种表达控制序列用于这些载体以表达本发明的DNA序列。有用的表达控制序列包括与前述表达载体之结构基因相关的表达控制序列。有用的表达控制序列的实例包括例如SV40和腺病毒的早期和晚期启动子， lac系统， trp系统， TAC或 TRC系统，T3和T7启动子，噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区，fd包被蛋白的控制区，3-磷酸甘油激酶或其他糖酵解酶、酸性磷酸酶的启动子如Pho5，酵母α-交配系统启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒之基因表达的其他组成型和诱导型启动子序列，和其各种组合。T7RNA聚合酶启动子10在大肠杆菌中表达HSP72是特别有用的(实施例3)。
用前述载体转化的宿主细胞形成了本发明的另一方面。各种单细胞宿主可用于表达本发明的DNA序列。这些宿主可包括熟知的真核和原核宿主，如大肠杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌、链霉菌、真菌、酵母的菌株，昆虫细胞如草地贪夜蛾(SF9)，动物细胞如CHP和小鼠细胞，非洲绿猴细胞如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10，人细胞和组织培养的植物细胞。优选的宿主生物包括细菌如大肠杆菌和枯草芽胞杆菌和组织培养中的哺乳动物细胞。
当然应理解不是所有的载体和表达控制序列都能够同样好地表达本发明的DNA序列。也不是所有的宿主都同样好地与同一的表达系统起作用。但是，本领域专业人员可以对这些载体、表达控制序列和宿主进行选择而无需过分试验，而且也不会偏离本发明的范围。例如在载体的选择中，必需考虑宿主，因为载体必需要在其中进行复制。还应考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力以及由载体编码的任何其他蛋白质的表达如抗生素标记。在表达控制序列的选择中，还应考虑各种因素。这些包括例如序列的相对长度、其控制能力以及其与本发明DAN序列，特别是潜在二级结构的相容性。根据与所选载体的相容性、由本发明DNA序列编码之产物的毒性、其分泌特征、其正确折叠蛋白质的能力、其发酵或培养要求、是否容易从中纯化由本发明DNA编码的产物来选择单细胞宿主。在这些参数内，本领域专业人员可选择各种载体/表达控制序列/宿主组合，在发酵或大规模动物培养中表达本发明的DNA序列。
用包括下列的各种常规方法可以从发酵物或细胞培养物中分离并纯化由本发明DNA序列编码的多肽：液相色谱如用HPLC、FPLC的正相或反相等；亲和色谱(如用无机配体或单克隆抗体)；大小排阻色谱；固定金属螯合剂色谱；凝胶电泳等。本领域专业人员在不偏离本发明范围的情况下，可以选择最适宜的分离和纯化方法。
另外，可以用任何化学方法生产本发明的多肽。例如用由R.B.Merrifield，“Solid Phase Peptide Synthesis.I.The Synthesis Of aTetrapeptide”，J.Am.Chem.Soc.，83，pp.2149-54(1963)描述的固相合成技术制备所述多肽，或可通过在溶液中合成来制备。肽合成技术的综述参见：E.Gross & H.J.Meinhofer，4 ThePeptides：Analysis，Synthesis，Biology；Modern Techniques Of Peptide AndAmino Acid Analysis，John Wiley & Sons，(1981) andM.Bodanszky，Principles Of Peptide Synthesis Springer-Verlag(1984)。
本发明的优选组合物和方法包括具有增强的免疫原性的多肽。当修饰多肽的天然形式或其片段或对其进行处理以增强其在待试受者中的致免疫特征时，可得到所述多肽。优选的多肽是链球菌特异性片段，如选自天然多肽C末端的片段。可使用各种可得到的、而且本领域专业人员熟知的技术，而不需进行过分试验，就可极大增强本文公开之多肽的免疫原性。例如通过与二硝基苯酚或阿散酸偶联，或通过热和/或SDS变性可修饰多肽。特别是，如果所述多肽是化学合成的小多肽，则期望将其与致免疫载体偶联。当然，偶联必需不能干扰多肽或载体发挥正常的功能。有关偶联策略的综述参见Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，ed.E.Harlow and D.Lane(1988)。有用的致免疫载体是本领域熟知的。所述载体的实例是匙孔兰蛋白(KLH)；白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和卵白蛋白，PPD(纯化的结核菌素衍生物)；红细胞；破伤风类毒素；霍乱类毒素；琼脂糖珠；活化的碳或膨润土。
为了改变脂化状态，修饰本文公开之多肽的氨基酸序列也是一种方法，可以用这种方法来增强其免疫原性和生物化学特性。例如，多肽或其片段可以与或不与信号序列一起表达，所述信号序列可指导脂部分加成。
根据本发明，可用各种方法来制备多肽衍生物，包括体外操作编码多肽的DNA，随后表达修饰的DNA，化学合成衍生的DNA序列，或通过化学或生物学方法操作表达的氨基酸序列。
例如，通过用不同的天然氨基酸、氨基酸衍生物或非天然氨基酸取代一个或多个氨基酸来生产衍生物，保守取代是优选的，例如3-甲基组氨酸可取代组氨酸，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸，5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸等。
例如通过引起电荷、构型和其他生物性活性的变化，引起保守性降低的氨基酸取代也会得到所需的衍生物。所述取代包括例如可用亲水残基取代疏水残基、用半胱氨酸或脯氨酸取代另一残基，用具有小侧链的残基取代具有大侧链的残基或用具有净正电荷的残基取代带净负电荷的残基。当给定的取代之结果不能确定性地预测时，用本文公开的方法很容易检测衍生物以确定是否存在所需的特征。
根据增加稳定性或提供更易于纯化和制备之分子的目的，也可制备肽。一种所述技术是将多肽表达为含其他肺炎链球菌或非肺炎链球菌序列的融合蛋白。优选含本发明多肽的融合蛋白是在DNA水平生产的，例如通过构建编码融合蛋白的核酸分子，用所述分子转化宿主细胞，诱导细胞表达融合蛋白，然后从细胞培养物中回收融合蛋白。另外，在按照已知方法，进行基因表达后，可生产融合蛋白。本发明融合蛋白的一个实例是实施例3(见下文)的FucI/HSP72(C-169)蛋白。
本发明的多肽可以是用重组或化学合成之较大的多聚体分子的一部分。所述多聚体还可包括与氨基酸以外包括类脂和碳水化合物的部分，融合或偶联的多肽。
本发明多肽特别适用于产生抗体以及建立抗疾病的保护性反应。因此，在本发明的另一方面，我们提供了具有HSP72免疫反应性的抗体或其片段。本发明的抗体还可通过用HSP72或免疫相关肽来诱导，或通过其与HSP72或免疫相关肽的反应性来鉴定。应理解本发明的抗体不包括当被天然肺炎链球菌感染后正常引发的，而且在引发的动物内未能被除去或改变的那些抗体。
本发明的抗体是含有完整抗原结合位点的完整免疫球蛋白分子或其片段，包括本领域已知的如F(v)，Fab，Fab’和F(ab’)2。还可通过遗传工程方法或合成方法来生产抗体。抗体或片段可以是动物源，特别是哺乳动物源的，更具体地说是鼠、大鼠、猴子或人源的。它可以是天然抗体或片段，或如果需要，可以是重组抗体或片段。所述抗体或抗体片段可以是多克隆的，或优选是单克隆的。它们可以是大量表位特异性的，但优选是一种表位特异性的。特别优选的是实施例2(见下文)的单克隆抗体F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。本领域专业人员可以使用本发明的多肽以生产其他单克隆抗体，所述单克隆抗体可根据其当用于免疫初次受试动物时赋予抗肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌或其他链球菌相关细菌感染的能力来进行筛选。在发现特定的单克隆抗体赋予了保护作用后，就可鉴定被该抗体识别特定的表位。生产多克隆和单克隆抗体的方法是本领域专业人员熟知的。所述方法的综述参见antibodies，a LaboratoryManual同上文，和D.E.Yelton等，Ann.Rev.of Biochem.，50，pp657-80(1981)。可以用本领域已知的任何方法，包括免疫印迹检测和ELISA确定与本发明多肽的免疫反应性。
本发明的抗体还可以是杂种分子，所述杂种分子可以是从不同种(如小鼠和人)的免疫球蛋白或从相同种的免疫球蛋白轻和重链部分形成的。它还可以是有多结合特异性的分子，例如用本领域专业人员熟知的各种技术制备的双功能抗体，所述技术包括：杂种杂交瘤的生产；二硫键交换；化学交联；在两个单克隆抗体之间增加肽键；将两组免疫球蛋白重和轻链导入特定的细胞系等。本发明的抗体还可以是人单克隆抗体，例如通过不死的人细胞系、SCID-hu小鼠或其他能够生产“人”抗体的非人动物或通过表达克隆的人免疫球蛋白基因而生产的抗体。
总之，本领域专业人员按照本发明的教导，可以用各种方法来改变本发明抗体的生物学特性，所述方法包括增加或降低特定抗体分子的稳定性或半衰期、免疫原性、毒性、亲和性或产率，或以任何方式使其发生改变以便更适用于特定的应用。
本发明的多肽、DNA序列和抗体可用于预防、治疗和诊断组合物，所述组合物可用于预防、治疗和诊断疾病。
可以将标准免疫学技术与本发明的多肽和抗体一起使用以便将其作为免疫原和疫苗。具体地说，用药物有效量的多肽可注射给任何适宜的宿主以便产生单克隆或多价抗体或诱导抗疾病的保护性免疫反应。优选的，所述多肽选自HSP72(SEQ ID NO：5)、HSP70(SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22)或其片段。
如本文所用的，多肽或抗体的“药物有效量”指，当施用于患者后，可引发免疫反应，所述免疫反应可有效地预防或降低链球菌或相关细菌感染的严重程度。
可以按照实施例10(见下文)中所述的任何方法，或各种其他的标准方法来施用本发明的多肽或抗体。有关所述技术的详细讨论，参见Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ed.E.Harlow and D.Lane(1988)。优选的，如果使用多肽，则应与可药用佐剂如完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)一起施用。优选组合物包括油包水乳液或以氢氧化铝作为佐剂并经肌肉内施用。在一定时间或在一系列的治疗中给患者施用疫苗组合物。最有效的施用方式和最佳剂量方案取决于免疫原性水平、用于治疗的特定组合物和/或佐剂、预期感染的严重性和过程、以前的治疗、患者的健康状况和对接种的反应，以及医生的判断。例如在具免疫能力的患者中，多肽的致免疫性越高，则所需的接种剂量越低，次数越少。同样，如果将多肽与佐剂一起施用，则就可减少剂量和必需的治疗时间。
总之，剂量由约0.01-10mg，优选0.1-1.0mgHSP72抗原/患者的首次注射(经常是与佐剂一起)，然后是一次或可能多次的加强注射组成。优选加强注射在开始注射后的约1和6个月进行。
本发明的多肽可以以可药用盐的形式使用。能够与本发明多肽形成盐的适宜的酸和碱是本领域专业人员熟知的，包括无机和有机的酸和碱。
为了就共赋予抗肺炎链球菌或相关细菌引起之疾病的能力、或其降低所述感染严重性的能力而筛选本发明的多肽和抗体，本领域专业人员可以使用许多动物模型。可以使用任何对肺炎链球菌或相关细菌感染敏感的动物。实施例5的Bal/c小鼠(见下文)对于主动免疫保护筛选是优选的动物模型，实施例5恶性复合免疫缺陷(severe-combined immunode ficient)小鼠是被动筛选的优选动物模型。因此通过给这些动物模型施用特定的多肽或抗体，本领域专业人员无需过分实验就可以确定多肽或抗体是否在本文的方法和组合物中是有用的。
根据本发明的另一实施方案，我们描述了一种方法，该方法包括以足以预防或降低(在一段时间内)链球菌或相关细菌感染严重程度的方式，用含有药物有效量的本发明的任何多肽来治疗患者。此外，用于所述方法的优选多肽是HSP70/HSP72或其片断。
本发明的多肽、DNA序列和抗体还是诊断方法以及用于检测病原体生物之试剂盒的基础。有多种不同的诊断方法。例如本发明提供了检测生物样品中的肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌或相关细菌的方法，所述方法包括下步骤：
(a)从患者体内分离生物样品；
(b)将本发明的多肽或其片段与所述生物样品一起培养以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的抗体或片段，从而表明是否存在肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌或相关细菌。用于该方法的优选抗体包括单克隆抗体F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。
另外，本发明还提供了检测生物样品中肺炎链球菌或相关细菌特异性抗体的方法，所述方法包括步骤：
(a)从患者体内分离生物样品；
(b)将本发明的多肽或其片段与所述生物样品一起培养以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的多肽，从而表明是否存在肺炎链球菌或相关细菌特异性的抗体。在上述检测抗体的方法中，HSP72(SEQ IDNO：5)、其C-169片段(SEQ ID NO：5的残基439-607)其C-151片段(SEQ ID NO：5的残基457-607)、和肽片段GFDAERDAAQAALDD(SEQ ID NO：5的残基527-541)和AEGAQATGNAGDDVV(SEQ ID NO：5的残基586-600)是优选的多肽和片段。
本领域专业人员可以认识到这些诊断实验可采用多种形式，包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射性免疫检测或胶乳凝集实验。
可将诊断试剂包括在试剂盒中，试剂盒可包括使用说明和其他适宜试剂，优选当结合多肽或抗体时，用于检测的工具。例如可将多肽或抗体用一种检测工具来标记，这样可以检测与抗体结合的多肽，或检测与肺炎链球菌或相关细菌结合的抗体。检测工具可以是荧光标记试剂如异氰酸荧光素(FIC)、异硫氰酸荧光素(FITC)等，酶如辣根过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶等，产生γ射线的放射性元素如125I或51Cr，或与检测溶液中的电子遭遇后，发出产生γ射线的正电子的放射性元素如11C、15O或13N。也可用其他方法，如经链霉亲和素-生物素复合物检测结合情况。检测工具结合是本领域熟知的。例如通过将含放射性同位素的氨基酸掺入到培养基中，可代谢标记由杂交瘤生产的单克隆抗体，或可将多肽通过激活的功能基团而与检测物质结合或偶联。
可用本发明的DNA序列设计用于检测生物样品中是否存在肺炎链球菌或相关细菌的DNA探针。本发明以探针为基础的检测方法包含下列步骤：
(a)从患者体内分离生物样品；
(b)将具有本发明DNA序列的DNA探针与所述生物样品一起温育以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的DNA，以表明存在肺炎链球菌或相关细菌。
还可将本发明的DNA探针用于检测样品中环化的核酸，例如可以用聚合酶链反应，可作为诊断肺炎链球菌或相关细菌感染的方法。所述探针可以用常规技术合成，并固定在固相上，或可用可检测标记进行标记。用于该应用的优选DNA探针是一种寡聚物，该寡聚物与HSP72(SEQ IDNO：4，核苷酸682-2502)的至少约6个连续的核苷酸互补。
例如利用在抗原柱上免疫亲和纯化抗体的方法，本发明的多肽还可用于纯化抗蛋白质上表位的抗体。
按照本发明，例如利用在抗原柱上免疫亲和纯化抗体的方法，还可将本发明的抗体或抗体片段用于制备基本上纯的蛋白质。
                        实施例
为了更好地理解本发明，列举了下列实施例。这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不以任何方式对本发明的范围构成限制。
实施例1描述了HSP72，即本发明免疫反应性热休克蛋白的鉴定。实施例2描述了抗HSP72表位之单克隆抗体的分离。实施例3描述了本发明HSP72和HSP72片段的制备。实施例4描述了本发明抗HSP72及免疫相关蛋白之单克隆抗体的抗原特异性和免疫反应性的鉴定。实施例5描述了得到基本上纯的HSP72的方法，HSP72或抗HSP72抗体以抵御肺炎链球菌感染的用途。实施例6描述了本发明HSP72的重组C-151片段的制备方法。实施例7描述了用本发明的重组HSP72或HSP72片段接种后，产生的体液免疫反应。实施例8描述了HSP72上的线性B细胞表位的定位。实施例9描述了肺炎链球菌和化脓链球菌的hsp70基因和HSP70蛋白质。实施例10描述了HSP72抗原在人疫苗中的用途。实施例1鉴定免疫反应性肺炎链球菌热休克蛋白
A方法
除非特别说明，在本文的全部实施例中均使用下列方法。
1细菌
肺炎链球菌菌株是由Laboratorire de la Sante Publique duQuebéc，Sainte-anne de Bellevue。肺炎链球菌菌株包括4型菌株53和6型菌株64。如果未特别说明，则使用肺炎链球菌6型菌株64。在巧克力琼脂板上，使细菌菌株在37℃，5％二氧化碳中生长过夜。
2抗原制备
制备各种肺炎链球菌抗原以用于免疫和免疫实验。通过在56℃预热的水浴中将细菌悬浮液保温20分钟来得到热杀死的全细胞抗原。按下述方法，从肺炎链球菌中提取可溶于洗涤剂的蛋白质。将热杀死的细菌悬浮在10mM Hepes缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(Boehringer MannheimGmbH，Germany)(pH7.4)中，以20,000Kz/秒声处理4次30秒。以1,700g离心20分钟，除去完整细胞和大碎片。收集上清液并以100,000g离心60分钟。将沉淀重悬在1ml Hepes缓冲液中，加入1ml 2％N-月桂酰肌氨酸(Sigma Chemical Co.，St.，Louis，MO)。在室温将混合物保温30分钟，然后以100,000g离心60分钟来收集溶于洗涤剂的馏分。
3热休克处理
将肺炎链球菌(4型，菌株53和6型，菌株64)重悬在不含甲硫氨酸的Eagle’s基本培养基(ICN Biomedicals Inc.，Costa Mesa，CA)中，37℃用补充1％ BIO-X(Quelab Laboratories，Montreal，Canada)15分钟，然后分成等体积的馏分。在37℃或45℃，将样品保温5分钟，然后用100μCi/ml[35S]甲硫氨酸(ICN)在37℃标记10、30或60分钟。收集细菌，然后按照上述，用Tris-HCl溶解缓冲液或SDS-PAGE样品缓冲液制备细胞提取物。
4免疫接种小鼠
用肺炎链球菌抗原免疫接种雌性Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories，St-Constant，Quebéc，Canada)。通过皮下注射107热杀死的细菌或20μg溶于洗涤剂的吸附与氢氧化铝佐剂(Alhydrogel；CedarlaneLaboratories Ltd.，Horny，Ontario，Canada)的肺炎球菌蛋白，以2周的间隔从免疫接种的小鼠中得到肺炎链球菌6型菌株64的免疫血清。在免疫接种前和第一次和第二次免疫接种后7天收集血液样品。
5SDS-PGAE和免疫检测
通过将细菌悬浮液在Tris-HCl溶解缓冲液(50mM Tris，150mMNaCl，0.1％十二烷基磺酸钠，0.5％ Na deoxycholate，2％ Triton X-100,100μg/ml苯基甲基磺酰基氟化物和2μg/ml抑蛋白酶肽)(pH8.0)中，在冰上保温30分钟，将细胞提取物用于SDS-PGAE、Western印迹分析和放射性免疫沉淀检测。通过离心清楚溶解的细胞，然后将上清液分成等份，然后在-70℃冷冻保藏。
按照Laemmli[Nature，227，pp.680-685(1970)]的方法，用Mini Protean系统(BioRad Laboratories Ltd.，Mississauga，Canada)，在10％聚丙烯酰胺凝胶上完成SDS-PGAE。通过在含2％2-巯基乙醇的样品缓冲液中煮沸5分钟而使样品变性。用PhastGel Blue(Pharmacia Biotech Inc.，Baied’Urfé，Canada)染色聚丙烯酰胺凝胶来分辨蛋白质。通过荧光照相肉眼观察放射性标记的产物。用激光光密度测量仪扫描荧光图。
按照Towbin等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，pp.4350-4354(1979)]的方法完成免疫印迹方法。用过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白和邻联茴香胺颜色底物，通过间接抗体免疫实验来完成抗原与抗体反应的检测。
按照J.A.Wiley等[J.Virol.66，pp.5744-5751(1992)]的描述来完成放射性免疫沉淀试验。总之，将血清或杂交瘤培养上清液加到含等量[35S]甲硫氨酸的放射性标记的样品中。4℃，将混合物保温90分钟，同时恒定搅拌。然后4℃，用牛血清白蛋白处理的蛋白质A Sepharose(Pharmacia)将免疫复合物沉淀1小时。将珠沉淀，用pH8.0的Tris缓冲盐洗涤3次，然后通过在样品缓冲液中煮沸来离解抗原复合物。在SDS-PAGE上，通过电泳分析抗原。固定凝胶，用Amplify(Amersham CanadaLimited，Oakville，Ontario，Canada)增强荧光显影，干燥然后暴露于X射线胶片。
B肺炎链球菌中热休克反应的表征
在从37℃到45℃前后，我们通过蛋白质合成的方式研究了肺炎链球菌的热休克反应。图1表示当肺炎链球菌6型菌株64(A组)和4型53菌株(B组)在37℃生长，37℃(道1、3、5、7和9)或在45℃(道2、4、6、8和10)保温5分钟，然后用[35S]甲硫氨酸标记10分钟(道1、2和7、8)、30分钟(道3、4和9、10)或60分钟(道5、6)时的结果。
从SDS-PAGE得到的荧光图表明增加温度后，至少有3种蛋白质的合成增加(图1)。最显著诱导的蛋白质是约72kDa(HSP72)、而另两种是约80kDa(HSP80)和62kDa(HSP62)。在标记10分钟后(图1，道1、2和7、8)，蛋白质合成的增加已经很明显，而且当标记期延长到30分钟(图1，道3、4和9、10)和60分钟(图1，道5、6)后，变得更加显著。温度增加对两种不同肺炎链球菌菌株蛋白质合成图的影响相似，合成了分子量相似的HSP(A组的(6型64菌株)与B组(4型53菌株)相比)。
分析扫描蛋白质合成图谱的光密度测量示踪可以估算蛋白质的相对量。例如就热休克的肺炎链球菌6型菌株64而言，标记10分钟后，HSP80和HSP62分别产生2.9％和6.8％的标记蛋白，而37℃产生的不到0.1％(图2)。在37℃和45℃检测表观分子量为72kDa的标记蛋白(图2)。但放射性免疫沉淀分析表明，在37℃检测不到HSP72(上文；和图3、4和6)，因此表明图2的峰9对应于与HSP72共迁移的蛋白质组分。假设在该物质的标记中没有改变，这些结果表明HSP72的量在热休克处理后，占总标记细胞蛋白质的8.7％。比较光密度测量示踪表明对应于峰4、10、13、17、19和21的细胞蛋白质是以与热休克处理无关的相同速率合成的(图2)。但是，在应答热休克处理过程中，多种蛋白质(峰1、2、3、15、20、22、24和26)的合成有显著的下降。
C对肺炎链球菌HSP的免疫反应
为了评估对肺炎球菌的抗体反应，首先用放射性免疫沉淀检测小鼠血清。图3和4中列出了可被用肺炎链球菌免疫之小鼠的血清识别的标记蛋白的所有组成成份。图3是去垢剂可溶的蛋白质制品。图4是热杀死的细菌制品。尽管用大多数抗血清检测了许多带，但HSP72主要是沉淀产物。通过检测热休克产物中的蛋白质(图3，道4、6、8和10；和图4；道4、6和8)来说明HSP72抗体的特异性。令人惊奇的是，所有免疫的小鼠都识别HSP72。由于观察到与异源肺炎链球菌HS片2的强反应性，因此抗体与HSP72的反应性对于在免疫过程中所用的菌株来说不是特异性的。应注意到，除HSP72外，一种血清沉淀在37℃和45℃标记的共迁移产物(图4，道4)。该72kDa产物可能对应于图2中峰9的组分，但在免疫印迹中检测不到。HSP62是另一免疫靶，是通过一些而不是所有免疫血清沉淀的(图3，道6；图4，道4和6)。没有一种试验血清与HSP80有反应。当从该研究所用的小鼠中取预血清来检测是否存在与标记产物反应的抗体时，没有蛋白质沉淀。
如图3和5中所描述的，在用洗涤剂可溶的蛋白质或肺炎链球菌全细胞提取物免疫接种后，可以检测HSP72抗体。另外，在第二次免疫接种后，观察到对HSP72的抗体反应显著增加(图3，比较4和6，及道8和10)。
用热杀死的肺炎链球菌免疫接种的15只小鼠的免疫印迹图谱明显与以前描述的放射性免疫沉淀结果一致。尽管对各种蛋白质，会发生抗体反应变化，但在第一次免疫接种后，HSP72主要是8种(53％)阳性血清的免疫反应抗原(图5)。在第二次免疫接种后，在试验的15种免疫血清中的13种(87％)检测到HSP72抗体。在5种(33％)和7种(47％)血清中，分别检测到表观分子量为53.5和47 kDa另两种主要抗原(图5)。在免疫印迹实验中，用重组HSP72抗原确定72 kDa-反应带为肺炎球菌HSP72(见下文实施例3)。预免疫血清不能检测任何肺炎球菌蛋白质。实施例2分离抗HSP72表位的单克隆抗体
A方法
1免疫小鼠和融合
用肺炎链球菌抗原免疫接种雌性Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories)。一组小鼠(融合试验1)通过腹膜注射107福尔马林杀死的全细胞抗原(来自MTL菌株，悬浮在弗氏完全佐剂中)来免疫接种，以两星期的间隔，用相同的抗原，然后加上来自热杀死细菌的声处理物(sonicate)(在弗氏完全佐剂中的)加强接种。第二组小鼠(融合试验2)以三个星期的间隔，用75μg来自菌株64(6型)的洗涤剂可溶的肺炎球菌抗原(在25μg Quil A佐剂(Cedarlane Laboratories Ltd.，Hornby，Ontario，Canada)中)免疫接种。融合前3天，所有小鼠腹膜内注射只悬浮在PBS中的不同抗原。按照J.Hamel等[J.Med.Microbiol.，23，pp.163-170(1987)]所述，通过将脾细胞与非分泌SP2/0骨髓瘤细胞融合来生产杂交瘤。通过系列限制稀释克隆特异性的杂交瘤，然后扩增并冷冻在液氮中。按照Martin等[Eur.J.Immunol.，18，pp.601-606(1988)]所述，用从Southern BiotechnologyAssociates Inc.(Birmingham，AL)得到的试剂确定MAbs的型、亚型和轻链。
2亚细胞分级分离
按照Pearce[Mol.Microbiol.，9，pp.1037-1050(1993)]描述的技术，将肺炎球菌分离成亚细胞馏份。总而言之，37℃使肺炎链球菌菌株64(6型)在用0.5％(w/v)酵母提取物补充的Todd Hewitt培养液中生长6小时，然后离心分离。将细胞沉淀重悬在25mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰基氟化物(PMSF)中，然后用15秒脉冲声处理4分钟。离心除去细胞碎片。以98,000离心4小时来分离细菌膜和胞质重复。将胞质(上清液)和膜(沉淀)馏份调到1mg蛋白质/ml，然后进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。
B鉴定并表征肺炎链球菌HSP72的MAbs
按照D.Martin等(同上文)描述的方法，用来自肺炎链球菌菌株65(4型)的全细胞，通过点酶免疫试验初步筛选杂交瘤的培养上清液。然后再通过免疫印迹检测阳性杂交瘤以便鉴定分泌与HSP72反应之MAbs的杂交瘤。在免疫印迹中，26个杂交有抗肺炎链球菌反应性，其中4个识别蛋白质带上的表位，所述蛋白质的表观分子量为72kDa。将这4个杂交瘤命名为F1-Pn3.1(来自融合实验1)和F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4(来自融合实验2)。同种型分析表明杂交瘤F1-Pn3.1(来自融合实验1)分泌IgG-2ak免疫球蛋白，而杂交瘤F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4(来自融合实验2)均分泌IgG1k。由于没有抗[35S]甲硫氨酸-标记的肺炎链球菌蛋白(从在37℃的培养物得到的)的放射性免疫沉淀活性，从而清楚地说明了HSP72之MAbs的特异性，而72kDa蛋白与45℃保温的热休克衍生的溶解产物发生免疫沉淀。图6(道5和6)表明了Mab F1-Pn3.1的结果。用Mabs F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4得到了相同的结果。
将用MAbs探测的来自非热休克和热休克肺炎链球菌细胞的[35S]甲硫氨酸-标记的溶解产物在SDS-PAGE凝胶上电泳，然后进行Western印迹分析。所得的免疫印迹表明在两种样品中均存在HSP72抗原。图7，A组表明了Mab F1-Pn3.1的结果。用Mabs F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4得到了相同的结果。因此，热休克应激不会显著增加抗HSP72单克隆抗体的反应性。但免疫印迹荧光图清楚地表明发生了热休克反应(图7，B组)。这些试验表明为应答热休克，肺炎链球菌HSP72的合成速率有所提高，但在热休克后，HSP72的绝对量没有增加。
CHSP72的细胞定位
为了研究HSP72的细胞位置，通过差速离心来分离肺炎链球菌的细胞溶解产物，从而得到可溶馏份和富集膜蛋白质的颗粒馏份(同上文)。将肺炎链球菌的含15μg蛋白质的膜馏份(道1)和胞质馏份(道2)在SDS-PAGE上电泳，然后转移到硝酸纤维素上，用Mab F1-Pn3.1检测。在所得的Western印迹中，在两种馏份中均发现了HSP72，大部分蛋白质与胞质馏份有关(图8)。实施例3编码HSP72抗原之基因的分子克隆、测序和表达
A方法
1菌株和质粒
在表1中列处理在该研究中所用的菌株和质粒。
表1：细菌菌株、噬菌体和质粒菌株、噬菌体、质粒      相关特征          文献或来源大肠杆菌菌株JM109              Δ(lac-proAB)[F’traD      BRL
                proAB lacIq ZΔM15]Y1090               rk-mk-lon sup[pMC9]   AmershamBL21(DE3)           lacUV5-T7 RNA聚合     Studier等见下文
                酶噬菌体λgt11              cI857 S100克隆载体       AmershamλJBD7              LacZ-HSP72融合片          本研究
                段；λgt11中的2.3kb
                EcoRI片段λJBD17             FucI-HSP72嵌合体；        本研究
                2.4kb EcoRI片段和
               λgt11中的2.3kb
                EcoRI片段质粒pWSK29              Ampr；低拷贝克隆载Wang等(见下文)
                体pWKS30              与pWSK29相同，但Wang等(见下文)
                有相反的多克隆位点pJBD171             与λJBD17相同，但在       本研究
                pWSK29中pJBD177             在pWKS30中的2.8           本研究
               kb  XhoI-EcoRI  片
               段，不含重组HSP72pJBD179            FucI-HSP72融合体；        本研究
               pWSK29中的2.4kb
               EcoRI片段和0.8kb
               EcoRI-EcoRV片段pT7-5              Ampr；T7启动子φ10 Tabor等(见下文)pT7-6              与pT7-5相同，但有Tabor等(见下文)
               相反的多克隆位点pJBDf51            与pJBD179相同，但         本研究
               在T7-5中pJBDf62            与pJBD179相同，但         本研究
               在T7-6中pDELTA1            Ampr；Tn100              BRLpJBDΔ1            与pJBD179相同，但         本研究
               在pDELTA1pJBD291            HSP72；在pWSK29           本研究
               中的3.2 kbHindIII片
               段pJBDk51           与pJBD291相同，但          本研究
              在T7-5中pJBDΔ4           与pJBD291相同，但          本研究
              在pDELTA1中
37℃在L肉汤或L琼脂上使大肠杆菌菌株生长。需要时，以50μg/ml的浓度将氨苄青霉素加到培养基中。用Magic/Wizard Mini-Prep试剂盒(Promega，Fisher Scientific，Ottawa，Canada)分离质粒。
2常规重组DNA技术
从Boehringer Mannheim Canada，Laval，Quebec或PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden购买限制核酸内切酶、T4 DNA聚合酶和DNA分子量标准。按照J.Sambrook等[分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约，1989]所述完成DNA限制核酸内切酶消化和连接。用来自Boehringer Mannheim的TAE缓冲液(0.04 M Tris乙酸；0.002 MEDTA)，完成DNA片段琼脂糖凝胶电泳。用Prep-A-Gene DNA纯化试剂盒(Bio-Rad Laboratories Ltd.，Mississauga，Ontario)，从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段。按照制造商提供的方法，用Gene Pulser(Bio-Rad)通过电穿孔完成转化。
3构建和筛选基因组文库
按照制造商提供的方法，用噬菌体表达载体λgt11(λgt11克隆系统，Amersham)制备肺炎链球菌的基因组DNA文库。按照J.C.Paton等[Infect.Immun.，54，pp.50-55(1986)]的方法，制备肺炎链球菌6型64菌株的染色体DNA。用EcoRI部分消化肺炎链球菌的染色体DNA，从琼脂糖凝胶上分离并纯化4到7 kb的片段。将片段连接到λgt11臂，包装，然后用所得的噬菌体化合物感染大肠杆菌Y1090。用HSP72特异性单克隆抗体F1-Pn3.1(同上文)免疫筛选表达重组HSP72抗原的噬菌斑。分离并纯化被Mab F1-Pn3.1识别的表达肽的噬菌斑。制备液体溶解产物，然后按照制造商的说明和常规DNA纯化方法，从Promega LambdaSorb噬菌体吸附剂上纯化DNA。
4Southern印迹分析
在本实施例中，用从Boehringer Mannheim得到的非放射性DIG DNA标记和检测试剂盒完成Southern印迹分析。通过琼脂糖凝胶纯化筛选用作探针(见下文)的DNA片段，然后用洋地黄毒苷(DIG)-11-dUTP标记。用HindIII消化肺炎球菌染色体DNA，然后在0.8％ SDS-PAGE凝胶上电泳分离消化片段，并按照J.Sambrook等(同上文)转化到带阳性电荷的尼龙膜(Boehringer Mannheim)上。按照制造商的方法，用DIG-标记的DNA探针印迹膜。
5DNA测序和序列分析
首先将本实施例中待测序的DNA片段克隆到质粒pDELTA 1(GIBCOBRL Life Technologies，Burlington，Ontario)中。按照供应商同的方法，通过由Tn1000转座子转位(Deletion Factory System，GIBCO BRL)介导的体内缺失，从两条链产生系列嵌套缺失。通过琼脂糖凝胶电泳确定这些缺失的大小，通过F.Sanger等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，pp/5463-5467(1977)]双脱氧核苷酸链终止法来首先适宜的缺失衍生进行测序。为了确定缺失模板之间缺口的序列，，用寡核苷酸合成仪392(ABI，Applied BiosystemsInc.，Foster City，CA)合成寡核苷酸。用Taq DyeDeoxy Terminatou Cycle测序试剂盒(ABI)，通过PCR(DNAThermal Cycler 480，Perkin Elmer)完成测序反应，在自动DNA测序仪373A(ABI)上进行DNA电泳。
6在大肠杆菌T7 RNA pol/启动子系统中表达克隆的基因
利用大肠杆菌中的噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统，完成本实施例中克隆基因的高水平表达。以其中将待表达基因置于噬菌体T7 RNA聚合酶特异性启动子10控制下的适宜方向，将说明重组蛋白质的DNA片段连接到质粒pT7-5或pT7-6[S.Tabor and C.C.Richardson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，pp.1074-1078(1985)]。将所得的质粒转到大肠杆菌菌株BL21(DE3)[F.W.Studier andB.A.Moffatt，J.Mol.Biol.，189，pp.113-130(1986)]中，该菌株在其染色体上携带了位于可诱导lacUV5启动子下的T7 RNA聚合酶结构基因。在IPTG诱导后，在BL21(DE3)转化体中诱导的T7 RNA聚合酶特异性地转录在T7启动子10控制下的基因。用Western印迹或考马斯兰染色来肉眼观察过表达的重组蛋白质。
7HSP72的N-末端氨基酸序列分析
用Mab F1-Pn-3.1(同上文)和按照L.S.Daniels等[Microb.Pathogen.，1，pp..519-531(1986)]所述制备的肺炎链球菌菌株64的细胞壁提取物样品作为抗原，通过免疫沉淀纯化肺炎球菌HSP72。用SDS-PAGE分别免疫沉淀物，然后用P.Matsudaira[J.Biol.Chem.，262，pp.10035-10038(1987)]的方法，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。按照标准方法用考马斯兰将PVDF染色，切下HSP72带，然后用自动测序仪(ABI)分析。
B构建对应于C-169的含肺炎链球菌HSP72基因片段的质粒
用HSP-特异性MAb F1-Pn-3.1筛选λgt11肺炎链球菌基因组DNA文库。从检测的共1500个噬菌体中分离并纯化17个免疫反应性克隆。为了确定由重组噬菌体表达之蛋白质的特异性，对重组噬菌体溶解产物进行Western印迹分析。在由MAb F1-Pn-3.1识别的17个阳性克隆中，鉴定两组克隆，将其代表鉴定为λJBD7和λJBD17以作进一步表征用。如图9所示，对来自肺炎链球菌菌株64(道1)和的全细胞提取物和来自λJBD17(道2和3)或λJBD7(道4和5)感染之大肠杆菌(存在(+)或不存在(-)IPTG条件下培养的)的噬菌体溶解产物进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转移到硝酸纤维素上。用HSP72特异性的MAb F1-Pn-3.1检测免疫印迹。克隆λJBD17有两个2.4kb和2.3kb的EcoRI-EcoRI插入片段(图10)，表达在SDS-PAGE凝胶上，表观分子量为74kDa的嵌合重组蛋白质(图9，道2和3)。克隆λJBD7含有2.3kb的EcoRI插入片段并产生一明显的融合蛋白，该蛋白由LacZ和克隆λJBD17表达的74kDa嵌合蛋白组成。用SDS-PAGE估算，融合蛋白的表观分子量为160kDa(图9，道5)。噬菌体λJBD17编码之嵌合重组蛋白的表达不受IPTG的诱导(图9，道2和3)，而噬菌体λJBD7编码之重组融合蛋白的表达依赖于lac启动子的诱导(图9，道4和5)。
为了亚克隆HSP72基因，提取克隆λJBD17的肺炎球菌DNA插入片段，纯化并连接到低拷贝质粒pWSK29[R.F.Wang andS.R.Kushner，Gene，100，pp.195-199(1991)]中，得到质粒pJBD171。用限制图谱(图10)表征pJBD171的插入片段，完成一系列的亚克隆和免疫印迹以确定编码有MAb F1-Pn-3.1反应性之抗原的基因范围。发现表达74kDa嵌合蛋白质区域位于3.2kb EcoRI-EcoRV片段上，该片段由完整的2.4kb EcoRI-EcoRI片段和2.3kb EcoRI-EcoRI片段的0.8kbEcoRI-EcoRV部分组成。将携带3.2kb EcoRI-EcoRV插入片段的质粒命名为pJBD179。
C编码C-169之嵌合基因的表达和DNA序列分析
为了进一步确定74kDa嵌合蛋白质编码基因在3.2kb EcoRI-EcoRV片段上的转录方向，并提高用于免疫研究的74kDa嵌合蛋白质的产率，我们决定在大肠杆菌T7 RNA和T7启动子系统中表达74kDa嵌合蛋白质。将来自pJBD179的3.2kb EcoRI-EcoRV连接到质粒pT7-5和pT7-6中，其中将多克隆位点放在与T7 RNA聚合酶特异性T7启动子10相反的方向。用连接混合物转化大肠杆菌JM109，按照J.Sambrook等[同上文]描述的菌落筛选方法鉴定有MAb F1-Pn-3.1反应性的阳性转化体。将衍生于pT7-5和pT7-6的所得重组质粒分别称为pJBDf51和pJBDf62。用限制图谱确定在这些重组质粒中的完整3.2kb EcoRI-EcoRV插入片段和其方向。为了过表达74kDa嵌合蛋白，分开将pJBDf51和pJBDf62转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在37℃，用IPTG(1mM)将转化体诱导3小时。收集细胞，洗涤并重悬在1％ SDS中，然后煮沸10分钟。然后用溶解产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。如所预期的，两个转化体均生产74kDa嵌合蛋白，这通过利用Mab F1-Pn3.1的Western印迹很容易检测到(图11)。但是，在IPTG诱导的条件下，只有转化体BL21(DE3)(pJBDf51)过表达74 kDa嵌合蛋白(图11A和B，道2)，这表明在3.2kb EcoRI-EcoRV片段上，该基因的转录方向是从EcoRI末端向EcoRV末端(图10A)。
将3.2kb EcoRI-EcoRV片段克隆到转录pDELTA1中，得到质粒pJBDΔ1。产生一系列的重叠缺失，然后作为DNA测序模板。完整3.2kbEcoRI-EcoRV插入片段的DNA序列是SEQ ID NO：1。发现了两个开放阅读框架(“ORFs”)，在图10B中标明了其方向”ORF27”和”FucI-HSP72(C-169)”)。在这两个ORF的前面，鉴定了推测的核糖体结合位点(SEQ ID NO：1，核苷酸8-21和760-763)。未检测到明显的-10和-35启动子。ORF27包括核苷酸30-755(SEQ ID NO：1)，编码计算分子量为27,066道尔顿的242个氨基酸组成蛋白质。该蛋白质的推测氨基酸序列为SEQ ID NO：2。我们将该基因称为orf27，并将其与其它已知序列进行比较。未发现同源基因或蛋白质。大ORF(核苷酸771-2912，SEQ IDNO：1)是预期分子量为79,238道尔顿的714个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质的推测氨基酸序列为SEQ ID NO：3。将该ORF与其它已知序列进行比较以确定其与其它氨基酸序列的关系。该分析表明：该编码蛋白质与大肠杆菌岩藻糖异构酶(FucI)和多种HSP70基因家族成员(也称为DnaK基因)有高度的相似性。SEQ ID NO：3和大肠杆菌FucI和HSP70(DnaK)蛋白质的排列表明对应于74kDa嵌合蛋白氨基酸1-545(SEQID NO：3)的N末端不断与大肠杆菌FucI高度同源，而对应于氨基酸546-714(SEQ ID NO：3)的C末端部分与HSP70(DnaK)蛋白质相似。值得注意的是，在编码74kDa蛋白质之基因的这两部分的连接处，有一EcoRI限制位点(SEQ ID NO：1，在核苷酸2404和2405之间)。其它限制位点位于核苷酸971和971(PstI)、核苷酸1916和1917(PstI)、核苷酸1978和1979(XhoI)以及核苷酸3164和3165(EcoRV)之间。我们从这些资料得出结论，74kDa蛋白质是一种嵌合蛋白，是由两部分的肺炎链球菌染色体DNA编码的，这两部分是衍生于FucI同源基因的2.4kb EcoRI-EcoRI片段和衍生于HSP72基因的2.3kb EcoRI-EcoRI片段。
DSouthern印迹分析
完成Southern印迹以确定74kDa蛋白质是一种嵌合蛋白并试图克隆完整的肺炎球菌HSP72基因。用HindIII完全消化肺炎链球菌染色体DNA，在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后转移到带正电荷的尼龙膜(Boehringer Mannheim)上。然后用衍生于2.3kb EcoRI-EcoRI片段的0.8kb EcoRI-EcoRV探针或衍生于2.4kb EcoRI-EcoRI片段的1kb PstI-PstI探针印迹膜。用洋地黄毒苷-dUTP事先标记这两个探针。这两个探针与不同大小的HindIII片段杂交(图10B和图C)。0.8kb EcoRI-EcoRV探针识别3.2kb HindIII片段，1kb PstI-PstI探针与4kbHindIII片段反应。该结果还进一步表明可引起74kDa嵌合蛋白质表达的该基因可通过在框架中融合两个EcoRI片段来产生，这两个片段一个来自含肺炎链球菌FucI同系物之5’部分的片段，另一个衍生物携带肺炎球菌HSP72基因之C-169片段的片段。0.8kb EcoRI-EcoRV探针与单个3.2kb片段杂交的事实说明在肺炎链球菌中只有一个拷贝的HSP72基因。
E生产重组HSP72
通过将染色体DNA的HindIII消化物集合体(大小为2.8-3.7kb)连接到质粒pWSK29/HindIII中来产生部分肺炎球菌基因组文库。用连接混合物转化大肠杆菌菌株JM109，通过与0.8kb EcoRI-EcoRV探针杂交来筛选转化体。将来自4个阳性杂交克隆的一个质粒命名为pJBD291。用插入片段的限制分析和转化体细胞溶解产物的Western印迹证明质粒pJBD291确实携带了3.2kb HindIII片段，该片段含有表达重组HSP72蛋白质的HSP72基因(图10B)。由该转化体(pJBD291)表达的HSP72蛋白质在SDS-PAGE凝胶上与天然HSP72蛋白质的迁移的位置相同(图12)。为了测定完整HSP72的序列并过表达全长HSP72蛋白质，从质粒pJBD291分离3.2kb HindIII片段，然后亚克隆到质粒pDELTA1和pT7-5中，分别得到pJBDΔ4和pJBDk5。
对质粒pJBDΔ4携带的完整3.2kb HindIII DNA片段和质粒pJBD177所含2.3kb EcoRI-EcoRI DNA片段进行序列测定。总之，所述核苷酸序列含有4320个碱基对并有两个ORF(SEQ ID NO：4)。将开始于核苷酸682并终止于核苷酸2502(SEQ ID NO：4)的第一个ORF鉴定为肺炎球菌HSP72基因，包括核苷酸3265到核苷酸4320(SEQ ID NO：4)的第二个ORF位于HSP72结构基因的764个碱基对下游，并鉴定为肺炎球菌DnaJ基因的5’部分。推测的核糖体结合位点(“AGGA”)位于HSP72结构基因起始密码子上游9个碱基对处，而发现典型糖体结合位点(“AGGA”)位于DnaJ结构基因起始密码子上游66个碱基对上游。在这两个基因前，没有典型的5’调节区。限制位点位于核苷酸1和2(HindIII)、核苷酸1318和1319(EcoRI)、核苷酸1994和1995(EcoRI)、核苷酸3343和3344(HindIII)以及核苷酸4315和4316(EcoRI)之间。在肺炎链球菌中，HSP72(DnaK)和(DnaJ)的基因方向与大肠杆菌[Saito，H.andUchida，Mol.Gen.Genet.，164，1-8(1978)]以及其它几种革兰氏阳性细菌[Wetzstein，M.等，J.Bacteriol.174，3300-3310(1992)]的方向相似。肺炎链球菌的基因内区相当大，在HSP72(DnaK)结构基因的上游没有发现grpE基因的ORF。
预测的HSP72蛋白质有607个氨基酸，与用SDS-PAGE估算的72kDa分子量相比较，计算的分子量为64,755道尔顿。预测的HSP72蛋白质酸性的，等电点(pI)为4.35。自动Edman降解从肺炎链球菌菌株64中提取的纯化天然HSP72蛋白质表明SKIIGIDLGTIN-AVAVLE为该蛋白质的19个氨基酸的N末端。未检测到氨基末端的甲硫氨酸，这可能是由已知在许多蛋白质中发生的原位加工造成的。在位置13未鉴定到氨基酸残基。从天然HSP72蛋白质得到的19个氨基酸的N末端与从重组肺炎链球菌HSP72基因(SEQ ID NO：5)核苷酸序列得到的19个氨基酸的N末端序列完全一致，这表明克隆成功。该N末端序列与乳酸球菌的DnaK蛋白质完全相同，与大肠杆菌的DnaK有68.4％的一致性。同样，HSP72的预测氨基酸序列排列(SEQ ID NO：5)与来自其它细菌HSP70(DnaK)蛋白质的序列排列也有高度的同源性(图13A-13D)。例如，HSP72与大肠杆菌DnaK蛋白质有54％的一致性。与革兰氏阳性菌Lactococcus lactis比较得到最高的一致性值，与HSP72有85％的一致性。象革兰氏阳性菌的其它HSP70蛋白质一样，当与革兰氏阴性菌的DnaK蛋白质比较时，HSP72丢失了靠近氨基末端的24个氨基酸(图13A-13D)。
尽管HSP72与来自其它生物的HSP70(DnaK)蛋白质有同源性，但它还具有某些特有的特征。HSP70(DnaK)蛋白质的序列趋异主要在两个区(残基244到330 510到607，SEQ ID NO：5)。更具体地说，HSP72不包括肽序列GFDAERDAAQAALDD(残基527-541，SEQ IDNO：5)和AEGAQATGNAGDDVV(残基586-600，SEQ ID NO：5)。HSP72 C末端的高度可变性表明该部分携带了肺炎链球菌特异性的抗原决定基。与该假设一致，当HSP72C-169片段(见下文)的单克隆抗体不与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌反应，已知这两种细菌均表达与HSP72相似的DnaK蛋白质。
肺炎链球菌的截短DnaJ蛋白质(SEQ ID NO：6)有352个氨基酸，与L.lactis DnaJ蛋白质(72％一致性)和大肠杆菌DnaJ蛋白质(51％一致性)的相应部分有高度的相似性。预测的截短DnaJ蛋白质含有高含量的甘氨酸(15％)。在肺炎链球菌DnaJ蛋白质(SEQ ID NO：6)的氨基酸148到212之间鉴定了4个富集Gly-Cys的重复片段，每个重复片段均具有DnaJ蛋白质的Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly基元序列特征[P.A.Silverand J.C.Way，Cell，74，pp.5-6(1993)]。发现3个靠近N末端的重复GGFGG序列(残基75-79、81-8和90-94)。
F抗重组抗原之MAbs的反应性
检测4个HSP72特异性MAbs(F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4，同上文)与大肠杆菌表达之蛋白质的反应性，所述大肠杆菌是用含HSP72基因的重组噬菌体和质粒感染或转化的。4个MAbs与克隆λJBD7表达的lacz-HSP72融合蛋白反应，因此将由这些MAbs识别的表位定位于C末端的169个残基。令人惊奇的是，由λJBD17和pJBDΔ1中的肺炎球菌插入片段编码的蛋白质仅被4个单克隆抗体中的3个所识别。这些结果表明尽管在是用λJBD7和λJBD17感染的大肠杆菌中合成的C-169片段有相同的一级结构，但它们有不同的构型。F2-Pn3.2与某些重组蛋白质没有反应性表明了这种特定单克隆抗体识别更复杂表位的可能性。尽管是复合物，但F2-Pn3.2在Western免疫印迹上仍是可识别的。由含重组质粒pJBDΔ4的大肠杆菌表达的完整HSP72rec与所有4中单克隆抗体均有反应性。实施例4 HSP72特异性单克隆抗体的抗原特异性和反应性
用D.Martin等(同上文)描述的点酶免疫实验和免疫印迹检测单克隆抗体F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4与细菌菌株收集物的反应性，所述收集物包含表2中所列的20个代表16种荚膜血清型(型1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、14、15、19、20和22)的肺炎链球菌菌株和17个非肺炎球菌菌株。为了进行点酶免疫实验，使细菌在巧克力其中平板上生长过夜，然后悬浮在pH7.4的PBS中。将含约109CFU/ml的5μl悬浮液用于硝酸纤维素纸，用含3％牛血清白蛋白的PBS阻断，然后依次与单克隆抗体和过氧化物酶标记的二级抗体保温。通过在样品合成仪中将细菌悬浮液煮沸5分钟，来制备用于Western印迹分析的全细胞提取物。
表2：用点酶免疫实验检测的非肺炎球菌分离物菌株登记号    属种                组或型C-2           化脓链球菌          A组C-3           无乳链球菌          B组C-7           粪肠球菌            D组C-9           牛链球菌            D组C-14          变异链球菌C-15          唾液链球菌C-19          血链球菌            IC-20          血链球菌            IC-21          血链球菌            IC-22          血链球菌            IIC-23          血链球菌            IIC-24          血链球菌            IIC-25          血链球菌            IIC-27          Gemella morbillorumC-30          金黄色葡萄球菌C-33          芽孢杆菌C-36          大肠杆菌
当用点酶免疫实验检测时，各个单克隆抗体与各肺炎链球菌菌株和非肺炎球菌分离物反应。这些结果是意想不到的，因为比较研究表明HSP72与已知的细菌HSP70(DnaK)蛋白质，如来自大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的那些非常相似。
然后进行免疫印迹，进一步研究我们的单克隆抗体的免疫反应性。如表3所示，各单克隆抗体均有反应性。尽管大肠杆菌氨基酸序列与HSP72氨基酸序列(SEQ ID NO：5)的一致性百分比为54％，但4个HSP72特异性单克隆抗体不识别大肠杆菌HSP70(DnaK)蛋白质。同样，HSP72特异性单克隆抗体不与C.trachomatisHSP70(DnaK)蛋白质反应，它与HSP72氨基酸序列有56％的氨基酸一致性。在HSP72和来自革兰氏阳性菌的HSP70(DnaK)蛋白质之间观察到高度的氨基酸序列同源性。但是，没有一个HSP72特异性单克隆抗体与S.aureaus或芽孢杆菌革兰氏阳性菌反应，分别与HSP72有74％和76％的氨基酸序列同源性。从这些资料清楚地看出，尽管HSP70(DnaK)蛋白质在结构上与HSP72相关，但它们在免疫学上是不同的。在与至少一种单克隆抗体反应的非肺炎球菌分离物中，有化脓链球菌、粪肠球菌、变异链球菌和血链球菌，它们都属于链球菌或链球菌相关的肠球菌属。到目前为止，在这些链球菌或肠球菌中，既未鉴定HSP70蛋白质，也未确定基因结构。总之，这些观察结果表明HSP70(DnaK)蛋白质内的高可变氨基酸序列或残基与抗原性有关。令人感兴趣的是，免疫印迹分析表明在肺炎链球菌分离物和免疫反应非肺炎球菌分离物中，分子量为HSP70(DnaK)的蛋白质没有显著的改变。
表3单克隆抗体在WESTERN免疫印迹中与非肺炎球菌分离物的反应性
细菌菌株单克隆抗体登记号  属/种        型    F1-    F2-   F2-   F2-
                       Pn3.1  Pn3.2 Pn3.3 Pn3.4C-2     化脓链球菌   A组   -      +     -     ±aC-3     无乳链球菌   B组   -      -     -     -C-7     粪肠球菌     D组   -      +     -C-9     牛链球菌     D组   -      -     -     -C-14    变异链球菌         -      +     -     ±C-15    唾液链球菌         -      -     -     -C-19    血链球菌     I     +      +     -     -C-20    血链球菌     I     +      +     -     +C-21    血链球菌     I     +      +     +     +C-22    血链球菌     II    +      +     +     +C-23    血链球菌     II    +      +     -     -C-24    血链球菌     II    +      +     +     +C-25    血链球菌     II    +      +     +     +C-27    Gemella            -      -     -     -
    morbillorumC-30    金黄色葡萄球       -      -     -     -
    菌C-33    芽孢杆菌           -      -     -     -C-36    大肠杆菌           -      -     -     -C-RP    Chlamydia          -      -     -     -
    trachomatisba±表示与用肺炎链球菌抗原观察到的反应性相比，信号较弱b检测C.trachomatis纯化的原体(elemenrary body)。实施例5纯化HSP72以及其作为抗致死肺炎链球菌感染之免疫原的用途
A方法
1制备纯化的重组HSP72蛋白质和重组C-169
在大肠杆菌中用噬菌体T7RNA聚合酶/T7启动子系统完成HSP72基因的高水平排他性表达。以两个方向将3.2kb HindIII片段克隆在质粒pT7-5内的T7启动子前。然后将所得的质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。在加入IPTG达到1mM的终浓度后，通过在用抗生素补充的肉汤中培养3小时来诱导重组HSP72蛋白质(HSP72rec)的过表达。通过离心浓缩大肠杆菌高水平表达的HSP72rec，然后通过在含0.2mg/ml溶菌酶的50mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA和100mM NaCl溶解缓冲液中进行柔和的声处理来溶解。以12,000g将细胞溶解产物离心15分钟，然后收集上清液。通过利用固定在在Sepharose 4B珠(Pharmacia)上的单克隆抗体F1-Pn3.1，经免疫亲和法来纯化HSP72rec。在SDS-PAGE上评估洗脱液的纯度。
在用质粒pJBDΔ1转化的大肠杆菌菌株JM109中，以不溶的包含体形式表达重组C-169蛋白质(C-169rec)。按前述，通过声处理破碎，从沉淀的细菌细胞中回收蛋白质包含体。用含1mg/ml脱氧胆酸盐的溶解缓冲液洗涤沉淀以除去污染物，然后将蛋白质包含体溶解在6M脲中。以100,000g离心蛋白质溶液，收集澄清的上清液，然后用磷酸缓冲盐透析。纯化后，通过Bio-Rad蛋白质实验(Bio-RadLaboratories，Mississauga，Ontario，Canada)确定蛋白质含量。
2活性免疫保护研究
用吸附到Alhydrogel佐剂上的纯化HSP72rec或C-169rec抗原，以2星期的间隔，皮下注射3次，以免疫接种两组10只雌性Balb/c小鼠(CharlesRiver Laboratories)。试验两种抗原剂量，约1和5μg。第三组对照小鼠以相同的方式只用Alhydrogel佐剂免疫接种。在各免疫接种前和第三次注射后5-7天从眶窦收集血样。然后用约106CFU的3型肺炎链球菌菌株WU2攻击小鼠。将肺炎链球菌攻击接种物放在巧克力琼脂平板上以确定CFU并确认攻击剂量。以6小时的间隔，记录感染后3-4天的致死情况，然后以24小时的间隔，记录14天内的情况。在14或15天，杀死存活的小鼠，检测血样中是否操作肺炎链球菌生物。在实施例7中描述了应答重组HSP72抗原的抗体反应。
3被动免疫保护作用研究
用约50μg附到Alhydrogel佐剂上的纯化C-169rec蛋白质皮下多位点免疫接种一只NZW兔(Charles River Laboratories)。以2星期的间隔，用相同的抗原加强接种3次，在最后一次免疫接种后7天和14天收集血样。集中血清样品，通过40％饱和硫酸铵沉淀来纯化抗体。
在用5000或880CFU的3型肺炎链球菌菌株WU2静脉内攻击前1小时，用0.25ml的纯化兔抗体腹膜内注射恶性组合的免疫缺陷性SCID小鼠。对照SCID小鼠只接受无菌缓冲液或从非免疫兔血清中纯化的抗体。将肺炎链球菌攻击接种物放在巧克力琼脂平板上以确定CFU并确认攻击剂量。有用其对肺炎链球菌感染的高度敏感性，所以选自SCID小鼠。将攻击后24小时得到的血样(各20μl)放在巧克力琼脂上，然后检测是否操作肺炎链球菌生物。检测的水平是50CFU/ml。以24小时的间隔，记录5天的致死情况。
B结果
由于可以得到克隆的编码完全或部分(C-160)HSP72蛋白质的肺炎链球菌DNA插入片段，所以也就可以得到用于研究可作为疫之的HSP72蛋白质的纯化蛋白质。HSP72rec和C-169rec蛋白质均可以相对纯的状态得到，在考马斯兰染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测，没有污染。
为了评估可作为疫苗的HSP72，我们首先检测了HSP72rec引发保护性免疫反应的能力。用全长HSP72rec(1μg或5μg的剂量)免疫10只小鼠组成的组，然后用4.2×106CFU的肺炎链球菌3型菌株WU2攻击。用1μgHSP72rec的小鼠中的80％在攻击后存活下来，用5μg HSP72的小鼠，有50％存活下来。用Alhydrogel佐剂而不用抗原免疫接种的自然小鼠没有一只在攻击后存活下来(图16)。在14或15天从存活小鼠中收集的任何血样中均未检测到肺炎链球菌生物。这些观察结果表明，HSP72rec引发了抗3型WU2肺炎球菌的保护作用，从而说明衍生于从6型菌株提取之DNA的HSP72含有能够引发保护作用的表位，所述保护作用可抵御具有不同荚膜型的异源菌株。
用经嵌合fucI-HSP72基因转化的大肠杆菌而表达的重组蛋白质片段，我们进一步研究了对HSP72蛋白质的免疫反应。用纯化C-169rec的免疫的小鼠可以抵御致死肺炎球菌的攻击，因此说明引发保护作用的某些(如果不是全部的话)表位存在于含有后169个残基的HSP72分子的C末端区域内。用全长C-169rec(1μg或5μg的剂量)免疫10只小鼠组成的组，然后用6×106CFU的肺炎链球菌3型菌株WU2攻击。用1μg C-169rec的小鼠中的60％在攻击后存活下来，用5μg C-169rec的小鼠，有70％存活下来(图17)。相反，所有自然小鼠均在攻击后2天死亡。因此，肺炎链球菌HSP72的C末端部分(包括DnaK蛋白质之间的最大趋异区)是保护性免疫反应的靶。
如在下列表4中所说明的，两个独立的试验表明用兔抗C-169rec抗体被动转移的SCID小鼠可以抵御肺炎链球菌WU2的致死性感染。相反，15只对照小鼠没有一只能存活下来。对照小鼠接受来自非免疫兔血清的抗体或只接受无菌缓冲液。另外，来自对照组的所有小鼠在攻击后24小时都有阳性肺炎链球菌血培养物，而只在共10只免疫SCID小鼠中的2只中检测到肺炎链球菌生物。
表4：被动免疫研究表明抗C-169rec兔抗体对试验肺炎链球菌感染SCID小鼠的保护作用试验           注射         攻击5天后存活肺炎链球菌阳性
                        的小鼠数      的试验小鼠数1              灭菌缓冲液   0/5           5/5
           抗重组C-160  4/5           2/5
           对照抗体     0/5           5/52              灭菌缓冲液   0/5           5/5
           抗重组C-160  5/5           0/5
在试验1和2(表4)中，分别用5000和880 CFU的3型肺炎链球菌菌株WU2攻击小鼠。表4中的结果表示为与各组中的小鼠总数相比，攻击后小鼠的存活数，或肺炎链球菌的存在是否是阳性。
以肺炎链球菌细胞溶解产物为抗原，用Western印迹分析说明通过用重组HSP72或C-169蛋白质免疫而引发的抗体的抗HSP72特异性。所有试验兔和小鼠血清中均检测到一个对应于HSP72的带。这些血清学结果表明有重组蛋白质免疫后的保护作用归因于产生了与肺炎链球菌HSP72反应的抗体。实施例6用于高水平生产HSP72之C-151末端部分的热可诱导的表达系统
A构建含肺炎链球菌HSP72 C-151末端编码区的质粒pURV3
将编码肺炎链球菌HSP72羧基末端的151个氨基酸的DNA区域插入到翻译载体p629[H.J.George等，Bio/Technology 5，pp.600-603(1987)]的启动子λPL的下游。该载体含有噬菌体λcI857温度敏感性阻遏基因，已经从该基因中缺失了功能PR启动子。将温度从30-37℃增加到37-42℃而使cI857阻遏物失活，从而在λPL的控制下诱导该基因。通过温度增加而在大肠杆菌中诱导该基因的表达有利于大规模发酵，因为用现代发酵罐很容易做到。但是，应理解大肠杆菌是本文试验中所选的微生物，其他宿主生物，如较也在本发明的范围内。
肺炎链球菌477个核苷酸的片段(包括HSP72基因中2050-2506之间的的457个碱基)(SEQ ID NO：4)用寡核苷酸引物OCRR26(5’-GGCAGATCTATGAAGGCCAAAGACCTTGGAAC)和OCRR27(5’-CGCGGATCCTTACTTTTCCGTAAACTCTCCGT)，从肺炎链球菌6型菌株64的基因组DNA经聚合酶链反应(PCR)扩增。用Jayarao等的方法[J.Clin.Microbiol.，29，pp.2774-2778(1991)]从肺炎链球菌指数生长细胞的90ml培养物制备染色体DNA。用DNA Thermal Cycler，PerkinElmer，San Jose，CA进行DNA扩增反应。在OCRR26中，一个ATG起始密码子存在于框架中C-151氨基末端编码区的上游。引物OCRR26和OCRR27分别含有一BglII(AGATCT)和BamHI(GGATCC)识别位点以有利于将PCR产物克隆到p629的去磷酸限制位点BglII和BamHI。用酚冷冻法[S.A.Benson，Biotechniques 2，pp.67-68(1984)]从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物，然后用限制酶BglII和BamHI消化。然后将471个碱基对的BglII-BamHI片段连接到p629的去磷酸限制位点BglII和BamHI中。在图18中列处理所得质粒pURV3的部分图谱。用Simanis的方法[Hanahan，D.InD.M.Glover编，DNA Cloning，pp.109-135，(1985)]，将该质粒转化到从Stratagene，La Jolla，CA得到的大肠杆菌菌株XLI BlueMRF’(Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 supE44 thi-1 recA1gyrA96 relA1 lac[F’proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]c。用与C-169rec反应的单克隆抗体F1-Pn3.1，通过菌落免疫印迹[J.Sambrook等，同上文]来筛选在37℃生长的转化体。从筛选的转化体中纯化质粒DNA，然后用AppliedBiosystems Inc.(ABI)的Taq Dye Deoxy terminator Cycle测序试剂盒通过PCR测定DNA插入片段的序列，然后在自动DNA测序仪373A(ABI)上进行DNA电泳。插入片段的核苷酸序列与HSP72基因的C-151编码的核苷酸序列完全匹配。(参见SEQ ID NO24和对应的氨基酸序列SEQ IDNO：26)。将该质粒转化到原养型大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27325)中以生产C-151rec。
BC-151rec的表达和抗原制备
在含有质粒pURV3的大肠杆菌菌株W3110中，用在其氨基末端的甲硫氨酸残基合成重组C-151rec。30℃使大肠杆菌细胞在含有100μg氨苄青霉素/ml的LB肉汤中生长，直到A600达到0.6。然后将细胞在40℃培养18小时以诱导C-151rec蛋白质的生产。用下列方法制备半纯化的C-151rec蛋白质。离心收集细菌细胞，然后洗涤所得的沉淀并重悬在磷酸缓冲的盐中。加入溶菌酶，在通过脉冲声处理破碎前，将细胞在冰上保温15分钟。离心分离细胞溶解产物，收集上清液，然后用Amicon’s超滤装置(搅拌的细胞系列，Amicon Canada Ltd.Oakville，Ontario)分离。回收不能由YM30膜保留的超滤物，用SDS-PAGE分析并用考马斯兰R-250染色。通过将C-151rec蛋白质的染色强度与用确定浓度的大豆胰蛋白酶抑制剂所得到的强度进行比较来估算蛋白质浓度。
C抗C-151rec单克隆抗体的反应性
用按上述制备的YM3-超滤物，通过Western印迹分析检测根据其与肺炎链球菌HSP72蛋白质的反应性而筛选的一组10个单克隆抗体与C-151rec的反应性。单克隆抗体包括对HSP72rec蛋白质产生的6个单克隆抗体(F3-Pn3.5到F3-Pn3.10)和单克隆抗体F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、F2-Pn3.4。与C-169rec有反应的3个单克隆抗体F1-Pn3.1、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4也识别C-151rec片段。所有其他的单克隆抗体只与HSP72rec反应，因此表明它们可以抗HSP72蛋白质氨基末端区域中存在的表位。实施例7Balb/c小鼠和猕猴对重组HSP72抗原的抗体反应
A方法
1动物的免疫接种
按照实施例5所述，用重组HSP72或重组C-169皮下免疫接种10只雌性Balb/c小鼠的组。微粒评估对重组C-151的抗体反应，用吸附到Alhydrogel佐剂上的0.5μg重组C-151，以两星期的间隔，腹膜内注射3次来免疫接种6只小鼠。在各免疫接种前和在第3次免疫接种后4到7天，收集的血样中的血清，然后通过用肺炎链球菌细胞壁提取物包被的平板，通过ELISA检测所述血清与肺炎链球菌的抗体反应。
在1、22和77天，用含有吸附到Alhydrogel佐剂上的150μg纯化重组HSP72或重组C-169的0.5ml肌肉内注射来免疫接种雌性猕猴。在各免疫接种前后收集血样，然后通过Western印迹分析来检测所述血清与肺炎链球菌HSP72抗原的抗体反应。
通过Western印迹分析来确定肺炎链球菌HSP72的抗体与肺炎链球菌细胞提取物和纯化重组抗原的特异性。
B结果
在前述实施例5中描述的结果清楚地表明在用重组HSP72抗原免疫接种后引发了抗体反应的保护性。在此，我们监测了在免疫过程中小鼠(图19、20和21)以及猴(图22)中，血清抗体反应的出现。两个种对作为免疫原的全长和截短的重组HSP72蛋白质都有强烈的反应，在第三次注射后，平均滴度为1∶64000。各血清的详细分析表明在产生与肺炎链球菌HSP72有反应的抗体的过程中，各个动物对免疫接种均有应答。
在用重组C-169免疫的小鼠中，试验的两种剂量，即1和5μg有相似的效果，同时有相似的抗体滴度诱导作用(图20)。在用重组C-169第二次注射后，观察到强的加强反应，而在第三次注射后，抗体滴度没有提高。与此相反，我们观察到对重组HSP72的免疫反应是剂量依赖性的。在用重组HSP72或C-151进行第二次和第三次注射后(图19和21)，观察到特异性抗体滴度的增加。
猴免疫反应的研究清楚地表明重组HSP72抗原的免疫原性不限于啮齿类如兔和小鼠。用两种抗原第二次注射后的激素反应的特征在于HSP72特异性抗滴度有显著增加，而且可持续数周，其抗体滴度都不会有显著的降低(图22)。另外，在用重组抗原一次注射后，即可监测到各猴血清中的特异性血清抗体。实施例8HSP72应激蛋白质的B细胞表位图谱
在实施例3中，表明HSP72蛋白质序列的显著改变主要是位于对应于肺炎链球菌HSP72蛋白质的氨基酸残基244-330和510-607这两个区内。这些可变区可含有引起实施例4中所述抗原不均一性的B细胞表位。为了研究这种可能性，对经过选择基本上覆盖了这些区域的14种肽来检测多克隆和单克隆抗体与肺炎链球菌HSP72的反应性。
A方法
缓冲14到30个氨基酸残基的14种肽。在表5中列出了肽序列和其在蛋白质中的位置。用自动肽合成仪，由Biochem ImmunosystemInc.(Montreal，Canada)缓冲肽CS870、CS873、CS874、CS875、CS876、CS877、CS878、CS879、CS880和CS882。由Service deSequence de Peptides de l’Est du Quebec Centre de recherche duCHUL(Sainet-Foy，Canada)在作为多抗原肽(MAP)的分支赖氨酸核心上缓冲肽MAP1、MAP2、MAP3和MAP4。用反相高压液相色谱纯化肽。将肽溶剂在蒸馏水中，而将肽CS874和CS876溶剂在小体积的6M盐酸胍或二甲亚砜中，然后用蒸馏水调到1mg/ml。
用包被到Immunolon 4微滴定板(DynatechLaboratories，Inc.，Chantilly，VA)上的缓冲肽完成肽ELISA。为了确定单克隆抗体与肽的反应性，确定液相肽一种单克隆抗体与固体HSP72结合的能力。为了进行抑制试验，用肺炎链球菌细胞壁提取物包被微滴定板。4℃，将含HSP72-特异性的单克隆抗体的杂交瘤培养上清液与不同浓度的肽保温过夜。按照上述，用ELISA检测处理的肽和对照上清液。
免疫血清来自用重组HSP72抗原免疫了三次的动物。按照实施例5中的免疫方法，用37.5μg的纯化重组HSP72免疫接种一只兔子。鼠血清池来自疏水肿瘤用重组HSP72免疫的3只Balb/c小鼠，猴血清池来自用重组HSP72或重组C-169免疫的两只动物。
表5：对应于肺炎链球菌HSP72之氨基酸残基的合成肽的序列和位置
   肽a     位置                 序列    SEQID No.
 CS876   247-261  TSTQISLPFITAGEA     7
 CS877   257-271  TAGEAGPLHLEMTLT     8
 CS878   268-281  MTLTRAKFDDLTRD     9
 CS879   276-290  DDLTRDLVERTKVPV    10
 CS880   286-299  TKVPVRQALSDAGL    11
 CS882   315-333  RIPAVVEAVKAETGKEPNK    23
 CS873   457-471  KAKDLGTQKEQTIVI    12
 CS874   467-481  QTIVIQSNSGLTDEE    24
 CS875   477-491  LTDEIDRMMKDAEA    13
 MAP1   487-510  KDAEANAESDKKRKEEVDLRNEVD    14
 CS870   507-521  NEVDQAIFATEKTIK    15
 MAP2   517-544  EKTIKETEGKGFDAERDAAQAALDDLKK    16
 MAP3   544-573  KAQEDNNLDDMKAKLEALNEKAQGLAVKLY    17
 MAP4   583-607  QEGAEGAQATGNAGDDVVDGEFTEK    18
B线性B细胞表位的鉴定和定位
图23中所列的结果表明用位于氨基酸残基457-607内的肽来观察大部分的免疫反应，所述肽对应于HSP72的C-151。来自用重组HSP72或重组C-169免疫之动物的兔、小鼠和猴血清抗体与肽MAP2和肽MAP4均可反应。令人惊奇的是，肽MAP2和MAP4的序列跨高可变的羧基末端区，含有序列GFAERDAAQAALDD(残基527到541)和AEGAQATGNAGDDVV(残基586到600)，这两个序列是肺炎链球菌HSP72特有的，这是以与数据库中的HSP70蛋白质序列进行比较而得出的。因此我们的数据表明这两种肽序列均含有线性B细胞表位。另外，只有肽MAP4也可被单克隆抗体F1-Pn3.1所识别。通过液相抑制试验确定所述反应性，其中10μg/ml的MAP4会完全抑制F1-Pn3.1与HSP72的结合。来自用全长HSP72重组蛋白质免疫之动物的多克隆血清也识别位于CS875、MAP1和MAP3上的B细胞表位。在有这些数据表明HSP72的高可变C-151末端片段刺激B细胞反应，并可能构成HSP72蛋白质的免疫优势部分。单克隆抗体F2-Pn3.3和F2-Pn3.4与合成肽没有反应性表明它们与HSP72C末端区上的构型决定基反应。在C-151区中保护性表位的存在在实施例5中得到显著地说明，其中用纯化重组C-169免疫的小鼠可抵御肺炎链球菌强菌株的致死感染，因此说明肺炎链球菌HSP72的羧基末端片段C-169或C-151或甚至其更小的片段对应疫苗的发展是非常有用的。
氨基酸残基244-330内的可变区还构成了一个抗原结构域。用高免疫血清鉴定在重叠肽CS877(氨基酸257-271)和CS878(氨基酸268-281)、肽CS880(氨基酸286-299)和肽CS882(氨基酸315-333)上的线性表位。实施例9来自化脓链球菌和无乳链球菌的HSP70(DnaK)：hsp70基因的分子克隆和DNA测序；核苷酸和蛋白质序列分析；与肺炎链球菌的抗原相关性；在对热的反应中，增加的无乳链球菌HSP70的合成
A方法
1细菌菌株和质粒载体
在本研究中所用的化脓链球菌(A型链球菌)和无乳链球菌(B型链球菌)菌株是由Laboratoire de la Sante Publique duQuebéc(LSPQ)，Sainte-Anne de Bellevue，Quebéc，Canada提供的。无乳链球菌II型菌株V8对应于ATCC菌株12973。化脓链球菌菌株Bruno对应于ATCC菌株19615。从Stratagene得到大肠杆菌菌株XLI Blue MRF’。37℃在5％ CO2保温箱中使链球菌菌株生长。将链球菌划在含5％羊血(LesLaboratoires Quelab，Montreal，Canada)的胰蛋白酶大豆琼脂板上。用心灌注液肉汤(Difco Laboratories，Detroit，MI)，不用搅拌制备液体培养基。37℃，使大肠杆菌菌株在L肉汤中生长，以250rmp的速率搅拌或在L琼脂上生长。
从Stratagene购买常规的克隆噬菌粒pBluescript KS(-)。
2重组DNA技术
按照供应商(Pharmacia[Canada]Inc.Baie d’Urfe，Canada；and NewEngland Biolabs Ltd.，Mississauga，Canada)的说明试验限制酶、T4 DNA连接酶和牛肠磷酸酶。按照J.Sambrood等所述(同上文)，完成通过在CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心来制备质粒、DNA片段的琼脂糖凝胶电泳、Southern杂交和菌落DNA杂交。用适合于90ml细菌培养的B.M.Jayarao等的方法[J.Clin.Microbiol.，29，pp.2774-2778(1991)]制备链球菌的染色体DNA。按照Ish-Horowicz等的方法[Nucl.Acids Res.9，pp.2989-2998]完成快速质粒制备。用QiagenInc.(Chatsworth，CA)的质粒试剂盒纯化用于DNA测序的质粒。用酚冷冻法[S.A.Benson，Biotechniques 2，pp.67-68(1984)]从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段。用Boehringer Mannheim(Laval，Canada)的随机引物标记试剂盒，用P-dCTP或洋地黄毒苷(DIG)-11-dUTP标记DNA探针。用Simanis的方法[Hanahan，D.In D.M.Glover(ed.)，DNACloning，pp.109-135(1985)]完成质粒转化。用合成的寡核苷酸测定质粒中基因组DNA插入片段的序列。用Taq Dye Deoxy Terminator Cycle测序试剂盒(ABI)，通过聚合酶链反应(PCR)完成测序反应，然后在自动DNA测序仪373A(ABI)上完成DNA电泳。用来自Gene CodesCorporation(Ann Arbor，MI)的program Sequencher 3.0完成DNA序列的组装。用来自Intelligenetics，Inc.(Mountain View，CA)的程序Gene Works2.45完成DNA序列和其推测多肽的分析。用DNA Thermal Cycler480，Perkin Elmer完成DNA扩增反应。用寡核苷酸合成仪394型(ABI)合成寡核苷酸。
3无乳链球菌和化脓链球菌hsp70/dnaK基因的分子克隆
用具有回文六聚核苷酸识别序列的各种限制酶完全消化无乳链球菌和化脓链球菌的染色体DNA。用标记的PCR-扩增的DNA探针通过Southern杂交分析消化产物，所述探针对应于肺炎链球菌HSP72基因(见SEQ IDNO：4)从起始密码子ATG下游332个碱基开始的782个碱基对。选择该DNA区是因为在所表征的革兰氏阳性菌的hsp70基因中，它是相对高度保守的。用寡核苷酸OCRR2(5’-AAGCTGTTATCACAGTTCCGG)和OCRR3(5’-GATACCAAGTGACAATGGCG)，在肺炎链球菌基因组DNA上进行PCR扩增。通过从琼脂糖凝胶中提取对应大小的基因组片段来部分纯化足够大小的编码70kDa多肽(＞1.8kb)的杂交基因组限制片段。用标记的782-肺炎链球菌DNA探针，通过Southern杂交证明在纯化的基因组限制片段中纯化hsp70基因。
将纯化的基因组DNA限制片段克隆到pBluescript KS(-)的去磷酸化匹配的限制位点中，然后转化到大肠杆菌菌株XLI Blue MRF’中。用标记的782-肺炎链球菌DNA探针，通过DNA杂交来筛选菌落。用各种限制酶消化提取的质粒以评估插入片段的大小并用标记的782-肺炎链球菌DNA探针，通过Southern杂交证明hsp70基因的存在。质粒pURV5含有无乳链球菌基因组DNA的4.2kb HindIII插入片段。质粒pURV4含有化脓链球菌基因组DNA的3.5kb HindIII片段。
4热休克和蛋白质标记
按照前文实施例1所述，用[35S]甲硫氨酸，通过脉冲标记来检测无乳链球菌对热休克的应激反应。离心沉淀在SMAM中生长过夜的无乳链球菌(用1mg/l甲硫氨酸、1％(v/v)Isovitalex和1mg/l胆碱盐酸盐补充的)，然后重悬在无甲硫氨酸的SMAM培养基中。将细菌在37℃培养1小时，然后分成等体积的两份。将样品在37℃或43℃保温10分钟，然后在37℃，用100μCi/ml[35S]甲硫氨酸标记30分钟。用PCS剧烈洗涤细菌，按照用于DNA分离的方法，用mutanolysine和溶菌酶处理(M.Jayarao等，同上文)，然后是声处理来制备细胞提取物。
5免疫学特征
通过Western印迹分析，检测6个抗重组HSP72蛋白质的单克隆抗体(F3-Pn3.5-F3-Pn3.10)和单克隆抗体F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、F2-Pn3.4与化脓链球菌和无乳链球菌之HSP70抗原的反应性。通过用mutanolysine和溶菌酶处理(M.Jayarao等，同上文)，声处理，然后在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸得到来自化脓链球菌和无乳链球菌中的细胞溶解产物。在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，检测来自大肠杆菌的细胞溶解产物，所述大肠杆菌是用产生截短的化脓链球菌HSP70抗原的pURV4或pURV6转化的。
B化脓链球菌、无乳链球菌和肺炎链球菌之hsp70/dnak基因的DNA序列分析
确定质粒pURV5中4.2kb HindIII插入片段的2438个碱基的区。该序列含有一个编码609个氨基酸之多肽的1830个核苷酸的开放阅读框架(ORF)，该多肽的分子量为64907(见SEQ ID NO：7)。该ORF在位置248有一ATG起始密码子，在位置2077有一TAA终止密码子。在位置237开始的序列GAGG在ATG起始密码子之前，该序列与16S rRNA互补并作为大肠杆菌中的核糖体结合位点[G.D.Stormo等，Nucleic AcidsRes.10，pp.2971-2996(1982)]。无乳链球菌HSP70的ORF和多肽分别与肺炎链球菌HSP72的ORF和多肽有85％和95％的一致性。
与肺炎链球菌HSP72的一级序列相比较表明质粒pURV4中的3.5kbHindIII插入片段没有化脓链球菌hsp70的3’末端编码区。克隆含完整化脓链球菌hsp70编码区的3kb SalI基因组片段产生了含3.1kb插入片段的质粒pURV6，所述3.1kb插入片段没有该具有的5’末端编码区。组装在质粒pURV4和pURV6中存在的hsp70基因区得到了一个2183个核苷酸的区，该区含有一编码608个氨基酸之多肽(见SEQ ID NO：20)的1824个碱基的ORF，所述多肽的分子量为64847。ATG起始密码子是在位置204开始的，而TAA终止密码子延伸到位置2030。与化脓链球菌hsp70相似，在位置193开始的核糖体结合位点序列GAGG在ATG起始密码子之前[G.D.Stormo，同上文]。化脓链球菌hsp70的ORF和推测的多肽分别与肺炎链球菌HSP72的ORF和多肽有85％和94％的一致性。质粒pURV4的ORF没有编码化脓链球菌HSP79羧基末端之41个氨基酸的125个碱基对；因此该ORF编码HSP70(重组N-567)氨基末端的567个氨基酸。质粒pURV6的ORF没有编码化脓链球菌HSP79氨基末端之38个氨基酸的114个碱基对；因此该ORF编码HSP70(重组N-570)氨基末端的570个氨基酸。
化脓链球菌、无乳链球菌和肺炎链球菌的HSP70/DnaK之DNA开放阅读框架(图24)和氨基酸序列(图25)的综合比较表明，其一致性分别为82％和93％。
C无乳链球菌对热作出反应而使HSP70的合成增加
用[35S]甲硫氨酸脉冲标记的无乳链球菌的热休克细胞提取物和对照的一维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，在施加了热应激后，70kDa的合成显著增加(图26，道1和2)。放射性免疫沉淀分析表明用单克隆抗体F2-Pn3.4在43℃很容易检测到热可诱导的70kDa蛋白质，因此说明该蛋白质属于热休克HSP70(hsp70/DnaK)家族(图26，道3和4)。
D肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌中HSP70蛋白质的抗原相关性
在本研究中，用一组单克隆抗体研究化脓链球菌、无乳链球菌和肺炎链球菌HSP70蛋白质的抗原相关性。10个单克隆抗体中的8个与所有3种链球菌都发生反应，因此表明没有B细胞表位广泛地分布在肺炎链球菌、化脓链球菌和无乳链球菌中。直接抗一个位于肺炎链球菌HSP72的氨基酸残基584和607之间的表位的单克隆抗体F1-Pn3.1不与来自化脓链球菌或无乳链球菌的HSP70抗原反应。3种链球菌该区域的比较表明在氨基酸589和596之间有5到8个氨基酸的差异。抗存在于C-151区中之表位的单克隆抗体F2-Pn3.3与无乳链球菌反应，但不与化脓链球菌反应。这些资料清楚地说明，来自链球菌的HSP79蛋白质在结构和免疫学上是相关的。但存在免疫学差异。
单克隆抗体F3-Pn3.5、F3-Pn3.6、F3-Pn3.7和F3-Pn3.10与截短的重组化脓链球菌HSP70抗原的反应性分析使得可以鉴定位于肺炎链球菌HSP72氨基末端附近的抗原区。这些单克隆抗体与表达N末端567个氨基酸残基的构建体反应，但不能与表达C-570片段的构建体反应。这些资料将由单克隆抗体F3-Pn3.5、F3-Pn3.6、F3-Pn3.7和F3-Pn3.10识别的表位定位于HSP72蛋白质的残基1和38之间。实施例10HSP70/HSP72作为人疫苗的用途
为了配制用于人的疫苗，从本文所述的多肽中选择试验的HSP72抗原。例如本领域专业人员可以设计含一个致免疫表位的HSP70/HSP72多肽或其片段周围的疫苗。分子生物学技术特别适用于制备基本上纯的重组抗原。
疫苗组合物可采用各种形式。这些包括，但不限于固体、半固体和液体剂量形式，如粉末、液体溶液或悬浮液和脂质体。我们认为当施用于人时，本发明的HSP70/HSP72抗原可引发保护性免疫反应，以此为基础，本发明的组合物与使用其他蛋白质或多肽来免疫接种人以抵御如破伤风和白喉的那些组合物相似。因此，本发明组合物优选含有可药用佐剂如不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、胞壁酰肽、油包水乳液、脂质体、ISCOM或CTB，或来自霍乱毒素的无毒的B亚单位。最优选的是，组合物以油包水乳液或氢氧化铝为佐剂。
可以以包括肌肉内、皮内、皮下或局部的各种可药用形式，将所述组合物施用于患者。优选肌肉内施用疫苗。
通常，施用由首次注射(最可能与佐剂一起)，以及此后最可能的一次或多次加强注射组成，初次注射的剂量为每个患者约0.01-10mg，优选0.1-1.0mg。优选加强注射在初次注射后约1和6个月。
有关肺炎球菌疫苗发展的一个重要考虑是粘膜免疫问题。理想的粘膜疫苗可以以一种或多种剂量，安全口服或鼻内使用，并在适宜的表面上引发保护性抗体，城市全身免疫。粘膜疫苗组合物可包含佐剂、惰性颗粒载体或重组活载体。
本发明的抗HSP72抗体可用于因肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌或相关细菌感染的人的被动免疫治疗和免疫预防。所述被动免疫的剂量形式和方案与其他被动免疫治疗的相似。
本发明的抗体可以是由生产单克隆抗体F1-Pn3.1的杂交瘤生产的，该杂交瘤于1995年7月21日保藏在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，并将其鉴定为鼠杂交瘤细胞系F1-Pn3.1。该保藏物的登记号为HB11960。
尽管我们描述了本发明的许多实施方案，但显然，我们的实施方案可以改变以提供其他利用本发明组合物和方法的实施方案。因此，应理解本发明的范围包括在前述说明书和其权利要求书中所定义的所有其他的实施方案和改变；而且本发明不受本文作为实施例所列的具体实施方案的限制。
序列表(1)一般资料：(i)申请人：Hamel，JoseeBrodeur，Bernard RMartin，DenisRioux，Clement(ii)发明题目：HSP70家族的链球菌热休克蛋白质成员(iii)序列数：26(iv)通讯地址：(A)收件人：Goudreau Gage Dubue & Martineau Walker(B)街道：800 Place Victoria，Suite 3400，Stock Exchange Tower(C)城市：Montreal(D)州：魁北克(E)国家：加拿大(F)邮政编码：H4ZIE9(v)计算机可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容的(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version，#1.25(vi)目前的申请资料：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类号：(vii)在先申请资料：(A)申请号：US 08/472,534(B)申请日：1995年6月7日(vii)在先申请资料：(A)申请号：US 60/001,805(B)申请日：1995年8月4日(viii)代理人/代理资料：(A)姓名：Leclere/Dubuc/Prince，Alain/Jean/Gaetan(C)文献/文档号：BIOVAC2-PCT(ix)通信资料：(A)电话：(514)397-7400(B)电传：(514)397-4382(2)SEQ I的NO：1的资料：(I)序列特征：(A)长度：3167个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iv)反义：无(vi)来源：(A)生物：肺炎链球菌(ix)特征：(A)名称/关键词：CDS(B)位置：30..755(ix)特征：(A)名称/关键词：CDS(B)位置：771..2912(D)其他资料：/产物＝“FucI/SP72(C-169)”(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GAACTTCATT TTTAGAAAGG AGTGAGTTT ATG TCT CAA GAT GAA AAA TTA ATT         53
                            Met Ser Gln Asp Glu Lys Leu Ile
                              1               5CGT GAA CAG ATT TGT GAT GTT TGT CAT AAG ATG TGG CAA CTT GGT TGG        101Arg Glu Gln Ile Cys Asp Val Cys His Lys Met Trp Gln Leu Gly Trp
 10                  15                  20GTT GCT GCT AAC GAT GGG AAT GTA TCT GTT CGA TTA GAT GAG GAT ACC        149Val Ala Ala Asn Asp Gly Asn Val Ser Val Arg Leu Asp Glu Asp Thr25                  30                  35                  40ATT CTT GCA ACA CCT ACT GGT ATC AGC AAA AGT TTT ATT ACA CCA GAA        197Ile Leu Ala Thr Pro Thr Gly Ile Ser Lys Ser Phe Ile Thr Pro Glu
             45                  50                  55AAG CTG GTG AAG TTA AAT CTT AAA GGA GAG ATT TTA GAA GCA GAA GGT        245Lys Leu Val Lys Leu Asn Leu Lys Gly Glu Ile Leu Glu Ala Glu Gly
         60                  65                  70GAT TAC TGT CCT TCT AGT GAA ATT AAA ATG CAC ATT CGG TGC TAC GAA        293Asp Tyr Cys Pro Ser Ser Glu Ile Lys Met His Ile Arg Cys Tyr Glu
     75                  80                  85GAA CGT GAG GAT GTT CGT TCA GTT GTT CAC GCG CAT CCA CCG ATT GCA        341Glu Arg Glu Asp Val Arg Ser Val Val His Ala His Pro Pro Ile Ala
 90                  95                 100ACA GGA TTT GCT CTT GCA CAC ATT CCT TTA GAT ACT TAT TCA CTA ATT        389Thr Gly Phe Ala Leu Ala His Ile Pro Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Ile105                 110                 115                 120GAG AGC GCG ATT GTG GTT GGG GCA ATT CCT ATT ACC CCA TTT GGA GTA        437Glu Ser Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Pro Ile Thr Pro Phe Gly Val
            125                 130                 135CCG TCT ACA ATG GAA GTG CCA GAA GCA ATT ACA CCT TAT CTG CCC GAT        485Pro Ser Thr Met Glu Val Pro Glu Ala Ile Thr Pro Tyr Leu Pro Asp
        140                 145                 150CAT GAT GTC ATG CTA TTA GAA AAT CAT GGA GCT CTG ACT GTC GGA AGC        533His Asp Val Met Leu Leu Glu Asn His Gly Ala Leu Thr Val Gly Ser
    155                 160                 165GAT GTC ATT ACA GCA TAC TAC CGT ATG GAA ACT TTA GAA TTA GTC GCA        581Asp Val Ile Thr Ala Tyr Tyr Arg Met Glu Thr Leu Glu Leu Val Ala
170                 175                 180AAG ACA ACC TTC CAC GGA AGA ATG TTA CTT TCT ACA AAG GGC ATT GAG        629Lys Thr Thr Phe His Gly Arg Met Leu Leu Ser Thr Lys Gly Ile Glu185                 190                 195                 200GAG CAA GAA ATT GCT CGT CCG ACT TTA GAA CGT CTA TTC TCA ATG CGA        677Glu Gln Glu Ile Ala Arg Pro Thr Leu Glu Arg Leu Phe Ser Met Arg
            205                 210                 215GAA AAT TAT AAG GTT ACA GGT CGT CAC CCA GGC TAC CGT AAA TAT AAT        725Glu Asn Tyr Lys Val Thr Gly Arg His Pro Gly Tyr Arg Lys Tyr Asn
        220                 225                 230GGC GAT GGT AGT ATA AAA GAA ACA AAA AAA TAAGAGGAAA GTATT ATG ATC         776Gly Asp Gly Ser Ile Lys Glu Thr Lys Lys                  Met Ile.
    235                 240                            1CAA CAT CCA CGT ATT GGG ATT CGT CCG ACT ATT GAT GGT CGT CGT CAA          824Gln His Pro Arg Ile Gly Ile Arg Pro Thr Ile Asp Gly Arg Arg Gln
      5                  10                  15GGT GTA CGC GAA TCA CTT GAA GTA CAA ACA ATG AAC ATG GCT AAA AGT          872Gly Val Arg Glu Ser Leu Glu Val Gln Thr Met Asn Met Ala Lys Ser
 20                  25                  30GTG GCA GAT TTG ATT TCA AGC ACA TTG AAA TAT CCA GAT GGG GAA CCT          920Val Ala Asp Leu Ile Ser Ser Thr Leu Lys Tyr Pro Asp Gly Glu Pro35                  40                  45                  50GTG GAA TGT GTG ATT TCT CCA TCT ACC ATT GGT CGT GTT CCA GAG GCT          968Val Glu Cys Val Ile Ser Pro Ser Thr Ile Gly Arg Val Pro Glu Ala
             55                  60                  65GCA GCT TCC CAT GAG TTG TTT AAA AAA TCA AAT GTT TGC GCA ACA ATT         1016Ala Ala Ser His Glu Leu Phe Lys Lys Ser Asn Val Cys Ala Thr Ile
         70                  75                  80ACA GTT ACA CCA TGC TGG TGT TAT GGT AGT GAA ACT ATG GAT ATG TCT         1064Thr Val Thr Pro Cys Trp Cys Tyr Gly Ser Glu Thr Met Asp Met Ser
     85                  90                  95CCA GAT ATT CCT CAT GCT ATT TGG GGA TTT AAT GGG ACA GAA CGC CCA         1112Pro Asp Ils Pro His Ala Ile Trp Gly Phe Asn Gly Thr Glu Arg Pro
100                 105                 110GGA GCT GTC TAT CTT GCA GCT GTA CTA GCT TCA CAT ACT CAA AAA GGG         1160Gly Ala Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Ala Ser His Thr Gln Lys Gly115                 120                 125                 130ATT CCA GCC TTT GGG ATT TAT GGT AGA GAT GTT CAG GAA GCT AAT GAT         1208Ile Pro Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Arg Asp Val Gln Glu Ala Asn Asp
            135                 140                 145ACA GCT ATT CCA GAA GAT GTC AAA GAA AAA CTT TTA CGT TAT GCG CGG         1256Thr Ala Ile Pro Glu Asp Val Lys Glu Lys Leu Leu Arg Tyr Ala Arg
        150                 155                 160GCA GTT CTT GCA ACT GGC TTG ATG AGA GAC ACT GCT TAC CTA TCA ATG         1304Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Met Arg Asp Thr Ala Tyr Leu Ser Met
    165                 170                 175GGT AGT GTT TCG ATG GGG ATT GGT GGT TCT ATT GTA AAT CCA GAT TTC         1352Gly Ser Val Ser Met Gly Ile Gly Gly Ser Ile Va1 Asn Pro Asp Phe
180                 185                 190TTC CAA GAA TAC TTA GGA ATG CGA AAT GAA TCG GTA GAT ATG ACG GAG         1400Phe Gln Glu Tyr Leu Gly Met Arg Asn Glu Ser Val Asp Met Thr Glu195                 200                 205                 210TTC ACG CGC CGT ATG GAC CGT GGT ATT TAC GAC CCT GAA GAG TTC GAA         1448Phe Thr Arg Arg Met Asp Arg Gly Ile Tyr Asp Pro Glu Glu Phe Glu
            215                 220                 225CGT GCG CTC AAA TGG GTG AAA GAA AAC GTA AAA GAA GGA TTC GAC CAT         1496Arg Ala Leu Lys Trp Val Lys Glu Asn Val Lys Glu Gly Phe Asp His
        230                 235                 240AAC CGT GAA GAC CTT GTT TTA AGC CGT GAA GAA AAA GAT AGA CAA TGG         1544Asn Arg Glu Asp Leu Val Leu Ser Arg Glu Glu Lys Asp Arg Gln Trp
    245                 250                 255GAA TTT GTT ATT AAG ATG TTC ATG ATT GGA CGT GAC TTA ATG GTT GGT       1592Glu Phe Val Ile Lys Met Phe Met Ile Gly Arg Asp Leu Met Val Gly
260                 265                 270AAC CCA AGA CTT GCT GAA CTT GGT TTT GAG GAA GAA GCA GTT GGT CAC       1640Asn Pro Arg Leu Ala Glu Leu Gly Phe Glu Glu Glu Ala Val Gly His275                 280                 285                 290CAT GCT TTA GTA GCT GGT TTC CAA GGT CAA CGT CAG TGG ACA GAC CAT       1688His Ala Leu Val Ala Gly Phe Gln Gly Gln Arg Gln Trp Thr Asp His
            295                 300                 305TTT CCA AAT GGG GAC TTT ATG GAA ACT TTC CTC AAT ACT CAG TTT GAC       1736Phe Pro Asn Gly Asp Phe Met Glu Thr Phe Leu Asn Thr Gln Phe Asp
        310                 315                 320TGG AAT GGT ATT CGA AAA CCA TTT GTA TTT GCG ACA GAG AAT GAT TCA       1784Trp Asn Gly Ile Arg Lys Pro Phe Val Phe Ala Thr Glu Asn Asp Ser
    325                 330                 335CTA AAT GGT GTG TCT ATG CTC TTT AAT TAT CTA TTA ACA AAT ACT CCA       1832Leu Asn Gly Val Ser Met Leu Phe Aan Tyr Leu Leu Thr Asn Thr Pro
340                 345                 350CAA ATC TTT GCT GAT GTG CGT ACT TAT TGG AGT CCA GAG GCT GTT GAA       1880Gln Ile Phe Ala Asp Val Arg Thr Tyr Trp Ser Pro Glu Ala Val Glu355                 360                 365                 370CGT GTA ACA GGA TAT ACT TTA GAG GGT CGT GCT GCA GCT GGA TTC TTA       1928Arg Val Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Ala Ala Ala Gly Phe Leu
            375                 380                 385CAT CTA ATC AAC TCT GGA TCT TGT ACA TTG GAT GGT ACA GGT CAA GCT       1976His Leu Ile Asn Ser Gly Ser Cys Thr Leu Asp Gly Thr Gly Gln Ala
        390                 395                 400ACT CGA GAT GGC AAA CCT GTT ATG AAA CCA TTC TGG GAG TTG GAT GAA       2024Thr Arg Asp Gly Lys Pro Val Met Lys Pro Phe Trp Glu Leu Asp Glu
    405                 410                 415AGT GAA GTA CAG GCT ATG CTT GAA AAT ACA GAC TTC CCA CCA GCA AAC       2072Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Glu Asn Thr Asp Phe Pro Pro Ala Asn
420                 425                 430CGC GAA TAC TTC CGT GGA GGA GGA TTC TCA ACT CGT TTC TTG ACG AAG       2120Arg Glu Tyr Phe Arg Gly Gly Gly Phe Ser Thr Arg Phe Leu Thr Lys435                 440                 445                 450GGG GAT ATG CCA GTA ACA ATG GTA CGT CTC AAT CTT TTA AAA GGG GTT       2168Gly Asp Met Pro Val Thr Met Val Arg Leu Asn Leu Leu Lys Gly Val
            455                 460                 465GGT CCA GTG CTA CAA ATT GCA GAA GGT TAC ACA CTT GAA CTT CCT GAA       2216Gly Pro Val Leu Gln Ile Ala Glu Gly Tyr Thr Leu Glu Leu Pro Glu
        470                 475                 480GAT GTT CAC CAT ACT TTA GAT AAT CGT ACA GAT CCA GGA TGG CCA ACT       2264Asp Val His His Thr Leu Asp Asn Arg Thr Asp Pro Gly Trp Pro Thr
    485                 490                 495ACT TGG TTT GCT CCA CGT TTG ACA GGA AAA GGT GCT TTC AAG TCT GTC       2312Thr Trp Phe Ala Pro Arg Leu Thr Gly Lys Gly Ala Phe Lys Ser Val
500                 505                 510TAT GAC GTC ATG AAT AAT TGG GGA GCT AAT CAC GGA GCC ATA ACA TAT       2360Tyr Asp Val Met Asn Asn Trp Gly Ala Asn His Gly Ala Ile Thr Tyr515                 520                 525                 530GGA CAC ATT GGA GCA GAC TTG ATT ACC TTG GCT TCT ATG TTG AGA ATT         2408Gly His Ile Gly Ala Asp Leu Ile Thr Leu Ala Ser Met Leu Arg Ile
            535                 540                 545CCT CAA ATC GAA GTA ACA TTT GAC ATC GAC AAG AAC GGT ATC GTG TCT         2456Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser
        550                 555                 560GTT AAG GCC AAA GAC CTT GGA ACT CAA AAA GAA CAA ACT ATT GTC ATC         2504Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Tle Val Ile
    565                 570                 575CAA TCG AAC TCA GGT TTG ACT GAC GAA GAA ATC GAC CGC ATG ATG AAA         2552Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys
580                 585                 590GAT GCA GAA GCA AAC GCT GAA TCC GAT AAG AAA CGT AAA GAA GAA GTA         2600Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val595                 600                 605                 610GAC CTT CGT AAT GAA GTG GAC CAA GCA ATC TTT GCG ACT GAA AAG ACA         2648Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr
            615                 620                 625ATC AAG GAA ACT GAA GGT AAA GGC TTC GAC GCA GAA CGT GAC GCT GCC         2696Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala
        630                 635                 640CAA GCT GCC CTT GAT GAC CTT AAG AAA GCT CAA GAA GAC AAC AAC TTG         2744Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu
    645                 650                 655GAC GAC ATG AAA GCA AAA CTT GAA GCA TTG AAC GAA AAA GCT CAA GGA         2792Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly
660                 665                 670CTT GCT GTT AAA CTC TAC GAA CAA GCC GCA GCA GCG CAA CAA GCT CAA         2840Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln675                 680                     685             690GAA GGA GCA GAA GGC GCA CAA GCA ACA GGA AAC GCA GGC GAT GAC GTC         2888Glu Gly Ala Glu Gly Als Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val
            695                 700                 705GTA GAC GGA GAG TTT ACG GAA AAG TAAGATGAGT GTATTGGATG AAGAGTATCT        2942Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys
        710AAAAAATACA CGAAAAGTTT ATAATGATTT TTGTAATCAA GCTGATAACT ATAGAACATC       3002AAAAGATTTT ATTGATAATA TTCCAATAGA ATATTTAGCT AGATATAGAG AAATTATATT       3062AGCTGAGCAT GATAGTTGTG TCAAAAATGA TGAAGCGGTA AGGAATTTTG TTACCTCAGT       3122ATTGTTGTCT GCATTTGTAT CGGCGATGGT ATCAGCTATG ATATC                       3167(2)    SEQ I的NO：2的资料：
   (i)序列特征：
        (A)长度：242个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑结构：线性
 (ii)分子类型：蛋白质
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ser Gln Asp Glu Lys Leu Ile Arg Glu Gln Ile Cys Asp Val Cys1               5                  10                  15His Lys Met Trp Gln Leu Gly Trp Val Ala Ala Asn Asp Gly Asn Val
         20                  25                  30Ser Val Arg Leu Asp Glu Asp Thr Ile Leu Ala Thr Pro Thr Gly Ile
     35                  40                  45Ser Lys Ser Phe Ile Thr Pro Glu Lys Leu Val Lys Leu Asn Leu Lys
 50                  55                  60Gly Glu Ile Leu Glu Ala Glu Gly Asp Tyr Cys Pro Ser Ser Glu Ile65                  70                  75                  80Lys Met His Ile Arg Cys Tyr Glu Glu Arg Glu Asp Val Arg Ser Val
             85                  90                  95Val His Ala His Pro Pro Ile Ala Thr Gly Phe Ala Leu Ala His Ile
        100                 105                 110Pro Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Ile Glu Ser Ala Ile Val Val Gly Ala
    115                 120                 125Ile Pro Ile Thr Pro Phe Gly Val Pro Ser Thr Met Glu Val Pro Glu
130                 135                 140Ala Ile Thr Pro Tyr Leu Pro Asp His Asp Val Met Leu Leu Glu Asn145                 150                 155                 160His Gly Ala Leu Thr Val Gly Ser Asp Val Ile Thr Ala Tyr Tyr Arg
            165                 170                 175Met Glu Thr Leu Glu Leu Val Ala Lys Thr Thr Phe His Gly Arg Met
        180                 185                 190Leu Leu Ser Thr Lys Gly Ile Glu Glu Gln Glu Ile Ala Arg Pro Thr
    195                 200                 205Leu Glu Arg Leu Phe Ser Met Arg Glu Asn Tyr Lys Val Thr Gly Arg
210                 215                 220His Pro Gly Tyr Arg Lys Tyr Ash Gly Asp Gly Ser Ile Lys Glu Thr225                 230                 235                 240Lys Lys(2)  SEQ I的NO：3的资料：
    (i)序列特征：
         (A)长度：714个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Ile Gln His Pro Arg Ile Gly Ile Arg Pro Thr Ile Asp Gly Arg1               5                  10                  15Arg Gln Gly Val Arg Glu Ser Leu Glu Val Gln Thr Met Asn Met Ala
         20                  25                  30Lys Ser Val Ala Asp Leu Ile Ser Ser Thr Leu Lys Tyr Pro Asp Gly
     35                  40                  45Glu Pro Val Glu Cys Val Ile Ser Pro Ser Thr Ile Gly Arg Val Pro
 50                  55                  60Glu Ala Ala Ala Ser His Glu Leu Phe Lys Lys Ser Asn Val Cys Ala65                  70                  75                  80Thr Ile Thr Val Thr Pro Cys Trp Cys Tyr Gly Ser Glu Thr Met Asp
             85                  90                  95Met Ser Pro Asp Ile Pro His Ala Ile Trp Gly Phe Asn Gly Thr Glu
        100                 105                 110Arg Pro Gly Ala Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Ala Ser His Thr Gln
    115                 120                 125Lys Gly Ile Pro Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Arg Asp Val Gln Glu Ala
130                 135                 140Asn Asp Thr Ala Ile Pro Glu Asp Val Lys Glu Lys Leu Leu Arg Tyr145                 150                 155                 160Ala Arg Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Met Arg Asp Thr Ala Tyr Leu
            165                 170                 175Ser Met Gly Ser Val Ser Met Gly Ile Gly Gly Ser Ile Val Asn Pro
        180                 185                 190Asp Phe Phe Gln Glu Tyr Leu Gly Met Arg Asn Glu Ser Val Asp Met
    195                 200                 205Thr Glu Phe Thr Arg Arg Met Asp Arg Gly Ile Tyr Asp Pro Glu Glu
210                 215                 220Phe Glu Arg Ala Leu Lys Trp Val Lys Glu Asn Val Lys Glu Gly Phe225                 230                 235                 240Asp His Asn Arg Glu Asp Leu Val Leu Ser Arg Glu Glu Lys Asp Arg
            245                 250                 255Gln Trp Glu Phe Val Ile Lys Met Phe Met Ile Gly Arg Asp Leu Met
        260                 265                 270Val Gly Asn Pro Arg Leu Ala Glu Leu Gly Phe Glu Glu Glu Ala Val
    275                 280                 285Gly His His Ala Leu Val Ala Gly Phe Gln Gly Gln Arg Gln Trp Thr
290                 295                 300Asp His Phe Pro Asn Gly Asp Phe Met Glu Thr Phe Leu Asn Thr Gln305                 310                 315                 320Phe Asp Trp Asn Gly Ile Arg Lys Pro Phe Val Phe Ala Thr Glu Asn
            325                 330                 335Asp Ser Leu Asn Gly Val Ser Met Leu Phe Asn Tyr Leu Leu Thr Asn
        340                 345                 350Thr Pro Gln Ile Phe Ala Asp Val Arg Thr Tyr Trp Ser Pro Glu Ala
    355                 360                 365Val Glu Arg Val Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Ala Ala Ala Gly
370                 375                 380Phe Leu His Leu Ile Asn Ser Gly Ser Cys Thr Leu Asp Gly Thr Gly385                 390                 395                 400Gln Ala Thr Arg Asp Gly Lys Pro Val Met Lys Pro Phe Trp Glu Leu
            405                 410                 415Asp Glu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Glu Asn Thr Asp Phe Pro Pro
        420                 425                 430Ala Asn Arg Glu Tyr Phe Arg Gly Gly Gly Phe Ser Thr Arg Phe Leu
    435                 440                 445Thr Lys Gly Asp Met Pro Val Thr Met Val Arg Leu Asn Leu Leu Lys
450                 455                 460Gly Val Gly Pro Val Leu Gln Ile Ala Glu Gly Tyr Thr Leu Glu Leu465                 470                 475                 480Pro Glu Asp Val His His Thr Leu Asp Asn Arg Thr Asp Pro Gly Trp
            485                 490                 495Pro Thr Thr Trp Phe Ala Pro Arg Leu Thr Gly Lys Gly Ala Phe Lys
        500                 505                 510Ser Val Tyr Asp Val Met Asn Asn Trp Gly Ala Asn His Gly Ala Ile
    515                 520                 525Thr Tyr Gly His Ile Gly Ala Asp Leu Ile Thr Leu Ala Ser Met Leu
530                 535                 540Arg Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile545                 550                 555                 560Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile
            565                 570                 575Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met
        580                 585                 590Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu
    595                 600                 605Glu Val Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu
610                 615                 620Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp625                 630                 635                 640Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn
            645                 650                 655Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala
        660                 665                 670Gln Gly Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln
    675                 680                 685Ala Gln Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp
690                 695                 700Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys705                 710(2)  SEQ I的NO：4的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：4320个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
      (A)生物：肺炎链球菌(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：682..2502
  (D)其他资料：/产物＝“热休克蛋白72”(ix)特征
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：3265..4320
  (D)其他资料：/产物-“DNAJ的NH2末端部分”(ix)特征：
  (A)名称/键：mat-peptide
  (B)位置：682..2502(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AAGCTTGATT CACGCTTTGA AAGAAGAAGG AATTGAAGAA ATCGCAGCAG ATGGCGAATT      60TGACCATAAC TACCATATGG CCATCCAAAC TCTCCCAGCA GACGATGAAC ACCCAGTAGA     120TACCATCGCC CAAGTCTTTC AAAAAGGCTA CAAACTCCAT GACCGCATCC TACGCCCAGC     180AATGGTAGTG GTGTATAACT AAGATACAAA GCCCGTAAAA AGCTCGCAGT AAAAATAGGA     240GATTGACGAA GTGTTCGATG AACACAAGAA AATCTATCTT TTTTACTCAG AGCTTAGGGC     300GTGTTCGATT CGGCAATTCT GACGGTAGCT AAAGCAACTC GTCAGAAAAC GGCAGTCGCT     360ATGGCGTTTC TCTAGCTTCC TTACTAACTC GTCGTCGAAA TAAAATCGAT TTCGACTCTT     420CGTGTCGCAA TTTACATAAT AGAAAACTTG TCCGAAACGA CAATAAACTA TGAAGAAAGA     480TAAAATATGT TTGGCTTTGT AATAGTGAGC GAAGCGAACC AAAGACGATA CTCTTCGCTG     540TGGCGCTATT TGCGCAAATT TTGAGACCTT AGGCTCAAAG TTTAGTCAAA GAGATTGACA     600AAGTCAAGCT CTGACGGCGT CGCCACTTAA GAAGAGTATC AAAAAGAAAA ATAGAAAATT     660AACTAACAAG GAGAAAAACA C ATG TCT AAA ATT ATC GGT ATT GAC TTA GGT       711
                    Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly
                      1               5                  10ACA ACA AAC TCA GCA GTT GCA GTT CTT GAA GGA ACT GAA AGC AAA ATC       759Thr Thr Asn Ser Ala Val Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile
             15                  20                  25ATC GCA AAC CCA GAA GGA AAC CGC ACA ACT CCA TCT GTA GTC TCA TTC       807Ile Ala Asn Pro Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe
         30                  35              40AAA AAC GGA GAA ATC ATC GTT GGT GAT GCT GCA AAA CGT CAA GCA GTT       855Lys Asn Gly Glu Ile Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val
     45                  50                  55ACA AAC CCA GAT ACA GTT ATC TCT ATC AAA TCT AAG ATG GGA ACT TCT       903Thr Asn Pro Asp Thr Val Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser
 60                  65                  70GAA AAA GTT TCT GCA AAT GGA AAA GAA TAC ACT CCA CAA GAA ATC TCA       951Glu Lys Val Ser Ala Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser75                  80                  85                  90GCT ATG ATC CTT CAA TAC TTG AAA GGC TAC GCT GAA GAC TAC CTT GGT       999Ala Met Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly
             95                 100                 105GAG AAA GTA ACC AAA GCT GTT ATC ACA GTT CCG GCT TAC TTC AAC GAC         1047Glu Lys Val Thr Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp
        110                 115                 120GCT CAA CGT CAA GCA ACA AAA GAC GCT GGT AAA ATT GCT GGT CTT GAA         1095Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu
    125                 130                 135GTA GAA CGT ATT GTT AAC GAA CCA ACT GCA GCA GCT CTT GCT TAT GGT         1143Val Glu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly
140                 145                 150TTG GAC AAG ACT GAC AAA GAA GAA AAA ATC TTG GTA TTT GAC CTT GGT         1191Leu Asp Lys Thr Asp Lys Glu Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly155                 160                 165                 170GGT GGT ACA TTC GAC GTC TCT ATC CTT GAA TTG GGT GAC GGT GTC TTC         1239Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe
            175                 180                 185GAC GTA TTG TCA ACT GCA GGG GAC AAC AAA CTT GGT GGT GAC GAC TTT         1287Asp Val Leu Ser Thr Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe
        190                 195                 200GAC CAA AAA ATC ATT GAC CAC TTG GTA GCA GAA TTC AAG AAA GAA AAC         1335Asp Gln Lys Ile Ile Asp His Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu Asn
    205                 210                 215GGT ATC GAC TTG TCT ACT GAC AAG ATG GCA ATG CAA CGT TTG AAA GAT         1383Gly Ile Asp Leu Ser Thr Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Lys Asp
220                 225                 230GCG GCT GAA AAA GCG AAG AAA GAC CTT TCT GGT GTA ACT TCA ACA CAA         1431Ala Ala Glu Lys Ala Lys Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Ser Thr Gln235                 240                 245                 250ATC AGC TTG CCA TTT ATC ACT GCA GGT GAG GCT GGA CCT CTT CAC TTG         1479Ile Ser Leu Pro Phe Ile Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu
            255                 260                 265GAA ATG ACT TTA ACT CGT GCG AAA TTT GAT GAT TTG ACT CGT GAC CTT         1527Glu Met Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu
        270                 275                 280GTT GAA CGT ACA AAA GTT CCA GTT CGT CAA GCC CTT TCA GAT GCA GGT         1575Val Glu Arg Thr Lys Val Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly
    285                 290                 295TTG AGC TTG TCA GAA ATC GAC GAA GTT ATC CTT GTT GGT GGT TCA ACT         1623Leu Ser Leu Ser Glu Ile Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr
300                 305                 310CGT ATC CCT GCC GTT GTT GAA GCT GTT AAA GCT GAA ACT GGT AAA GAA         1671Arg Ile Pro Ala Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu315                 320                 325                 330CCA AAC AAA TCA GTA AAC CCT GAT GAA GTA GTT GCT ATG GGT GCG GCT         1719Pro Asn Lys Ser Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala
            335                 340                 345ATC CAA GGT GGT GTG ATT ACT GGT GAT GTC AAG GAT GTT GTC CTT CTT         1767Ile Gln Gly Gly Val Ile Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu
        350                 355                 360GAT GTA ACG CCA TTG TCA CTT GGT ATC GAA ACA ATG GGT GGA GTA TTT         1815Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe
    365                 370                 375ACA AAA CTT ATC GAT CGC AAC ACT ACA ATC CCA ACA TCT AAA TCA CAA     1863Thr Lys Leu Ile Asp Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln
380                 385                 390GTC TTC TCA ACA GCA GCA GAC AAC CAA CCA GCC GTT GAT ATC CAC GTT     1911Val Phe Ser Thr Ala Ala Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val395                 400                 405                 410CTT CAA GGT GAA CGC CCA ATG GCA GCA GAT AAC AAG ACT CTT GGA CGC     1959Leu Gln Gly Glu Arg Pro Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg
            415                 420                 425TTC CAA TTG ACT GAT ATC CCA GCT GCA CCT CGT GGA ATT CCT CAA ATC     2007Phe Gln Leu Thr Asp Ile Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile
        430                 435                 440GAA GTA ACA TTT GAC ATT GAC AAG AAC GGT ATC GTG TCT GTT AAG GCC     2055Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala
    445                 450                 455AAA GAC CTT GGA ACT CAA AAA GAA CAA ACT ATT GTC ATC CAA TCG AAC     2103Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile Va1 Ile Gln Ser Asn
460                 465                 470TCA GGT TTG ACT GAC GAA GAA ATC GAC CGC ATG ATG AAA GAT GCA GAA     2151Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu475                 480                 485                 490GCA AAC GCT GAA TCC GAT AAG AAA CGT AAA GAA GAA GTA GAC CTT CGT     2199Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Arg
            495                 500                 505AAT GAA GTG GAC CAA GCA ATC TTT GCG ACT GAA AAG ACA ATC AAG GAA     2247Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu
        510                 515                 520ACT GAA GGT AAA GGC TTC GAC GCA GAA CGT GAC GCT GCC CAA GCT GCC     2295Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ala Ala
    525                 530                 535CTT GAT GAC CTT AAG AAA GCT CAA GAA GAC AAC AAC TTG GAC GAC ATG     2343Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu Asp Asp Met
540                 545                 550AAA GCA AAA CTT GAA GCA TTG AAC GAA AAA GCT CAA GGA CTT GCT GTT     2391Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Val555                 560                 565                 570AAA CTC TAC GAA CAA GCC GCA GCA GCG CAA CAA GCT CAA GAA GGA GCA     2439Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln Glu Gly Ala
            575                 580                 585GAA GGC GCA CAA GCA ACA GGA AAC GCA GGC GAT GAC GTC GTA GAC GGA     2487Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val Val Asp Gly
        590                 595                 600GAG TTT ACG GAA AAG TAAGATGAGT GTATTGGATG AAGAGTATCT AAAAAATACA     2542Glu Phe Thr Glu Lys
    605CGAAAAGTTT ATAATGATTT TTGTAATCAA GCTGATAACT ATAGAACATC AAAAGATTTT   2602ATTGATAATA TTCCAATAGA ATATTTAGCT AGATATAGAG AAATTATATT AGCTGAGCAT   2662GATAGTTGTG TCAAAAATGA TGAAGCGGTA AGGAATTTTG TTACCTCAGT ATTGTTGTCT   2722GCATTTGTAT CGGCGATGGT ATCAGCTATG ATATCATTAG AAATACAAAC ATATAAATTT   2782GTAATACCGT TCATAATTGG TATGATTTGG ACAGTAGTTG TATTTCTTAT GATCAATTGG   2842AATTATATAG GCAAATACTA AGAAGAGACA AAAATATATA AATATTTCTG TACTTATAGG       2902ATATTTAAAA TCCAAATAAA GTTAATTTAC TTATTTGCAG AGGTTGCAAC CCAGCCTCTG       2962TTTTTCGATA AAAAGGGACG GAATCTCATT TGTTTGGGTT TTGTCTCATC AATAGAAAGG       3022AACAAAGAGT GTTCGTAACT GAACACGGGT TTCAGAATTT CTTACTAAAT ATAAAAGAAA       3082GGAATTGAAC CCGACCTAAA TGGTGGTTCG ATTCAGAACA TCAATAGAAA GGAATAAGGG       3142TGTTCGTAAC TGAACACGGG CTACGGACTG TGCCAAAAAG ATAGTTTTTT CTAGGACGTA       3202AGCGTCCGTC GTCAAAACTC CTAGATGGCT GTGTCCGTTT GACGCCCTTT GTATCTTGAA       3262TT ATG AAC AAT ACT GAA TTT TAT GAT CGT CTG GGG GTA TCC AAA AAC          3309Met Asn Asn Thr Glu Phe Tyr Asp Arg Leu Gly Val Ser Lys Asn
 1               5                  10                  15GCT TCG GCA GAC GAA ATC AAA AAG GCT TAT CGT AAG CTT TCC AAA AAA         3357Ala Ser Ala Asp Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ser Lys Lys
             20                  25                  30TAT CAC CCA GAT ATC AAC AAG GAG CCT GGT GCT GAG GAC AAG TAC AAG         3405Tyr His Pro Asp Ile Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Asp Lys Tyr Lys
         35                  40                  45GAA GTT CAA GAA GCC TAT GAG ACT TTG AGT GAC GAC CAA AAA CGT GCT         3453Glu Val Gln Glu Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Asp Gln Lys Arg Ala
     50                  55                  60GCC TAT GAC CAG TAT GGT GCT GCA GGC GCC AAT GGT GGT TTT GGT GGA         3501Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Asn Gly Gly Phe Gly Gly
 65                  70                  75GCT GGT GGT TTC GGC GGT TTC AAT GGG GCA GGT GGC TTC GGT GGT TTT         3549Ala Gly Gly Phe Gly Gly Phe Asn Gly Ala Gly Gly Phe Gly Gly Phe80                  85                  90                  95GAG GAT ATT TTC TCA AGT TTC TTC GGC GGA GGC GGT TCT TCG CGC AAT         3597Glu Asp Ile Phe Ser Ser Phe Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asn
            100                 105                 110CCA AAC GCT CCT CGC CAA GGA GAT GAT CTC CAG TAT CGT GTC AAT TTG         3645Pro Asn Ala Pro Arg Gln Gly Asp Asp Leu Gln Tyr Arg Val Asn Leu
        115                 120                 125ACC TTT GAA GAA GCT ATC TTC GGA ACT GAG AAG GAA GTT AAG TAT CAT         3693Thr Phe Glu Glu Ala Ile Phe Gly Thr Glu Lys Glu Val Lys Tyr His
    130                 135                 140CGT GAA GCT GGC TGT CGT ACA TGT AAT GGA TCT GGT GCT AAG CCA GGG         3741Arg Glu Ala Gly Cys Arg Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly
145                 150                 155ACA AGT CCA GTC ACT TGT GGA CGC TGT CAT GGC GCT GGT GTC ATT AAC         3789Thr Ser Pro Val Thr Cys Gly Arg Cys His Gly Ala Gly Val Ile Asn160                 165                 170                 175GTC GAT ACG CAG ACT CCT CTT GGT ATG ATG CGT CGC CAA GTA ACC TGT         3837Val Asp Thr Gln Thr Pro Leu Gly Met Met Arg Arg Gln Val Thr Cys
            180                 185                 190GAT GTC TGT CAC GGT CGA GGA AAA GAA ATC AAA TAT CCA TGT ACA ACC         3885Asp Val Cys His Gly Arg Gly Lys Glu Ile Lys Tyr Pro Cys Thr Thr
        195                 200                 205TGT CAT GGA ACA GGT CAT GAG AAA CAA GCT CAT AGC GTA CAT GTG AAA         3933Cys His Gly Tnr Gly His Glu Lys Gln Ala His Ser Val His Val Lys
    210                 215                 220ATC CCT GCT GGT GTG GAA ACA GGT CAA CAA ATT CGC CTC GCT GGT CAA         3981Ile Pro Ala Gly Val Glu Thr Gly Gln Gln Ile Arg Leu Ala Gly Gln
225                 230                 235GGT GAA GCA GGC TTT AAC GGT GGA CCT TAT GGT GAC TTG TAT GTA GTA         4029Gly Glu Ala Gly Phe Asn Gly Gly Pro Tyr Gly Asp Leu Tyr Val Val240                 245                 250                 255GTT TCT GTG GAA GCT AGT GAC AAG TTT GAA CGT GAA GGA ACG ACT ATC         4077Val Ser Val Glu Ala Ser Asp Lys Phe Glu Arg Glu Gly Thr Thr Ile
            260                 265                 270TTC TAC AAT CTC AAC CTC AAC TTT GTC CAA GCG GCT CTT GGT GAT ACA         4125Phe Tyr Asn Leu Asn Leu Asn Phe Val Gln Ala Ala Leu Gly Asp Thr
        275                 280                 285GTA GAT ATT CCA ACT GTT CAC GGT GAT GTT GAA TTG GTT ATT CCA GAG         4173Val Asp Ile Pro Thr Val Hie Gly Asp Val Glu Leu Val Ile Pro Glu
    290                 295                 300GGA ACT CAG ACT GGT AAG AAA TTC CGC CTA CGT AGT AAG GGG GCA CCG         4221Gly Thr Gln Thr Gly Lys Lys Phe Arg Leu Arg Ser Lys Gly Ala Pro
305                 310                 315AGC CTT CGT GGC GGT GCA GTT GGT GAC CAA TAC GTT ACT GTT AAT GTC         4269Ser Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Asp Gln Tyr Val Thr Val Asn Val320                 325                 330                 335GTA ACA CCG ACA GGC TTG AAC GAC CGC CAA AAA GTA GCC TTG AAA GAA         4317Val Thr Pro Thr Gly Leu Asn Asp Arg Gln Lys Val Ala Leu Lys Glu
            340                 345                 350TTCPhe                                                                     4320(2)SEQ I的NO：5的资料：
   (i)序列特征：
        (A)长度：607个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑结构：线性
 (ii)分子类型：蛋白质
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val1               5                  10                  15Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile Ile Ala Asn Pro Glu Gly
         20                  25                  30Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu Ile Ile
     35                  40                  45Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Asp Thr Val
 50                  55                  60Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn65                  70                  75                  80Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu Gln Tyr
             85                  90                  95Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Thr Lys Ala
        100                 105                 110Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr
    115                 120                 125Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile Val Asn
130                 135                 140Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Thr Asp Lys145                 150                 155                 160Glu Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val
            165                 170                 175Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Asp Val Leu Ser Thr Ala
        180                 185                 190Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp
    195                 200                 205His Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Thr
210                 215                 220Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys225                 230                 235                 240Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Ser Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile
            245                 250                 255Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Thr Leu Thr Arg
        260                 265                 270Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Val
    275                 280                 285Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser Leu Ser Glu Ile
290                 295                 300Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala Val Val305                 310                 315                 320Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn
            325                 330                 335Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile
        340                 345                 350Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser
    355                 360                 365Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg
370                 375                 380Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala385                 390                 395                 400Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro
            405                 410                 415Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile
        420                 425                 430Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile
    435                 440                 445Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln
450                 455                 460Lys Glu Gln Thr Ile Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu
465             470                 475                 480Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp
            485                 490                 495Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala
        500                 505                 510Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe
    515                 520                 525Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys
530                 535                 540Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala545                 550                 555                 560Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala
            565                 570                 575Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr
        580                 585                 590Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys
    595                 600                 605(2)SEQ I的NO：6的资料：
   (i)序列特征：
         (A)长度：352个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Asn Asn Thr Glu Phe Tyr Asp Arg Leu Gly Val Ser Lys Asn Ala1               5                  10                  15Ser Ala Asp Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ser Lys Lys Tyr
         20                  25                  30His Pro Asp Ile Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Asp Lys Tyr Lys Glu
     35                  40                  45Val Gln Glu Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Asp Gln Lys Arg Ala Ala
 50                  55                  60Tyr Asp Gln Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Asn Gly Gly Phe Gly Gly Ala65                  70                  75                  80Gly Gly Phe Gly Gly Phe Asn Gly Ala Gly Gly Phe Gly Gly Phe Glu
             85                  90                  95Asp Ile Phe Ser Ser Phe Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asn Pro
        100                 105                 110Asn Ala Pro Arg Gln Gly Asp Asp Leu Gln Tyr Arg Val Asn Leu Thr
    115             120                     125Phe Glu Glu Ala Ila Phe Gly Thr Glu Lys Glu Val Lys Tyr His Arg
130                 135                 140Glu Ala Gly Cys Arg Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Thr145                 150                 155                 160Ser Pro Val Thr Cys Gly Arg Cys His Gly Ala Gly Val Ile Asn Val
            165                 170                 175Asp Thr Gln Thr Pro Leu Gly Met Met Arg Arg Gln Val Thr Cys Asp
        180                 185                 190Val Cys His Gly Arg Gly Lys Glu Ile Lys Tyr Pro Cys Thr Thr Cys
    195                 200                 205His Gly Thr Gly His Glu Lys Gln Ala His Ser Val His Val Lys Ile
210                 215                 220Pro Ala Gly Val Glu Thr Gly Gln Gln Ile Arg Leu Ala Gly Gln Gly225                 230                 235                 240Glu Ala Gly Phe Asn Gly Gly Pro Tyr Gly Asp Leu Tyr Val Val Val
            245                 250                 255Ser Val Glu Ala Ser Asp Lys Phe Glu Arg Glu Gly Thr Thr Ile Phe
        260                 265                 270Tyr Asn Leu Asn Leu Asn Phe Val Gln Ala Ala Leu Gly Asp Thr Val
    275                 280                 285Asp Ile Pro Thr Val His Gly Asp Val Glu Leu Val Ile Pro Glu Gly
290                 295                 300Thr Gln Thr Gly Lys Lys Phe Arg Leu Arg Ser Lys Gly Ala Pro Ser305                 310                 315                 320Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Asp Gln Tyr Val Thr Val Asn Val Val
            325                 330                 335Thr Pro Thr Gly Leu Asn Asp Arg Gln Lys Val Ala Leu Lys Glu Phe
        340                 345                 350(2)  SEQ I的NO：7的资料：
      (i)序列特征：
           (A)长度：15个氨基酸
           (B)类型：氨基酸
           (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：肽
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Thr Ser Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile Thr Ala Gly Glu Ala
1               5                   10                  15(2) SEQ I的NO：8的资料：
  (i)序列特征：
       (A)长度：15个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：肽
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Thr Leu Thr
1               5                   10                  15(2) SEQ I的NO：9的资料：
  (i)序列特征：
       (A)长度：14个氨基酸
           (B)类型：氨基酸
           (D)拓扑结构：线性
 (ii)分子类型：肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
 Met Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp
 1               5                   10(2) SEQ I的NO：10的资料：
(i)序列特征：
     (A)长度15个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Val Pro Val
1               5                   10                  15(2)SEQ I的NO：11的资料：
(i)序列特征：
    (A)14个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
Thr Lys Val Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu
1               5                   10(2)SEQ I的NO：12的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：15个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列：描述：SEQ ID NO：12：
Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile Val Ile
1               5                   10                  15(2)SEQ I的NO：13的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：14个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
Leu Thr Asp Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu Ala
1               5                   10(2)SEQ I的NO：14的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：24个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Val Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp
            20(2)SEQ I的NO：15的资料：
(i)序列特征
     (A)长度：15个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys
1               5                   10                  15(2)SEQ I的NO：16的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：28个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ NO：16：
Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
Asp Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys
            20                  25(2)SEQ I的NO：17的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：30个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17
Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu       -
1               5                   10                  15
Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Val Lys Leu Tyr
            20                  25                  30(2)SEQ I的NO：18的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：25个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
Gln Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp
1               5                   10                  15
Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys
            20                  25(2)SEQ I的NO：19的资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：2183个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义:无
(vi)来源：
     (A)生物：化脓链球菌
(ix)特征：
     (A)名称/关键词：CDS
     (B)位置204..2030
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19CAGCGATGGT AGTTGTTTAT AACTAAGGTA AATGAGTTTT CGTTTTTGTC CGTAATGACA        60GTAAACTAGA TAGCAAGTTA GAAGCTATTT CGCTTGCTGA TTAAACTATA GTGATTGCTT       120AGAATTGGAA GTAAAATAAT TCGAGTGCTT ACTAAGATAA ATTGAAATAA AAAGTAATAA       180AGTATAAAAT AAGAGGTATT AAC ATG TCT AAA ATT ATT GGT ATT GAC TTA           230
                      Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu
                        1               5GGT ACA ACA AAC TCA GCA GTA GCA GTT CTT GAA GGG ACT GAA TCA AAA         278Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys10                  15                  20                  25ATC ATT GCT AAC CCA GAA GGC AAT CGT ACA ACT CCT TCA GTA GTA TCA         326Ile Ile Ala Asn Pro Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser
             30                  35                  40TTC AAA AAT GGT GAA ATT ATC GTG GGT GAT GCT GCA AAA CGC CAA GCA         374Phe Lys Asn Gly Glu Ile Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala
         45                  50                  55GTG ACA AAC CCA GAA ACA GTA ATC TCT ATT AAA TCT AAA ATG GGA ACT        422Val Thr Asn Pro Glu Thr Val Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr
     60                  65                  70TCT GAA AAA GTT TCT GCA AAT GGT AAA GAA TAT ACT CCT CAA GAA ATT        470Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile
 75                  80                  85TCA GCA ATG ATT CTT CAA TAC CTT AAA GGT TAT GCT GAA GAC TAT CTT        518Ser Ala Met Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu90                  95                 100                 105GGA GAA AAA GTA GAA AAA GCA GTT ATT ACT GTT CCA GCT TAT TTC AAC        566Gly Glu Lys Val Glu Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn
            110                 115                 120GAT GCA CAA CGT CAA GCA ACT AAA GAC GCT GGT AAA ATT GCA GGT CTT        614Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu
        125                 130                 135GAA GTA GAA CGT ATC GTT AAT GAA CCA ACA GCA GCT GCA CTT GCT TAT        662Glu Val Glu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr
    140                 145                 150GGT ATG GAC AAG ACT GAC AAG GAT GAA AAA ATC TTA GTT TTT GAC CTT        710Gly Met Asp Lys Thr Asp Lys Asp Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu
155                 160                 165GGT GGT GGT ACA TTT GAC GTA TCA ATC CTT GAA TTA GGT GAT GGT GTC        758Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Ila Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val170                 175                 180                 185TTC GAC GTT CTT GCA ACA GCA GGT GAT AAC AAA CTT GGT GGT GAC GAC        806Phe Asp Val Leu Ala Thr Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp
            190                 195                 200TTT GAC CAA AAA ATT ATT GAT TTC TTA GTG GCT GAA TTT AAG AAA GAA        854Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp Phe Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu
        205                 210                 215AAT GGT ATT GAC TTA TCA CAA GAT AAG ATG GCA CTT CAA CGC TTG AAA        902Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gln Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys
    220                 225                 230GAT GCT GCT GAA AAA GCT AAA AAA GAT CTT TCA GGT GTG ACA CAA ACA        950Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr
235                 240                 245CAA ATT TCA TTA CCG TTC ATC ACT GCT GGT TCT GCT GGT CCT CTT CAC        998Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile Thr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His250                 255                 260                 265TTA GAG ATG AGC TTA TCT CGT GCT AAA TTT GAC GAT CTC ACT CGT GAC       1046Leu Glu Met Ser Leu Ser Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp
            270                 275                 280CTT GTT GAA CGT ACG AAA ACT CCA GTT CGT CAA GCT CTT TCA GAT GCA       1094Leu Val Glu Arg Thr Lys Thr Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala
        285                 290                 295GGA TTG TCA TTG TCA GAA ATT GAT GAA GTT ATC CTT GTT GGT GGA TCA       1142Gly Leu Ser Leu Ser Glu Ila Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser
    300                 305                 310ACT CGT ATC CCA GCA GTT GTC GAA GCT GTA AAA GCT GAA ACT GGT AAA       1190Thr Arg Ile Pro Ala Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys
315                 320                 325GAA CCA AAT AAA TCT GTA AAC CCT GAT GAA GTG GTT GCT ATG GGT GCT       1238Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala330                 335                 340                 345GCT ATC CAA GGT GGG GTT ATC ACT GGG GAT GTG AAA GAC GTT GTC CTT       1286Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu
            350                 355                 360CTT GAC GTA ACA CCA TTG TCA CTT GGT ATT GAA ACA ATG GGT GGT GTC       1334Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val
        365                 370                 375TTC ACT AAA TTG ATC GAC CGC AAT ACA ACT ATC CCA ACA TCT AAA TCA       1382Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser
    380                 385                 390CAA GTC TTC TCA ACA GCA GCA GAC AAC CAA CCA GCC GTT GAT ATC CAT       1430Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His
395                 400                 405GTT CTT CAA GGT GAA CGC CCA ATG GCA GCA GAT AAC AAG ACT CTT GGT       1478Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly410                 415                 420                 425CGC TTC CAA TTG ACT GAT ATC CCA GCT GCA CCT CGT GGA ATC CCA CAA       1526Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln
            430                 435                 440ATT GAA GTA ACA TTT GAT ATC GAT AAA AAC GGT ATT GTT TCT GTA AAA       1574Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys
        445                 450                 455GCT AAA GAC CTT GGT ACG CAA AAG GAA CAA CAC ATC GTT ATC AAA TCA       1622Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln His Ile Val Ile Lys Ser
    460                 465                 470AAC GAC GGA CTT TCT GAA GAA GAA ATT GAT CGC ATG ATG AAA GAC GCT       1670Asn Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala
475                 480                 485GAA GCT AAT GCC GAA GCC GAT GCG AAA CGT AAA GAA GAA GTT GAC CTT       1718Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu490                 495                 500                 505AAA AAC GAA GTT GAC CAA GCT ATC TTT GCT ACT GAA AAA ACA ATC AAA       1766Lys Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys
            510                 515                 520GAA ACT GAA GGT AAA GGC TTT GAC ACA GAA CGC GAT GCA GCG CAA TCA       1814Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser
        525                 530                 535GCT CTT GAC GAG TTA AAA GCT GCG CAA GAA TCT GGC AAC CTT GAC GAC       1862Ala Leu Asp Glu Leu Lys Ala Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp
    540                 545                 550ATG AAA GCT AAA CTT GAA GCA TTA AAT GAA AAA GCG CAA GCT TTG GCT       1910Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala
555                 560                 565GTT AAA ATG TAC GAG CAA GCT GCA GCA GCT CAA CAA GCA GCA CAA GGT       1958Val Lys Met Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Ala Gln Gly570                 575                 580                 585GCA GAA GGT GCA CAA GCT AAT GAT TCA GCA AAT AAT GAT GAT GTT GTA       2006Ala Glu Gly Ala Gln Ala Asn Asp Ser Ala Asn Asn Asp Asp Val Val
            590                 595                 600GAT GGC GAA TTT ACA GAA AAG TAATGATTTA GTTATCTAGT AACATTAATA          2057Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys
        605TCCGAATTCA GAGGTTGTAC CAAACCTCTG TTTTTGGCTA AATAAAATGT AAAAATGCTG     2117ACGTCAAAAT ATTTTAAGAA AGGAATACAA GTTCGATTAT TCGAACACAG GCTAAAGCGT     2177GTAAAG                                                                2183(2)SEQ I的NO：20的资料：
(i)序列特征：
         (A)长度608个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val1               5                  10                  15Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile Ile Ala Asn Pro Glu Gly
         20                  25                  30Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu Ile Ile
     35                  40                  45Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Glu Thr Val
 50                  55                  60Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn65                  70                  75                  80Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu Gln Tyr
             85                  90                  95Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Glu Lys Ala
        100                 105                 110Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr
    115                 120                 125Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile Val Asn
130                 135                 140Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Met Asp Lys Thr Asp Lys145                 150                 155                 160Asp Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val
            165                 170                 175Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Asp Val Leu Ala Thr Ala
        180                 185                 190Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp
    195                 200                 205Phe Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gln
210                 215                 220Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys225                 230                 235                 240Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile
            245                 250                 255Thr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Ser Leu Ser Arg
        260                 265                 270Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Thr
    275                 280                 285Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser Leu Ser Glu Ile
290                 295                 300Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala Val Val305                 310                 315                 320Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn
            325                 330                 335Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile
        340                 345                 350Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser
    355                 360                 365Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg
370                 375                 380Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala385                 390                 395                 400Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro
            405                 410                 415Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile
        420                 425                 430Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile
    435                 440                 445Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln
450                 455                 460Lys Glu Gln His Ile Val Ile Lys Ser Asn Asp Gly Leu Ser Glu Glu465                 470                 475                 480Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp
            485                 490                 495Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp Gln Ala
        500                 505                 510Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe
    515                 520                 525Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu Lys Ala
530                 535                 540Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala545                 550                 555                 560Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Val Lys Met Tyr Glu Gln Ala
            565                 570                 575Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gla Gly Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Asn
        580                 585                 590Asp Ser Ala Asn Asn Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys
    595                 600                 605(2)SEQ I的NO：21的资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：2438个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
      (A)生物：无乳链球菌
(ix)特征：
      (A)名称/关键词：CDS
      (B)位置：248..2077
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：CTTTCAAAAG GGATATAAAT TGCACGAGCG TCTGCTAAGA CCAGCGATGG TAGTTGTCTA     60TAACTAAGGT AAATGAGTTT TCGTTTTTGT CCGTAATGAC AGTAAACTAG ATAGCAAGTT    120AGAAGCTATT CAGCTTGCTG ATTAAACTAT AGTGATTGCT TAGAATTGGA AGTAAAATAA    180TTCGAGTGCT TACTAAGATA AATTGAAATA AAAAGTAATA AAGTATTATA AAATAAGAGG    240TATTAAC ATG TCT AAA ATT ATT GGT ATT GAC TTA GGT ACA ACA AAC TCA      289
    Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser
      1               5                  10GCA GTA GCA GTT CTT GAA GGG ACT GAA TCA AAA ATC ATT GCT AAC CCA      337Ala Val Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile Ile Ala Asn Pro15                  20                  25                  30GAA GGC AAT CGT ACA ACT CCT TCA GTA GTA TCA TTC AAA AAT GGT GAA      385Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu
             35                  40                  45ATT ATC GTG GGT GAT GCT GCA AAA CGT CAA GCG GTA ACA AAT CCA GAT      433Ile Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Asp
         50                  55                  60ACT GTT ATC TCT ATC AAA TCA AAG ATG GGA ACT TCT GAA AAA GTT TCT      481Thr Val Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser
     65                  70                  75GCA AAT GGT AAA GAA TAT ACT CCT CAA GAA ATT TCA GCA ATG ATT CTT      529Ala Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu
 80                  85                  90CAA TAC CTT AAA GGT TAT GCT GAA GAC TAT CTT GGA GAA AAA GTA GAA      577Gln Tyr Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Glu95                 100                 105                 110AAA GCA GTT ATT ACT GTT CCA GCT TAC TTC AAC GAT GCA CAA CGT CAG      625Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln
            115                 120                 125GCA ACT AAA GAC GCT GGT AAA ATT GCA GGT CTT GAA GTA GAA CGT ATC      673Ala Thr Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile
        130                 135                 140GTT AAC GAA CCA ACA GCA GCC GCA CTT GCT TAT GGT ATG GAC AAG ACT      721Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Met Asp Lys Thr
    145                 150                 155GAC AAG GAT GAA AAA ATC TTA GTT TTT GAC CTT GGT GGT GGT ACA TTT      769Asp Lys Asp Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe
160                 165                 170GAC GTA TCA ATC CTT GAA TTA GGT GAT GGT GTC TTC GAC GTT CTT GCA      817Asp Val Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Asp Val Leu Ala175                 180                 185                 190ACA GCA GGT GAT AAC AAA CTT GGT GGT GAC GAC TTT GAC CAG AAA ATT      865Thr Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Lys Ile
            195                 200                 205ATT GAT TTC TTG GTA GAA GAA TTC AAG AAA GAA AAT GGT ATT GAT CTT      913Ile Asp Phe Leu Val Glu Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu
        210                 215                 220TCT CAA GAC AAA ATG GCT CTT CAA CGC TTG AAA GAT GCT GCT GAA AAA      961Ser Gln Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys
    225                 230                 235GCT AAA AAA GAC CTT TCA GGT GTA ACT CAA ACT CAA ATT TCA TTA CCG     1009Ala Lys Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr Gln Ile Ser Leu Pro
240                 245                 250TTC ATC ACT GCT GGT TCT GCT GGT CCT CTT CAC TTG GAG ATG AGC TTA     1057Phe Ile Thr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Ser Leu255                 260                 265                 270TCA CGT GCT AAA TTT GAC GAT CTC ACT CGT GAC CTT GTT GAA CGT ACG     1105Ser Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr
            275                 280                 285AAA ACT CCA GTT CGT CAA GCT CTT TCA GAT GCA GGC TTG TCA TTG TCA     1153Lys Thr Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser Leu Ser
        290                 295                 300GAA ATT GAT GAA GTT ATC CTC GTT GGT GGA TCA ACA CGT ATC CCA GCA     1201Glu Ile Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala
    305                 310                 315GTT GTT GAA GCT GTA AAA GCT GAA ACT GGT AAA GAA CCA AAT AAA TCT     1249Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser
320                 325                 330GTT AAC CCT GAT GAA GTG GTT GCC ATG GGT GCT GCT ATC CAA GGT GGT     1297Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly335                 340                 345                 350GTT ATC ACT GGG GAT GTG AAA GAC GTT GTA CTT CTT GAC GTA ACA CCA     1345Val Ile Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro
            355                 360                 365TTG TCA CTT GGT ATT GAA ACA ATG GGT GGT GTC TTC ACT AAA TTG ATC     1393Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile
        370                 375                 380GAC CGC AAC ACA ACT ATC CCA ACA TCT AAA TCA CAA GTC TTC TCA ACA     1441Asp Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr
    385                 390                 395GCA GCA GAC AAC CAA CCA GCC GTT GAT ATC CAT GTT CTT CAA GGT GAA     1489Ala Ala Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu
400                 405                 410CGC CCA ATG GCA GCA GAT AAC AAA ACA CTC GGT CGC TTC CAA TTG ACT     1537Arg Pro Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr415                 420                 425                 430GAT ATC CCA GCT GCA CCT CGT GGA ATC CCA CAA ATT GAA GTA ACA TTT     1585Asp Ile Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe
            435                 440                 445GAT ATC GAT AAA AAT GGT ATT GTA TCT GTT AAA GCT AAA GAT CTC GGT     1633Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly
        450                 455                 460ACT CAA AAA GAA CAA CAC ATT GTT ATC CAA TCT AAT TCA GGA TTA ACT     1681Thr Gln Lys Glu Gln His Ile Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr
    465                 470                 475GAT GAA GAA ATT GAT AAA ATG ATG AAA GAT GCT GAA GCA AAT GCT GAA     1729Asp Glu Glu Ile Asp Lys Met Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu
480                 485                 490GCA GAT GCA AAA CGT AAA GAA GAA GTT GAT CTT AAA AAT GAA GTT GAC     1777Ala Asp Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp495                 500                 505                 510CAA GCC ATC TTT GCA ACA GAA AAA ACT ATT AAA GAA ACT GAA GGC AAA     1825Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys
            515                 520                 525GGT TTT GAT ACA GAA CGC GAT GCA GCG CAA TCA GCA CTT GAT GAG TTG     1873Gly Phe Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu
        530                 535                 540AAA AAA GCT CAA GAA TCA GGT AAC CTT GAC GAC ATG AAA GCT AAA CTT     1921Lys Lys Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu
    545                 550                 555GAA GCT CTT AAC GAA AAA GCA CA GCT CTT GCA GTT AAA CTT TAC GAA      1969Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Geu Ala Val Lys Leu Tyr Glu
560                 565                 570CAA GCG GCT GCA GCA CAA CAA GCA GCT CAA GGG GCT GAA GGT GCA CAA     2017Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Ala Gln Gly Ala Glu Gly Ala Gln575                 580                 585                 590TCA GCT GAT TCA TCA AGC AAG GGT GAT GAT GTT GTA GAT GGC GAA TTC     2065Ser Ala Asp Ser Ser Ser Lys Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe
            595                 600                 605ACT GAG AAA TAATTATTAA TATTGTTCAG ATTCATTTGA ATATAAGCAT             2114Thr Glu Lys
        610GAAAACTATA CTAGCATAGT AAAGTTCTTC GTGATAGGGA TTGCTCAATA ATCTAGATAA   2174GTTTCAGATT ACATAAGCTA ATTTCGCTAT CACTAAATAA AAACATATTA ATAATAAATA   2234GGCGGGGCGC CTCGCTCCGT CTGTTTTATT AAGTGTCATA TATATGTTAA CTATTTAGAG   2294CTGTAACTGG GCAAGAATAA TTGTTAATCT CTTCAAGTGT AGTATATGAA CAAAATATAA   2354AGGATTAGAT AATGAACAAT ACAGAATTTT ATGATCGTCT TGGCGTTTCA AAAGATGCTT   2414CTCAGGACGA AATAAAAAAA GCTT                                          2438(2)  SEQ I的NO: 22的资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：609个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val1               5                  10                  15Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile Ile Ala Asn Pro Glu Gly
         20                  25                  30Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu Ile Ile
     35                  40                  45Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Asp Thr Val
 50                  55                  60Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn65                  70                  75                  80Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu Gln Tyr
             85                  90                  95Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Glu Lys Ala
        100                 105                 110Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr
    115                 120                 125Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile Val Asn
130                 135                 140Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Met Asp Lys Thr Asp Lys145                 150                 155                 160Asp Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val
            165                 170                 175Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Asp Val Leu Ala Thr Ala
        180                 185                 190Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp
    195                 200                 205Phe Leu Val Glu Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gln
210                 215                 220Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys225                 230                 235                 240Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile
            245                 250                 255Thr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Ser Leu Ser Arg
        260                 265                 270Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Thr
    275                 280                 285Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser Leu Ser Glu Ile
290                 295                  300Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala Val Val305                 310                 315                 320Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn
            325                 330                 335Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile
        340                 345                 350Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser
    355                 360                 365Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg
370                 375                 380Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala385                 390                 395                 400Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro
            405                 410                 415Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile
        420                 425                 430Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile
    435                 440                 445Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln
450                 455                 460Lys Glu Gln His Ile Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu465                 470                 475                 480Glu Ile Asp Lys Met Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp
            485                 490                 495Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp Gln Ala
        500                 505                 510Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe
    515                 520                 525Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu Lys Lys
530                 535                 540Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala545                 550                 555                 560Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala
            565                 570                 575Ala Ala Ala Gln Gln Ala Ala Gln Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ser Ala
        580                 585                 590Asp Ser Ser Ser Lys Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu
    595             600                      605Lys(2)SEQ I的NO：23的资料：
(i)序列特征
   (A)长度：19个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
Arg Ile Pro Ala Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Pro Asn Lys(2)SEQ I的NO：24的资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：15个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
Gln Thr Ile Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu
1               5                   10                  15(2)SEQ I的NO：25的资料：
(i)序列特征：
     (A)长度：460个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
     (A)生物：肺炎链球菌
(ix)特征：
     (A)名称/关键词：CDS
     (B)位置：1..456
     (D)其他资料：/产物＝“HSP72的C末端151残基片段(C-151)”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：ATG AAG GCC AAA GAC CTT GGA ACT CAA AAA GAA CAA ACT ATT GTC ATC         48Met Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile Val Ile1               5                  10                  15CAA TCG AAC TCA GGT TTG ACT GAC GAA GAA ATC GAC CGC ATG ATG AAA         96Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys
         20                  25                  30GAT GCA GAA GCA AAC GCT GAA TCC GAT AAG AAA CGT AAA GAA GAA GTA        144Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val
     35                  40                  45GAC CTT CGT AAT GAA GTG GAC CAA GCA ATC GCG ACT ACT GAA AAG ACA        192Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr
 50                  55                  60ATC AAG GAA ACT GAA GGT AAA GGC TTC GAC GCA GAA CGT GAC GCT GCC        240Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala65                  70                  75                  80CAA GCT GCC CTT GAT GAC CTT AAG AAA GCT CAA GAA GAC AAC AAC TTG        288Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu
             85                  90                  95GAC GAC ATG AAA GCA AAA CTT GAA GCA TTG AAC GAA AAA GCT CAA GGA        336Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly
        100                 105                 110CTT GCT GTT AAA CTC TAC GAA CAA GCC GCA GCA GCG CAA CAA GCT CAA         384Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln
    115                 120                 125GAA GGA GCA GAA GGC GCA CAA GCA ACA GGA AAC GCA GGC GAT GAC GTC         432Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val
130                 135                 140GTA GAC GGA GAG TTT ACG GAA AAG TAAG                                    460Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys145                 150(2)SEQ I的NO：26的资料：
(i)序列特征：
     (A)长度152个氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Met Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile Val Ile1               5                  10                  15Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys
         20                  25                  30Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val
     35                  40                  45Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr
 50                  55                  60Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala65                  70                  75                  80Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu
             85                  90                  95Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly
        100                 105                 110Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln
    115                 120                 125Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val
130                 135                 140Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys145                 150

Claims (101)

1 选自下列的多肽：
(a)具有SEQ ID NO：5之氨基酸序列的HSP72多肽；
(b)具有SEQ ID NO：20之氨基酸序列的HSP70(DnaK)多肽；
(c)具有SEQ ID NO：22之氨基酸序列的HSP70(DnaK)多肽；
(d)与用肺炎链球菌细胞感染哺乳动物宿主产生的抗体有免疫反应性的多肽，所述抗体与(a)、(b)或(c)中的多肽有免疫反应性；
(e)能够引发抗体的多肽，所述抗体与(a)、(b)或(c)中的多肽有免疫反应性；
(f)与抗体有免疫反应性的多肽，所述抗体是用(a)、(b)或(c)中的多肽免疫接种而引发的；
(g)前述多肽的任何片段，或者单独或者与其他多肽组合以形成融合蛋白。
2 权利要求1的多肽，其中(d)中的多肽选自链球菌和肠球菌属的多肽。
3 权利要求1的多肽，其中(d)中的多肽选自肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、变异链球菌、血链球菌和粪肠球菌。
4 权利要求1的多肽，其中(d)中的多肽选自肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓链球菌。
5 权利要求1的多肽，其中(d)中的多肽选自SEQ ID NO：5的氨基酸439-607(C-169)、SEQ ID NO：5的氨基酸457-607(C-151)、SEQ IDNO：5的氨基酸527-541和SEQ ID NO：5的氨基酸586-600。
6 具有SEQ ID NO：5之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
7 具有SEQ ID NO：20之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
8 具有SEQ ID NO：22之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
9 具有SEQ ID NO：26之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
10 具有SEQ ID NO：7之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
11 具有SEQ ID NO：8之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
12 具有SEQ ID NO：9之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
13 具有SEQ ID NO：10之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
14 具有SEQ ID NO：11之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
15 具有SEQ ID NO：12之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
16 具有SEQ ID NO：13之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
17 具有SEQ ID NO：14之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
18 具有SEQ ID NO：15之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
19 具有SEQ ID NO：16之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
20 具有SEQ ID NO：17之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
21 具有SEQ ID NO：18之氨基酸序列的多肽，其类似物、同系物和衍生物。
22 权利要求1到21和100-101的任一多肽，其中所述多肽引发链球菌菌株特异性的免疫反应。
23 选自下列的多肽：
(a)具有SEQ ID NO：5之氨基酸序列的HSP72多肽；
(b)与用肺炎链球菌细胞感染哺乳动物宿主产生的抗体有免疫反应性的多肽，所述抗体与(a)中的多肽有免疫反应性；
(c)能够引发抗体的多肽，所述抗体(a)中的HSP72多肽有免疫反应性；
(d)与抗体有免疫反应性的多肽，所述抗体是用(a)中的HSP72多肽免疫接种而引发的；
(e)前述多肽的任何片段，或者单独或者与其他多肽组合以形成融合蛋白。
24 权利要求23的多肽，其中(b)中的多肽选自链球菌属和肠球菌属的多肽。
25 权利要求23的多肽，其中(b)中的多肽选自化脓链球菌、变异链球菌、血链球菌和粪肠球菌。
26 权利要求23的多肽，其中(e)中的多肽选自SEQ ID NO：5的氨基酸439-607(C-169)、SEQ ID NO：5的氨基酸527-541和SEQ ID NO：5的氨基酸586-600。
27 权利要求23的多肽，其中(e)的融合蛋白是具有SEQ ID NO：3之氨基酸序列的岩藻糖异构酶HSP72(C-169)蛋白质。
28 选自下列的DNA序列：
(a)SEQ ID NO：4的HSP72 DNA序列；
(b)SEQ ID NO：19的HSP70(DnaK)DNA序列；
(c)SEQ ID NO：21的HSP70(DnaK)DNA序列；
(d)编码与因肺炎链球菌细胞感染哺乳动物宿主而产生的抗体发生免疫反应之多肽的DNA序列，所述抗体与HSP72多肽(SEQ ID NO：5)有免疫反应；
(e)编码能够引发抗体之多肽的DNA序列，所述抗体与HSP72多肽(SEQ ID NO：5)发生免疫反应；
(f)编码与抗体有免疫反应之多肽的DNA序列，所述抗体是通过用HSP72多肽(SEQ ID NO：5)免疫而引发的；
(g)与前述DNA序列有简并性的DNA序列；和
(h)前述任何DNA序列的片段，或者单独或者与其他DNA序列组合形成融合DNA序列。
29 权利要求28的DNA序列，其中(d)中的DNA序列选自链球菌和肠球菌属的DNA序列。
30 权利要求28的DNA序列，其中(d)中的DNA序列选自肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、变异链球菌、血链球菌和粪肠球菌的DNA序列。
31 权利要求28的DNA序列，其中(d)中的DNA序列选自肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓链球菌的DNA序列。
32 来自SEQ ID NO：4中核苷酸682到核苷酸2502的DNA序列或其衍生物，编码HSP72。
33 来自SEQ ID NO：4中核苷酸1996到核苷酸2502的DNA序列或其衍生物，编码HSP72的C-169片段。
34 来自SEQ ID NO：4中核苷酸2050到核苷酸2502的DNA序列或其衍生物，编码HSP72的C-151片段。
35 来自SEQ ID NO：4中核苷酸2260到核苷酸2304的DNA序列或其衍生物。
36 来自SEQ ID NO：4中核苷酸2437到核苷酸2481的DNA序列或其衍生物。
37 来自SEQ ID NO：19中核苷酸204到核苷酸2027的DNA序列或其衍生物，编码无乳链球菌的HSP70。
38 来自SEQ ID NO：21中核苷酸248到核苷酸2074的DNA序列或其衍生物，编码化脓链球菌的HSP70。
39 来自SEQ ID NO：25中核苷酸4到核苷酸456的DNA序列或其衍生物，编码HSP72的C末端151-残基片段(C-151)。
40 编码权利要求1-21和100-101任一多肽的DNA序列。
41 选自下列的DNA序列：
(a)SEQ ID NO：4的HSP72 DNA序列；
(b)编码与因肺炎链球菌细胞感染哺乳动物宿主而产生的抗体发生免疫反应之多肽的DNA序列，所述抗体与HSP72多肽(SEQ ID NO：5)有免疫反应；
(c)编码能够引发抗体之多肽的DNA序列，所述抗体与HSP72多肽(SEQ ID NO：5)发生免疫反应；
(d)编码与抗体有免疫反应之多肽的DNA序列，所述抗体是通过用HSP72多肽(SEQ ID NO：5)免疫而产生的；
(e)与前述DNA序列有简并性的DNA序列；和
(f)前述任何DNA序列的片段，或者单独或者与其他DNA序列组合形成融合DNA序列。
42 权利要求41的DNA序列，其中(b)中的DNA序列选自链球菌和肠球菌属的DNA序列。
43 权利要求41的DNA序列，其中(b)中的DNA序列选自肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、变异链球菌、血链球菌和粪肠球菌的DNA序列。
44 权利要求41的DNA序列，其中(f)中的片段选自SEQ ID NO：4的核苷酸1996-2502(氨基酸439-607)(C-169)；SEQ ID NO：4的核苷酸2260-2304(氨基酸527-541)；SEQ ID NO：4的核苷酸2437-2481(氨基酸586-600).
45 权利要求41的DNA序列，其中(f)中的融合DNA序列是岩藻糖异构酶-SEQ ID NO：1的HSP72(C-169)DNA序列(核苷酸771-2912)。
46 包含与启动子可操作地相连的权利要求41中至少一个DNA序列的表达载体。
47 含有权利要求28到40任一DNA序列，和与所述DNA序列可操纵相连的一个或多个控制序列的重组DNA分子。
48 权利要求47的重组DNA分子，其中所述表达控制序列是可诱导表达载体。
49 权利要求48的重组DNA分子，其中所述表达载体含有λPL启动子。
50 权利要求47的重组分子由选自下列的质粒构成：pURV3、pURV4、pURV5、pURV6、pJBD291、pJBDΔ4、pJBDk51、pJBD177、pJBD171、pJBD177、pJBD179、pJBDΔ1、pJBDf51和pJBDf62。
51 用权利要求46的表达载体转化的单细胞宿主。
52 用权利要求47的表达载体转化的单细胞宿主。
53 根据权利要求52的单细胞宿主，其中所述宿主选自大肠杆菌XLIBlue MRF’、W3110、JM109、Y1090和BL21(DE3)菌株。
54 生产多肽或其片段的方法，包括培养权利要求51的单细胞宿主并分离所述多肽或片段。
55 与权利要求23的多肽特异性结合的抗体或其片段。
56 与由单克隆抗体F1-Pn3.1识别之表位特异性结合的抗体或其片段。
57 权利要求55的抗体或片段，是单克隆抗体。
58 权利要求57的单克隆抗体或片段，是鼠源的。
59 权利要求58的单克隆抗体或片段鼠是IgG型。
60 权利要求59的单克隆抗体，选自F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。
61 单克隆抗体F1-Pn3.1。
62 分离权利要求55的抗体的方法，包括：
(a)将权利要求23的多肽制备物导入到哺乳动物中；和
(b)从含所述抗体的哺乳动物中分离血清。
63 分离权利要求57的单克隆抗体的方法，包括：
(a)将权利要求23的多肽制备物导入到哺乳动物的抗体生产细胞中；和
(b)将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；和
(c)从杂交瘤细胞中分离所述单克隆抗体。
64 含有权利要求23之多肽的药物组合物。
65 权利要求64的药物组合物，它是疫苗。
66 权利要求64的药物组合物，它还含有一种或多种可药用赋形剂。
67 预防肺炎链球菌或相关细菌感染患者的方法，包括施用药物有效量的权利要求65的疫苗。
68 含有权利要求55之一种或多种抗体或其片段的药物组合物。
69 权利要求68的药物组合物，它是疫苗。
70 权利要求69的药物组合物，它还含有可药用赋形剂。
71 权利要求69的药物组合物，其中所述抗体选自F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。
72 权利要求69的药物组合物，其中所述抗体是F1-Pn3.1。
73 治疗感染有或怀疑感染有肺炎链球菌或相关细菌的病人方法，包括施用药物有效量的权利要求69的疫苗。
74 检测生物样品中的肺炎链球菌或相关细菌的方法，包括：
(a)从患者中分离生物样品；
(b)将权利要求55的抗体或片段与生物样品一起保温以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的抗体或片段，以表明是否存在肺炎链球菌或相关细菌。
75 权利要求74的方法，其中所述抗体选自F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。
76 权利要求74的药物组合物，其中所述抗体是F1-Pn3.1。
77 检测生物样品中的肺炎链球菌或相关细菌特异性抗体的方法，包括：
(a)从患者中分离生物样品；
(b)将权利要求23的多肽与生物样品一起保温以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的多肽，以表明是否存在肺炎链球菌或相关细菌特异性抗体。
78 检测生物样品中的肺炎链球菌或相关细菌的方法，包括：
(a)从患者中分离生物样品；
(b)将具有权利要求41之DNA序列的DNA探针与生物样品一起保温以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的DNA探针，以表明是否存在肺炎链球菌或相关细菌。
79 权利要求78的方法，其中所述DNA探针是一寡聚物，它具有与权利要求41之DNA序列中的至少约6个连续的核苷酸互补的序列。
80 权利要求79的方法，还包括：
(a)提供一组用作聚合酶链反应方法之引物并位于靶区侧翼的寡聚物；和
(b)经聚合酶链方法扩增靶区。
81 药物有效量的权利要求23的多肽用于预防人中肺炎链球菌或相关细菌感染的用途。
82 药物有效量的HSP72特异性抗体用于人的预防肺炎链球菌或相关细菌感染的用途。
83 生产多肽或其片段的方法，包括培养权利要求52或53的单细胞宿主并分离所述多肽或片段。
84 用权利要求83的方法得到的基本上纯的多肽。
85 与权利要求1或2的多肽特异性结合的抗体或片段。
86 分离权利要求86之抗体的方法，包括；
(a)将权利要求1或22的多肽制备物导入到哺乳动物中；和
(b)从含所述抗体的哺乳动物中分离血清。
87 含有权利要求1或22之多肽的药物组合物。
88 权利要求87的药物组合物，它是疫苗。
89 权利要求87的药物组合物，它还含有一种或多种可药用赋形剂。
90 预防患者被肺炎链球菌、化脓链球菌或无乳链球菌感染的方法，包括施用药物有效量的权利要求88的疫苗。
91 与权利要求1或22的多肽特异性结合的抗体或其片段。
92 检测生物样品中肺炎链球菌、化脓链球菌或无乳链球菌的方法，包括：
(a)从患者中分离生物样品；
(b)将权利要求91的抗体或片段与生物样品保温以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的抗体或片段，表明是否存在肺炎链球菌、化脓链球菌或无乳链球菌。
93 检测生物样品中的肺炎链球菌、化脓链球菌或无乳链球菌特异性抗体的方法，包括：
(a)从患者中分离生物样品；
(b)将权利要求1或22的多肽与生物样品一起保温以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的多肽，以表明是否存在肺炎链球菌或化脓链球菌或无乳链球菌特异性抗体。
94 检测生物样品中的肺炎链球菌或化脓链球菌或无乳链球菌的方法，包括：
(a)从患者中分离生物样品；
(b)将具有权利要求28之DNA序列的DNA探针与生物样品一起保温以形成混合物；和
(c)检测混合物中特异性结合的DNA探针，以表明是否存在肺炎链球菌或化脓链球菌或无乳链球菌。
95 权利要求94的方法，其中所述DNA探针是一寡聚物，含有与权利要求28之DNA序列的至少约6个连续核苷酸互补的序列。
96 权利要求95的方法，其中还包括：
(a)提供一组用作聚合酶链反应方法之引物并位于靶区侧翼的寡聚物；和
(b)经聚合酶链方法扩增靶区。
97 药物有效量的权利要求1或22的多肽用于预防人的肺炎链球菌或化脓链球菌或无乳链球菌感染的用途。
98 药物有效量的HSP72特异性抗体用于人的预防肺炎链球菌或化脓链球菌或无乳链球菌感染的用途。
99 药物有效量的权利要求2到21中任一多肽用于预防人的链球菌感染的方法。
100 具有SEQ ID NO：23之氨基酸序列的多肽、其类似物、同系物或衍生物。
101 具有SEQ ID NO：24之氨基酸序列的多肽、其类似物、同系物或衍生物。
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