CN1159441C

CN1159441C - 粘膜炎莫拉菌的uspa1和uspa2抗原

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Publication number: CN1159441C
Application number: CNB971808430A
Authority: CN
Inventors: E��J��ɭ; E·J·汉森; C·埃比; L·D·科普; I·马西夫; M·J·菲斯克; ��ǳ�; R·弗雷登伯奇
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; University of Texas System
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: JP2009142276A; US6310190B1; CA2274495C; US20050131221A1; US20050137131A1; KR20000057575A; CA2274495A1; AU746442B2; AU2011201228A1; US7576194B2; US7569683B2; US20030032772A1; EP0948625A2; DE69740108D1; JP2001515467A; AU5720198A; WO1998028333A2; ATE497004T1; EP0948625B1; BR9714160A

Abstract

本发明公开了两种新的蛋白UspA1和UspA2及其各自的基因uspA1和uspA2。每种蛋白包含了一个区域，该区域在两种蛋白间是保守的并且该区域包含了被MAb 17C7识别的表位。这二种蛋白的一个或多个可以聚集形成极高分子量形式(即大于200kDa)的UspA抗原。本发明还公开了用来治疗和研究粘膜炎莫拉菌的组合物和诊断及治疗方法。

Description

粘膜炎莫拉菌的USPA1和USPA2抗原

发明背景

I.发明领域

本发明总的涉及微生物领域和临床细菌学领域。更具体地，本发明涉及分别编码UspA1和UspA2蛋白的uspA1和uspA2基因的序列，这两者均编码了与单克隆抗体(MAb)17C7反应的表位，并提供了免疫诊断和免疫预防中有用的表位。

II.相关技术描述

以前认为粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(以前称为卡他布汉球菌(Branhamella catarrhalis)或粘膜炎萘瑟菌(Neisseria catarrhalis)是一种无害的上呼吸道腐生菌(Catlin，1990；Berk，1990)。然而，在前十年间，已经确定该生物是一种重要的人病原体。实际上，已经知道该革兰阴性双球菌是许多人感染的起因(Murhpy，1989)。现在知道粘膜炎莫拉菌是第三种最常见的急性和慢性中耳炎病因(Catlin，1990；Faden等，1990；1991；Marchant，1990)，根据1989年舆论报道，中耳炎是接受卫生保健的婴儿及儿童中最常见的疾病。该微生物也会引起急性上颌窦炎(一种播散性下呼吸道感染)(Murphy和Loeb，1989)，是正患慢性肺病患者体内支气管肺感染的重要病因，并且有时还是免疫受损患者体内全身性感染的病因(Melendez和Johnson，1990；Sarubbi等，1990；Schonheyder和Ejlertsen，1989；Wright和Wallace，1989)。

1989年舆论报道进一步作出结论，预防中耳炎是一项重要的卫生保健目标，因为该疾病发生在婴儿和儿童、以及所有年龄组的某些群体中。实际上，估计中耳炎的每年总财政负担至少为25亿美元。由于许多原因，疫苗被认为是预防该疾病最理想的方法。例如，据估计，如果疫苗能使中耳炎发病减少30％，则每年卫生保健将至少节省4亿美元。然而，尽管在三种常见中耳炎病原体中，2种病原体(肺炎链球菌和流感嗜血杆菌)的疫苗开发已经取得一些进展，但是在粘膜炎莫拉菌方面却没有迹象表明有类似的进展。这是特别麻烦的，因为现在粘膜炎莫拉菌导致了大约17-20％的中耳炎感染(Murphy，1989)。另外，粘膜炎莫拉菌也是儿童窦炎(van Cauwenberge等1993)和持续性咳嗽(Gottfarb和Brauner，1994)的明显病因。在成人中，它感染患诱因性疾病(如慢性阻塞性肺病(COPD)和其它慢性心肺疾病)的患者(Boyle等1991；Davies和Maesen，1988；Hager等1987)。

尽管已经认识到它的毒性潜力，但是对于粘膜炎莫拉菌产生疾病所用机制或控制对该病原体的免疫力的宿主因素却知之甚少。利用ELISA系统，采用粘膜炎莫拉菌全细胞作为抗原，急性期和恢复期血清或中耳体液作为抗体来源，已经记载了对粘膜炎莫拉菌中耳炎的抗体应答反应(Leinonen等1981)。成人中粘膜炎莫拉菌感染时的血清灭菌抗体发展显示依赖于经典的补体通路(Chapman等，1985)。最近已经报道了患粘膜炎莫拉菌中耳炎的青年儿童在中耳内产生抗体应答，但是不能以相同的方式产生全身性抗体应答(Faden等，1992)，

以前曾尝试过对作为人体抗感染免疫应答潜在重要靶标的粘膜炎莫拉菌抗原进行鉴定和性质分析(Murphy，1989；Goldblatt等，1990；Murphy等，1990)。一般来讲，粘膜炎莫拉菌的表面由外膜蛋白(OMP)、脂寡糖(LOS)和纤毛组成。粘膜炎莫拉菌看来与其它革兰阴性菌有一些不同，因为试图用洗涤剂组分细胞包膜来分离该生物的外膜通常因工艺结果不一致而不成功(Murphy，1989；Murphy和Loeb，1989)。而且，发现制备物被细胞质膜污染，这表明粘膜炎莫拉菌细胞包膜有不寻常的性质。

用产生的抗粘膜炎莫拉菌菌株035E外膜囊泡的多克隆抗血清来被动免疫接种，也发现能抵抗异源粘膜炎莫拉菌菌株TTA24的肺部攻击。另外，用粘膜炎莫拉菌外膜囊泡作主动免疫接种导致攻击后增强了对该生物从肺部的清除。免疫接种在肺清除中的明确效果表明，抗体在免疫保护抗该病原体中起主要作用。抵抗异源粘膜炎莫拉菌菌株肺侵袭的保护力证明，一个或多个保守的表面抗原是抗体的靶，抗体的作用是增强粘膜炎莫拉菌从肺部的清除。

外膜蛋白(OMP)构成了该非包囊菌的主要抗原决定簇(Bartos和Murphy，1988)，并且不同菌株都具有非常相似的OMP图谱(Bartos和Murphy，1988；Murphy和Bratos，1989)。至少三个表面外露的外膜抗原已经显示在粘膜炎莫拉菌菌株中是非常保守的；它们包括81kDa的CopB OMP(Helminen等，1993b)、可热修饰的CD OMP(Murphy等，1993)和高分子量UspA抗原(Heliminen等，1994)。这三个抗原中，CopB蛋白和UspA抗原已经显示能与在动物模型中具有抗粘膜炎莫拉菌生物活性的抗体结合(Helminen等，1994；Murphy等，1993)。

MAb17C7被描述成与UspA结合，它是与至少250kDa的表观分子量一起迁移出(在SDS-PAGE中)的极高分子量蛋白(Heliminen等，1994；Klingman和Murphy，1994)。当用于被动免疫研究时，MAb 17C7增强了小鼠肺对粘膜炎莫拉菌的清除，在菌落印迹放射性免疫试验分析中，MAb 17C7与受检粘膜炎莫拉菌的每个分离株结合。该Mab还与约100kDa的另一抗原条带反应(尽管强度较低)，如美国专利No.5,552,146所述(纳入本文作参考)。还确定了一种重组噬菌体，它含有粘膜炎莫拉菌染色体DNA的片段，能表达可与MAb 17C7结合的蛋白产物，其迁移速度与粘膜炎莫拉菌的天然UspA抗原相近或不可区分(Helminen等，1994)。

随着该病原体在呼吸道感染中的重要性与日增加，该细菌涉及毒力表达和免疫力的表面成分的鉴定就越显得越来越重要。目前为止还没有获得抗其它任何OMP、LOS或纤毛的可诱导抗粘膜炎莫拉菌保护性抗体的疫苗。因此，显然需要确定和鉴定可用来制备免疫预防剂的有用抗原。此外，一旦确定了该抗原，就需要提供能制备疫苗的方法和组合物，且提供量能使其广泛用于预防过程。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供新的UspA1和UspA2蛋白及其编码基因。本发明另一个目的是提供这些新蛋白的使用方法，例如用来制备治疗和抑制粘膜炎莫拉菌感染的制剂。还可考虑通过采用其它技术如抗体治疗和免疫预防来抑制或甚至预防粘膜炎莫拉菌感染。

为了满足这些目的，提供了UspA1和UspA2的表位核心序列，其可作为制备治疗性或预防性组合物或疫苗的基础，该组合物或疫苗包括可引起抗原性反应的7、10、20、30、40、50或者甚至60个氨基酸长度的肽以及药学上可接受的缓冲液或稀释剂。这些肽可以与载体、佐剂、另一种肽或其它分子结合，以保留或者甚至增强对粘膜炎莫拉菌的有效的抗原性反应。另外，这些肽本身可作为载体与引起对粘膜炎莫拉菌或其它病原体的抗原性的反应其它肽或分子结合。例如，UspA2可作为寡糖的载体。

在一个实例中，UspA1和UspA2的表位核心序列包括一个或多个分离的肽，该肽的氨基酸长度为7、10、20、30、40、50或者甚至60，含有氨基酸序列AQQQDQH(SEQ ID NO：17)。

在另一个实例中，提供了一种抗原组合物，它包含(a)7至60个氨基酸的分离的肽，该肽包含氨基酸序列AQQQDQH(SEQ ID NO：17)和(b)药学上可接受的缓冲液或稀释剂。在一个较佳的实施方案中，其中所述肽与第二抗原共价连接。该第二抗原是肽抗原，也可以是非肽抗原。

在另一个实例中，提供了分别编码UspA1和UspA2抗原的核酸uspA1和uspA2，以及粘膜炎莫拉菌分离株O35E、TTA24、TTA37和O46E的UspA1和UspA2抗原的氨基酸序列。预计uspA1和uspA2基因的核酸节段和片段以及UspA1和UspA2抗原在制备用来治疗、抑制或者甚至预防粘膜炎莫拉菌感染的治疗性或预防性组合物或疫苗的制备和应用中是非常有价值的。

在另一个实例中，提供了在哺乳动物中诱导免疫应答的的方法，该方法包括向哺乳动物提供抗原组合物的步骤，该抗原组合物包含含有确定的表位核心序列的约20-60个氨基酸的分离的肽以及药学上可接受的缓冲液或稀释剂。

在另一个实例中，提供了一种诊断粘膜炎莫拉菌感染的方法，该方法包括测定样品中对应于UspA1或UspA2抗原表位核心序列残基的粘膜炎莫拉菌氨基酸序列存在的步骤。该方法可包括用PCR^TM检测核苷酸序列，或与UspA1或UspA2抗原起免疫反应的抗体。

在另一个实例中，提供了一种治疗患粘膜炎莫拉菌感染的个体的方法，该方法包括向个体提供约20-60个氨基酸的分离的肽的步骤，该肽包含的氨基酸序列至少约10个连续残基与UspA 1或UspA2表位核心序列相同。

在还有一个实例中，提供了一种预防或限制粘膜炎莫拉菌感染的方法，该方法包括向患者提供一种抗体，该抗体与粘膜炎莫拉菌的UspA1或UspA2的鉴定的表位核心区域发生免疫反应。

在另一个实例中，提供了一种筛选能与抗体起反应的肽的方法，该抗体可免疫结合UspA1、UspA2或两者，该方法包括提供肽，使肽与抗体接触，然后测定抗体与肽的结合的步骤。该方法可包括免疫试验，如western印迹法、ELISA、RIA或免疫亲和分离。

在还有一个实例中，提供了一种筛选能诱导抗粘膜炎莫拉菌的保护性免疫应答的UspA1和UspA2肽的方法，该方法包括提供肽，将其以合适形式给予实验动物，用粘膜炎莫拉菌攻击动物，然后测定动物体内的粘膜炎莫拉菌感染。预计所用动物是用粘膜炎莫拉菌作肺攻击的小鼠，试验方法包括测定小鼠肺清除程度。

在另一例中，提供了一种分离的肽，该肽具有粘膜炎莫拉菌UspA1或UspA2蛋白的至少7个连续的氨基酸，其中所述肽包括位于所述UspA1蛋白(SEQ ID NO：1)的残基582-604、或所述UspA2蛋白(SEQ ID NO：3)的残基355-377。较佳的，所述肽可包含非UspA1或非UspA2的序列。更佳的，所述肽包含非粘膜炎莫拉菌的序列。

根据下列详述，本发明的其它目的、特征和优点将是显而易见的。然而，应当理解，这些详述和具体的实施例表明了本发明的较佳实例，它们只是用来进行描述，因为从这些详述中本领域技术人员明显可在本发明的宗旨和范围内作各种变化和改动。

附图简述

下列附图组成了本说明书的一部分，它们用于进一步描述本发明的某些方面。参照一幅或多幅此类附图，结合本文列举的具体实例的详细描述，就能更好地了解本发明。

图1。用uspA1基因的探针，对粘膜炎莫拉菌菌株的PvuII消化的染色体DNA进行Southern印迹分析。顶部为菌株名称；千碱基(kb)位置标记在左侧。

图2A。存在于野生型菌株O35E和同基因uspA1突变株的全细胞裂解液中的蛋白。这些蛋白通过SDS-PAGE分辨，用考马斯蓝染色。左侧泳道(WT)含有野生型菌株，右侧(MUT)含有突变株。箭头示出了大小约为120kDa的蛋白，其存在于野生型中，在突变株中没有。千碱基位置在左侧。

图2B。Western印迹分析野生型菌株O35E和同基因uspA1突变株的全细胞裂解液。这些蛋白通过SDS-PAGE分辨，在western印迹分析中用MAb 17C7作为探针。左侧泳道(WT)含有野生型菌株，右侧(MUT)含有突变株。千碱基位置在左侧。可以看出，两种菌株均具有与MAb 17C7反应的极高分子量的条带，而只有野生型菌株还有与该MAb结合的约120kDa的条带。

图2C。用MAb 17C7对从野生型菌株O35E(WT)和同基因uspA1突变株(MUT)的全细胞裂解液(WCL)和EDTA抽提的外膜囊泡(OMV)进行Western印迹分析。样品在SDS-PAGE前37℃加热15分钟(H)或100℃加热5分钟(B)。分子量位置标记(千道尔顿)显示在左侧。空心箭头示出了与MAb 17C7反应的极高分子量形式抗原的位置；实心箭头示出了约120kDa蛋白的位置；空心圆圈示出了约70-80kDa蛋白的位置。

图3。Southern印迹法分析野生型粘膜炎莫拉菌菌株O35E和同基因uspA1突变株的染色体DNA。染色体DNA用PvuII消化，并用uspA1基因的0.6kbBglII-PvuII片段探测。野生型菌株用此图顶部O35E显示，突变株用O35E-uspA1显示。千碱基位置标记在左侧。

图4。Western印迹分析粘膜炎莫拉菌菌株O35E外膜囊泡的蛋白(标记成O35E OMV)以及MF-4-1 GST融合蛋白(标记成GST融合蛋白)与MAb 17C7的反应性。

图5。在与uspA1突变株的染色体DNA一起用于PCR^TM扩增时，用T3和P10引物(中间泳道，0.9kb产物)以及T7和P9引物(右侧泳道，1.7kb产物)所获得的PCR^TM产物。kb梯在第一泳道中；该图左侧列出了几个kb位置标记。

图6A-6C。纯化蛋白的SDS-PAGE和western结果。图6A。纯化的UspA2的考马斯蓝染色凝胶(泳道2)。图6B。制得的纯化UspA1的考马斯蓝染色凝胶，泳道4为样品没有加热，泳道5为100℃加热3分钟，泳道6为100℃加热5分钟，泳道7为100℃加热10分钟。图6C。用17C7 MAb探测的纯化UspA2(泳道9)和纯化UspA1(泳道10)的Western结果。两种蛋白均加热10分钟。泳道1、3和8中的分子大小标记物用千道尔顿表示。

图7。ELISA测定纯化的UspA1和UspA2与HEp-2的相互反应。使培养在96孔板中的HEp-2细胞单层与连续稀释的UspA1或UspA2一起培育。O35E菌株用作阳性对照。将细菌稀释至悬液起始蛋白的A₅₅₀为1.0。如方法中所述的，用抗UspA1和UspA2的1：1混合抗血清检测结合的蛋白或附着的细菌。

图8。用斑点印迹测定与纤连蛋白和玻连蛋白的相互作用。结合的玻连蛋白用兔多克隆抗体检测，与纤连蛋白结合的蛋白用制备的抗UspA1和UspA2合并血清检测。

图9。正常人血清中抗蛋白UspA1、UspA2和粘膜炎莫拉菌O35E菌株的抗体水平。数据为ELISA测得的IgG(图9A-9C)和IgA(图9D-9F)抗体的转化终点滴度的log₁₀值。单个滴度根据年龄组用点表示，用实线将每一年龄组的几何平均数连接起来。2-18月龄的幼儿血清是一组10个儿童的连续样品。

图10。正常人血清中抗UspA1和UspA2的IgG抗体亚类的分布。图10A显示了对UspA1的滴度，图10B显示了对UspA2的滴度。

图11。抗UspA1(图11A)和UspA2(图11B)的血清IgG滴度与抗O35E菌株的灭菌滴度间的关系，用对数回归法测得(p＜0.05)。实线表示IgG滴度和灭菌滴度间的线性关系。虚线代表线性匹配的95％置信区间。

图12。显示UspA1和UspA2区域中与MAb 17C7结合的十肽10-24的相对位置的示意图。

图13。Western斑点印迹分析证实了十肽10-24与MAb 17C7的反应性。

图14。粘膜炎莫拉菌菌株O35E的uspA1(图14A)和uspA2(图14B)基因以及这些基因的突变型的部分限制性酶图谱。带阴影的方框表示每一基因的开放读框。示出了相关的限制性位点。PCR^TM引物位点(P1-P6)用箭头示出。通过PCR^TM从粘膜炎莫拉菌菌株O35E染色体DNA获得并克隆入pBluescript SK+中的含有部分uspA1和uspA2开放读框的DNA片段用黑色条表示。带点线连接这些DNA插入物和染色体中对应的限制性位点。空心条分别示出了卡那霉素或氯霉素盒的位置。uspA1或uspA2特异性的DAN探针用合适的交叉线条示出，它们通过PCR^TM分别用寡核苷酸引物对P3(5′-GACGC TCAAC AGCACT AATACG-3′)(SEQ ID NO：20)/p4(5′-CCAA GCTG ATATC ACTACC-3′)(SEQ ID NO：21)以及P5(5′-TCAATGCCTTT GATG GTC-3′)(SEQ ID NO：22)/P6(5′-TGTAT GCCGC TACTCGCAGCT-3′)(SEQ ID NO：23)从粘膜炎莫拉菌菌株O35E染色体DNA扩增获得。

图15。检测粘膜炎莫拉菌O35E野生型和突变株中的UspA1和UspA2蛋白。用SDS-PAGE分辨野生型(泳道1)、uspA1突变株O35E.1(泳道2)、uspA2突变株O35E.2(泳道2)、同基因uspA1 uspA2双重突变株O35E.12(泳道4)的EDTA抽提的外膜囊泡中存在的蛋白，用考马斯蓝染色(图15A)或转移到硝酸纤维素上在western印迹分析中用MAb 17C7探测，然后用放射性碘标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白探测。在图15A中，实心箭头示出了UspA抗原的极高分子量形式，它包含UspA1和UspA2。在图15B中，左侧括号示出了与MAb 17C7结合的极高分子量形式的UspA1和UspA2蛋白。空心箭头示出了120kDa推定单体形式的UspA1。实心箭头示出了85kDa推定单体形式的UspA2。分子量位置标记物(千道尔顿)显示在左侧。

图16。比较野生型和突变型粘膜炎莫拉菌的生长速度和程度。将粘膜炎莫拉菌O35E的野生型菌株O35E(实心方框)、uspA1突变株O35E.1(空心方框)、uspA2突变株O35E.2(实心圆圈)和uspA1 uspA2双重突变株O35E.12(空心圆圈)的过夜肉汤培养物以BHI肉汤稀释至密度为35Klett单位，然后使其37℃振动培育。生长后进行浊度测定。

图17。粘膜炎莫拉菌的野生型和突变型菌株对被正常人血清杀死的易感性。在10％(v/v)正常人血清(实心符号)或热灭活正常人血清(空心符号)的存在下，培育对数期BHI肉汤培养物中的野生型亲代菌株O35E(菱形)、uspA1突变株O35E.1(三角)、uspA2突变株O35E.2(圆圈)以及uspA1 uspA2双重突变株O35E.12(方块)的细胞。数据表示成每一时间点残留的初始接种物的百分数。

描述性实例详述

本发明涉及鉴定用于开发抗粘膜炎莫拉菌潜在疫苗的表位。早期的工作涉及确定UspA抗原的分子特征和鉴定被MAb 17C7识别的表位的性质。初步工作表明，MAb 17C7识别单一抗原表位，据信该表位由单个基因编码。然而，含有此表位的蛋白的分离却没有获得预计的结果。MAb 17C7识别单个表位，但是与该表位相关的蛋白性质提示存在两个(不是一个)分开的蛋白。进一步的仔细分析产生了令人惊奇的发现。MAb 17C7识别UspA抗原的一个表位，但是该表位存在于两个不同蛋白(UspA1和UspA2)中，这两个蛋白分别由两个不同的基因uspA1和uspA2编码，且相互之间相同率仅为43％。本发明提供了基因uspA1和uspA2的核苷酸序列，其各自的蛋白产物UspA1和UspA2，以及为MAb 17C7识别的共享表位。

另外，根据对蛋白包括的UspA1和UspA2蛋白序列的分析，本发明提供了对UspA蛋白的抗原结构的观察。对被MAb 17C7靶向的分子的表位区域进行性质鉴定，就能够开发出可用来保护抵抗粘膜炎莫拉菌感染(例如用来制备预防性试剂)的试剂。具体实例涉及相应于UspA1和UspA2蛋白的氨基酸和核酸，从其衍生的肽和抗原组分，以及诊断和治疗粘膜炎莫拉菌疾病的方法。

如上所述，粘膜炎莫拉菌感染对健康，尤其是年轻人的健康是一种严重的挑战。因此，非常需要开发出有助于治疗和诊断该疾病的组合物和方法。根据关于粘膜炎莫拉菌UspA抗原结构的新信息以及对两种新的不同的蛋白UspA1和UspA2的发现，本发明提供这些改进的组合物和方法。由于在被动免疫接种动物的肺清除模型中，MAb 17C7已经显示出能保护试验动物，因此UspA1和UspA2代表了很重要的抗原决定簇。

在第一个实例中，本发明提供了粘膜炎莫拉菌菌株O35E的UspA1和UspA2蛋白的鉴定结果。UspA1蛋白包含约831个氨基酸残基，预计质量为88271道尔顿(SEQ ID NO：1)。UspA2蛋白包含576个残基，预计质量约为62483道尔顿(SEQID NO：3)。UspA2并不是UspA1的截短或加工过的形式。

在第二个实例中，本发明鉴定了与MAb 17C7结合的特异性表位。在粘膜炎莫拉菌菌株O35E的UspA1蛋白(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基480-502和582-604以及UspA2蛋白(SEQ ID NO：3)的残基355-377之间发现了一个共同的肽序列，其称为“3Q”肽，其包括了似乎被MAb 17C7识别的区域。(注意氨基酸残基的编号根据SEQ ID NO：3中提供的菌株O35E)。预计该区域在病原体生物学中起着很重要的作用，根据该信息，就可以推导出在MAb 17C7抗体结合中关键的氨基酸残基。也可设想，根据该信息，就能设计出对MAb 17C7或其它抗体有较高或较低亲和力的表位区域。下面进一步描述本发明的实例。

在另一个较佳实例中，本发明提供了包含至少一个能编码粘膜炎莫拉菌UspA1或UspA2蛋白、多肽、结构域、肽或其融合蛋白的分离的基因、DNA节段或编码区的DNA节段、载体等。这里提供了至少一个能编码粘膜炎莫拉菌uspA1基因的分离的基因、DNA节段或编码区，该基因包含菌株O35E的约2493个碱基对(bp)(SEQ ID NO：2)、菌株O46E的约3381bp(SEQ ID NO：6)、菌株TTA24的约3538bp(SEQ ID NO：1 0)、或菌株TTA37的约3292bp(SEQ ID NO：14)。另外还提供了至少一个编码粘膜炎莫拉菌uspA2基因的分离的基因、DNA节段或编码区，该基因包含菌株O35E的约1728bp(SEQ ID NO：4)、菌株O46E的约3295bp(SEQ ID NO：8)、菌株TTA37的约2673bp(SEQ ID NO：12)或约4228bp(SEQID NO：16)。预计uspA1和uspA2基因可用来制备蛋白、抗体、潜在候选药物等的筛选试验以治疗或抑制或者甚至预防粘膜炎莫拉菌感染。

本发明还提供了UspA1和UspA2蛋白或肽作为可用来治疗、抑制或者甚至预防其它细菌、病毒或寄生虫感染的其它试剂的免疫原性载体的应用。预计UspA1和UspA2抗原或其部分可以通过接头、多接头或衍生化氨基酸来与一种或多种试剂偶合、键合、结合、偶联或化学连接，从而制得可用来治疗、抑制或者甚至防止粘膜炎莫拉菌和另一病原体感染的双特异性或多价组合物或疫苗。还可预计到，制备这些组合物所用的方法是本领域技术人员熟知的，例如与用来制备匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)偶联物的方法类似。

重要的是应注意，很容易实现诊断和预防用的筛选方法，如下所述。因此，(1)测试肽、突变型肽以及抗体相互反应性的能力以及(2)测定肽和抗体预防体内感染的能力为开发临床上重要的试剂提供强大的工具。

1.0 UspA蛋白、肽和多肽

本发明的一个实例包括了两种新的蛋白序列，UspA1和UspA2，以及被确定成MAb 17C7靶表位的肽序列AQQQDQH(SEQ ID NO：17)。另外，检查粘膜炎莫拉菌四种菌株的UspA1和UspA2蛋白的氨基酸序列，结果表明每个蛋白含有至少一个拷贝的与MAb 17C7结合的肽YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)，或在一种情况下，几乎相同的氨基酸序列为YDLAQQQDQH的肽(SEQ ID NO：19)。

肽YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)在菌株O35E的UspA1中出现两次，在残基486-495和588-597(SEQ ID NO：1)，菌株O35E的UspA2残基358-367(SEQ IDNO：3)上出现一次。它在菌株TTA24的UspA1中出现一次，在残基497-506(SEQID NO：9)中，而在TTA24的UspA2中出现两次，在残基225-234和413-422(SEQID NO：11)中。肽YDLAQQQDQH(SEQ ID NO：19)在菌株O46E的UspA1中出现一次，在残基448-457(SEQ ID NO：5)中，而在肽YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)在蛋白中出现一次，在残基649-658(SEQ ID NO：5)中。肽YELAQQQDQH(SEQ IDNO：18)在菌株O46E的UspA2中出现一次，在残基416-425(SEQ ID NO：7)中。肽YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)在菌株TTA37的UspA1中出现两次，在残基478-487和630-639(SEQ ID NO：13)中，而在菌株TTA37的UspA2中出现两次，在残基522-531和681-690(SEQ ID NO：15)中。

本发明还包括杂交的分子，该分子含有一个UspA蛋白(例如UspA1蛋白)的部分，其与另一UspA蛋白(在本例中是UspA2蛋白)的部分融合，或在筛选潜在疫苗或进一步鉴定UspA1和UspA2蛋白中与用于鉴定(如卡那霉素抗性)或其它目的的其它蛋白融合。例如，可将任一UspA1的残基1-350与任一UspA2的残基351-576融合。或者，融合可用单个UspA抗原中具有的三个、四个或者甚至五个肽区域的序列来产生。还可包含的是本文公开的UspA1和UspA2分子的片段，以及插入、缺失或替换突变型(其中分别是导入了非UspA序列、除去UspA序列、或UspA序列被非-UspA序列替换)。

根据本发明，将UspA1和UspA2蛋白断裂成片段有利于作进一步结构或功能分析，或用来产生试剂如UspA相关的多肽和UspA特异性抗体。这可通过用肽酶(如内切蛋白酶glu-C)(Boehringer，Indianapolis，IN)处理纯化的或未纯化的UspA1和/或UspA2来实现。用CNBr处理是另一种方法，用这种方法可从其各自天然蛋白来生产UspA 1和/或UspA2片段。还可用重组技术来生产UspA1或UspA2的特异性片段。

在编码本发明的UspA1或UspA2多肽结构中还可作更微小的改动和变化，并且仍可获得能编码具有天然UspA抗原性质的蛋白或肽的分子。下面是关于根据蛋白氨基酸变化产生等价物或者甚至改进的第二代分子的描述。根据下列密码子表，通过改变DNA序列的密码子，就可实现氨基酸的改变。

表1

氨基酸名称缩写密码子

丙氨酸 Ala A GCA GCC GCG GCU

半胱氨酸 Cyc C UGC UGU

天冬氨酸 Asp D GAC GAU

谷氨酸 Glu E GAA GAG

苯丙氨酸 Phe F UUC UUU

甘氨酸 Gly G GGA GGC GGG GGU

组氨酸 His H CAC CAU

异亮氨酸 Ile I AUA AUC AUU

赖氨酸 Lys K AAA AAG

亮氨酸 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

甲硫氨酸 Met M AUG

天冬酰胺 Asn N AAC AAU

脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU

谷氨酰胺 Gln Q CAA CAG

精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

丝氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

苏氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU

缬氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU

色氨酸 Trp W UGG

酪氨酸 Tyr Y UAC UAU

为了改变或提高蛋白抗原性或免疫原性活性，已知可将蛋白结构中的某些氨基酸取代成其它氨基酸(例如参见，Kyte和Doolittle，1982；Hopp，美国专利4,554,101，纳入本文作参考)。例如，通过替换氨基酸的取代，小的构型变化将使得多肽的活性或稳定性增加。另外，某些多肽中的氨基酸取代可用来提供与其它分子连接的残基以提供肽-分子偶联物，此种偶联物保留了起始肽足够的抗原性可用于其它目的。例如，可构建成与固体支持物结合的选定的UspA1或UspA2肽，其在诊断实例中是特别佳的。

Kyte和Doolittle(1982)已经总的讨论了氨基酸亲水性指数在赋予蛋白质相互作用生物功能中的重要性，其中发现，某些氨基酸可被具有类似亲水性指数或核心的其它氨基酸代替仍可保留相似的生物活性。如下表II所示，根据氨基酸的疏水性和电荷特征给予各氨基酸一个亲水性指数。据信氨基酸的相对亲水特性决定了所得蛋白的二级结构，从而确定了蛋白与底物分子的相互作用。导致产生抗原性等价的肽或蛋白的较佳取代通常涉及相互具有指数值在±2单位内的氨基酸，更佳在±1单位内，还要佳的在±0.5单位内。

表II

氨基酸亲水性指数(hydropathic index)

异亮氨酸 4.5

缬氨酸 4.2

亮氨酸 3.8

苯丙氨酸 2.8

半胱氨酸/胱氨酸 2.5

甲硫氨酸 1.9

丙氨酸 1.8

甘氨酸 -0.4

苏氨酸 -0.7

色氨酸 -0.9

丝氨酸 -0.8

酪氨酸 -1.3

脯氨酸 -1.6

组氨酸 -3.2

谷氨酸 -3.5

谷氨酰胺 -3.5

天冬氨酸 -3.5

天冬酰胺 -3.5

赖氨酸 -3.9

精氨酸 -4.5因此，例如，亲水性指数为+4.5的异亮氨酸最好用氨基酸如缬氨酸(+4.2)或亮氨酸(+3.8)来替换。或者，在上述值的另一端，赖氨酸(-3.9)最好被精氨酸(-4.5)取代，等等。

类似氨基酸的取代还可根据亲水性，特别当产生的生物学功能等价蛋白或肽打算用于免疫实例中时。美国专利4,554,101(纳入本文作参考)描述说，由其毗邻氨基酸亲水性控制的蛋白最大局部平均亲水性与免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质重要的生物学性能相关。

如美国专利4,554,101中详细指出的，每个氨基酸已经被给予一个亲水性数值。这些数值在下表III中有详细描述。

表III

氨基酸亲水性指数

精氨酸 +3.0

赖氨酸 +3.0

天冬氨酸 +3.0±1

谷氨酸 +3.0±1

丝氨酸 +0.3

天冬酰胺 +0.2

谷氨酰胺 +0.2

甘氨酸 0

苏氨酸 -0.4

丙氨酸 -0.5

组氨酸 -0.5

脯氨酸 -0.5±1

半胱氨酸 -1.0

甲硫氨酸 -1.3

缬氨酸 -1.5

亮氨酸 -1.8

异亮氨酸 -1.8

酪氨酸 -2.3

苯丙氨酸 -2.5

色氨酸 -3.4

应当理解，一个氨基酸可被具有相似亲水性数值的另一氨基酸取代，并且仍能获得生物学等价物，特别是免疫学上等价的蛋白。在该变化中，亲水性数值在±2内的氨基酸取代是较佳的，在±1内的是特别佳的，在±0.5内的是还要佳的。

因此，这些氨基酸取代通常是根据R基团取代基的相对类似性，例如在大小、亲电性、电荷等方面.总之，考虑到前述各种特性的较佳的取代是本领域技术人员已知的，其包括(例如)下列组合：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

此外，可考虑采用从这些多肽衍生获得的肽，包括从这些序列获得的至少约6个连续氨基酸的肽。另外，这些肽可包含约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个连续残基。例如，包含6个连续氨基酸残基的肽可包含UspA1或UspA2蛋白的1至6、2至7或3-8残基，依此类推。这些肽可用下式表示

x至(x+n)＝5′至3′第一和最后连续残基的位置其中x等于从1到UspA1或UspA2蛋白全长的任何一个数字，n等于肽的长度减去1。这样，对于UspA1，x＝1至831，对于UspA2，x＝1至576。当肽为10个残基长时(n＝10-1)，该式代表了每个抗原的可能的每个10聚体。例如，当x等于1时，肽将包含残基1至(1+[10-1])，即1至10。当x等于2时，肽将包含残基2至(2+[10-2])，即2至11，依此类推。

肽的合成很容易用常规合成技术如固相方法来实现(例如，通过采用商业上可获得的肽合成仪如Applied Biosystem Model 430A肽合成仪)。然后，用这种方式合成的肽可按预先确定的量等份并以常规方式保藏，如以水溶液，或更佳的以粉末或冻干状态保藏待用。

通常，由于肽的相对稳定性，如果需要，它们很容易在水溶液中保藏相当长的时间，例如长达6个月或更多，可保藏在几乎所有水溶液中而不会有显著的降解或抗原活性损失。然而，如果需要延长在水中保藏期，则通常需要加入试剂，包括缓冲液如Tris或磷酸盐缓冲液，以维持pH为7.0至7.5。另外，可能希望加入抑制微生物生长的试剂，如叠氮钠或硫柳汞。为了在水性状态下延长保藏期，则希望将溶液保藏在4℃下，或更佳的进行冷冻。当然，当肽保藏在冻干或粉末状态下，它们基本上可无限期保藏，例如以计量等份保藏，在使用前可用预定量的水(较佳的为蒸馏水去离子水)或缓冲液重新水化。

特别感兴趣的肽是具有表位位于UspA抗原内的肽，其包括本发明的UspA1和UspA2蛋白。“表位”是分子中刺激T细胞或B细胞反应从而引起这些细胞免疫应答的区域。本文所用的术语“表位核心序列”是相对较短的一段氨基酸序列，它在结构上与抗体或T细胞受体上的结合位点“互补”因而可与它们结合。应当理解，在本公开的含义中，术语“互补”指相互间表现出吸引力的氨基酸或肽。因此，本发明的某些表位的核心序列在操作上可以根据它们与相应的UspA抗原竞争或代替相应的UspA抗原，和抗相应UspA的抗血清结合的能力来定义。

表位核心序列的鉴定是本领域技术人员已知的。例如，美国专利4,554,101指出了根据亲水性并通过Chou-Fasman分析来从氨基酸序列鉴定和制备表位。在预测蛋白抗原性部分时可采用各种计算机程序，其例如包括以Jameson-Wolf分析法(Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988)为基础的那些程序、PepPlot程序(Brutlag等，1990；Weinberger等，1985)以及预测蛋白三级结构的其它新程序(Fetrow和Bryant，1993)，这些方法可与计算机化的肽序列分析程序结合使用。

通常，认为多肽抗原的大小并不是特别关键的，只要其至少足够大得能携带鉴定的核心序列。本公开预期的最小的有用核心序列的长度大约为6个氨基酸。因此，该大小一般相当于根据本发明制得的最小的肽抗原。然而，在需要的时候，抗原的大小可以更大，只要其含有基本的表位核心序列。

2.0UspA1和UspA2核酸

除了多肽，本发明还包括分别编码典型粘膜炎莫拉菌菌株O35E、O46E。TTA24和TTA37的UspA1蛋白的核酸(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：14)以及UspA2蛋白的核酸(SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16)。由于基因密码的简并性，其它许多核酸也可编码给定的UspA1或UspA2蛋白。例如，有四种不同的三碱基密码子可编码丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和缬氨酸，而有六种不同的密码子编码精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。只有甲硫氨酸和色氨酸由一种密码子编码。表I提供了用于此实例中的氨基酸及其相应密码子的一览表。为了生产编码UspA1或UspA2的任何核酸，只需参看本文提供的密码子表即可。用任何编码相同氨基酸的密码子取代天然密码子将产生编码UspA1或UspA2的不同核酸。在实践方式上，这可通过定点诱变已经存在的uspA1或uspA2基因或从头化学合成一个或多个核酸来实现。

这些关于密码子选择、定点诱变和化学合成的研究同样适用于上述关于取代型突变株UspA1或UspA2肽的讨论。更具体地，通过核酸序列中定点变化改变给定多肽或表位的一个或多个密码子而产生的取代型突变株能提供更方便的方法来迅速生产大量突变株。本发明的核酸提供了一种简单的方法来生产UspA1、UspA2、UspA1-UspA2融合分子(上述)以及UspA1或UspA2与其它分子的融合物的片段(如截短物)。在uspA1或uspA2基因中使用限制性酶和核酶就能操纵这些基因的结构和所得的基因产物。

本公开提供的核酸序列信息还能用来制备能与选定uspA1或uspA2基因的基因序列特异性杂交的相对较短的DNA(或RNA)序列。在这方面，根据uspA1或uspA2基因的编码序列、或uspA1或uspA2基因附近的侧接区域(如粘膜炎莫拉菌染色体中的上游和下游区域)，可制得合适长度的核酸探针。这些核酸探针与uspA1或uspA2基因序列的特异性杂交的能力使得它们特别可用于各种实例。例如，探针可用于检测给定样品中病原性生物体存在的各种诊断试验。另外，这些寡核苷酸可以插入表达构建物的框架中，目的是筛选与已有抗体反应的相应的肽或制成诊断或治疗试剂用的相应肽。

为了提供本发明的某些优点，用于杂交研究或试验的较佳的核酸序列包括与序列中至少10-20个核苷酸互补的下列，但是预计30-60个核苷酸的序列也是有用的。长度至少为9个核苷酸的大小有助于确保片段足够长，能形成稳定而选择性的双链分子。但是具有长度超过10个碱基的互补序列的分子通常是较佳的，以提高杂交的稳定性和选择性，从而改进所得特异性杂交分子的质量和杂交程度。因此，通常最好是设计具有15至20个核苷酸的uspA1或uspA2基因互补序列的核酸分子，如果需要，甚至可以更长，例如30至60个核苷酸。这些片段可通过(例如)化学方法直接合成片段、采用核酸再生产技术如美国专利4,603,102的PCR^TM技术、或通过在重组生产用重组载体中导入选定序列来方便地制得。

适用的探针可从SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的序列任何一部分获得。因此，具体考虑采用的探针包括核苷酸1至9、或2至10、或3至11，依此类推至包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的核苷酸序列的最后9个核苷酸。因此，每个探针将包含SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的核苷酸序列中至少约9个线性核苷酸，其用式子“n至n+8”表示，其中n是从1或序列核苷酸数目的整数。也考虑采用在低度、中度、中高度和高度严谨条件下与uspA1或uspA2基因杂交的更长的探针，包括含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的全部核苷酸序列的那些探针。对于长度约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100及更多碱基的探针，可以重复这一假设。

.由于认为本发明的UspA抗原性表位是病原性莫拉菌属诸如O35E、O46E、TTA24和TTA37菌株的指征性表位，因此本发明的探针可以特别用作检测临床样品中的UspA1或UspA2 DNA的诊断性杂交试验的基础。因此，用于诊断感染的典型的临床样品是可包括莫拉菌核酸的任何样品，包括中耳体液、痰液、粘液、支气管肺泡液、羊膜水等。可结合于本发明杂交方面的各种杂交技术和系统是已知的，包括例如Falkow等在美国专利4,358,535中描述的诊断性试验。根据预想的应用，希望采用不同的杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高度选择性的应用，通常希望采用相当严谨的条件来形成杂交物，例如可以选择相对低盐和/或高温条件，例如在50-70℃下提供0.02-0.15M NaCl。这些条件是特别具选择性的，并且只能容忍很少的探针与模板或靶链间的错配(如果有的话)。

当然，对于某些应用，例如希望用突变型引物链与潜在模板杂交来制备突变体，则需要严谨度较低的杂交条件以形成异双链体。在这些环境中，希望采用条件例如是0.15M-0.9M的盐，温度在20-55℃间。在任何情况下，通常希望通过加入增加量的甲酰胺来使条件更严谨，甲酰胺的作用与提高温度相似，使杂交双链体不稳定。因此，很容易控制杂交条件，而方法的选择通常取决于所需的结果。

在某些实例中，希望用核酸探针从含有突变性克隆的克隆文库中分离出变体。在特定的实例中，用例如菌落印迹试验中所用的杂交条件和方法使仅仅含探针序列变体和具体菌落中所含核酸序列变体杂交，就可在双重滤膜上鉴定出生长在固体培养基上含有UspA1和/或UspA2序列变体的突变型克隆菌落。在这种方式下，含有uspA1或uspA2基因的短变体序列的小杂交探针可用来鉴定生长在固体培养基上含有全部uspA1或uspA2基因序列突变体的那些克隆。然后使这些克隆生长，以获得所需量的变体UspA1或UspA2核酸序列或相应的UspA抗原。

在临床诊断实例中，本发明的核酸序列与合适手段(例如用于测定杂交的标记物)联合使用。各种合适的指示物是本领域中已知的，包括放射性、酶或其它配体，例如能提供可检测信号的亲和素/生物素。在较佳的诊断实例中，可能希望采用酶，如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，来代替放射性或环境不希望的其它试剂。在酶标记物情况下，已可用显色指示底物提供肉眼或分光光度法可见的方法来鉴定与含病原体核酸的样品的特异性杂交。

通常，预计本文所述的杂交探针可用作溶液杂交中的试剂，还可用于采用固相的实例。在涉及固相的实例中，将测试的有疑问的临床样品如渗出液、体液中(如羊膜水、中耳渗出液、支气管肺泡灌洗液)测试DNA(或RNA)吸附或固定在选定的介质或表面上。然后在所需的条件下使固定的单链核酸与选定的探针特异性杂交。该选定的条件将取决于根据所需求的特别标准而定的特定情况(例如取决于G+C含量、靶核酸的类型、核酸来源、杂交探针的大小等)。在洗涤杂交表面除去非特异性结合的探针分子后，利用标记物检测有无特异性杂交或者甚至进行定量。

编码UspA1和/或UspA2表位的核酸序列或其变体可与pCR^TM方法结合来检测粘膜炎莫拉菌。总之，采用例如美国专利4,603,102中提出的PCR^TM方法，可用uspA1或uspA2序列的不同部分作为寡核苷酸探针来PCR^TM扩增样品中uspA1或uspA2核酸的指定部分。然后，uspA1或uspA2序列的扩增部分可通过与含互补序列的杂交探针杂交来检测。通过这种方式，就可用uspA1或uspA2序列来检测样品中浓度极低的粘膜炎莫拉菌核酸。

3.0生产UspA1和/或UspA2抗原的载体、宿主细胞和培养物

为了表达UspA1和/或UspA2多肽，需要在表达盒中提供uspA1和/或uspA2基因。表达盒含有在启动子转录控制下的编码UspA1和/或UspA2的核酸。“启动子”指被细胞的合成机制或导入的合成机制识别的、引发基因特异性转录所需的DNA序列。术语“在转录控制下”指启动子在相对于核酸的正确位置和方向上控制RNA聚合酶引发和基因表达。原核重组DNA构建中最常用的那些启动子包括B-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，1980；欧洲专利出版物No.0036776)。尽管这些是最常用的，但是其它微生物启动子也已经被发现和使用，关于其核苷酸序列的细节已经公开，使得技术人员能将其与质粒载体功能性连接(EPO申请出版物No.0036776)。下表IV提供了有用的启动子的其它例子。

表IV

启动子	文献
启动子	文献	免疫球蛋白重链	Hanerji等，1983；Gilles等，1983；Grosschedl和Baltimore，1985；Atchinson和Perry，1986，1987Imler等，1987；Weinberger等，1988；Kiledjian等，1988；Porton等，1990
免疫球蛋白轻链	Queen和Baltimore，1983；Picard和Schaffner，1984	免疫球蛋白重链
免疫球蛋白轻链	Queen和Baltimore，1983；Picard和Schaffner，1984	T-细胞受体	Luria等，1987，Winoto和Baltimore，1989；Redondo等，1990
HLA DQα和DQβ	Sullivan和Peterlin，1987	T-细胞受体	Luria等，1987，Winoto和Baltimore，1989；Redondo等，1990
HLA DQα和DQβ	Sullivan和Peterlin，1987	β-干扰素	Goodbourn等，1986；Fujita等，1987；Goodbourn和Maniatis，1985
白细胞介素-2	Greene等，1989	β-干扰素	Goodbourn等，1986；Fujita等，1987；Goodbourn和Maniatis，1985
白细胞介素-2	Greene等，1989	白细胞介素-2受体	Greene等，1989；Lin等，1990
MHC II类5	Koch等，1989	白细胞介素-2受体	Greene等，1989；Lin等，1990
MHC II类5	Koch等，1989	MHC II类HLA-DRα	sherman等，1989
β-肌动蛋白	Kawamoto等，1988；Ng等，1989	MHC II类HLA-DRα	sherman等，1989
β-肌动蛋白	Kawamoto等，1988；Ng等，1989	肌酸激酶	Jaynes等，1988；Horlich和Benfield，1989；Johnson等，1989a
前白蛋白(运甲状腺素蛋白)	Costa等，1988	肌酸激酶	Jaynes等，1988；Horlich和Benfield，1989；Johnson等，1989a
前白蛋白(运甲状腺素蛋白)	Costa等，1988	弹性蛋白酶I	Omitz等，1987
金属硫蛋白	Karin等，1987；Culotta和Hamre，1989	弹性蛋白酶I	Omitz等，1987
金属硫蛋白	Karin等，1987；Culotta和Hamre，1989	胶原酶	Pinkert等，1987；Angel等，1987
白蛋白基因	Pinkert等，1987，Tronche等，1989，1990	胶原酶	Pinkert等，1987；Angel等，1987
白蛋白基因	Pinkert等，1987，Tronche等，1989，1990	α-胎儿蛋白	Godbout等，1988；Campere和Tilghman，1989
τ-珠蛋白	Bodine和Ley，1987；Perez-Stable和Constantini，1990	α-胎儿蛋白	Godbout等，1988；Campere和Tilghman，1989
τ-珠蛋白	Bodine和Ley，1987；Perez-Stable和Constantini，1990	β-珠蛋白	Trudel和Constantini，1987
e-fos	Cohen等，1987	β-珠蛋白	Trudel和Constantini，1987
e-fos	Cohen等，1987	C-HA-ras	Triesman，1986；Deschamps等，1985
胰岛素	Edlund等，1985	C-HA-ras	Triesman，1986；Deschamps等，1985

中性细胞粘着分子(NCAM)	Hirsch等，1990
中性细胞粘着分子(NCAM)	Hirsch等，1990	α1-抗胰蛋白酶	Latimer等，1990
H2B(TH2B)组蛋白	Hwang等，1990	α1-抗胰蛋白酶	Latimer等，1990
H2B(TH2B)组蛋白	Hwang等，1990	小鼠或I型胶原	Ripe等，1989
葡萄糖-调节的蛋白(GRP94和GRP78)	Chang等，1989	小鼠或I型胶原	Ripe等，1989
葡萄糖-调节的蛋白(GRP94和GRP78)	Chang等，1989	大鼠生长激素	Larsen等，1986
人血清淀粉状蛋白A(SAA)	Edbrooke等，1989	大鼠生长激素	Larsen等，1986
人血清淀粉状蛋白A(SAA)	Edbrooke等，1989	肌钙蛋白I(TNI)	Yutzey等，1989
血小板衍生生长因子	Pech等，1989	肌钙蛋白I(TNI)	Yutzey等，1989
血小板衍生生长因子	Pech等，1989	杜兴氏肌营养不良	Klamut等，1990
SV40	Banerji等，1981；Moreau等，1981；Sleigh和Lockett，1985；Firak和Subramanian，1986；Herr和Clarke，1986；Imbra和Karin，1986；Kadesch和Berg，1986；Wang和Calame，1986；Ondek等，1987；Kuhl等，1987 Schaffner等，1988	杜兴氏肌营养不良	Klamut等，1990
SV40		多瘤病毒	Swartzendruber和Lehman，1975；Vasseur等，1980；Katinka等，1980，1981；Tyndell等，1981；Dandolo等，1983；deVilliers等，1984；Hen等，1986；Satake等，1988；Campbell和Villarreal，1988
逆转录病毒	Kriegler和Botchan，1982，1983；Leveinson等，1982；Kriegler等，1983，1984a，b，1988；Bosze等，1986；Miksicek等，1986；Celander和Haseltine，1987；Thiesen等，1988；Celander等，1988；Chol等，1988；Reisman和Rotter，1989	多瘤病毒
逆转录病毒		乳头状瘤病毒	Campo等，1983；Lusky等，1983；Spandidos和Wilkie，1983；Spalholz等，1985；Lusky和Botchan，1986；Cripe等，1987；Gloss等，1987；Hirochika等，1987，Stephens和Hentschel，1987；Glue等，1988
乙型肝炎病毒	Bulla和Siddiqui，1986；Jameel和Siddiqui，1986，Shaul和Ben-Levy，1987；Spandau和Lee，1988；Vannice和Levinson，1988	乳头状瘤病毒

人免疫缺陷型病毒	Muesing等，1987；Hauber和Cullan，1988；Jakobovits等，1988；Feng和Holland，1988；Takebe等，1988；Rowen等，1988；Berkhout等，1989；Laspia等，1989；Sharp和Marchiniak，1989；Braddock等，1989
人免疫缺陷型病毒		巨细胞病毒	Weber等，1984；Boshart等，1985；Foecking和Hofstetter，1986
Gibbon猿白血病病毒	Holbrook等，1987；Quinn等，1989	巨细胞病毒	Weber等，1984；Boshart等，1985；Foecking和Hofstetter，1986

合适的表达盒可以通过标准的亚克隆技术插入商业上可获得的表达载体中。例如，大肠杆菌载体pUC或pBluescript^TM可根据本发明用来在体外生产重组UspA1和/或UspA2多肽。这些载体的操作是本领域中熟知的。通常，含有与宿主细胞相容动物衍生而得的复制子和控制序列的质粒可与这些宿主结合使用。载体通常携带一个复制位点以及能在转化细胞内提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常用pBR322(从大肠杆菌种类衍生而得的质粒(Bolivar等，1977))来转化。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，从而提供了易鉴定转化细胞的方法。pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体也必须含有、或经修饰而含有被微生物用来表达其自身蛋白的启动子。

此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可用作转化载体与这些宿主结合。例如，噬菌体λGEM^TM-11可用来制备用于转化宿主细胞(如大肠杆菌LE392)的重组噬菌体载体。

在一个实例中，用pGEX4T-2蛋白融合系统(Pharmacia LKB，Piscataway，NJ)将UspA抗原表达成融合蛋白，从而鉴定出UspA抗原包含UspA1和UspA2蛋白。融合蛋白表达系统的其它例子是谷胱苷肽S-转移酶系统(Pharmacia，Piscataway，NJ)、麦芽糖结合蛋白系统(NEB，Beverlsy，MA)、FLAG系统(IBI，New Haven，CT)以及6xHis系统(Qiagen，Chatsworth，CA)。这些融合系统中的一些产生了只携带少量附加氨基酸的重组蛋白，这些氨基酸不可能影响重组蛋白的功能性。例如，FLAG系统和6xHis系统均仅仅增加了一些短序列，已知两者的抗原性均很差，且对蛋白折叠成其天然构型没有不利影响。其它融合系统产生的蛋白需要将融合部分从所需蛋白中切除。在另一个实例中，融合蛋白通过含有蛋白酶特异性识别序列的肽序列来与重组蛋白连接。合适序列的例子是被烟草Etch病毒蛋白酶(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)或Xa因子(New England Biolabs，Beverley，MA)识别的那些序列。

大肠杆菌是较佳的原核宿主。例如，大肠杆菌RR1菌株是特别有用的。可采用的其它微生物菌株包括大肠杆菌菌株如大肠杆菌LE392、大肠杆菌B和大肠杆菌X 1776(ATTC No.31537)。前述菌株、以及大肠杆菌W3110(F-、λ-、原养型，ATCC No.273325)、杆菌如枯草芽胞杆菌、或其它肠杆菌如鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷菌以及各种假单胞杆菌属是适用的。当然，这些例子只是用来描述，而无限制性。使重组细菌细胞(例如大肠杆菌)在许多合适培养基的任何一种中(例如LB)生长，通过在培养基中加入IPTG或将培育切换到较高温度来诱导重组多肽表达。在使细菌进一步培育2至24小时后，离心收集细胞并洗去残余培养基。然后使细菌细胞裂解(例如通过在细胞匀浆器中破碎)，并离心从可溶性细胞组分中分离出稠密的包含体和细胞膜。该离心可在一定条件下进行，通过在缓冲液中加入糖(如蔗糖)并在选定速度下离心就可使稠密的包含体选择性地富集。

如在许多场合中那样，如果重组蛋白表达在包含体内，则它们可用几种溶液的任何一种中洗涤，以除去一些污染的宿主蛋白，然后在还原剂(如β-巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇))存在下溶解在含高浓度(如8M)尿素或离液剂(如盐酸胍)的溶液中。

在一些场合下，使多肽在适合蛋白经历重折叠过程形成更接近天然蛋白构型的条件下培育数小时是很有利的。这些条件通常包括低于500μg/ml的低蛋白浓度、低水平的还原剂、尿素浓度低于2M，经常还存在诸如还原和氧化的谷胱苷肽混合物等试剂(促使蛋白分子间的二硫键交换)。

重折叠过程可通过SDS-PAGE或对天然分子有特异性的抗体(可从接种了细菌中分离出的天然分子的动物中获得)来监控。在重折叠后，然后可通过在几种支持物(包括离子交换树脂、凝胶渗透树脂或各种亲和柱)任一种上进行层析来进一步纯化和分离重折叠混合物。

还有其它各种真核载体可供作合适的运载体，重组UspA蛋白可在其中产生。在本发明的不同实例中，表达构建物可包含病毒或从病毒基因组衍生的经工程改造的构建物。某些病毒通过受体介导的胞吞作用进入细胞、整合入宿主细胞基因组并稳定有效地表达病毒基因的能力使得它们成为具有吸引力的将外来基因转移入哺乳动物细胞的候选者(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。用作载体的第一个病毒是DNA病毒，包括乳多空病毒(猴病毒40(SV40)、牛乳头瘤病毒、和多瘤病毒)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)以及腺伴随病毒。逆转录病毒也是具有吸引力的基因转移载体(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986)，如同牛痘病毒(Ridgeway，1988)、腺伴随病毒(Ridgeway，1988)和单纯疱疹病毒(HSV)(Glorioso等，1995)。这些载体可用来(i)体外转化细胞系以表达感兴趣的蛋白，或(ii)体外或体内转化细胞以提供基因治疗方案中的治疗性多肽。

关于真核载体，本文所用的术语启动子指簇集在RNA聚合酶II起始位点周围的一组转录控制组件。关于启动子怎样组织的许多思路来自对几种病毒启动子的分析，其中包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的那些启动子。这些研究及最近增加的工作已经表明启动子由不连续的功能组件组成，每一模件包括约7-20bp的DNA，并含有转录激活剂或阻遏蛋白的一个或多个识别位点。

每一启动子中至少有一个组件的作用是确定RNA合成起始位点的位置。了解最多的例子是TATA框，但是在一些启动子中没有TATA框，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点的不连续元件本身有助于确定起始位置。

其它启动子元件调节转录引发的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp区域内，但是最近发现许多启动子在起始位点下游也含有功能性元件。启动子元件间的间距经常是灵活的，因此当元件相互对换或相对移动时，启动子功能被保留。在tk启动子中，启动子元件间的间距增加到50bp才开始下降。看来启动子的各个元件可协同或单独起作用以激活转录，这取决于何种启动子。

用来控制核酸表达的特定启动子并不认为是关键性的，只要它能在靶向的细胞中表达核酸即可。因此，当靶向人细胞时，最好使核酸密码区的位置毗邻能在人细胞中表达的启动子并在该启动子的控制下。通常来讲，这种启动子可包括人或病毒启动子。较佳的启动子包括从HSV衍生的那些启动子，包括α4启动子。另一较佳的实例是四环素控制的启动子。

在其它各实例中，可用人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子和Rous肉瘤病毒长末端重复序列来高水平表达转基因。也可考虑采用本领域中所熟知的其它病毒或哺乳动物细胞或噬菌体启动子来表达转基因，只要其表达水平满足给定目的。表IV列出了本发明中可用来调节转基因表达的几种启动子。该表并不意味着穷尽了涉及转基因表达启动的所有可能的元件，而只是起列举作用。

增强子最初作为增强转录的基因元件而被发现，它在同一DNA分子上距启动子较远的位置上。在原核生物转录调控的经典研究中，很少有能跨越长距离起作用的先例。以后的研究工作表明，有增强子活性的DNA区域的组成非常类似于启动子。即，它们由多个单独的元件组成，每个元件与一个或多个转录蛋白结合。

增强子和启动子之间的基本区别在于操作性。增强子区域必需以整体才能远距离刺激转录；而启动子区域或其组成元件不需如此。另一方面，启动子必需有一个或多个元件在特定位点处并按特定方向指导RNA合成的启动，而增强子则没有这些特征。启动子和增强子经常重叠和毗邻，通常看上去有非常相似的组件组成。表V列出了几种增强子，当然该列表并不意味着限制性，而是起列举作用。

表V

增强子	诱导物	参考文献
增强子	诱导物	参考文献	MT II	佛波酯(TPA)重金属	Palmiter等，1982；Haslinger和Karin，1985；Searle等，1985；Stuart等，1985；Imagawa等1987；Karin，1987；Angel等，1987b；McNeal等，1989
MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)	促糖皮质激素	Huang等，1981；Lee等，1981；Majors和Varmus，1983；Chandler等，1983；Lee等，1984；Fonta等，1985；Sakai等，1986	MT II	佛波酯(TPA)重金属
MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)	促糖皮质激素		β-干扰素	聚(rI)X聚(rc)	Tavernier等，1983
腺病毒5E2	Ela	Imperiale和Nevins，1984	β-干扰素	聚(rI)X聚(rc)	Tavernier等，1983
腺病毒5E2	Ela	Imperiale和Nevins，1984	胶原酶	佛波酯(TPA)	Angle等，1987a
溶基质素	佛波酯(TPA)	Angle等，1987b	胶原酶	佛波酯(TPA)	Angle等，1987a
溶基质素	佛波酯(TPA)	Angle等，1987b	SV40	佛波酯(TPA)	Angle等，1987b
鼠MX基因	干扰素，新城堡病病毒		SV40	佛波酯(TPA)	Angle等，1987b
鼠MX基因	干扰素，新城堡病病毒		GRP78基因	A23 187	Resendez等，1988
α-2-巨球蛋白	IL-6	Kunz等，1989	GRP78基因	A23 187	Resendez等，1988
α-2-巨球蛋白	IL-6	Kunz等，1989	波形蛋白	血清	Rittling等，1989
MHC I类基因H-2kb	干扰素	Blanar等，1989	波形蛋白	血清	Rittling等，1989
MHC I类基因H-2kb	干扰素	Blanar等，1989	HSP70	Ela，SV40大T抗原	Taylor等，1989；Taylor和Kingston，1990a，b
增殖蛋白	佛波酯-TPA	Mordacq和Linzer，1989	HSP70	Ela，SV40大T抗原	Taylor等，1989；Taylor和Kingston，1990a，b
增殖蛋白	佛波酯-TPA	Mordacq和Linzer，1989	肿中瘤坏死因子	FMA	Hensel等，1989
促甲状腺素α基因	甲状腺素	Chatterjee等，1989	肿中瘤坏死因子	FMA	Hensel等，1989

另外，还可用任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库(EPDB))来驱动转基因的表达。采用T3、T7或SP6胞质表达系统是另一种可行的实例。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合体的一部分或作为附加的基因表达构建物，则真核细胞能够支持某些细菌启动子的胞质转录。

也可采用包括真核微生物(如酵母培养)的宿主细胞。酿酒酵母菌或常见的面包酵母是真核微生物中最常用的，但是也可用其它许多菌株。例如，对于在酵母菌中的表达，常用质粒YRp7(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。该质粒已经含有trp1基因，该基因为不能在色氨酸中生长的突变型酵母菌株(例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977))提供了选择标记物。作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损害，其存在为检测在缺乏色氨酸时细菌生长而致的转化提供了有效的环境。

酵母载体中的合适的启动序列包括3′磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)的启动子，这些糖酵解酶例如是烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。在构建合适的表达质粒时，还将与这些基因有关的终止序列连到表达载体中希望表达序列的3′端，以提供mRNA的聚腺苷酸化和终止序列。具有其它优点(通过生长条件来控制转录)的其它启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及担负利用麦芽糖和半乳糖的酶的启动子区域。含有与酵母相容的启动子、复制起始区和终止序列的质粒是适用的。

除了真核生物外，从多细胞生物体衍生获得的细胞培养物也可用作宿主。理论上，任何此类细胞培养物，无论来自脊椎动物或非脊椎动物培育物，均可工作。然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，最近几年，在培养物中增殖脊椎动物细胞(组织培养)已经成为常规工艺(Tissue Culture，1973)。这些有用的宿主细胞系的例子是VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、W138、BHK、COS-7、293和MDCK细胞系。用于这些细胞的表达载体通常包括(如果需要)复制起始区、位于待表达基因前的启动子和必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。

4.0抗UspA蛋白的抗体的制备

利用众所周知的技术(如美国专利4,196,265中列举的技术)，很容易制得抗UspA1或UspA2肽或多肽的抗体。通常，该技术涉及用选定的免疫原成分(例如疫苗部分中讨论的纯化的或部分纯化的蛋白、合成的蛋白或其片段)来免疫接种合适的动物。待免疫接种的动物(例如)是猫、狗和马，但不局限此，还可以是能建立某种免疫应答的某些种类的动物。给予免疫接种成分以有效地刺激抗体产生的细胞。啮齿类动物如小鼠和大鼠是较佳的动物，然而，也可用家兔、羊或蛙细胞。采用大鼠可能会有某些优点，但是小鼠是较佳的，其中BALB/c小鼠是最佳的，它是最常用的动物，通常能提供较高比例的稳定融合。

为了产生单克隆抗体(MAb)，在免疫接种后，选择具有生产抗体潜力的体细胞，具体是B淋巴细胞(B细胞)，以用于MAb生产程序。这些细胞可从活检的脾脏、扁桃体或淋巴结、或周围血液样品获得。脾细胞和周围血细胞是较佳的，因为前者是处于分裂的浆母细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，而后者周围血液很容易获得。通常是对一组动物免疫接种，取出抗体滴度最高的动物的脾脏。用注射器将脾脏匀浆，获得脾淋巴细胞。免疫接种过的小鼠的脾脏通常含有约5×10⁷至2×10⁸的淋巴细胞。

然后，使免疫接种的动物的产生抗体的B细胞与无限增殖骨髓瘤细胞系(通常与免疫接种动物的种类相同)融合。适用于产生杂交瘤融合程序的骨髓瘤细胞系最好不产生抗体，融合效率较高，且有酶缺陷，使得它们不能在某些只支持所需融合细胞(称为杂交瘤)生长的选择性培养基中生长。

可采用许多骨髓瘤细胞中的任何一种，它们是本领域技术人员中已知的。例如，当免疫接种的动物是小鼠时，可采用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可采用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均可与人细胞融合结合。

一种较佳的小鼠骨髓瘤细胞系是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，它可从NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository通过要求细胞系保藏号GM3573获得。可采用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤SP2/0非生产型细胞系。

产生抗体产生性脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交物的方法通常包括在促进细胞膜融合的一种或数种试剂(化学或电)存在下，以2∶1的比例混合体细胞和骨髓瘤细胞，但是比例也可分别从约20∶1至约1∶1。Kohler & Milstein(1975；1976)已经描述了采用Sendai病毒的融合方法，Gefter等(1977)描述了采用聚乙二醇(PEG)(如37％(v/v)PEG)。采用电诱导的方法也是适用的。

融合步骤产生存活杂交细胞的频率通常较低，约1×10^-6至1×10^-8。然而，这并不成问题，因为通过在选择性培养基中培养可将存活的融合杂交细胞与亲代未融合细胞(特别是会继续正常无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)中区分开来。选择性培养基通常含有阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂。典型的较佳的试剂是氨基喋呤、氨甲喋呤和重氮丝氨酸。氨基喋呤和氨甲喋呤阻断了嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅仅阻断嘌呤的合成。当采用氨甲喋呤或氨甲喋呤时，在培养基中补充入次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸源(HAT培养基)。当采用重氮丝氨酸时，在培养基中补充加入次黄嘌呤。

较佳的选择培养基是HAT。只有能进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤在补救途径中缺少关键性酶，如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，它们不能存活。B细胞能进行该途径，但是它们在培养基中的生命期有限，通常会在大约两周内死亡。因此在选择性培养基中存活的细胞只有骨髓瘤和B细胞形成的杂交瘤细胞。

这一培育提供了一群杂交瘤，从中选出具体的杂交瘤。通常，杂交瘤的选择是：在微量滴定板中单克隆稀释，然后测试各个克隆的上清液(约2-3周后)是否具有所需反应性。该试验应当灵敏、简单而迅速，例如放射性免疫试验、酶免疫试验、细胞毒性试验、空斑试验、斑点免疫结合试验等。

然后系列稀释所选杂交瘤，并克隆成单个的抗体产生细胞系，然后就可使克隆无限增殖以提供单克隆抗体。细胞系可利用两种基本的方式来生产单克隆抗体。可将杂交瘤样品注射入用来提供体细胞和骨髓瘤细胞进行最初融合的组织相容性动物中，通常注射入腹膜腔内。注射过的动物产生的肿瘤分泌出由杂交融合细胞产生的特异性单克隆抗体。然后可抽出动物的体液(如血清或腹水)以提供高浓度的单克隆抗体。各个细胞系还可体外培育，单克隆抗体自然分泌到培养基，从而很容易从培养基中获得高浓度的单克隆抗体。如果需要，用任一方法产生的单克隆抗体可用过滤、离心和各种层析方法(如HPLC或亲和层析)进一步纯化。

本发明的单克隆抗体还包括用本领域熟知的方法产生的抗独特型(anti-idiotypic)抗体。本发明的单克隆抗体还可以是单克隆异偶联体，即两个或多个抗体分子的杂交抗体。在另一个实例中，本发明的单克隆抗体是嵌合的单克隆抗体。在一种方法中，通过克隆一重组DNA来工程改造嵌合的单克隆抗体，该重组DNA含有来自小鼠抗体生成细胞的启动子、引导序列和可变区以及来自人抗体基因的恒定区外显子。由这种重组基因编码的抗体是小鼠-人嵌合体。其抗体特异性由小鼠序列的可变区来决定。其同种型由来自人DNA的恒定区决定。

在另一个实例中，本发明的单克隆抗体是“人化的”单克隆抗体，它可用本领域熟知的方法来生产。即，将小鼠互补决定区(CDR)从小鼠Ig的重链和轻链可变区转移到人的可变区内，然后使读框区中的一些人残基以小鼠的对应残基代替。本发明的“人化的”单克隆抗体尤其适用于处理莫拉菌感染的体内诊断和治疗方法。

如上所述，本发明的单克隆抗体及其片段可用本领域熟知的体外和体内方法繁殖。体外繁殖可在合适的培养基(如Dulbecco改进的Eagle培养基或RPMI 1640培养基)中进行，还可任意的补加入哺乳动物血清(如胎牛血清)或微量元素以及维持生长的补充物，如饲养细胞(如正常小鼠腹膜渗出液细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞等)。体外生产提供了较纯的抗体制品，并允许放大规模来大量提供所需抗体。在组织培育条件下大规模培育杂交瘤的技术是本领域中已知的，其包括均相悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌罐反应器中，或固定或截留细胞培养。

本发明的单克隆抗体还可通过体内繁殖杂交瘤来大量获得。将细胞克隆注射入与亲代细胞组织相容的哺乳动物(例如同系小鼠)中，以使抗体生产性肿瘤生长。任选地，在注射细胞前给予动物一种烃类(具体说是油，如降植烷Pristane(四甲基十五烷))。

根据本发明，本发明的单克隆抗体的片段可如上所述从制得的单克隆抗体获得，其方法包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜酶)消化和/或用化学还原来断裂二硫键。另外，本发明包括的单克隆抗体片段可用自动化肽合成仪来合成，或用本领域熟知的方法来人工制得。

本发明的单克隆偶联物可用本领域熟知的方法制得，例如，在偶联剂(如戊二醛或高碘酸盐)存在下使上述制得的单克隆抗体与酶反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸盐反应，制得带荧光素标记的偶联物。类似地制得带金属螯合剂的偶联物。可与抗体偶联的其它物质包括放射性核素，如³H、¹²⁵I、¹³¹I、³²p、³⁵S、¹⁴C、⁵¹Cr、³⁶Cl、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹⁵²Eu和⁹⁹mTc以及可与抗体偶联的其它有用的标记物。本发明的放射性标记过单克隆抗体可根据本领域熟知的方法制得。例如，通过与碘化钠和碘化钾以及化学氧化剂(如次氯酸钠)或酶氧化剂(如乳过氧化物酶)接触，可使单克隆抗体碘化。本发明的单克隆抗体可通过配体交换方法或直接标记方法来标记锝⁹⁹m。交换方法例如是用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，然后将抗体施加到该柱上；直接标记方法例如是培育高锝酸盐、还原剂(如SNCl₂)、缓冲液(邻苯二甲酸钠-钾溶液)和抗体。

5.0肽和单克隆抗体在免疫试验中的用途

本发明认为，本发明的单克隆抗体可用于标准免疫化学方法，例如利用抗CopB表位特异性抗体的ELIgA、Western印迹方法和其它方法。虽然以ELISA为佳，但是显然，这类试验还包括RIA以及其它非酶联抗体结合试验或方法。此外，本发明认为，针对UspA特殊表位的特异性单克隆抗体具有其它用途。例如，它们在免疫吸附程序中的用途可用来纯化天然或重组的UspA蛋白或其变体。

本发明还认为，本发明所公开的UspA1和UspA2肽可以用作抗原来产生抗体，或用于免疫试验中检测抗UspA抗原反应性抗体。在此类实施方案的一种变化形式中，可以用免疫试验的方法对UspA1和UspA2突变蛋白进行筛选，选出抗UspA1或UspA2特异性抗体例如Mab 17C7。如此，可以进行多种表位的突变分析。然后利用这些分析的结果来确定其它哪些UspA1或UspA2表位可以被抗体识别，并用于制备潜在的莫拉菌疫苗。

免疫诊断试验包括以液体培养形式或在固相载体上(例如营养琼脂板)培养体液。典型的试验涉及：收集患者的体液样品，将样品置于最适于病原生长的条件下。然后就可以确定样品中是否存在病原微生物。可以进一步分析确定该微生物的溶血特性。

本发明所包括的免疫试验包括但不限于美国专利4,367,110(双单克隆抗体夹心试验)和美国专利4,452,901(Western印迹法)中所述的那些。其它试验包括体外和体内的标记配体的免疫沉淀法，和免疫细胞化学法。

免疫试验就其最直白的意义讲就是结合试验。较好的免疫试验是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射性免疫试验(RIA)。特别有用的还有采用组织切片的免疫组织化学检测。但是，显然，检测决不仅限于上述技术，还可用Western印迹、斑点印迹、FACS分析等。

在典型的ELISA中，本发明抗UspA抗体被固定在具有蛋白亲和性的选定表面上，例如聚苯乙烯微滴板的测试孔。然后，在测试孔中加入怀疑含有抗原的待测组合物，例如临床样品。在结合、并洗涤去除非特异性结合的免疫复合物后，就可以检测被结合的抗原。检测通常是通过加入另一种抗体来完成的，所述抗体对要求检测的抗原具有特异性并连接有可测标记。这类ELISA是一种简单的“夹心ELISA”。还可以先加入对所需检测抗原具有特异性的第二抗体，然后加入对第二抗体有结合亲和性的第三抗体来进行测定，所述第三抗体连接有可测标记。

在另一例ELISA中，怀疑含有UspA抗原的样品被固定在测试孔表面，然后与抗UspA抗体接触。在结合和适当洗涤后，检测结合的免疫复合物。如果第一个抗原特异性抗体连接有可测标记，就可以直接检测免疫复合物。同样，也可以用对第一抗原特异性抗体有结合亲和性的第二抗体来检测免疫复合物，所述第二抗体连接有可测标记。

其它方法包括用两步法来检测初代免疫复合物。如上所述，用对第一抗体具有结合亲和性的第二结合配体(例如抗体)来检测第二代免疫复合物。洗涤后，再在可有效形成免疫复合物(第三代免疫复合物)的条件下，使第二代免疫复合物与对第二抗体具有结合亲和性的第三抗体接触足够长的时间。第三配体或抗体连接有可测标记，可以令所形成的第三代免疫复合物被测得。以上系统可以根据需要进行信号放大。

也可以使用竞争ELISA，其中，待测样品与已知量的标记抗原或抗体竞争结合。在与包被测试孔孵育前或孵育过程中，将样品与已知的标记反应物混合来测定未知样品中反应物的量。(抗原或抗体也可以与固相载体连接，所述载体是微珠、短杆、薄膜或柱基质等形式，待分析样品则将与固定化的抗原或抗体反应)。样品中存在的反应物起反应从而减少了与测试孔结合的标记反应物的量，由此减弱了最终的信号。

不论采用何种方式，各种ELISA有一些共同的特征步骤，例如包被、孵育或结合、洗涤去除非特异性结合物、和检测结合的免疫复合物。后文将对此进行说明。

在用抗原或抗体包被测试板时，通常是将测试板孔与抗原或抗体溶液一起孵育过夜或一定的时间。然后，洗涤测试板孔以去除不完全吸附的物质。然后，在测试孔的剩余表面“包被”以非特异性蛋白，此蛋白对待测抗血清在抗原性上是中性的。这类蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、伴刀豆蛋白和奶粉溶液。此步包被封闭了固相表面上的非特异性吸附位点，由此减弱因抗血清与表面的非特异性结合引起的背景。

在抗原性物质与测试孔结合，用非反应性物质包被以减弱背景和洗涤去除未结合物质后，使固相化表面在一定条件下与待测的抗血清或临床或生物学提取物接触形成(抗原/抗体)免疫复合物。这类条件宜包括用BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲液(PBS)/吐温等稀释剂来稀释抗血清。加入的这些试剂还有助于减弱非特异性背景。然后，置入抗血清，宜在温度25℃至27℃下孵育2至4小时。孵育之后，洗涤接触过抗血清的表面去除非免疫复合的物质。洗涤过程宜包括用例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液之类溶液进行洗涤。

在待测样品与结合的抗原之间形成了特异性免疫复合物，并经洗涤后，可以用与第一抗体有特异性的第二抗体来测定有无所形成的免疫复合物甚至测定其含量。当然，如果待测样品通常是人体来源样品，第二抗体最好是对人IgG具有特异性的的抗体。为了提供检测手段，第二抗体宜含有与之偶联的酶，该酶在与合适的生色底物孵育后会显现出颜色。所以，例如，希望在有利于显现免疫复合物形成的条件下，将结合有抗血清的表面与脲酶或辣根过氧化物酶交联的抗人IgG一起接触孵育一段时间(例如，在室温下、在含有PBS的溶液(例如PBS-吐温)中孵育2小时)。

在与酶标记第二抗体一起孵育并洗涤去除未结合物质后，通过与生色底物一起孵育来测定标记的量，所述底物例如脲和溴甲酚紫，如果酶标记是过氧化物酶，则底物为2，2’-偶氮-二-(3-乙基-苯并噻唑林-6-磺酸)(ABTS)和H₂O₂。然后通过测定生色程度来定量，例如使用可见光光谱分光光度计。或者，可以是化学发光标记。有关这类标记的使用可参见美国专利5,310,687、5,238,808和5,221,605。

6.0 UspA肽和UspA特异性抗体的预防性用途

在本发明的另一实施例中，提供了主动和被动免疫预防的方法。首先讨论主动免疫预防，然后讨论被动免疫预防。必须注意的是，在论述主动免疫治疗时谈到的免疫组合物的配制关系到在实验动物体内产生抗体以进行被动免疫治疗或用于诊断。

6.1主动免疫治疗

根据本发明，前文所述的UspA1或UspA2多肽或UspA1或UspA2衍生肽可用于疫苗制剂，在体内产生保护性抗粘膜炎莫拉菌的抗体应答。保护性只是表示受治疗个体的免疫系统能够产生应答，所述应答可一定程度上减弱细菌感染造成的临床影响。这种减弱的程度从最大程度地减少细菌量，直至彻底避免感染。理想的是，受治疗患者不出现粘膜炎莫拉菌感染引起的严重临床病症。

通常，免疫预防涉及对高危患者给予疫苗组合物。在本发明实例中，疫苗组合物包含置于药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的UspA1和/或UspA2多肽或其免疫原性衍生物。如前所述，本领域熟练技术人员能够通过各种机制来鉴定正确的UspA1和UspA2抗原特征，这样做就开发了能够获得抗粘膜炎莫拉菌免疫应答的疫苗。

UspA1和UspA2的稳定性和免疫原性可能有所不同，所以，有必要将抗原与载体分子偶联。载体例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、BSA、人血清白蛋白、肌球白蛋白、β-半乳糖苷酶、青霉素酶、交叉反应性突变体197(CRM₁₉₇)和细菌类毒素例如白喉类毒素和破伤风类毒素。本领域熟练技术人员知道如何将肽与载体连接而不破坏肽的免疫原性。也考虑过使用诸如多-聚-DL-丙氨酰-聚-L-赖氨酸和聚-L-赖氨酸之类的合成载体。偶联一般通过抗原的氨基或羧基末端残基进行，这样，肽或多肽在偶联后具有相对“天然”构象的机会最大。

已认识到可将其它保护剂与UspA1或UspA2抗原偶联，使得UspA1或UspA2作为载体分子。例如，有些药物具有对其它病原微生物例如细菌、病毒或寄生虫等的保护作用，可将其与UspA1或UspA2偶联，由此产生多价疫苗或药物组合物，用来治疗或抑制粘膜炎莫拉菌感染和其它病原感染。尤其是，可考虑UspA1或UspA2蛋白或多肽，作为其它疫苗成份(例如，肺炎球菌、脑膜炎双球菌或嗜血杆菌流感病毒的多糖)的免疫原性载体，甚至可与这些成份共价偶联。

组合物中还可能需要加入各种不同物质作佐剂，已知它们刺激疫苗接种动物免疫系统的相应部分。适合本发明(包括实验动物)疫苗的佐剂包括但不限于：油性乳剂，例如Freund完全或非完全佐剂(不适用于家畜)、Marcol 52：Montanide888(Marcol是Esso的商品名，Montanide是SEPPIC的商品名，巴黎)、角鲨烷或角鲨烯、佐剂65(含花生油、一油酸二缩甘油酯和一硬脂酸铝)、MPL^TM(3-O-脱乙酰一磷酸酯A；RIBI ImmunoChen Research Inc.，Hamilton，Utah)、Stimulon^TM(QS-21；Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Wooster，MA)，无机凝胶，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙和明矾，表面活性剂，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基二十八烷基铵、N，N-二十八烷基-N，N’-二(2-羟乙基)-丙二胺、甲氧基十六烷基甘油和普卢兰尼克多元醇，聚阴离子例如吡喃、硫酸葡聚糖，聚丙烯酸和聚羧乙烯，肽和氨基酸例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、tuftsin和霉菌酸海藻糖酯。还可以使用含有糖的合成聚合物的制剂(Carbopol)、以药学上可接受的油运载体(例如一油酸二缩甘油酯)配的乳液(Acacel A)或含20％全氟碳的乳液(Flusosol-DA)。

含有肽序列作为活性成份的疫苗的制备是本领域众所周知的，例如，可参见美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792和4,578,770，以上均被本文纳为参考。通常，这些疫苗被制成可注射形式。还可以制备成固体形式，所述固体在注射前可溶于或悬浮于液体中成为溶液或悬浮液。经常将活性免疫成份与药学上可接受并与活性成份相容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的混合物。此外，疫苗可以视需要含有加强疫苗效果的少量辅助剂，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂。

此外，本发明的疫苗制剂可如下给予：掺入非毒性载体例如脂质体或其它微载体物质中，或与多糖、蛋白质或聚合物偶联，或与Quil-A混合，形成“iscoms”(免疫刺激复合物)后给予。这些复合物作为佐剂可以减弱抗原的毒性，延迟其被宿主清除的时间，并改善免疫应答。其它适用于本发明此实例的佐剂包括INF、IL-2、IL-4、IL-8、IL-12和其它免疫刺激性化合物。而且，包含免疫原与原核生物完整膜蛋白的偶联物，例如TraT(参见PCT/AU87/00107)可能提供某些优点。

这些疫苗常规经肠胃外给予，例如皮下或肌内注射。适合其它给药方式的制剂包括栓剂，在某些情况下为口服制剂。就栓剂而言，可以包含常规的粘合剂和载体，例如聚乙二醇或甘油三酯；这类栓剂可从含有0.5％至10％，(以1-2％为佳)活性成份的混合物来制备。口服制剂包括以下常用的赋形剂，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物的形式是乳液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉末，含有10-95％的活性成份，以25-70％为佳。

配制在疫苗中的肽可以是中性或盐形式的。药学上可接受的盐包括与盐酸或磷酸等无机酸，或乙酸、草酸、酒石酸、苯乙醇酸等有机酸形成的酸加成盐(与肽的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可以从无机碱和有机碱衍生获得，无机碱如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁有机碱如异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

疫苗的给药方式需与剂型相适合，而且用量需具有治疗效果和免疫原性。给药剂量取决于受治疗个体，例如个体免疫系统合成抗体的能力和需要达到的保护程度。活性成份的准确给药剂量由医生来判断决定。但是，合适的剂量范围约为每次接种数百微克活性成分。合适的初次给药和增强免疫注射的方案也是已知的，但通常在初次给药后再进行接种或其它给药。

使用方式可能有很大差异。疫苗给予的各种常规方法均适用。这其中包括口服(在药学上可接受的固体基质上或在药学上可接受的分散系中)，注射等肠胃外给药。疫苗的剂量取决于给药途径，并根据宿主的大小而不同。

很多时候，需要多次给予疫苗，通常不超过6次，更经常，不超过4次，最好是一次左右，通常至少3次。接种间隔一般为2至12周，更经常的是间隔3至5周。为了保持抗体在保护性水平，需要隔1至5年，一般隔三年进行定期加强免疫。可以在此免疫过程后测试针对上清液抗原的抗体。该试验可通过常规标记物(例如放射性核素、酶、荧光剂等)进行标记来进行。这些技术是众所周知的，有关这类试验的说明可参见多项专利，例如美国专利3,791,932；4,174,384和3,949,064。

6.2被动免疫

就本发明申请的目的而言，被动免疫的定义为将一生物体内产生的免疫应答效应物传递给另一个生物体。建立被动免疫的经典例子是将第一生物体产生的抗体传递给第二生物体，即免疫相容的动物。“免疫相容”指：抗体能够在新宿主动物体内发挥其至少部分免疫功能。最近，随着对细胞免疫功能更深入地理解，已经可能通过传递其它效应物例如某些类型淋巴细胞(包括细胞毒T细胞和辅助T细胞)、NK细胞等免疫效应细胞来达到被动免疫。本发明对以上两种方法都作了仔细考虑。

如前所述，在合适的动物体内，用标准接种方案产生抗体、抗血清和免疫效应细胞。给原动物接种本发明的至少一种微生物制剂或细菌产物或副产物，其中加或不加佐剂以产生免疫应答。可以用标准ILISA方法测定所产生的抗体水平来监测此免疫应答。

一旦产生了充分的免疫应答，可以通过常规手段收集免疫效应细胞，通常是抽血收集。可用例如蛋白A或蛋白G层析法从血液中纯化出抗体组份。在另一种较好的实施方案中，用标准技术制备了产生单克隆抗体的杂交瘤(Coligan等，1991)。然后由这些杂交瘤细胞制备单克隆抗体。如果原宿主的单克隆抗体与待治疗动物不相容，可以对杂交瘤细胞进行基因工程改造来修饰抗体，使得它能够被待治疗动物所耐受。就人而言，可以这种方式对小鼠抗体进行“人源化”。

将上述制备的抗体、抗血清或免疫效应细胞注入宿主以提供抗微生物感染的被动免疫。例如，利用药学制剂或兽医学制剂的标准方法，将至少一种抗体与至少一种药学上可接受或兽医学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合，最好是均匀混合，制备成抗体组合物。生产单剂型所需的抗体量随接种的微生物种类、待治疗的个体和给药的具体模式而不同。对于某具体个体给予的特定剂量取决于多种因素，其中包括该个体的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，给药时间，给药途径，排泄速度、药物组合情况和微生物感染的严重程度。

抗体组合物的给药可以通过静脉内、皮下、鼻内、口服、肌内、阴道、直肠、局部或其它何种所需途径。可能需要多次剂量，而且随临床环境、具体的微生物、患者的情况和所用的其它治疗而不同。

6.3DNA免疫HC

本发明涉及一种疫苗和生理上可接受的运载体。疫苗所含的核酸分子编码UspA1或UspA2蛋白或含有SEQ ID NO：17序列的肽，其中所述的UspA1、UspA2蛋白或肽保留有免疫原性，在掺入免疫原性组合物或疫苗中并给于脊椎动物时，它们可在该脊椎动物再次感染粘膜炎莫拉菌时提供保护作用，避免产生更重的疾病。这样的疫苗本文称为核酸疫苗或DNA疫苗，它可用于给脊椎动物作基因免疫接种。

本文用术语“基因免疫接种”指给脊椎动物(尤其是小鼠或人)接种抗病原(尤其是粘膜炎莫拉菌)的核酸疫苗，保护脊椎动物抵抗粘膜炎莫拉菌。“核酸疫苗”或“DNA疫苗”在此指一种核酸结构，它含有编码UspA1、UspA2或包括SEQID NO：17免疫原性表位的核酸分子。该核酸结构还可以包含转录启动元件、加强元件、拼接信号、终止信号和聚腺苷酸化信号，以及其它核酸序列。

可以用标准方法来生产核酸疫苗。例如，用已知方法，可将编码UspA1或UspA2的核酸(即DNA)插入表达载体构成核酸疫苗(参见Maniatis等，1989)。用标准方法给脊椎动物个体接种以核酸疫苗(即给予核酸疫苗)。给脊椎动物接种的方式可以是皮下、静脉内、腹膜内、皮内、肌内、局部、口服、直肠、经鼻、经颊、阴道、吸雾剂，或者植入储存有制剂剂量的储存器，其中含有常规无毒、生理学上可接受的运载体或媒质。或者，可以用一种特殊的加速仪器(“基因枪”)来给脊椎动物接种。给药形式(例如胶囊、片剂、溶液、乳液)一定程度上取决于给药途径。例如，可以使用粘膜给药、滴鼻液、吸入剂或栓剂。

核酸疫苗可以与任何合适的佐剂联用。这些佐剂以足量给予，即该量足以产生对核酸疫苗的加强免疫应答。佐剂的给予可以在接种核酸疫苗前(例如1天多前)；在接种的当前(例如24小时内)；或同时；或接种后(例如1天多后)。佐剂的给予还可以不只一次(例如，接种前一次，接种后再一次)。“联用”在此表示包括任意时间周期，包括以上特别说明的时间周期，和以上具体说明的时间周期的组合，在此期间，给予佐剂以产生对核酸疫苗的加强免疫应答(例如，针对核酸疫苗所编码抗原的抗体滴度的升高，或抗粘膜莫拉菌抗体滴度的升高)。佐剂和核酸疫苗可给于脊椎动物的几乎同一部位；例如，佐剂和核酸疫苗都给予脊椎动物小腿上作了标记的部位。

在一具体实施方案中，核酸结构与转染促进剂共给予。在一较好的实施方案中，转染促进剂是二辛基甘氨酰精氨(DOGS)(其实施例参见已出版的PCT申请号WO96/21356，本文将其纳为参考)。在另一实施方式中，转染促进剂是布比卡因(其实施例参见美国专利5,593,972，本文将其纳为参考)。

6.4测试疗效的动物模型

因为没有合适的动物模型，阻碍了评价粘膜炎莫拉菌表面抗原抗体的功能意义。该菌对动物相对缺乏毒性，使得鉴定合适的模型系统很困难(Doem，1986)。偿试用包括美国栗鼠在内的啮齿类动物来研究粘膜炎莫拉菌引起的中耳感染没有成功，同样是因为该菌不能在这些宿主的中耳内生长或存活(Doyle，1989)。

现已开发出了小鼠短期肺清除模型(Unhanand等，1992；Verghese等，1990)，它可用于评价粘膜炎莫拉菌与下呼吸道的相互作用，以及评价肺内病理变化。该模型可重复性地将细菌接种物递送到鼠肺的某定位外围区。细菌在肺内增殖，但是最终因以下机制而被清除：(i)局部原有的防御机制；(ii)炎性反应的发展，和/或(iii)特异性免疫应答的发展。利用该模型发现，血清IgG抗体可以在无炎性反应的情况下进入肺泡空间，并加强对非典型性(nontypable)流感嗜血杆菌的肺清除(McGehee等，1989)，该病原的宿主范围和疾病范围与粘膜炎莫拉菌的几乎相同。

7.0筛选试验

在进一步的实施方案中，本发明提供鉴定新的抑制粘膜炎莫拉菌化合物的方法，这些化合物可以称为“候选物”，该方法通过使用包含已确定免疫原性表位区一处或多处突变的肽来筛选免疫活性。我们认为，这种筛选技术可广泛用于鉴定任何抑制或甚至杀死粘膜炎莫拉菌的化合物，在较好的实施方案中，还可以提供候选疫苗化合物。

我们还认为，就这方面而言有用的化合物决不限于蛋白质类或肽基类化合物。实际上，困难，通过应用此筛选试验进行鉴定的最有用化合物性质上不是肽基类的，但却能够通过紧密结合或其它化学反应来抑制细菌蛋白质的转录。候选物可从合成的化学物质，或从诸如雨林或海洋样品等天然样品的文库中获得。

为了鉴定粘膜炎莫拉菌抑制剂，只需进行平行性或比较性对照免疫试验，鉴定出抑制粘膜炎莫拉菌表型的化合物。竞争性筛选免疫试验是本领域熟练技术人员所熟知的(例如，参见Sambrook等，1989)。

一旦鉴定到了候选物，就可以在候选物存在下测定候选物抑制粘膜炎莫拉菌的能力。通常需要衡量或测定不加候选物时粘膜炎莫拉菌的活性，并与加候选物后的活性相比较，由此评价候选物的相对抑制能力。

7.1诱变

通过对原来的DNA的特殊诱变进行定点诱变是一种有用的技术，可用于制备各个肽。或生物学功能相当的蛋白质或肽。结合前述考虑的一项或多项问题，该技术通过在此DNA内引入一处或多处核苷酸序列变化，进一步提供了制备和测试序列突变体的能力。通过使用特定的寡核苷酸序列(该序列编码具有所需突变的DNA序列以及足够数量的相邻核苷酸)，定点诱变技术提供了具有足够大小和序列复杂性的引物序列，这样的引物能够与有待跨接的缺失接头的两端形成稳定的双链体。通常，引物长约17至25核苷酸为佳，待改变序列的接头两端各有约5至10个残基。

一般说来，定点诱变技术是本领域所熟知的。正如所理解的，该技术一般使用以单链和双链两种形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括M13噬菌体。这类噬菌体载体是有商品出售，它们的使用通常是本领域所熟知的。双链质粒也常规用于定点诱变，这就删除了将感兴趣基因从噬菌体转移到质粒的步骤。

通常，定点诱变是如下进行的：首先获取一单链载体，或将双链载体的两条链熔解开来，所述单双链载体的序列中含有一段编码所需蛋白质的DNA序列。合成制备带有所需突变序列的核苷酸引物。使该引物与制备的单链DNA退火，并与DNA聚合酶例如大肠杆菌聚合酶IKlenow片段反应，由此完成带突变链的合成。这样就形成了一个异源双链体，其中一链编码原来的非突变序列，另一链带有所需的突变。然后，用这种异源双链载体转化合适的细胞例如大肠杆菌细胞，挑选出包含重组载体(带有突变序列)的集落。

采利用定点诱变来制备选定基因的序列变异体证明是产生潜在有用物质的方法之一，这不限定于此，因为还有其它方法来获得基因的序列变异体。例如，可以用诸如羟基胺之类的诱变剂来处理编码所需基因的重组载体，以获得序列变异体。

7.2第二代抑制剂

除了最初鉴定的抑制性化合物之外，本发明者还认为可以制造其它立体结构类似的化合物来模拟抑制剂结构中的关键部分。这样的化合物(可能包括肽抑制剂的肽模拟物)可以与最初的抑制剂相同的方式使用。

某些模拟蛋白质二级结构某些部分的模拟物是用以下原理设计的：蛋白质的肽骨架主要是使得氨基酸侧链的取向有利于分子间的反应。由此设计了使分子间反应与天然分子类似的肽模拟物。

此肽模拟概念的某些成功应用主要集中在已知具有高度抗原性的蛋白质内的β-转角模拟物。如本发明所述，可以利用计算机演算来预计多肽内部可能的β-转角结构。一旦确定了转角的组成氨基酸，就可以构建模拟物以使得氨基酸侧链的必要部分获得类似的空间取向。

通过本领域技术人员已知的建模技术和化学设计技术可以获得又一代结构相当物或模拟物。现在，计算机化学建模技术是众所周知的。在初步鉴定了抑制RNA延伸(但是不特异性或不具备足够的特异性来优先抑制沿人RNA延伸的病毒RNA延伸)的一个化合物之后，利用该技术可以设计然后合成特异性抑制病毒转录延伸的化合物。所有这些立体结构类似的构建物和第二代分子都应该理解为属于本发明范围内。

8.0粘膜炎莫拉菌感染的诊断

8.1扩增和PCR^TM

根据标准技术(Sambrook等，1989)从生物样品中含有的细胞内分离出用作扩增模板的核酸序列。这些核酸可以是基因组DNA或组成的或全细胞RNA。当使用RNA时，需要将RAN转化成cDNA。

在选择性杂交条件下，与UspA1或UspA2蛋白或其突变蛋白相应的核酸选择性杂交的引物对与分离的核酸接触。术语“引物”在此指包括任何能够使新生核酸以模板依赖性方式合成的核酸。典型的是，引物是长度为10至20碱基对的寡核苷酸，但是也可以使用更长序列。引物可以是单链或双链形式的，但是以单链形式为佳。

一旦杂交后，使核酸：引物复合物与一种或多种促进模板依赖性核酸合成的酶接触。进行多轮扩增(又称“循环”)，直至产生足量的扩增产物。

接着，检测扩增产物。在某些应用中，检测可以通过目测来进行。或者，检测可能涉及：通过化学发光剂，掺入放射性标记或荧光标记的放射性闪烁照相，甚至通过使用电或热脉冲信号的系统(Affymax technology)来间接鉴定产物。

有多种模板依赖性方法可用于扩增给定模板样品中的标志序列。最有名的扩增方法是聚合酶链反应(又称“PCR^TM”)，详述参见美国专利4,683,195，4,683,202和4,800,159，以上均被本文纳为参考。

简而言之，在PCR^TM中，制备两段引物，它们分别与标志序列相对两互补链上的区域互补。在反应混合物中加入DNA聚合物例如Taq聚合酶，并同时加入过量的三磷酸脱氧核苷酸。如果样品中有标志序列，引物就会与标记结合，聚合酶就会通过添加核苷酸引起引物沿标志序列的延伸。通过升高或降低反应混合物的温度，延伸后的引物会从标志序列上解离，形成反应产物，过量的引物将与标志序列和反应产物结合，并重复以上过程。

为了确定扩增mRNA的数量或从所需的mRNA制备cDNA，可以进行逆转录酶PCR^TM(RT-PCR^TM)扩增程序。将RNA逆转录成cDNA的方法是众所周知的，描述可参见Sambrook等，1989。其它逆转录方法使用热稳定性RNA依赖性DNA聚合酶。这些方法的描述可参见1990年12月21日申请的WO90/07641，本文将其纳为参考。聚合酶链反应在本领域是众所周知的。

另一种扩增方法是连接酶链反应(“LCR”)，公开在纳为本文参考的EPA320308中。在LCR中，制备两对互补探针，在靶序列存在下，各对探针将结合靶序列的与之相对的互补链，使得它们彼此靠紧。在连接酶存在下，两对探针连接成一个单元。通过PCR^TM中的温度循环，结合着的连接后单元从靶序列上解离，作为“靶序列”用于过量探针对的连接。美国专利4,883,750说明了一种类似于LCR的方法，用于将探针对与靶序列结合。

作为本发明的另一种扩增方法，还可以使用PCT申请PCT/US87/00880(纳入本文作参考)中所述的Qβ复制酶。在该方法中，在RNA聚合酶存在下，在样品中加入含有与靶序列区域互补区域的复制性RNA序列。聚合酶将复制可在以后被检测的复制序列。

等温扩增法也可以用来扩增本发明的核酸，在该方法中使用限制性核酸内切酶和连接酶来扩增在一条链上含有限制性位点5’-[α-硫]-三磷酸核苷酸的靶分子。

链置换扩增(SDA)是进行核酸等温扩增的另一方法，它涉及多轮链置换和合成，即切口平移。另一种类似的方法称为修复链反应(RCR)涉及在扩增靶区域退火结合多个探针，然后进行四种碱基中只有两种的修复反应。为了便于检测，其它两种碱基可作为生物素酰化衍生物加入。类似的方法被用于SDA。还可以用循环探针反应(CPR)来检测靶特异性序列。在CPR中，将中段序列为特异性RNA而3’端和5’端是非特异性DNA序列的探针与样品中的DNA杂交。杂交后，用RNase H处理反应物，经鉴定是特有产物的探针产物经消化后被释放。原模板与其它循环探针退火结合，并重复此反应。

根据本发明还可以使用本文纳为参考的英国申请2,202,328和PCT申请PCT/US89/01025中所述的另一种扩增方法。在前一申请中，在类似PCR^TM、模板和酶依赖性合成方法中使用“修饰”引物。引物可以用捕捉部分(例如生物素)和/或检测剂部分(例如酶)进行标记来修饰。在后一申请中，在样品中加入过量的标记探针。在靶序列存在下，探针结合并被催化反应剪切。剪切后，靶序列被完好地释放，与过量的探针结合。标记探针的剪切即存在着靶序列的信号。

其它核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，其中又包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR，Gingeras等，PCT申请WO88/10315，本文将其纳为参考。在NASBA中，可以制备核酸如下进行扩增：利用标准的苯酚/氯仿萃取，临床样品热变性，用裂解缓冲液处理，分离DNA和RNA的微旋转柱层析或氯化胍萃取RNA。这些扩增技术包括将具有靶特异性序列的引物退火。聚合反应后，用RNase H消化DNA/RNA杂交体，而双链DNA分子则再次加热变性。在两种情况中，加入第二靶特异性引物并经聚合反应后，单链DNA都完全转变成为双链。然后，双链DNA分子经RNA聚合酶(例如T7或SP6)作用被多次转录。在等温循环反应中，RNA被逆转录成单链DNA，后者再转变成双链DNA，然后再经RNA聚合酶(例如T7或SP6)转录一次。所得的产物，不论是截短的还是完整的，都显示有靶特异性序列。

Davey等，EPA329822(本文将其纳为参考)公开了一种核酸扩增方法，涉及循环合成单链RNA(“ssRNA”)和双链DNA(dsDNA)，该方法也可以用于本发明。ssRNA是第一核苷酸引物的模板，该引物由逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)延伸。然后，通过核糖核酸酶H(RNase H，对DNA或RNA构成双链体中的RNA具有特异性的RNA酶)的作用，从所得的DNA：RNA双链体中去除RNA。所得的ssDNA是第二引物的模板，该引物也包括5’端的RNA聚合酶启动子序列(例如T7 RNA聚合酶)，因而具有与模板的同源性。该引入然后由DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶的大Klenow片段)延伸，形成双链DNA分子(dsDNA)，具有一段位于引物之间的与原RAN相同的序列，还在一端具有一段启动子序列。该启动子序列可以被合适的RNA聚合酶所利用，产生许多DNA的RNA拷贝。然后，这些拷贝再进入循环导致迅速扩增。通过选用合适的酶，扩增可以等温进行而无需在每一轮循环添加酶。由于该方法的循环特点，所选的起始序列可以是DNA或者RNA形式的。

Miller等在PCT申请WO89/06700(本文将其纳为参考)公开了一种核酸序列扩增方法，其基础为启动子/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)的杂交，然后转录出该序列的许多RNA拷贝。该方法不是循环性的，即，新的模板不是由所得的RNA转录产物产生的。其它扩增方法包括“RACE”和“单侧RCR”(Frohman，1990，本文将其纳为参考)。

在核酸存在下，(所述核酸含有产生的“二-寡核苷酸”的序列)连接两个(或多个)寡核苷酸，然后扩增该二-寡核苷酸，以此为基础的方法也可以用于本发明的扩增步骤。

扩增后，为了确定是否发生了特异性扩增，可能需要将扩增产物与模板和过量引物分开。在实施方案之一中，用标准方法，通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离扩增产物。参见Sambrook等，1989。

或者，可以用层析技术来进行分离。有许多种层析技术可用于本发明：吸附、分配、离子交换和分子筛，和使用它们所需的特殊技术，包括柱、纸上、薄层和气相层析。

为了确认标志序列被扩增，必须将扩增产物显影。一种典型的显影方法包括用溴乙锭染色凝胶，在UV光下显影。或者，如果扩增产物本身标记有放射性或荧光标记核苷酸，扩增产物可以在分离后曝光X光胶片或在合适的激发光谱下显影。

在实施方案之一中，显影是间接做到的。在分离扩增产物后，标记的核酸探针与扩增的标志序列接触。探针以交联有生色团的为佳，但也可以是放射性标记的。在另一实施方案中，探针与一结合伴侣例如抗体或生物素交联，并且结合对的另一成员则带有可测部分。

在实施方案之一中，检测通过利用标记探针的Southern印迹和杂交进行。Southern印迹所涉及的技术是本领域熟练技术人员所熟知的，可以在许多有关分子方法的标准书籍中找到。参见Sambrook等，1989。简而言之，通过凝胶电泳来分离扩增产物。然后将凝胶与纤维素薄膜之类的薄膜接触，将核酸转移上去，并形成非共价结合。然后，薄膜与交联有生色团的探针一起孵育，该探针能够与靶扩增产物杂交。检测通过膜曝光X光胶片或离子发射检测仪进行。

以上所述的实例之一可参见本文纳为参考的美国专利5,279,721，它公开了一种用于自动化核酸电泳和转移的设备。给设备无需外部的凝胶操作就可以进行电泳和印迹，而且很适合实施本发明的方法。

可以将检测生物样品中P-TEFb或激酶蛋白标志所需的所有必须物质和试剂都组装在一个试剂盒中。这通常包括预选的特异性标志引物。还包括适合扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(RT、Taq等)，脱氧核苷酸和缓冲液，以提供扩增必需的反应混合物。

这样的试剂盒通常以适当方式将包括装有各种反应试剂和酶，以及各标志引物对的不同的容器。较好的用于扩增核酸的引物对被选用来扩增以下序列SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16，由此制备得到包含与以下相邻段序列相同的核酸片段：例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的约15，20，25，30，35等；48，49，50，51等；75，76，77，78，79，80等；100，101，102，103等；118，119，120，121等；127，128，129，130，131等；316，317，318，319等；322，323，324，325，326等；361，362，363，364等；372，373，374，375等，只要所选的毗邻段序列来自空间上不同的区域。可以制备类似的片段，例如与SEQ ID NO：1相同或者互补，因此这些片段不会与例如SEQ ID NO：3杂交。

在另一实施方案中，这类试剂盒包括UspA1或UspA2蛋白的特异性杂交探针，选自对应于以下序列的核酸：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ IDNO：16，或对应于所述序列的中等长度。这类试剂盒通常以适当方式包括装用各种反应试剂和酶以及各标志杂交探针的容器。

8.2其它试验

根据具体情况，可以使用其它方法来进行基因筛选在基因组DNA，cDNA或RNA样品中准确检测出粘膜炎莫拉菌感染，此菌感染改变了正常细胞的产生和加工。

例如，筛选基因变异的方法之一是基于RNase对RNA/DNA或RNA/RNA异源双链体中错配碱基对的剪切作用。术语“错配”在此定义为在双链RNA/RNA，RNA/DNA或DNA/DNA分子内一个或多个不配对或错配的核苷酸区域。所以，该定义包括因插入/缺失突变，以及单独或多个碱基点突变引起的错配。

美国专利4,946,773说明了RNase A错配剪切试验涉及：单链DNA或RNA待测样品与RNA探针的退火，然后用RNase A处理核酸双链体。在RNase剪切反应后，通过蛋白质水解消化和有机萃取灭活RNase，剪切产物经加热变性，然后在变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。为了检测错配，RNase A处理后的单链产物根据大小经电泳分离后与经类似处理的对照双链体相比较。含有对照双链体中所没有的较小片段的样品记录为+。

目前已有的RNase错配剪切试验(包括根据美国专利4,946,773进行的那些)都需要使用放射性标记的RNA探针，Myers和Maniatis在美国专利4,946,773中说明了用RNase A检测碱基对的错配。其它学者说明了在错配试验中使用大肠杆菌酶，RNase I。因为其剪切特异性比RNase A广，如果能够找到降低非特异性剪切并提高错配剪切频率的因素，RNase I将是用于检测碱基对错配较为理想的酶。利用RNase I检测错配的说明可参见Promega Biotech中的文献。Promega出售一种试剂盒，其中包含RNase I，据其文献所示，如果酶浓度足够高，该RNaseI可剪切4处已知错配中的3处。

RNase保护试验最初用来检测和图示溶液中的特定靶mRNA的两端。该试验依赖于通过体外转录能够容易地产生与感兴趣的mRNA互补的高特异性放射性标记RNA探针。最初，用于体外转录的模板是含有噬菌体启动子的重组质粒。探针与全细胞RNA样品混合，使得它们能够与它们的互补性靶杂交，然后用RNase处理混合物以降解过量的未杂交探针。而且，按照原来的意图，所用的RNase是单链RNA特异性的，因而杂交的双链探针受到保护而不被降解。在将RNase灭活并去除后，在聚丙烯酰胺凝胶上分析受保护探针(其量与存在的靶mRNA量成正比)。

RNase保护试验适用于检测单碱基突变。在这种RNase A错配剪切试验中，由野生型序列体外转录得到放射性标记RNA探针，与待测样品中的互补性靶区域杂交。待测靶通常包括DNA(基因组DNA或通过质粒克隆或通过PCR^TM扩增得到的DNA)，但是有时也使用RNA靶(内源性mRNA)。如果杂交后的探针与靶之间出现单个核苷酸(或更多个)序列的差异，这会造成在该位置的Watson-Crick氢键破裂，在有些情况下，这样的破裂可以被单链特异性核糖核酸酶识别并剪切。迄今，几乎仅用RNase A来剪切单碱基错配，但是最近RNase I也显示可用于错配剪切。这是对利用MutS蛋白和其它DNA修复酶检测单碱基错配的最新报道。

9.0实施例

以下实施例是为了展示本发明较好的实施方式。本领域熟练技术人员应该理解的是，以下实施例中公开的技术代表了本发明人所发现的在实施本发明中非常有效的技术并认为构成了实施本发明的较优模式。但是，根据本发明的内容，本领域熟练技术人员应该理解，可以对在此公开的具体实施方案进行许多修改而获得相同或相似的结果，这些并不背离本发明的精神和范围。

实施例1：uspA1的序列分析和特征描述

菌株和培养条件。粘膜炎莫拉菌菌株035E，046E，TTA24，012E，FR2682和B21已经有所说明(Helminen等，1993a；Helminen等，1994；Unhanand等，1992)。粘膜炎莫拉菌菌株FR3227和FR2336获自Richard Wallace，University ofTexas Health Center，Tyler，TX。粘膜炎莫拉菌菌株B6获自Elliot Juni，University ofMichigan，Ann Ardor，MI。粘膜炎莫拉菌菌株TTA1获自Steven Berk，East Tennessee State University，Johnson City，TN。粘膜炎莫拉菌菌株25240获自美国典型培养物保藏中心Rockville，MD。粘膜炎莫拉菌株通常在95％空气-5％CO₂的气体中37℃培养在心脑浸液(Brai Heart Infusion)(BHI)肉汤中(DifcoLaboratoris，Detroit，MI)或BHI琼脂板上。大肠杆菌菌株LE392和XL-1BlueMRF’(Stratagene，La Jolla，CA)37℃培养在补充了麦芽糖(0.2％w/v)和10mMMgSO₄的Lubria-Bertani培养基(Maniatis等，1982)中，根据需要补充以抗生素。

单克隆抗体(MAb).MAb17C7是与迄今测试过的所有粘膜炎莫拉菌株的UspA蛋白类物质起反应的小鼠IgG(Helminen等，1994)。根据文献所述(Helminen等，1993a)，用粘膜炎莫拉菌035E的外膜囊泡免疫小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0-Ag14浆细胞瘤细胞系融合产生了用于此研究的UspA特异性的其它MA6(即16A7、17B1和5C12)。这些MAb以杂交瘤培养物上清液的形式用于Western印迹和斑点印迹分析。

克隆载体。表VI列出了本发明所用的质粒和噬菌体克隆载体，以及这些载体的重组衍生物。

表VI

噬菌体和质粒

噬菌体或质粒说明来源
噬菌体或质粒说明来源			噬菌体
λGEM-11	克隆用载体	Promega Corp.(Madison，WI)	噬菌体
λGEM-11	克隆用载体	Promega Corp.(Madison，WI)	MEH200	含有11kb插入片段的λGEM-11，所述片段是编码UspA蛋白类物质的粘膜炎莫拉菌035E DNA	(Helminen等，1994)
ZAP表达载体	克隆用载体	Stratagene	MEH200	含有11kb插入片段的λGEM-11，所述片段是编码UspA蛋白类物质的粘膜炎莫拉菌035E DNA	(Helminen等，1994)
ZAP表达载体	克隆用载体	Stratagene	USP100	含有2.7kb DNA片段(含USP A1)的ZAP表达载体，所述片段由粘膜炎莫拉菌035E的染色体扩增得到	本发明
质粒			USP100	含有2.7kb DNA片段(含USP A1)的ZAP表达载体，所述片段由粘膜炎莫拉菌035E的染色体扩增得到	本发明
质粒			pBluscript II SK+(pB S)	克隆用载体，Amp^R	Stratagene
pJL501.6	含有1.6kb MEH200的BglII-EcoRI片段的pBS	本发明	pBluscript II SK+(pB S)	克隆用载体，Amp^R	Stratagene
pJL501.6	含有1.6kb MEH200的BglII-EcoRI片段的pBS	本发明	pJL500.5	含有600bp MEH200的BglII片段的pBS	本发明

MEH200，生成噬菌斑与UspA特异性MAb 17C7反应的最初重组噬菌体克隆，已经有所说明(Helminen等，1994)。

基因技术。标准重组DNA技术包括：质粒的分离，限制性酶消化，DNA修饰，连接反应和转化大肠杆菌，这些都是本领域技术人员所熟知的，并可根据现有文献进行操作(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989)。

聚合酶链反应(PCR ^TM)。用GeneAmp试剂盒(Perkin-Elmer，Branchberg，NJ)进行PCR^TM。所有反应均按照制造商的说明进行。为了从全基因组DNA扩增产物，在每100μl反应物中使用1μg粘膜炎莫拉菌染色体DNA和100ng各个引物。

核酸序列分析.使用Applied Biosystem 373A型自动化DNA测序仪(AppliedBiosystem，Foster City，CA)进行重组质粒内、噬菌体内、或 PCR ^TM衍生的DNA片段的核苷酸序列分析。使用University of Wisconsin Genetics Computer Group的分析软件包中的Intelligenetics组件包和程序(Devereux等，1984)分析DNA序列信息。用Kyte和Doolittle(1982)的方法分析蛋白质的亲水性，用MacVector^TM蛋白基质分析软件包(Eastman Kodak Company，Rochester，NY)来分析UspA蛋白质内的重复氨基酸序列。

重组噬菌体的鉴定。用重组噬菌体感染大肠杆菌细胞，利用现有裂解方法(Helminen等，1994)产生大肠杆菌细胞的裂解液。根据制造商的说明(Stratagene，LaJolla，CA)以MAb筛选重组ZAP表达噬菌体在大肠杆菌XLl-Blue MRF’细胞上形成的噬菌斑。简而言之，在噬菌体感染细菌菌苔后，将在10mM IPTG中浸渍过的硝酸纤维素滤膜覆盖在琼脂培养板表面5小时。37℃孵育过夜，揭下硝酸纤维素片，用含有0.5％(v/v)吐温20和0.5％(w/v)脱脂牛乳的PBS(PBS-T)洗涤，与含有MAb的杂交瘤培养上清液室温孵育4小时。PBS-T洗涤四次后，在各片上加用含有¹²⁵I-标记的山羊抗小鼠IgG的PBS-T。4℃孵育过夜后，各片用PBS-T洗涤四次，干燥斑点，并曝光胶片。

粘膜炎莫拉菌蛋白抗原的特征鉴定。利用EDTA缓冲液法(Murphy和Loeb，1989)从生长在BHI肉汤中的粘膜炎莫拉菌细胞制备外膜囊泡。用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺分离胶，通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来离析这些囊泡内的蛋白质。将SDS-PAGE离析的蛋白质电泳转移到硝酸纤维素膜上，按Kimura等，1985所述，用MAb 17C7作为第一抗体进行Western印迹分析。为了用Western印迹分析重组噬菌体内DNA插入片段所编码的蛋白质，取一份噬菌体感染大肠杆菌细胞的裂解液与一份SDS消化缓冲液(Kimura等，1985)混合，该混合物37℃孵育15分钟，然后进行SDS-PAGE。

uspA1基因及其编码折质产物的特征。粘膜炎莫拉菌035E uspA1基因的核苷酸序列和UspA1蛋白质的推定氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：1.含有2,493个核苷酸的开放读码框(ORF)编码831个氨基酸的蛋白产物，其计算分子量为88,271道尔顿(Da)。

uspA1 ORF的推定蛋白产物的pI约4.7，高度亲水，其特征在于具有许多重复基序。第一基序含有共有序列NXAXXYSXIGGGXN(SEQ ID NO：24)，该基序在残基80和170之间多次重复。第二区域位于氨基酸残基320至460之间，含有一个长序列，该序列完整地重复3次，但是还含有自身重复数次的较小单元。这种“重复单元内重复”排列也出现在第三区域，该区域自氨基酸残基460延伸至600。最后一个基序由小基序QADI(SEQ ID NO：25)重复数次构成，其中两个大的重复单元包含自身内部QADI(SEQ ID NO：25)基序。

UspA1与其它蛋白的类似性。对现有数据库进行BLAST-X检索(Altschul等，1990；Gish和States，1993)，查找与UspA1明显同源的蛋白质，该检索显示与粘膜炎莫拉菌抗原最相似的原核蛋白是H.influenzae Rd的一种推定粘附素(GenBank编号：U32792)(Fleischmann等，1995)，未分类的H.influenzae的Hia粘附素(GenBank编号：U38617)(Barenkamp和St.Geme III，1996)和耶尔森小肠结肠炎菌的YadA侵染素(Skurnik和Wolf-Watz，1989)(SwissProt：P31489)。在使用GAP排列程序(Devereux等，1984)将UspA1序列与上述蛋白质和密切相关的细菌粘附素的序列进行比较时，证明UspA1与肠病原性大肠杆菌的AIDA-I粘附素(Benz和Schmidt，1989；Benz和Schmidt，1992b；)具有25％的相同性和47％的相似性，与Hia(Barenkamp和St.Geme III，1996)具有23％的相同性和46％的相似性，与YadA(Skurnik和Wolf-Watz，1989)具有24％的相同性和43％的相似性。经数据库检索找到的与UspA1具有同源性的其它蛋白质包括多种物种的肌球蛋白重链。

实施例II：两个基因编码蛋白质UspA1和UspA2

MAb17C7结合粘膜炎莫拉菌的一种分子量极高的蛋白类物质，该物质称为UspA，该物质迁移(在SDS-PAGE中)时的表观分子量至少250kDa。同一MAb还与约100kDa的另一抗原带反应，正如美国专利5,552,146中所述(本文将其纳为参考)，而且该抗体被感染了重组噬菌体的大肠杆菌的噬菌体裂解液所结合，所述的重组噬菌体含有一段粘膜炎莫拉菌染色体DNA片段。噬菌体裂解液中结合该MAb的粘膜炎莫拉菌蛋白类物质其迁移速度与天然UspA物质相似或没有区别(Helminen等，1994)。

uspA1分析。对经重组噬菌体表达的粘膜炎莫拉菌035E菌株基因(被称为uspA1)进行的核苷酸序列分析显示存在一个ORF，它编码分子量88,271的一种推定蛋白质产物(SEQ ID NO：1)。将uspA1 ORF用在一种DNA引导的体外蛋白质表达系统显示uspA1基因编码的蛋白质在SDS-PAGE中迁移时的表观分子量约120kDa。(本领域技术人员知道，SDS-PAGE这类变性过程可能改变蛋白质的迁移速度，造成变性蛋白质的表观分子量与非变性蛋白质的推定分子量有某些差别)。此外，在将uspA1 ORF引入噬菌体载体时，含有该重组噬菌体的重组大肠杆菌表达一种蛋白质，其在SDS-PAGE中的迁移速度与粘膜炎莫拉菌天然UspA蛋白质的明显相同。

将衍生自克隆的uspA1基因的0.6kb的Bg/II-PvuII片段用作探针进行数种粘膜炎莫拉菌染色体DNA的Southern印迹分析，分析显示在几种菌株中有两种不同的限制片段结合此uspA1衍生探针(图1)，这表明粘膜炎莫拉菌具有与uspA1基因有些类似的第二种基因。

粘膜炎莫拉菌035E菌株的天然极高分子量UspA蛋白类物质用SDS-PAGE来离析，电泳洗脱，并用蛋白酶消化。部分所得肽的N末端氨基酸序列分析显示，某些肽的氨基酸序列与UspA1推定的氨基酸序列不匹配。此实验获得的其它肽的氨基酸序列与推定的氨基酸序列相似但不全同。

高分子量UspA蛋白类物质的蛋白酶和溴化氰(CNBr)剪切。用90％乙醇沉淀0.3mg纯化的极高分子量UspA蛋白类物质(在纯化时，该物质被认为是单独一种蛋白质)，将沉淀重悬在含有12M脲的100ml 88％甲酸中。重悬后，加入含有2MCNBr的88％甲酸100ml，混合物在黑暗中室温孵育过夜。在含有25mg胰蛋白酶或靡蛋白酶的试管中直接加入1ml(0.2mg)纯化UspA。反应混合物37℃孵育约48小时。在含有15mg内源蛋白酶Lys-C的试管内直接加入1ml(2.0mg)纯化UspA。反应混合物37℃孵育约48小时。

在Eppendorf^TM离心试管中12,000rpm离心5分钟以澄清剪切反应混合物。澄清后的上清液直接上样在Vydac C4 HPLC层析柱上，以0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液(溶液A)和乙腈∶H₂O∶三氟乙酸80∶20∶0.1(v/v/v)(溶液B)为移动相，流速为1.0ml/min。用100％A溶剂将反应混合物洗到层析柱上，然后用线性梯度(0-100％)溶剂B进行30分钟的剪切片段洗脱。手工收集组份，在Speed-Vac中干燥过夜，然后重悬在家用纯水中。对重悬的HPLC分离组份进行SDS-PAGE分析，使用Tris-Tricine缓冲系统中的10-18％梯度胶。对表现为单种肽带的组份进行直接N末端测序。将表现出多条肽带的组份从SDS-PAGE上转移到PVDF薄膜上，切下各条带，进行N末端测序。

然后，用Applied Biosystems477A型PTH分析仪(Applied Biosystems，FosterCity，CA，U.S.A.)测定这些片段的N末端氨基酸序列。表VII概括了这些序列。约半数序列发现与自uspA1基因推定的序列相匹配，另一半则不。试图进行uspA1基因序列读码框移码以描述非匹配肽序列，但是没有成功，这表明高分子量UspA蛋白可能包含一种以上独特蛋白的多聚体，或两种不同蛋白的不同多聚体。

表VII

内部肽片段N末端序列概述

消化	序列^a
消化	序列^a	CNBr	AAQAALSGLFVPYSVGKFNATAALGGYGSKSEQ ID NO：26GKITKNAARQENG SEQ ID NO：27
LysC消化#1	VIGDLGRKV SEQ ID NO：28ALEXNVEEGL SEQ ID NO：29ALESNVEEGLXXLS SEQ ID NO：30ALEFNGE SEQ ID NO：31	CNBr
LysC消化#1		LysC消化#2	SITDLGXKV SEQ ID NO：32SITDLGTIVDGFXXX SEQ ID NO：33SITDLGTIVD SEQ ID NO：34
胰蛋白酶	VDALXTKVNALDXKVNSDXT SEQ ID NO：35LLAEQQLNGKTLTPV SEQ ID NO：36AKHDAASTEKGKMD SEQ ID NO：37ALESNVEEGLLDLSG SEQ ID NO：38	LysC消化#2
胰蛋白酶		胰蛋白酶消化#1	NQNTLIEKTANK SEQ ID NO：39IDKNEYSIK SEQ ID NO：40SITDLGTK SEQ ID NO：41
胰蛋白酶消化#2	NQNTLIEK SEQ ID NO：42ALHEQQLETLTK SEQ ID NO：43NSSD SEQ ID NO：44NKADADASFETLTK SEQ ID NO：45FAATAIAKDK SEQ ID NO：46KASSENTQNIAK SEQ ID NO：47RLLDQK SEQ ID NO：48	胰蛋白酶消化#1
胰蛋白酶消化#2		靡蛋白酶	AATADAITKNGX SEQ ID NO：49AKAXAANXDR SEQ ID NO：50
用cys-C-内肽酶消化研究级UspA	NQADIAQNQTDIQDLAAYNELQ SEQ ID NO：51NQADIANNINNIYELAQQQDQ SEQ ID NO：52YNERQTEAIDALN SEQ ID NO：53ILGDTAIVSNSQD SEQ ID NO：54	靡蛋白酶	AATADAITKNGX SEQ ID NO：49AKAXAANXDR SEQ ID NO：50

^a几个肽的某些残基无法证实，这样的模糊残基在SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中以“X”表示。在SEQ ID NO：29中，模糊残基可能是丝氨酸；SEQ ID NO：33中的第13位可能是天冬氨酸，第14位可能是甘氨酸，第15位可能是精氨酸；SEQ ID NO：35中第13位和第19位可能都是丝氨酸；SEQ IDNO：49中的模糊残基可能是天冬酰胺；SEQ ID NO：50中的第4位可能是丝氨酸，第8位可能是苏氨酸。

还进行了其它尝试来通过SDS-PAGE分辨粘膜炎莫拉菌O35E的极高分子量UspA蛋白带，然后进行电洗脱，并用蛋白酶或溴化氰消化，这些实验也产生了许多肽，对这些肽进行了测序。获得几条肽(肽1至6，表VIII)，其氨基酸序列与uspA1基因的核苷酸序列推定的氨基酸序列相同或非常相似。但是，其它几个肽(肽7至10，表VIII)推定氨基酸序列中不存在。上述发现支持了以下提议，即在UspA抗原制剂中存在着第一种蛋白质。

表VIII

相配或近乎相配的肽：

肽# 氨基酸序列

肽1 KALESNVEEGLLDLSGR (SEQ ID NO：55)

肽2 ALESNVEEGLLELSGRTIDQR (SEQ ID NO：56)

肽3 NQAHIANNINXIYELAQQQDQK(SEQ ID NO：57)

肽4 NQADIAQNQTDIQDLAAYNELQ(SEQ ID NO：58)

肽5 ATHDYNERQTEA (SEQ ID NO：59)

肽6 KASSENTQNIAK (SEQ ID NO：60)

不相配的肽：

肽# 氨基酸序列

肽7 MILGDTAIVSNSQDNKTQLKFY(SEQ ID NO：61)

K

肽8 AGDTIIPLDDDXXP (SEQ ID NO：62)

肽9 LLHEQQLXGK (SEQ ID NO：63)

肽10 IFFNXG (SEQ ID NO：64)

^a几个肽的某些残基无法证实，这样的模糊残基在SEQ ID NO：57，SEQ IDNO：62，SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64中以“X”表示。

其它证据也支持以下论点，即高分子量的UspA蛋白类物质是一种以上独特蛋白的多聚体或两种不同蛋白的不同多聚体，这样的证据来自较早期的电喷射质谱分析，该分析假设UspA单体的分子量为59,500。这一约60kDa的蛋白质与Mab 17C7、45-2、13-1和29-31发生免疫反应，这与UspA1蛋白相反，后者仅与Mab 17C7交叉反应。MAb 17C7与这两种分离蛋白质都反应这一事实提示，该Mab识别两蛋白共有的某表位。

突变uspA1构建物的制备。采用克隆uspA1基因的核苷酸序列来构建一种同基因uspA1突变体。用寡核苷酸引物(表IX中的BamHI终止的P1和P16)来扩增粘膜炎莫拉菌O35E染色体DNA的截短uspA1 ORF；将该PCR^TM产物克隆到质粒载体pBluescript II SK+的BamHI位点。从该克隆片段中部切下一段0.6kb Bg/II片段，代之以BamHI终止的基因盒，该盒编码卡那霉素抗性。在大肠杆菌DH5α这培养这一新的质粒，用柱层析纯化，EcoRI消化线性化，沉淀，然后溶解在水中。使用现有技术(Helminen等，1993b)用该线性DNA分子电穿孔野生型粘膜炎莫拉菌O35E。获得约5,000个卡那霉素抗性转化株；随机挑选的几个发现仍与MAb 17C7反应。从这些卡那霉素抗性集落中随机挑选一个用于进一步的检查和Southern印迹分析，证实该突变体是同基因性的。

对uspA1突变体表达产物的分析。对野生型粘膜炎莫拉菌和上述突变株的全细胞裂解液都进行了SDS-PAGE，野生型菌株和突变株都表达原先命名为UspA的极高分子量带。但是，在突变株中发现约120kDa的蛋白质缺失了(图2A)。野生型菌株和突变株都表达与MAb 17C7反应的极高分子量抗原(图2B)表明，在粘膜炎莫拉菌O35E中一定有第二种基因编码一种MAb 17C7反应性抗原。而且，应注意的是，EDTA萃取的野生菌株(图2C，泳道5和7)和突变株(图2C，泳道6和8)的外膜囊泡都具有一种70至80kDa、与MAb 17C7反应的蛋白质。70至80kDa的这一条带很可能代表另一种编码MAb 17C7反应性表位的第二基因产物的一种形式，可能是单体形式。

重要的是应注意，野生亲本株和突变株的染色体DNA都用PvuII消化，并在Southern印迹分析中用一段来自uspA1基因的0.6kb Bg/II-PvuII片段作为探针进行检测时，野生株显示结合该探针的一条2.6kb带和一条2.8bk带。相比之下，突变株显示结合该探针的一条2.6kb带和一条3.4bk带。存在3.4bk带是因为在uspA1基因中的缺失位置插入了kan片段。

实施例III：UspA2和uspA2的特征描述

融合蛋白的构建。用前述uspA1基因的核苷酸序列构建融合蛋白定位了结合MAb 17C7的表位。首先，用pGEX4T-2蛋白质融合系统(Pharmacia LKB)构建包含覆盖UspA1蛋白的5条肽的融合蛋白。表IX列出了用于PCR^TM扩增粘膜炎莫拉菌O35E中所需核苷酸序列的寡核苷酸引物。它们在各自的5’端或具有一个BamHI位点或具有一个XhoI位点，因此可以将扩增产物按照读码框内取向克隆到BamHI和XhoI消化的载体中。在表达5种融合蛋白之一种的各重组大肠杆菌株用于集落印迹放射性免疫试验时，仅融合蛋白MF-4易结合MAb 17C7。对MF-4融合结构中uspA1衍生核苷酸序列的进一步分析，包括生产衍生自MF-4融合蛋白的含79个氨基酸残基(MF-4-1)和123个氨基酸残基的融合蛋白(MF-4-2)(表IX)。这两种融合蛋白都结合MAb 17C7(表IX)。图4显示MAb 17C7与MF-4-1融合蛋白的Western印迹反应性。这两种融合蛋白只共有一段23残基的区域：NNINNIYELAQQQDQHSSDIKTL(SEQ ID NO：65)，揭示被命名为“3Q”肽的这一23残基区域包含结合MAb 17C7的表位。

表IX用于生产构建融合蛋白用uspA1基因片段和诱变的PCR^TM引物以及所得融合蛋白

与MAb 17C7的反应性

产生的片段引物对^a 与MAb 17C7的反应性

MF-3 P5-P8 -

MF-4 P6-P13 +

MF-4.1 P7-P12 +

MF-4.2 P11-P13 +

^a引物序列如下：

P5 GGTGCAGGTCAGATCAGTGAC SEQ ID NO：66

P6 GCCACCAACCAAGGTGAC SEQ ID NO：67

P7 AGCGGTCGCCTGCTTGATCAG SEQ ID NO：68

P8 CTGATCAAGCAGGCGACCGCT SEQ ID NO：69

P11 CAAGATCTGGCCGCTTACAA SEQ ID NO：70

P12 TTGTAAGCGGCCAGATCTTG SEQ ID NO：71

P13 TGCATGAGCCGCAAACCC SEQ ID NO：72

MAb 17C7表位的说明。重要的是应注意，编码这一23残基多肽(即3Q肽)的核苷酸序列存在于实施例II所述Southern印迹分析所用的0.6kb Bg/II-PvuII片段中。这一发现提示，结合Mab 17C7的表位可能由2.6kb和2.8kb的PvuII片段中都存在的DNA编码。2.8kb的PvuII片段衍生自克隆的uspA1基因，而2.6kb的PvuII片段代表了编码该相同表位的另一基因的全部或部分。

用基于连接反应的PCR^TM系统来验证这一发现。用PvuII彻底消化突变株的染色体DNA，通过琼脂糖凝胶电泳离析。从琼脂板上切下大小介于2至3kb的片段，平整末端，然后连接到pBluescript II SK+的EcoRI位点内。沉淀该连接反应混合物，然后用于PCR^TM扩增反应。各PCR^TM反应含有来自编码3Q肽的DNA的T3引物或T7引物。该方法用T3和P10引物产生一种1.7kb的产物，用T7和P9引物则产生一种0.9kb的产物(图5)。此两条带之和与所需DNA片段2.6kb的大小相同。

对这两种PCR^TM产物的核苷酸序列分析显示两种不完整的ORF，与编码3Q肽的区域连接后形成一个1,728bp的ORF，它编码一种计算分子量为62,483Da的蛋白质(SEQ ID NO：3)。此蛋白的氨基酸序列与UspA1有43％相同。更精密的检测显示，该第二种蛋白(命名为UspA2)内的氨基酸278至411区域与UspA1内的氨基酸505至638区域(SEQ ID NO：1)几乎相同。而且，上述两区域都包含23聚体(3Q肽)，该聚体可能包含结合MAb 17C7的表位。还应当注意的是，发现表IX中UspA1内没有的4种肽(肽7至10)与UspA2推定的氨基酸序列相同或十分相似。此外，表IX中与UspA1推定的氨基酸序列中的肽相同或十分相似的前6种肽也与UspA2推定的氨基酸序列中发现的肽相同。

寡核苷酸引物P1和P2(表IX)用来扩增来自粘膜炎莫拉菌O35E染色体DNA的一段2.5-2.6kb片段。用该PCR^TM产物的核苷酸序列分析来确认基于连接反应的PCR^TM研究所测定的uspA2 ORF核苷酸序列。结果证明，粘膜炎莫拉菌O35E含有两种不同的ORF(即uspA1和uspA2)，它们编码同一肽，该肽可能结合MAb17C7。所述的3Q肽看来在UspA1中出现2次，在UspA2中出现1次(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)。

uspA1内编码这些3Q肽的两段DNA节段的核苷酸序列几乎相同，仅有3处核苷酸差异。这些核苷酸差异没有造成氨基酸序列的改变。uspA2内编码3Q肽的DNA节段的核苷酸序列与编码UspA1内第一个3Q肽的DNA相同。

参见图2C，泳道7，粘膜炎莫拉菌O35E外膜囊泡中这3种主要MAb 17C7反应性条带的表观分子量大于200kDa，约120kDa和约70至80kDa。应注意的是，美国专利5,552,146中也显示存在着表观分子量大于200kDa，约120kDa和约70至80kDa的数种MAb 17C7反应性条带。所以，早在1991年就明白存在着至少一种与MAb 17C7反应的粘膜炎莫拉菌抗原。现在显而易见的是，约120kDa的条带可能代表UspA1抗原的单体形式，约70至80kDa的条带可能代表UspA2抗原的单体形式，两种抗原均来自粘膜炎莫拉菌O35E。这两种抗原的一个或一个以上可能凝聚成UspA抗原的极高分子量蛋白类物质(即大于200kDa)。

在噬菌体载体ZAP表达载体(Stratagene，La Jolla，CA)内构建了一个新的粘膜炎莫拉菌O35E菌株的基因组文库。用Sau3A1部分消化该菌株的染色体DNA，按照制造商的说明书将4至9kb的DNA片段连接到该载体内。在大肠杆菌MRF’内扩增该文库。取一份该文库稀释并接种平板，在形成的噬菌斑中筛选与MAb17C7的反应性。检测到了约24个结合此MAb的噬菌斑；用单噬菌斑分离法纯化相应的重组噬菌体，对这些噬菌体之一的DNA插入片段进行核苷酸序列分析。该重组噬菌体内存在2.6kb DNA片段的核苷酸序列显示，其一端含有编码3Q肽的不完整ORF。直至被载体克隆位点所截断，该不完整ORF的序列与刚才所述的基于连接反应的PCR^TM研究所得到的uspA2 ORF序列相同或几乎相同，这为以下结论提供了进一步的证据，即具有相同表位的两基因都编码UspA抗原。

实施例IV：蛋白质UspA1和UspA2的纯化及其免疫学特性材料和方法

细菌.实施例I已经对TTA24和O35E分离株进行了说明。其它分离株获自University of Rochester和美国典型培养物保藏中心(ATCC)。按照常规细菌在Mueller-Hinton琼脂板上、5％二氧化碳中、35℃孵育传代。用于生产纯化蛋白的细菌培养在每升含10g水解酪蛋白氨基酸(Difco，Detroit，MI)和15g酵母提取物(BBL，Cockeysville，MD)的无菌肉汤中。这些分离株于-70℃保存在含40％甘油的Mueller-Hinton肉汤中。

UspA2的纯化。用含有1.0％Triton^X-100(TX-100)(J.T.Baker Inc.，Philipsburg，NJ)(pH6.0)的2升pH6.3、0.03M磷酸钠(NaPO₄)液室温搅拌60分钟洗涤细菌细胞(湿重约400g的粘膜炎莫拉菌O35E)二次。4℃13,700×g离心30分钟沉淀含有UspA2蛋白的细胞。然后，将沉淀重悬在2升含有1.0％TX-100的pH8.0、0.03M盐酸三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)液中，4℃搅拌过夜以抽提UspA2蛋白。4℃13,700×g离心30分钟沉淀细胞。收集含有UspA2蛋白的上清液，先后滤过0.8μm滤膜(CN.8，Nalge，Rochester，NY)和0.45μm滤膜(乙酸纤维素，低蛋白结合性，Corning，Corning，NY)进一步澄清。

将过滤后的粗提取制剂全部上样在50×217mm(约200ml)TMAE柱[650(S)，0.025-0.4mm，EM Separations，Gibbstown，NJ]上，该柱经含0.1％TX-100的pH8.0、0.03M Tris-HCl缓冲液(THT)平衡。先用400ml平衡缓冲液再用600ml 0.25M NaCl的0.03M THT溶液洗柱。然后用800ml 1.0M NaCl的0.03M THT溶液洗脱UspA2。利用SDS-PAGE筛选UspA2组份，并将其合并。在氮气压力下，用带YM-100滤膜的Amicon搅拌含(Amicon Corp.，Beverly，MA)超滤，将合并的含UspA2组份(约750ml)浓缩约2倍。将TMAE浓缩液等分成175ml的两份，每一份通过经含0.1％TX-100、pH7.0、10mM NaPO₄(10mM PT)平衡的50×280mm(约550ml)Sephadex G-25(Coarse)柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)进行缓冲液更换。接着，将更换了缓冲液的材料上样在经10mM PT平衡的50×217mm(约425ml)陶土羟基磷灰石柱(I型，40μm，Bio-Rad)上。先用450ml平衡缓冲液再用900ml含0.1％TX-100pH7.0、0.1M的NaPO₄液洗柱。然后用pH7.0的NaPO₄线性梯度液，即含0.1％TX-100的0.1M至0.2M的NaPO₄液洗脱UspA2。将另一份含0.1％TX-100、pH7.0 0.2M的NaPO₄上样在层析柱上，然后进行收集，以尽可能回收UspA2。用SDS-PAGE筛选UspA2组份，并将其合并。然后用0.1％TX-100、pH7.0 0.5M的NaPO₄洗柱。用SDS-PAGE在洗出的组份中筛选UspAl，将其合并，并保存于4℃。用此合并液来纯化UspAl。

UspAl的纯化。将在4次UspA2分离纯化过程中收集的富含UspAl组份合并。在氮气压力下，用带YM-100滤膜的Amicon搅拌盒超滤，将合并的UspAl组份浓缩约3倍。将UspAl浓缩液等分成175ml的两份，每一份通过经10mM PT平衡的50×280mm(约550ml)Sephadex G-25柱进行缓冲液更换。接着，将更换了缓冲液的材料上样在经10mM PT平衡的50×217mm(约425ml)陶土羟基磷灰石柱(Bio-Rad)上。先用450ml平衡缓冲液再用900ml含0.1％TX-100pH7.0、0.25M的NaPO₄液洗柱。然后用pH7.0的NaPO₄线性梯度液，即含0.1％TX-100的0.25至0.5M的NaPO₄液洗脱UspAl，含UspAl的组分经SDS-PAGE鉴定并合并。

SDS-PAGE和Western印迹分析。如Laemmli所述(1970)，用4至20％(w/v)梯度丙烯酰胺凝胶(一体化分离系统(ISS)，Natick，MA)进行SDS-PAGE。用考马斯亮蓝R250染色凝胶来显示蛋白质。用Personal Densitometer SI(MolecularDynamics Inc.，Sunnyvale，CA)扫描凝胶，以来自ISS的已染色分子量标记物作为标准，利用片段分析软件(1.1版)估计分子量。用半干式电印迹仪和电印迹缓冲液(ISS)将蛋白质转移到聚二氟乙烯(PVDF)薄膜上。用蛋白质特异性抗血清或MAb，然后用山羊抗小鼠碱性磷酸酶交联物作为第二抗体(BioSource International，Camarillo，CA)检测薄膜。利用BCIP/NBT磷酸酶底物系统(Kirkegaard和Perry实验室，Gaithersburg，MD)进行Western印迹的显影。

蛋白质估计。用BCA试验(Pierce，Rockford，IL)估计蛋白质的浓度，以牛血清白蛋白作为标准物。

UspA2和UspA1的酶剪切和化学剪切。

(i)CNBr剪切。用90％(v/v)乙醇沉淀约0.3mg纯化蛋白，将沉淀重悬在100μl含12M脲的88％(v/v)甲酸中。然后，加入100μl含2M CNBr(Sigma，St.Louis，MO)的88％(v/v)甲酸，在黑暗中将混合物室温孵育过夜。

(ii)胰蛋白酶和靡蛋白酶剪切。用90％(v/v)乙醇沉淀约2mg纯化蛋白，将沉淀重悬在总体积为1ml的含0.1％TX-100的磷酸盐缓冲液(PBS)中。将该制剂直接加入含有25μg胰蛋白酶或靡蛋白酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的试管中。反应混合物37℃孵育48小时。

(iii)内源性蛋白酶Lys-C剪切。用90％(v/v)乙醇沉淀约2mg纯化蛋白，将沉淀重悬在总体积为1ml的含0.1％TX-100的PBS中。将该制剂直接加入含有15μg内源性蛋白酶Lys-C(Boehringer Mannheim)的试管中。反应混合物37℃孵育48小时。

(iv)肽的分离.上述剪切反应混合物在Eppendorf离心试管中以12,000rpm离心5分钟，将上清液直接上样到Vydac蛋白质C4 HPLC柱(The Separations Groups，Hesperia，CA)上。所用的溶剂是0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)水溶液[溶剂A]和乙腈∶水∶TFA为80∶20∶0.1(v/v/v)[溶剂B]，流速为1.0ml/min。在先用溶剂A洗涤后，用线性梯度0至100％的溶剂B洗脱肽，并检测220nm处的吸光度。收集合适的组份，在Speed-Vac浓缩仪(Jouan Inc.，Winchester，VA)中干燥，再重悬在蒸馏水中。在10至18％(w/v，丙烯酰胺)梯度凝胶(ISS)上用Tris-Tricine缓冲液系统(Schagger和von Jagow，1987)，作SDS-PAGE分离此组份。对含有单条肽带的组份直接进行N末端测序。在SDS-PAGE中展示多条肽带的组份如前所述转移到PVDF模拟上。薄膜用考马斯亮蓝R250染色，切下各条带，然后进行N末端序列分析(Matsudaira，1987)。

亚基大小的测定。以3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸为基质，在Lasemat 2000Mass Analyzer(Finnigan Mat，Hemel Hempstead，UK)上通过基质辅助激光吸收/离子化-光时(MALDI-TOF)质谱法测定分子量。用低温乙醇沉淀含有≥0.1％(v/v)TX-100的样品以去除该除垢剂。乙醇的最终浓度为90％(v/v)。将沉淀的蛋白重悬在水中。

凝胶过滤层析测定凝聚体的大小。用90％(v/v)乙醇沉淀约1mg纯化蛋白，将沉淀重悬在含0.1％(v/v)TX-100的PBS中，总体积为1.0ml。以0.5ml/min的流速将200ml制剂上样在经PBS/0.1％TX-100平衡的Superose-6 HR 10/30凝胶过滤柱(10×30mm，Pharmacia)上。用HMW标定试剂盒(Phamacia)标定此柱，该试剂盒中含有158,000的醛缩酶；232,000的过氧化氢酶；440,000的铁蛋白；669,000的甲状腺球蛋白；和2000至2,000,000之间的右旋糖苷。

氨基酸序列分析。用Applied Biosystems 477A型蛋白质/肽测序仪进行N末端序列分析，该仪器配备有在线型120A PTH分析仪(Applied Biosystems，FosterCity，CA)。用Brownlee PTH C-18柱(颗粒大小为5μm，2.1mm i.d.×22cm 1.；Applied Biosystems)，通过反相HPLC鉴定乙内酰苯硫脲(PTH)衍生物。

免疫接种。取6至8周龄的雌性BALB/c小鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)，隔4周两次皮下免疫注射UspA1或UspA2。为了制备疫苗，将纯化的UspA1或UspA2加入磷酸铝，混合物在4℃转动过夜。在临使用前加入3-O-脱乙酰单磷酸脂质A(MBL)(Ribi ImmunoChem Research，Inc.，)。每剂疫苗含有5μg纯化蛋白，100μg磷酸铝和50μg MPL，重悬在200μl体积中。对照小鼠注射5μg CRM₁₉₇和相同的佐剂。分别在第一次接种后和第二次免疫的两周后采集血清样品。小鼠饲养在无特殊病原设施中，并随意供给水和食物。

单克隆抗体.17C7 MAb是由杂交瘤(ATCC HB11093)分泌的。根据Chen等，1995描述制备MAb：13-1，29-31，45-2和6-3。

粘膜炎莫拉菌肺清除小鼠模型。根据Chen等，1995描述使用该模型。

酶联免疫吸附试验(ELISA)程序。本发明使用了两种不同的ELISA。一种用来检测血清对全细菌细胞的反应性，另一种用来检测血清对纯化蛋白的反应性。

就全细胞ELISA而言，细菌在Mueller-Hinton琼脂板上培养过夜，从板上擦洗到PBS中。调整细胞液的浊度在600nm处为0.10，在96孔Nune F免疫测试板(Nunc，Roskilde，Denmark)的测试孔中加入100μl细胞。细胞37℃干燥过夜，Mylar测试板封条密封，4℃保存至需要时。在试验的当天，加入含0.1％吐温(Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer[BLOTTO])20的5％脱脂乳PBS溶液，封闭残留的蛋白质结合位置，并在37℃孵育1小时。然后去除封闭溶液，用blotto在测试孔中连续稀释100μl血清。血清在37℃孵育1小时。测试板各孔以含有0.1％吐温20的300ml PBS中浸泡30秒，用Skatro测试板洗涤器进行3次5秒钟的洗涤，以blotto按1∶1000稀释交联碱性磷酸酶(BioSource)的山羊抗小鼠IgG，各测试板孔与之37℃孵育1小时。将磷酸对硝基苯在二乙醇胺缓冲液中溶解成1mg/ml，测试板经洗涤后每孔加入100μl该溶液室温显影。在各孔中加入50μl的3N NaOH终止显影。在405nm处读取各孔吸光度，利用线性回归(linearregression)计算滴度。滴度表示为外推至吸光值为0.10单位时稀释度的倒数。

就针对纯化蛋白的ELISA而言，在含有0.02％叠氮钠(Sigma Chemical Co.)的50mM碳酸钠缓冲液(pH9.8)中将此蛋白质稀释至5μg/ml。在96孔E.I.A./R.I.A.培养基结合性ELISA测试板(Costar Corp.，Cambridge，MA)的各孔中加入100μl，4℃孵育16小时。洗涤测试板，然后如上所述按全细胞ELISA程序同样处理。

补体依赖性灭菌试验。为了进行该试验，20μl的细菌悬浮液在PBS中含有约1200cfu细菌，PBS中添加有0.1mM CaCl₂；MgCl₂和0.1％明胶(PCMG)，将此细菌悬浮液与20μl以PCMG稀释血清混合，4℃孵育30分钟。按前述(Chen等，1996)制备补体，以20％的浓度将其加入，混合，35℃孵育30分钟。用200μl4℃冷PCMG稀释来终止该试验。取50μl悬浮液铺在Mueller-Hinton平板上。另一样品中用热灭活的补体代替活性补体，将样品中cfu的百分比降低与对照样品的相比较，来计算相对杀死率。

抑制细菌对HEp-2细胞的粘附。研究了特异性抗体对细菌粘附HEp-2细胞的作用。将悬浮于300μl RPMI-10中的总共5×10⁴个HEp-2细胞加入无菌的8格Lab-Tek腔式玻片培养器(Nunc，Inc.，Naperville，III)中，在5％CO₂的培养箱中培养过夜，在玻片上获得细胞单层。用PBS洗涤玻片，与300μl细菌悬浮液(A₅₅₀＝0.5)或与事先与抗血清(1∶100)孵育过的细菌悬浮液一起37℃孵育1小时。然后用PBS洗涤玻片，按照生产商的说明用Difco快速染料染色。用配有相机的光学显微镜(Nikon Microphot-SA，Nikon，Tokyo，Japan)观察玻片并拍照。

蛋白质与纤连蛋白和玻连蛋白的反应。用斑点印迹来检查纯化UspA1和UspA2与纤连蛋白的反应。将人血浆纤连蛋白(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)点印在硝酸纤维素薄膜上，此薄膜在室温下用blotto封闭1小时。然后用PBS洗涤印迹，与纯化的UspA1或UspA2(2μg/ml的blotto溶液)4℃孵育过夜。用PBS洗涤3次后，该薄膜与MAb 17C7的blotto稀释液室温孵育2小时，然后与碱性磷酸酶交联的山羊抗小鼠免疫球蛋白(BIO-RAD Lab，Hercules，Calif.)(1∶2,000以5％脱脂牛乳的PBS溶液配制)室温孵育2小时。最后，用底物溶液显影薄膜，所述的底物溶液为氮蓝四唑和5-溴-氯-3-吲哚磷酸酯以0.1M Tris-HCl缓冲液(pH9.8)配成的溶液。

以相同的方法检查了与玻连蛋白的反应。将纯化的UspA1和UspA2点印在硝酸纤维素薄膜上，薄膜用blotto封闭。然后薄膜先后与人血浆玻连蛋白(GIBCOBRL，Grand Island，N.Y.，1μg/ml的blotto溶液)、家兔抗人玻连蛋白血清(GIBCOBRL)、山羊抗家兔IgG-碱性磷酸酶交联物和底物孵育。

纯化蛋白与HEp-2细胞的反应。给96孔培养板(Costar Corp.，Cambridge，Mass)的各孔接种含于0.2ml(含10％胎牛血清)RPMI中的5×10⁴HEp-2细胞，在5％CO₂培养箱中37℃孵育过夜。加入纯化的UspA1或UspA2(1至1,000ng)的blotto溶液，37℃孵育2小时。用PBS洗涤培养板，与小鼠抗血清对UspA1或UspA2(以含5％脱脂牛乳的PBS作1∶1000稀释)的1∶1混合液一起孵育，洗涤培养板，并与辣根过氧化物酶交联的家兔抗小鼠IgG(Brookwood Biomedical，Birmingham，AL)(以含5％脱脂奶的PBS作1∶500稀释)室温孵育1小时.最后，洗涤培养板，用底物溶液显影，底物溶液为2，2’-偶氮-双-(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)，以pH4.0含有0.03％过氧化氢的乙酸缓冲液(KPL，Gaithersburg，MD)配成0.3mg/ml溶液.以O35E菌株全菌作为阳性对照。被测的最高细菌浓度的光密度为A₅₅₀＝1.0。图7中细菌数据图中横坐标是细菌悬浮液三倍稀释所相应的值。

结果

UspA1和UspA2的纯化。本发明人发明了一种大规模、高产量的方法用于从粘膜炎莫拉菌细胞沉淀中提取和纯化UspA2。该方法由3个关键步骤构成。首先，用pH8.0的0.03M THT从细菌中提取UspA2蛋白。其次，将细胞提取物上样在TMAE柱上，用NaCl洗脱UspA2蛋白。最后，富集TMAE层析的组份，将其上样在陶土羟基磷灰石柱上，用线性梯度的NaPO₄溶液洗脱UspA2。从约400g湿重的粘膜炎莫拉菌O35E细胞中一般可获得250mg纯化的UspA2。通过考马斯亮蓝染色，在SDS-PAGE凝胶中可以看到单独一条UspA2带。这对应于约240,000的分子量，经扫描光密度测定此蛋白质高于95％(图6A)。UspA2制备物中可用Western法检测但用考马斯亮兰染色不能检测到的、与17C7MAb反应的第二条带分子量大约125,000(图6C)。细胞无需裂解就可获得如此高的产量，这提示，该蛋白大量存在于细菌的表面。

本发明还发展了一种纯化UspA1的方法，通过在最初的提取和TMAE层析步骤，与UspA2共纯化出该蛋白。但是，在羟基磷灰石层析后，UspA1仍然结合在柱上，必须用较高的盐浓度500mM NaPO₄来洗脱。这一步得到的粗UspA1制剂再上样到羟基磷灰石柱上，并用线性梯度磷酸钠洗脱。从约1.6kg湿重的粘膜炎莫拉菌O35E菌株细胞可分离得到总共80mg纯化的UspA1。根据样品制备的方法，用这种方法纯化的UspA1在SDS-PAGE中迁移时有3种不同的表观大小。未热处理的样品表现出约280,000的单一条带，100℃加热3分钟的样品迁移的表观分子量约350,000。100℃延长加热时间，350,000条带变为100,000条带(图6B)。样品经100℃加热7分钟后，根据考马斯亮蓝染色凝胶的扫描光密度测定，100,000条带含有95％以上的此蛋白质。相比之下，SDS-PAGE检查时，UspA2都迁移到240,000位置，与加热时间无关。这一迁移行为的差异表明，此制剂中含有两种明显不同的蛋白质。

分子量测定。在70％(v/v)乙腈水溶液和0.1％TFA存在下，用3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸基质，用MALDI-TOF质谱分析测定UspA2的分子量，结果鉴定的主要物质平均分子量为59,518Da。此外，除了预计到的[M+H]⁺和[M+2H]²⁺离子，还发现了[2M+H]⁺和[3M+H]⁺离子。后两种离子与二聚体和三聚体相符。使用类似的条件，本发明人无法测定UspA1的质量。

为了测定溶液中纯化蛋白的分子量，将UspA1和UspA2分别上样到Superose-6 HR 10/30凝胶过滤柱(最佳分离范围：5,000-5,000,000)上，该柱已经分子量标准物标定过。纯化的UspA1表现出的天然分子量为1,150,000，UspA2的分子量为830,000。但是，上述大小会受到TX-100存在的影响。

UspA1和UspA2内部肽的N末端序列分析。尝试了各种方法来分析UspA和UspA2的N末端序列，但是都不成功。没有确定任何序列。这表明了两点。首先，两种蛋白的N末端都被封闭，第二，两种蛋白质制剂中都不含N末端未被封闭的污染性蛋白质。

所以，为了确认纯化的UspA1和UspA2的一级序列与根据它们各自基因序列所推定的序列是否一致，生产了内部肽片段来进行N末端序列分析。表X和XI分别显示消化UspA1和UspA2蛋白所产生的片段的N末端序列。各片段显示，它们的序列与根据各自基因序列所推定的一级氨基酸序列一致。UspA2的片段3和片段4表现出与根据UspA1基因推定的氨基酸序列中残基505-515和605-614的序列相似性。在表XII中，UspA1的片段3表现出与UspA2一级序列中残基278至294的序列相似性。这些序列与UspA1和UspA2中的结构域相对照享有93％序列相同性。但是，此序列的其余部分为两蛋白各所特有。

表X

UspA2肽内部剪切片段的N末端序列

UspA2片段序列^a 一致^b 剪切1)LL AEQQLNG SEQ ID NO：73 92-100 胰蛋白酶2)ALESNVEEGL SEQ ID NO：74 216-225 Lys-C

245-254

274-2833)ALESNVEEGLLDLS SEQ ID NO：75 274-288 胰蛋白酶

^*505-5154)AKASAANTDR SEQ ID NO：76 378-387 靡蛋白酶

^*605-6145)AATAADAITKNGN SEQ ID NO：77 439-450 靡蛋白酶6)SITDLGTKVDGFDGR SEQ ID NO：78 458-472 Lys-C7)V DALXTKVNALDXKVN SEQ ID NO：79 473-488 胰蛋白酶8)AA QAALSGLF VPYSVGKFNATAALGGYGSK 506-535 CNBrSEQ ID NO：80

^a加有下划线的残基表示与根据核苷酸序列推定的氨基酸序列不一致。不能确定的模糊残基用X表示。

^b星号(^*)表示与UspA1一致。没有星号的表示与根据UspA2核苷酸序列推定的氨基酸序列一致。

表XI

UspA1肽内部剪切片段的N末端序列

UspA1片段序列^a 一致^b 剪切

1)LENNVEE PXLNLS 456-468 Lys-C

2)DQKADI 473-478 胰蛋白酶

3)NNVEEGLLDLSGRLIDQK 504-521 Lys-C

^*278-294

4)VA EGFEIF 690-697 胰蛋白酶

5)AGIATNKQELILQNDRLNRI 701-720 Lys-C

^a和表X一样，X表示不确定的氨基酸残基。

^b星号(^*)表示与UspA2一致。没有星号的表示与根据UspA1核苷酸序列推定的氨基酸序列一致。

MAb与UspA1和UspA2的反应性。纯化UspA1和UspA2的Western印迹分析显示，如Helminen等(1994)所述，两种蛋白都与MAb 17C7有强反应(图7)。对这些蛋白与其它MAb的反应性也进行了研究。表XII中的数据显示，不论是ELISA或Wstern印迹测试，MAb 13-1，29-31和45-2只与UspA2反应，MAb 7D7，29C6，11A6和12D5只与UspA1反应。当用ELISA检查时，表XIII显示所有MAb都结合全细菌。以上结果表明，UspA2暴露在细菌表面上。

表XII

概述单克隆抗体与纯化UspA1、UspA2和完整的O35E细胞的反应性

mAb 同种异型反应性

全细菌^a 纯化UspA1^b 纯化UspA2^b

13-1 IgGlк + - +

29-31 IgGlλ + - +

45-2 IgG2a + - +

17C7 IgG2a + + +

6-3 IgM + + +

7D7 IgG2b + + -

29C6 IgG1 + + -

11A6 IgA + + -

12D5 IgG1 + + -

^a经全细胞ELISA测定。

^b经ELISA和Western印迹法测定。

表XIII

抗体与UspA1和UspA2蛋白的交叉反应性

针对以下抗原的抗血清对以下抗原的ELISA滴度的几何平均值^b

UspA1 UspA2

UspA1^a 740,642^c 10,748^c

UspA2^a 19,120^d 37,615^d

^a血清的制备参见说明书。

^b ELISA滴度是十只小鼠珠合并血清IgG和IgM的总滴度。

^c根据Wilcoxon signed rank test，两种纯化蛋白的抗UspA1滴度差异有统计学差异(p＝0.0002)

^d根据Wilcoxon signed rank test，两种纯化蛋白的抗UspA2滴度差异有统计学差异(p＝0.01)

免疫原性和抗体交叉反应性。在小鼠体内产生抗纯化UspA1和UspA2蛋白的抗血清。用各个纯化蛋白(表XIII)，通过ELISA试验来测定这些血清中抗原特异性抗体(IgG和IgM)以及交叉反应性抗体的滴度。两种蛋白引发的对自身的抗体滴度都高于对异源蛋白的滴度。所以，单克隆抗体(表XII)和多克隆抗体的反应性显示，这两种蛋白质都拥有共有的和非共有的B细胞表位。

对细菌全细胞的抗体反应性和灭菌活性。用全细胞ELISA检测抗UspA1和UspA2抗血清对同源性O35E菌株和数种异源分离株的反应性(表XIV)。抗UspA1和抗UspA2的抗体与O35E菌株的反应最强烈。血清与异源分离株具有反应性表明，它们与UspA1和UspA2引发的抗体都结合。

表XIV纯化UspA1和纯化UspA2引发的针对粘膜炎莫拉菌多种分离株的细菌全细胞的

ELISA和补体介导灭菌滴度

全细胞ELISA ^a 灭菌滴度 ^b

分离株抗UspA1^a 抗UspA2^a 抗UspA1 抗UspA2

O35E 195,261 133,492 400 800

430-345 12,693 18,217 400 400

1230-359 7,873 13,772 400 400

TTA24 14,341 7,770 800 800

^a测定的是十只小鼠合并血清的滴度。首次接种后抽取的血清对所有分离株的滴度都低于50。

^b灭菌滴度即杀死50％以上细菌的是高血清稀释度的倒数。同时以CRM₁₉₇免疫的小鼠血清滴度低于100。

测定了抗UspA1和UspA2抗血清对O35E和其它分离株的灭菌活性(表XIV)。对O35E和疾病分离株，两种血清的灭菌滴度都在400至800之间。作为阴性对照的抗CRM₁₉₇血清和免疫前抽取的血清对所有分离株的滴度都低于100。以上结果与先前的观察到的：两种蛋白享有的共同表位在分离株中高度保守，而且针对这些分离株的抗体具有灭菌活性的结果相一致。

肺攻击。用同源性O35E菌株或异源性TTA24菌株对免疫小鼠进行肺攻击。与用CRM197免疫的对照小鼠相比，不论小鼠是用UspA1或UspA2免疫，观察到对两种毒株的清除作用都增强(表XV)。在用UspA1和UspA2免疫的小鼠两组间，没有发现统计学差异(p＞0.05)。

表XV

纯化UspA1和UspA2免疫接种小鼠对粘膜炎莫拉菌的肺清除研究免疫原攻击菌株清除％^a p^a1 UspA1 O35E 49.0 0.013

UspA2 31.8 0.05

CRM₁₉₇ 0 -2 UspA1 TTA24 54.6 0.02

UspA2 66.6 0.0003

CRM₁₉₇ 0 -

^a攻击方法参见说明书。所示的数字是与用CRM₁₉₇免疫的对照小鼠相比，被免疫小鼠清除的细菌的百分比。

纯化蛋白与HEp-2细胞的反应。用ELISA，在96孔测试板中测试纯化UspA1和UspA2与HEp-2细胞单层反应的能力。将小鼠抗血清与UspA1和UspA2按1∶1混合时，检测蛋白质与HEp-2细胞的结合。在高于10ng的浓度时纯化UspA1与HEP-2细胞结合。在100ng以上浓度，检测到UspA2与细胞的微弱结合(图7)。O35E细菌与HEp-2细胞的粘着作为阳性对照。以上结果，再加上有数据显示抗UspA1抗体抑制细菌与HEp-2细胞的粘着，由此提示，UspA1在细菌粘着过程中起着重要作用，还提示UspA1暴露在细菌的表面。

纯化蛋白与纤连蛋白和玻连蛋白的反应。用斑点印迹试验测试了纯化蛋白与纤连蛋白和玻连蛋白反应的能力。固定在硝酸纤维素薄膜上的人血浆纤连蛋白结合纯化的UspA1但不结合UspA2(图8)，而固定在硝酸纤维素薄膜上的UspA2能够结合玻连蛋白(图8)。UspA1结合玻连蛋白也被检测到了，但是反应性很弱。还测试了胶原(IV型)、猪粘液素(III型)、胎球蛋白和肝素与纯化UspA1和UspA2的反应，但是它们都没有显示出可测知的结合。

讨论

过去纯化UspA的尝试，获得的制品经SDS-PAGE和Western印迹分析，都含有多种高分子量蛋白质带。因为各带都与“UspA特异性”MAb 17C7反应，认为它们代表了UspA蛋白的多种形式(Chen等，1996)。但是，本发明人发现，有两种不同的蛋白质，UspA1和UspA2，它们享有一个被”MAb 17C7识别的相同表位。这两种蛋白由不同的基因编码。此研究显示，UspA1和UspA2可以相互分离。分离后的蛋白质具有不同的SDS-PAGE迁移特性，与一组单克隆抗体不同的反应性，和不同的内部肽序列。但是，这些结果与它们享有一段包括MAb17C7表位在内的相同肽序列这一点并不相违。将两种蛋白质彼此分离使得本发明人能够进一步阐明两蛋白质的差别，并研究它们的生物化学、功能和免疫学方面的特征。

在溶液中，此二纯化蛋白表现为各自亚基通过强的非共价键结合在一起的均聚物。这一点由以下事实表明，即UspA2没有半胱氨酸，用还原剂处理两种蛋白都不改变它们在SDS-PAGE中的迁移特性。两种基因具有亮氨酸拉链基序，该基序可能介导了交织螺旋型相互作用(O’Shea等，1991)。即便如此，出人意料的是，两种蛋白的非共价键其强度不仅足以抵抗制备SDS-PAGE样品通常所用条件的解离作用，而且足以抵抗高浓度螯合剂例如脲(Klingman和Murphy，1994)和盐酸胍的作用。在两种蛋白质中，UspA2看起来聚集地不太紧密，质谱测定可测得其59,500Da的亚基，表明了这一点。但是，UspA1能够抵抗所试过的所有方法的解离，这可能是其分子量无法用质谱法测得的原因。在SDS-PAGE中，大部分UspA2迁移的表观大小为240,000，很少的一部分为125,000，而且只能被Western印迹测得。但是，UspA1的迁移率根据样品被加热是时间长短而不同。最小的形式约100,000。这与从uspA1突变基因中遗失的基因产物的大小是一致的，但与根据基因序列推定的88,000Da不一致。在溶液中，两种蛋白质都形成了比在SDS-PAGE中所见要大的凝聚体。根据凝胶过滤层析测定，UspA1和UspA2各自凝聚体的大小分别为1,150,000和830,000。如果蛋白质在体内也是这样，UspA1和UspA2很可能以大分子复合物的形式存在于细菌的表面。

对UspA1和UspA2衍生肽N末端氨基酸序列分析的结果与根据各自基因序列推定的蛋白质序列一致。这证实了纯化的UspA1和UspA2是各自uspA1和uspA2基因的产物。而且，根据蛋白质大小和准确的氨基酸测定，UspA1和UspA2的实验氨基酸组成与理论氨基酸组成是一致的。但是，在质谱测得的大小59,518和根据UspA2基因序列显示的大小62,483之间存在差异。这一差异提示，该蛋白或者经历了翻译后加工，或者受蛋白酶降解。

以上数据还提示，两种蛋白都暴露在细菌的表面。我们发现Mab 17C7和多克隆血清与全细胞反应，这证明至少有一种蛋白质暴露在外。在全细胞ELISA中。UspA2特异性单克隆抗体13-1，29-31和45-2能够与细菌细胞反应，这证明UspA2是表面蛋白(表XII)。在全细胞ELISA中。UspA1特异性单克隆抗体7D7，29C6，11A6和12D5能够与细菌细胞反应，这证明UspA1是表面蛋白(表XII)。抗血清对于细菌与HEp-2细胞的附着具有抑制作用，这是UspA1暴露于表面的进一步证据。抗UspA2的血清没有这一活性。所以，UspA1和UspA2看来都暴露在细菌的表面。

蛋白质暴露于表面可能对此两种蛋白的功能十分重要的。UspA1功能之一好象是介导与宿主组织的粘着。UspA1抗体抑制细菌与HEp-2细胞的结合，而纯化蛋白本身能与细胞结合，这证明了上述功能。结合HEp-2细胞的意义在于，这些细胞是来自喉部(粘膜炎莫拉菌的常见集聚部位)的上皮细胞(Schalen等，1992)。这证实了本发明人的发现：不表达UspA1的突变体不能结合上皮细胞。本发明人还证明，UspA1结合纤连蛋白。据报道，纤连蛋白是其它病原体的宿主受体(Ljungh和Wadstrom，1995；Westerlund和Korhonen，1993)。但是，对其基因序列的研究没能发现与报道的纤连蛋白的革兰阳性菌结合性基序(Westerlund和Korhonen，1993)有任何相似性。所以，显然，UspA1可能通过细胞结合有关的纤连蛋白在与宿主的粘附中起着作用。

UspA2的功能较不确定。它的抗体不阻断与HEp-2细胞或Chang细胞系的结合，该纯化蛋白也不结合上述细胞。但是，UspA2与玻连蛋白紧密结合。已经证明，病原体结合玻连蛋白与宿主细胞粘附有联系(Gomez-Duarte等，1997；Limper等，1993)；但是，Van Dijk及其同事报告说，粘膜炎莫拉菌与玻连蛋白的结合可能被细菌利用来扰乱宿主的防御功能(Verdium等，2994)。被称为补体因子S的玻连蛋白可溶形式调节膜攻击复合物的形成(Su，1996)。他们提出，玻连蛋白与粘膜炎莫拉菌表面的结合抑制了膜攻击复合物的形成，使得细菌能够抵抗血清的补体依赖性杀伤作用。他们还说明了两种人分离株：一种结合玻连蛋白并耐血清的裂解活性，另一种不结合玻连蛋白，对血清敏感(Hol等，1993)、但是必须注意的是，玻连蛋白象所有的细胞外基质蛋白一样，在宿主内具有多种形式，起着多种作用(Preissner，1991；Seiffert，1997)。所以，UspA1和UspA2与胞外基质蛋白纤连蛋白和玻连蛋白的反应也许对细菌有利，不仅扰乱宿主的防御，或者作为细菌粘附的受体。

虽然两种蛋白享有相同的表位和序列，它们的生物化学活性是不同的，而且可能具有不同的生物功能。如果对各个蛋白的免疫应答干扰了它的功能，该蛋白应该考虑作为候选疫苗。在小鼠内进行的免疫学研究结果显示，两种蛋白都是良好的候选疫苗。用UspA1或UspA2免疫的小鼠都产生了对同源或异源分离菌株的高抗体滴度。而且，这些小鼠的血清对所有被测的分离株都具有补体依赖性灭菌活性。此外，免疫小鼠肺显示出清除同源和异源分离株的能力加强。重要的是应注意，两蛋白引发的抗体具有部分交叉反应性。这是预料之中的，因为它们都与17C7 Mab反应，而且具有相同的氨基酸序列。

实施例V：儿童和成人的抗蛋白质UspA1和UspA2抗体的水平和灭菌能力

为了测定人体是否自然获得抗粘膜炎莫拉菌UspA1和UspA2的抗体，以及如果有时，这些抗体的生物活性，用ELISA和灭菌试验检查了各种年龄健康人的血清。我们发现，健康人在他们的血清中自然获得抗UspA1和UspA2的抗体，这些抗体的水平及其灭菌能力随年龄而不同。这些结果还表明，自然获得的抗UspA1和UspA2抗体具有生物功能，所以它们可以用作预防粘膜炎莫拉菌病的候选疫苗。

材料与方法

细菌。粘膜炎莫拉菌O35E和TTA24参见实施例I。还使用了一种ATCC菌株(ATCC 25238)和发明人收集的另3种临床分离株。

人血清。由接受过常规儿童期免疫的2、4、6、7、15和18月龄的儿童组成一组，从中采集了58份血清样品。还测试了26名成人和另外15名18至36月龄儿童的个体血清。所有血清都获自临床健康的个体。没有收集到粘膜炎莫拉菌集结和感染这些个体的信息。血清保存在-70℃。

UspA1和UspA2的纯化。如本发明实施例I所述，从粘膜炎莫拉菌O35E菌株制备纯化的UspA1和UspA2。根据对考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE的光密度扫描，各蛋白制剂中各自特异性蛋白的含量高于95％。根据采用单克隆抗体的Western印迹分析，各蛋白都没有检测到被对方所污染。

从人血浆中纯化UspA1和UspA2特异性抗体。两位健康成人的血清获自American Red Cross(Rochester，N.Y.)，将它们合并。加入浓度为50％饱和浓度的硫酸铵，沉淀抗体。离心收集沉淀，用PBS透析。硝酸纤维素薄膜(2×3英寸)与UspA1或UspA2(0.5mg/ml，溶于含0.1％(v/v)Triton X-100的PBS)室温孵育1小时，用PBS洗涤两次，用5％(w/v)的脱脂乳PBS溶液室温孵育2小时，封闭薄膜上残留的结合位点。此膜依次用PBS、100mM甘氨酸(pH2.5)、最后用PBS洗两次，再与透析过的抗体制剂孵育。4℃孵育4小时后薄膜先后用PBS和含有1M氯化钠的100mM Tris缓冲液(pH8.0)洗涤两次，去除非特异性蛋白。在5ml100mM甘氨酸(pH2.5)中振荡孵育2分钟，洗脱结合的抗体。立即在洗脱液中加入1ml Tris-HCl(1M，pH8.0)使pH为中性。洗脱的抗体经PBS透析后保存于-20℃。

酶联免疫吸附测试(ELISA)。如现有技术所述，用生物素标记的家兔抗人IgG或IgA抗体(Brookwood Biomedical，Birminham，Alabama)(Chen等，1996)，用全细胞ELISA来测定抗体抗O35E以及其它粘膜炎莫拉菌株的抗体滴度。用类似方法测定抗UspA1和UspA2的抗体滴度，所不同的是测试板每孔包被以0.1μg纯化蛋白/100μl PBS溶液，室温孵育过夜。用碱性磷酸酶交联的绵羊抗人IgG亚类抗体(The Binding Site Ltd.，San Diego，Calif.)来测定抗UspA1或UspA2的IgG亚类抗体。将A₄₁₅比对照高3倍时的最高血清稀释度认定为抗体的终点滴度，对照孔受到除人血清外的所有处理通常具有的吸光度范围在0.03至0.06之间。

通过ELISA来测定生物素标记的家兔抗人IgG和IgA抗体抗纯化的人IgG、IgM和IgA(Pierce，Rockford，IL)的特异性。没有发现交叉反应性。在ELISA中通过测定纯化的人相应同型抗体而确定的试验灵敏度，IgG和IgA试验分别为15ng/ml和60ng/ml。同样，在ELISA中确认了人IgG亚类抗体试验对纯化的人骨髓瘤IgG亚类蛋白(ICN Biomedicals，Inc.，Irvine，CA)的特异性，在IgGl、IgG3和IgG4的试验中，试验灵敏度为15ng/ml，在IgG2试验中灵敏度为120ng/ml。将两个对照血清作为试验与试验变化的对照。

补体依赖的灭菌试验。根据已有描述测定了人血清的灭菌活性(Chen等，1996)。在有些研究中，在试验前用纯化的UspA1或UspA2来吸附血清。通过加入纯化蛋白(最终浓度为20或50μg/ml)来进行这些血清的特异性抗体吸收。血清的最终稀释度为1∶10。混合物4℃孵育2小时，微离心去除沉淀。以类似的方法，用5种粘膜炎莫拉菌对纯化的抗UspA1和UspA2特异性人抗体进行了测试。

统计学处理。用JMP软件(SAS institute，Cary，N.C.)对对数转化的滴度进行了统计学分析。为了进行转化，将最低血清稀释度的半值定为无可测滴度的血清。通过方差(variance)分析来比较年龄组之间的IgG水平，通过逻辑(logistic)回归来确定抗体滴度和灭菌滴度之间的关系。p值低于0.05被认为有显著意义。

结果

儿童和成人血清IgG和IgA抗UspA1和UspA2滴度的比较。采集2至18月龄10名儿童和18至36月龄15名儿童，以及26个成人随机血清样品，用ELISA测试其中IgG和IgA抗体抗O35E菌株全细胞、纯化UspA1和纯化UspA2的滴度。在几乎所有血清中测到了抗所有三种抗原的IgG滴度(图9)。与抗O35E菌的IgG滴度相比，抗UspA1和UspA2的IgG滴度表现出很强的年龄依赖性变化(图9)。与各年龄儿童的血清相比，成人血清抗二种纯化蛋白的IgG滴度明显较高(p＜0.01)。6至7月龄儿童血清抗UspA蛋白的IgG滴度最低，该月龄的平均滴度明显低于2月龄的(p＜0.05)。

抗UspA1、UspA2和O35E细菌细胞的IgA抗体水平是年龄依赖性的(图9)。测定了全部26名成人和18至36月龄儿童的抗UspA1和UspA2血清IgA滴度。18月龄以下儿童表现出抗原特异性IgA滴度的比例随年龄增加。在最初7个月，这些血清中的抗UspA1、UspA2或O35E细菌平均IgA滴度很低，但是随后逐渐升高。(图9)

抗UspA1和UspA2的IgG抗体的年龄依赖性亚类分布。测定了10名成人的血清和35名儿童血清抗UspA1和UspA2抗原的IgG亚类滴度。发现亚类的分布具有年龄依赖性。最主要的抗UspA1和UspA2抗体是IgG1和IgG3亚类，它们存在于所有血清中。IgG2和IgG4滴度要么无法测得要么极低。所以，本发明只报告有关IgG1和IgG3的数据(图10)。在成人血清中抗UspA1或UspA2的IgG3滴度明显高于IgG1滴度(p＜0.05)。在2月龄儿童的血清中也发现了相同的亚类分布情况，但是IgG1和IgG3滴度之间的差异还未到达统计学上的意义，这可能是因为样品规模较小。4至36月龄儿童的血清具有类似的亚类分布情况，但是与成人和2月龄儿童的不同。这些儿童血清中的IgG1滴度高于或等于IgG3滴度。在这些儿童的血清中，抗UspA1或UspA2的IgG1平均滴度明显高于对相同抗原的IgG3滴度(p＜0.05)。

灭菌活性。测定了17份代表不同年龄组的血清的灭菌滴度(表XVI)。具有抗UspA蛋白的高IgG滴度的全部成人血清和5份2月龄儿童血清中的3份，具有强灭菌活性。6月龄儿童血清的灭菌活性最低。该年龄的5份血清具有极限灭菌滴度50，这是所测得的最低稀释度。18至36月龄儿童血清的灭菌滴度差异很大，滴度范围从50以下到500。根据逻辑回归分析，灭菌滴度与抗UspA1和UspA2两者的IgG抗体滴度之间有着明显的线性关系(p＜0.01)(图11)。

表XVI

正常人血清抗UspA1和UspA2的IgG抗体水平以及血清灭菌活性被测者^a 年龄 ELISA IgG滴度^b BC滴度^c

UspA1 UspA2

1 2月 17,127 6,268 500

6月 4,273 1,363 50

15月 798 250 ＜50

2 2月 12,078 12,224 500

6月 1,357 878 50

18月 14,041 14,488 200

3 2月 30,283 20,362 500

6月 1,077 1,947 50

18月 2,487 1,475 ＜50

4 2月 2,086 869 ＜50

6月 530 802 50

18月 9,767 8,591 200

5 2月 3,233 2,655 ＜50

6月 2,246 360 50

18月 26,693 43,703 500

6 1.5-3年 4,036 2,686 50

7 1.5-3年 2,037 1,251 50

8 1.5-3年 341 251 ＜50

9 1.5-3年 2,538 1,200 500

10 1.5-3年 1078 1,370 500

11 1.5-3年 1,265 953 50

12 成人 161,750 87,180 450

13 成人 873,680 248,290 ＞1350

14 成人 154,650 146,900 450

15 成人 10,330 7,860 50

16 成人 35,780 31,230 150

17 成人 19,130 132,200 450

^a收集所述年龄被测者1至5的三份连续样品。

^b将A₄₁₅比背景高3倍的最高血清稀释度作为抗O35E的纯化UspA1或UspA2的ELISA终点滴度。

^cBC滴度：测试抗O35E的灭菌滴度。血清以1∶50，1∶100，1∶200和1∶500稀释度接受测试。将与对照相比杀死50％或以上细菌的最高血清稀释度作为灭菌滴度。对照菌与测试血清和热灭活补体血清一起孵育。

用纯化UspA1或UspA2吸收的血清的灭菌活性。因为Western印迹显示，普通人血清含有抗粘膜炎莫拉菌多种抗原的抗体，所以用吸收法来确定UspA1和UspA2特异性抗体对灭菌活性的贡献。用纯化的UspA1或UspA2吸收6份成人血清，测定抗UspA蛋白的ELISA反应性变化。吸收后，所有血清的ELISA反应性均见下降(表XVII)。而且，用一个蛋白吸收造成对另一蛋白的IgG滴度下降。不论吸收剂是UspA1或UspA2，UspA2反应性下降的程度相同。相反，用UspA2吸收后UspA1反应性降低小于用UspA1吸收后的(表XVII)。这表明，抗UspA1和UspA2的抗体是部分交叉反应性的抗体。

表XVII

吸收前后成人血清的ELISA滴度^a

吸收剂样品中的抗UspA1的IgG滴度^b

#1 #2 #3 #4 #5 #6

盐水 161,750 873,680 154,650 10,330 35,780 19,130

UspA1 2,450 2,210 3,160 1,650 ＜500 3,010

UspA2 42,620 90,150 33,570 6,420 3,490 4,130

抗UspA2的IgG滴度^b

盐水 87,180 248,290 146,900 7,860 31,230 13,200

UspA1 2,800 2,120 2,700 2,220 ＜500 ＜500

UspA2 ＜500 1,820 3,010 2,960 ＜500 ＜500

^a吸收(过程)：稀释一份成人血清，加入O35E细菌的纯化UspA1或UspA2至最终蛋白浓度为50μg/ml，最终血清的稀释度为1∶10。将混合物4℃孵育2小时，微离心去除沉淀。

^b从1∶500的血清稀释度开始，测得终点滴度，即为抗UspA1和UspA2的IgG滴度。

测定吸收后血清的灭菌滴度，并与吸收前所见滴度比较(表XVIII)。在对O35E菌株(从该菌株制得纯化的蛋白)进行试验时，吸收UspA1或UspA2将导致所有6份血清完全丧失灭菌活性(＜50)(表XVIIII)。另外，在对异源菌株1230-359进行试验时，吸收后的血清的灭菌活性也降低至少三倍。与用UspA2吸收相比，用UspA1吸收导致6份样品中有3份抗异源菌株的灭菌滴度的降低幅度较大(表XVIII)。该结果与吸收两种蛋白后抗UspA1 ELISA滴度降低程度的不同一致。用UspA1和UspA2的组合蛋白吸收不会时灭菌活性比单用UspA1有更进一步地减少。经western印迹法分析，所有6份人血清含有抗粘膜炎莫拉菌的74kDa OMP的抗体，而用纯化的74kDa蛋白吸收不会影响对O35E菌株或1230-357菌株的灭菌活性。这表明抗UspA蛋白的抗体是成人血清中抗粘膜炎莫拉菌的灭菌活性的主要来源。

表XVIII

吸收前后成人血清的灭菌滴度^a吸收剂样品中抗O35E菌株的灭菌滴度^b

#1 #2 #3 #4 #5 #6盐水 450 ＞1350 450 50 150 450UspA1 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50UspA2 ＜50 150 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50

抗1230-359菌株的灭菌滴度^b盐水 450 4050 ＞1350 150 150 450UspA1 50 150 ＜50 ＜50 50 150UspA2 150 1350 450 ＜50 50 50

^a血清与表XVII中所述相同。

^b灭菌滴度：用3倍系列稀释血清(从1∶50起)，测定抗O35E或1230-359菌株的灭菌活性。测得的导致50％或更高的杀死率的最高血清稀释度即为灭菌滴度。用来吸收的UspA1和UspA2蛋白从O35E菌株制得。

由于只获得很少体积的儿童血清，因此这些血清的吸收用UspA1和UspA2蛋白的混合物。吸收导致7份血清中有四份的灭菌活性完全丧失或明显降低(表XIX)。四份血清(包括三份来自两月龄儿童)在吸收前的初始灭菌滴度均大于等于200。另外三份在吸收时灭菌滴度没有变化的血清在吸收前的边缘滴度均为50。吸收后抗UspA蛋白的ELISA反应性减少确证了抗体浓度已经降低。这说明儿童血清中对UspA1和UspA2蛋白有特异性的抗体也是抗粘膜炎莫拉菌的灭菌活性的主要来源。

表XIX

用合并的纯化UspA1和UspA2吸收前后的儿童血清的灭菌活性^a

样品年龄未吸收的血清吸收后的血清

(月龄) A₄₁₅ ^b BC滴度^c A₄₁₅ ^b BC滴度^c

1 2 0.84 200 0.29 ＜50

2 2 0.93 200 0.19 ＜50

3 2 0.98 500 0.38 50

4 18 0.88 200 0.43 50

5 15 0.66 50 0.25 50

6 18 0.62 50 0.32 50

7 15 0.68 50 0.35 50

^a吸收：每份血清用O35E菌株的UspA1和UspA2蛋白混合物(最终蛋白浓度为200、50或20μg/ml)吸收。每份样品的三种吸收均观察到相同结果。只显示了用20μg/ml蛋白进行试验的数据。

^bA₄₁₅：ELISA中用UspA1和UspA2混合物作为检测抗原的吸收值。在1∶300稀释度下测试血清。

^cBC滴度：试验中导致O35E菌50％或更高致死率的最高血清稀释度。在1∶50、200和500的稀释度时测定血清。

亲和纯化的抗UspA1和UspA2抗体：为了证实它们的交叉反应性和灭菌活性，利用亲和层析过程从成人血浆中分离出抗UspA1或UspA2的抗体。在western印迹试验中，纯化的抗体与O35E裂解液中的UspA1和UspA2蛋白发生特异性反应，但是不与非UspA蛋白反应。在ELISA中，抗一种蛋白的纯化抗体也几乎等价地与另一蛋白反应(表XX)。在全细胞ELISA和灭菌试验中，两种抗体制品均表现出与5种粘膜炎莫拉菌菌株有反应性(表XXI)。抗所有5种粘膜炎莫拉菌菌株的灭菌滴度均在400至800范围内，这与纯化抗体制品中0.25-0.50μg/ml蛋白等价(表XXI)。

表XX

在ELISA中，亲和纯化的抗UspA1和UspA2人抗体的交叉反应性

纯化的抗体^a IgG滴度^b

UspA1 UspA2

抗UspA1 50468 20088

抗UspA2 53106 52834

^a用固定在硝酸纤维素膜上的O35E菌株的纯化的UspA1或UspA2进行免疫洗脱，从两位健康成人的血浆合并物中纯化出抗体。

^bELISA终点滴度是A₄₁₅值大于背景值三倍以上的最高抗体稀释度。

表XXI

亲和纯化的抗UspA1和UspA2人抗体的全细胞ELISA滴度和灭菌滴度

试验全细胞ELISA滴度^b BC滴度^c

菌株抗UspA1的抗抗UspA2的抗抗UspA1的抗抗UspA2的抗

体体体体

O35E 12553 9939 400 800

ATCC25238 30843 29512 400 400

TTA24 51511 57045 800 800

216：96 31150 23109 400 400

1230-359 8495 16458 800 800

^a纯化的抗体制品与表XX中所述相同。western印迹法证实纯化抗体对UspA蛋白有特异的反应性，但对其它外膜蛋白却没有。

^bELISA终点滴度是对全细菌细胞进行试验时，A₄₁₅值大于背景值三倍的最高抗体稀释度。

^cBC滴度：在试验中导致细菌接种物50％或更高杀死率的最高抗体稀释度。抗体(120μg/ml)在1：100、200、400和800的稀释度下进行测定。

讨论

以前检查抗粘膜炎莫拉菌全细胞或外膜蛋白的人抗体的研究通常集中于单一年龄组中。而且，大多数没有测定抗体的生物功能(Chapman等，1985)，诱导引起功能性抗体的抗原也未被鉴定出来。因此，以前的这些研究并没有提供关于天然获得的抗体在抵抗粘膜炎莫拉菌疾病中起保护作用的信息，也没有提供哪个抗原适于疫苗开发的明确信息。本研究的数据表明，抗UspA1和UspA2的IgG抗体存在于正常人血清中，它们的水平与年龄有关。这些抗体是儿童和成人体内血清灭菌活性的重要来源。

这些数据表明，两月龄的大多数儿童具有抗UspA1和UspA2的血清IgG抗体(尽管个体之间的水平不同)，且这些婴儿血清中的IgG亚类分布与成人血清中的相似。婴儿血清具有灭菌活性。吸收研究表明，这些血清中的大量灭菌抗体是针对UspA1和UspA2蛋白的。这些结果表示两月龄儿童中检测到的IgG抗体来自于母体。这与脐带血清含有抗粘膜炎莫拉菌全细胞抽提物的高滴度抗体的报道结果一致(Ejlertsen等，1994b)。

由于缺乏对研究对象的临床信息且本研究中的受检查对象数量较少，因此不能确定母亲的抗UspA抗体是否在幼儿中起保护作用(尽管在体外有灭菌作用)。然而，与15-18月龄的儿童相比，2月龄儿童具有明显较高的抗UspA蛋白的血清IgG滴度，而这些儿童中仅仅少数具有低水平的抗粘膜炎莫拉菌的IgA抗体。如果血清IgA反映了对细菌曾有粘膜接触，则大多数儿童在生命的前几个月中不会被粘膜炎莫拉菌感染。原因之一可能是母源抗体在此阶段存在于婴儿体内保护婴儿免受感染。这与婴儿在出生后几个月中很少会携带该细菌且不会发生粘膜炎莫拉菌疾病的发现(Ejlertsen等，1994a)是一致的。

随着母源抗体的消失，儿童变得易受粘膜炎莫拉菌感染。在本研究中，6-7个月龄儿童的血清具有最低水平的抗UspA IgG抗体和几乎检测不到的抗粘膜炎莫拉菌全细胞的灭菌滴度。在15个月时，几乎所有的儿童都具有抗UspA蛋白的血清IgA抗体，且与6-7个月龄的儿童相比，IgA抗体以及IgG抗体水平和灭菌活性均显著提高。这表明这些儿童已经接触细菌并已经建立了抗体应答。18-36个月龄儿童组的15份血清均有抗UspA蛋白的IgG和IgA滴度，而灭菌滴度有很大不同。较大儿童血清中的UspA特异性IgG抗体的特征与2月龄儿童的抗体不同。首先，在儿童血清中IgG1抗体滴度明显高于IgG3滴度，而在2月龄儿童体内却恰恰相反(图10)。第二，大多数2月龄儿童的血清具有灭菌活性，而6个月以上儿童的血清中却几乎检测不到灭菌活性。在6-36个月龄的儿童中发现抗体水平和血清灭菌活性较低，这与该年龄组儿童具有最高的定居率和最高的粘膜炎莫拉菌发病率的流行病学发现结果(Bluestone，1986；Ejlertsen等，1994b；Leinonen等，1981；Roitt等，1985；Ruuskanen和Heikkinen，1994；Sethi等，1995；Teele等，1989)是一致的。

对于成人，这一通常对粘膜炎莫拉菌感染由抵抗力的群体(Catlin，1990；Ejlertsen等，1994a)，发现他们的抗UspA蛋白IgG抗体水平和血清灭菌活性始终高于儿童。成人血清的灭菌活性很明显是由抗体介导的，因为免疫球蛋白缺失的血清没有活性(Chen等，1996)，且从成人血浆中纯化获得的抗体表现出依赖于补体的灭菌活性。单个分离株中的UspA1或UspA2从人血清中纯化出的抗体表现出能杀死多种菌株。该结果表明人在应答自然感染时产生了针对UspA蛋白的保守性表位的灭菌抗体。

在所有成人样品中，IgG抗体基本上是IgG1和IgG3亚类，其中IgG3较高。这与以前关于成人及4岁以上儿童(而非更年幼儿童)中对粘膜炎莫拉菌感染的免疫应答的主要组成是IgG3亚类的报道(Carson等，1994；Goldblatt等，1990)是一致的。在人的四种IgG亚类中，IgG3只组成了血清中全部免疫球蛋白的少量成分。然而，IgG3与C1q相互作用的亲和力最高，而该相互作用是经典的补体(激活)途径的初始步骤，从而导致补体依赖性杀死和调理吞噬来消除细菌(Roitt等，1985)。由于IgG3抗体有效地转移到胎盘中，因此它也可以赋予婴儿保护性免疫力。这一研究的数据表明，抗UspA蛋白的IgG3抗体是免疫应答自然感染的重要成分，并有体外生物活性。

由于没有收集到关于研究对象粘膜炎莫拉菌感染的临床资料，因此不知道抗UspA1或UspA2的抗体是怎样诱导产生的。当用western印迹法测定通过豚鼠中对抗UspA蛋白制得的抗体与其它细菌种类(包括绿脓杆菌、脑膜炎萘瑟菌、淋病萘瑟菌、百日咳博德特菌、大肠杆菌和非典型(nontypable)流感嗜血杆菌)的反应性时，没有检测到有反应性。这表明，抗体是由对粘膜炎莫拉菌UspA抗原的特异性应答引起的。这与该生物体在人群体中较高的定居率和地方性特征相符。由于抗两种UspA蛋白的亲和纯化抗体是交叉反应的，因此不能确定人抗体是由一种还是两种蛋白引起的。看来很明显这两种蛋白之间的共享序列是灭菌性抗体的主要靶。

总之，这一研究证实抗两种UspA蛋白的抗体存在于几乎人中(不论年龄大小)。然而，这些抗体的总体水平和亚类分布依赖于年龄。抗UspA1和UspA2的IgG抗体是交叉反应的，并且是成人中血清灭菌活性的主要来源。这些抗体的水平和血清灭菌活性看来与抗粘膜炎莫拉菌感染的年龄依赖性抵抗力相关。由于在自然感染后，人还产生了对UspA1和UspA2外其它许多粘膜炎莫拉菌抗原的抗体应答，因此仍需确定用一种或两种UspA蛋白免疫接种是否能赋予易感性群体足够的保护力。

实施例VI：UspA2作为寡糖的载体

UspA2作为肺炎球菌糖类载体

本研究证实了UspA2可作为肺炎球菌糖类的载体。通过还原性胺化，使七价肺炎球菌多糖与UspA2偶联。在第0周和第4周免疫接种瑞士Webster小鼠，最后在第6周取血。每只小鼠用每剂1μg糖在腹部作皮下(s.c.)免疫接种，以磷酸铝作为佐剂。一组小鼠用PP7F-CRM偶联物免疫接种作为对照。第6周取血的血清的数据显示在表XXII、表XXIII和表XXIV中。偶联物诱导出抗多糖的抗体以及抗粘膜炎莫拉菌的灭菌抗体。这些结果证实了UspA2可作为载体来诱导出抗该肺炎球菌糖类的抗体，并且保留了UspA2的免疫原性。

表XXII

7F偶联物诱导的对肺炎球菌多糖7F的抗体滴度

抗原抗Pn Ps 7F的IgG ELISA滴度^*

PP7F-UspA2混合物＜100

PP7F-UspA2偶联物 9514

PP7F-CRM偶联物 61333

^*5只小鼠的合并血清

表XXIII

抗三种粘膜炎莫拉菌分离株全细胞的血清ELISA滴度

免疫原试验菌株

组¹ O35E 430-345 1230-359

PP7F-UspA2²混合物 51409 4407 9124

PP7F CRM偶联物 56 49 47

PP7F UspA2偶联物 31111 3529 8310

¹疫苗组包括5只瑞士Webster小鼠。每组在第0周和第3周免疫接种，在第6周收集血清。

²疫苗由1μg肺炎球菌7F和1μg UspA2组成，以磷酸铝为佐剂。

表XXIV

抗三种粘膜炎莫拉菌分离株的补体依赖性灭菌抗体

免疫原试验菌株

组¹ O35E 430-345 1230-359PP7F-UspA2混合物 400 400 400PP7F CRM偶联物＜100 ＜100 ＜100PP7F UspA2偶联物 400 400 200

¹BC₅₀滴度是与第0周小鼠血清相比大于50％的细菌被杀死时的最高血清稀释度。测试的最浓血清为1∶100稀释度。

UspA2作为嗜血杆菌属b型寡糖的载体

本研究证实了UspA2可作为流感嗜血杆菌b型寡糖(HbO)的载体。在0.1％Triton X-100存在下通过水性还原性胺化使HbO样品(平均DP＝24)与UspA2偶联。HbO与UspA2的重量比为2∶1。偶联在35℃进行3天，用Amicon100K截留膜渗滤偶联物。偶联比例(毫克糖类/毫克UspA2)为0.43∶1。用orcinal(地衣酚)试验测定糖类，用Lowry法测定蛋白。用氨基酸分析测定羟乙基赖氨酸的数目，发现为12.6。

通过免疫接种瑞士Webster小鼠来检测偶联物的免疫原性。小鼠在第0周和第4周用1μg糖免疫接种两次。偶联物不采用佐剂，而是与UspA2一起使用。合并血清并滴定。放射性抗原结合试验(RABA)测得的对HbPS的反应性与用HbO和CRM197交联时所见相似(表XXV)。抗同源型粘膜炎莫拉菌分离株(O35E)的全细胞滴度与未偶联UspA2所见相似(表XXVI)，灭菌滴度也相似(表XXVII)。因此，当通常只能诱导出低于0.10的RABA滴度的糖抗原与UspA2偶联时，该糖抗原变成免疫原性。

表XXV

通过放射性抗原结合试验(RABA)比较UspA2偶联的HbO与CRM₁₉₇偶联的

HbO对嗜血杆菌属b型多糖的免疫原性

周 HbO-CRM197 HbO-UspA2

0 ＜0.10 ＜0.10

3 2.51 2.87

4 4.46 3.56

6 58.66 18.92

表XXVI

通过ELISA比较HbO-UspA2偶联物与未偶联的UspA2对粘膜炎莫拉菌

O35E分离株全细胞的免疫原性

周 UspA2^a HbO-UspA2

0 ＜50 ＜50

4 54284 17424

6 345057 561513

^a5μg UspA2以500μg磷酸铝作为佐剂

表XXVII

血清对两种粘膜炎莫拉菌分离株的灭菌性

分离株 UspA2^a HbO-UspA2

O35E 4500 ＞4500

345 n.d. n.d.

^a5μg UspA2以500μg磷酸铝作为佐剂

n.d.＝未测定

实施例VII：小鼠血清敏感性与突变型UspA2表达的关系

当细菌被缺少抗该菌特异性抗体的血清杀死时，则称其为“血清敏感性”。以粘膜炎莫拉菌为例，已经发现缺少完整UspA2蛋白的突变体具有血清敏感性。构建这些突变体，使得一个突变体(O35E.1；参见实施例IX中对分离株O35E.1、O35E.2和O35E.12分离株的描述)不表达UspA1，一个突变体(O35E.2)不表达UspA2，一个突变体(O35E.12)不表达任一蛋白(根据缺少与17C7单克隆抗体的反应性)。然而，O35E.2和O35E.12表达了较小的截短形式的UspA2(tUspA2)，它能与用纯化UspA2免疫接种小鼠制得的抗体反应。tUspA2可以在细菌裂解液的western印迹法中用多克隆抗UspA2血清或MAb13-1检测到。较小形式的分子与两个突变体构建时采用的截短基因一致。

将非免疫小鼠血清、1∶5稀释的人补体和细菌悬液(约1000cfu)在微量滴定板孔内混合，测试灭菌性能。小鼠血清在1∶50和1∶100的稀释度下进行测试。然后将该细菌稀释悬液涂布在琼脂生长培养基上，测定存活细菌的数目。当回收到的存活细菌(cfu)少于无小鼠血清样品的50％时，则认为杀死作用显著。只有缺少“全部”UspA2的突变体才观察到非免疫血清有杀死效果(表XXVIII)。

表XXVIII

Balb/c小鼠的免疫前血清的灭菌活性

突变体表达的蛋白正常小鼠血清的灭菌活性

O35E UspA1 & UspA2 -

O35E.1 UspA2 -

O35E.2 UspA1 & tUspA2 +

O35E.12 tUspA2 +

实施例VIII：UspA1中结合MAb 17C7的十肽表位的鉴定

从粘膜炎莫拉菌不同菌株的研究及其UspA1蛋白序列的分析可以明显看出，在所有菌株中一定存在某些相近(如果不相同)的表位区域，它们为人体内的免疫原性应答提供了基础。为了鉴定这个或这些免疫原性表位，制得跨越已知含有MAb 17C7结合位点的UspA1区域的肽并检测其与MAb 17C7结合的能力。

具体讲，从Resarch Genetics Inc.(Huntsville，AL)获得重叠的合成十肽(如表XXIX和图12所示)，其N端与与衍生化纤维素组成的膜结合。在用含5％(w/v)脱脂干牛奶的PBS-吐温洗涤5次后，使膜与MAb 17C7(杂交瘤培养物上清液形式)4℃培育过夜。在用PBS-吐温洗涤三次后，使膜与10⁶cpm放射性碘化的(比活为×10⁷cpm/μg蛋白)、亲和纯化的山羊抗小鼠免疫球蛋白一起轻微摇动4℃培育过夜。然后如上所述洗膜，曝光X-射线胶片(Fuji RX安全膜，Fuji Industries，Tokyo，Japan)。

表XXIX

用来鉴定MAb 17C7结合位点的十肽

肽编号肽序列

9 SGRLLDQKAD SEQ ID NO：81

10 QKADIDMNIN SEQ ID NO：82

11 NNINNIYELA SEQ ID NO：83

12 NNIYELAQQQ SEQ ID NO：84

13 YELAQQQDQH SEQ ID NO：18

14 AQQQDQHSSD SEQ ID NO：85

15 QDQHSSDIKT SEQ ID NO：86

16 HSSDIKTLKN SEQ ID NO：87

17 DIKTLKNNVE SEQ ID NO：88

18 TLKNNVEEGL SEQ ID NO：89

19 EEGLLDLSGR SEQ ID NO：90

20 LSGRLIDQKA SEQ ID NO：91

21 DQKADIAKNQ SEQ ID NO：92

22 ANKQADIAQN SEQ ID NO：93

23 IAQNQTDIQD SEQ ID NO：94

24 DIQDLAAYNE SEQ ID NO：95

从放射自显影所示斑点印迹结果(图13)可以明显看出，肽13YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)显示出与MAb 17C7的结合最优，而肽14(SEQ ID NO：85)表现出次于最优结合。该相同的肽(SEQ ID NO：18)也存在于UspA2中，从而解释了两种蛋白均与MAb 17C7结合的原因。

令人感兴趣的是，肽12显示出不结合，而肽15、16、19、22、23的结合可能没有特异性。因此，比较肽12、13和14产生了这样一个结论，即7聚的AQQQDQH(SEQ ID NO：17)是UspA1和UspA2与MAb 17C7结合的必需表位。该结论与目前所知道的免疫原性表位可能包含5、6或7个氨基酸残基的信息相符。

实施例IX：粘膜炎莫拉菌菌株O35E上同基因uspA1

和uspA2突变体的表型作用

材料和方法

细菌菌株、质粒和生长条件。本研究中所用的细菌菌株和质粒显示在表XXX中。粘膜炎莫拉菌常规地在37℃、95％空气-5％CO₂的气氛下，脑-心脏灌输(BHI)琼脂板(Difco Laboratories，Detroit，MI)上生长，需要时补充卡那霉素(20μg/ml)(Sigma Chemicals Co.，St.Louis，MO)或氯霉素(0.5μg/ml)(Sigma)，或在BHI肉汤中生长。用来生长粘膜炎莫拉菌细胞进行粘附试验的BHI肉汤通过过滤来除菌。在Luria-Bertani(LB)琼脂板(Maniatis等，1982)上培育大肠杆菌，需要时补充加入氨苄青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(30μg/ml)或氯霉素(30μg/ml)。

表XXX

本研究中所用的细菌菌株和质粒

菌株或质粒描述来源或文献

粘膜炎莫拉菌

O35E 中耳体液中的野生型分离株 Helminen等，1994

O35E.1 uspA1结构基因中有kan弹夹 Aebi等，1997

的O35E的同基因突变体

O35E.2 uspA2结构基因中有kan弹夹 Aebi等，1997

的O35E的同基因突变体

O35E.12 uspA2结构基因中有kan弹本研究

夹、uspA1结构基因中有cat

弹夹的O35E的同基因突变体

P-44 表现出迅速凝血的野生型分 Soto-Hernandez等，1989

离株

P-48 表现出缓慢凝血的野生型分 Soto-Hernandez等，1989

离株

大肠杆菌

DH5α 克隆研究用宿主 Stratagene

质粒

pBluescript II 克隆载体；Ampr Stratagene

pUSPA1 具有2.7kb插入物的 Aebi等，1997

pBluescript II SK+，此插入物

含有粘膜炎莫拉菌菌株O35E

的大部分uspA1基因

pUSPA1CAT uspA1基因的0.6kb BglII片段本研究

被cat弹夹代替的pUSAPA1

外膜蛋白的性质鉴定.如Murphy和Loeb，1989；Patrick等，1987中所述的那样制得粘膜炎莫拉菌的全细胞裂解液和外膜囊泡。如Helminen等，1993a中所述的那样，用SDS-PAGE分辨存在于这些制品中的蛋白，并通过考马斯蓝染色或western印迹分析来检测。

单克隆抗体(MAb).在本文前述实施例中已经描述了MAb 17C7，一种与粘膜炎莫拉菌菌株O35E的UspA1和UspA2保守性表位反应的鼠IgG抗体，将其用于这些蛋白的免疫检测。在western印迹分析和间接抗体-可及性试验中，MAb17C7以杂交瘤培养物上清液形式使用。在间接抗体-可及性试验中，用MAb3F12(对杜克雷嗜血杆菌主要外膜蛋白有特异性的IgG单克隆抗体(Klesney-Tait等，1997))作为阴性对照。

分子克隆方法。在聚合酶链反应(PCR^TM)系统中，采用粘膜炎莫拉菌菌株O35E的染色体DNA作为模板，寡核苷酸引物从菌株O35E uspA1开放读框起始序列后(即图14中的P1)或该开放读框终止序列后(即图14中的P2)衍生获得。设计这些引物，使其5′端含有BamHI限制性位点。这些引物的序列是：

P1-5′-CGGGA TCCGTG AAGAAA AATGC CGCAGGT-3′(SEQ ID NO：96)

P2-5′-CGGGA TCCCGT CGCAAG CCGAT TG-3′(SEQ ID NO：97)。DNA片段扩增采用PTC 100程控热控制仪(MJ Research，Inc，Cambridge，MA)和GeneAmp PCR^TM试剂盒(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ)。用QiaexGel Extraction试剂盒(Qiagen，Inc.，Chadsworth，CA)从0.7％琼脂糖凝胶切片中抽提出PCR^TM产物，用BamHI(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)消化，然后连接入pBluescript II SK+(Stratagene，La Jolla.CA)的BamHI位点中。连接反应用T 4 DNA连接酶(Gibco BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)16℃过夜培育。根据标准热休克程序(Sambrook等，1989)用连接反应混合物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，在合适的抗微生物化合物存在下进行培育，选出所需的重组体。1.3kb氯霉素(cat)抗性弹夹通过从pUCAECAT(Wyeth-Lederle，Rochester，NY)切下(用BamHI)来制得。然后将cat弹夹连接入位于uspA1基因克隆片段中部的BglII限制性位点内，在转化感受态大肠杆菌DH5细胞后，在含氯霉素的固定化培养基中选择，鉴定出重组克隆。

粘膜炎莫拉菌的转化.用来转化粘膜炎莫拉菌菌株O35E的电穿孔方法已有描述(Helminen等，1993b)。简言之，离心收获30毫升对数生长阶段的肉汤培养物(10⁹菌落形成单位[cfu]/ml)，用含10％(v/v)甘油的蒸馏水洗涤三次，重新悬浮在100μl同一溶液中。在微量电穿孔容器(Cel-Porator电穿孔系统；Bethesda ResearchLaboratories，Gaithersburg，MD)中，在0.15cm距离内施加16.2kV电场强度，用含5μg线形DNA(即含cat弹夹的截短的uspA1基因)的5μl水对这些细胞的20μl部分进行电穿孔。在电穿孔后，将细胞悬液转移到1毫升BHI肉汤中，37℃振荡培育90分钟。然后将10份100μl的部分涂布在含有合适抗微生物化合物的BHI琼脂板上。

Southern印迹分析。用PvuII或HindIII(New England Biolabs)消化野生型和突变型粘膜炎莫拉菌菌株纯化出的染色体DNA，并如Sambrook等，1989年中所述的那样进行Southern印迹分析。用随机引导DNA标记试剂盒(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)对双链DNA探针作³²P标记。

间接抗体可及性试验。将粘膜炎莫拉菌菌株O35E及其同基因突变体的过夜的BHI肉汤培育物稀释在含有10％(v/v)胎牛血清和0.025％(w/v)叠氮钠的PBS缓冲液(PBS-FBS-A)中，至密度约为110 Klett单位(约10⁹cfu/ml)(用Klett-Summerson比色计(Klett Manufacturing Co.，New York，NY)测得)。将该悬液的一部分(100μl)加入1毫升MAb 17C7或MAb 3F12培养上清液中。轻微搅拌4℃培育1小时后，洗涤细菌细胞一次，然后悬浮在1毫升PBS-FBS-A中。加入亲和纯化的山羊抗小鼠免疫球蛋白(用¹²⁵I放射性标记至比活为10⁸cpm/μg)，轻微搅拌4℃培育混合物1小时。然后用1毫升PBS-FBA-A洗涤细胞四次，悬浮在500μl三重洗涤剂(Helminen等，1993)中，转移至玻璃管内。用γ计数器测定每一样品中的放射性。

自身凝集和凝血试验。用在BHI琼脂板中过夜生长的细菌细胞评定粘膜炎莫拉菌抗自身凝集的能力。将细胞重新悬浮在PBS中至玻璃管内浊度为400Klett单位，然后使其在室温下静置10分钟，再次测定该悬液的浊度。迅速凝集和缓慢凝集分别定义为10分钟后的浊度低于和高于200Klett单位。如前所述(Soto-Hernandez等，1989)，用肝素化人O型Rh⁺红细胞进行玻片凝血试验。

血清细菌试验。用标准方法制得充足补体的正常成人血清。加热血清至56℃30分钟使补体灭活。将处于对数生长早期的粘膜炎莫拉菌肉汤培养物稀释在含0.10％(w/v)明胶(GVBS)的Veronal缓冲盐溶液中至浓度为1-2×10⁵cfu/ml，将20μl部分和160μl含5mM MgCl₂和1.5mM CaCl₂的Veronal缓冲盐溶液加入20μl天然或热灭活的正常人血清中。在静置37℃水浴中培育该混合物。在0、10和15分钟时，取出10μl，悬浮在75μlBHI肉汤中并涂布到预暖的BHI琼脂板上。

粘附试验。用来测定流感嗜血杆菌体外粘附Chang结膜细胞的方法(St.GemeIII和Falkow，1990)适用于粘膜炎莫拉菌。简言之，将2-3×10⁵Hep-2细胞(ATCCCCL 23)或Chang结膜细胞(ATCC CCL 20.2)接种到24孔组织培养板(Corning-Costar)的每个孔中，并在使用前培育24小时。从粘膜炎莫拉菌的无抗生素过夜培养物中取0.3毫升接种到10毫升新鲜的缺少抗生素的BHI培养基中，然后使该培养在环动式水浴中振荡生长至浓度约为5×10⁸cfu/ml(120Klett单位)。4-8℃、6000xg下离心10分钟，收获培养物。弃去上清液，用巴斯德移液管小心地将细菌细胞重新悬浮在5毫升pH7.4磷酸缓冲盐溶液(PBS)或含0.15％(w/v)明胶的PBS(PBS-G)中。再次离心细菌细胞，小心地将最终沉淀重悬于6-8毫升PBS或PBS-G中。

将该悬液(10⁷CFU)的一部分(25μl)接种到含有HEp-2或Chang细胞单层的24孔组织培养板各孔中。在165×g下离心这些组织培养板5分钟，然后37℃培育30分钟。用PBS或PBS-G轻微洗孔5次，除去不粘附的细菌，然后加入200μl含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS，从塑料支持物上释放下上皮细胞。在PBS或PBS-G中序列稀释该细胞悬液，并将其涂布到BHI板上以测定存活粘膜炎莫拉菌的数目。粘附(率)表示为与人细胞粘连的细菌相对于最初接种加入孔中的细菌的百分数。

结果

缺少UspA1和UspA2表达的同基因粘膜炎莫拉菌突变株的构建。在前述实施例(Aebi等，1997)中已经描述了不能表达UspA1(突变株O35E.1)或UspA2(突变株O35E.2)的粘膜炎莫拉菌突变株的构建。为了构建不能表达UspA1和UspA2的双重突变株，用cat盒代替pUSPA1的0.6kb BglII片段(图14A)，产生重组质粒pUSPA1CAT。采用引物P1和P2，通过PCR^TM扩增pUSAPlCAT的3.2插入物。该PCR^TM产物用于电穿孔卡那霉素抗性uspA2菌株O35E.2，产生氯霉素和卡那霉素抗性的转化体O35E.12，一种推定的uspA1 uspA2双重突变株。

用Southern印迹分析来证实O35E.1、O35E.2以及O35E.12是同基因突变株，且发生了合适的等位基因交换，从而导致野生型uspA1或uspA2基因或两者被突变型等位基因代替。用PvuII将野生型亲代菌株O35E、uspA1突变株O35E.1、uspA2突变株O35E.2、以及推定的uspA1 uspA2突变株O35E.12的染色体DNA制品消化至完全，并在Southern印迹分析中用这两种粘膜炎莫拉菌基因衍生的DNA片段或kan弹夹来检测。为了用cat弹夹探测，用HindIII消化菌株O35E.12的染色体DNA。

采用引物P3和P4(图14A)，以PCR^TM为基础，扩增粘膜炎莫拉菌菌株O35E的染色体DNA，获得uspA1特异性DNA探针。用引物P5和P6(图14B)，通过PCR^TM，从O35E染色体DNA扩增得到500bp的uspA2特异性DNA片段。这两个基因特异性探针以及kan和cat弹夹在Southern印迹分析中的应用证明了菌株O35E.12菌株是uspA1 uspA2双重突变株。

野生型和突变型粘膜炎莫拉菌菌株表达的选定蛋白的性质鉴定。用SDS-PAGE辨别从野生型以及这三种突变株中抽提出的外膜囊泡中存在的蛋白，并用考马斯蓝染色(图15A)或在western印迹分析(图15B)中用MAb 17C7检测。野生型亲代菌株O35E具有极高分子量的考马斯蓝染色可检测到的条带(图15A，泳道1，实心箭头)，uspA1突变株O35E.1中丰裕度也类似(图15A，泳道2)。uspA2突变株O35E.2(图15A，泳道3)在凝胶相同区域中的条带表达水平则大大减少；而在uspA1 uspA2双重突变株O35E.12中完全看不到该条带(图2，A组，泳道4)

Western印迹分析揭示了野生型菌株(图15B，泳道1)表达了大量的与MAb17C7反应的抗原，其中大多数有非常高的分子量，超过220000。野生型菌株还显示出与该单克隆抗体结合的分散的抗原，其表观分子量大约在120000至85000之间(图15B，泳道1，分别为空心和实心箭头)。uspA1突变株O35E.1(图15B，泳道2)不表达120kDa抗原(可能是UspA1的单体形式)，但仍表达85kDa抗原。该uspA1突变株表达出的极高分子量MAb 17C7反应性抗原的量看来与野生型菌株表达出的量相等。uspA2突变株O35E.2(图15B，泳道3)表达出120kDa抗原，但是不表达85kDa抗原(可能是UspA2蛋白的单体形式)。与uspA1突变株相反，uspA2突变株具有相当少的极高分子量的与MAb 17C7反应的抗原。最后，不能检测到uspA1 uspA2双重突变株O35E.12(图15B，泳道4)表达出了MAb 17C7反应性抗原。

MAb 17C7与野生型和突变型菌株的全细胞的结合。用间接抗体可及性试验测定UspA1和UspA2二者是否暴露在粘膜炎莫拉菌的表面上并是抗体可及的。野生型菌株O35E和uspA1突变株O35E.1的全细胞二者结合相似量的MAb17C7(表XXXI)。该结果提示，UspA2表达在粘膜炎莫拉菌的表面上，或至少在uspA1突变株的表面上。uspA2突变株O35E.2与MAb 17C7的结合量显著少于野生型菌株，但是其结合水平仍比抗杜克雷嗜血杆菌外膜蛋白的不相关IgG单克隆抗体所得结合水平至少高大约一个数量级(表XXXI)。如western印迹分析所预计的那样，uspA1 uspA2双重突变株O35E.12不与MAb 17C7结合，其水平高于阴性对照(包括杜克雷嗜血杆菌特异性单克隆抗体)获得的水平(表XXXI)。

表XXXI

MAb 17C7与野生型和突变型粘膜炎莫拉菌菌株表面的结合

结合^a

菌株 MAb17C7 MAb3F12b

O35E(野生型) 145583^c 4924

O35E.1(uspA1突变株) 154119 4208

O35E.2(uspA2突变株) 96721 4455

O35E.12(uspA1 uspA2双重突变株) 6081 3997

^a间接抗体可及性试验中测得，每分钟¹²⁵I-标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白与连接在细菌细胞表面的单克隆抗体结合的放射性计数。

^b加入MAb 3F12，一种对杜克雷嗜血杆菌外膜蛋白有特异性的小鼠IgG抗体(Klesney-Tait等，1997)，作为阴性对照。

^c数值表示两个独立研究的平均值。

野生型和突变型菌株的生长、自身凝集和凝血性能的性质鉴定。这三种突变株在BHI琼脂板上生长的菌落形态与野生型亲代菌株之间没有不同。与此相似，所有四种突变株在BHI肉汤中的生长速度和程度也非常相似(如果不相同的话)(图16)。在如上所述本实施例中材料和方法部分中进行的自身凝集试验中，所有四种菌株表现出相同自身凝集速度。最后，在采用人O型红细胞的凝血试验中，野生型亲代和三个突变株之间也没有可检测到的不同(Soto-Hernandez等，1989)。对照凝血研究的进行采用一对粘膜炎莫拉菌分离株(即菌株P-44和P48)，它们以前就已被鉴定出分别有迅速或缓慢的凝血速度(Soto-Hernandez等，1989)。

uspA1和uspA2突变对粘膜炎莫拉菌粘附人细胞能力的影响。初步研究揭示，野生型粘膜炎莫拉菌菌株O35E容易在体外粘附HeLa细胞、HEp-2细胞以及Chang结膜细胞。为了确定UspA1或UspA2表达的缺失是否影响该粘附能力，首先在粘附试验中采用Hep-2细胞以及野生型和三种突变型菌株。在该系列研究中，PBS被用作洗涤HEp-2细胞单层和在试验结束时序列稀释胰蛋白酶处理的HEp-2细胞单层的稀释剂。野生型菌株和uspA2突变株O35E.2显示出的与HEp-2单层的粘附水平相似(表XXXI)。然而，uspA1突变株O35E.1却不太能与这些HEp-2细胞粘附；UspA1表达的缺失使粘附水平减少大约6倍(表XXXII)。uspA1uspA2双重突变株O35E.2显示的粘附水平有相似程度地减少(表XXXII)。

表XXXII

野生型和突变型粘膜炎莫拉菌菌株在体外与

HEp-2和Chang结膜细胞的粘附

粘附^a

菌株 HEp-2细胞^b Chang细胞^c

O35E(野生型) 14.7±4.9 51.4±30.8

O35E.1(uspA1突变株) 2.4±0.9(0.006^d) 0.8±0.5(0.002^d)

O35E.2(uspA2突变株) 19.1±7.0(0.213^d) 55.9±16.7(0.728^d)

O35E.12(uspA1 uspA2双重 2.3±1.8(0.011^d) 0.6±0.2(0.002^d)

突变株)

^a粘附率表示成在培育30分钟后，与人上皮细胞粘附的最初接种物的百分数。每一数字用两个独立实验的平均值(±标准误差)表示。

^b用PBS洗涤细胞单层和系列稀释粘附的粘膜炎莫拉菌。

^c用PBS-G洗涤细胞单层和系列稀释粘附的粘膜炎莫拉菌。

^d用双尾实习t检测(two-tailed student t-test)与野生型菌株O35E比较时的P值。

然而，对照研究揭示，粘膜炎莫拉菌在用于洗涤HEp-2单层和系列稀释粘附的粘膜炎莫拉菌的PBS中却不能很好地存活。当10⁸CFU的野生型和突变型粘膜炎莫拉菌菌株悬浮在PBS中，连续稀释，并使其在冰上静置30分钟，细菌的存活数减少到10⁷CFU。相反，当相同类型实验中采用含有0.15％(w/v)明胶的PBS(PBS-G)时，这些粘膜炎莫拉菌菌株的存活率在实验期间没有减少。当用PBS-G来洗涤HEp-2细胞单层并作为稀释剂来重复以HEp-2为基础的粘附研究时，uspA1突变株的粘附只比野生型亲代菌株的粘附降低3倍。这一发现表明，原先观察到的野生型和uspA1突变株粘附能力间的6倍差别可能部分是由于采用PBS洗涤和稀释而引起的存活率问题。

随后的研究采用Chang结膜细胞作为细菌粘附的靶，并用PBS-G来洗涤和稀释，研究表明，野生型菌株和uspA1突变株的粘附能力之间有显著差别(表XXXII)。尽管野生型和uspA2突变株显示出与Chang细胞粘附的水平接近，但是uspA1突变株的粘附程度却几乎比野生型亲代菌株低大约两个数量级。uspA1uspA2双重突变株也表现出粘附水平大大降低，与uspA1突变株所获得的结果类似(表XXXII)。

uspA1和uspA2突变对血清抗粘膜炎莫拉菌抗性的作用。与大多数粘膜炎莫拉菌疾病分离株(Hol等，1993；1995；Verduin等，1994)相似，野生型菌株O35E在体外对正常人血清杀死作用有抗性(Helminen等，1993b)。为了检查不表达UspA1或UspA2对血清抗性的作用，在血清灭菌试验中测试野生型菌株和三种突变株。野生型菌株(图17，实心菱形)和uspA1突变株O35E.1(图17，实心三角)能在正常人血清中生长，这表明不表达UspA1不会对菌株O35E.1抵抗正常人血清杀死作用的能力有不利影响。然而，uspA2突变株O35E.2(图17，实心圆圈)和uspA1uspA2双重突变株O35E.12(图17，实心正方形)(它们的共同之处是不表达UspA2)很容易被正常人血清杀死。存在于该正常人血清中的补体系统的热灭活消除了该血清杀死后两种突变株的能力(图17，空心圆圈和正方形)。

本文公开和揭示的所有组合物与方法可通过借鉴本文公开内容无需进行过多试验而制得和实施。尽管本发明的组合物和方法已经通过较佳实例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述的组合物、方法、以及方法步骤和步骤次序作改动。更具体地，明显可用化学和生理上相关的某些试剂代替本文所述的试剂来获得相同或相似的结果。所有这些相似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括附加权利要求定义的本发明精神、范围和内容中。

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Wright和Wallace，Semin.Respir.Infect.，440-46，1989.

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)姓名：Board of Regents.The University of Texas

System

(B)街道：201W.7th Street

(C)城市：Austin

(D)州：Texas

(E)国家：USA

(F)邮政编码(邮编)：78701

(ii)发明名称：粘膜炎莫拉菌的USPA1和USPA2抗原

(iii)序列数目：98

(iv)计算机可读形式：

(A)记录介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version #1.30(EPO)

(vi)在先申请资料：

PCT/US97/23930的基础是

(A)申请号：US 60/033,598

(B)申请日：1996年12月20

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：831氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Met Asn Lys Ile Tyr Lys Val Lys Lys Asn Ala Ala Gly His Leu Val

1 5 10 15

Ala Cys Ser Glu Phe Ala Lys Gly His Thr Lys Lys Ala Val Leu Gly

20 25 30

Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Leu Gly Met Ala Thr Thr Ala Ser Ala

35 40 45

Gln Ala Thr Asn Ser Lys Gly Thr Gly Ala His Ile Gly Val Asn Asn

50 55 60

Asn Asn Glu Ala Pro Gly Ser Tyr Ser Phe Ile Gly Ser Gly Gly Tyr

65 70 75 80

Asn Lys Ala Asp Arg Tyr Ser Ala Ile Gly Gly Gly Leu Phe Asn Lys

85 90 95

Ala Thr Asn Glu Tyr Ser Thr Ile Val Gly Gly Gly Tyr Asn Lys Ala

100 105 110

Glu Gly Arg Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Ser Asn Asn Glu Ala Thr

115 120 125

Asn Glu Tyr Ser Thr Ile Val Gly Gly Asp Asp Asn Lys Ala Thr Gly

130 135 140

Arg Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Asp Asn Asn Thr Arg Glu Gly Glu

145 150 155 160

Tyr Ser Thr Val Ala Gly Gly Lys Asn Asn Gln Ala Thr Gly Thr Gly

165 170 175

Ser Phe Ala Ala Gly Val Glu Asn Gln Ala Asn Ala Glu Asn Ala Val

180 185 190

Ala Val Gly Lys Lys Asn Ile Ile Glu Gly Glu Asn Ser Val Ala Ile

195 200 205

Gly Ser Glu Asn Thr Val Lys Thr Glu His Lys Asn Val Phe Ile Leu

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Thr Gly Val Thr Ser Asn Ser Val Leu Leu Gly Asn

225 230 235 240

Glu Thr Ala Gly Lys Gln Ala Thr Thr Val Lys Asn Ala Glu Val Gly

245 250 255

Gly Leu Ser Leu Thr Gly Phe Ala Gly Glu Ser Lys Ala Glu Asn Gly

260 265 270

Val Val Ser Val Gly Ser Glu Gly Gly Glu Arg Gln Ile Val Asn Val

275 280 285

Gly Ala Gly Gln Ile Ser Asp Thr Ser Thr Asp Ala Val Asn Gly Ser

290 295 300

Gln Leu His Ala Leu Ala Thr Val Val Asp Asp Asn Gln Tyr Asp Ile

305 310 315 320

Val Asn Asn Arg Ala Asp Ile Leu Asn Asn Gln Asp Asp Ile Lys Asp

325 330 335

Leu Gln Lys Glu Val Lys Gly Leu Asp Asn Glu Val Gly Glu Leu Ser

340 345 350

Arg Asp Ile Asn Ser Leu His Asp Val Thr Asp Asn Gln Gln Asp Asp

355 360 365

Ile Lys Glu Leu Lys Arg Gly Val Lys Glu Leu Asp Asn Glu Val Gly

370 375 380

Val Leu Ser Arg Asp Ile Asn Ser Leu His Asp Asp Val Ala Asp Asn

385 390 395 400

Gln Asp Asp Ile Ala Lys Asn Lys Ala Asp Ile Lys Gly Leu Asn Lys

405 410 415

Glu Val Lys Glu Leu Asp Lys Glu Val Gly Val Leu Ser Arg Asp Ile

420 425 430

Gly Ser Leu His Asp Asp Val Ala Thr Asn Gln Ala Asp Ile Ala Lys

435 440 445

Asn Gln Ala Asp Ile Lys Thr Leu Glu Asn Asn Val Glu Glu Glu Leu

450 455 460

Leu Asn Leu Ser Gly Arg Leu Leu Asp Gln Lys Ala Asp Ile Asp Asn

465 470 475 480

Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser

485 490 495

Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp

500 505 510

Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln

515 520 525

Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr

530 535 540

Asn Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Ala Gln Lys Gln Thr Glu Ala Ile Asp

545 550 555 560

Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Glu Asn Thr Gln Asn Ile Ala Lys Asn

565 570 575

Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln

580 585 590

Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys Val Ser

595 600 605

Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala Asp Ala

610 615 620

Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu Gln Gly

625 630 635 640

Glu Ala Leu Val Glu Gln Asn Lys Ala Ile Asn Gln Glu Leu Glu Gly

645 650 655

Phe Ala Ala His Ala Asp Ile Gln Asp Lys Gln Ile Leu Gln Asn Gln

660 665 670

Ala Asp Ile Thr Thr Asn Lys Thr Ala Ile Glu Gln Asn Ile Asn Arg

675 680 685

Thr Val Ala Asn Gly Phe Glu Ile Glu Lys Asn Lys Ala Gly Ile Ala

690 695 700

Thr Asn Lys Gln Glu Leu Ile Leu Gln Asn Asp Arg Leu Asn Arg Ile

705 710 715 720

Asn Glu Thr Asn Asn Arg Gln Asp Gln Lys Ile Asp Gln Leu Gly Tyr

725 730 735

Ala Leu Lys Glu Gln Gly Gln His Phe Asn Asn Arg Ile Ser Ala Val

740 745 750

Glu Arg Gln Thr Ala Gly Gly Ile Ala Asn Ala Ile Ala Ile Ala Thr

755 760 765

Leu Pro Ser Pro Ser Arg Ala Gly Glu His His Val Leu Phe Gly Ser

770 775 780

Gly Tyr His Asn Gly Gln Ala Ala Val Ser Leu Gly Ala Ala Gly Leu

785 790 795 800

Ser Asp Thr Gly Lys Ser Thr Tyr Lys Ile Gly Leu Ser Trp Ser Asp

805 810 815

Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Val Gly Gly Ser Tyr Arg Trp Lys

820 825 830

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3349碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

ATCAGCATGT GAGCAAATGA CTGGCGTAAA TGACTGATGA GTGTCTATTT AATGAAAGAT 60

ATCAATATAT AAAAGTTGAC TATAGCGATG CAATACAGTA AAATTTGTTA CGGCTAAACA 120

TAACGACGGT CCAAGATGGC GGATATCGCC ATTTACCAAC CTGATAATCA GTTTGATAGC 180

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TCATCGGTAG TGGCGGTTAT AACAAAGCCG ACAGATACTC TGCCATCGGT GGTGGCCTTT 600

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AACCAAGTGG TGTTACCATC ATGCAATGCA TGATGTATTG CTTTGTCAA 3349

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：573氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Met Lys Leu Leu Pro Leu Lys Ile Ala Val Thr Ser Ala Met Ile Val

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ala Thr Ser Thr Val Asn Ala Gln Val Val Glu Gln Phe

20 25 30

Phe Pro Asn Ile Phe Phe Asn Glu Asn His Asp Glu Leu Asp Asp Ala

35 40 45

Tyr His Asn Met Ile Leu Gly Asp Thr Ala Ile Val Ser Asn Ser Gln

50 55 60

Asp Asn Ser Thr Gln Leu Lys Phe Tyr Ser Asn Asp Glu Asp Ser Val

65 70 75 80

Pro Asp Ser Leu Leu Phe Ser Lys Leu Leu His Glu Gln Gln Leu Asn

85 90 95

Gly Phe Lys Ala Gly Asp Thr Ile Ile Pro Leu Asp Lys Asp Gly Lys

100 105 110

Pro Val Tyr Thr Lys Asp Thr Arg Thr Lys Asp Gly Lys Val Glu Thr

115 120 125

Val Tyr Ser Val Thr Thr Lys Ile Ala Thr Gln Asp Asp Val Glu Gln

130 135 140

Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Ile Gln Gly Asp Ile Asp Asp Leu Tyr Asp

145 150 155 160

Ile Asn Arg Glu Val Asn Glu Tyr Leu Lys Ala Thr His Asp Tyr Asn

165 170 175

Glu Arg Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala

180 185 190

Asn Thr Asp Arg Ile Asp Thr Ala Glu Glu Arg Ile Asp Lys Asn Glu

195 200 205

Tyr Asp Ile Lys Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu

210 215 220

Leu Ser Gly His Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr Lys Asp Ile

225 230 235 240

Lys Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Leu Ser Gly

245 250 255

His Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr Lys Asp Ile Lys Ala Leu

260 265 270

Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Leu

275 280 285

Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Gln Asn

290 295 300

Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Ala

305 310 315 320

Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser

325 330 335

Ser Glu Asn Thr Gln Asn Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn

340 345 350

Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser

355 360 365

Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys Ala Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg

370 375 380

Ile Ala Lys Asn Lys Ala Asp Ala Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr

385 390 395 400

Lys Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu Lys Asp Lys Glu His Asp Lys Leu

405 410 415

Ile Thr Ala Asn Lys Thr Ala Ile Asp Ala Asn Lys Ala Ser Ala Asp

420 425 430

Thr Lys Phe Ala Ala Thr Ala Asp Ala Ile Thr Lys Asn Gly Asn Ala

435 440 445

Ile Thr Lys Asn Ala Lys Ser Ile Thr Asp Leu Gly Thr Lys Val Asp

450 455 460

Gly Phe Asp Gly Arg Val Thr Ala Leu Asp Thr Lys Val Asn Ala Leu

465 470 475 480

Asp Thr Lys Val Asn Ala Phe Asp Gly Arg Ile Thr Ala Leu Asp Ser

485 490 495

Lys Val Glu Asn Gly Met Ala Ala Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu Phe

500 505 510

Gln Pro Tyr Ser Val Gly Lys Phe Asn Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gly

515 520 525

Tyr Gly Ser Lys Ser Ala Val Ala Ile Gly Ala Gly Tyr Arg Val Asn

530 535 540

Pro Asn Leu Ala Phe Lys Ala Gly Ala Ala Ile Asn Thr Ser Gly Asn

545 550 555 560

Lys Lys Gly Ser Tyr Asn Ile Gly Val Asn Tyr Glu Phe

565 570

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Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Leu Gly Net Ala Thr Thr Ala Ser Ala

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Gln Ala Thr Lys Gly Thr Gly Lys His Val Val Asp Asn Lys Asp Asn

50 55 60

Lys Ala Lys Gly Asp Tyr Ser Thr Ala Ser Gly Gly Lys Asp Asn Glu

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Ala Lys Gly Asn Tyr Ser Thr Val Gly Gly Gly Asp Tyr Asn Glu Ala

85 90 95

Lys Gly Asn Tyr Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Ser Asn Thr Ala Lys

100 105 110

Gly Glu Lys Ser Thr Ile Gly Gly Gly Asp Thr Asn Asp Ala Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Tyr Tyr Ser Arg Ala Ile Gly Asp

130 135 140

Ser Ser Thr Ile Gly Gly Gly Tyr Tyr Asn Gln Ala Thr Gly Glu Lys

145 150 155 160

Ser Thr Val Ala Gly Gly Ar9 Asn Asn Gln Ala Thr Gly Asn Asn Ser

165 170 175

Thr Val Ala Gly Gly Ser Tyr Asn Gln Ala Thr Gly Asn Asn Ser Thr

180 185 190

Val Ala Gly Gly Ser His Asn Gln Ala Thr Gly Glu Gly Ser Phe Ala

195 200 205

Ala Gly Val Glu Asn Lys Ala Asn Ala Asn Asn Ala Val Ala Leu Gly

210 215 220

Lys Asn Asn Thr Ile Asp Gly Asp Asn Ser Val Ala Ile Gly Ser Asn

225 230 235 240

Asn Thr Ile Asp Ser Gly Lys Gln Asn Val Phe Ile Leu Gly Ser Ser

245 250 255

Thr Asn Thr Thr Asn Ala Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Gly His Asn

260 265 270

Thr Ala Gly Lys Lys Ala Thr Ala Val Ser Ser Ala Lys Val Asn Gly

275 280 285

Leu Thr Leu Gly Asn Phe Ala Gly Ala Ser Lys Thr Gly Asn Gly Thr

290 295 300

Val Ser Val Gly Ser Glu Asn Asn Glu Arg Gln Ile Val Asn Val Gly

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Ala Gly Asn Ile Ser Ala Asp Ser Thr Asp Ala Val Asn Gly Ser Gln

325 330 335

Leu Tyr Ala Leu Ala Thr Ala Val Lys Ala Asp Ala Asp Glu Asn Phe

340 345 350

Lys Ala Leu Thr Lys Thr Gln Asn Thr Leu Ile Glu Gln Gly Glu Ala

355 360 365

Gln Asp Ala Leu Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Thr Ala Asn Lys

370 375 380

Thr Ala Ile Glu Arg Asn Phe Asn Arg Thr Val Val Asn Gly Phe Glu

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Ile Glu Lys Asn Lys Ala Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln

405 410 415

Thr Leu Glu Asn Asn Val Gly Glu Glu Leu Leu Asn Leu Ser Gly Arg

420 425 430

Leu Leu Asp Gln Lys Ala Asp Ile Asp Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr

435 440 445

Asp Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu

450 455 460

Lys Lys Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile

465 470 475 480

Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr Lys Asp Ile Lys Thr Leu Glu Asn Asn

485 490 495

Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys

500 505 510

Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp

515 520 525

Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Ala Gln

530 535 540

Lys Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn

545 550 555 560

Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys

565 570 575

Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile

580 585 590

Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn

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Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr

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Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp

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Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp

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Gln His Ser Sec Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Ala Asn

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Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ser Phe Glu

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Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu Gln Gly Glu Ala Leu

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Val Glu Gln Asn Lys Ala Ile Asn Gln Glu Leu Glu Gly Phe Ala Ala

705 710 715 720

His Ala Asp Val Gln Asp Lys Gln Ile Leu Gln Asn Gln Ala Asp Ile

725 730 735

Thr Thr Asn Lys Ala Ala Ile Glu Gln Asn Ile Asn Arg Thr Val Ala

740 745 750

Asn Gly Phe Glu Ile Glu Lys Asn Lys Ala Gly Ile Ala Thr Asn Lys

755 760 765

Gln Glu Leu Ile Leu Gln Asn Asp Arg Leu Asn Gln Ile Asn Glu Thr

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Asn Asn Arg Gln Asp Gln Lys Ile Asp Gln Leu Gly Tyr Ala Leu Lys

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Glu Gln Gly Gln His Phe Asn Asn Arg Ile Ser Ala Val Glu Arg Gln

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Thr Ala Gly Gly Ile Ala Asn Ala Ile Ala Ile Ala Thr Leu Pro Ser

820 825 830

Pro Ser Arg Ala Gly Glu His His Val Leu Phe Gly Ser Gly Tyr His

835 840 845

Asn Gly Gln Ala Ala Val Ser Leu Gly Ala Ala Gly Leu Ser Asp Thr

850 855 860

Gly Lys Ser Thr Tyr Lys Ile Gly Leu Ser Trp Ser Asp Ala Gly Gly

865 870 875 880

Leu Ser Gly Gly Val Gly Gly Ser Tyr Arg Trp Lys

885 890

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

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(i)序列特征：

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Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Leu Gly Met Ala Thr Thr Ala Ser Ala

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130 135 140

Gly Gly Ser Asn Asn Gln Ala Lys Gly Ala Asn Ser Phe Ala Ala Gly

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Val Gly Asn Gln Ala Asn Thr Asp Asn Ala Val Ala Leu Gly Lys Asn

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Asn Thr Ile Asn Gly Asn Asn Ser Ala Ala Ile Gly Ser Glu Asn Thr

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Asn Phe Ser Gly Val Ser Lys Ala Asp Asn Gly Thr Val Ser Val Gly

245 250 255

Ser Gln Gly Lys Glu Arg Gln Ile Val His Val Gly Ala Gly Gln Ile

260 265 270

Ser Asp Asp Ser Thr Asp Ala Val Asn Gly Ser Gln Leu Tyr Ala Leu

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Gly Val Leu Ser Arg Asp Ile Gly Ser Leu His Asp Asp Val Ala Asp

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Asn Gln Ala Asp Ile Ala Lys Asn Lys Ala Asp Ile Lys Glu Leu Asp

340 345 350

Lys Glu Met Asn Val Leu Ser Arg Asp Ile Val Ser Leu Asn Asp Asp

355 360 365

Val Ala Asp Asn Gln Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Lys

370 375 380

Thr Leu Glu Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg

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Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Asp Asn Asn Ile Asn His Ile Tyr

405 410 415

Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu

420 425 430

Ala Lys Ala Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala

435 440 445

Asp Ala Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu

450 455 460

Ile Glu Lys Asp Lys Glu His Asp Lys Leu Ile Thr Ala Asn Lys Thr

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Ala Ile Asp Ala Asn Lys Ala Ser Ala Asp Thr Lys Phe Ala Ala Thr

485 490 495

Ala Asp Ala Ile Thr Lys Asn Gly Asn Ala Ile Thr Lys Asn Ala Lys

500 505 510

Ser Ile Thr Asp Leu Gly Thr Lys Val Asp Gly Phe Asp Gly Arg Val

515 520 525

Thr Ala Leu Asp Thr Lys Val Asn Ala Phe Asp Gly Arg Ile Thr Ala

530 535 540

Leu Asp Ser Lys Val Glu Asn Gly Met Ala Ala Gln Ala Ala Leu Ser

545 550 555 560

Gly Leu Phe Gln Pro Tyr Ser Val Gly Lys Phe Asn Ala Thr Ala Ala

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Ser Gly Asn Lys Lys Gly Ser Tyr Asn Ile Gly Val Asn Tyr Glu Phe

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(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

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GCCGCACCTG ACCGAGACGC TCCGCCAAAT CAATGCGTCG GTGTACTATG CCCCGACCGA 60

GCTATGCACG GATAATGGTG CGATGATCGC CTATGCTGGC TTTTGTCGGC TAAGCCGTGG 120

ACAGTCGGAT GACTTGGCGG TTCGCTGCAT TCCCCGATGG GATATGACAA CGCTTGGTAT 180

CGAATATGAT AATTAGGCTG TGGTATTTGA GTTTTGAGTA ATGTACCTAC TACCACTAAT 240

TTATCATACA ATACATAAAC ATAAAAAACA TCGGTATTGT TAAAAAACAA TACCCAAGTT 300

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TTTTTATGTT TATAATACCA ACAGAGTATC TATACAGCTA AAATAGCTAA TACCTTAGGT 1080

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AGGAGACTAA GGTGAACAAA ATTTATAAAG TGAAAAAAAA TGCCGCAGGT CATTCGGTGG 1260

CATGTTCTGA ATTTGCCAAA GGCCATACCA AAAAGGCAGT TTTGGGCAGT TTATTGATTG 1320

TTGGGGCATT GGGCATGGCA ACGACAGCGT CTGCACAAAC AGGCAGTACA AATGCAGCCA 1380

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AGAGTAACCA AGCTACAGGT CGTAACTCAA CGGTTGCAGG GGGTTCTAAT AACCAAGCCG 1620

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AAAAAAATGT CTTTATTCTT GGCTCTAACA CAACAAATGC ACAAAGCGGC TCAGTACTGC 1860

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CTGCACTTGG TGGCTATGGC TCAAAATCTG CGGTTGCTAT CGGTGCTGGC TATCGTGTGA 2340

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(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：873氨基酸

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(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

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325 330 335

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Asn Gly Ser Gln Leu His Ala Leu Ala Thr Ala Val Asp Ala Glu Phe

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Ile Asn Gln Glu Leu Glu Gly Leu Ala Asp Tyr Thr Asn Ala Gln Asp

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Glu Lys Ile Leu Lys Asn Gln Thr Asp Ile Thr Ala Asn Lys Thr Ala

405 410 415

Ile Glu Gln Asn Phe Asn Arg Thr Val Thr Asn Gly Phe Glu Ile Glu

420 425 430

Lys Asn Lys Ala Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Thr Leu

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Glu Asn Asp Val Gly Lys Glu Leu Leu Asn Leu Ser Gly Arg Leu Leu

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Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln

500 505 510

Lys Ala Asp Leu Thr Lys Asp Ile Lys Ala Leu Glu Asn Asn Val Glu

515 520 525

Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp

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Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu

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Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu

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Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala

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Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn

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Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser

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Asn Lys Ala Ile Asn Gln Glu Leu Glu Gly Phe Ala Ala His Ala Asp

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Lys Gly Ser Phe Ala Ala Gly Ile Asp Asn Lys Ala Asn Ala Asp Asn

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Ala Thr Val Gly Asp Leu Ser Leu Thr Gly Phe Ala Gly Val Ser Lys

405 410 415

Ala Asn Ser Gly Thr Val Ser Val Gly Ser Glu Gly Lys Glu Arg Gln

420 425 430

Ile Val His Val Gly Ala Gly Arg Ile Ser Asn Asp Ser Thr Asp Ala

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Val Asn Gly Ser Gln Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Ala Val Asp Asp Asn

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Gln Tyr Asp Ile Glu Lys Asn Gln Asp Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala

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Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Thr Leu Glu Asn Asp Val

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Gly Lys Glu Leu Leu Asn Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala

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Asp Ile Asp Asn Asn Ile Asn His Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln

515 520 525Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Lys Asn Val Glu Glu

530 535 540Gly Leu Leu Glu Leu Ser Gly His Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu545 550 555 560Thr Lys Asp Ile Lys Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu

565 570 575Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Gln Asn

580 585 590Gln Ala Asn Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Gln

595 600 605Tyr Ala Gln Lys Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser

610 615 620Ser Glu Asn Thr Gln Asn Ile Glu Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu625 630 635 640Gln Asp Ala Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn

645 650 655Lys Ala Ser Ser Glu Asn Thr Gln Asn Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp

660 665 670Ile Ala Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp

675 680 685Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys Ala Ser Ala Ala Asn

690 695 700Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Asp Ala Asp Ala Ser Phe Glu705 710 715 720Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu Lys Asp Lys Glu His

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740 745 750Ser Ala Asp Thr Lys Phe Ala Ala Thr Ala Asp Ala Ile Thr Lys Asn

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835 840 845

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1

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1 5 10 15

Lys Phe Asn Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Gly Ser Lys

20 25 30

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(A)名称/关键：修饰位点

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Ser Ile Thr Asp Leu Gly Xaa Lys Val

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(A)名称/关键：修饰位点

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Ser Ile Thr Asp Leu Gly Thr Ile Val Asp Gly Phe Xaa Xaa Xaa

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(A)名称/关键：修饰位点

(B)位置：5..19

(D)其它信息：/注意＝″X＝任何″

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Val Asp Ala Leu Xaa Thr Lys Val Asn Ala Leu Asp Xaa Lys Val Asn

1 5 10 15

Ser Asp Xaa Thr

20

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(A)长度：15氨基酸

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Leu Leu Ala Glu Gln Gln Leu Asn Gly Lys Thr Leu Thr Pro Val

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Ser Ile Thr Asp Leu Gly Thr Lys

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1 5 10

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Phe Ala Ala Thr Ala Ile Ala Lys Asp Lys

1 5 10

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Lys Ala Ser Ser Glu Asn Thr Gln Asn Ile Ala Lys

1 5 10

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Arg Leu Leu Asp Gln Lys

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(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(D)拓扑结构：线性

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(A)名称/关键：修饰位点

(B)位置：12

(D)其它信息：/注意＝″X＝任何″

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Ala Ala Thr Ala Asp Ala Ile Thr Lys Asn Gly Xaa

1 5 10

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(A)长度：10氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键：修饰位点

(B)位置：4..8

(D)其它信息：/注意＝″X＝任何″

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Ala Lys Ala Xaa Ala Ala Asn Xaa Asp Arg

1 5 10

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(A)长度：22氨基酸

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(D)拓扑结构：线性

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1 5 10 15

Ala Tyr Asn Glu Leu Gln

20

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(i)序列特征：

(A)长度：2l氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

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Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu Ala

1 5 10 15

Gln Gln Gln Asp Gln

20

(2)SEQ ID NO：53的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：13氨基酸

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(D)拓扑结构：线性

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Tyr Asn Glu Arg Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn

1 5 10

(2)SEQ ID NO：54的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：13氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(D)拓扑结构：线性

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Ile Leu Gly Asp Thr Ala Ile Val Ser Asn Ser Gln Asp

1 5 10

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(i)序列特征：

(A)长度：17氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

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Lys Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly

1 5 10 15

Arg

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(A)长度：21氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

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1 5 10 15

Thr Ile Asp Gln Arg

20

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(i)序列特征：

(A)长度：22氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/注意＝″X＝任何″

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Asn Gln Ala His Ile Ala Asn Asn Ile Asn Xaa Ile Tyr Glu Leu Ala

1 5 10 15

Gln Gln Gln Asp Gln Lys

20

(2)SEQ ID NO：58的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：

Asn Gln Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala

1 5 10 15

Ala Tyr Asn Glu Leu Gln

20

(2)SEQ ID NO：59的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

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Ala Thr His Asp Tyr Asn Glu Arg Gln Thr Glu Ala

1 5 10

(2)SEQ ID NO：60的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

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Lys Ala Ser Ser Glu Asn Thr Gln Asn Ile Ala Lys

1 5 10

(2)SEQ ID NO：61的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23氨基酸

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(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

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Met Ile Leu Gly Asp Thr Ala Ile Val Ser Asn Ser Gln Asp Asn Lys

1 5 10 15

Thr Gln Leu Lys Phe Tyr Lys

20

(2)SEQ ID NO：62的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：14氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键：修饰位点

(B)位置：12..13

(D)其它信息：/注意＝″X＝任何″

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Ala Gly Asp Thr Ile Ile Pro Leu Asp Asp Asp Xaa Xaa Pro

1 5 10

(2)SEQ ID NO：63的信息：

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(A)长度：10氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键：修饰位点

(B)位置：8

(D)其它信息：/注意＝″X＝任何″

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Leu Leu His Glu Gln Gln Leu Xaa Gly Lys

1 5 10

(2)SEQ ID NO：64的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键：修饰位点

(B)位置：5

(D)其它信息：/注意＝″X＝任何″

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Ile Phe Phe Asn Xaa Gly

1 5

(2)SEQ ID NO：65的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：65：

Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His

1 5 10 15

Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu

20

(2)SEQ ID NO：66的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

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GGTGCAGGTC AGATCAGTGA C 21

(2)SEQ ID NO：67的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

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GCCACCAACC AAGCTGAC 18

(2)SEQ ID NO：68的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

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AGCGGTCGCC TGCTTGATCA G 21

(2)SEQ ID NO：69的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：

CTGATCAAGC AGGCGACCGC T 21

(2)SEQ ID NO：70的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：

CAAGATCTGG CCGCTTACAA 20

(2)SEQ ID NO：71的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

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TTGTAAGCGG CCAGATCTTG 20

(2)SEQ ID NO：72的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：

TGCATGAGCC GCAAACCC 18

(2)SEQ ID NO：73的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：9氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：

Leu Leu Ala Glu Gln Gln Leu Asn Gly

1 5

(2)SEQ ID NO：74的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：10氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：

Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu

1 5 10

(2)SEQ ID NO：75的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：14氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：

Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser

1 5 10

(2)SEQ ID NO：76的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3788氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：

Thr His Glu Phe Ile Arg Ser Thr Ser Glu Gln Glu Asn Cys Glu Ser

1 5 10 15

Ala Arg Glu Asn Thr His Glu Asp Ile Ser Lys Glu Thr Thr Glu Ser

20 25 30

Ala Asn Asp Ala Thr Leu Glu Ala Ser Thr Ser Met Glu Phe Thr His

35 40 45

Glu Ser Glu Ala Leu Arg Glu Ala Asp Tyr Asn Thr His Glu Thr Asp

50 55 60

Arg Ile Val Glu Cys His Glu Cys Lys Trp Ile Thr His Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Ile Thr His Glu Ser Glu Ser Glu Gln Glu Asn Cys Glu Ser Ala

85 90 95

Arg Glu Asn Ala Met Glu Asp Asn Thr His Glu Asp Ile Ser Lys Glu

100 105 110

Thr Thr Glu Ser Ala Asn Asp His Ala Arg Asp Cys Pro Ile Glu Ser

115 120 125

Ala Thr Thr Ala Cys His Glu Asp Ala Ser Phe Leu Leu Trp Ser Ala

130 135 140

Asn Asp Asp Asn Thr His Ala Val Glu Ala Asn Tyr Ser Pro Glu Cys

145 150 155 160

Ile Ala Leu Cys His Ala Arg Ala Cys Thr Glu Arg Ser Asp Asn Thr

165 170 175

Thr Arg Ala Asn Ser Leu Ala Thr Glu Ala Asn Tyr Ser Glu Gln Glu

180 185 190

Asn Cys Glu Ser Thr His Ala Thr Ile Ser Thr His Glu Arg Glu Ile

195 200 205

Ser Asn Ser Thr Ala Arg Thr Cys Asp Asn Ser Glu Gln Ile Asp Asn

210 215 220

Phe Ile Leu Glu Asn Ala Met Glu Thr Tyr Pro Glu Ser Thr Arg Ala

225 230 235 240

Asn Asp Thr Pro Leu Gly Tyr Ser Glu Gln Ile Asp Asn Glu Ser Pro

245 250 255

Ala Ala Ala Pro Arg Thr Glu Ile Asn Asn Ala Leu Ile Asn Glu Ala

260 265 270

Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Glu Ser Pro Ala Asn Ala Asp Asn Ala

275 280 285

Asp Asx Leu Glu Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn

290 295 300

Glu Ser Pro Ala Ala Ala Pro Arg Thr Glu Ile Asn Asn Ala Leu Ile

305 310 315 320

Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Glu Ser Pro Ala Asn Ala

325 330 335

Asp Asn Ala Asp Asx Leu Glu Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln

340 345 350

Ile Asp Asn Glu Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ala Thr Pro Arg Thr Glu

355 360 365

Ile Asn Asn Ala Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn

370 375 380

Glu Ser Pro Ala Asn Ala Pro Ala Thr Asp Asn Ala Asp Asx Leu Glu

385 390 395 400

Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Glu Ser Pro Ala

405 410 415

Ala Ala Pro Ala Thr Pro Arg Thr Glu Ile Asn Asn Ala Leu Ile Asn

420 425 430

Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Glu Ser Pro Ala Asn Ala Pro

435 440 445

Ala Thr Asp Asn Ala Asp Asx Leu Glu Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser

450 455 460

Glu Gln Ile Asp Asn Thr Thr Ala Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ala Thr

465 470 475 480

Pro Arg Thr Glu Ile Asn Asn Ala Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu

485 490 495

Gln Ile Asp Asn Thr Thr Ala Ser Pro Ala Asn Ala Pro Ala Thr Asp

500 505 510

Asn Ala Asp Asx Leu Glu Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile

515 520 525

Asp Asn Thr Thr Ala Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ala Thr Pro Arg Thr

530 535 540

Glu Ile Asn Asn Ala Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp

545 550 555 560

Asn Thr Thr Ala Ser Pro Ala Asn Ala Pro Ala Thr Asp Asn Ala Asp

565 570 575

Asx Leu Glu Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Thr

580 585 590

Thr Ala Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ala Thr Pro Arg Thr Glu Ile Asn

595 600 605

Asn Ala Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Thr Thr

610 615 620

Ala Ser Pro Ala Asn Ala Pro Ala Thr Asp Asn Ala Asp Asx Leu Glu

625 630 635 640

Leu Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Thr Thr Ala Ser

645 650 655

Pro Ala Ala Ala Pro Ala Thr Pro Arg Thr Glu Ile Asn Asn Ala Leu

660 665 670

Ile Asn Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Thr Thr Ala Ser Pro

675 680 685

Ala Asn Ala Pro Ala Thr Asp Asn Ala Asp Asx Leu Glu Leu Ile Asn

690 695 700

Glu Ala Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asn Thr His Arg Gly His Ser Glu

705 710 715 720

Gln Ile Asp Asn Ile Ser Gly Ile Val Glu Asn Asx Glu Leu Trp Ala

725 730 735

Asn Asp Ala Arg Glu Asn Thr Asn Thr His Glu Asp Ile Ser Lys Glu

740 745 750

Thr Thr Glu Ser Ser Glu Gln Glu Asn Cys Glu Ser Glu Gln Ile Asp

755 760 765

Asn Thr Tyr Pro Glu Thr Pro Leu Gly Tyr Ser Thr Arg Ala Asn Asp

770 775 780

Ser Pro Glu Cys Ile Ala Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Glu

785 790 795 800

Gln Ile Asp Asn Pro Arg Thr Glu Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ala Arg

805 810 815

Asn Ala Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Glu Gln Ile

820 825 830

Asp Asn Pro Arg Thr Glu Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ala Arg Asn Ala

835 840 845

Tyr Asp Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Glu Gln Ile Asp Asn

850 855 860

Pro Arg Thr Glu Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ala Arg Asn Ala Gly Ala

865 870 875 880

Cys Gly Cys Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Ala Ala

885 890 895

Thr Ala Cys Gly Ser Glu Gln Ile Asp Asn Asp Asn Ala Leu Ile Asn

900 905 910

Glu Ala Arg Asp Asx Leu Glu Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala

915 920 925

Thr Ala Thr Cys Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ser Glu Gln Ile Asp Asn

930 935 940

Asp Asn Ala Leu Ile Asn Glu Ala Arg Asp Asx Leu Glu Thr Cys Ala

945 950 955 960

Ala Thr Gly Cys Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ser

965 970 975

Glu Gln Ile Asp Asn Asp Asn Ala Leu Ile Asn Glu Ala Arg Asp Asx

980 985 990

Leu Glu Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr Ala Cys Thr

995 1000 1005

Cys Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ser Glu Gln Ile Asp Asn Asp Asn Ala

1010 1015 1020

Leu Ile Asn Glu Ala Arg Asp Asx Leu Glu Asn Xaa Ala Xaa Xaa Tyr

1025 1030 1035 1040

Ser Xaa Ile Gly Gly Gly Xaa Asn Ser Glu Gln Ile Asp Asn Pro Arg

1045 1050 1055

Thr Glu Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ala Arg Asn Ala Xaa Ala Asn Tyr

1060 1065 1070

Ala Thr Pro Ser Ile Thr Ile Asn Ser Gln Ala Asp Ile Ser Glu Gln

1075 1080 1085

Ile Asp Asn Pro Arg Thr Glu Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ala Arg Asn

1090 1095 1100

Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu Phe Val Pro Tyr Ser Val

1105 1110 1115 1120

Gly Lys Phe Asn Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Gly Ser Lys Ser

1125 1130 1135

Glu Gln Ile Asp Asn Pro Arg Thr Glu Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ala

1140 1145 1150

Arg Asn Ala Gly Lys Ile Thr Lys Asn Ala Ala Arg Gln Glu Asn Gly

1155 1160 1165

Ser Glu Gln Ile Asp Asn Pro Arg Thr Glu Ile Asn Leu Ile Asn Glu

1170 1175 1180

Ala Arg Asn Ala Val Ile Gly Asp Leu Gly Arg Lys Val Ser Glu Gln

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Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly

35 40 45

Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile

50 55 60

Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu

65 70 75

Claims

1.一种7至60个氨基酸的分离的肽，它包含氨基酸序列AQQQDQH(SEQ IDNO：17)。

2.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽长度为10个氨基酸。

3.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽长度为20个氨基酸。

4.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽长度为30个氨基酸。

5.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽长度为40个氨基酸。

6.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽长度为50个氨基酸。

7.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽长度为60个氨基酸。

8.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽具有至少16个连续的残基，且包含氨基酸序列YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)。

9.一种抗原组合物，它包含(a)7至60个氨基酸的分离的肽，该肽包含氨基酸序列AQQQDQH(SEQ ID NO：17)和(b)药学上可接受的缓冲液或稀释剂。

10.根据权利要求9所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物还包含与所述肽偶联的载体。

11.根据权利要求10所述的抗原组合物，其中所述载体是匙孔血蓝蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素或交叉反应性突变体197。

12.根据权利要求9所述的抗原组合物，它还包含佐剂。

13.根据权利要求12所述的抗原组合物，其中所述佐剂包含脂类。

14.根据权利要求9所述的抗原组合物，其中所述肽与第二抗原共价连接。

15.根据权利要求14所述的抗原组合物，其中所述第二抗原是肽抗原。

16.根据权利要求14所述的抗原组合物，其中所述第二抗原是非肽抗原。

17.根据权利要求9所述的抗原组合物，其中所述分离的肽具有至少16个连续的残基，且包含氨基酸序列YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)。

18.一种疫苗组合物，该组合物包含7至60个氨基酸的、含有氨基酸序列AQQQDQH(SEQ ID NO：17)的分离的肽以及药学上可接受的缓冲液或稀释剂。

19.根据权利要求1 8所述的疫苗组合物，其中所述分离的肽还定义成具有至少16个连续的残基且包含氨基酸序列YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)。

20.抗原组合物在制备用于诱导哺乳动物体内免疫应答的药物中的应用，该抗原组合物包含(a)7至60个氨基酸的分离的肽，该肽包含氨基酸序列AQQQDQH(SEQ ID NO：17)以及(b)药学上可接受的缓冲液或稀释剂。

21.根据权利要求20所述的应用，其中所述分离的肽还定义成包含具有氨基酸序列YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)的至少16个连续的残基。

22.一种核酸，它编码粘膜炎莫拉菌分离株O35E的UspA1抗原(SEQ ID NO：1)。

23.一种核酸，它具有粘膜炎莫拉菌分离株O35E的uspA1 DNA序列(SEQ IDNO：2)。

24.一种核酸，它编码粘膜炎莫拉菌分离株O35E的UspA2抗原(SEQ ID NO：3)。

25.一种核酸，它具有粘膜炎莫拉菌分离株O35E的uspA2 DNA序列(SEQ IDNO：4)。

26.一种核酸，它编码粘膜炎莫拉菌分离株O46E的UspA1抗原(SEQ ID NO：5)。

27.一种核酸，它具有粘膜炎莫拉菌分离株O46E的uspA1 DNA序列(SEQ IDNO：6)。

28.一种核酸，它编码粘膜炎莫拉菌分离株O46E的UspA2抗原(SEQ ID NO：7)。

29.一种核酸，它具有粘膜炎莫拉菌分离株O46E的uspA2 DNA序列(SEQ IDNO：8)。

30.一种核酸，它编码粘膜炎莫拉菌分离株TTA24的UspA1抗原(SEQ ID NO：9)。

31.一种核酸，它具有粘膜炎莫拉菌分离株TTA24的uspA1 DNA序列(SEQID NO：10)。

32.一种核酸，它编码粘膜炎莫拉菌分离株TTA24的UspA2抗原(SEQ ID NO：11)。

33.一种核酸，它具有粘膜炎莫拉菌分离株TTA24的uspA2 DNA序列(SEQID NO：12)。

34.一种核酸，它编码粘膜炎莫拉菌分离株TTA37的UspA1抗原(SEQ ID NO：13)。

35.一种核酸，它具有粘膜炎莫拉菌分离株TTA37的uspA1 DAN序列(SEQID NO：14)。

36.一种核酸，它编码粘膜炎莫拉菌分离株TTA37的UspA2抗原(SEQ ID NO：15)。

37.一种核酸，它具有粘膜炎莫拉菌分离株TTA37的uspA2 DNA序列(SEQID NO：16)。

38.一种在体外进行的诊断粘膜炎莫拉菌感染的方法，该方法包括测定样品中是否存在对应于所述UspA1或UspA2抗原表位核心序列残基的粘膜炎莫拉菌氨基酸序列AQQQDQH的步骤。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述测定包括PCR。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述测定包括检测抗体对粘膜炎莫拉菌抗原的免疫反应性。

41.分离的肽在制备用于治疗患粘膜炎莫拉菌感染个体的药物中的应用，该肽具有7至60个氨基酸，且包含氨基酸序列AQQQDQH(SEQ ID NO：17)。

42.根据权利要求41所述的应用，其中所述肽包含具有氨基酸序列YELAQQQDQH(SEQ ID NO：18)的至少16个连续的残基。

43.一种筛选与抗体起反应的肽的方法，所述抗体与UspA1或UspA2免疫结合，该方法包括下列步骤：

a)提供所述肽；

b)用UspA1或UspA2产生与UspA1或UspA2免疫结合的抗体，使所述抗体与所述肽接触；和

c)测定所述抗体与所述肽的结合。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗体是17C7、45-2、13-1、29-31、16A7、17B1或5C12。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体是17C7。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体是45-2。

47.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体是13-1。

48.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体是29-31。

49.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体是16A7。

50.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体是5C12。

51.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体是17B1。

52.根据权利要求43所述的方法，其中所述测定包括选自western印迹、ELISA、RIA和免疫亲和分离的免疫试验。

53.一种分离的肽，该肽具有粘膜炎莫拉菌UspA1或UspA2蛋白的至少7个连续的氨基酸，其中所述肽包括位于所述UspA1蛋白(SEQ ID NO：1)的残基582-604、或所述UspA2蛋白(SEQ ID NO：3)的残基355-377。

54.根据权利要求53所述的分离的肽，其中所述肽的长度在7至60个氨基酸之间。

55.根据权利要求53所述的分离的肽，其中所述肽包含非UspA1或非UspA2的序列。

56.根据权利要求53所述的分离的肽，其中所述肽包含非粘膜炎莫拉菌的序列。

57.一种抗原组合物，它包含：

a)一种分离的肽，该肽具有粘膜炎莫拉菌UspA1或UspA2蛋白的至少7个连续的氨基酸，其中所述氨基酸包括位于所述UspA1蛋白(SEQ ID NO：1)的残基582-604、或所述UspA2蛋白(SEQ ID NO：3)的残基355-377，

b)药学上可接受的缓冲液或稀释剂。