CN1391610A - 粘膜炎莫拉氏菌的basb118多肽和多核苷酸 - Google Patents

粘膜炎莫拉氏菌的basb118多肽和多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明提供了BASB118多肽和编码BASB118多肽的多核苷酸，以及通过重组技术生产这些多肽的方法。并且提供了诊断的、预后的和治疗的用途。

Description

粘膜炎莫拉氏菌的BASB118多肽和多核苷酸
发明领域
本发明涉及多核苷酸(此处称作“BASB118多核苷酸”)，其编码的多肽(此处称作“BASB118”或者“BASB118多肽”)，重组材料及其制备方法。另一方面，本发明涉及使用这些多肽和多核苷酸的方法，包括针对细菌感染的疫苗。另一方面，本发明涉及检测某些病原体感染的诊断分析。
发明背景
粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)(也称作粘膜炎布兰汉球菌Branhamella catarrhalis)是革兰氏阴性菌，常常从人体上呼吸道分离得到。它是造成几种病变的原因，主要有幼儿和儿童中耳炎，和老年人肺炎。它也是造成窦炎和医院感染的原因，并且不太经常的造成入侵性疾病。
中耳炎在病例数目和其潜在后遗症来说，都是一种重要的儿童疾病。美国每年有超过350万病例报道，据估计80％的儿童在3岁之前都经历过至少一种耳炎症状(Klein，JO(1994)临床感染疾病(Clin.Inf.Dis)19：823)。除了未治疗的或者变成慢性的之外，该疾病可以造成暂时的(对于内耳液体积存的情况)或者永久的(如果听觉神经受损)听力损伤。对于幼儿，这样的听力损伤可能造成迟缓说话学习。
从有中耳炎的儿童中耳中，主要分离出3种细菌菌种：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，无型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)(NTHi)和粘膜炎莫拉氏菌。它们出现在60-90％的病例中。一篇近期研究的评论显示，肺炎链球菌和NTHi都出现在大约30％的中耳炎病例中，粘膜炎莫拉氏菌出现在大约15％的中耳炎病例中(Murphy，TF(1996)微生物学综述(Microbiolo.Rev.)60：267)。也可以从中耳中分离出其他细菌(B型流感嗜血杆菌，化脓链球菌等)，但是频率很低(2％或者更低的病例)。
流行病学数据显示，对于在中耳中发现的病原体来说，在上呼吸道定居是发生耳炎的绝对前提；而其他条件对于引起疾病也是需要的(Dickinson，DP等(1998)传染病学杂志(J.Infect.Dis.)158：205，Faden，HL等(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100：612)。这对于引发细菌通过耳咽管移植到中耳是重要的，接着便开始发炎过程。今天这些因素是已知的。假定，例如，免疫系统在病毒感染后的暂时性异常，可能造成不能控制呼吸道定居(Faden，HL等(1994)传染病学杂志(J.Infect.Dis.)169：1312)。另一种解释是，暴露于环境因素使得有些儿童具有更重要的定居，因为中耳病原体的持续存在，使得他们随后变得易发生中耳炎(Murphy，TF(1996)微生物学综述(Microbiolo.Rev.)60：267)。
粘膜炎莫拉氏菌免疫反应的特征很少。依次从0-2岁婴儿鼻咽分离的菌株的分析显示，抗他们频繁的得到和排除新菌株。这表明被定居的儿童，可以增加抗该细菌有效的免疫反应(Faden，HL等(1994)传染病学杂志(J.Infect.Dis.)169：1312)。
在大多数被试成年人中鉴定出细菌抗体(Chapman，AJ等(1985)传染病学杂志(J.Infect.Dis.)151：878)。粘膜炎莫拉氏菌菌株，在抵抗血清杀菌活性能力上有各种变化：一般的，从患病个体分离的细菌，比从仅被定居的个体分离的细菌具有更强的抵抗性(Hol，C等(1993)论坛(Lancet)341：1281，Jordan，KL等(1990)美国药学杂志(Am.J.Med.)88(增刊.5A)：28S)。因此，血清抗性可以被看作细菌的一个毒性因素。在从中耳炎恢复的儿童的血清中观测到调理活性。
除了OMP B1，84kDa蛋白质，该蛋白质的表达受铁的调节，并且可以被肺炎患者的血清识别(Sethi，S，等(1995)感染·免疫(Infect.Immun.63：1516)，以及除UspA1和UspA2(Chen D.等(1990)，感染·免疫(Infect.Immun.)67：1310)之外，被人体中这些不同免疫反应作为目标的抗原还没有得到鉴定。
出现在粘膜炎莫拉氏菌表面的许多其他膜蛋白，可以通过生物化学方法表现其特征，或者对于它们在诱导保护性免疫方面的潜在本质(综述参见Murphy，TF(1996)微生物学综述(Microbiol.Rev.)60：267)进行表征。在鼠的肺炎模型中，针对它们(UspA，CopB)增加的抗体的出现，促进肺部感染更快的清除。另一种多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中高度保守，并且与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的一种膜空蛋白具有同源性，证明它可以在动物模型中有效地对抗该细菌。
在过去几十年中，粘膜炎莫拉氏菌感染的频率有惊人的增加。这归因于多种抗生素抗性菌株的出现，以及具有弱化免疫系统人群的增加。分离出抵抗部分或者全部标准抗生素的粘膜炎莫拉氏菌菌株已经不再罕见。这一现象造成未能满足的医疗需要，以及对新的抗微生物药剂、疫苗、药物筛选方法和对该微生物诊断检测的需求。
发明概述
本发明涉及BASB118，特别是涉及BASB118多肽和BASB118多核苷酸、重组材料及其制备方法的。另一方面，本发明涉及使用这些多肽和多核苷酸的方法，其中包括微生物疾病的预防和治疗。另一方面，本发明涉及微生物感染相关疾病检测的诊断分析和这种感染相关条件，例如检测BASB118多核苷酸或者多肽表达或者活性的分析。
通过阅读以下描述和阅读本公开内容的其他部分，在本公布发明的精神和范畴内的各种变化和更改，对于技术熟练者来说是很明显的。
发明描述
本发明涉及BASB118多肽和多核苷酸，以下有更详细的描述。本发明特别涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB118多肽和多核苷酸，其特征是一种含有信号序列的脂蛋白，该信号序列是脂蛋白的特征，因此预测它在表面表达。本发明尤其涉及这样的BASB118，该BASB118具有分别列在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的核苷酸和氨基酸序列。在序列表(Sequence Listing)中“DNA”下引用的序列，被理解为代表本发明实施方案的一个实施例，因为熟悉常规技术者可以认识到，这些序列一般可以有效地用于多核苷酸中，包括核糖多核苷酸。
多肽
本发明的一个方面提供了粘膜炎莫拉氏菌的多肽，在此处被称作“BASB118”和“BASB118多肽”，和其生物学上、诊断上、预防上、临床上或者治疗上有用的变体，以及含有这些成分的组合物。
本发明进一步提供：
(a)分离的多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少85％同一性，优选的有至少90％同一性，更优选的有至少95％同一性，最优选的有至少97-99％的同一性或者完全相同；
(b)分离的多核苷酸编码的多肽，该分离的多核苷酸的多核苷酸序列与SEQ ID NO：1在SEQ ID NO：1全长上有至少85％同一性，优选的有至少90％同一性，更优选的有至少95％同一性，最优选的有至少97-99％的同一性或者完全相同；
(c)分离的多核苷酸编码的多肽，该分离的多核苷酸的多核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少85％同一性，优选的有至少90％同一性，更优选的有至少95％同一性，最优选的有至少97-99％的同一性或者完全相同。
SEQ ID NO：2提供的BASB118多肽，是粘膜炎莫拉氏菌MC2931(ATCC43617)菌株的BASB118多肽。
本发明也提供了BASB118多肽的免疫原性片段，即BASB118多肽的邻接部分，其具有与具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽相同的或者基本相同的免疫活性；也就是说，该片段(如果需要可以与载体结合)能够引起识别BASB118多肽的免疫反应。这样的免疫原性片段可以包括，例如缺少N-末端前导序列、和/或跨膜区域和/或C-末端锚定区域的BASB118多肽。在一个优选的方面，根据本发明的BASB118的免疫原性片段包括这样一种多肽的几乎全部细胞外区域，该多肽与SEQID NO：2在SEQ ID NO：2全长上，有至少85％同一性，优选的有至少90％同一性，更优选的有至少95％同一性，最优选的有至少97-99％的同一性。
片段是含有氨基酸序列的多肽，它与本发明任何多肽氨基酸序列的一部分完全相同，而不是与全部氨基酸序列相同。至于BASB118多肽，片段可以是“游离状态”，或者是包含在更大的多肽之中，它们形成更大的多肽的一部分或者一个区域，最优选的是作为单个更大多肽的单独连续区域。
优选的片段包括，例如，具有SEQ ID NO：2氨基酸序列或者其变体的一部分的截短的多肽，例如包括氨基-和/或羧基-末端氨基酸序列的残基连续系列。通过宿主细胞产生的或者宿主细胞内的本发明多肽的降解形式，也是优选的。更优选的是具有结构或者功能特征的片段，例如含有α-螺旋或者α-螺旋形成区域的片段、含有β-折叠和β-折叠形成区域的片段、含有转角和转角形成区域的片段、含有卷曲和卷曲形成区域的片段、含有亲水区域的片段、含有疏水区域的片段、含有α两亲性区域的片段、含有β两亲性区域区域的片段、含有柔性区域的片段、含有表面形成区域的片段、含有底物结合区域的片段以及含有高抗原索引区域的片段。
更优选的片段包括这样的分离的多肽，该分离多肽的氨基酸序列含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的至少15，20，30，40，50或者100个连续氨基酸，或者这样的分离的多肽，该多肽的氨基酸序列含有从SEQ ID NO：2氨基酸序列剪切或者缺失的至少15，20，30，40，50或者100个连续氨基酸。
本发明多肽的片段可以用于通过肽合成制备相应的全长多肽；因此，这些片段可以用作制备本发明全长多肽的中间体。
其中的几个，5-10，1-5，1-3，1-2或者1个氨基酸以任意组合被替换、缺失或者添加的变体是特别优选的。
本发明的多肽或者免疫原性片段，可以是“成熟”蛋白的形式，或者可以是像前体或者融合蛋白这样更大蛋白的一部分。包含一段额外的氨基酸序列经常是有利的，这包括分泌或者前导序列、前序列、象多聚组氨酸这样有助于纯化的序列，或者在重组制备中用于稳定的额外序列。另外，也可以考虑添加提高最终分子免疫原性潜力的外源多肽或者脂质尾部或者多核苷酸序列。
一方面，本发明涉及遗传工程可溶性融合蛋白，该蛋白含有本发明的多肽或者其片段，以及免疫球蛋白各种亚类(IgG，IgM，IgA，IgE)重链或者轻链恒定区的各种部分。优选的免疫球蛋白是，人体IgG，特别是IgG1重链的稳定部分，融合发生在铰链区。在一个特别优选的实施方案中，可以通过与剪切序列结合而简单地除去Fc部分，该剪切序列可以被凝血因子Xa剪切。
另外，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，并且涉及其药物筛选、诊断和治疗的用途。本发明的另一方面涉及编码这种融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的实施例可以在国际专利申请WO94/29458和WO94/22914中找到。
蛋白质可以化学结合，或者作为重组融合蛋白表达，这与非融合蛋白相比，可以允许提高表达系统生产的水平。融合配偶体可以有助于提供T辅助细胞抗原决定簇(免疫融合配偶体)，特别是人体识别的T辅助细胞抗原决定簇，或者有助于以比天然重组蛋白更高的产量表达蛋白质(表达增强子)。优选的融合配偶体既是免疫融合配偶体，又是表达增强配偶体。
融合配偶体包括来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白D和来自流感病毒NS1(血凝素)的非结构蛋白。另一种融合配偶体是称为LytA的蛋白。优选使用分子的C末端部分。Lyta来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，它合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶LytA(lytA基因编码{Gene，43(1986)265-272页})，一种特异性降解肽聚糖主链某些键的自溶素。LytA蛋白的C末端区域负责与胆碱或者某些胆碱类似物结合，例如DEAE。该性质被用于开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LytA表达质粒。对于在氨基末端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化，已有描述{生物技术(Biotechnology)：10，(1992)795-798页}。可以使用LytA分子的重复部分，该重复部分位于C末端起始于178残基，例如残基188-305。
本发明也包括前述多肽的变体，即通过保守氨基酸替换而与目标对象不同的多肽，保守氨基酸替换是指用另一个具有相似性质的残基替换一个残基。典型的这种替换发生在丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间；丝氨酸和苏氨酸之间；酸性残基天冬氨酸和谷氨酸之间；天冬酰胺和谷氨酰胺之间；碱性残基赖氨酸和精氨酸残基之间；或者芳香族残基苯丙氨酸和酪氨酸之间。
本发明的多肽可以用任何合适的方法制备。这些多肽包括分离的天然存在的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽，或者组合这些方法产生的多肽。制备这些多肽的方法，在技术上是熟知的。
本发明的多肽最优选的是来自粘膜炎莫拉氏菌，然而，也可以优选从同一分类学属的其他生物体获得。例如，本发明多肽也可以从同一分类学科或者目的生物体获得。
多核苷酸
本发明的一个目标是提供编码BASB118多肽的多核苷酸，特别是编码此处称作BASB118多肽的多核苷酸。
在本发明一个特别优选的实施方案中，该多核苷酸含有编码具有SEQ ID NO：1中列出序列的BASB118多肽的区域，该区域包含全长基因或者其变体。
SEQ ID NO：1提供的BASB118多核苷酸，是来自粘膜炎莫拉氏菌MC2931(ATCC 43617)菌株的BASB118多核苷酸。
本发明的另一方面提供了分离的编码和/或表达BASB118多肽和多核苷酸的核酸分子，特别是粘膜炎莫拉氏菌BASB118多肽和多核苷酸，例如包括，未加工RNA、核酶RNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、B-DNA和Z-DNA。本发明的其他实施方案包括生物学上、诊断上、预防上、临床上或者治疗上有用的多核苷酸和多肽，以及其变体，以及含有它们的组合物。
本发明的另一个方面涉及分离的多核苷酸、与其有紧密关系的多核苷酸及其变体，该多核苷酸包括至少一条编码BASB118多肽的全长基因，该BASB118多肽具有SEQ ID NO：2推导出的氨基酸序列。
在本发明另一个特别优选的实施方案中，来自粘膜炎莫拉氏菌的BASB118多肽含有或者由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者其变体组成。
使用此处提供的信息，例如SEQ ID NO：1列出的多核苷酸序列，使用标准克隆或者筛选方法，例如，那些使用粘膜炎莫拉氏菌Catlin细胞作为起始物质，接着可以获得全长克隆的，克隆或者测序细菌染色体DNA片段的方法，可以获得编码BASB118多肽的本发明多核苷酸。例如，为了获得本发明的多核苷酸序列，例如SEQ ID NO：I给出的多核苷酸序列，典型的是使用放射性标记的来自部分序列的寡聚核苷酸，优选的是17-mer或者更长，探测粘膜炎莫拉氏菌Catlin在大肠杆菌或者其他合适宿主中的染色体DNA克隆文库。然后，使用严格杂交条件，可以辨别出携带有与探针DNA一致的DNA的克隆。使用由原始多肽或者多核苷酸序列设计的测序引物，对杂交鉴定的个体克隆进行测序，可以两个方向扩展多核苷酸序列，以确定全长基因序列。例如，可以使用由质粒克隆制备的变性双链DNA，方便的进行测序。合适的技术描述于Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，分子克隆，实验手册(MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL)，第二版，；冷泉港实验出版社.冷泉港，纽约(1989)(特别参见杂交筛选1.90和对变性的双链DNA模板的测序13.70(Screening ByHybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-StrandedDNA Templates 13.70))。也可以进行基因组DNA直接测序得到全长基因序列。本发明说明，SEQ ID NO：1列出的多核苷酸发现于来自粘膜炎莫拉氏菌的DNA文库。
另外，SEQ ID NO：1列出的DNA序列含有编码一种蛋白质的可读框，该蛋白质具有大约SEQ ID NO：2列出的氨基酸残基数目，可以使用本领域技术人员公知的氨基酸残基分子量计算该蛋白质的推导出的分子量。
SEQ ID NO：1的多核苷酸，在SEQ ID NO：1核苷酸编号1的起始密码子和开始于核苷酸编号1159的终止密码子之间，编码SEQ IDNO：2的多肽。
另一方面，本发明提供含有或者由以下序列组成的分离的多核苷酸：
(a)多核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO：1在SEQ ID NO：1全长上有至少85％同一性，优选的有至少90％同一性，更优选的有至少95％同一性，甚至更优选的有至少97-99％的同一性或者完全相同；或者
(b)编码多肽的多核苷酸序列，该多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列在SEQ ID NO：2全长上，有至少85％同一性，优选的有至少90％同一性，更优选的有至少95％同一性，甚至更优选的有至少97-99％的同一性或者100％完全相同。
本发明编码多肽的多核苷酸，包括来自粘膜炎莫拉氏菌以外其他菌种的同源物和直向同源物，可以通过包括以下步骤的方法获得：在严格杂交条件下(例如，使用温度范围45-65℃，SDS浓度0.1-1％)，使用包含或者由SEQ ID NO：1序列或者其片段组成的标记或者可探测探针，筛选合适的文库；分离含有该多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆。
本发明提供在其全长上与SEQ ID NO：1编码序列(可读框)一致的多核苷酸序列。本发明也提供了成熟多肽或者其片段的编码序列的本身，或者阅读框架中成熟多肽或者其片段的编码序列和另一段编码序列，例如编码前导或者分泌序列、前蛋白序列、或者原蛋白序列、或者前原蛋白序列的序列。本发明多核苷酸也含有至少一段非编码序列，例如，包括但是不仅仅局限于，至少一段5’和3’非编码序列，例如转录但是不翻译的序列，终止信号(例如依赖rho的和不依赖rho的终止信号)，核糖体结合位点，Kozak序列、稳定mRNA的序列、内含子和多聚腺苷酸信号。多核苷酸序列也可以包含编码附加氨基酸的额外编码序列。例如，可以编码有助于融合多肽纯化的标记序列。在本发明某些实施方案中，标记序列是6组氨酸肽，如在pQE载体(Qiagen，Inc)中提供的，描述于Gentz等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)86：821-824(1989)，或者HA肽标记(Wilson等，细胞(Cell)37：767(1984))，它们都可以用于纯化与之融合的多肽序列。本发明的多核苷酸，也包括但是不仅仅局限于，含有结构基因和其控制基因表达的天然相关序列的多核苷酸。
编码SEQ ID NO：2的BASB118多肽的核苷酸序列，可以与包含在SEQ ID NO：1的1至1158核苷酸中的多肽编码序列一致。另外，它也可以是这样的序列，该序列作为遗传密码冗余(简并)的结果，也编码SEQ ID NO：2的多肽。
如此处所用的术语“编码多肽的多核苷酸”包含这样的多核苷酸，该多核苷酸包括编码本发明多肽的序列，特别是细菌多肽，更特别是具有SEQ ID NO：2中列出氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌BASB118多肽。该术语也包含这样的多核苷酸，该多核苷酸包括编码多肽(例如，被整合噬菌体、整合插入序列、整合载体序列、整合转座子序列中断的多核苷酸，或者由于RNA编辑或者基因组DNA重组中断的多核苷酸)的单独连续区域或者不连续区域，以及额外区域，也含有编码和/或非编码序列。
本发明进一步涉及此处描述的多核苷酸的变体，这些多核苷酸变体编码具有SEQ ID NO：2推导出的氨基酸序列多肽的变体。本发明多核苷酸的片段也可以用于，例如合成本发明全长多核苷酸。
更加特别优选的实施方案，是编码BASB118变体的多核苷酸，该变体具有SEQ ID NO：2 BASB118多肽的氨基酸序列，其中若干、许多、5-10、1-5、1-3、2、1或者没有氨基酸残基以任何组合被替换、修饰、缺失和/或添加。特别优选的是不改变BASB118多肽的性质和活性的沉默替换，添加和缺失。
本发明另一个优选的实施方案是这样的多核苷酸以及与这种多核苷酸互补的多核苷酸，该多核苷酸在其全长上，与编码具有SEQ ID NO：2列出氨基酸序列的BASB118多肽的多核苷酸有至少85％的同一性。另外，最优选的是含有这样区域的多核苷酸及其互补多核苷酸，该区域在其全长上与编码BASB118多肽的多核苷酸有至少90％的同一性。在这点上，在其全长上与编码BASB118多肽的多核苷酸有至少95％同一性的多核苷酸是特别优选的。另外，在那些至少有95％同一性的多核苷酸中有至少97％同一性的那些多核苷酸是高度优选的，其中那些至少有98％和至少有99％同一性的那些多核苷酸是特别高度优选的，至少有99％同一性的是更加优选的。
优选的实施方案是编码多肽的多核苷酸，该多肽具有与SEQ IDNO：1的DNA编码的成熟多肽基本相同的生物功能或活性。
根据本发明某些优选的实施方案，提供了与BASB118多核苷酸序列杂交的多核苷酸，例如SEQ ID NO：1多核苷酸，特别是在严格杂交条件下。
本发明此外还涉及与此处提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。在这点上，本发明特别涉及在严格杂交条件下，和此处提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。如此处所用的，术语“严格条件”和“严格杂交条件”是指，只有当两条序列之间有至少95％同一性，优选的有至少97％同一性时，发生的杂交。严格杂交条件的一个特定实施例是，在含有以下组分的溶液中42℃孵育过夜：，50％甲酰胺，5×SSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH6.7)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸右旋糖苷，20mg/ml变性剪切鲑鱼精子DNA，然后用0.1×SSC在大约65℃清洗杂交载体。杂交和清洗条件是熟知的，在Sambrook等分子克隆：实验手册，第二版，冷泉港、纽约(MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor，N.Y.)，(1989)中有举例说明，特别是在其第11章。用本发明提供的多核苷酸序列也可以使用溶液杂交。
本发明也提供多核苷酸，该多核苷酸含有或者由这样的多核苷酸序列组成，该序列是在严格杂交条件下，使用探针，该探针具有所说的列在SEQ ID NO：1中的多核苷酸序列或者其片段的序列，针对SEQ IDNO：1列出的多核苷酸序列，筛选含有全部基因的合适文库而得到的；以及分离该多核苷酸序列。用于获得该多核苷酸的片段包括，例如此处其他部分详细描述的探针和引物。
正如此处其他部分关于本发明多核苷酸分析所讨论的，例如，本发明的多核苷酸，可以用作RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针，以分离编码BASB118的全长cDNA和基因组克隆，分离与BASB118基因有高度同一性的，特别是高度序列同一性的其他基因的cDNA和基因组克隆。这些探针通常含有至少15个核苷酸残基或者碱基对。优选的，这些探针具有至少30个核苷酸残基或者碱基对，并且可以具有至少50个核苷酸残基或者碱基对。特别优选的探针具有至少20个核苷酸残基或者碱基对，并且具有少于30个核苷酸残基或者碱基对。
用SEQ ID NO：1提供的DNA序列合成寡聚核苷酸探针，用该探针进行筛选，可以分离得到BASB118基因的编码区域。然后，使用具有与本发明基因序列互补序列的标记寡聚核苷酸，筛选cDNA、基因组DNA或者mRNA文库，以确定探针与文库中的哪些成员杂交。
有几种可以使用的，并且是本领域技术人员公知的方法，用于获得全长DNA，或者扩展短mDNA，例如那些基于cDNA末端快速扩增方法(Rapid Amplification of cDNA ends)(RACE)(参见例如，Frohman，等，PANS USA 85：8998-9002，1988)的方法。新近的技术修改，例如以MarathonTM技术(Clontech Laboratories Inc.)为例，很大程度上简化了对较长cDNA的搜寻。在MarathonTM技术中，从由选定组织中提取的mRNA及与每个末端连接的“连接物”序列中，可以制备cDNA。然后使用基因特异的和连接物特异的寡聚核苷酸引物组合，进行核酸扩增(PCR)，以扩增DNA“缺失的”5’端。接着，使用“嵌套”引物重复PCR反应，嵌套引物是指为了扩增产物间退火而设计的引物(典型的是连接物特异引物，它在连接物序列的3’以外退火，以及基因特异的引物，它在所选基因序列的5’以外退火)。随后，可以通过DNA测序分析该反应的产物，并且可以通过把产物直接与已存在的DNA连接产生完全序列，或者使用用于5’引物设计的新序列信息进行单独的全长PCR，可以构建全长DNA。
正如此处关于多核苷酸分析所进一步讨论的，本发明的多核苷酸和多肽可以用作，例如疾病治疗和诊断发现的研究试剂和材料，特别是人体疾病。
那些来自序列SEQ ID NO：1的寡聚核苷酸的本发明多核苷酸，可以用于此处描述的方法中，以确定此处被鉴定的全部或者部分多核苷酸是在感染组织的细菌中转录的，优选的方法是PCR。已知这些序列也可以用于诊断病原体达到的感染阶段和感染类型。
本发明也提供编码多肽的多核苷酸，该是成熟蛋白质加额外的氨基或者羧基端氨基酸，或者成熟多肽的内部氨基酸(例如，当成熟形式有多于一条多肽链时)。这些序列可以在蛋白质从前体到成熟形式的加工过程中发挥作用，可以使得蛋白质运输发生，可以增长或者缩短蛋白质半寿期或者可以有利于蛋白质分析或者制备的操作，以及其他作用。正如通常体内的情形，额外氨基酸可以被细胞酶类从成熟蛋白质加工除去。
对于本发明的每一条和所有的多核苷酸，都提供了与其互补的多核苷酸。优选的，这些互补多核苷酸与每一条与之互补的多核苷酸完全互补。
前体蛋白质，具有与一条或者多条原序列融合的多肽成熟形式，可以是多肽的失活形式。当除去这些原序列时，这些失活前体通常被激活。在激活之前，可以除去部分或者全部的原序列。通常这些前体被称作原蛋白。
除了标准的核苷酸的A，G，C，T/U表示之外，术语“N”也可以用于描述本发明的某些多核苷酸。“N”是指在DNA或者RNA序列中，出现在指定位置的四个DNA或者RNA核苷酸的任意一个，除了优选的，当结合邻近核苷酸位置，阅读正确的阅读框架时，N不是这样的一个核酸，该核酸具有在这些阅读框架中产生成熟前终止子的作用。
总之，本发明多核苷酸可以编码成熟蛋白质，成熟蛋白质加前导序列(可以称作前蛋白)，具有一条或者多条原序列的成熟蛋白质前体，这些原序列不是前蛋白质的前导序列，或者前原蛋白质，它是原蛋白质的前体，具有前导序列和一条或者多条原序列，这些序列通常在产生多肽活性和成熟形式的过程中被除去。
根据本发明的一个方面，提供了本发明多核苷酸用于治疗和预防目的的用途，特别是遗传免疫。
本发明多核苷酸在遗传免疫中的用途，优选的使用合适的送递方法，例如肌肉直接注射质粒DNA(Wolff等，人类分子遗传学(Hum Mo1Genet)(1992)1：363，Manthorpe等，人类基因治疗(Hum.GeneTher.)(1983)4：419)，递送与特殊蛋白质载体结合的DNA(Wu等，生物化学杂志(J Biol Chem.)(1989)264：16985)，DNA与磷酸钙共沉淀(Benvenisty & Reshef，PNAS USA，(1986)83：9551)，把DNA包装于各种形式的脂质体中(Kaneda等，科学(Science)(1989)243：375)，颗粒轰击(Tang等，自然(Nature)(1992)356：152，Eisenbraun等，DNA细胞生物学(DNA Cell Biol)(1993)12：791)以及使用逆转录克隆载体的体内感染(Seeger等，PNAS USA(1984)84：5849)。
载体，宿主细胞，表达系统
本发明也涉及含有本发明一条或者多条多核苷酸的载体，经遗传工程操作具有本发明载体的宿主细胞，以及通过重组技术制备本发明多肽。使用来自本发明DNA构建体的RNA，也可以使用无细胞翻译系统生产这些蛋白质。
本发明重组多肽，可以使用本领域技术人员公知的方法，从含有表达系统的遗传工程宿主细胞制备。因此，另一方面，本发明涉及含有本发明一条或者多条多核苷酸的表达系统，经遗传工程操作具有这些表达系统的宿主细胞，以及通过重组技术制备本发明多肽。
对于本发明多肽的重组制备，宿主细胞可以经遗传操作而结合本发明表达系统或者其部分或者多核苷酸。可以通过描述于很多标准实验室手册的方法，例如Davis，等，分子生物学基础方法(BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)，(1986)和Sambrook，等，分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，N.Y.(1989)，例如磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、转位、微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、刮擦装载、弹道引入以及感染，有效地把多核苷酸导入宿主细胞。
合适宿主细胞的代表性实施例包括，细菌细胞，例如链球菌、葡萄球菌、肠球菌、大肠杆菌、链霉菌、蓝藻类细菌、枯草芽孢杆菌、脑膜炎奈球菌和粘膜炎莫拉氏菌细胞；真菌，例如酵母、克鲁维酵母菌、酿酒酵母、担子菌、白色念珠菌和曲霉菌细胞；昆虫细胞，例如Drosophila S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞，例如CHO、COS、Hela、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑色素瘤细胞；以及植物细胞，例如裸子植物和被子植物细胞。
各种各样的表达系统可以用于生产本发明多肽。这些载体其中包括，染色体来源的、附加体来源的和病毒来源的载体，例如来自细菌质粒的载体，来自噬菌体的载体，来自转座子的载体，来自酵母附加体的载体，来自插入元件的载体，来自酵母染色体元件的载体，来自例如杆状病毒、像SV40这样的乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、细小核糖核酸病毒、逆转录病毒和甲病毒这些病毒的载体，以及来自它们组合的载体，例如那些来自质粒和噬菌体遗传元件的载体，像是粘粒和噬菌粒。表达系统构建体可以含有调节并引起表达的控制区域。通常，在宿主细胞中适合维持、繁殖或者表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或者载体，都可以在这点上用于表达。可以通过各种熟知的和常规的技术，把合适的DNA序列插入表达系统，例如，像是列在Sambrook，等，分子克隆，实验手册(MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL)，(上文)中的那些。
在真核细胞重组表达系统中，为了把翻译的蛋白质分泌到内质网内腔、周质空间或者细胞外环境中，可以将合适的分泌信号结合到表达多肽上。这些信号对于多肽可以是内源的，或者是异源信号。
使用熟知的方法，包括硫酸铵或者乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或者阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析，可以从重组细胞培养物中回收和纯化本发明多肽。最优选的是使用金属离子亲和层析(IMAC)用于纯化。当多肽在细胞内合成、分离和或者纯化过程中变性时，可以使用熟知的关于蛋白质再折叠的技术，再生其活性构象。
表达系统也可以是重组的活微生物，例如病毒或者细菌。感兴趣的基因可以被插入活的重组病毒或者细菌的基因组中。接种或者体内感染这些活的载体，可以引起抗原的体内表达，以及诱导免疫应答。用于这一目的的病毒和细菌举例来说有：痘病毒(例如牛痘，禽痘，canarypox)，甲病毒(新培斯病毒，Semliki Forest病毒，VenezuelianEquine Encephalitis病毒)，腺病毒，腺相关病毒，细小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)，疱疹病毒(水痘-带状疱疹病毒等)，这些病毒和细菌可以是毒性的，或者为了得到活的疫苗而以各种方式减毒的。这些活疫苗也组成了本发明的一部分。
诊断、预后、血清型和突变分析
本发明也涉及用作诊断试剂的本发明BASB118多核苷酸和多肽的用途。真核细胞中，特别是哺乳动物中，尤其是人体中，BASB118多核苷酸和/或多肽的检测，为疾病诊断、疾病阶段的诊断或者感染生物体对于药物的反应，提供了诊断方法。在核酸或者氨基酸水平上，使用各种熟知的方法以及此处提供的方法，可以检测真核细胞，特别是哺乳动物，尤其是人体，特别是感染了或者怀疑被感染了含有BASB118基因或者蛋白质生物体的那些人体。
可以从推定被感染的和/或已经被感染的个体机体物质中，获得用于预后、诊断或者其他分析的多肽和多核苷酸。这些来源的多核苷酸，特别是DNA或者RNA，可以直接用于检测，或者可以通过使用PCR或者其他任何分析前扩增技术进行酶促扩增。RNA，特别是mRNA，cDNA和基因组DNA，也可以以相同的方式使用。通过生物体所选多核苷酸的基因型分析，使用扩增，可以表征个体感染的或者固有的微生物菌种或者菌株的特征。通过与选自亲缘微生物对照序列基因型的比较得到的扩增产物大小的变化，可以检测缺失与插入，亲缘微生物优选的是同一属中不同的种，或者同一种中不同菌株。通过扩增DNA与标记BASB118多核苷酸序列的杂交，可以鉴定点突变。通过分别对DNA或者RNA使用Dnase或者Rnase消化，或者通过测定融化温度或者复性动力学的不同，可以区分完全或者很大程度上匹配的序列与不完全或者很大程度上不匹配的双螺旋。通过多核苷酸片段在凝胶中，与对照序列相比电泳迁移率的变化，也可以检测多核苷酸序列的不同。这可以使用或者不使用变性剂进行。通过直接DNA或者RNA测序，也可以检测多核苷酸的不同，参见例如，Myers等，科学(Science)，230：1242(1985)。通过核酸酶保护分析，例如Rnase、V1和S1保护分析，或者化学剪切方法，也可以显示特殊位置的序列改变。参见例如，Cotton等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，85：4397-4401(1985)。
在另一个实施方案中，可以构建含有BASB118核酸序列或者其片段的一批寡核苷酸探针，进行有效筛选，例如，遗传突变、血清型、分类学分类或者鉴定的筛选。阵列技术方法是熟知的，具有全面的适用性，并且可以用于各种分子遗传学问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传多样性(参见例如，Chee等，科学(Science)，274：610(1996))。
因此，本发明的一个方面涉及含有以下组分的诊断试剂盒：
(a)本发明的多核苷酸，优选的是SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或者其片段；
(b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(c)本发明的多肽，优选的是SEQ ID NO：2的多肽，或者其片段；或者
(d)本发明多肽的抗体，优选的是SEQ ID NO：2多肽的抗体。
更明白在任何这种试剂盒中，(a)，(b)，(c)，(d)可以含有大量成分。其中，这种试剂盒在诊断疾病或者疾病易感性中是有用的。
本发明也涉及本发明多核苷酸作为诊断试剂的用途。本发明多核苷酸的突变形式，优选的是SEQ ID NO：1的突变形式，其与疾病或者致病性有关，为诊断提供了一种诊断工具，该工具可以增加或者确定疾病诊断、疾病过程预后、疾病阶段确定、或者疾病易感性，这是由于多核苷酸的低表达、过量表达或者变化表达引起的。在多核苷酸水平上，通过各种技术，例如此处其他部分描述的那些技术，可以检测携带有这些多核苷酸突变体的微生物，特别是有感染力的微生物。
在多核苷酸或者多肽水平上，通过各种技术，例如血清分型技术，也可以检测携带有本发明多核苷酸和/或多肽突变体或者多态性(等位基因变体)的微生物细胞。例如，可以使用RT-PCR检测RNA突变。特别优选的是结合自动检测系统使用RT-PCR，例如像是GeneScan这样的。RNA，cDNA或者基因组DNA也可以用于同样的目的，PCR。作为一个实施例，可以使用与编码BASB118多肽的多核苷酸互补的PCR引物，鉴定和分析突变体。
本发明进一步提供从5’和/或3’端除去1，2，3或者4个核苷酸的引物。其中，这些引物可以用于扩增分离的BASB118 DNA和/或RNA，这些分离的核酸从来自个体样品，例如机体物质。可以使用引物扩增从感染个体分离的多核苷酸，从而多核苷酸可以用于各种阐明多核苷酸序列的技术。按这种方法，可以检测多核苷酸序列的突变，并且可以使用这些突变诊断和/或预后感染或者其阶段或者过程或者血清型和/或把感染病因分类。
本发明进一步提供了诊断疾病的方法，优选的是细菌感染，更优选的是粘膜炎莫拉氏菌造成的感染，该方法包括，从来自个体的样品，例如来自机体物质的样品，确定具有SEQ ID NO：1序列多核苷酸提高的表达水平。可以使用任何技术上熟知的多核苷酸定量方法，例如，像是扩增、PCR、RT-PCR、RNA酶保护、Northern杂交、分光法和其他杂交方法，测量BASB118多核苷酸增高的或者减少的表达。
另外，依照本发明用于检测BASB118多肽相对于正常对照组织样品过量表达的诊断分析，可以用于检测，例如感染的存在。用于确定来自宿主样品，例如来自机体物质样品中的BASB118多肽水平的分析技术，对于本领域技术人员是公知的。这些分析方法包括放射免疫分析、竞争结合分析、Western杂交分析、抗体夹心分析、抗体检测和ELISA分析。
本发明多核苷酸可以用作多核苷酸分析的组分，优选的是高密度阵列或者格栅(grid)。这些高密度阵列对于诊断和预后目的特别有用。例如，使用得自或者来自机体样品的探针，各自含有不同基因的一系列点，并且进一步含有本发明一条或者多条多核苷酸，可以用于探测，例如使用杂交或者核酸扩增，以确定特殊多核苷酸序列或者相关序列在个体中的存在。这种存在可以指示病原体的存在，特别是粘膜炎莫拉氏菌，并且在疾病或者疾病过程的诊断和/或预后中也是有用的。含有许多SEQ ID NO：1序列多核苷酸变体的格栅是优选的。含有许多编码SEQ ID NO：2多肽序列的多核苷酸序列变体的格栅，也是优选的。
抗体
本发明的多肽和多核苷酸或者其变体，或者表达这些物质的细胞，都可以用作产生分别对这些多肽或者多核苷酸具有免疫特异性抗体的免疫原。术语“免疫特异性”是指，抗体与本发明多肽的亲和力，比它与已知技术中的其他相关多肽的亲和力强很多。
在本发明的某些优选实施方案中，提供了抗BASB118多肽或者多核苷酸的抗体。
通过操作本发明多肽和/或多核苷酸，或者其带有抗原决定簇的片段，其类似物，或者表达它们的细胞，使用常规技术，在动物中，优选的是非人类的动物，可以得到针对本发明多肽或者多核苷酸产生的抗体。为了制备单克隆抗体，可以使用任何提供通过连续细胞系培养产生抗体的本领域已知的技术。实施例包括各种各样的技术，例如Kohler，G.和Milstein，C.，自然(Nature)256：495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫学(Immunology Today)4：72(1983)；Cole等，pg.77-96单克隆抗体和癌症治疗(MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY)，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的那些技术。
生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)适合生产本发明多肽或者多核苷酸的单链抗体。并且，转基因小鼠，或者其他生物体或者动物，例如其他哺乳动物，可以用于表达对本发明多肽或者多核苷酸免疫特异的人源抗体。
另外，也可以使用噬菌体展示技术，从为含有抗-BASB118而筛选的PCR扩增的人体淋巴细胞v-基因库中，或者天然文库中，选择具有与本发明多肽结合活性的抗体基因(McCafferty，等，(1990)，自然(Nature)348，552-554；Marks，等，(1992)生物技术(Biotechnology)10，779-783)。通过例如链改组也能改善这些抗体的亲和性(Clackson等，(1991)自然(Nature)352：628)。
上述抗体可以用于分离或者鉴定表达本发明多肽或者多核苷酸的克隆，例如通过亲和层析纯化多肽或者多核苷酸。
因此，在其中，可以使用抗BASB118-多肽或者BASB118-多核苷酸的抗体治疗感染，特别是细菌感染。
多肽变体包括，抗原等价物变体、抗原决定簇等价物变体或者免疫等价物变体，构成本发明的一个特殊方面。
优选的，修饰抗体或者其变体，使之在个体中免疫原性更小。例如，如果个体是人体，抗体可以最优选的被“人源化”，其中互补决定区或者来自杂交瘤抗体的区域已经被移植到人体单克隆抗体中，例如描述于Jones等(1986)，自然(Nature)321，522-525或者Tempest等，(1991)生物技术(Biotechnology)9，266-273中的。
拮抗剂和激动剂-分析和分子
本发明多肽和多核苷酸可以用于估定，在例如细胞、无细胞制备物、化学库和天然产物混合物中，小分子底物与配体的结合。这些底物和配体可以是天然底物和配体，或者是结构或者功能类似物。参见例如，Coligan等，当代免疫学方法(Current Protocols inImmunology)1(2)：第5章(1991)。
依靠直接或者间接与候选化合物结合的标记，筛选方法可以简单地测定候选化合物与多肽或者多核苷酸的结合，或者与带有多肽或者多核苷酸的细胞或者膜结合，或者与多肽的融合蛋白结合。另外，筛选方法可以包括与标记竞争物的竞争。另外，使用适合于含有多肽或者多核苷酸细胞的检测系统，这些筛选方法，可以检验候选化合物是否会导致通过激活或者抑制多肽或者多核苷酸而产生信号。通常在已知激动剂存在时分析活性抑制剂，并且通过已知激动剂的存在，观测激动剂对于活性的作用。在激动剂或者抑制剂不存在的情况下，通过检验候选化合物是否导致多肽或者多核苷酸活性的抑制，视情况而定，组成型活性多肽和/或组成型表达多肽和多核苷酸，可以用于对相反激动剂或者抑制剂的筛选方法。另外，筛选方法可以简单地包括这些步骤：在含有多肽或者多核苷酸的溶液中混合候选化合物以形成混合物，测定混合物中BASB118多肽和/或多核苷酸的活性，以及相对于标准，比较混合物中BASB118多肽和/或多核苷酸的活性。如此处所描述的融合蛋白，例如由Fc部分和BASB118多肽制造的那些融合蛋白，也可以用于高产筛选分析，该高产筛选分析可以鉴定本发明多肽的拮抗剂，以及系统发生和/或功能相关多肽的拮抗剂(参见D.Bennett等，分子识别杂志(J Mol Recognition)，8：52-58(1995)；和K.Johanson等，生物化学杂志(J Biol Chem)，270(16)：9459-9471(1995))。
与本发明多肽结合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗体，也可以用于配置筛选方法，该筛选方法用于检测添加的化合物对于细胞中mRNA和/或多肽产生的作用。例如，可以构建ELISA分析，使用单克隆或者多克隆抗体，通过本领域已知的标准方法来测量多肽的分泌或者细胞结合水平。这可以用于从适合操作的细胞或者组织中，发现抑制或者增强多肽生产的物质(也分别称作拮抗剂和激动剂)。
本发明也提供了筛选化合物的方法，特别是那些抑菌的和/或杀菌的化合物，该方法可以鉴定那些增强(激动剂)或者阻滞(拮抗剂)BASB118多肽或者多核苷酸功能的化合物。筛选技术可以包括高产量技术。例如，为了筛选激动剂或者拮抗剂，在可能是BASB118激动剂或者拮抗剂的候选分子存在或者不存在地情况下，孵育含有BASB118多肽和该多肽标记底物或者配体的合成反应混合物、像膜这样的细胞区室、细胞包膜或者细胞壁、或者它们的制备物。候选分子激动或者拮抗BASB118多肽的能力，反映在标记配体结合的减少或者从该底物产生产物产量的减少。义务结合的分子，即不诱导BASB118多肽作用的分子，最有可能是好的拮抗剂。结合好的分子，并且视情况而定，可以增加从底物产生产物的速率、增加信号传导、或者增加化学通道活性的分子，是激动剂。速率的测定，或者视情况而定，从底物产生产物的效率、信号传导、或者化学通道活性的测定，都可以使用报告系统得以增强。在这点上有用的报告系统，包括但是不仅仅局限于，比色分析、转化成产物的标记底物、负责改变BASB118多核苷酸或者多肽活性的报告基因、以及本领域已知的结合分析。
BASB118激动剂分析的另一个实施例是竞争分析，该分析在合适条件下，为了竞争抑制分析，结合BASB118和BASB118结合分子的潜在激动剂，重组BASB118结合分子，天然底物或者配体，或者底物或者配体的模拟物。BASB118可以使用例如放射性或者比色混合物标记，例如可以准确确定与结合分子结合的BASB118分子或者转化为产物的BASB118分子，从而估定潜在拮抗剂的效力。
潜在拮抗剂其中包括，与本发明多核苷酸和/或多肽结合，并从而抑制或者消除其活性或者表达的有机小分子、肽、多肽和抗体。潜在拮抗剂，也可以是像是与结合分子在相同位点结合的紧密相关蛋白质或者抗体这样的有机小分子、肽、多肽和抗体，例如这样的结合分子，该分子不诱导BASB118诱导的活性，从而通过排除BASB118多肽和/或多核苷酸的结合，阻止BASB118多肽和/或多核苷酸的功能或者表达。
潜在拮抗剂包括这样的小分子，该小分子结合并且占据多肽的结合位点，从而与细胞结合分子结合，以致阻止正常生物活性。小分子的实施例包括但是不仅仅局限于，有机小分子、肽和肽相似分子。其他潜在拮抗剂包括反义分子(关于这些分子的描述，参见Okano，神经化学杂志(J.Neurochem.)56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSEINHIBITORS OF GENE EXPRESSION)，CRC Press，Boca Raton，FL(1998)。优选的潜在拮抗剂包括与BASB118相关的化合物或者BASB118变体。
另一方面，本发明涉及遗传工程可溶性融合蛋白，该融合蛋白包含本发明多肽或者其片段，以及免疫球蛋白各亚类(IgG，IgM，IgA，IgE)重链或者轻链恒定区各个部分。优选的免疫球蛋白是，人体IgG，特别是IgG1重链的稳定部分，融合发生在铰链区。在一个特别优选的实施方案中，可以通过与剪切序列结合而简单地除去Fc部分，该剪切序列可以被凝血因子Xa剪切。另外，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，并且涉及其药物筛选、诊断和治疗的用途。本发明的另一方面涉及编码这种融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的实施例可以在国际专利申请Nos.WO94/29458和WO94/22914中找到。
此处提供的每条多核苷酸序列，都可以用于发现和开发抗菌化合物。编码的蛋白质，一旦表达，便可以用作筛选抗菌药物的目标。另外，这样的多核苷酸可以用于构建控制感兴趣编码序列表达的反义序列，该多核苷酸编码被编码蛋白质氨基末端区域，或者核糖体结合序列，或者有助于各个mRNA翻译的序列。
本发明也提供了，本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或者拮抗剂在干扰病原体与真核的导致感染后遗症的宿主之间初始物理相互作用中的用途，优选的是哺乳动物的这种宿主。特别的，本发明分子可以用于：阻止细菌粘着，特别是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌与真核的，优选的是哺乳动物的细胞外基质蛋白内藏装置之间，或者与伤口处的细胞外基质蛋白之间的粘着；阻止真核的，优选的是哺乳动物的细胞外基质蛋白与介导组织损伤的细菌BASB118蛋白之间的细菌粘着，和/或；通过植入内藏装置或者通过其他手术技术，阻止初始感染的致病原因的正常发展。
同样依照本发明的另一方面，提供了BASB118激动剂和拮抗剂，优选的是抑菌的或者杀菌的激动剂和拮抗剂。
本发明的激动剂和拮抗剂可以用于，例如阻止、抑制和/或治疗疾病。
另一方面，本发明涉及本发明多肽的mimotope。mimotope是一段肽序列，与天然肽(在序列上或者结构上)有充分的相似性，它能够被识别天然肽的抗体所识别；或者当与合适的载体结合时，能够产生可识别天然肽的抗体。
可以为了特殊的目的，通过添加、缺失或者替换所选择氨基酸，可以设计肽的mimotope。因此，为了使与蛋白质载体的结合容易，可以对肽进行修饰。例如，对某些化学结合方法来说，包含末端半胱氨酸是值得做的。另外，对结合到蛋白质载体上的肽来说，在肽的结合末端包含疏水末端也是值得做的，这样肽游离的未结合末端保持与载体蛋白质表面的结合。因此，肽以这样的构像存在，该构像与在全部天然分子环境中发现的构像最相似。例如，可以改变肽使之具有N-末端半胱氨酸和C-末端酰胺化疏水尾部。另外，可以对一个或者多个氨基酸的D-立体异构体形式进行添加或者取代，从而创造有益的衍生物，例如增加肽的稳定性。
另外，可以使用抗体鉴定肽的mimotope，使用像是噬菌体展示技术(EP 0 552 267 B1)这样的技术，这些抗体自身可以与本发明多肽结合。该技术产生大量与天然肽结构相似的肽序列，并且因此能够结合抗天然肽的抗体，但是它们自身没有必要与天然多肽共有很大程度的序列同源性。
疫苗
本发明另一方面涉及在个体中诱导免疫反应的方法，特别是在哺乳动物中，优选的是在人体中，该方法包括对个体接种BASB118多核苷酸和/或多肽或者其片段或者变体，足以产生保护该个体免于感染的抗体和/或T细胞免疫反应，特别是细菌感染和最特别的是粘膜炎莫拉氏菌感染。也提供了这样的方法，由此这种免疫反应减慢细菌的复制。而本发明的另一方面，涉及在个体中诱导免疫反应的方法，为了在体内表达BASB118多核苷酸和/或多肽或者其片段或者变体，为了保护该个体免除疾病，优选的是人体，无论该疾病是否已经在个体中建立，诱导免疫反应，例如产生抗体和/或T细胞免疫反应，包括例如产细胞因子T细胞或者细胞毒性T细胞，该方法包括给这些个体递送核酸载体、序列或者核酶，以指导BASB118多核苷酸和/或多肽或者其片段或者变体表达。施用这些基因的一个实施例是，将其作为颗粒的包被或者其他东西，加速其进入所需细胞。这些核酸载体可以包括DNA、RNA、核酶、修饰核酸、DNA/RNA杂交体、DNA-蛋白质复合体或者RNA-蛋白质复合体。
本发明的另一方面涉及免疫组合物，当被导入个体，特别是人体时，该组合物能够在其中诱导免疫反应，在该个体中，诱导针对BASB118多核苷酸和/或由此编码多肽的免疫反应，其中该组合物包括重组BASB118多核苷酸和/或由其编码的多肽，和/或包括编码并表达该BASB118多核苷酸、由其编码的多肽、或者本发明的其他多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫反应可以用于治疗或者疾病预防，并且可以采取抗体免疫和/或细胞免疫的形式，例如由CTL或者CD4+T细胞发生的细胞免疫。
BASB118多肽或者其片段，可以与辅蛋白或者化学部分融合，这些辅蛋白或者化学部分虽然自身可以或者不可以产生抗体，但是能够稳定第一蛋白，并且产生具有抗原性和/或免疫原性，以及优选的保护特性的融合或者修饰蛋白。因此融合重组蛋白，优选的进一步包含抗原性辅蛋白，例如来自流感嗜血杆菌的脂蛋白D，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或者β-半乳糖苷酶，或者可以稳定蛋白质和有助于其生产与纯化的其他任何相关的大的辅蛋白。另外，从对接受蛋白的生物体免疫系统提供全身性刺激来说，辅蛋白可以作为佐剂。辅蛋白可以结合到第一蛋白的氨基端或者羧基端。
根据本发明的疫苗组合物中，BASB118多肽和/或多核苷酸，或者其片段，或者其mimotope，或者其变体，都可以存在于载体中，例如像是活的细菌载体那样的前述活的重组载体。
BASB118多肽的非活载体也是合适的，例如细菌外膜囊泡或者“泡(bleb)”。0M泡来自革兰氏阴性菌双层膜外膜，并且被记载于许多革兰氏阴性细菌中(Zhou，L等1998.FEMS微生物快报(FEMSMicrobiol.Lett.)163：223-228)，包括C.trachomatis和C.psittaci。被报道可以产生泡的细菌病原体的一份不详尽清单也包括：
百日咳博德特氏杆菌，布氏疏螺旋体，马尔他布鲁氏菌，绵羊布鲁化菌，大肠埃希氏杆菌，流感嗜血杆菌，侵肺军团菌，粘膜炎莫拉氏菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，铜绿假单胞菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。
泡具有可以提供天然构象外膜蛋白的优势，因此对于生产疫苗特别有用。通过工程改造细菌，从而改变一种或者多种外膜分子的表达，泡也可以经改进而用作疫苗用途。因此，可以引导或者上调(例如，通过改变启动子)，例如所需免疫原性蛋白在外膜的表达，例如BASB118多肽。另外，也可以下调不相关(例如，非保护性抗原，或者免疫显性但是易变的蛋白质)或者有害的(例如，毒性分子，像是LPS，或者自身免疫反应的潜在诱导物)外膜蛋白的表达。这些方法在下面有更详细的讨论。
BASB118基因两侧非编码区域，含有对于基因表达重要的调节元件。这种调节发生在转录和翻译水平上。在基因可读框的上游或者下游的这些区域的序列，可以通过DNA测序得到。这些序列信息允许确定潜在的调节基元，例如不同的启动子元件、终止子序列、诱导序列元件、阻抑物、负责相转变的元件、核糖体结合序列、具有潜在二级结构的参与调节的区域，以及其他类型的调节基元或者序列。该序列是本发明的另一个方面。
这些序列信息允许调节BASB118基因的天然表达。通过改变启动子、核糖体结合序列、潜在的阻抑物或者操纵基因元件、或者其他相关元件，可以实现基因表达的正调节。同样的，通过相似类型的调节，可以实现表达的负调节。另外，通过改变相改变序列，可以把基因的表达置于相改变的控制之下，或者将其与该调节分开。在另一种方法中，基因表达可被置于一个或者多个调节表达的诱导元件的控制之下。这种调节的实施例包括，但是不仅仅局限于，通过温度变化调节，添加与所选糖类或者其衍生物相似的诱导底物，微量元素、维生素、辅因子、金属离子，等等。
上述这些调节，可以通过几种不同的方法导入。参与基因表达的序列调节，可以通过随机突变，及随后筛选所需的表型，而在体内进行。另一种方法包括，分离感兴趣的区域，通过随机诱变或者定点替换、插入或者缺失突变，对该区域进行修饰。然后，通过同源重组可以把调节区域再次导入细菌基因组，并且可以估计它对基因表达的作用。在另一种方法中，可以使用感兴趣区域的序列知识，替换或者缺失全部或者部分天然调节序列。在这种情况下，为了从其他基因，来自不同基因的调节元件组合，合成调节区域，或者任何其他调节区域，获得调节元件，或者为了缺失野生型调节序列的所选部分，需要分离并修饰目标调节区域。这些经修饰的序列，通过同源重组可以被再次导入细菌基因组。可用于基因表达正调节的优选启动子的一份不详尽清单包括，来自淋病奈瑟氏球菌(N.meningitidis)或者脑膜炎奈瑟氏球菌(N.gonorroheae)的启动子porA，porB，1bpB，tbpB，p110，1st，hpuAB；来自粘膜炎莫拉氏菌(M.Catarrhalis)的启动子ompCD，copB，1bpB，ompE，UspA1；UspA2；TbpB；来自流感嗜血杆菌的启动子p1，p2，p4，p5，p6，1pD，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。
在一个实施例中，通过将其启动子与一个更强的启动子进行交换(通过分离基因的上游序列，对该序列进行体外修饰，并通过同源重组将其再次引入基因组)，可以调节基因表达。在细菌中，以及在从细菌脱落(或者制得)的外膜囊泡中，都可以获得上调的表达。
在另一个实施例中，所述方法可以用于产生重组细菌菌株，该菌株可以增强疫苗应用的特性。这些菌株可以是，但是不仅仅局限于，减毒菌株，提高所选抗原的表达的菌株，敲除(或者减少表达)干扰免疫反应基因的菌株，可以调节免疫优势蛋白质表达的菌株，可以调节外膜囊泡脱落的菌株。
因此，本发明也提供了BASB118基因的一段经修饰上游区域，该经修饰上游区域含有改变位于外膜的BASB118蛋白表达水平的异源调节元件。根据本发明的这一方面，上游区域包括BASB118基因的上游序列。该上游区域直接起始于BASB118基因的上游，通常延续到基因ATG起始密码子上游小于大约1000bp处。在基因位于多顺反子序列(操纵子)中的情况下，上游区域可以直接起始于感兴趣基因之前，或者操纵子中第一个基因之前。优选的，根据本发明的这一方面，经修饰的上游区域包含位于ATG上游500至700bp之间的异源启动子。
因此，本发明提供了在经修饰细菌泡中的BASB118多肽。本发明进一步提供了经修饰的宿主细胞，该细胞能够产生基于非活性膜的泡载体。本发明进一步提供了含有BASB118基因的核酸载体，该BASB118基因具有含有异源调节元件的经修饰上游区域。
本发明进一步提供了，根据本发明制备宿主细胞和细菌泡的方法。
本发明也提供了组合物，特别是疫苗组合物，以及包括本发明多肽和/或多核苷酸和免疫刺激DNA序列的方法，例如那些描述在Sato，Y等科学(Science)273：352(1996)中的方法。
本发明也提供了，在粘膜炎莫拉氏菌感染的动物模型中，遗传免疫试验所使用的多核苷酸构建中，使用所述多核苷酸或者其特殊片段的方法，这些多核苷酸或者其特殊片段编码细菌细胞表面蛋白的非变化区域。这些试验，用于鉴定能够激发预后或者治疗免疫反应的蛋白质抗原决定簇特别有效。为了开发用于哺乳动物，特别是人体中，细菌感染的预防物质或者治疗疗法，特别是粘膜炎莫拉氏菌感染，该方法被认为，为随后有特殊价值的单克隆抗体作了准备，该单克隆抗体来自成功抵抗或者清除感染的动物的必需器官。
本发明也包括疫苗制剂，该制剂包含结合合适载体的本发明的免疫原性重组多肽和/或多核苷酸，合适载体例如药学可接受载体。因为多肽和多核苷酸在胃中可以降解，所以它们优选的进行非肠道用药，包括例如，皮下、肌内、静脉内或者皮内用药。适合非肠道用药的制剂包括，消毒的含水或者不含水注射溶液，这些溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌化合物和溶质，其中溶质使制剂与个体的体液等渗，优选的是血液；消毒的含水或者不含水的悬浮液，该悬浮液可以包括悬浮剂或者增稠剂。制剂可以是单剂量或者多剂量的包装，例如，密封的安瓿和小瓶，并且可以在冻干的条件下储存，只需在使用前加入消毒的液体载体。
本发明的疫苗制剂也包括用于增强制剂免疫原性的佐剂系统。优选的佐剂系统优先激发TH1型反应。
免疫应答可以概括的划分为两个极端种类，即体液或者细胞介导的免疫应答(其传统特征分别是保护机制的抗体效应物和细胞效应物)。应答的这些种类分别称作TH1-型应答(细胞介导应答)和TH2-型免疫应答(体液应答)。
极端TH1-型免疫应答的特征是，产生抗原特异的单元型限制的细胞毒性T淋巴细胞，以及天然杀伤细胞应答。鼠的TH1-型应答的特征通常是，产生IgG2a亚型抗体，相应于人体中的IgG1型抗体。TH2-型免疫应答的特征是，产生大范围的免疫球蛋白同种型，包括鼠中的IgG1、IgA和IgM。
发展这两种类型免疫应答背后的驱动力，可以认为是细胞因子。高水平的TH1-型细胞因子，倾向于促成针对所给抗原的细胞介导免疫应答的诱导，而高水平的TH1-型细胞因子，倾向于促成针对所给抗原的体液免疫应答的诱导。
TH1和TH2-型免疫应答的划分不是绝对的。实际中，个体忍受的免疫应答可以被描述为TH1占优势或者TH2占优势。然而，按照Mosmann和Coffman描述的鼠CD4+ev T细胞克隆(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞：导致不同功能性质的细胞因子分泌的不同模式(TH1 and TH2 cells：different patterns oflymphokine secretion lead to different functionalproperties.)免疫学综述年报(Annual Review of Immunology)，7，p145-173)考虑细胞因子家族，常常是很合适的。惯例的，TH1-型应答是与T-淋巴细胞产生INF-γ和IL-2联系在一起的。其他经常与TH1-型免疫应答诱导直接相关的细胞因子，不是T-细胞产生的，例如IL-12。相反的，TH2-型应答与IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌是相关的。
已知某些疫苗佐剂特别适合于刺激TH1或者TH2-型细胞因子应答。接种疫苗或者感染之后，免疫应答TH1∶TH2平衡传统的最好指标包括，用抗原重复刺激之后，体外直接测定T淋巴细胞产生的TH1或者TH2细胞因子，和/或测定抗原特异性抗体应答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，TH1-型佐剂是这样的佐剂，它在体外用抗原重复刺激时，优先刺激分离的T-细胞群体产生高水平的TH1-型细胞因子，并且促进CD8+细胞毒性T淋巴细胞的发育和与TH1-型同种型相关的抗原特异性免疫球蛋白应答的发展。
能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂，描述于国际专利申请No.WO94/00153和WO 95/17209。
3去氧-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)是一种这样的佐剂。这是从GB2220211(Ribi)已知的。化学上，它是具有4，5或者6酰化链的3去氧-酰化单磷酰脂A的混合物，Ribi Immunochem.Mantana制造。3去氧-酰化单磷酰脂A的优选形式公布于欧洲专利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)。
优选的，3D-MPL颗粒是足够小的，小到可以通过0.22微米膜除菌(欧洲专利0 689 454)。3D-MPL以每剂量10μg-100μg的范围优选25-50μg出现，其中抗原典型的是出现在每剂量2-50μg范围。
另一种优选的佐剂包含QS21，来自Quillaja Saponaria Molina树皮的一种Hplc纯化的无毒部分。可以选择将其与3去氧-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)混合，也可以选择连同载体一起使用。
生产QS21的方法公开于美国专利No.5,057,540。
含有QS21的无反应原性佐剂配方，在前面有描述(WO 96/33739)。含有QS21和胆固醇的该配方，当与抗原一起配制时，表明是成功的TH1刺激佐剂。
优先刺激TH1细胞应答的其他佐剂，包括免疫调节寡聚核苷酸，例如在WO 96/02555中公开的未甲基化CpG序列。
也涉及不同TH1刺激佐剂的组合，例如那些在上文提到的，提供TH1细胞应答优先刺激剂的佐剂。例如，QS21可以与3D-MPL一起配制。QS 21∶3D-MPL的比率，典型的是在1∶10和10∶1之间，优选的是在1∶5和5∶1之间，经常基本上是1∶1。最佳增效作用的优选范围是3D-MPL∶QS21是2.5∶1至1∶1。
优选地，根据本发明的疫苗组合物中也存在载体。载体可以是水包油乳状液，或者铝盐，例如磷酸铝或者氢氧化铝。
优选的水包油乳状液包含可以可代谢的油，例如角鲨烯、α生育酚和Tween 80。根据本发明一个特别优选的方面，疫苗组合物中的抗原，结合了在该乳状液中的QS21和3D-MPL。另外，水包油乳状液可以含有span 85和/或卵磷脂和/或辛酸甘油脂。
对于人体用药来说，在疫苗中存在的QS21和3D-MPL典型地是，每剂量在1μg-200μg范围内，例如10-100μg，优选的是在10μg-50μg。典型的水包油含有2-10％的角鲨烯，2-10％的α生育酚，以及0.3-3％的tween 80。优选的角鲨烯∶α生育酚比率是等于或者小于1，这便提供了更稳定的乳状液。Span 85可以出现在1％的水平上。有些情况下，本发明疫苗进一步含有稳定剂是有利的。
无毒的水包油乳状剂，优选的在水质载体中，含有无毒的油，例如角鲨烯或者角鲨烯，乳化剂，例如Tween 80。水质载体可以是，例如磷酸缓冲盐水。
一种特别有效的佐剂配方，在水包油乳状液中含有QS21、3D-MPL和生育酚，描述于WO 95/17210。
本发明也提供多价疫苗组合物，它含有本发明疫苗配方与其他抗原的组合，特别是用于治疗癌症、自身免疫疾病和相关疾病的抗原。这种多价疫苗组合物可以包括如在上文中描述的TH-1诱导佐剂。
本发明被描述为是关于某些BASB118多肽和多核苷酸的，可以理解为这覆盖了天然存在的多肽和多核苷酸片段，以及经过添加、缺失和替换，但是基本上没有影响重组多肽或者多核苷酸免疫原性的相似多肽和多核苷酸。
组合物、试剂盒和用药
本发明的另一方面提供了，包含给单细胞或者多细胞生物体用药的BASB118多核苷酸和/或BASB118多肽的组合物。
本发明也涉及含有此处讨论的多核苷酸和/或多肽或者它们的激动剂或者拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多核苷酸可以与用于细胞、组织或者生物体的未消毒或者消毒的载体结合使用，例如适用于个体给药的合适配药载体。这些组合物含有，例如，介质添加剂或者有效治疗剂量的本发明多肽和/或多核苷酸，以及药物可接受载体或者赋形剂。这些载体包括，但是不仅仅局限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合。制剂应该适合用药方式。本发明进一步涉及诊断的和药物的包和试剂盒，这种包和试剂盒，包含一个或者多个装有一种或者多种本发明前述组合物中成分的容器。
本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物，可以单独使用或者与其他化合物结合使用，例如治疗化合物。
可以以任何有效方便的方式对药物组合物进行用药，这些方式在其中包括，例如，局部的、口服的、肛门的、阴道的、静脉内的、腹膜内的、肌肉内的、皮下的、鼻内的或者真皮下的给药途径。
在治疗中或者作为预防药，活性药剂可以作为可注射组合物给个体用药，例如作为消毒的水分散剂，优选的是等渗的。
另一方面，本发明提供了这样的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效剂量多肽和/或多核苷酸，例如本发明多肽和/或多核苷酸的可溶性形式，激动剂或者拮抗剂肽或者小分子化合物，并且结合药物可接受载体或者赋形剂。这些载体包括，但是不仅仅局限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合。本发明进一步涉及诊断的和药物的包和试剂盒，这种包和试剂盒，包含一个或者多个装有一种或者多种本发明前述组合物中成分的容器。本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物，可以单独使用或者与其他化合物结合使用，例如治疗化合物。
组合物要适合给药途径，例如全身或者口服途径。全身给药的优选方式包括注射，典型的是静脉注射。也可以使用其他注射途径，例如皮下的、肌肉内的或者腹膜内的。全身用药的其他方式，包括使用渗透剂的粘膜渗透和皮肤渗透用药，渗透剂例如胆盐或者梭链孢酸或者其他去垢剂。另外，如果本发明的多肽或者其他化合物可以用于肠道或者胶囊配方，那么口服用药也是可以的。这些化合物的用药也可以是局部的，以药膏、软膏、凝胶、溶液、粉末以及其他类似的形式。
给哺乳动物，特别是人体用药，活性药剂的每日剂量水平预期是0.01mg/kg至10mg/kg，典型的大约是1mg/kg。无论如何，应该由医生来确定实际剂量，该剂量最适合于个体并且随年龄、体重和特殊个体的反应而变化。上述剂量是一般情况的实施例。当然，也存在适合更高或者更低剂量范围的个体情况，这些也在本发明的范围之内。
所需的剂量范围依赖于多肽的选择、用药途径、配方性质、受治疗者条件的性质，以及主治医师的判断。然而，合适剂量在0.1-100μg/kg受治疗者的范围内。
疫苗组合物常规是以可注射形式存在的。常规佐剂可以用于增强免疫应答。疫苗合适的剂量单位是0.5-5微克/kg抗原，该剂量优选的是给药1-3次，并间隔1-3周。在所指出的剂量范围内，不会观测到本发明化合物有害的毒性作用，这些有害的毒性作用会妨碍对合适个体的用药。
然而，由于所用到的各种化合物以及各种用药途径的不同效能，可以预期所需剂量可以有很大的变化。例如，可以预期口服用药比静脉注射用药需要更高的剂量。可以使用最优化的标准经验程序，调节这些剂量水平的变化，这在技术上是可以理解的。
序列数据库，有形介质中的序列，以及运算法则
多核苷酸和多肽序列，可以构成有价值的信息资源，用该资源可以确定它们的2-维和3-维结构，并且可以进一步鉴定类似同源物的序列。通过把这些序列储存在计算机可读的介质中，然后在已知的大分子结构程序中使用这些已储存的数据，或者使用熟知的搜索工具搜索序列数据库，例如GCG程序包，可以使这些方法更容易。
本发明也提供了序列或者链性质分析的方法，特别是对遗传序列或者编码蛋白质的序列。序列分析优选的方法包括，例如，序列同源分析方法，像是鉴定分析和相似性分析，DNA、RNA和蛋白质结构分析，序列汇编，生物分类学分析，序列基元分析，可读框确定，核酸碱基calling，密码子使用分析，核酸碱基修整，以及测序色谱峰分析。
提供了一种基于计算机的方法进行同源性鉴定。该方法包括以下步骤：在计算机可读介质中提供含有本发明多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；将该第一多核苷酸序列，与至少一条用于鉴定同源性的第二多核苷酸或者多肽序列进行比较。
也提供了一种基于计算机的方法进行同源性鉴定，该方法包括以下步骤：在计算机可读介质中提供含有本发明多肽序列的第一多肽序列；将该第一多肽序列，与至少一条用于鉴定同源性的第二多核苷酸或者多肽序列进行比较。
本说明书描述中所引用的所有的出版物和参考文献，包括但是不仅仅局限于专利和专利申请，在此处通过引用全部结合在一起，这如同每一种出版物或者参考文献，在此处作为完全公开，都明确并且单独的被指出是通过引用而被结合的。任何本申请声明对其有优先权的专利申请，也用以上所述对出版物和参考文献的方式，通过引用被完全的结合于此。
定义
“同一性”，如本领域公知的，是指两条或者多条多肽序列之间或者两条或者多条多核苷酸序列之间的关系，视情况而定，可以通过序列比较测定。在技术上，“同一性”也指多肽或者多核苷酸序列之间序列相关性的程度，视情况而定，可以由这些序列链之间的匹配测定。“同一性”可以通过已知方法容易地计算，包括但是不仅仅局限于，描述于计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.，编著，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算机处理：信息学和基因组课题(Biocomputing：Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.，编著，Academic Press，New York，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第I部分Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编著，Humana Press，NewJersey，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis inMolecular Biology)，Von Heine，G.，Academic Press，1987；和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和Devereux，J.，编著M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM应用数学杂志(J.Applied Math，)，48：1073(1988)中的那些方法。设计测定同一性的方法，以便给出被测试序列之间最大的匹配。另外，测定同一性的方法编码于公开提供的计算机程序中。测定两条序列之间同一性的计算机程序方法，包括，但是不仅仅局限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，等，核酸研究(Nucleic Acids Reseach)12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN(Altschul，S.F.等，分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)215：403-410(1990))，以及FASTA(Pearson和Lipman美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85；2444-2448(1988))。BLAST程序家族，由NCBI和其他来源公开提供(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410(1990))。熟知的Smith Waterman运算法则也可以用于测定同一性。
多肽序列比较的参数包括以下这些：
运算法则：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J.MolBiol.)48：443-453(1970)
比较介质：Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62
美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)89：10915-10919(1992)
空位处罚：8
空位长度处罚：2
一个使用这些参数的有用程序，由Genetics Computer Group，Madison WI作为“gap”程序公开提供。上述参数是肽序列比较的缺省参数(连同末端空位没有处罚)。
多核苷酸序列比较的参数包括以下这些：
运算法则：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J.MolBiol.)48：443-453(1970)
比较介质：匹配＝+10，不匹配＝0
空位处罚：50
空位长度处罚：3
提供：来自Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序。这些是核酸序列比较的缺省参数。
多核苷酸和多肽“同一性”的优选含义，视情况而定，在以下(1)和(2)中提供。
(1)  多核苷酸实施方案，进一步包括包含这样多核苷酸序列的分离的多核苷酸，该多核苷酸序列与SEQ ID NO：1对照序列有至少50，60，70，80，85，90，95，97或者100％的同一性，其中该多核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1对照序列一致，或者与对照序列比较，包括某一特定整数数目的核苷酸改变，其中这种改变选自至少一个核苷酸缺失、替换，包括转变和颠换，或者插入，而且其中这种改变可以发生在对照核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者末端位置间的任何位置，或者单独散布在对照序列核苷酸之间，或者以一个或者多个连续基团散布于对照序列中，并且这样确定该核苷酸改变的数目，即用SEQID NO：1中总核苷酸数，乘以定义百分同一性的整数除以100，然后从SEQ ID NO：1总核苷酸数中减去该乘积，或者：
                  nn≤xn-  (xn·y)其中nn是核苷酸改变的数目，xn是SEQ ID NO：1中总核苷酸数，y对于50％是0.50，对于60％是0.60，对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85，对于90％是0.90，对于95％是0.95，对于97％是0.97，对于100％是1.00，·是乘法算子的符号，其中xn和y的任何非整数乘积，在将其从xn中减去之前，按去尾法变为整数。编码SEQ ID NO：2多肽的多核苷酸序列的改变，可以产生该编码序列中的无义、错义或者阅读框架漂移突变，并从而改变已发生这些改变的多核苷酸编码的多肽。
通过实施例的方式，本发明多核苷酸序列，可以与SEQ ID NO：1对照序列一致，即可以是100％的一致，或者与对照序列相比较，包括某一特定整数数目的核苷酸改变，从而百分比同一性小于100％同一性。这种改变选自至少一个核苷酸缺失、替换，包括转变和颠换，或者插入，而且其中这种改变可以发生在对照多核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者末端位置间的任何位置，或者单独散布在对照序列核酸之间，或者以一个或者多个连续基团散布于对照序列中。给定百分同一性的核酸改变的数目，由下列方法确定，即用SEQ ID NO：1中总核苷酸数，乘以定义百分同一性的整数除以100，然后从SEQ ID NO：1总核苷酸数中减去该乘积，或者：
                     nn≤xn-  (xn·y)其中nn是核苷酸改变的数目，xn是SEQ ID NO：1中总核苷酸数，y是，例如对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85等等，·是乘法算子的符号，其中xn和y的任何非整数乘积，在将其从xn中减去之前，按去尾法变为整数。
(2)  多肽实施方案，进一步包括包含这样多肽的分离的多肽，该多肽序列与SEQ ID NO：2对照多肽序列有至少50，60，70，80，85，90，95，97或者100％的同一性，其中该多肽序列可以与SEQ ID NO：2对照序列一致，或者与对照序列比较，包括某一特定整数数目的氨基酸改变，其中这种改变选自至少一个氨基酸缺失、替换，包括保守和非保守替换，或者插入，而且其中这种改变可以发生在对照多肽序列的氨基-或者羧基-末端位置，或者末端位置间的任何位置，或者单独散布在对照序列氨基酸之间，或者以一个或者多个连续基团散布于对照序列中，并且这样确定该氨基酸改变的数目，即用SEQ ID NO：2中总氨基酸数，乘以定义百分同一性的整数除以100，然后从SEQ ID NO：2总氨基酸数中减去该乘积，或者：
                    na≤xa-  (xa·y)其中na是氨基酸改变的数目，xa是SEQ ID NO：2中总氨基酸数，y对于50％是0.50，对于60％是0.60，对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85，对于90％是0.90，对于95％是0.95，对于97％是0.97，对于100％是1.00，·是乘法算子的符号，其中xa和y的任何非整数乘积，在将其从xa中减去之前，按去尾法变为整数。
通过实施例的方式，本发明多肽序列，可以与SEQ ID NO：2对照序列一致，即可以是100％的一致，或者与对照序列相比较，包括某一特定整数数目的氨基酸改变，从而百分比同一性小于100％同一性。这种改变选自至少一个氨基酸缺失、替换，包括保守和非保守替换，或者插入，而且其中这种改变可以发生在对照多肽序列的氨基-或者羧基-末端位置，或者末端位置间的任何位置，或者单独散布在对照序列氨基酸之间，或者以一个或者多个连续基团散布于对照序列中。给定％同一性的氨基酸改变的数目，由下列方法确定，即用SEQ ID NO：2中总氨基酸数，乘以定义百分同一性的整数除以100，然后从SEQ ID NO：2总氨基酸数中减去该乘积，或者：
                    na≤xa-  (xa·y)其中na是氨基酸改变的数目，xa是SEQ ID NO：2中总氨基酸数，y是，例如对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85等等，·是乘法算子的符号，其中xa和y的任何非整数乘积，在将其从xa中减去之前，按去尾法变为整数。
“个体”，当用在此处关于生物体时，是指多细胞真核生物，包括但是不仅仅局限于，后生动物、哺乳动物、ovid、牛、猿、灵长类和人。
“分离的”是指“经过人手”使之从其天然状态改变，即，如果它存在于自然状态，将它从其原始环境中改变或者移动，或者既改变也移动。例如，如该术语此处所用的，天然存在于活的生物体中的多核苷酸或者多肽不是“分离的”，但是从其天然状态共存物质中分离出的同样的多核苷酸或者多肽就是“分离的”。另外，通过转化、遗传操作或者其他任何重组方法，导入生物体的多核苷酸或者多肽是“分离的”，即便它仍然存在于该生物体中，该生物体可以是活的或者死的。
“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或者多脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或者DNA，或者修饰的RNA或者DNA，包括单链和双链区域。
“变体”是指不同于对照多核苷酸或者多肽，但是保留基本性质的多核苷酸或者多肽。多核苷酸的典型变体，其核苷酸序列不同于别的对照多核苷酸。变体核苷酸序列的改变，可以或者可以不改变对照多核苷酸编码多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改变，可以导致对照序列所编码多肽的氨基酸替换、添加、缺失、融合和截短。多肽的典型变体，其氨基酸序列不同于别的对照多肽。通常，不同是有限的，从而使得对照多肽序列和变体，总的来说非常类似，并且在许多区域是一致的。变体可以在氨基酸序列上，通过一个或者多个任意组合的替换、添加、缺失，而与对照多肽有所不同。替换或者插入的氨基酸残基，可以是或者可以不是遗传密码子编码的。多核苷酸或者多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者它也可以是已知非天然存在的。多核苷酸和多肽的非天然存在变体，可以通过突变技术或者通过直接合成制得。
“疾病”是指由细菌感染造成的或者与细菌感染相关的任何疾病，包括，例如，婴儿和儿童的中耳炎、老年人肺炎、窦炎、医院感染和入侵性疾病、导致失聪的慢性中耳炎、中耳液体积存、听觉神经受损、耽误语言学习、上呼吸道感染和中耳发炎。
实施例
以下实施例使用标准技术实现，除了另外详细描述的以外，这些技术对于本领域技术人员来说是熟知的和常规的。实施例是说明性的，但是并不限制本发明。实施例1：粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株BASB118基因的DNA测序
粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株(也称作MC2931菌株)BASB118基因的DNA序列，显示在SEQ ID NO：1。BASB118多核苷酸序列的翻译，显示在SEQ ID NO：2。实施例2：表达重组BASB118的质粒的构建
A：BASB118克隆
用遗传工程分别向MC-Lip10-Fn/t-RI(5’-AGG CAG AGG GAA TTCATG CAT AAA ATG TAT CCT ACT AGT A-3’)[SEQ ID NO：3]正向扩增引物和MC-Lip10RCh/t-Sal(5’-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATGGTG ATG GTG ATG GTG GCT TAA TCG GTG ACG CTT GGC GGT CG-3’)[SEQ ID NO：4]反向扩增引物引入EcoRI和SalI限制性位点，允许把PCR产物定向克隆到大肠杆菌表达载体pTLZ2中，从而使BASB118蛋白能够作为在C-末端含有(His)6亲和层析标记的融合蛋白而表达。根据制造商的说明书，可以通过使用基于硅胶的spin柱(QiaGen)的扩增反应，纯化BASB118 PCR产物。为了产生克隆所需的EcoRI和SalI末端，如制造商所(Life Technologies)推荐的，应随后用EcoRI和SalI限制性酶完全消化PCR产物。在第一步限制性消化之后第二步酶消化之前，用上述spin柱除盐并用无菌水洗脱，纯化PCR产物。在与pTLZ2质粒连接之前，再次使用基于硅胶的spin柱纯化被消化的DNA片段。
B：表达载体的产生
为了制备用于连接的pTLZ2表达质粒，类似的用EcoRI和SalI完全消化该质粒，然后按照制造商的指导，用牛肠磷酸酶(CIP，～0.02单位/pmol 5’端，Life Technologies)进行处理，以避免自身连接。使用超过准备好的载体大约5倍摩尔的消化片段，设计连接反应。使用本领域熟知的方法，用T4 DNA连接酶(～2.0单位/反应，LifeTechnologies)催化标准的～20μl连接反应(～16℃，～16小时)。根据本领域熟知的方法，使用连接的一个等分试样(～5μl)转化电感受态JM109细胞。在～1ml LB肉汤培养基中37℃生长～2-3小时，将转化细胞涂布在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上。抗生素包含在筛选中。平板在37℃培养～16小时过夜。使用消毒牙签挑选单个的ApR克隆，用其“补丁”接种新鲜的LB ApR平板和～1.0ml LB ApR肉汤培养基。补丁平板和培养基在标准孵育箱(平板)或者水浴摇床中37℃培养过夜。使用基于全细胞的PCR分析，检验含有BASB118 DNA插入的转化物。此处，把～1.0ml过夜的LB ApR肉汤培养基转移到1.5ml的聚丙烯管中，Beckmann微型离心机(～3分钟，室温，～12,000Xg)离心收集细胞。细胞沉淀悬浮于～200μl无菌水中，使用～10μl等分试样，进行终体积为～50μl的含有BASB118正向和反向扩增引物的PCR反应。除了使用～5.0单位的Tag聚合酶以外，PCR反应成分的终浓度，基本上与实施例2中所说明成分的浓度相同。初始95℃的变性步骤增加到3分钟，以确保细菌细胞的热破碎和质粒DNA的连接。使用ABI Model 9700热循环控制器和32个循环的3步热扩增过程，即95℃，45秒，55-58℃，45秒，72C，1分钟，扩增来自溶解转化子样品的BASB118片段。热扩增之后，用琼脂糖凝胶电泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液中含有0.8％琼脂糖)分析反应的～20μl等分试样。凝胶电泳和溴乙啶染色之后，用紫外线照明观测DNA片段。DNA分子大小标准(1Kb序列梯，Life Technologies)与被测样品一起平行电泳，并用于估计PCR产物的大小。鉴定产生预期大小PCR产物的转化物为含有BASB118表达结构的菌株。接下来分析含有表达质粒的菌株是否可以诱导表达重组BASB118。
C：PCR-阳性转化物的表达分析
对于上述鉴定的每一个PCR-阳性转化物，使用来自补丁平板的细胞，接种含有氨苄青霉素(100μg/ml)的～5.0ml LB肉汤培养基，并在37℃摇动(～250rpm)培养过夜。在含有～25ml LB Ap肉汤培养基的125ml锥形烧瓶中，接种等分试样的过夜种子培养基(～1.0ml)，并在37℃摇动培养(～250rpm)，直到培养物的浊度达到O.D.600～0.5，即中对数阶段(通常是大约1.5-2.0小时)。这时，把大约一半培养物(～12.5ml)转移到第二个锥形烧瓶中，加入IPTG(无菌水制备的1.0M储存液，Sigma)至终浓度1.0mM诱导重组BASB118蛋白的表达。继续在37℃摇动培养IPTG-诱导的和非IPTG-诱导的培养物～4小时。在诱导期过后，取出诱导和非诱导培养物的样品(～1.0ml)，用微型离心机室温～3分钟离心收集细胞。单个的细胞沉淀悬浮于～50ml无菌水中，然后与含有2-巯基乙醇的等体积2X Laemelli SDS-PAGE样品缓冲液混合，置于沸水浴～3分钟变性蛋白质。把等体积(～15μl)粗IPTG-诱导和非诱导的细胞溶解物，加样到完全相同的两块12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(1mm厚的Mini-凝胶，Novex)。在常规条件下，使用标准SDS/Tris/甘氨酸电泳缓冲液(BioRad)电泳诱导的和非诱导的细胞溶解样品，同时电泳预染色的分子量标记(SeeBlue，Novex)。电泳之后，一块胶用考马斯亮蓝R250(BioRad)染色，然后脱色至可以看见新的BASB118 IPTG-诱导蛋白。第二决胶使用BioRad Mini-Protean II印迹仪器和Towbin’s甲醇(20％)转移缓冲液，在4℃～2小时电印迹至PVDF膜(孔尺寸0.45微米，Novex)。根据本领域熟知的方法进行膜阻断和抗体孵育。使用单克隆抗-PGS(His)3抗体，紧接着使用结合HRP(QiaGen)的兔抗鼠第二抗体，确定BASB118重组蛋白的表达和特性。使用ABT不溶底物或者使用Amersham ECL化学发光系统的Hyperfilm，可以看见抗-His抗体的反应模式。实施例3：重组BASB118的生产
细菌菌株
含有编码粘膜炎莫拉氏菌BASB118的质粒(pTLZ2)的大肠杆菌JM109重组表达菌株，被用于生产用于纯化重组蛋白的细胞质。表达菌株被培养在含有100μg/ml氨苄青霉素(“Ap”)的LB琼脂平板上，以确保维持pTLZ2。对于-80℃低温储藏，在含有相同浓度抗生素的LB肉汤培养基中繁殖菌株，然后与含有30％(w/v)甘油的相同体积的LB肉汤培养基混合。
培养基
用于重组蛋白质生产的发酵培养基，由含有100μg/ml Ap的2XYT肉汤(Difco)组成。在发酵罐中，以0.25ml/L向培养基添加消泡剂(Antifoam 204，Sigma)。为了诱导表达重组BASB118蛋白，在发酵罐中加入IPTG(异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷)(终浓度1mM)。
发酵
含有50ml工作体积的500-ml种子锥形烧瓶，用0.3ml速融冷冻培养物，或者用选出的琼脂平板培养物的几个克隆进行接种，在摇动平台上(Innova 2100，New Brunswick Scientific)，150rpm，37±1℃培养大约12个小时。然后，该种子培养物被用于接种含有2X YT肉汤和Ap抗生素的5-L工作体积的发酵罐。发酵罐(Bioflo 3000，New Brunswick Scientific)在37±1℃，换气量0.2-0.4VVM，Rushton叶轮250rpm的条件下进行操作。在锥形烧瓶种子培养或者发酵罐中都不控制pH。发酵过程中，发酵罐中的pH在6.5到7.3范围内。当培养物到达中对数期时(～0.7 O.D.600单位)时，在发酵罐中添加IPTG(无菌水制备的1.0M储存液)。诱导细胞2-4小时，然后使用28RS Heraeus(Sepatech)或者RC5C超速离心机(SorvallInstruments)进行离心收集。细胞粘糊在处理之前储存于-20℃。
化学物质和材料
咪唑、盐酸胍、Tris(羟甲基)和EDTA(乙二胺四乙酸)，是生物技术级或者更高级别的，都来自Ameresco Chemical，Solon，Ohio。Triton X-100(t-聚乙二醇辛基苯基醚)、Triton X-144和磷酸二氢钠是试剂级或者更高级别的，来自Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri。冰醋酸和盐酸来自Mallincrodt Baker Inc.，Phillipsburg，New Jersey。甲醇来自Fisher Scientific，Fairlawn，New Jersey。PefablocSC(4-(2-氨基乙基)-苯磺酰基氟化物)、完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂和PMSF(苯甲基磺酰氟)来自RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，Indiana。抑氨肽酶素、抑胃肽和E-64蛋白酶抑制剂来自Calbiochem，LaJolla，California。Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(1×PBS)来自QualityBiological，Inc.，Gaithersburg，Maryland。Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(10×PBS)来自Bio Whittaker，Walkersville，Maryland。无牛血清白蛋白的五-His抗体来自QiaGen，Valencia，California。过氧化物酶结合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG来自Jackson Immuno Research，West Grove，Penn。AEC single溶液来自Zymed，South San Francisco，California。所有其他化学试剂都是试剂级或者更高级别的。
Ni螯合Sepharose Fast Flow树脂来自Pharmacia，Sweden，California。预制Tris-甘氨酸4-20％和10-20％聚丙烯酰胺凝胶，所有的电泳缓冲液和溶液，SeeBlue预染标准，Multi-Colored标准和PVDF转移膜都来自Novex，San Diego，California。SDS-PAGE银染试剂盒来自Daiichi Pure Chemicals Company Limited，Tokyo，Japan。考马斯染液来自BioRad Laboratories，Hercules，California。AcrodiscPF 0.2m注射滤器来自Pall GelmanSciences，Ann Arbor，Michigan。GD/X 25mm一次性注射滤器来自Whatman Inc.，Clifton，New Jersey。透析管8,000 MWCO来自BioDesign Inc.Od New York，Carmal New York。BCA Protein AssayRegents和Snake Skin透析管3,500 MWCO来自Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois。实施例4：来自大肠杆菌的重组BASB118的纯化
提取纯化
细胞粘糊在室温融化30到60分钟。细胞粘糊破碎之后，用含有1％Triton X-114的冰冷PBS分相提取物。
除去细胞碎片，提取物升温至37℃，并且用离心进行相分配。
然后，感兴趣部分经过一镍螯合的Sepharose Fast Flow树脂，用含有10％甘油和0.05％Triton X-100的PBS(pH 7.5)平衡。用含有200mM咪唑的相同缓冲液洗脱蛋白质。含有洗脱蛋白质的部分，用含有2mM EDTA，10mM氯化钠和0.05％Triton X-100的四倍体积的50mM Tris缓冲液(pH7.5)稀释，然后通过DEAE-SepharoseFF树脂。收集流出物。分析表明，制备物含有7种主要污染蛋白质。因此，样品再次通过镍螯合的Sepharose FF树脂，用含有10％甘油和0.05％Triton X-100的PBS(pH7.5)平衡。用含有200mM咪唑的相同缓冲液洗脱蛋白质。该制备物在含有1％Triton X-100的PBS(pH7.4)中透析，然后用3kD截留量的搅拌池(stir-cell)浓缩。
如图1-A所示，在SDS-PAGE分析中，纯化的BASB118蛋白质表现为五条带和两条额外的小带。五条主带对于针对6-组氨酸基元的小鼠单克隆抗体有活性(图1-B)。纯度估计在50％左右。
生物化学性质
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
纯化的重组BASB118蛋白在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，然后如前所述在100V，1小时电泳转移至PVDF膜上(Thebaine等1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76：4350-4354)。然后，用含有5％脱脂奶粉的25ml Dulbecco’s磷酸缓冲盐水对PVDF膜进行预处理。随后所有的孵育都使用该预处理缓冲液进行。
用25ml未免疫的或者免疫的血清或者抗-His免疫血清的1∶500稀释液，室温孵育PVDF膜1小时。然后用清洗缓冲液(含有150mM氯化钠和0.05％Tween-20的20mM Tris缓冲液，pH7.5)清洗PVDF膜2次。用25ml氧化物酶标记的山羊抗兔或者抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)的1∶5000稀释液，室温孵育PVDF膜30分钟。然后用清洗缓冲液清洗PVDF膜4次，并用Zymed(San Francisco，CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和过氧化脲分别显影10分钟。实施例5：重组BASB118抗血清的产生
直接针对BASB118蛋白的多价抗血清，是通过用纯化的重组BASB118蛋白免疫接种两只兔子产生的。每只动物总共进行3次皮下免疫，每次注射大约10μg BASB118蛋白，间隔大约21天。在第一次免疫前(“前取血”)、第49天、第56天对动物取血。
使用重组BASB118蛋白(4μg/孔)ELISA测定抗-BASB118蛋白的效价。该效价被定义为，通过使用XL Fit软件的4-参数逻辑模型计算出的效价的中点。兔血清免疫后的效价是1∶2000。实施例6：免疫特性：BASB118的表面暴露
使用福尔马林杀死的粘膜炎莫拉氏菌14，358，216，2926菌株完整细胞(20μg/孔)，通过ELISA测定抗-BASB118蛋白的效价。该效价被定义为，通过使用SoftMax Pro软件的4-参数逻辑模型计算出的效价的中点。
观测到的兔免疫血清效价(分别是1∶312，1∶1290，1∶284，1∶513)表明，BASB118蛋白发现于粘膜炎莫拉氏菌细胞的表面。实施例7：免疫特性：杀菌活性
测定抗-BASB118抗体的补体介导的细胞毒性活性，以测定如上所述制备的BASB118抗血清的免疫效力。测定了免疫前血清和抗-BASB118抗血清在介导补体杀死粘膜炎莫拉氏菌中的活性。在MuellerHinton平板上，36℃下生长粘膜炎莫拉氏菌菌株24小时。把几个菌落接种到125ml锥形烧瓶的15ml BHI中。培养物在200rpm生长大约4小时，直到A620＝0.4。经过一次清洗之后，粘糊悬浮于HBSS，菌株稀释至每毫升28500 CFU。在96-孔板的第一个孔里加入五十(50)μl免疫前血清和抗-BASB118血清(56℃灭活30分钟)，在同一行的其他孔里加入HBSS的两倍系列稀释液。随后加入二十五(25)μl稀释的活粘膜炎莫拉氏菌，混合物室温培养15分钟。按照事先在毒性分析中确定的工作稀释液，在每个孔中加入幼兔补体(Pel freez，clinical systems，Brown Deer，WI，UAS)。
盖上微量平板，37℃下200rpm培养1小时。每个测试包括补体对照(没有血清的孔，该血清含有活性的或者灭活的补体源)，阳性对照(含有已知杀菌抗体效价血清的孔)，培养物对照(没有血清和补体的孔)和血清对照(没有补体的孔)。
兔抗血清的杀菌效价(同源菌株50％致死)＜1∶35(免疫前)＞1∶300(免疫的)。实施例8：BASB118疫苗的功效：在小鼠中增强肺部清除粘膜炎莫拉氏菌
小鼠的模型是基于接种鼠的标准鼻内激发之后的粘膜炎莫拉氏菌肺部侵染分析。按照10μg剂量用100μl疫苗皮下免疫6只BALB/c鼠群体(雌性，6周龄)，2周后加强。加强一周后，在麻醉情况下(用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉剂的结合麻醉小鼠，0.24mg甲苯噻嗪(Rompun)和0.8mg氯胺酮(Imalgene)/100μl)，通过在左鼻孔滴注50μl细菌悬浮液(5×105 CFU/50μl)，对小鼠进行激发。激发之后4小时处死鼠，无菌条件下摘出肺脏，单个进行匀浆。涂布20μl的5个系列匀浆物稀释液之后，通过计数Mueller-Hinton琼脂平板上生长的菌落，确定CFU/肺脏的log10加权平均值。计算每一组的CFU/肺脏的log10加权平均值的算数平均值，以及标准偏差。
在假定方差等式(经过Brown and Forsythe’s测试检验)和正规性等式(经过Shapiro-Wilk测试检验)之后，通过使用1-途径ANOVA，对结果进行统计分析。使用Dunnet测试、Tukey’s studentised范围测试(HSD)和Student-Newman-Keuls测试，分析组之间的差异。
在该试验中，小鼠的分组用吸附在AlPO4上的BASB118(100μgAlPO4上的10μg BASB118)进行免疫，或者用吸附在AlPO4上的粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株的死的全细胞(kwc)制备物(100μgAlPO4上的5×108个细胞)进行免疫，或者用没有抗原的100μg AlPO4进行免疫。用5 105CFU活的粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617细菌菌株对鼠进行攻击。
对每一组计算攻击4小时后的CFU/肺脏的log10加权平均值和标准偏差。攻击4小时后假装免疫小鼠的log10 CFU/肺脏是5.66(+/-0.18)。
与对照组比较，kwc制备物引起明显的肺部清除(log差异1.3)。在肺部清除中，BASB118疫苗与对照组比较引起0.43的log差异，这与对照有相当大的差异。
保藏材料
含有粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌株的保藏物，在1997年6月21日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(此处的“ATCC”)，保藏号43617。该保藏物被描述为粘膜炎氏布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)(Frosch andKolle)，是由粘膜炎莫拉氏菌分离株构建的冻干的1.5-2.9kb插入文库，该种群是从患有慢性支气管炎的煤矿工人气管吸出物中得到的。该保藏物在抗微生物物质化学治疗(Antimicrob.AgentsChemother.)21：506-508(1982)中有描述。
粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物，在此处称作“保藏菌株”或者“保藏菌株的DNA”。
保藏菌株含有全长的BASB118基因。
包括插入在pQE30中的粘膜炎莫拉氏菌DNA的pMC-ORF1/2载体保藏物，在1999年2月12日保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(此处的“ATCC”)，保藏号207118。
当与此处的任何序列描述有冲突时，保藏菌株/克隆中包含的多核苷酸序列，及其编码的任何多肽的氨基酸序列是控制查对的。
保藏菌株的保藏物，符合国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognitionof Deposit of Micro-organisms for Purpose of PatentProcedure)。保藏菌株在保护专利的前提下，不可取消地并且没有限制和条件地准许公众公开使用。保藏菌株只是为那些本领域技术人员提供方便，而不是例如35 U.S.C.§112要求的那些实施所需要的保藏物的许可。
序列信息BASB118多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO：1来自ATCC43617菌株的粘膜炎莫拉氏菌BASB118的多核苷酸序列ATGCATAAAATGTATCCTACTAGTATTTTATTGTGTGCCGTGGTTTTGTCAGGCTGTGATGCAGTCAAGCAGACCATCACAGACAAACCTACGCTCAGCGATGCCCAAATCACCAAATTAATCCCCAAGCGTGTCAATAACGCCAAGCTATGGGCAACTGATATTGGCGATATTTTTGATGAATTATCACTACCGAAAACCGCACAAAATATCTGTACCGCTATCGCTGTCATTGACCAAGAATCAAATTTTCATGCCGATCCCAGCGTCCCAAACTTAGGCAATGCTGCCCTAAAAGCCATTGATGACAAGCTAGAAGATAAACTTGGTAAAAATATGGCAGGCGTATTTCGCAACATGCTTGAGACACGCCCAACGCCAAAAAACAACTTCATCAAACAAATCAAAGCTGTAAAAACCGAAAAACAGCTTGATGAGCTATACCGAGAGATTTTTGATTATTTTACCAGAACCTATAAAATAGCCCCTTTAACCAACATCACAAAACTCTCAGGACAAGGCATTGATGAACGCATCAACCCTGTCACAACACTTGGTTCTATGCAGGTACATATCGACTACGCACGAGCACATCGCCGTGCCAGCATGAGCGATCGGGATTTGCGTGCCGATTTATACACACGCTATGGCGGGCTTTATTACGGCATACATCGATTAATGGTATATCAGGCAAATTATGACAAGCCTTTATACCGTTTTGCTGATTATAATTCGGGTATGTATTCAAGCCGAAATGCTGCCTTTCAGCAGCGGATCGCTACTTTAAGTGGTGAAAGCTTAGCCATTGATGGAGATTTATTGCTTTATAAAGATGGCAGCCCCATAAGCAAAATATCCTCTACCGAAACTGCCGCCATCGCTTTACTTGCTACCGCATCAAAACCCATCAACGCACAACAAATCCGATCTGATTTTAAAAAAGAAAAAACTCGTGATTTTGAAAAAACCATCACTTATCGTGCGGTGAATGATATGTTTGCCAGTAAATTTGGGCGAGAGCCTACTTATGCCATTATGCCAAAAGTTGTCATTTCAGGGCCCAAGCTTAGCCGAGACTTTGATACCAATTGGTTTGCCACCCGTGTCAATGAACGCTATCAAACCTGCATCACGACCGCCAAGCGTCACCGATTAAGCTAASEQ ID NO：2由SEQ ID NO：1推导出的BASB118多肽序列MHKMYPTSILLCAVVLSGCDAVKQTITDKPTLSDAQITKLIPKRVNNAKLWATDIGDIFDELSLPKTAQNICTAIAVIDQESNFHADPSVPNLGNAALKAIDDKLEDKLGKNMAGVFRNMLETRPTPKNNFIKQIKAVKTEKQLDELYREIFDYFTRTYKIAPLTNITKLSGQGIDERINPVTTLGSMQVHIDYARAHRRASMSDRDLRADLYTRYGGLYYGIHRLMVYQANYDKPLYRFADYNSGMYSSRNAAFQQRIATLSGESLAIDGDLLLYKDGSPISKISSTETAAIALLATASKPINAQQIRSDFKKEKTRDFEKTITYRAVNDMFASKFGREPTYAIMPKVVISGPKLSRDFDTNWFATRVNERYQTCITTAKRHRLSSEQ ID NO：3AGG CAG AGG GAA TTC ATG CAT AAA ATG TAT CCT ACT AGT ASEQ ID NO：4AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG GCT TAA TCGGTG ACG CTT GGC GGT CG
wq申请人或代理人挡案号 国际申请号
                  关于微生物保藏的说明
                     (细则13之二)
A.对说明书第    43    页，第  15    行所述的微生物的说明
B.保藏事项
保藏单位名称 美国典型培养物保藏中心
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)10801 UNIVERSITY  BLVD，MANASSAS，VIRGINIA  20110-2209，UNITED STATE OF AMERICA
保藏日期    1997年6月21日，1999年2月12日    保藏编号    43617/207118
 c.补充说明(必要时)
就这些谋求欧洲专利的指定事项而言，仅通过将这一样品递交该样品请求人指定的专门机构，保藏的微生物的样品即为可得，直至欧洲专利授权公开，或直至本申请被驳回或撤回，。
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
PCT/RO/134表(1992年7月)
                           序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals SA
<120>新化合物
<130>BM45409
<160>4
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>1161
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>1atgcataaaa tgtatcctac tagtatttta ttgtgtgccg tggttttgtc aggctgtgat      60gcagtcaagc agaccatcac agacaaacct acgctcagcg atgcccaaat caccaaatta     120atccccaagc gtgtcaataa cgccaagcta tgggcaactg atattggcga tatttttgat     180gaattatcac taccgaaaac cgcacaaaat atctgtaccg ctatcgctgt cattgaccaa     240gaatcaaatt ttcatgccga tcccagcgtc ccaaacttag gcaatgctgc cctaaaagcc     300attgatgaca agctagaaga taaacttggt aaaaatatgg caggcgtatt tcgcaacatg     360cttgagacac gcccaacgcc aaaaaacaac ttcatcaaac aaatcaaagc tgtaaaaacc     420gaaaaacagc ttgatgagct ataccgagag atttttgatt attttaccag aacctataaa     480atagcccctt taaccaacat cacaaaactc tcaggacaag gcattgatga acgcatcaac     540cctgtcacaa cacttggttc tatgcaggta catatcgact acgcacgagc acatcgccgt     600gccagcatga gcgatcggga tttgcgtgcc gatttataca cacgctatgg cgggctttat     660tacggcatac atcgattaat ggtatatcag gcaaattatg acaagccttt ataccgtttt     720gctgattata attcgggtat gtattcaagc cgaaatgctg cctttcagca gcggatcgct     780actttaagtg gtgaaagctt agccattgat ggagatttat tgctttataa agatggcagc     840cccataagca aaatatcctc taccgaaact gccgccatcg ctttacttgc taccgcatca     900aaacccatca acgcacaaca aatccgatct gattttaaaa aagaaaaaac tcgtgatttt     960gaaaaaacca tcacttatcg tgcggtgaat gatatgtttg ccagtaaatt tgggcgagag    1020cctacttatg ccattatgcc aaaagttgtc atttcagggc ccaagcttag ccgagacttt    1080gataccaatt ggtttgccac ccgtgtcaat gaacgctatc aaacctgcat cacgaccgcc    1140aagcgtcacc gattaagcta a                                              1161<210>2<211>386<212>PRT<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400> 2Met His Lys Met Tyr Pro Thr Ser Ile Leu Leu Cys Ala Val Val Leu1           5              10                  15Ser Gly Cys Asp Ala Val Lys Gln Thr Ile Thr Asp Lys Pro Thr Leu
      20              25                30Ser Asp Ala Gln Ile Thr Lys Leu Ile Pro Lys Arg Val Asn Asn Ala
   35               40               45Lys Leu Trp Ala Thr Asp Ile Gly Asp Ile Phe Asp Glu Leu Ser Leu50               55               60Pro Lys Thr Ala Gln Asn Ile Cys Thr Ala Ile Ala Val Ile Asp Gln65               70               75               80Glu Ser Asn Phe His Ala Asp Pro Ser Val Pro Asn Leu Gly Asn Ala
         85               90                95Ala Leu Lys Ala Ile Asp Asp Lys Leu Glu Asp Lys Leu Gly Lys Asn
     100               105              110Met Ala Gly Val Phe Arg Asn Met Leu Glu Thr Arg Pro Thr Pro Lys
  115               120              125Asn Asn Phe Ile Lys Gln Ile Lys Ala Val Lys Thr Glu Lys Gln Leu130               135             140Asp Glu Leu Tyr Arg Glu Ile Phe Asp Tyr Phe Thr Arg Thr Tyr Lys145              150              155              160Ile Ala Pro Leu Thr Asn Ile Thr Lys Leu Ser Gly Gln Gly Ile Asp
         165              170              175Glu Arg Ile Asn Pro Val Thr Thr Leu Gly Ser Met Gln Val His Ile
      180              185              190Asp Tyr Ala Arg Ala His Arg Arg Ala Ser Met Ser Asp Arg Asp Leu
   195              200              205Arg Ala Asp Leu Tyr Thr Arg Tyr Gly Gly Leu Tyr Tyr Gly Ile His210               215             220Arg Leu Met Val Tyr Gln Ala Asn Tyr Asp Lys Pro Leu Tyr Arg Phe225              230              235               240Ala Asp Tyr Asn Ser Gly Met Tyr Ser Ser Arg Asn Ala Ala Phe Gln
         245              250               255Gln Arg Ile Ala Thr Leu Ser Gly Glu Ser Leu Ala Ile Asp Gly Asp
     260               265               270Leu Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Ser Pro Ile Ser Lys Ile Ser Ser Thr
  275               280              285Glu Thr Ala Ala Ile Ala Leu Leu Ala Thr Ala Ser Lys Pro Ile Asn290              295               300Ala Gln Gln Ile Arg Ser Asp Phe Lys Lys Glu Lys Thr Arg Asp Phe305             310               315               320Glu Lys Thr Ile Thr Tyr Arg Ala Val Asn Asp Met Phe Ala Ser Lys
         325             330                335Phe Gly Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Ile Met Pro Lys Val Val Ile Ser
     340             345                350Gly pro Lys Leu Ser Arg Asp Phe Asp Thr Asn Trp Phe Ala Thr Arg
    355             360              365Val Asn Glu Arg Tyr G1n Thr Cys Ile Thr Thr A1a Lys Arg His Arg370              375               380Leu Ser385
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3aggcagaggg aattcatgca taaaatgtat cctactagta                       40
<210>4
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4aggcagaggg tcgacttaat  ggtgatggtg atggtggctt  aatcggtgac  gcttggcggt     60cg                                                62

Claims (26)

1.分离的多肽，该多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列在SEQ ID NO：2全长上有至少85％的同一性。
2.如权利要求1中所述的分离的多肽，其氨基酸序列与SEQ IDNO：2的氨基酸序列在SEQ ID NO：2全长上有至少95％的同一性。
3.如权利要求1中所述的分离的多肽，该多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO：2的分离的多肽。
5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的多肽的免疫原性片段，其中该免疫原性片段的免疫原性基本上与SEQ ID NO：2多肽相同。
6.如权利要求1-5中任一权利要求所述的多肽，其中该多肽是更大的融合蛋白的一部分。
7.编码如权利要求1-6中任一权利要求所述多肽的分离的多核苷酸。
8.分离的包含编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸，该多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列在SEQ ID NO：2全长上有至少85％的同一性；或者与该分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
9.分离的多核苷酸，该多核苷酸与编码SEQ ID NO：2多肽的核苷酸序列在全部编码区域上有至少85％的同一性；或者与该分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
10.分离的多核苷酸，该多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ IDNO：1的核苷酸序列在SEQ ID NO：1全长上有至少85％的同一性；或者与该分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
11.如权利要求7-10中任一权利要求所述的分离的多核苷酸，其与SEQ ID NO：1有至少95％的同一性。
12.分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列。
13.包含SEQ ID NO：1多核苷酸的分离的多核苷酸。
14.分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码SEQ ID NO：2多肽的核苷酸序列，它是通过在严格杂交条件下使用具有SEQ ID NO：1序列或者其片段的标记探针筛选适当的文库得到的。
15.表达载体或者活的重组微生物，它们包含根据权利要求7-14中任一权利要求的分离的多核苷酸。
16.包含权利要求15的表达载体的宿主细胞，或者表达分离的多肽的该宿主细胞的亚细胞部分或者膜，该分离的多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2氨基酸序列有至少85％的同一性。
17.生产权利要求1-6多肽的方法，该方法包括在足够生产该多肽的条件下培养权利要求16的宿主细胞，以及从培养基中回收所述多肽。
18.表达权利要求7-14中任一权利要求的多核苷酸的方法，该方法包括用含有至少一种所说的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，以及在足够表达所说的任一多核苷酸的条件下，培养该宿主细胞。
19.疫苗组合物，其含有有效量的权利要求1-6中任一权利要求的多肽和药学可接受载体。
20.疫苗组合物，其含有有效量的权利要求7-14中任一权利要求的多核苷酸和药物有效载体。
21.根据权利要求19或者20中任一权利要求的疫苗组合物，其中该组合物含有至少一种其他粘膜炎莫拉氏菌抗原。
22.对如权利要求1-6中任一权利要求所述的多肽或者免疫片段有免疫特异性的抗体。
23.诊断粘膜炎莫拉氏菌感染的方法，包括鉴定如权利要求1-6中任一权利要求所述的多肽，或者对所说多肽有免疫特异性的抗体，这些多肽或者抗体出现在怀疑有这种感染的动物体的生物样品中。
24.含有免疫有效量的如权利要求1-6中任一权利要求所述的多肽的组合的在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的用途。
25.含有免疫有效量的如权利要求7-14中任一权利要求所述的多核苷酸的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的用途。
26.在治疗具有粘膜炎莫拉氏菌疾病的人体中有效的治疗组合物，该组合物含有至少一种直接针对权利要求1-6多肽的抗体和合适的药物载体。
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