CN1128876C - 莫拉菌属的运铁蛋白受体基因 - Google Patents

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Abstract

提供纯化和分离的核酸分子，它编码诸如卡他莫拉菌的莫拉菌属的运铁蛋白受体蛋白或该运铁蛋白受体蛋白的片段或其类似物。该核酸序列可以用来生产不含该莫拉菌属菌株其它蛋白的该莫拉菌属菌株的重组运铁蛋白受体结合蛋白Tbp1和Tbp2，以用于诊断和医学治疗目的。此外，该核酸分子可以用于诊断感染。

Description

莫拉菌属的运铁蛋白受体基因
                       发明领域
本发明涉及编码运铁蛋白受体(TfR)蛋白的基因的分子克隆，详细地说，涉及来自卡他莫拉菌(布兰汉氏球菌)的运铁蛋白受体基因的克隆。
                  相关申请的相互参考
本申请是1997年1月3日提交的共同未决美国专利申请08/778,570号的部分继续，后者本身是1996年3月8日提交的美国专利申请08/613,009号的部分继续。
                       发明背景
卡他莫拉菌(布兰汉氏球菌)细菌是在健康人呼吸道中无症状携带的革兰氏阴性双球菌病原体。最近几年，已经识别出卡他莫拉菌为中耳炎的重要病原体。另外，卡他莫拉菌已与窦炎、结膜炎和泌尿生殖器感染以及多种儿童和成人下呼吸道的炎症性疾病有关，所述炎症性疾病包括肺炎、慢性支气管炎、气管炎和肺气肿(参考文献1-8)。(在本申请中，括弧中引用的各种参考文献更全面地描述了本发明涉及领域的状态。在恰好在权利要求书前的本说明书结尾处发现每个引用文的全面的著书目录资料。这些参考文献的说明书通过引用结合到本说明书中)。有时，卡他莫拉菌侵入引起败血症、关节炎、心内膜炎和脑膜炎(参考文献9-13)。
中耳炎是一种最常见的幼童疾病，大约所有儿童的80％在三岁前至少患一次中耳感染(参考文献14)。慢性中耳炎已与儿童中的听觉和语言减弱有关，在某些病例中，与学习能力损失有关。中耳炎的传统治疗包括给与抗生素和手术方法，包括扁桃体切除术、增殖腺切除术和鼓膜穿刺放液术。在美国，用于中耳炎的治疗费用估计每年为十至二十亿美元。
在中耳炎的病例中，卡他莫拉菌通常从中耳流体中与肺炎链球菌和非典型的流感嗜血菌共分离，后两种细菌据信分别导致50％和30％的中耳炎感染。卡他莫拉菌据信导致大约20％的中耳炎感染(参考文献15)。流行病学报道表明：根据卡他莫拉菌的抗生素抗性分离菌数目，归因于卡他莫拉菌的中耳炎病例数正在增加。因此，在1970年之前，尚无报道产生β-内酰胺酶的卡他莫拉菌分离菌，但自从70年代中以来，已经检测的日益增加数目的表达β-内酰胺酶的分离菌。最近的调查提示：75％的临床分离菌产生-内酰胺酶(参考文献16、26)。
铁是许多细菌生长的必需营养物。包括卡他莫拉菌在内的几个细菌物种通过用运铁蛋白受体蛋白捕获运铁蛋白而从宿主中获得铁。包括脑膜炎奈瑟氏球菌(参考文献17)、淋病奈瑟氏球菌(参考文献18)、流感嗜血菌(参考文献19)以及卡他莫拉菌(参考文献20)在内的许多细菌产生特异性结合人类运铁蛋白的外膜蛋白。这些蛋白的表达受该环境中铁量的调节。
卡他莫拉菌的的两种运铁蛋白受体蛋白命名为运铁蛋白结合蛋白1(Tbp1)和运铁蛋白结合蛋白2(Tbp2)，其分子量为115kDa(Tbp1)和大约80-90kDa(Tbp2)。与对脱铁运铁蛋白具有亲和性的其它细菌的运铁蛋白受体蛋白不同，卡他莫拉菌Tbp2受体对铁(iron-)饱和(即铁(ferri-)饱和)的运铁蛋白具有优先亲和性(参考文献21)。
卡他莫拉菌感染可以导致严重的疾病。提供免疫原制剂中作为抗原的运铁蛋白结合蛋白的重组源和产生诊断试剂可能是有利的，其中所述免疫原制剂包括疫苗、其它抗原的载体和免疫原。编码运铁蛋白结合蛋白的基因及其片段是特别需要的，可用于特异性鉴定和莫拉菌的诊断和用于对卡他莫拉菌引起的疾病进行免疫，和用于产生诊断试剂。
                     发明概述
本发明涉及提供编码莫拉菌属菌株的运铁蛋白受体的纯化的和分离的核酸分子或该运铁蛋白受体蛋白的片段或类似物。本文提供的核酸分子可用于莫拉菌属菌株的特异性鉴定和用于诊断莫拉菌属引起的感染。通过用以经济方式提供纯化和分离的运铁蛋白受体蛋白及其亚基、片段或类似物的重组DNA方法，本文提供的纯化和分离的核酸分子(诸如DNA)也可用来表达所述tbp基因。该运铁蛋白受体及其亚基或片段或类似物以及编码它们的核酸分子和含有这类核酸分子的载体可用于免疫原性组合物中，用于对莫拉菌属引起的疾病进行疫苗接种、诊断莫拉菌属的感染和作为产生免疫学试剂的工具。产生的抗按照本发明该方面产生的运铁蛋白受体蛋白的单克隆抗体或单特异性抗血清(抗体)，可用于诊断莫拉菌属的感染、特异性检测莫拉菌属(例如在体外和体内检测中)和用于治疗莫拉菌属引起的疾病。
按照本发明的一个方面，提供纯化和分离的核酸分子，它编码莫拉菌属菌株(更详细地说为卡他莫拉菌，具体为卡他莫拉菌4223、Q8或R1菌株)的运铁蛋白受体蛋白或该运铁蛋白受体蛋白的片段或类似物。
在本发明的最佳实施方案中，该核酸分子可以仅编码该莫拉菌属菌株的Tbp1蛋白，或仅编码该莫拉菌属菌株的Tbp2蛋白。在本发明的另一最佳实施方案中，该核酸编码具有保守氨基酸序列的莫拉菌属菌株的运铁蛋白受体蛋白的片段。
在本发明的另一方面，提供具有选自以下DNA序列的纯化和分离的和核酸分子：(a)如图5、6、10、11或27中陈述的DNA序列(SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、45或46)或其互补DNA序列；(b)编码如图5、6、10、11或27中陈述的氨基酸序列(SEQ ID No：9、10、11、12、13、14、15、16或47)的DNA序列或其互补DNA序列；以及(c)在严格条件下与(a)或(b)中定义的DNA序列中的任一个杂交的DNA序列。(c)中定义的DNA序列最好与(a)和(b)中定义的DNA序列的任一个至少具有90％的序列同一性。(c)中定义的DNA序列可以是编码来自另一莫拉菌属菌株的相等运铁蛋白受体蛋白的DNA序列。
在另一方面，本发明包括适于转化宿主的包含本文提供的核酸分子的载体，可以具有载体LEM3-24、pLEM3、pLEM25、pLEM23、SLRD-A、DS-1698-1-1、DS-1754-1、pSLRD2、pSLRD3、pSLRD4和pSLRD5内含有的核苷酸序列的特征。
该载体可以适合于该编码运铁蛋白受体或其片段或类似物在异源或同源宿主中以或者脂质化(lipidated)形式或者非脂质化形式的表达。因此，本发明的再一方面提供适合于转化宿主的包含本文提供的核酸分子的表达载体和表达工具，该表达工具操作性地与用于该宿主表达运铁蛋白受体蛋白或运铁蛋白片段或其类似物的核酸分子偶联。在本发明该方面的具体实施方案中，该核酸分子可以编码莫拉菌属菌株的大致整个运铁蛋白受体蛋白、仅Tbp1蛋白、仅Tbp2蛋白或所述Tbp1或Tbp2蛋白的片段。该表达工具可以包括启动子和编码用于从该宿主分泌该运铁蛋白受体蛋白或该运铁蛋白受体蛋白片段或类似物的前导序列的核酸部分。该表达工具也可以包括编码用于该宿主表达脂质化形式该运铁蛋白受体蛋白或该运铁蛋白受体蛋白片段或类似物的脂质化信号的核酸部分。该宿主可以选自例如大肠杆菌、博代氏杆菌属、杆菌属、嗜血菌属、莫拉菌属、真菌、酵母或杆状病毒，也可以使用西门利启森林病毒表达表达系统。在特定实施方案中，适合于Tbp1表达的质粒为pLEM29，适合于表达Tbp2的质粒为pLEM33。其它载体包括pLEM-37、SLRD35-A和SLRD-35-B。
在本发明的另一方面，提供含有本文提供的表达载体的转化宿主。本发明还包括该转化宿主可产生的莫拉菌属菌株的重组运铁蛋白受体蛋白或其片段或类似物。
这种重组运铁蛋白受体蛋白可以以按照本发明再一方面的大致纯形式提供，本发明的再一方面提供形式大致纯的重组运铁蛋白受体蛋白的形成方法，它包括让本文提供的转化宿主生长，以表达作为包涵体的运铁蛋白受体蛋白，纯化无细胞物质和可溶性蛋白的包涵体、从纯化的包涵体中溶解运铁蛋白受体蛋白，并纯化无其它溶解的材料的该运铁蛋白受体蛋白。大致纯的重组运铁蛋白受体蛋白可以包括单独的Tbp1、单独的Tbp2或它们的混合物。该重组蛋白的纯度一般至少为大约70％，最好至少为大约90％。
由此，本发明的其它方面提供重组产生的莫拉菌属一菌株的Tbp1蛋白，该菌株缺乏该莫拉菌属菌株的Tbp2蛋白和该莫拉菌属菌株的其它蛋白，还提供重组产生的一莫拉菌属菌株的Tbp2蛋白，该菌株缺乏该莫拉菌属菌株的Tbp1蛋白和该莫拉菌属菌株的其它蛋白。该莫拉菌属菌株可以是卡他莫拉菌4223菌株、卡他莫拉菌Q8菌株或卡他莫拉菌R1菌株。
按照本发明的另一方面，提供一免疫原性组合物，它包括至少一种选自至少一种本文提供的核酸分子和至少一种本文提供的重组蛋白的活性组分和一种其药学上可接受的载体(carrier)或其载体(vector)。该至少一种活性组分当给与宿主时产生免疫应答。
本文提供的免疫原性组合物可以配制为用于体内给与宿主的疫苗。对于这种目的，所述组合物可以配制为微颗粒、胶囊、ISCOM或脂质体制剂。该免疫原性组合物可以与用于传递至免疫系统特定细胞或粘膜表面的寻靶分子结合而提供。本发明的免疫原性组合物(包括疫苗)可以还包含至少一种其它免疫原或免疫刺激物质，该免疫刺激物质可以是至少一种佐剂或至少一种细胞因子。适用于本发明的佐剂包括(但不限于)磷酸铝、氢氧化铝、QS21、Quil A、其衍生物和组分、ISCOM基质、磷酸钙、氢氧化钙、氢氧化锌、糖脂类似物、氨基酸的辛酯、胞壁酰二肽聚膦嗪(polyphosphazene)、ISCOPREP、DC-chol、DDBA和脂蛋白。1994年6月16日提交的转让给受让人的共同未决美国专利申请08/261,194和1995年6月7日提交的转让给受让人的共同未决每个专利申请08/483,856中描述了佐剂的有利组合，其说明书通过引用结合到本文中(WO 95/34308)。
按照本发明的另一方面，提供在宿主中产生免疫应答的方法，该方法包括给与易感宿主(诸如人类)有效量的本文提供的免疫原性组合物的步骤。该免疫应答可以为体液免疫应答或细胞介导的免疫应答，可以提供保护抵抗莫拉菌属引起的疾病。可以赋予保护抵抗疾病的宿主包括灵长类，包括人类。
在再一方面，提供用于将运铁蛋白补体传递至宿主的活载体，它包含含有上述核酸分子的载体。该载体可以选自沙门氏菌属、BCG、腺病毒、痘病毒、牛痘和脊髓灰质炎病毒。
本文提供的核酸分子可用于诊断应用。因此，在本发明的再一方面，提供测定样品中存在编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的核酸，该方法包括以下步骤：
(a)使该样品与本文提供的核酸分子接触，以产生包含该核酸分子和编码存在于该样品中的与其特异性杂交的莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的任何核酸分子的二元复合物；以及
(b)测定该二元复合物的产生。
另外，本发明提供测定样品中存在编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的诊断试剂盒，它包含：
(a)本文提供的核酸分子；
(b)用于使该核酸分子与该样品接触以产生二元复合物的工具，该二元复合物包含该核酸分子和该样品中存在的与该核酸分子杂交的任何这种核酸分子；以及
(c)测定该二元复合物产生的工具。
本发明还包括本文提供的核酸分子和蛋白质作为药物的用法。本发明另外包括本文提供的核酸分子和蛋白质在生产保护抵抗莫拉菌属菌株感染的药物的用法。
本发明的优点包括：
-编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白或该运铁蛋白受体蛋白片段或其类似物的分离和纯化的核酸分子；
-重组产生的包括Tbp1或Tbp2在内的运铁蛋白受体蛋白，该蛋白无另一种蛋白和其它莫拉菌属蛋白；以及
-用于特异性鉴定莫拉菌属的诊断试剂盒和免疫试剂。
                       附图简述
由以下描述，参考所述附图进一步理解本发明，其中：
图1显示用于合成简并引物的Tbp1蛋白保守部分的氨基酸序列(SEQ ID No：17和18)，该引物用于PCR扩增卡他莫拉菌4223 tbpA基因的一部分；
图2显示含有卡他莫拉菌分离菌4223的tbpA和tbpB基因的克隆LEM3-24的限制性图谱；
图3显示卡他莫拉菌4223的tbpA基因的限制性图谱；
图4显示卡他莫拉菌4223的tbpB基因的限制性图谱；
图5显示卡他莫拉菌4223的tbpA基因的核苷酸序列(SEQ ID No：1-完整的序列，SEQ ID No：2-编码序列)和推导出的Tbp1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No：9-全长，而SEQ ID No：10-成熟蛋白)。下划线表明该前导序列(SEQ ID No：19)；
图6显示卡他莫拉菌4223的tbpB基因的核苷酸序列(SEQ ID No：3-完整的序列，SEQ ID No：4-编码序列)和推导出的Tbp2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No：11-全长，而SEQ ID No：12-成熟蛋白)。下划线表明该前导序列(SEQ ID No：20)；
图7显示含有卡他莫拉菌Q8的tbpA和tbpB基因的克隆SLRD-A的限制性图谱；
图8显示卡他莫拉菌Q8的tbpA基因的限制性图谱；
图9显示卡他莫拉菌Q8的tbpB基因的限制性图谱；
图10显示卡他莫拉菌Q8的tbpA基因的核苷酸序列(SEQ ID No：5-完整的序列，SEQ ID No：6-编码序列)和推导出的Tbp1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No：13-全长，而SEQ ID No：14-成熟蛋白)；
图11显示卡他莫拉菌Q8的tbpB基因的核苷酸序列(SEQ ID No：7-完整的序列，SEQ ID No：8-编码序列)和推导出的Tbp2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No：15-全长，而SEQ ID No：16-成熟蛋白)；
图12显示来自卡他莫拉菌4223(SEQ ID No：9)和Q8(SEQ ID No：13)、流感嗜血菌菌株Eagan(SEQ ID No：21 )、脑膜炎奈瑟氏球菌B16B6(SEQ ID No：22)和M982(SEQ ID No：23)和淋病奈瑟氏球菌菌株FA19(SEQ ID No：24)的Tbp1的氨基酸序列比较。点表示相同的残基，已插入短划线以进行最大限度的序列对比；
图13显示来自卡他莫拉菌4223(SEQ ID No：11)和Q8(SEQ ID No：15)、流感嗜血菌菌株Eagan(SEQ ID No：25)、脑膜炎奈瑟氏球菌B16B6(SEQ ID No：26)和M918(SEQ ID No：27)和淋病奈瑟氏球菌菌株FA19(SEQ ID No：28)的Tbp2的氨基酸序列比较。点表示相同的残基，已插入短划线以进行最大限度的序列对比；
图14显示用于从大肠杆菌表达重组Tbp1蛋白的质粒pLEM29的构建；
图15显示用质粒pLEM29转化的大肠杆菌细胞表达Tbp1蛋白的SDS-PAGE分析；
图16显示纯化重组Tbp1蛋白的流程图；
图17显示纯化的重组Tbp1蛋白的SDS-PAGE分析；
图18显示用于在大肠杆菌中表达卡他莫拉菌4223的分别无或有前导序列的TbpA基因的质粒pLEM33和pLEM37的构建；
图19显示用质粒pLEM37转化的大肠杆菌细胞表达rTbp2蛋白的SDS-PAGE分析；
图20显示用于在大肠杆菌中表达卡他莫拉菌Q8的无前导序列的tbpB基因的质粒sLRD35B的构建、以及于在大肠杆菌中表达卡他莫拉菌Q8的有前导序列的tbpB基因的质粒SLRD35A的构建。限制位点B＝BamHI；Bg＝Bg1II；H＝HindIII；R＝EcoRI；
图21显示用质粒SLRD35A和SLRD35AB转化的大肠杆菌细胞中表达rTbp2蛋白的SDS-PAGE分析；
图22显示从大肠杆菌纯化重组Tbp2蛋白的流程图；
图23包括板A和板B，显示从大肠杆菌表达纯化卡他莫拉菌菌株4223(板A)和Q8(板B)的重组Tbp2蛋白的SDS-PAGE分析；
图24显示Tbp2与人运铁蛋白的结合；
图25包括板A、板B和板C，显示卡他莫拉菌菌株中Tbp2蛋白的抗原保守性；
图26显示卡他莫拉菌R1的tbpB基因的限制性图谱；
图27显示卡他莫拉菌R1的tbpB基因的核苷酸序列(SEQ ID No：45-完整的序列，SEQ ID No：46-编码序列)和推导出的Tbp2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No：47)；以及
图28显示卡他莫拉菌4223(SEQ ID No：21)、Q8(SEQ ID No：15)和R1(SEQ ID No：47)的氨基酸序列的比较。点表示相同的残基，而已插入短划线用于最大限度的序列对比。星号表示终止密码子。
                      发明概述
任何莫拉菌属菌株都可以方便地用来提供该纯化和分离的核酸，它可以是DNA分子形式，包含至少一个编码本发明实施方案代表的运铁蛋白受体的核酸的一部分。这类菌株一般可得自临床来源和细菌培养物保藏中心，诸如美国典型培养物保藏中心。
在该应用中，术语“运铁蛋白受体”(TfR)和“运铁蛋白结合蛋白”(Tbp)用来定义Tbp1和/或Tbp2蛋白家族，它包括其氨基酸序列中具有变异的那些蛋白，所述变异包括天然存在于各种例如莫拉菌属菌株中的变异。包含至少一个编码本发明运铁蛋白受体的部分的纯化和分离的DNA分子，也包括编码莫拉菌属运铁蛋白受体蛋白Tbp1和Tbp2的功能类似物的那些DNA分子。在该应用中，如果第一种蛋白免疫学上与第二种蛋白相关和/或具有相同功能，那么第一种蛋白是第二种蛋白的“功能类似物”。该功能类似物可以是例如该蛋白的片段或其置换、添加或缺失突变体。
卡他莫拉菌4223的染色体DNA用Sau3A消化，以便产生15-23kb大小的片段，将其克隆到λ载体EMBL3的BamHI位点中。用抗Tbp1豚鼠抗血清筛选该文库，选择含有插入大约13.2kb大小的阳性克隆LEM3-24用于进一步分析。发现感染LEM3-24的大肠杆菌LE392的裂解液含有大小大约为115kDa、在Western印迹上与抗Tbp1抗血清反应的蛋白。大小大约为80kDa的第二种蛋白在Western印迹上与抗Tbp2豚鼠抗血清反应。
为了将tnpA基因定位于LEM3-24的13.2kb的插入片段上，使用简并PCR引物扩增假定卡他莫拉菌4223的tbpA基因的小区。所述简并寡核苷酸引物的序列基于几种奈瑟氏球菌和嗜血菌物种的Tbp1蛋白内的保守氨基酸序列，并示于图1(SEQ ID No：17和18)。产生300碱基对的扩增产物，在图5(SEQ ID No：29)中用粗体字母指出它在4223tbpA基因内的位置。将扩增的产物亚克隆到载体pCRII中，进行标记并用来探测含有限制性内切酶消化的克隆LEM3-24 DNA的Southern印迹。该探针与3.8kb HindIII-HindIII、2.0kb AvrII-AvrII和4.2kbSalI-SphI片段杂交(图2)。
将3.8kb HindIII-HindIII片段亚克隆到pACYC177中并测序。鉴定出一个大的开放阅读框架，随后发现它含有大约2kb假定的tbpA基因。通过将相邻的下游HindIII-HindIII片段亚克隆到载体pACYC177中获得剩余的1kb tbpA基因。卡他莫拉菌4223的tbpA基因的核苷酸序列(SEQ ID No：1和2)和推导出的氨基酸序列(SEQ ID No：9-全长；SEQ ID No：10-成熟蛋白)示于图5。
卡他莫拉菌Q8的染色体DNA用Sau3AI消化，将15-23kb的片段连接到EMBL3的BamHI臂上。在大肠杆菌LE392细胞中产生高效价文库，用基于4223tbpA序列的寡核苷酸探针筛选该文库。制备噬菌体DNA，限制性酶分析揭示已经克隆了大约13-15kb的插入片段。用噬菌体克隆SLRD-A亚克隆用于序列分析的片段。产生一克隆载体(pSKMA)，以利于克隆所述片段，产生含有全部tabA和大部分tbpB的质粒pSLRD1、pSLRD2、pSLRD3、pSLRD4和pSLRD5。来自菌株Q8 tbpA基因的核苷酸序列(SEQ ID No：5和6)和推导出的氨基酸序列(SEQ ID No：13-全长，SEQ ID No：14-成熟蛋白)示于图10。
发现所述tbpA基因编码的Tbp1蛋白的推导出的氨基酸序列与多种奈瑟氏球菌属和嗜血菌属种基因编码的氨基酸序列共享一定的同源性(图12；SEQ ID No：21、22、23和24)。
在本发明之前，已经发现奈瑟氏球菌属、嗜血菌属和放线杆菌属中鉴定的tbpA基因位于具有几个保守区的tbpB基因之后。这两个基因通常由短的基因间序列分开。然而，未发现tbpB基因在卡他莫拉菌4223tbpA基因的上游。为了将该tbpB基因定位于克隆LEM3-24的13.2kb插入片段内，在几个种的Tbp2蛋白中保守的氨基酸序列EGGFYGP(SEQ ID No：30)的基础上合成简并寡核苷酸探针。标记该寡核苷酸，并将其用来探测含有克隆LEM3-24的不同限制性内切酶片段的Southern印迹。该探针与5.5kb的NheI-SalI片段杂交，随后将该片段亚克隆到pBR328中并测序。该片段含有除启动子区外的该假定tbpB基因的大部分。将克隆LEM3-24测序，以获得剩余的上游序列。与嗜血菌属和奈瑟氏球菌属中tbpA和tbpB基因的遗传结构相反，该tbpB基因定位于该tbpA基因末端下游的3kb处。卡他莫拉菌4223的tbpB基因的核苷酸序列(SEQ ID No：3和4)和推导出的氨基酸序列(SEQ IDNo：11、12)示于图6。也将卡他莫拉菌Q8的tbpB基因克隆并测序。该核苷酸序列(SEQ ID No：7和8)和推导出的氨基酸序列(SEQ ID No：15和16)示于图11。也将卡他莫拉菌R1的tbpB基因克隆并测序。该核苷酸序列(SEQ ID No：45和46)和推导出的氨基酸序列(SEQ IDNo：47)示于图27。在图28的比较性序列对比中所示卡他莫拉菌Tbp2氨基酸序列(SEQ ID No：11、15和47)之间和图13中比较性序列对比中所示的他莫拉菌Tbp2氨基酸序列与多种奈瑟氏球菌属和嗜血菌属种的Tbp2序列(SEQ ID No：25、26、27、28)之间明显有同源区。
在大肠杆菌中表达克隆的tbpA和tbpB基因，以产生不含其它莫拉菌属蛋白的重组Tbp1和Tbp2蛋白。纯化这些重组蛋白并用于免疫。
通过将卡他莫拉菌和表达重组Tbp2蛋白的大肠杆菌菌株的全细胞裂解液进行SDS PAGE分离所述蛋白，并用豚鼠中产生的抗4223rTbp2抗血清或抗Q8 rTbp2抗血清进行抗血清免疫印迹分析，证明卡他莫拉菌各菌株之间的Tbp2蛋白的抗原保守性。卡他莫拉菌菌株3、56、135、585、4223、5191、8185和ACTT25240以该方式进行测试，全都显示出与抗4223rTbp2或抗Q8rTbp2抗体的特异性反应性(图25)。
另外，通过ELISA在以下表1中显示了来自一个菌株的抗rTbp2抗体识别来自同源或异源菌株的天然的或重组蛋白的能力。
进行了卡他莫拉菌4223的运铁蛋白受体的N末端和溴化氰片段的氨基酸测序。封闭Tbp1和Tbp2的N末端。在图5和图6(SEQ ID No：19和20)中的下划线部分分别指出Tbp1和Tbp2的假定信号序列。推导出的Tbp2的N末端区的氨基酸序列提示一个脂蛋白结构。
以下表1和表2所示的结果说明通过用Tbp1或Tbp2免疫产生的抗Tbp1和抗Tbp2豚鼠抗血清裂解卡他莫拉菌的能力。结果表明：通过用从卡他莫拉菌分离菌4223分离的Tbp1或Tbp2蛋白免疫产生的抗血清是抗得自分离菌4223的同源非凝集卡他莫拉菌菌株RH408(一种与转让给受让人的美国专利申请08/328,589(WO 96/12733)有关的先前于1994年12月13日保藏在美国典型培养物保藏中心的菌株，ACTT保藏号为55,637，该保藏中心位于1301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美国)的杀菌剂。另外，用从卡他莫拉菌4223分离的Tbp1蛋白免疫产生的抗血清是抗异源非凝集菌株Q8(CentreHospitalier de 1’Uniersite Laval，St.Foy，Quebec的M.G.Bergeron博士的赠品)的杀菌剂。另外，对重组Tbp2(rTbp2)蛋白产生的抗血清是抗卡他莫拉菌的同源菌株的杀菌剂。
分离和纯化的运铁蛋白结合蛋白产生杀菌抗体的能力是利用这些蛋白作为保护抵抗莫拉菌属引起的疾病的疫苗的体内证据。
因此，按照本发明的另一方面，提供抗莫拉菌属菌株引起的感染的疫苗，它包含免疫原性有效量的莫拉菌属一菌株的运铁蛋白结合蛋白和生理上可接受的载体。疫苗制剂可以包含抗原性或序列多样化的运铁蛋白结合蛋白。
本文提供的运铁蛋白结合蛋白可用作诊断试剂、用于产生抗运铁蛋白蛋白结合抗体的抗原、针对莫拉菌属种引起的疾病的疫苗接种的抗原和用于检测莫拉菌属和其它这类细菌感染的抗原。
本文提供的运铁蛋白结合蛋白也可以用作半抗原、制备针对与运铁蛋白结合蛋白无关的抗原决定基的结合疫苗的多糖或肽的载体蛋白。因此，在本发明的其它实施方案中，本文提供的运铁蛋白结合蛋白可以用作制备针对病原细菌(包括包囊细菌)的嵌合分子和结合疫苗(包括糖缀合物)的载体分子。因此，例如本发明的糖缀合物可以用来赋予针对具有多糖抗原(包括脂寡糖(LOS)和PRP)的细菌引起的疾病和感染的保护作用。这类细菌病原体可以包括例如流感嗜血菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、伤寒沙门氏菌、突变链球菌、新型隐球菌、克雷伯氏菌属、金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌。1993年11月23提交的、转让给受让人的美国专利申请08/433,522号(WO94/12641)中描述了可以与运铁蛋白结合蛋白结合的特定抗原和达到这种结合的方法，其说明书通过引用结合到本文中。
在另一实施方案中，可以利用运铁蛋白结合蛋白载体功能，以例如诱导针对肿瘤细胞的异常多糖的免疫应答，或产生可以与化学治疗剂或生物活性剂结合的抗肿瘤抗体。
本发明延伸至卡他莫拉菌的运铁蛋白结合蛋白，以在针对莫拉菌属感染引起的疾病的疫苗中用作活性组分。本发明也延伸至药用疫苗组合物，它含有卡他莫拉菌的运铁蛋白结合蛋白和可选的药学上可接受的载体和/或稀释剂。
在本发明的另一方面，提供运铁蛋白结合蛋白用于制备用于对莫拉菌属感染引起的疾病免疫的药用疫苗组合物的用途。
对本领域技术人员显而易见的是，本发明的不同实施方案在疫苗接种、诊断、治疗例如莫拉菌属感染和产生免疫性试剂和其它诊断试剂领域中有许多应用。下面进一步提出这种用途的另一非限制性讨论。1.疫苗的制备和用途
可以由所述核酸分子以及本文公开的核酸分子编码的免疫原性运铁蛋白受体蛋白、其类似物或其片段制备适于用作疫苗的免疫原性组合物。该疫苗引起的免疫应答产生抗体，包括抗运铁蛋白受体抗体和调理性或为杀菌的抗体。如果接种疫苗的受治疗者被莫拉菌属攻击，所述抗体则与该运铁蛋白受体结合，由此防止所述细菌利用其生存需要的铁源。此外，调理性或杀菌的抗运铁蛋白受体抗体也可以通过其它机制提供保护。
包括疫苗在内的免疫原性组合物可以制备为可注射的液体溶液或乳液。运铁蛋白受体蛋白、其类似物和其片段以及编码核酸分子可以与药学上可接受的赋形剂混合，所述赋形剂与该运铁蛋白受体蛋白、其片段、类似物或核酸分子相容。这类赋形剂可以包括水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇和它们的组合物。所述免疫原性组合物和疫苗可以还含有辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂，以增加所述疫苗的效力。所述免疫原性组合物和疫苗可以通过皮下、皮内或肌内给与胃肠外给与。另一方面，按照本发明提供的免疫原性组合物可以以在粘膜表面引起免疫应答的方式配制和传递。因此，所述免疫原性组合物可以通过例如经鼻或经口(胃内)途径给与粘膜表面。可以结合寻靶分子提供该免疫原性组合物，所述寻靶分子用于传递至该免疫系统的特定细胞或粘膜表面。某些这类寻靶分子如WO 92/17167描述的包括维生素B12和细菌毒素片段(Biotech Australis Pty.Ltd.)，如美国专利5,194,254(Barber等)描述的包括单克隆抗体。另一方面，包括栓剂和口服制剂的其它给药途径可以是合乎要求的。对于栓剂，粘合剂和载体可以包括例如聚链烷二醇或甘油三酯。口服制剂可以包括正常使用的赋形剂(incipient)，诸如药用级糖类、纤维素和碳酸镁。这些组合物可以采用溶液、悬液、片剂、丸剂、胶凝、缓释制剂或粉末的形式，含有大约1-95％的运铁蛋白受体蛋白、片段、类似物和/或核酸分子。
所述疫苗以与该剂量制剂相容的方式给与，其量就是治疗有效的、具有保护性和免疫原性。待给与的量取决于待治疗的受治疗者，包括例如该个体免疫系统合成抗体的能力，如果需要，包括其免疫系统产生细胞介导的免疫应答的能力。待给与所需的活性组分的精确的量取决于医师的判断。然而，本领域技术人员容易确定合适的剂量范围，可以大约为数微克所述运铁蛋白受体蛋白、其类似物和其片段和/或核酸分子。初次给药和加强剂量的制度也是可变的，但可以包括初次给药后接着随后的给药。该疫苗的剂量也可以取决于给药途径，并根据该宿主的大小变化。
编码莫拉菌属运铁蛋白受体的核酸分子可以通过直接给与该DNA直接用于免疫，例如通过注射用于遗传免疫、或通过构建含有所述核酸分子的活载体(诸如沙门氏菌属、BCG、腺病毒、痘病毒、牛痘或脊髓灰质炎病毒)。例如在O’Hagan(参考文献22)中包含已经用来携带异源抗原至该免疫系统的某些活载体的讨论。例如在Ulmer等(参考文献23)中描述了直接将DNA注射到试验受治疗者中用于遗传免疫的方法。
如果所述抗原与佐剂一起共给与，通常用作磷酸盐缓冲盐水中的0.05-1.0％溶液，可以显著提高免疫原性。佐剂增强抗原的免疫原性，但它们本身不必为免疫原。佐剂可以通过将该抗原在给药位点附近局部保留，以产生贮存效应促进将抗原缓慢、持续释放该免疫系统的细胞而起作用。佐剂也可以将免疫系统的细胞吸引至抗原贮存点，并刺激这类细胞以引起免疫应答。
多年来免疫刺激剂或佐剂已经用来提高该宿主对例如疫苗的免疫应答。诸如脂多糖的内源佐剂通常为用作疫苗的灭活或减毒细菌的组分。外源佐剂为通常非共价连接到抗原上的免疫调节剂，将其配制以增强该宿主的免疫应答。因此，佐剂已经鉴定为增强对非肠道传递的抗原的免疫应答。然而，这些佐剂中的某些有毒，可以引起不良的副作用，使得它们不适用于人类和许多动物。实际上，仅有氢氧化铝和磷酸铝(统称为明矾)常规上用作人类和畜用疫苗中的佐剂。确定了明矾提高抗体对白喉类毒素和破伤风类毒素的效力，HBsAg疫苗已用明矾作佐剂。尽管确定明矾对于某些应用是有用的，但它有限制。例如明矾对于流感疫苗接种是无效的，不一致地引起细胞介导的免疫应答。明矾作佐剂的抗原引起的抗体在小鼠中主要是IgG1同种型，它对于由某些疫苗试剂的保护可能不是最适的。
各式各样的外源佐剂可以引起针对抗原的有效的免疫应答。这些包括与膜蛋白抗原复合的皂苷(免疫刺激复合物)、具有矿物油的pluronic聚合物、灭活分支杆菌和矿物油、弗氏完全佐剂、细菌产物，诸如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂质A和脂质体。
为了有效地诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫性(CMI)，通常将免疫原在佐剂中乳化。许多佐剂是有毒的，诱导肉芽肿、急性和慢性炎症(弗氏完全佐剂，FCA)、细胞溶解(皂苷和pluronic聚合物)和热原性、关节炎和前眼色素层炎(LPS和MDP)。尽管FCA是出色的佐剂并广泛用于研究中，但由于它的毒性，它不允许用于人类和兽医疫苗中。
理想的佐剂的希望特征包括：
(1)缺乏毒性；
(2)刺激长期持续的免疫应答的能力；
(3)生产简便和长期贮存稳定性；
(4)如果需要，引起针对通过各种途径给与的抗原的CMI和HIR的能力；
(5)与其它佐剂的协同作用；
(6)选择性与抗原提呈细胞(APC)群体的相互作用的能力；
(7)特异性引起合适TH1或TH2细胞特异性免疫应答的能力；以及
(8)选择性提高针对抗原的合适抗体同种型水平(例如IgA)的能力。
于1989年8月8日授予Lockhoff等的美国专利4,855,283(通过引用结合到本文中)指出包括N-糖酰胺、N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯的糖脂类似物作为免疫调节剂或佐剂，它们每种在糖残基中用氨基酸取代。因此Lockhoff等1991年(参考文献24)报道：表现出与天然存在的糖脂(诸如糖磷脂和糖基甘油酯)的结构相似性的N-糖脂类似物能够在单纯疱疹病毒疫苗和假狂犬病病毒疫苗中引起强免疫应答。某些糖脂已经由长链烷基胺和脂肪酸合成，将其通过异头碳原子直接与所述糖连接，以模拟天然存在的脂质残基的功能。
授予Moloney、转让给受让人的美国专利4,258,029(通过引用结合到本文中)指出，盐酸十八基酪氨酸(OTH)与破伤风类毒素和福尔马林灭活的I、II和II型脊髓灰质炎病毒疫苗复合时作为佐剂起作用。此外，Nixon-George等1990年(参考文献25)报道与重组乙型肝炎表面抗原复合的芳族氨基酸的十八酯增强该宿主对乙型肝炎病毒的免疫应答。2.免疫检定
本发明的运铁蛋白受体蛋白、其类似物和/或其片段可用作免疫原、免疫检定中的抗原，所述免疫检定包括酶联免疫吸附检定(ELISA)、RIA和其它非酶联抗体结合检定或本领域已知的用于检测抗莫拉菌属运铁蛋白受体蛋白抗体的方法。在ELISA检定中，将所述运铁蛋白受体蛋白、类似物和/或相应于TfR蛋白部分的片段固定到选定表面上，例如能够结合蛋白或肽的表面，诸如聚苯乙烯微量滴定板的孔。洗涤以除去不完全吸附的运铁蛋白受体、类似物和/或片段后，可以将已知对于该试验样品为抗原中性的非特异性蛋白(诸如牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白溶液)结合到选定表面上。这允许封闭固定化表面上的非特异性吸附位点，因此降低抗血清的非特异性结合到该表面上引起的背景。
然后该固定化表面与诸如临床或生物学材料的样品接触，以引出免疫复合物(抗原/抗体)形成的方式进行测试。该方法可以包括将该样品用稀释剂(诸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸缓冲盐水(PBS)/吐温)稀释。然后让该样品于诸如大约25-37℃的温度下温育大约2-4小时。温育后，洗涤样品接触的表面，以除去非免疫复合材料。该洗涤步骤可以包括用诸如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤。
在试验样品和结合的运铁蛋白受体蛋白、类似物和/或片段之间形成特异性免疫复合物和随后的洗涤后，可以通过使该免疫复合物接触对第一抗体具有特异性的第二抗体，测定免疫复合物形成的发生和量。如果该试验样品来源于人类，那么第二抗体为对人免疫球蛋白特异性的抗体，一般为IgG。为了提供检测工具，第二抗体可以具有相关的活性，诸如与适合的显色底物温育时产生例如颜色变化的酶促活性。然后，可以通过使用例如分光光度计测定颜色生成的程度进行定量。3.使用序列作为杂交探针
包含该运铁蛋白受体基因的序列本发明的核苷酸序列现在允许从莫拉菌属的任何菌种鉴定和克隆所述运铁蛋白受体基因。
包含本发明运铁蛋白受体基因序列的核苷酸序列对于它们选择性地与其它TfR基因的互补的一段序列形成双链体分子的能力而言是有用的。根据该应用，可以使用各种杂交条件达到不同程度的该探针对所述其它tfR基因的选择性。对于高度的选择性，使用相对严格的条件以形成所述双链体，所述相对严格的条件诸如低盐和/或高温条件，诸如于50-70℃下0.02M-0.15M NaCl提供的条件。对于某些应用，需要严格性较低的杂交条件，诸如于大约20-55℃的温度下0.15-0.9M盐。通过加入增加量的甲酰胺使杂种双链体去稳定，也可以赋予杂交条件更强的严格性。因此，可以容易地操作特定的杂交条件，一般为根据所需结果进行的一种选择方法。一般而言，在50％甲酰胺存在下便利的杂交温度为：对于与靶片段同源性为95-100％的探针为42℃，对于同源性为90-95％的探针为37℃，对于同源性为85-90％的探针为32℃。
在临床诊断实施方案中，本发明TfR基因的核酸序列可以与诸如用于检测杂交的标记的合适工具结合使用。各式各样的合适指示工具是本领域已知的，包括放射性、酶配基和诸如亲和素/生物素和洋地黄毒苷标记的其它配基，它们能够提供可检测信号。在某些诊断实施方案中，诸如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶之类的酶标记可以代替放射性标记使用。在酶标记的情况下，比色指示底物是已知的，它们可以用来提供人肉眼可见或分光光度计可见工具，以鉴别与含有TfR基因序列的样品的杂交。
本发明的TfR基因的核酸序列在溶液杂交和使用固相方法的实施方案中可用作杂交探针。在涉及固相方法的实施方案中，将来自样品的测试DNA(或RNA)吸附或按另一方式固定到选定的基质或表面上，所述样品诸如临床样品，包括渗出物、体液(例如血清、羊水、中耳渗漏液、唾液、支气管肺泡灌洗液)或甚至组织。然后将所述固定的单链核酸与包含本发明TfR基因核酸序列或其片段的选定探针在所需条件下进行特异性杂交。选定条件取决于所需特定标准基础上的特定环境，这取决于例如G+C含量、靶核酸的类型、核酸来源、杂交探针的大小等。洗涤杂交表面以除去非特异性结合的探针分子后，借助于该标记检测特异性杂交或甚至进行定量。最好选择在莫拉菌属种中保守的核酸序列部分。选定的探针必须至少为18bp，可以为大约30-90bp。4.所述运铁蛋白受体基因的表达
含有得自与该宿主细胞相容物种的复制子和控制序列的质粒载体可以用来在表达系统表达所述运铁蛋白受体基因。该载体一般携带复制位点以及能够在转化细胞提供表型选择的标记序列。例如可以用含有氨苄青霉素和四环素抗性的pBR322转化大肠杆菌，由此提供易于鉴别转化细胞的工具。pBR322质粒或其它微生物质粒或噬菌体也必须含有或修饰为含有该宿主能够使用表达其自身蛋白的启动子。
另外，含有与该宿主相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主相关的转化载体。例如λGEMTM-11的噬菌体可以用于制备可以用来诸如宿主大肠杆菌LE392的宿主细胞的重组噬菌体载体。
通常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统和其它微生物启动子，诸如美国专利4,952,496号中描述的T7启动子系统。关于启动子核苷酸序列的细节是已知的，使得技术人员能够将它们与基因功能性地连接。所用的特定启动子一般只是选择的问题，取决于所需的结果。适于所述运铁蛋白受体基因、其片段、类似物或其变异体表达的宿主可以包括大肠杆菌、杆菌属种、嗜血菌属、真菌、酵母、莫拉菌属、博德特氏菌属，或可以使用杆状病毒表达系统。
按照本发明，最好用重组方法制备该运铁蛋白受体蛋白、其片段或类似物，特别是因为天然存在的从莫拉菌属种培养物中纯化的TfR蛋白可以包括微量的有毒物质或其它污染物。该问题可以采用在异源系统重组产生的TfR蛋白来避免，所述蛋白可以从该宿主中以在纯化材料中最大限度的减少污染物的方式分离。在该方面特别希望用于表达的宿主包括革兰氏阳性细菌，它们不具有LPS，因此无内毒素。这类宿主包括杆菌属种，对于生产非热原性运铁蛋白受体、其片段或类似物可能特别有用。此外，生产的重组方法允许生产相互分离的区别于莫拉菌属中存在的正常混合蛋白的Tbp1或Tbp2或各自的类似物或片段。生物学保藏
含有至少一个编码本文描述和提到的卡他莫拉菌4223株和Q8株和卡他莫拉菌RH408株的运铁蛋白受体蛋白部分的某些载体，已经按照布达佩斯条约，在本申请提交之前保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，它位于12301 Parklawm Drive，Rockville，Maryland，美国。当根据美国专利申请授予专利时，保藏的载体和细菌菌株的样品对于公众将是可利用的，将消除对利用所述保藏物的限制。另外，如果该保藏中心不能分配发放存活样品，则可替换该保藏物。本文描述和要求保护的本发明在范围上将不受保藏的生物学材料的限制，因为保藏的具体材料仅作为本发明的说明。编码与该申请描述的相似的或相同的抗原的任何相同和相似的载体或菌株在本发明的范围内。
保藏概述
保藏物  ATCC标号 保藏日期
噬菌体LEM3-24  97,381 1995年12月4日
噬菌体SLRD-A  97,380 1995年12月4日
质粒pLEM29  97,461 1996年3月8日
质粒pSLRD35A  97,833 1997年1月13日
质粒pLEM37  97,834 1997年1月13日
菌株RH408  55,637 1994年12月9日
                        实施例
以上说明书概述了本发明。参考以下具体实施例可以更完全地理解。描述这些实施例仅仅为了说明，而不是为了限制本发明的范围。正如环境可以提示或赋予紧急方法一样，设想了形式的改变和等价物的替换。尽管本文已经使用具体的术语，但这些术语是为了描述，不是为了限制。
在本说明书中和这些实施例中使用的但没有清楚地描述的分子遗传学、蛋白生物化学和免疫学方法，在科学文献中详细地报道了，它们在本领域技术人员的技能范围内。实施例1
该实施例描述卡他莫拉菌的Tbp1和Tbp2蛋白的制备和用它们免疫豚鼠。
如下获得Tbp1和Tbp2蛋白：
将铁饥饿总的粗膜制剂在50mM Tris.Hcl-1M NaCl，pH8中稀释至4mg蛋白/ml，总体积为384ml。通过加入0.5M EDTA和30％N-月桂酰肌氨酸钠(sarkosyl)各8ml溶解膜，样品于室温下温育2小时，同时轻轻搅拌。溶解的膜于10K rpm离心20分钟。将15ml apo-hTf-Sepharose 4B加入上清液中，于室温下温育2小时，同时轻轻摇动。将该混合物加入柱中。该柱用50ml 50mM Tris.HCl-1M NaCl-250mM盐酸胍洗涤，以除去污染蛋白。加入100ml 1.5M盐酸胍将Tbp2从该柱中洗出。加入100ml 3M盐酸胍将Tbp1洗出。将前20ml的收集部分对3次更换的50mM Tris.HCl，pH8.0透析。样品贮藏于-20℃，或对碳酸氢铵透析并冻干。
在第1天时，用10μg剂量的在弗氏完全佐剂中乳化的Tbp1或Tbp2肌内免疫豚鼠(Charles River)。在第14天和第29天时，用同样剂量的在弗氏不完全佐剂中乳化的蛋白加强动物。在第42天时取血样，血清用于杀菌抗体活性的分析。另外，通过免疫印迹分析与卡他莫拉菌4223蛋白的反应性，评价所有的抗血清。
如下测定豚鼠抗卡他莫拉菌4223 Tbp1或Tbp2抗血清的杀菌抗体活性。将得自分离株4223的非凝集卡他莫拉菌RH408株接种到20mlBHI液体培养基中，于37℃生长18小时，同时以170rpm震荡。用1ml该培养物接种添加25mM乙二胺二羟苯基乙酸(EDDA，Sigma)的20mlBHI中。使该培养物生长至OD570为0.5。所述细胞在含有0.1％牛血清白蛋白(VBS)的140mM NaCl、93mM NaHCO3、2mM巴比妥酸钠、4mM巴比妥酸、0.5mM MgCl2.6H2O、0.4mMCaCl2.2H2O，pH7.6(Veronal缓冲液)中稀释，并置于冰上。豚鼠抗卡他莫拉菌4223Tbp1或Tbp2抗血清与预取血的对照抗血清一起加热至56℃30分钟，以灭活内源补体。将每种抗血清在VBS中的连续2倍稀释液加入96孔Nunclon微量滴定板(Nunc，Roskilde，Denmark)的孔中。稀释液由1∶8开始，制备为终体积为每孔25μl。将25μl稀释的细菌细胞加入每个孔中。豚鼠补体(Biowhittaker，Walkersville，MD)在VBS中稀释1∶10，将25μl的部分加入每个孔中。将所述板于37℃温育60分钟，在旋转平台上以70rpm震荡。将50μl的每种反应混合物平板接种于Mueller Hinton(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)琼脂平板上。所述板于37℃温育72小时，数每个平板的菌落数。与含有免疫前血清的对照相比，以能够杀死高于50％细菌的最高抗血清稀释度的倒数评价杀菌效价。下面表1所示结果说明抗Tbp1和抗Tbp2豚鼠抗血清裂解卡他莫拉菌的能力。实施例2
该实施例说明来自卡他莫拉菌4223株和Q8株的染色体DNA的制备。
将卡他莫拉菌分离株4223接种到100ml BHI液体培养基中，于37℃震荡温育18小时。以10,000×g离心20分钟收集所述细胞。沉淀用于抽提卡他莫拉菌4223的染色体DNA。
将细胞沉淀重悬浮于20ml的10mM Tris-HCl(pH7.5)-1.0mMEDTA(TE)中。加入链霉蛋白酶和SDS使其终浓度分别为500μg/ml和1.0％，将悬浮液于37℃温育2小时。用苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)顺序抽提几次后，将水性抽提液于4℃对1.0m NaCl透析4小时，对TE(pH7.5)更换3次缓冲液再透析48小时。将2倍体积的乙醇加入透析液中，将DNA缠绕在玻璃棒上。让DNA风干，并溶于3.0ml水中。用UV分光光度计估计的浓度大约为290μg/ml。
如实施例1所述，让卡他莫拉菌Q8株生长于BHI液体培养基中。从50ml培养基中通过以5000rpm于4℃离心20分钟沉淀细胞。将细胞沉淀重悬浮于10mlTE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH7.5)中，加入蛋白酶K和SDS，使其终浓度分别为500μg/ml和1％。该样品于37℃温育4小时，直至获得透明的裂解液。裂解液用Tris饱和的苯酚/氯仿(1∶1)抽提2次，用氯仿抽提2次。最终的水相于4℃对2×1000ml的1M NaCl透析24小时，更换1次缓冲液，于4℃对2×1000mlTE透析24小时，更换一次该缓冲液。最终的透析液用2倍体积的100％乙醇沉淀。将DNA缠绕、干燥并重悬浮于5-10ml TE缓冲液中。实施例3
该实施例说明在EMBL3中构建卡他莫拉菌的染色体文库。
在10μl终体积中进行染色体DNA的一系列Sau3A限制性消化，以便优化产生最大量15-23kb大小的限制性片段必需的条件。用所述优化消化条件，在含有以下材料的100μl体积中进行大规模的消化：50μl染色体DNA(290μg/ml)、33μl水、10μl 10×Sau3A缓冲液(New England Biolabs)、1.0μl BSA(10mg/ml，New England，Biolabs)和6.3μl Sau3A(0.04U/μl)。于37℃温育15分钟后，加入10μl 10mMTris-HCl(pH8.0)-10mM EDTA-0.1％溴酚蓝-50％甘油(加样缓冲液)终止消化。消化的DNA通过40mM Tris乙酸盐-2mM Na2EDTA.2H2O(pH8.5)(TAE缓冲液)以50V电泳6小时。从胶上切下含有分子大小为15-23kb的限制性片段，置于含有3.0ml TAE缓冲液的透析管中。施加1.0V/cm的场强18小时，从该胶中电洗脱出DNA。电洗脱的DNA用苯酚和苯酚∶氯仿(1∶1)各抽提1次，并用乙醇沉淀。将干燥的DNA溶于5.0μl水中。
用T4 DNA连接酶在9μl的终体积中将大小分级分离的染色体DNA与BamHI消化的EMBL3臂(Promega)连接。用市售包装试剂盒(Amersham)按照厂商的说明将完整的连接混合物包装入λ噬菌体中。
包装的DNA文库在固体培养基中扩增。将10mM MgSO4 0.1ml等份的大肠杆菌NM539株(OD260＝0.5)于37℃于15-25μl的该包装DNA文库一起温育15分钟。将样品与3ml含有1.0％BBL胰胨-0.5％NaCl的0.6％琼脂糖(BBL上层琼脂糖)混合，将混合物在含有1.0％BBL胰胨-0.5％NaCl的1.5％琼脂平板上铺平板，并于37℃培养18小时。将3ml量的50mM Tris-HCl(pH7.5)-8mM七水硫酸镁-100mM NaCl-0.01％(w/v)明胶(SM缓冲液)加入每个平板。平板于4℃放置7小时。从每个平板收集含有噬菌体的SM缓冲液，将其合并并于4℃与氯仿一起贮存于螺口试管中。
来自卡他莫拉菌Q8株的染色体DNA用Sau3A I(0.1单位/30μgDNA)于37℃消化30分钟，并在0.6％的低熔点琼脂糖凝胶上进行大小分级分离。切下15-23kb的DNA片段，在含有TAE(40mM Tris乙酸盐pH8.5、2mM EDTA)的透析管中于150V下电洗脱该DNA 25分钟。DNA用苯酚/氯仿(1∶1)抽提1次，沉淀并重悬浮于水中。将DNA与EMBL3 BamHI I臂(Promega)过夜连接，用λ体外包装试剂盒(Strategene)包装连接混合物，并在大肠杆菌LE392细胞上铺平板。测定该文库的效价，并将其在0.3％氯仿存在下贮存于4℃。实施例4
该实施例说明卡他莫拉菌文库的筛选。
将每份10μl等份来自以上实施例3制备的EMBL3/4223样品的噬菌体贮液与100μl 10mM MgSO4中的大肠杆菌LE392株(OD260＝0.5)(铺平板细胞)混合，并于37℃温育15分钟。将所述样品与各3ml的BBL上层琼脂糖混合，将混合物注入含有1％细菌培养用胰胨-0.5％细菌培养用酵母膏-0.05％NaCl并添加200μM EDTA的1.5％琼脂糖(LB琼脂糖；Difco)平板上。将所述平板于37℃温育18小时。用标准方法将空斑揭掀到硝酸纤维素滤膜(Amershan Hybond-C Extra)上，将所述滤膜浸入含5％牛血清白蛋白(BSA；Boehringer)的20mM Tris-HCl(pH7.5)-150mM NaCl(TBS)中于室温下30分钟，或于4℃过夜。滤膜在含有豚鼠抗卡他莫拉菌4223 Tbp1抗血清的1/1000稀释液的TBS中于室温至少保温1小时，或于4℃保温18小时。在含有0.05％吐温20的TBS(TBS-吐温)中连续4次洗涤10分钟后，滤膜于室温下在含有用辣根过氧化物酶标记的重组G蛋白(rProtein G-HRP；Zymed)的1/4000稀释液的TBS-吐温中温育30分钟。如上洗涤滤膜，将其浸入CN/DAB底物溶液(Pierce)中。将所述滤膜浸入水中停止显色。从所述平板取阳性空斑，将每个空斑置于含有几滴氯仿的0.5ml SM缓冲液中。该筛选步骤用豚鼠抗卡他莫拉菌4223 Tbp1抗血清再重复2次，直至100％揭掀的空斑为阳性。
用YT中的0.7％上层琼脂作为上层，将EMBL3/Q8文库平板接种到YT平板上的LE392细胞上。将空斑揭掀到硝酸纤维素滤膜上，用32Pα-dCTP标记的寡核苷酸探针(随机引物DNA标记试剂盒，Boehringer Mannheim)探测所述滤膜。在氯化钠/柠檬酸钠(SSC)缓冲液(参考文献27)中于37℃预杂交1小时，于42℃杂交过夜。所述探针基于4223tbpA的内部序列：
           I  R  D  L  T  R  Y  D  P  G(Seq ID No.31)4236-RD 5′ ATTCGAGACTTAACACGCTATGACCCTGGC 3′(Seq ID No 32)4237-RD 5 ′ATTCGTGATTTAACTCGCTATGACCCTGGT 3′(Seq ID No 33)。
假定的空斑再铺平板，用同样的方法进行第二和第三轮筛选。噬菌体克隆SLRD-A用来亚克隆该tfr基因用于序列分析。实施例5
该实施例说明用抗卡他莫拉菌4223 Tbp1和Tbp2抗血清进行的所述噬菌体裂解液的免疫印迹分析。
如下沉淀在以上实施例4中选择的噬菌体洗提液表达的蛋白。将60μl每种噬菌体洗提液与200μl大肠杆菌LE392铺平板细胞混合，于37℃温育15分钟。将该混合物接种到添加200mM EDTA的10ml 1.0％NZamine A-0.5％NaCl-0.1％酪蛋白氨基酸-0.5％酵母膏-0.2％七水硫酸镁(NZCYM液体培养基)中，于37℃震荡生长18小时。将DNA酶加入1.0ml的该培养物中，使其终浓度为50μg/ml，该样品于37℃温育30分钟。加入终浓度为12.5％的三氯乙酸，将该混合物置于冰上15分钟。以13,000×g离心10分钟沉淀蛋白，用1.0ml丙酮洗涤该沉淀。将该沉淀风干并重悬浮于50μl 4％SDS-20mM Tris-HCl(pH8.0)-0.2mM EDTA(裂解缓冲液)中。
通过11.5％的凝胶SDS-PAGE电泳后，在20V的恒定电压下，将所述蛋白在25mM Tris-HCl、200mM甘氨酸-20％甲醇(转移缓冲液)中转移18小时，转移至Immobilon-P滤膜(Millipore)上。在含5％BSA的TBS中将膜于室温下封闭30分钟。印迹于室温下或暴露于豚鼠抗卡他莫拉菌4223 Tbp1抗血清或暴露于豚鼠抗卡他莫拉菌4223 Tbp2抗血清2小时，所述抗血清在TBS-吐温中稀释1/500。在TBS-吐温中连续洗涤3次10分钟后，膜于室温下在含有重组蛋白(rProtein)G-HRP的1/4000稀释液的TBS-吐温中温育30分钟。如上洗涤膜，并浸入CN/DAB底物溶液中。将印迹浸入水中停止显色。
三个EMBL3噬菌体克隆既表达与Western印迹上的抗Tbp1抗血清反应的115kDa蛋白，也表达与Western印迹上的抗Tbp2抗血清反应的80kDa蛋白，因此总结为含有编码卡他莫拉菌运铁蛋白受体蛋白的基因。实施例6
该实施例说明卡他莫拉菌4223 Tbp1蛋白基因tbpA的亚克隆。
通过将噬菌体洗提液和大肠杆菌LM392铺平板细胞混合，在LB琼脂平板上产生连合裂解，制备实施例5中所述重组噬菌体的平板裂解物培养物。用Wizard Lamda Prep DNA纯化系统(Promega)，按照厂商的说明从所述平板裂解液中抽提噬菌体DNA。
发现EMBL3克隆LE3-24含有侧翼为两个SalI位点的13.2kb插入片段。制备tbpA基因探针，该探针由相应于Tbp1蛋白部分的氨基酸序列(图1)的两个简并寡核苷酸引物，通过PCR产生由300碱基对组成的扩增产物组成。所述引物序列基于氨基酸序列NEVTGLG(SEQID No：17)和GAINEIE(SEQ ID No：18)，已经发现它们在几种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌和流感嗜血菌的tbpA基因中推导出的氨基酸序列中是保守的。将扩增产物克隆到pCRII(Invitrogen，San Diego，CA)中并测序。推导出的氨基酸序列与得自脑膜炎奈瑟氏球菌和流感嗜血菌tbpA基因的其它假定氨基酸序列享有同源性(图12)。用NotI(New EnglandBiolabs)将该亚克隆线性化，并用洋地黄毒苷随机标记试剂盒(Boehringer Mannheim)，按照厂商的说明进行标记。该探针的浓度估计为2ng/μl。
来自该噬菌体克隆的DNA用HindIII、AvrII、SalI/SphI或SalI/AvrII消化，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳。用LKB VacuGene XL真空转移装置(Pharmacia)将DNA转移至尼龙膜(Genescreen Plus，Dupont)上。转移后，将该印迹风干，在含5×SSC-0.1％N-月桂酰肌氨酸-0.02％十二烷基磺酸钠-1.0％封闭试剂(Boehringer Mannheim)的10mM马来酸-15mM NaCl(pH7.5)(预杂交缓冲液)中预杂交。将标记的探针加入预杂交缓冲液中，使其终浓度为6ng/ml，该印迹在该探针溶液中于42℃温育18小时。该印迹于室温下在2×SSC-0.1％SDS中洗涤2次，每次5分钟，然后在0.1×SSC-0.1％SDS中于60℃洗涤2次，每次15分钟。洗涤后，该膜在100mM马来酸-150mM NaCl(pH7.5)(缓冲液1)中平衡1分钟，然后于室温下置于含1.0％封闭试剂(Boehringer Mannheim)的缓冲液1(缓冲液2)中60分钟。于室温下将该印迹暴露于在缓冲液2中稀释1/5000的抗DIG-碱性磷酸酶(BoehringerMannheim)30分钟。在缓冲液1中洗涤2次15分钟后，该印迹于100mMTris-HCl(pH9.5)、100mM NaCl、50mM MgCl2(缓冲液3)中平衡2分钟。用在缓冲液3中稀释1/100的Lumigen PPD底物(BoehringerMannheim)润湿该印迹，然后包封于Saran包封物中，对X光胶片曝光30分钟。该探针与3.8kb HindIII-HindIII、2.0 kbAvrII-AvrII和4.2kbSalI-SphI片段杂交。
为了将3.8kb HindIII-HindIII片段亚克隆到pACYC177中，将来自EMBL3克隆的噬菌体DNA和来自载体pACYC177(New EnglandBiolabs)的质粒DNA用HindIII消化，并在0.8％琼脂糖凝胶电泳上分级分离。从该凝胶上切下3.8kb HindIII-HindIII噬菌体DNA片段和3.9kb HindIII-HindIII pACYC177片段，并用Geneclean试剂盒(Bio 101 Inc.，LaJolla，CA)按照厂商的说明纯化。纯化的插入片段和载体用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)连接起来，并转化入大肠杆菌HB101(Gibco BRL)中。用Qiagen Plamid Midi-Kit(Qiagen)从其中一种氨苄青霉素抗性/卡那霉素敏感型转化体中抽提和纯化测序量的DNA，发现它携带3.8kb HindIII-HindIII插入片段。该亚克隆命名为pLEM3。如以下实施例7中所述，随后的测序揭示：pLEM3含有第一个大约2.0kb tbpA序列(图2和图5)。
为了亚克隆tblA基因的其余1kb，将1.6 kbHindIII-HidIII片段如上所述亚克隆到pACYC177中，并通过电穿孔转化入大肠杆菌HB101(Gibco BRL)中。用Midi-Plasmid DNA试剂盒(Qiagen)从假定携带具1.6kb HindIII-HindIII插入片段的质粒的卡那霉素敏感型转化体抽提质粒DNA。该亚克隆命名为pLEM25。正如以下实施例7中所述，序列分析揭示pLEM25含有tbpA基因的其余1kb(图2和图5)。实施例7
该实施例说明卡他莫拉菌4223 tbpB基因的亚克隆。
如上所述，在本发明之前检测的所有奈瑟氏球菌和嗜血菌种中，已经发现bpB基因恰好在与卡他莫拉菌4223tbpA基因具同源性的tbpA基因的上游。然而，卡他莫拉菌4223的上游序列与其它编码tbpB的序列不一致。
为了在EMBL3噬菌体克隆中定位tbpB基因，用来自Tbp2蛋白内高度保守的氨基酸区的简并探针进行Southern印迹。设计相应于编码EGGFYGP序列(SEQ ID No：30)的简并寡核苷酸探针，该序列在多种奈瑟氏球菌和嗜血菌种中的Tbp2蛋白中是保守的。用寡核苷酸加尾试剂盒(Boehringer Mannheim)，按照厂商的说明将该探针用洋地黄毒苷标记。HindIII消化的EMBL3克隆DNA通过0.8％琼脂糖凝胶分级分离，如实施例6所述转移至Geneclean Plus尼龙膜上。如上所述进行杂交后，该膜在2×SSC-0.1％SDS中于室温下洗涤2次，每次5分钟，然后于50℃下在0.1×SC-0.1％SDS中洗涤2次，每次15分钟。如上所述进行标记探针的检测。该探针与5.5kb NheI-SalI片段杂交。
将该5.5kb NheI-SalI片段如下亚克隆到pBR328中。LEM3-24DNA和pBR328 DNA用NheI-SalI消化，通过0.8％琼脂糖电泳。从该凝胶中切下5.5kb NheI-SalI片段和4.9kb pBR328的NheI-SalI片段，用Geneclean试剂盒如实施例6所述进行纯化。用T4 DNA连接酶将所述片段连接在一起，并转化入大肠杆菌DH5中。用Midi-Plasmid DNA试剂盒(Qiagen)从含有5.5kb Nhei-SalI插入片段的氨苄青霉素抗性/四环素敏感型克隆中抽提DNA。该亚克隆命名为pLEM23。序列分析揭示：pLEM23含有来自卡他莫拉菌4223的2kb tbpB基因(图2)。实施例8
该实施例说明卡他莫拉菌Q8 tfr基因的亚克隆。
如下亚克隆卡他莫拉菌Q8的tfr基因。由平板制备噬菌体DNA。简单地说，将来自三个铺满平板的上层琼脂糖刮入9ml SM缓冲液(0.1M NaCl、0.2％MgSO4、50mM Tris-HCl，pH7.6、0.01％明胶)中，加入100μl氯仿。将该混合物涡旋混合10秒，然后于室温下温育2小时。在SS34转子(Sorvall RCSC型)中于4℃以8000rpm离心15分钟除去细胞碎片。于10℃，在70.1 Ti转子(Beckman L8-80型)中以35,000rpm离心2小时沉淀噬菌体，将其重悬浮于500μl SM缓冲液中。该样品于4℃温育过夜，然后加入终浓度分别为40μg/ml和10μg/ml的RNA酶和DNA酶，该混合物于37℃温育1小时。向该混合物中加入10μl 0.5M EDTA和5μl 10％SDS，该样品于6℃温育15分钟。该混合物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提两次，用氯仿抽提两次，然后加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA。
产生部分限制性图谱，用图4所示的来自EMBL3的外部SalI位点和内部AvrII或EcoRI位点将所述片段亚克隆。为了便于亚克隆，构建在pBluescript.SK(Strategene)中导入新多克隆位点的质粒pSKMA。用寡核苷酸在pBluescript.SK的SalI和HindIII位点之间导入MstII、SfiI和AvrII限制性位点。
                               Sfi  I
         Sal I       Cla I     Mst II   Avr II  HindIII
          ↓          ↓       ↓   ↓   ↓     ↓
4639-RD  5′TCGACGGTAT CGATGGCC TTAG GGGC CTAGGA 3′
(SEQ ID No：34)
4640-RD  3′GCCATA GCTACCGG AATC CCCG GATCCTTCGA
(SEQ ID No：35)
质粒pSLRD1含有克隆入pSKMA中的～1.5kb SalI-AvrII片段；质粒pSLRD2和pSLRD4分别含有克隆入pSKMA中的～2kb和4kbAvrII-AvrII片段，并含有完整的tbpA基因。质粒pSLRD3含克隆入pSKMA中的～2.3kb AvrII-EcoRI片段，而质粒pSLRD5为克隆入pSKMA中的22.7kbEcoRI-EcoRI片段。这两个克隆都含有完整的tbpB基因(图7)。实施例9
该实施例说明卡他莫拉菌tbpB基因的序列分析。
用Applied Biosystems DNA测序仪对按照实施例6-8亚克隆的tbpB基因的两条链进行测序。卡他莫拉菌4223和Q8的tbpA基因的序列分别示于图5和图10中。得出的氨基酸序列与包括脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌和流感嗜血菌在内的其它tTbp1氨基酸序列比较(图12)。卡他莫拉菌4223和Q8的tbpB基因的序列分别示于图6和图11中。为了得到来自卡他莫拉菌4223的tbpB基因的假定起始点的序列，直接从克隆LEM3-24 DNA获得序列数据。该序列通过筛选克隆DS-1754-1证实。卡他莫拉菌4223和Q8翻译的tbpB基因的序列与脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌和流感嗜血菌的推导的Tbp2氨基酸序列享有同源性(图13)。实施例10
该实施例说明制备生产重组Tbp1蛋白的表达载体。构建流程示于图14中。
如实施例6所述制备的亚克隆pLEM3的质粒DNA用HindIII和BglI消化，产生1.84kb BglI-HindIII片段，它含有大约2/3的该tbpA基因。向消化物中加入BamHI，以消除共迁移的1.89kb BglI-HindIII载体片段。另外，用NdeI和HindIII消化载体pT7-7的质粒DNA。为了产生tbpA基因的起点，在tbpA基因至BglI位点的前61个碱基的基础上合成寡核苷酸；将NdeI位点加入5’端。用T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)将纯化的插入片段、载体和寡核苷酸连接在一起，并转化入大肠杆菌DH5α中。从其中一个含正确限制性位点的4.4kb氨苄青霉素抗性的转化体(pLEM27)中纯化DNA。
纯化的pLEM27 DNA用HindIII消化，与实施例6制备的pLEM25的1.6kb HindIII-HindIII插入片段连接，并转化入大肠杆菌DH5α中。从含有所述正确限制性位点的氨苄青霉素抗性转化体(pLEM29)中纯化DNA，并通过电穿孔转化入BL21(DE3)(Novagen；Madison，WI)中，以产生大肠杆菌pLEM29B-1。
用单个分离的转化菌落接种含有100μg/ml氨苄青霉素的100mlYT液体培养基，让该培养物于37℃以200rpm震荡生长过夜。将200μl该过夜培养物接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的10ml YT液体培养基中，使该培养物于37℃生长至OD578为0.35。加入30μl 100mM IPTG诱导该培养物，该培养物于37℃再生长3小时。在诱导时(t＝0)和t＝1小时和t＝3小时时取出1ml培养物。离心沉淀1ml样品，将其重悬浮于4％SDS-20mM Tris-HCl，pH8-200μM EDTA(裂解缓冲液)中。样品在11.5％SDS-PAGE凝胶上分级分离，并转移至Immbilon滤膜(Amersham)上。印迹用1∶1000稀释的抗Tbp1(卡他莫拉菌4223)抗血清作为第一抗体和结合辣根过氧化物酶的重组G蛋白(rProteinG)(Zymed)作为第二抗体显色。化学发光底物(Lumiglo；Kirkegaard andPerry Laboratories，Gaithersburg，MD)用于检测。诱导的重组蛋白在考马斯亮蓝染色的凝胶上可见(图15)。该抗Tbp1(4223)抗血清识别Western印迹上的重组蛋白。实施例11
该实施例说明卡他莫拉菌4223的重组Tbp1的提取和纯化。
通过图16所示的方法，从表达该tbpA基因的大肠杆菌细胞(实施例10)中纯化包涵体中含有的重组Tbp1蛋白。来自如实施例10中所述制备的500ml培养物的大肠杆菌细胞重悬浮于含有0.1M NaCl和5mM AEBSF(蛋白酶抑制剂)的50ml 50mM Tris-HCl，pH8.0中，通过超声处理(3×10分钟，70％的工作(dugy)循环)破碎细胞。抽提物以20,000×g离心30分钟，弃去产生的含有＞85％可溶性大肠杆菌蛋白的上清液。
余下的沉淀(图6，PPT1)进一步在含有0.5％Triton X-100和10mM EDTA的50ml 50mM Tris，pH8.0中抽提。以20,000×g离心30分钟后，弃去含有残留可溶性蛋白和大多数膜蛋白的上清液。
余下的沉淀(图16，PPT2)进一步在含有2M尿素和5mM二硫苏糖醇(DTT)的50ml50mM Tris，pH8.0中抽提。以20,000×g离心30分钟后，在上述抽提后获得的产生的沉淀(图16，PPT3)含有所述纯化的包涵体。
在含有6M盐酸胍和5mM DTT的50mM Tris，pH8.0中从PPT3溶解该Tbp1蛋白。离心后，产生的上清液进一步在Superdex 200凝胶过滤柱中纯化，该柱在含有2M盐酸胍和5mM DTT的50mM Tris，pH8.0中平衡。通过SDS-PAGE分析收集的部分，合并含有纯化的Tbp1的部分。向合并的Tbp1部分中加入终浓度为0.1％的Triton X-100。然后将收集部分于4℃对50mM Tris，pH8.0过夜透析，然后以20,000×g离心30分钟。在这些条件下该蛋白保持可溶性，将纯化的Tbp1贮存于-20℃。图16所示的纯化方法产生通过SDS-PAGE分析测定至少纯度为70％的Tbp1蛋白(图17)。实施例12
该实施例说明用于卡他莫拉菌4223无前导序列的rTbp2的表达质粒的构建。
用于表达rTbp2的质粒的构建流程示于图18。用寡核苷酸构建编码成熟蛋白的卡他莫拉菌4223 tbpB基因的大约前58bp。将一个NdeI位点加入所述寡核苷酸的5’端：
5′TATGTGTGGTGGCAGTGGTGGTTCAAATCCACCTGCTCCTACGCCCATTCCAAATG(SEQ ID NO：36)3′
3′ACACACCACCGTCACCACCAAGTTTAGGTGGACGAGGATGCGGGTAAGGTTTACGATC(SEQ ID NO：37)5′
将如实施例7所述制备的含有大约1kb来自pLEM23的tbpB基因的NdeI-ClaI片段与以上寡核苷酸连接，并插入用NdeI-ClaI切割的pT7-7中，产生pLEM31，它由此含有tbpB的5’一半。也用寡核苷酸构建从tbpB基因AvaII位点至该基因末端的最后大约104bp。将一个BamHI位点加入所述寡核苷酸的3’端：
5′GTCCAAATGCAAACGAGATGGGCGGGTCATTTACACACAACGCCGATGACAGCAAAGCCTCTGTGGTCTTTGGCACAAAAAGACAACAAGAAGTTAAGTAGTAG(SEQ ID NO：38)3′
3′GTTTACGTTTGCTCTACCCGCCCAGTAAATGTGTGTTGCGGCTACTGTCGTTTCGGAGACACCAGAAACCGTGTTTTTCTGTTGTTCTTCAATTCATCATCCTAG(SEQ ID NO：39)5′
将来自pLEM23、含有该tbpB基因3’端的大约0.9kb的ClaI-AvaII片段与AvaII-BamHI寡核苷酸连接，并插入用CalI-BamHI切割的pT7-7中，产生pLEM32。然后将来自pLEM31的1.0kb NdeI-CalI插入片段和来自pLEM32的1.0kb CalI-BamHI插入片段插入用NdeI-BamHI切割的pT7-7中，产生具有在T7启动子指导下的全长tbpB基因的pLEM33。
从pLEM33纯化DNA，并通过电穿孔转化入电感受态(electrocompetent)BL21(DE3)细胞(Novagen；Madison，WI)，产生菌株pLEM33B-1。让菌株pLEM33B-1生长，并如实施例10中所述用IPTG进行诱导。表达的蛋白通过SDS-PAGE分辨，并将其转移至适于免疫印迹的膜上。印迹用1∶4000稀释的抗4223 Tbp2抗血清作为第一抗体和结合辣根过氧化物酶的重组G蛋白(Zymed)作为第二抗体进行显色。化学发光底物(Lmiglo；Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaitherburg，MD)用于检测。诱导的重组蛋白在考马斯亮蓝染色的凝胶上可见(图19)。该抗4223 Tbp2抗血清识别Western印迹上的所述重组蛋白。实施例13
该实施例说明用于具有前导序列的卡他莫拉菌4223的rTbp2的表达载体的产生。
构建流程示于图18中。含有卡他莫拉菌4223 tbpB基因的天然前导序列的寡核苷酸用来构建该tbpB基因至NdeI位点的大约前115bp。将一个NdeI位点加入所述寡核苷酸的5’端：
5′TATGAAACACATTCCTTTAACCACACTGTGTGTGGCAATCTCTGCCGTCTTATTAACCGCTTGTGGTGGCAGTGGTGGTTCAAATCCACCTGCTCCTACGCCCATTCCAAATG(SEQ ID NO：40)3′
3′ACTTTGTGTAAGGAAATTGGTGTGACACACACCGTTAGAGACGGCAGAATAATTGGCGAACACCACCGTCACCACCAAGTTTAGGTGGACGAGGATGCGGGTAAGGTTTACGATC(SEQ ID NO：41)5′
将NdeI-NheI寡核苷酸与用NdeI-NheI切割的pLEM33连接，产生pLEM37，它由此含有具有其前导序列、由T7启动子驱动的编码Tbp2蛋白的全长4223tbpB基因。
从pLEM37纯化DNA，并通过电穿孔转化入电感受态BL21(DE3)细胞(Novagen；Madison，WI)，产生菌株pLEM38B-2。让菌株pLEM37B-2生长，并如实施例10中所述用IPTG进行诱导。表达的蛋白通过SDS-PAGE分辨，并将其转移至适于免疫印迹的膜上。印迹用1∶4000稀释的抗4223 Tbp2抗血清作为第一抗体和结合辣根过氧化物酶的重组G蛋白(Zymed)作为第二抗体进行显色。化学发光底物(Lumiglo；Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaitherburg，MD)用于检测。诱导的重组蛋白在考马斯亮蓝染色的凝胶上可见(图21)。该抗4223Tbp2抗血清识别Western印迹上的所述重组蛋白。实施例14
该实施例说明用于卡他莫拉菌Q8无前导序列的rTbp2的表达质粒的构建。
用于rTbp2的构建流程示于图20。从该成熟蛋白的Cys1密码子通过BsmI限制性位点PCR扩增卡他莫拉菌Q8 tbpB基因的5’端。将一个Nde I限制性位点导入5’端用于以后克隆入pT7-7，最终的PCR片段长度为238bp。所述PCR引物示于以下：
       NdeI    C   G   G   S   S   G   G   F   N5′GAATTC CATATG TGT GGT GGG AGC TCT GGT GGT TTC AAT C
 3′5247.RD(SEQ ID No：42)5′CCCATGGCAGGTTCTTGAATGCCTGAAACT     3′5236.RD(SEQ ID No：43).
将Q8 tbpB基因亚克隆到如实施例8所述制备的质粒SLRS3和SLRD5上含有的两个片段中。通过用EcoR I和Dra I消化SLRD5释放tbpB的3’端并将该～619bp片段插入已经用EcoR I和Sma I消化的SLRD3中，构建质粒SLRD3-5使其含有全长的tbpB基因。将来自LSRD3-5的1.85kb Bsm I-BamH I片段与238bp的PCR片段连接，并插入已经用Nde I和BamH I消化的pT7-7中，产生质粒SLRD35B。该质粒由此含有在T7启动子指导下的无其前导序列的全长tbpB基因。纯化来自LSRD35B的DNA，并通过电穿孔转化入电感受态BL21(DE3)细胞，产生菌株SLRD35BD，如实施例10所述让其生长并用IPTG诱导。表达的蛋白通过SDS-PAGE分辨，诱导的Tbp2蛋白通过考马斯亮蓝染色清楚可见(图19)。实施例15
该实施例说明具有前导序列的卡他莫拉菌Q8的rTbp2的表达质粒的产生。
rTbp2的构建流程示于图20中。从ATG起始密码子至Bsm I限制性位点PCR扩增Q8 tbpB基因的5’端。在5’端工程改造一个Nde I位点，以便于克隆入pT7-7表达载体，最终的PCR片段为295bp。所述PCR引物示于下面：
       NdeI     K   H   I   P   L   T5′GAATTC CATATG AAA CAC ATT CCT TTA ACC 3′5235.RD(SEQ ID No：44)5′CCCATGGCAGGTTCTTGAATGCCTGAAACT       3′5236.RD(SEQ ID No：43).
SLRD3-5(实施例14)用Bsm I和BamHI消化，产生1.85kb片段，将其与295bp的PCR片段连接，并连接到已经用NdeI和BamH I消化的pT7-7中。产生的质粒SLRD35A由此含有在T7启动子控制下的具有其内源前导序列的全长Q8 tbpB基因。纯化来自SLRD35A的DNA，并通过电穿孔转化入电感受态BL21(DE3)细胞中，产生菌株SLRD35AD，如实施例10所述让其生长并用IPTG诱导。表达的蛋白通过SDS-PAGE分辨，诱导的Tbp2蛋白通过考马斯亮蓝染色清楚可见(图19)。实施例16
该实施例说明从大肠杆菌提取和纯化卡他莫拉菌4223和Q8的rTbp2。
让pLEM37B(4223)和SLRD35AD(Q8)转化体生长，以产生在包涵体中的Tbp2，然后按照图22的流程纯化该Tbp2。将来自500ml培养物的大肠杆菌细胞重悬浮于含有5mM AEBSF(蛋白酶抑制剂)的50ml 50mM Tris-HCl，pH8.0中，通过超声处理(3×10分钟，70％的工作循环)破碎细胞。抽提物以20,000×g离心30分钟，弃去产生的含有＞95％可溶性大肠杆菌蛋白的上清液。
余下的沉淀(PPT1)进一步在含有0.5％Triton X-100和10mMEDTA的50ml 50mM Tris，pH8.0中抽提。将该混合物于4℃搅拌至少2小时，然后以20,000×g离心30分钟，弃去含有残留可溶性蛋白和大多数膜蛋白的上清液。
在上述抽提后获得的余下的沉淀(PPT2)含有所述包涵体。在含有6M胍和5mM DTT的50mM Tris，pH8.0中溶解该Tbp2蛋白。离心后，产生的上清液进一步在Superdex 200凝胶过滤柱中纯化，该柱在含有2M胍和5mM DTT的50mM Tris，pH8.0中平衡。通过SDS-PAGE分析收集的部分，合并含有纯化的Tbp2的部分。向合并的Tbp2部分中加入终浓度为0.1％的Triton X-100。然后将收集部分于4℃对PBS过夜透析，然后以20,000×g离心30分钟。在这些条件下该蛋白保持可溶性，将纯化的Tbp2贮存于-20℃。图22显示菌株4223(板A)和菌株Q8(板B)的rTbp2的纯化方法的收集部分的SDS PAGE分析。该rTbp2蛋白的纯度至少为70％。
在第1天、第29天和第43天给5只一组的BALB/c小鼠皮下注射(s.c.)三次在存在和缺乏AlPO4(1.5mg/剂量)的纯化卡他莫拉菌4223和Q8的rTbp2(0.3-10mg)。第14、28、42和56天时取血样，用于通过EIA分析抗rTbp2抗体的效价。
在第1天给2只一组的兔子和2只一组的豚鼠(Charles River，Quebec)肌内免疫(i.m.)5mg剂量的在弗氏完全佐剂(CFA)中乳化的纯化rTbp2蛋白。在第14天和第29天时，用同样剂量的在弗氏不完全佐剂(IFA)中乳化的蛋白加强动物。第42天时取血样用于分析抗rTbp2抗体效价和抗菌活性。以下表2表明针对按这些实施例中所述制备的重组运铁蛋白结合蛋白rTbp1(4223)、rTbp2(4223)和rTbp2(Q8)产生的抗体对卡他莫拉菌4223和Q8的杀菌活性。实施例17
该实施例说明Tbp2与人运铁蛋白的体外结合。
按照Schryvers和Lee(参考文献28)的并加以修饰的方法评价Tbp2的运铁蛋白结合活性。简单地说，纯化的rTbp2经过12.5％SDS-PAGE的不连续电泳。将所述蛋白电泳转移至PVDF膜上，与结合辣根过氧化物酶的人运铁蛋白(HRP-人运铁蛋白，1∶50稀释液)(Jackson ImmunoResearch Labs Inc.，Mississauga，Ontario)于4℃温育过夜。按照厂商的说明，用LumiGLO底物(Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)进行HRP活性的化学发光检测。如图24所示，在这些条件下4223 rTbp2和Q8 rTbp2都与人运铁蛋白结合。实施例18
该实施例说明在卡他莫拉菌菌株中Tbp2抗原的保守性。
将卡他莫拉菌菌株和表达重组Tbp2蛋白的大肠杆菌菌株的全细胞裂解液通过SDS-PAGE进行分离，并电泳转移至PVDF膜上。将豚鼠抗4223 rTbp2或抗Q8 rTbp2抗血清用作第一抗体，结合碱性磷酸酶的山羊抗豚鼠抗体用作第二抗体检测Tbp2。测试卡他莫拉菌菌株3、56、135、585、4223、5191、8185和ATCC25240，所有都表现出与抗4223 rTbp2或抗Q8 rTbp2抗体的特异性反应性(图25)。
表3说明来自一种卡他莫拉菌菌株的抗rTbp2抗体识别来自同源或异源卡他莫拉菌菌株的天然蛋白或重组蛋白的能力。实施例19
该实施例说明来自卡他莫拉菌R1株的tbpB基因的PCR扩增和扩增的R1 tbpB基因的特征鉴定。
用标准技术制备来自卡他莫拉菌R1株的染色体DNA。该寡核苷酸有义引物的设计基于卡他莫拉菌4223 tbpB基因上游的大约274碱基的区域，该反义引物基于4223 tbpB末端下游的大约11碱基的区域。使用以下引物：
有义引物(4940)：5′GATATAAGCACGCCCTACTT    3′(SEQ ID No：48)
反义引物(4967)：5′CCCATCAGCCAAACAAACATTGTGT 3′(SEQ ID No：49).
每个反应管含有总体积为100μl的10mM Tris-HCl(pH8.85)、25mM KCl、5mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、800mM dNTPs、引物4940和4967各1.0mg、10ng R1 DNA和2.5 U Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)。将热循环仪编程为于95℃5分钟，然后是于95℃30秒、于50℃45秒和于72℃2分钟的25个循环和最后于72℃的延伸。用Geneclean(BIO 101)按照厂商的说明纯化扩增的产物并测序。
图26显示正如刚才所述制备的卡他莫拉菌R1株tbpB的部分限制性图谱。PCR扩增的R1 tbpB基因的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列示于图27中。该R1 tbpB基因编码分子量为76.8kDa的714个氨基酸的蛋白。R1 Tbp2蛋白的前导序列与4223和Q8 Tbp2蛋白的前导序列相同。当将推导出的R1 Tbp2序列与4223 Tbp2序列对准时，发现83％相同，同源性为88％(图28)。如从其它卡他莫拉菌菌株的Tbp2以及流感嗜血菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的Tbp2蛋白中发现的一样，存在保守的LEGGFYG(SEQ ID No：50)表位。
                     本说明书概述
本说明书总起来说，本发明提供含有卡他莫拉菌运铁蛋白受体基因的纯化和分离的DNA分子、这些运铁蛋白受体基因的序列和得出的氨基酸序列。所述基因和DNA序列可用于诊断、免疫和产生诊断和免疫性试剂。可以制备包括疫苗在内的基于表达的重组Tbp1和/或Tbp2、其部分或其类似物的免疫原性组合物，以预防莫拉菌属引起的疾病。修改可能在本发明范围内。
                                     表1
                       抗菌抗体对卡他莫拉菌抗原的效价
  抗原1   抗血清来源2            杀菌效价3RH 084            杀菌效价Q85
  免疫前       免疫后   免疫前      免疫后
  TBP1     GP   ＜3.0      4.2-6.9    ＜3.0      4.4-6.2
  TBP2     GP   ＜3.0      12.0-13.6    ＜3.0     ＜3.0-4.0
1从卡他莫拉菌4223分离的抗原2GP＝豚鼠3杀菌效价：以能够杀死50％细胞的抗血清的稀释度的log2表示4卡他莫拉菌RH408为卡他莫拉菌4223的非凝集衍生物5卡他莫拉菌Q8为表现出非凝集表型的一种临床分离株
                                        表2
    杀菌效价-RH408             杀菌效价-Q8
    抗原    免疫前    免疫后     免疫前     免疫后
  rTBp1(4223)     ＜3.0     ＜3.0     ＜3.0     ＜3.0
  rTBp2(4223)     ＜3.0     10-15     ＜3.0     ＜3.0
  rTBp2(Q8)     NT     NT     ＜3.0     5.5-7.5
杀菌效价以能够杀死50％细胞的抗血清的稀释度的log2表示
                               NT＝未测试
                                         表3
抗rTbp2抗体识别菌株4223的天然或rTbp2或菌株Q8的rTbp2的ELISA效价
  包被抗原     抗rTbp2(4223)抗体效价          抗rTbp2(Q8)抗体效价
   兔抗血清     豚鼠抗血清     兔抗血清     豚鼠抗血清
  天然Tbp2(4223)    409,600204,800     1,638,4001,638,400     25,60025,600     51,200102,400
  rTbp2(4223)    409,600409,600     1,638,4001,638,400     102,400102,400     204,800204,800
  rTbp2(Q8)    409,600102,400     1,638,4001,638,400     1,638,400409,600     1,638,4001,638,400
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Claims (26)

1.纯化和分离的核酸分子，它编码莫拉菌属菌株的运铁蛋白受体蛋白或该运铁蛋白受体蛋白的免疫原性片段。
2.权利要求1中要求保护的核酸分子，其特征在于，该运铁蛋白受体蛋白为莫拉菌属菌株的运铁蛋白受体结合蛋白1。
3.权利要求1中要求保护的核酸分子，其特征在于，该运铁蛋白受体蛋白为莫拉菌属菌株的运铁蛋白受体结合蛋白2。
4.权利要求1-3的任一项中要求保护的核酸分子，其特征在于，所述莫拉菌属菌株为卡他莫拉菌菌株。
5.权利要求4中要求保护的核酸分子，其特征在于，所述卡他莫拉菌菌株为卡他莫拉菌4223、Q8或R1。
6.权利要求1-3的任一项中要求保护的核酸分子，它具有选自以下的DNA序列：
(a)图5、6、10、11或27中给出的DNA序列SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、45或46或其互补DNA序列；
(b)编码图5、6、10、11或27中给出的氨基酸序列的DNA序列SEQ ID No：9、10、11、12、13、14、15、16或47或其互补DNA序列；以及
(c)编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白、在严格条件下与(a)或(b)中定义的DNA序列中的任一个杂交的DNA序列。
7.权利要求6中要求保护的核酸分子，其特征在于，(c)中定义的DNA序列与(a)或(b)中定义的DNA序列中的任一个至少有90％的序列相同性。
8.权利要求6中要求保护的核酸分子，其特征在于，(c)中定义的DNA序列为编码卡他莫拉菌另一菌株的相同运铁蛋白受体蛋白的DNA序列。
9.载体，含有权利要求1中要求保护的核酸分子，适用于转化宿主。
10.载体，含有权利要求2-8的任一项中要求保护的核酸分子，适用于转化宿主。
11.权利要求9或10中要求保护的载体，其特征在于所述核酸分子编码运铁蛋白受体蛋白的片段，并具有选自以下质粒的特征：pLEM3、pLEM25、pLEM23、DS-1698-1-1、DS-1754-1、pSLRD2、pSLRD3、pSLRD4和pSLRD5。
12.权利要求9或10中要求保护的载体，其特征在于操作性偶联到用于表达的核酸分子上的表达工具，所述用于表达的核酸分子用于所述宿主表达莫拉菌属菌株的所述运铁蛋白受体蛋白或该运铁蛋白受体蛋白的片段。
13.权利要求12中要求保护的载体，具有选自pLEM-29、pLEM-33、pLEM-37、SLRD35-A和SLRD35-B的质粒的特征。
14.含有权利要求12中要求保护的表达载体的转化宿主细胞。
15.含有权利要求13中要求保护的表达载体的转化宿主细胞。
16.生成大致纯的莫拉菌属菌株的重组运铁蛋白受体蛋白或其免疫原性片段的方法，其特征在于：
让权利要求14或15的转化宿主细胞生长，以表达作为包涵体的运铁蛋白受体蛋白或其免疫原性片段，
纯化不含细胞材料和可溶性蛋白的所述包涵体，
从所述纯化的包涵体中溶解运铁蛋白受体蛋白或其免疫原性片段，以及
纯化不含其它溶解的材料的运铁蛋白受体蛋白或其免疫原性片段。
17.权利要求16中要求保护的方法，其特征在于，所述运铁蛋白受体蛋白是Tbp1、Tbp2或Tbp1和Tbp2的混合物。
18.权利要求16中要求保护的方法，其特征在于，所述运铁蛋白受体蛋白的纯度至少为70％。
19.权利要求17中要求保护的方法，其特征在于，所述运铁蛋白受体蛋白的纯度至少为70％。
20.权利要求18或19中要求保护的方法，其特征在于，所述运铁蛋白受体蛋白的纯度至少为90％。
21.一种重组的运铁蛋白受体蛋白，它为(a)无莫拉菌属菌株其它蛋白的莫拉菌属菌株的运铁蛋白受体结合蛋白1；或(b)无莫拉菌属菌株其它蛋白的莫拉菌属菌株的运铁蛋白受体结合蛋白2；或(a)或(b)的免疫原性片断。
22.免疫原性组合物，其特征在于至少一种选自以下的活性组分：
(A)编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白或该运铁蛋白受体蛋白的片段的纯化和分离的核酸分子；
(B)编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白并具有选自以下DNA序列的纯化和分离的核酸分子：
(a)图5、6、10、11或27中给出的DNA序列SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、45或46或其互补DNA序列；
(b)编码图5、6、10、11或27中给出的氨基酸序列的DNA序列SEQ ID No：9、10、11、12、13、14、15、16或47或其互补DNA序列；以及
(c)编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白、在严格条件下与(a)或(b)中定义的DNA序列中的任一个杂交的DNA序列；以及
(C)可由转化宿主生产的重组运铁蛋白受体蛋白或其片段，该转化宿主含有一表达载体，它包含(A)或(B)中定义的核酸分子和操作性偶联到该核酸分子的用于宿主表达重组运铁蛋白受体蛋白或其片段的表达工具；
以及药学上可接受的载体，所述至少一种活性组分当给与宿主时产生免疫应答。
23.确定样品中存在编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的核酸的方法，其特征在于以下步骤：
(a)将该样品与权利要求1的任一项中要求保护的核酸分子接触，以产生包含该核酸分子和该样品中存在的与其特异性杂交的任一编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的核酸分子的双链体；以及
(b)测定该双链体的产生。
24.确定样品中存在编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的核酸的方法，其特征在于以下步骤：
(a)将该样品与权利要求2-8的任一项中要求保护的核酸分子接触，以产生包含该核酸分子和该样品中存在的与其特异性杂交的任一编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的核酸分子的双链体；以及
(b)测定该双链体的产生。
25.确定样品中存在编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的核酸的诊断试剂盒，其特征在于：
(a)权利要求1中要求保护的核酸分子；
(b)用于将该核酸分子与样品接触以产生双链体的装置，所述双链体包含该核酸分子和该样品中存在的与其杂交的任一核酸分子；以及
(c)用于测定双链体产生的装置。
26.确定样品中存在编码莫拉菌属菌株运铁蛋白受体蛋白的核酸的诊断试剂盒，其特征在于：
(a)权利要求2-8的任一项中要求保护的核酸分子；
(b)用于将该核酸分子与样品接触以产生双链体的装置，所述双链体包含该核酸分子和该样品中存在的与其杂交的任一核酸分子；以及
(c)用于测定双链体产生的装置。
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