ES2285730T3

ES2285730T3 - Genes receptores de transferrina de moraxella.

Info

Publication number: ES2285730T3
Application number: ES97904969T
Authority: ES
Inventors: Lisa E. Myers; Anthony B. Schryvers; Robin E. Harkness; Sheena M. Loosmore; Run-Pan Du; Yan-Ping Yang; Michel H. Klein
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2017-03-07
Also published as: PT885300E; RU2235128C2; US6437096B1; AU1865397A; DE69737682T2; ATE361362T1; BR9710435A; EP0885300B9; CN1128876C; DK0885300T3; EP1777293A1; AU722681B2; WO1997032980A1; EP0885300B1; CA2248095A1; NZ331777A; US6090576A; CN1217748A; JP2000503855A; DE69737682D1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico purificada y aislada que codifica una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella.

Description

Genes receptores de transferrina de Moraxella.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la clonación molecular de genes que codifican proteínas receptoras de transferrina (TfR) y en particular a la clonación de genes receptores de transferrina de Moraxella (Branhamella) catarrhalis.

Antecedentes de la invención

Las bacterias Moraxella (Branhamella) catarrhalis son patógenos diplocócicos Gram-negativos que son transportados asintomáticamente en el tracto respiratorio humano sano. En los últimos años, se ha reconocido M. catarrhalis como causante importante de la otitis media. Adicionalmente, M. catarrhalis ha sido asociada con sinusitis, conjuntivitis, e infecciones urogenitales, así como con cierto número de enfermedades inflamatorias del tracto respiratorio inferior en niños y adultos, con inclusión de neumonía, bronquitis crónica, traqueítis, y enfisema (refs. 1 a 8). (A lo largo de esta solicitud, se citan diversas referencias entre paréntesis (para describir más plenamente el estado de la técnica a la que se refiere esta invención. Inflamación bibliográfica completa para cada cita se encuentra al final de la memoria descriptiva, inmediatamente antes de las reivindicaciones. Ocasionalmente, M. catarrhalis actúa como agente invasivo causante de septicemia, artritis, endocarditis, y meningitis (refs. 9 a 13).

La otitis media es una de las enfermedades más comunes de la primera infancia y aproximadamente 80% de todos los niños sufren al menos una infección en el oído medio antes de alcanzar la edad de 3 años (ref. 14). La otitis media crónica ha sido asociada con deterioro auditivo y del habla en los niños, y en algunos casos, ha estado asociada con discapacidades de aprendizaje. Los tratamientos convencionales para la otitis media incluyen la administración de antibióticos y procedimientos quirúrgicos, con inclusión de tonsilectomías, adenoidectomías, y timpanocentesis. En los Estados Unidos, se estima que los costes de tratamiento por la otitis media están comprendidos entre 1000 y 2000 millones de dólares al año.

En los casos de otitis media, M. catarrhalis se aísla por lo general conjuntamente del fluido del oído medio junto con Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae no tipificable, que se cree son responsables del 50% y 30% de las infecciones de otitis media, respectivamente. Se cree que M. catarrhalis es responsable de aproximadamente el 20% de las infecciones de otitis media (ref. 15). Informes epidemiológicos indican que el número de casos de otitis media atribuibles a M. catarrhalis está aumentando, junto con el número de aislados resistentes a antibióticos de M. catarrhalis. Así, antes de 1970, no había sido consignado ningún aislado de M. catarrhalis productor de \beta-lactamasas, pero desde mediados de los años 70, han sido detectados un número creciente de aislados expresantes de \beta-lactamasas. Revisiones recientes sugieren que el 75% de los aislados clínicos producen \beta-lactamasa (ref. 16, 26).

El hierro es un nutriente esencial para el crecimiento de muchas bacterias. Varias especies de bacterias, con inclusión de M. catarrhalis, obtienen hierro del hospedador utilizando proteínas receptoras de transferrina para capturar transferrina. Cierto número de bacterias con inclusión de Neisseria meningitidis (ref. 17), L. gonorrhoeae (ref. 18), Haemophilus influenzae (ref. 19), así como M. catarrhalis (ref. 20), producen proteínas de membrana exterior que fijan específicamente transferrina humana. La expresión de estas proteínas está regulada por la cantidad de hierro en el ambiente.

Las dos proteínas receptoras de transferrina de M. catarrhalis, designadas proteína 1 de fijación de transferrina (Tbp1) y proteína 2 de fijación de transferrina (Tbp2), tienen pesos moleculares de 115 kDa (Tbp1) y aproximadamente 80 a 90 kDa (Tpb2). Al contrario que las proteínas receptoras de transferrina de otras bacterias que tienen afinidad para apotransferrina, los receptores Tpb2 de M. catarrhalis tienen una afinidad preferida para la forma saturada con hierro (es decir; ferri-)transferrina (ref. 21).

La infección por M. catarrhalis puede conducir a una enfermedad grave. Seria ventajoso proporcionar una fuente recombinante de proteínas de fijación de transferrina como antígenos en preparaciones inmunógenas que incluyeran vacunas, vehículos para otros antígenos e inmunógenos y la generación de reactivos de diagnóstico. Los genes codificantes de proteínas de fijación de transferrina y fragmentos de los mismos son particularmente deseables y útiles en la identificación y diagnosis específicas de Moraxella y para inmunización contra enfermedades causadas por M. catarrhalis así como para la generación de reactivos de diagnóstico.

Sumario de la invención

La presente invención está dirigida hacia la provisión de moléculas de ácido nucleico purificadas y aisladas que codifican un receptor de transferrina de una cepa de Moraxella o un fragmento o un análogo de la proteína receptora de transferrina. Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en esta memoria son útiles para la detección específica de cepas de Moraxella y para el diagnóstico de la infección por Moraxella. Las moléculas de ácido nucleico purificadas y aisladas proporcionadas en esta memoria, tal como DNA, son también útiles para expresar los genes tbp por medios de DNA recombinante para proporcionar, de una manera económica proteínas receptoras de transferrina purificadas y aisladas así como subunidades, fragmentos o análogos de las mismas. El receptor de transferrina, subunidades o fragmentos del mismo o análogos del mismo, así como moléculas de ácido nucleico que codifican el mismo y vectores que contienen tales moléculas de ácido nucleico, son útiles en composiciones inmunógenas para vacunación contra enfermedades causadas por Moraxella, el diagnóstico de infección por Moraxella y como instrumentos para la generación de reactivos inmunológicos. Anticuerpos monoclonales o antisueros mono-específicos (anticuerpos) generados contra la proteína receptora de transferrina, producidos de acuerdo con aspectos de la presente invención, son útiles para el diagnóstico de infección por Moraxella, la detección específica de Moraxella (por ejemplo en ensayos in vitro e in vivo) y para el tratamiento de enfermedades causadas por Moraxella.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico purificada y aislada que codifica una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella, más particularmente una cepa de M. catarrhalis, específicamente la cepa de M. catarrhalis 4223, Q8 o R1.

En la realización preferida de la invención, la molécula de ácido nucleico puede codificar únicamente la proteína Tbp1 de la cepa de Moraxella o solamente la proteína Tbp2 de la cepa de Moraxella.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico purificada y aislada que tiene una secuencia de DNA seleccionada del grupo constituido por (a) una secuencia de DNA como se expone en Figura 5, 6, 10, 11 ó 27 (SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45 ó 46) o la secuencia de DNA complementaria a la misma; (b) una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos como la expuesta en Figura 5, 6, 10, 11 ó 27 (SEQ ID Nos: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 47) o la secuencia de DNA complementaria a la misma; y (c) una secuencia de DNA que se hibrida en condiciones severas a una cualquiera de las secuencias de DNA definidas en (a) o (b) y que codifica una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella. La secuencia de DNA definida en (c) tiene con preferencia al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias de DNA definidas en (a) y (b). La secuencia de DNA definida en (c) puede ser aquélla que codifica la proteína receptora de transferrina equivalentes de otra cepa de Moraxella.

En un aspecto adicional, la presente invención incluye un vector adaptado para transformación de un hospedador.

El vector puede estar adaptado para expresión del receptor de transferrina codificado en un hospedador heterólogo u homólogo, en una forma lipidada o no lipidada. De acuerdo con ello, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un vector de expresión adaptado para transformación de un hospedador que comprende una molécula de ácido nucleico como la proporcionada en esta memoria y medios de expresión acoplados operativamente a la molécula de ácido nucleico para expresión por el hospedador de la proteína receptora de transferrina o el fragmento o análogo de la proteína receptora de transferrina. En realizaciones específicas de este aspecto de la invención, la molécula de ácido nucleico puede codificar sustancialmente la totalidad de la proteína receptora de transferrina, solamente la proteína Tbp1, o solamente la proteína Tbp2 de la cepa de Moraxella. Los medios de expresión pueden incluir un promotor y una porción de ácido nucleico que codifica una secuencia conductora para secreción por el hospedador de la proteína receptora de transferrina. Los medios de expresión pueden incluir también una porción de ácido nucleico que codifica una señal de lipidación para expresión por el hospedador de una forma lipidada de la proteína receptora de transferrina. El hospedador puede seleccionarse de, por ejemplo, Escherichia coli, Bordetella, Bacillus, Haemophilus, Moraxella, hongos, levaduras o baculovirus y pueden utilizarse sistemas de expresión del virus Semlike Forest. En una realización particular, el plásmido adaptado para expresión de Tbp1 es pLEM29 y el adaptado para la expresión de Tbp2 es pLEM33. Vectores adicionales incluyen pLEM-37, SLRE35-D y SLRD-35-B.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un hospedador transformado que contiene un vector de expresión como se proporciona en esta memoria. Una proteína receptora de transferrina recombinante de una cepa de Moraxella puede ser producida por el hospedador transformado.

Dicha proteína receptora de transferrina recombinante puede proporcionarse en forma sustancialmente pura de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, que proporciona un método de formación de una proteína receptora de transferrina recombinante sustancialmente pura, que comprende dejar crecer el hospedador transformado proporcionado en esta memoria para expresar una proteína receptora de transferrina como cuerpos de inclusión, purificar los cuerpos de inclusión para dejarlos libres de material celular y proteínas solubles, solubilizar la proteína receptora de transferrina de los cuerpos de inclusión purificados, y purificar la proteína receptora de transferrina exenta de otros materiales solubilizados. La proteína receptora de transferrina recombinante sustancialmente pura puede comprender Tbp1 sola, Tbp2 sola o una mezcla de las mismas. La proteína recombinante tiene por lo general una pureza de al menos aproximadamente 70%, con preferencia al menos aproximadamente 90% de pureza.

La cepa de Moraxella puede ser la cepa M. catarrhalis 4223, la cepa M. catarrhalis Q8 o la cepa M. catarrhalis R1.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunógena que comprende al menos un componente activo seleccionado de al menos una molécula de ácido nucleico como la proporcionada en esta memoria, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo o vector para el mismo. El al menos un componente activo produce una respuesta inmunológica cuando se administra a un hospedador.

Las composiciones inmunógenas proporcionadas en esta memoria pueden formularse como vacunas para administración in vivo a un hospedador. Para dicho propósito, las composiciones pueden formularse como una micropartícula, cápsula, ISCOM o preparación de liposomas. La composición inmunógena puede proporcionarse en combinación con una molécula de direccionamiento para suministro a células específicas del sistema inmunitario o a superficies mucosales. Las composiciones inmunógenas de la invención (con inclusión de vacunas) pueden comprender adicionalmente al menos otro material inmunógeno o inmunoestimulante, y el material inmunoestimulante puede ser al menos un adyuvante o al menos una citoquina. Adyuvantes adecuados para uso en la presente invención incluyen (pero sin carácter limitante) fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, Quil A, derivados y componentes de los mismos, matriz ISCOM, fosfato de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de cinc, un análogo de glicolípidos, un éster octadecílico de un aminoácido, un muramil-dipéptido-polifosfazeno, ISCOPREP, DC-chol, DBA y una lipoproteína. Combinaciones ventajosas de adyuvantes se describen en las solicitudes de patente de los Estados Unidos también en tramitación 6.764.682 y 5.837.250, así como en WO95/34306.

La invención es útil en un método para generar una respuesta inmunitaria en un hospedador, que comprende el paso de administrar a un hospedador sensible, tal como un humano, una cantidad eficaz de la composición inmunógena proporcionada en esta memoria. La respuesta inmunológica puede ser una respuesta inmunológica humoral o mediada por células, y puede proporcionar protección contra enfermedades causadas por Moraxella. Los hospedadores a los cuales puede conferirse protección contra enfermedades incluyen primates, con inclusión de humanos.

En un aspecto adicional, se proporciona un vector vivo para suministro de receptor de transferrina a un hospedador, que comprende un vector que contiene la molécula de ácido nucleico que se ha descrito arriba. El vector puede seleccionarse de Salmonella, BCG, adenovirus, poxvirus, virus vaccinia y poliovirus.

Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en esta memoria son útiles en aplicaciones de diagnóstico. De acuerdo con ello, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para determinar la presencia, en una muestra, de ácido nucleico que codifica una proteína receptora de transferrina de un receptor de Moraxella, que comprende los pasos de:

(a): poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico tal como se proporciona en esta memoria para producir dúplex que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquier molécula de ácido nucleico codificante de la proteína receptora de transferrina en una cepa de Moraxella presente en la muestra e hibridable específicamente con ella; y

(b): determinar la producción de los dúplex.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un kit de diagnóstico para determinar la presencia, en una muestra, de ácido nucleico codificante de una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella, que comprende:

(a): una molécula de ácido nucleico como se proporciona en esta memoria;

(b): medios para poner en contacto la molécula de ácido nucleico con la muestra a fin de producir dúplex que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquier ácido nucleico de este tipo presente en la muestra e hibridable con la molécula de ácido nucleico; y

(c): medios para determinar la producción de los dúplex.

Las moléculas de ácido nucleico y proteínas proporcionadas en esta memoria son útiles como medicamentos y en la fabricación de medicamentos para protección contra la infección por cepas de Moraxella.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se comprenderá mejor a partir de la descripción siguiente con referencia a los dibujos, en los cuales:

La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos (SEQ ID Nos: 17 y 18) de una porción conservada de proteínas Tbp1 utilizadas para la síntesis de iniciadores degenerados empleados para la amplificación por PCR de una porción del gen de M. catarrhalis 4223 tbpA;

la Figura 2 muestra un mapa de restricción del clon LEM3-24 que contiene los genes tbpA y tbpB de un aislado de M. catarrhalis 4223;

la Figura 3 muestra un mapa de restricción del gen tbpA para M. catarrhalis 4223;

la Figura 4 muestra un mapa de restricción del tbpB para M. catarrhalis 4223;

la Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos del gen tbpA (SEQ ID No: 1 - secuencia entera y SEQ ID No: 2 - secuencia codificante) y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Tbp1 de M. catarrhalis 4223 (SEQ ID No: 9 - longitud total y SEQ ID No: 10 - proteína madura). La secuencia conductora (SEQ ID No: 19) se muestra en subrayado;

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la Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos del gen tbpB (SEQ ID No: 3 - secuencia entera y SEQ ID No: 4 - secuencia codificante) y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Tbp2 de M. catarrhalis 4223 (SEQ ID No: 11 - longitud total y SEQ ID No: 12 - proteína madura). La secuencia conductora (SEQ ID No: 20) se muestra en subrayado;

la Figura 7 muestra un mapa de restricción del clon SLRD-A que contiene los genes tbpA y tbpB de M. catarrhalis Q8;

la Figura 8 muestra el mapa de restricción del gen tbpA de M. catarrhalis Q8;

la Figura 9 muestra un mapa de restricción del gen tbpB de M. catarrhalis Q8;

la Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos del gen tbpA (SEQ ID No: 5 - secuencia entera y SEQ ID No: 6 - secuencia codificante) y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Tbp1 de M. catarrhalis Q8 (SEQ ID No: 13 - longitud total y SEQ ID No: 14 - proteína madura);

la Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos del gen tbpB (SEQ ID No: 7 - secuencia entera y SEQ ID No: 8 - secuencia codificante) y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Tbp2 de M. catarrhalis Q8 (SEQ ID No: 15 - longitud total y SEQ ID No: 16 - proteína madura);

la Figura 12 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Tbp1 de la cepa 4223 de M. catarrhalis (SEQ ID No: 9) y Q8 (SEQ ID No: 13), la cepa Eagan de H. influenzae (SEQ ID No: 21), las cepas B16B6 (SEQ ID No: 22) y M982 (SEQ ID No: 23) de N. meningitidis, y la cepa FA19 de N. gonorrhoeae (SEQ ID No: 24). Los puntos indican residuos idénticos y se han insertado guiones para alineación máxima;

la Figura 13 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Tbp2 del aislado 4223 de M. catarrhalis (SEQ ID No: 11) y Q8 (SEQ ID No: 15), la cepa Eagan de H. influenzae (SEQ ID No: 25), las cepas B16B6 (SEQ ID No: 26) y M918 (SEQ ID No: 27) de N. meningitidis, y la cepa FA19 de N. gonorrhoeae (SEQ ID No: 28). Los puntos indican residuos idénticos y se han insertado guiones para alineación máxima;

la Figura 14 muestra la construcción del plásmido pLEM29 para expresión de la proteína recombinante Tbp1 de E. coli;

la Figura 15 muestra un análisis SDS-PAGE de la expresión de la proteína Tbp1 por células de E. coli transformadas con el plásmido pLEM29;

la Figura 16 muestra un diagrama de flujo para purificación de la proteína Tbp1 recombinante;

la Figura 17 muestra un análisis SDS-PAGE de la proteína Tbp1 recombinante purificada;

la Figura 18 muestra la construcción de los plásmidos pLEM33 y pLEM37 para expresión del gen tbpA de M. catarrhalis 4223 en E coli sin y con una secuencia conductora respectivamente;

la Figura 19 muestra un análisis SDS-PAGE de la expresión de la proteína rTbp2 por células de E. coli transformadas con el plásmido pLEM37;

la Figura 20 muestra la construcción del plásmido sLRD35B para expresión del gen tbpB de M. catarrhalis Q8 en E coli sin una secuencia conductora, y la construcción del plásmido SLRD35A para expresión del gen tbpB de M. catarrhalis Q8 en E coli con una secuencia conductora. Sitio de restricción B = Bam HI; Bg = Bgl II; H = Hind III; R = EcoRI;

La Figura 21 muestra un análisis SDS-PAGE de la expresión de la proteína rTbp2 en células de E. coli, transformadas con los plásmidos SLRD35A y SRLE35B;

la Figura 22 muestra un diagrama de flujo para purificación de la proteína Tbp2 recombinante a partir de E. coli;

La Figura 23, que incluye los Paneles A y B, muestra un análisis SDS-PAGE de la publicación de la proteína Tbp2 recombinante a partir de las cepas 4223 (Panel A) y Q8 (Panel B) de M. catarrhalis por expresión en E. coli;

la Figura 24 muestra la fijación de Tbp2 a transferrina humana;

la Figura 25, incluye los Paneles A, B y C, muestra la conservación antigénica de la proteína Tbp2 entre cepas de M. catarrhalis;

La Figura 26 muestra un mapa de restricción del gen tbpB para M. catarrhalis R1;

la Figura 27 muestra la secuencia de nucleótidos del gen tbpB (SEQ ID No: 45 - secuencia entera y SEQ ID No: 46 - secuencia codificante) y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Tbp2 de M. catarrhalis R1 (SEQ ID No: 47); y

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La Figura 28 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Tbp2 para M. catarrhalis 4223 (SEQ ID No: 21), Q8 (SEQ ID No: 15) y R1 (SEQ ID No: 47). Los puntos indican residuos idénticos y se han insertado guiones para alineación máxima. Los asteriscos indican codones de parada.

Descripción general de la invención

Cualquier cepa de Moraxella puede utilizarse convenientemente para proporcionar el ácido nucleico purificado y aislado, que puede encontrarse en la forma de moléculas de DNA, que comprenden al menos una porción del ácido nucleico codificante de un receptor de transferrina como se tipifica por las realizaciones de la presente invención. Tales cepas están disponibles generalmente de fuentes clínicas y de colecciones de cultivos bacterianos, tales como la American Type Culture Collection.

En esta solicitud, se utilizan los términos "receptor de transferrina" (TfR) y "proteínas de fijación de transferrina" (Tbp) para definir una familia de proteínas Tbp1 y/o Tbp2 que incluyen aquéllas que tienen variaciones en sus secuencias de aminoácidos con inclusión de las que existen naturalmente en diversas cepas de, por ejemplo, Moraxella. Las moléculas de DNA purificadas y aisladas que comprenden al menos una porción que codifica el receptor de transferrina de la presente invención incluyen también aquéllas que codifican análogos funcionales de las proteínas receptoras de transferrina Tbp1 y Tbp2 de Moraxella. En esta solicitud, una primera proteína es un "análogo funcional" de una segunda proteína si la primera proteína es inmunológicamente afín a y/o tiene la misma función que la segunda proteína. El análogo funcional puede ser, por ejemplo, un fragmento de la proteína, o un mutante por sustitución, adición o deleción de la misma.

El DNA cromosómico de M. catarrhalis 4223 se digirió con Sau3A a fin de generar fragmentos dentro de un intervalo de tamaños de 15 a 23 kb, y se clonó en el sitio BamHI del vector lambda EMBL3. La genoteca se exploró con antisueros anti-Tbp1 de cobayo, y se seleccionó para análisis ulterior un clon positivo LEM3-24, que contenía una inserción de aproximadamente 13,2 kb de tamaño. Se encontró que el lisado de E. coli LE392 infectado con LEM3-24 contenía una proteína de un tamaño aproximado de 115 kdA que reaccionaba en transferencias Western con antisueros anti-Tbp1. Una segunda proteína, de un tamaño aproximado de 80 kdA, reaccionaba con los antisueros anti-Tbp2 de cobayo en las transferencias Western.

A fin de localizar el gen tbpA en la inserción de 13,2 kb de LEM3-24, se utilizaron iniciadores PCR degenerados para amplificar una pequeña región del gen tbpA supuesto de M. catarrhalis 4223. Las secuencias de los iniciadores oligonucleotídicos degenerados estaban basadas en secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las proteínas Tbp1 de varias especies de Neisseria y Haemophilus y se muestran en la Figura 1 (SEQ ID Nos; 17 y 18). Se generó un producto amplificado de 300 pares de bases, y su localización dentro del gen 4223 tbpA se indica por letras en negrilla en la Figura 5 (SEQ ID No: 29). El producto amplificado se subclonó en el vector pCRII, se marcó, y se utilizó para sondar una transferencia Southern que contenía DNA del clon LEM3-24 digerido con endonucleasas de restricción. La sonda se hibridaba a un fragmento HindIII-HindIII de 3,8 kb, un fragmento AvrII-AvrII de 2,0 kb y un fragmento SalI-SphI de 4,2 kb (Figura 2).

El fragmento HindIII-HindIII de 3,8 kb se subclonó en pACYC177, y se secuenció. Se identificó un gran marco de lectura abierto, y se encontró después que contenía aproximadamente 2 kb del gen tbpA supuesto. El 1 kb restante del gen tbpA se obtuvo por subclonación de un fragmento HindIII-HindIII adyacente aguas abajo en el vector pACYC177. La secuencia de nucleótidos del gen tbpA de M. catarrhalis 4223 (SEQ ID Nos: 1 y 2), y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID No: 9 - longitud total; SEQ ID No: 10 proteína madura) se muestran en Figura 5.

El DNA cromosómico de la cepa Q8 de M. catarrhalis se digirió con Sau3A I y se ligaron fragmentos de 15-23 kb con ramas BamHI de EMBL3. Se generó una genoteca de alto título en células E. coli LE392 y se exploró utilizando sondas oligonucleotídicas basadas en la secuencia 4223 tbpA. Se preparó DNA de fago y el análisis con enzimas de restricción reveló que se habían clonado inserciones de aproximadamente 13-15 kb. Se utilizó el clon de fago SLRD-A para subclonar fragmentos para análisis de la secuencia. Se generó un vector de clonación (pSKMA) para facilitar la clonación de los fragmentos y se generaron plásmidos pSLRD1, pSRLD2, pSLRD3, pSLRD4 y pSRLD5, que contienen la totalidad de tbpA y la mayor parte de tbpB. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID Nos 5 y 6) y la de aminoácidos deducida (SEQ ID No: 13 - longitud total, SEQ ID No: 14 - proteína madura) del gen tbpA de la cepa Q8 se muestran en la Figura 10.

Se encontró que las secuencias de aminoácidos deducidas para la proteína Tbp1 codificada por los genes tbpA comparten cierta homología con las secuencias de aminoácidos codificadas por los genes de cierto número de especies de Neisseria y Haemophilus (Figura 12; SEQ ID Nos: 21, 22, 23 y 24).

Antes del presente descubrimiento, se ha encontrado que los genes tbpA identificados en especies de Neisseria, Haemophilus, y Actinobacillus están precedidos por un gen tbpB con varias regiones conservadas. Los dos genes están separados típicamente por una secuencia intergénica corta. Sin embargo, no se encontraba un gen tbpB aguas arriba del gen tbpA en M. catarrhalis 4223. A fin de localizar el gen tbpB dentro de la inserción de 13,2 kb del clon LEM3-24, se sintetizó una sonda oligonucleotídica degenerada basada en una secuencia de aminoácidos EGGFYGP (SEQ ID No: 30), conservada entre proteínas Tbp2 de varias especies. El oligonucleótido se marcó y se utilizó para sondar una transferencia Southern que contenía diferentes fragmentos de endonucleasas de restricción del clon LEM3-24. La sonda se hibridaba a un fragmento NheI-SalI de 5,5 kb, que se subclonó subsiguientemente en pBR328, y se secuenció. El fragmento contenía la mayor parte del gen tbpB supuesto, con la excepción de la región promotora. El clon LEM3-24 se secuenció para obtener la secuencia de aguas arriba restante. El gen tbpB estaba localizado aproximadamente 3 kb aguas abajo del final del gen tbpA, en contraste con la organización genética de los genes tbpA y tbpB en Haemophilus y Neisseria. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID Nos: 3 y 4) del gen tbpB de M. catarrhalis 4223 y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID Nos: 11, 12) se muestran en la Figura 6. El gen tbpB de M. catarrhalis Q8 se clonó y secuenció también. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID Nos: 7 y 8) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID Nos: 15 y 169 se muestran en la Figura 11. El gen tbpB de M. catarrhalis R1 se clonó y secuenció también. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID Nos: 45 y 46) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID No: 47) se muestran en la Figura 27. Son evidentes regiones de homología entre las secuencias de aminoácidos Tbp2 de M. catarrhalis como se muestra en la alineación comparativa de la Figura 28 (SEQ ID No: 11, 15 y 47) y entre las secuencias de aminoácidos Tbp2 de M. catarrhalis y las secuencias Tbp2 de cierto número de especies de Neisseria y Haemophilus, como se muestra en la alineación comparativa de la Figura 13 (SEQ ID Nos: 25, 26, 27, 28).

Los genes tbpA y tbpB clonados se expresaron en E. coli para producir proteínas Tbp1 y Tbp2 recombinantes exentas de otras proteínas de Moraxella. Estas proteínas recombinantes se purificaron y utilizaron para inmunización.

La conservación antigénica de la proteína Tbp2 entre cepas de M. catarrhalis se demostró por separación de las proteínas en lisados de células enteras de M. catarrhalis o cepas de E. coli que expresaban proteínas Tbp2 recombinantes por SDS-PAGE e inmunotransferencia de antisuero con antisuero anti-4223 rTbp2 o antisuero anti-Q8 rTbp2 generado en cobayos. Las cepas de M. catarrhalis 3, 56, 135, 585, 4223, 5191, 8185 y ATCC 25240 se ensayaron de este
modo y todas ellas exhibían reactividad específica con los anticuerpos anti-4223rTbp2 o anti-Q8 rTbp2 (Figura 25).

Adicionalmente, la capacidad de los anticuerpos anti-rTbp2 de una cepa para reconocer proteína nativa o recombinante de la cepa homóloga o heteróloga por ELISA se muestra más adelante en la Tabla 1.

Se emprendió la secuenciación de aminoácidos de los términos N y fragmentos con bromuro de cianógeno del receptor de transferrina de M. catarrhalis 4223. Se bloquearon ambos términos N de Tbp1 y Tbp2. Las secuencias señal supuestas de Tbp1 y Tbp2 se indican por subrayado en las Figuras 5 y 6 (SEQ ID Nos: 19 y 20), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas para la región N-terminal de Tbp2 sugieren una estructura de lipoproteína.

Los resultados que se presentan en las Tablas 1 y 2 siguientes ilustran la capacidad de los antisueros de cobayo anti-Tbp1 y anti-Tbp2, producidos por la inmunización con Tbp1 o Tbp2, para lisar M. catarrhalis. Los resultados muestran que los antisueros producidos por inmunización con proteína Tbp1 o Tbp2 aislada del aislado 4223 de M. catarrhalis eran bactericidas contra una cepa RH408 de M. catarrhalis homóloga y no aglutinante (una cepa depositada previamente en conexión con la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 08/328589, cedida al cesionario de la presente invención (WO96/12733) con la American Type Culture Collection, localizada en 1301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU. bajo los términos del Tratado de Budapest de 13 de diciembre de 1994 bajo el depósito ATCC No. 55637) derivada del aislado 4223. Adicionalmente, antisueros producidos por inmunización con la proteína Tbp1 aislada de M. catarrhalis 4223 eran bactericidas contra la cepa Q8 heteróloga y no aglutinante (un obsequio de Dr. M.G. Bergeron, Centro Hospitalario de la Universidad Laval, St. Foy, Quebec). Adicionalmente, el antisuero generado contra la proteína recombinante Tbp2 (rTbp2) era bactericida contra la cepa homóloga de M. catarrhalis.

La capacidad de las proteínas fijadoras de transferrina aisladas y purificadas para generar anticuerpos bactericidas es una prueba in vivo de la utilidad de estas proteínas como vacunas para proteger contra la enfermedad causada por Moraxella.

1. Preparación y Uso de la Vacuna

Composiciones inmunógenas, adecuadas para ser utilizadas como vacunas, pueden prepararse a partir de proteínas receptoras de transferrina inmunógenas, análogos y fragmentos de las mismas, codificados por las moléculas de ácido nucleico así como las moléculas de ácido nucleico descritas en esta memoria. La vacuna provoca una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos, con inclusión de anticuerpos receptores anti-transferrina y anticuerpos que son opsonizantes o bactericidas. En caso de que el individuo vacunado se vea expuesto a Moraxella, los anticuerpos se fijan al receptor de transferrina e impiden con ello el acceso de la bacteria a una fuente de hierro que es necesaria para la viabilidad. Adicionalmente, los anticuerpos opsonizantes o receptores anti-transferrina bactericidas pueden proporcionar también protección por mecanismos alternativos.

Composiciones inmunógenas, con inclusión de vacunas, pueden prepararse como inyectables, como soluciones líquidas o emulsiones. Las proteínas receptoras de transferrina, análogos y fragmentos de las mismas y moléculas de ácido nucleico codificante pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con las proteínas receptoras de transferrina, fragmentos, análogos o moléculas de ácido nucleico. Tales excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunógenas y vacunas pueden contener adicionalmente sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH, o adyuvantes, para mejorar la eficacia de las vacunas. Las composiciones inmunógenas y vacunas pueden administrarse por vía parenteral, por inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular. Alternativamente, las composiciones inmunógenas proporcionadas de acuerdo con la presente invención pueden formularse y suministrarse de una manera que provoque una respuesta inmune en las superficies mucosales.

Así pues, la composición inmunógena puede administrarse a superficies mucosales mediante, por ejemplo, las rutas nasal u oral (intragástrica). La composición inmunógena puede proporcionarse en combinación con una molécula de direccionamiento para suministro a células específicas del sistema inmunitario o a superficies mucosales. Algunas moléculas de direccionamiento de este tipo incluyen vitamina B12 y fragmentos de toxinas bacterianas, como se describe en WO 92/17167 (Biotech Australia Pty. Ltd.), y anticuerpos monoclonales, como se describe en la patente U.S. No. 5.194.254 (Barber et al.). Alternativamente, pueden ser deseables otros modos de administración, con inclusión de supositorios y formulaciones orales. En el caso de supositorios, aglomerantes y vehículos pueden incluir, por ejemplo, polialcalen-glicoles o triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de sacarina, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen aproximadamente 1 a 95% de las proteínas, fragmentos, análogos y/o moléculas de ácido nucleico receptoras de transferrina.

Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad que sea terapéuticamente eficaz, protectora e inmunógena. La cantidad a administrar depende del individuo a tratar, con inclusión, por ejemplo, de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, y, si es necesario, producir una respuesta inmune mediada por células. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para ser administradas dependen del criterio del médico. Sin embargo, intervalos de dosificación adecuados son fácilmente determinables por un experto en la técnica y pueden ser del orden de microgramos de las proteínas receptoras de transferrina, análogos y fragmentos de las mismas, y/o moléculas de ácido nucleico. Los regímenes adecuados para administración inicial y dosis reforzantes son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida por administraciones subsiguientes. La dosificación de la vacuna puede depender también de la ruta de administración y variará de acuerdo con el tamaño del hospedador.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor de transferrina de Moraxella, pueden utilizarse directamente para inmunización por administración de DNA directamente, por ejemplo, por inyección para inmunización genética o por construcción de un vector vivo, tal como Salmonella, BCG, adenovirus, poxvirus, vaccinia, o poliovirus que contienen las moléculas de ácido nucleico. Una exposición de algunos vectores vivos que se han utilizado para transportar antígenos heterólogos al sistema inmunitario se contiene, por ejemplo, en O'Hagan (ref. 22). Procesos para la inyección directa de DNA en individuos sometidos a ensayo para inmunización genética se describen, por ejemplo, en Ulmer et al. (ref. 23).

La inmunogenicidad puede aumentarse significativamente si los antígenos se administran conjuntamente con adyuvantes, utilizados comúnmente como una solución al 0,05 hasta 1,0% en solución salina tamponada con fosfato. Los adyuvantes aumentan la inmunogenicidad de un antígeno pero no son necesariamente inmunógenos en sí mismos. Los adyuvantes pueden actuar por retención del antígeno localmente cerca del sitio de administración para producir un efecto de depósito que facilita una liberación lenta y sostenida de antígeno a las células del sistema inmunitario. Los adyuvantes pueden atraer también células del sistema inmunitario hacia un depósito de antígeno y estimular dichas células a provocar respuestas inmunitarias.

Los agentes inmunoestimulantes o adyuvantes han sido utilizados durante muchos años para mejorar la respuesta del sistema inmunitario a, por ejemplo, vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, tales como lipopolisacáridos, son normalmente los componentes de bacterias muertas o atenuadas utilizados como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que están unidos típicamente a los antígenos por enlaces no covalentes y están formulados para mejorar las respuestas del sistema inmunitario. Así, se han identificado adyuvantes que mejoran la respuesta inmunitaria a antígenos suministrados por vía parenteral. Algunos de estos adyuvantes son tóxicos, sin embargo, y pueden causar efectos secundarios indeseables, que los hacen inadecuados para uso en humanos y muchos animales. De hecho, únicamente hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio (a los que se hace referencia comúnmente de modo colectivo como alumbre) se utilizan rutinariamente como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. La eficiencia del alumbre en el aumento de las respuestas de anticuerpos frente a los toxoides de la difteria y del tétanos está perfectamente establecida y se ha utilizado una vacuna HBsAg con alumbre como adyuvante. Si bien la utilidad del alumbre está perfectamente establecida para algunas aplicaciones, tiene sus limitaciones. Por ejemplo, el alumbre es ineficaz para vacunación contra la gripe y provoca inconsistentemente una respuesta inmune mediada por células. Los anticuerpos provocados por antígenos que contienen alumbre como adyuvante son principalmente del isotipo IgG1 en el ratón, que puede no ser óptimo para protección por algunos agentes vacunales.

Una extensa gama de adyuvantes extrínsecos pueden provocar respuestas inmunes potentes frente a antígenos. Éstos incluyen saponinas complejadas con antígenos de proteínas de membrana (complejos estimulantes de la inmunidad), polímeros de tipo Pluronic con aceite mineral, micobacterias muertas y aceite mineral, adyuvante de Freund completo, productos bacterianos, tales como muramil-dipéptido (MDP) y lipopolisacárido (LPS), así como lípido A, y liposomas.

Para inducir eficazmente respuestas inmunes humorales (HIR) e inmunidad mediada por células (CMI), se emulsionan a menudo los inmunógenos en adyuvantes. Muchos adyuvantes son tóxicos, induciendo granulomas, inflamaciones agudas y crónicas (adyuvante de Freund completo, FCA), citólisis (saponinas y polímeros de tipo Pluronic), y pirogenicidad, artritis y uveítis anterior (LPS y MDP). Aunque FCA es un excelente adyuvante y se utiliza extensamente en investigación, no está autorizado para uso en vacunas humanas o veterinarias debido a su toxicidad.

Características deseables de los adyuvantes ideales incluyen:

(1): ausencia de toxicidad;

(2): posibilidad de estimular una respuesta inmune de larga duración;

(3): simplicidad de fabricación y estabilidad al almacenamiento a largo plazo;

(4): capacidad de provocar a la vez CMI y HIR frente a antígenos administrados por diversas rutas, en caso requerido;

(5): sinergia con otros adyuvantes;

(6): capacidad de interaccionar selectivamente con poblaciones de células presentadoras de antígeno (APC);

(7): capacidad de provocar específicamente respuestas inmunes apropiadas específicas de células T_{H}^{1} o T_{H}^{2}; y

(8): capacidad de aumentar selectivamente los niveles isotipo de anticuerpos apropiados (por ejemplo, IgA) contra antígenos.

La patente U.S. No. 4.855.283 da a conocer análogos glicolipídicos que incluyen N-glicosilamidas, N-glicosilureas y N-glicosil-carbamatos, cada uno de los cuales está sustituido en el resto azúcar con un aminoácido, como inmunomoduladores o adyuvantes. Así, Lockhoff et al. 1991 (ref. 24) consignaron que los análogos de N-glicolípidos que exhiben semejanzas estructurales con los glicolípidos existentes naturalmente, tales como glicofosfolípidos y glicoglicerolípidos, son capaces de provocar respuestas inmunes fuertes tanto en la vacuna del virus del herpes símplex como en la vacuna del virus de la pseudorrabia. Algunos glicolípidos han sido sintetizados a partir de alquilaminas de cadena larga y ácidos grasos que están enlazados directamente con los azúcares a través del átomo de carbono anomérico, para mimetizar las funciones de los residuos lipídicos existentes naturalmente.

La patente U.S. No. 4.258.029 expone que el hidrocloruro de octadecil-tirosina (OTH) funciona como un adyuvante cuando está complejado con toxoide del tétanos y vacuna del virus de la poliomielitis tipo I, II y III desactivada con formalina. Asimismo, Nixon-George et al. 1990 (ref. 25) consignaron que los octadecil-ésteres de aminoácidos aromáticos complejados con un antígeno de superficie recombinante de la hepatitis B mejoraban las respuestas inmunes del hospedador contra el virus de la hepatitis B''.

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2. Inmunoensayos

Las proteínas receptoras de transferrina, análogos y/o fragmentos de las mismas son útiles como inmunógenos, como antígenos en inmunoensayos que incluyen ensayos de fijación de anticuerpos unidos a enzima o procedimientos conocidos en la técnica para la detección de anticuerpos proteínicos receptores de transferrina anti-Moraxella. En los ensayos ELISA, la proteína receptora de transferrina, análogos y/o fragmentos correspondientes a porciones de la proteína TfR, se inmovilizan sobre una superficie seleccionada, por ejemplo, una superficie capaz de fijar proteínas o péptidos tal como los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno. Después de lavado para eliminar el receptor de transferrina, los análogos y/o los fragmentos incompletamente adsorbidos, puede fijarse a la superficie seleccionada una proteína inespecífica tal como una solución de sero-albúmina bovina (BSA) o caseína que se sabe es antigénicamente neutra con relación a la muestra de ensayo. Esto permite el bloqueo de sitios de adsorción inespecíficos en la superficie de inmovilización y reduce por consiguiente el ruido de fondo causado por las fijaciones inespecíficas de antisueros en la superficie.

La superficie de inmovilización se pone luego en contacto con una muestra, tal como materiales clínicos o biológicos, a ensayar de una manera que conduce a la formación del complejo inmune (antígeno/anticuerpo). Este procedimiento puede incluir dilución de la muestra con diluyentes, tales como BSA, gammaglobulina bovina (BGG) y/o solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween. La muestra se deja incubar luego durante aproximadamente 2 a 4 horas, a temperaturas tales como del orden de aproximadamente 25 a 37ºC. Después de la incubación, la superficie puesta en contacto con la muestra se lava para eliminar el material no-inmunocomplejado. El procedimiento de lavado puede incluir lavado con una solución tal como PBS/Tween o un tampón de borato.

Después de la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de ensayo y la proteína, análogos y/o fragmentos receptores de transferrina fijados, y lavado subsiguiente, la existencia, e incluso la cantidad, de formación de inmunocomplejos puede determinarse sometiendo el inmunocomplejo a un segundo anticuerpo que tiene especificidad para el primer anticuerpo. Si la muestra de ensayo es de origen humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo que tiene especificidad para inmunoglobulinas humanas y en general IgG. Para proporcionar medios de detección, el segundo anticuerpo puede tener una actividad asociada tal como una actividad enzimática que regenerará, por ejemplo, un desarrollo de color después de la incubación con un sustrato cromógeno apropiado. La cuantificación puede realizarse luego midiendo el grado de generación de color con utilización, por ejemplo, de un
espectrofotómetro.

3. Uso de Secuencias como Sondas de Hibridación

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención, que comprenden la secuencia del gen receptor de transferrina, permiten ahora la identificación y clonación de los genes receptores de transferrina de cualquier especie de Moraxella.

Las secuencias de nucleótidos que comprenden la secuencia de los genes receptores de transferrina de la presente invención son útiles por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de otros genes TfR. Dependiendo de la aplicación, pueden emplearse una diversidad de condiciones de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de la sonda frente a los otros genes TfR. Para un grado de selectividad alto, se utilizan condiciones relativamente severas a fin de formar los dúplex, tales como condiciones de bajo contenido en sal y/o temperatura elevada, como las proporcionadas por NaCl 0,02 M a 0,15 M, y temperaturas comprendidas entre aproximadamente 50ºC y 70ºC. Para algunas aplicaciones, se requieren condiciones de hibridación menos severas, tales como 0,15 M a 0,9 M de sal, a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 20ºC y 55ºC. Las condiciones de hibridación pueden hacerse también más severas por adición de cantidades crecientes de formamida, para desestabilizar el dúplex híbrido. Así, condiciones de hibridación particulares pueden manipularse fácilmente, y generalmente serán un método de elección dependiendo de los resultados deseados. En general, temperaturas de hibridación convenientes en presencia de 50% de formamida son: 42ºC para una sonda que sea 95 a 100% homóloga al fragmento diana, 37ºC para 90 a 95% de homología y 32ºC para 85 a 90% de homología.

En una realización de diagnóstico clínico, las secuencias de ácido nucleico de los genes TfR de la presente invención pueden utilizarse en combinación con un medio apropiado, tal como un marcador, para determinar la hibridación. Se conocen en la técnica una gran diversidad de medios indicadores apropiados, que incluyen ligandos radiactivos, enzimáticos o de otros tipos, tales como avidina/biotina y marcación con digoxigenina, que son capaces de proporcionar una señal detectable. En algunas realizaciones de diagnóstico, puede utilizarse una etiqueta enzimática tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de una etiqueta radiactiva. En el caso de etiquetas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que pueden emplearse para proporcionar un medio visible al ojo humano o espectro-
fotométricamente, a fin de identificar hibridación específica con muestras que contienen secuencias de genes TfR.

Las secuencias de ácido nucleico de los genes TfR de la presente invención son útiles como sondas de hibridación en hibridaciones en solución y en realizaciones que emplean procedimientos en fase sólida. En las realizaciones que implican procedimientos en fase sólida, el DNA (o RNA) de ensayo de las muestras, tal como muestras clínicas, con inclusión de exudados, fluidos corporales (v.g., suero, fluido amniótico, efusión del oído medio, esputo, fluido de lavado broncoalveolar) o incluso tejidos, se adsorbe o se fija de otro modo a una matriz o superficie seleccionada. El ácido nucleico monocatenario fijado se somete luego a hibridación específica con sondas seleccionadas que comprenden las secuencias de ácido nucleico de los genes TfR o fragmentos de los mismos de la presente invención en condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares basadas en los criterios particulares requeridos que dependen, por ejemplo, del contenido de G+C, el tipo de ácido nucleico diana, la fuente de ácido nucleico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc. Después de lavado de la superficie de hibridación a fin de eliminar las moléculas de sonda fijadas inespecíficamente, se detecta la hibridación específica, o incluso se cuantifica, por medio de la etiqueta. Se prefiere seleccionar porciones de secuencia de ácido nucleico que estén conservadas entre especies de Moraxella. La sonda seleccionada puede tener una longitud de al menos 18 pb y puede llegar en longitud hasta aproximadamente 30 a 90 pb.

4. Expresión de los Genes del Receptor de Transferrina

Vectores de plásmido que contienen secuencias de replicón y de control que se derivan de especies compatibles con la célula hospedadora pueden utilizarse para la expresión de los genes receptores de transferrina en sistemas de expresión. El vector lleva ordinariamente un sitio de replicación, así como secuencias de marcación que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli puede transformarse utilizando pBR322 que contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona así un medio fácil para identificación de células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido o fago microbiano, debe contener también, o modificarse para que contenga promotores que puedan ser utilizados por la célula hospedadora para expresión de sus propias proteínas.

Adicionalmente, vectores de fago que contienen secuencias de replicón y de control que son compatibles con el hospedador pueden utilizarse como vector de transformación en conexión con estos hospedadores. Por ejemplo, el fago en lambda GEM^{TM}-11 puede utilizarse en la marcación de vectores de fago recombinantes que se pueden emplear para transformar células hospedadoras, tales como E coli LE392.

Promotores utilizados comúnmente en la construcción de DNA recombinante incluyen los sistemas promotores de \beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa y otros promotores microbianos, tales como el sistema promotor T7 descrito en la patente U.S. No. 4.952.496. Se conocen detalles concernientes a las secuencias de nucleótidos de promotores, que permiten a un operario experto ligarlos funcionalmente con genes. El promotor particular utilizado será generalmente cuestión de elección dependiendo de los resultados deseados. Hospedadores que son apropiados para expresión de los genes receptores de transferrina, fragmentos, análogos o variantes de los mismos, pueden incluir E. coli, especies de Bacillus, Haemophilus, hongos, levaduras, Moraxella, Bordetella, o puede utilizarse el sistema de expresión de baculovirus.

Se prefiere producir la proteína receptora de transferrina, fragmento o análogo de la misma, por métodos recombinantes, particularmente dado que la proteína TfR existente naturalmente tal como se purifica a partir de un cultivo de una especie de Moraxella puede incluir cantidades traza de materiales tóxicos u otros contaminantes. Este problema puede evitarse utilizando proteína TfR producida recombinantemente en sistemas heterólogos que pueden aislarse del hospedador de una manera que minimice los contaminantes en el material purificado. Hospedadores particularmente deseables para expresión a este respecto incluyen bacterias Gram-positivas que no tienen LPS y están, por tanto, exentas de endotoxinas. Tales hospedadores incluyen especies de Bacillus y pueden ser particularmente útiles para la producción de receptor de transferrina no pirogénico, fragmentos o análogos del mismo. Adicionalmente, los métodos de producción recombinantes permiten la fabricación de Tbp1 o Tbp2 o fragmentos o análogos respectivos de los mismos, separados unos de otros, que son distintos de las proteínas normales combinadas presentes en Moraxella.

Depósitos Biológicos

Ciertos vectores que contienen al menos una porción codificante de una proteína receptora de transferrina a partir de las cepas 4223 y Q8 de Moraxella catarrhalis y una cepa de M. catarrhalis RH408 que se describen y a las que se hace referencia en esta memoria han sido depositados con la American Type Culture Collection (ATCC) localizada en 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EE.UU. de acuerdo con el Tratado de Budapest.

Sumario de Depósitos

1

Ejemplos

La exposición anterior describe en líneas generales la presente invención. Una comprensión más completa puede obtenerse por referencia a los ejemplos específicos que siguen. Estos ejemplos se describen únicamente para propósitos de ilustración y no tienen por objeto limitar el alcance de la invención. Se contemplan cambios de forma y sustitución de equivalentes cuando las circunstancias pueden sugerirlo o hacerlo conveniente. Aunque se han empleado términos específicos en esta memoria, dichos términos deben considerarse en un sentido descriptivo y no para propósitos de limitación.

Métodos de genética molecular, bioquímica de proteínas e inmunologías utilizados pero no descritos específicamente en esta exposición y estos ejemplos se consignan abundantemente en la bibliografía científica y están perfectamente dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la preparación e inmunización de cobayos con proteínas Tbp1 y Tbp2 de M. catarrhalis.

Las proteínas Tbp1 y Tbp2 se obtuvieron como sigue:

Se diluyeron preparaciones de membrana bruta total privadas de hierro hasta 4 gramos proteína/ml en Tris.HCl 50 mM-NaCl 1M, pH 8, en un volumen total de 384 ml. Las membranas se solubilizaron por adición de 8 ml de cada uno de EDTA 0,5 M y sarcosilo al 30%, y las muestras se incubaron durante 2 horas a la temperatura ambiente con agitación suave. Las membranas solubilizadas se centrifugaron a 10 K rpm durante 20 min. Se añadieron al sobrenadante 15 ml de apo-hTf-Sepharose 4B, y se incubó durante 2 horas a la temperatura ambiente, por agitación suave mediante sacudidas. La mezcla se añadió a una columna. La columna se lavó con 50 ml de Tris.HCl 50 mM - hidrocloruro de guanidina 250 mM, para eliminar las proteínas contaminantes. Se eluyó Tbp2 de la columna por la adición de 100 ml de hidrocloruro de guanidina 1,5 M. Se eluyó Tbp1 por adición de 100 ml de hidrocloruro de guanidina 3 M. Las primeras fracciones de 20 ml se dializaron contra 3 cambios de Tris.HCl 50 mM, pH 8,0, las muestras se guardaron a -20ºC, o se dializaron contra bicarbonato de amonio y se liofilizaron.

Se inmunizaron cobayos (Charles River) por vía intramuscular el día +1 con una dosis de 10 \mug de Tbp1 o Tbp2 emulsionada en adyuvante completo de Freund. Los animales recibieron una inyección de refuerzo los días +14 y +29 con la misma dosis de proteína emulsionada en adyuvante de FERUM incompleto. Se tomaron muestras de sangre el día +42, y se utilizaron los sueros para análisis de la actividad de anticuerpos bactericidas. Adicionalmente, todos los antisueros se evaluaron por análisis de inmunotransferencia en cuanto a reactividad con proteínas de M. catarrhalis 4223.

La actividad de anticuerpos bactericidas de los antisueros Tbp1 o Tbp2 4223 de cobayo anti-M. catarrhalis se determinó como sigue. Se inoculó una cepa no aglomerante de M. catarrhalis RH408, derivada del aislado 4223, en 20 ml de caldo BHI, y se dejó crecer durante 18 horas a 37ºC, agitando mediante sacudidas a 170 rpm. Se utilizó 1 ml de este cultivo para inocular 20 ml de BHI suplementado con ácido etilenodiamina-di-hidroxifenilacético 25 mM (EDDA; Sigma). El cultivo se dejó crecer hasta una DO_{570} de 0,5. Las células se diluyeron en relación 1:200.000 en NaCl 140 mM, NaHCO_{3} 93 mM, barbiturato de sodio 2 mM, ácido barbitúrico 4 mM, MgCl_{2}.6H_{2}O 0,5 mM, CaCl_{2}.2H_{2}O 0,4 mM, pH 7,6 (tampón de Veronal), que contenía 0,1% de seroalbúmina bovina (VBS) y se pusieron en hielo. Los antisueros Tbp1 o Tbp2 de cobayo anti-M. catarrhalis 4223, junto con antisueros de control pre-hemorragia, se calentaron a 56ºC durante 30 min para desactivar el complemento endógeno. Diluciones en serie al doble de cada antisuero en VPS se añadieron a los pocillos de una placa de microtitulación Nunclon de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Las diluciones comenzaron a 1:8, y se prepararon hasta un volumen final de 25 \mul. En cada pocillo, se añadieron 25 \mul de células bacterianas diluidas a cada uno de los pocillos. Un complemento de cobayo (Biowhittaker, Walkersville, MD) se diluyó en relación 1:10 en VBS, y se añadieron porciones de 25 \mul a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC durante 80 min, se agitaron suavemente mediante sacudidas a 70 rpm en una plataforma rotativa, y se extendieron 50 \mul de cada mezcla de reacción sobre placas de agar Mueller-Hinton (Vector-Dickinson, Cockeysville, MD). Las placas se incubaron a 37ºC durante 72 horas y se contó el número de colonias por placa. Los títulos bactericidas se evaluaron como el recíproco de la dilución más alta de antisuero capaz de destruir más del 50% de las bacterias comparado con controles que contenían sueros pre-inmunes. Los resultados que se muestran en la Tabla 1 siguiente ilustran la capacidad de los antisueros de cobayo anti-Tbp1 y anti-Tbp2 para lisar M. catarrhalis.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la preparación de DNA cromosómico a partir de las cepas 4223 y Q8 de M. catarrhalis.

Se inoculó el aislado 4223 de M. catarrhalis en 100 ml de caldo BHI, y se incubó durante 18 h a 37ºC con agitación mediante sacudidas. Las células se recogieron por centrifugación a 10.000 x g durante 20 min. Se utilizó el sedimento para extracción del DNA cromosómico de M. catarrhalis 4223.

El sedimento de células se resuspendió en 20 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5)-EDTA 1,0 mM (TE). Se añadieron pronasa y SDS a concentraciones finales de 500 \mug/ml y 1,0%, respectivamente, y la suspensión se incubó a 37ºC durante 2 h. Después de varias extracciones secuenciales con fenol, fenol:cloroformo (1:1), y cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), se dializó el extracto acuoso, a 4ºC, contra NaCl 1,0 M durante 4 h, y contra TE (pH 7,5) durante 48 h adicionales con 3 cambios de tampón. Se añadieron al dializado 2 volúmenes de etanol, y se devanó el DNA sobre una varilla de vidrio. El DNA se dejó secar al aire, y se disolvió en 3,0 ml de agua. Por espectrofotometría UV, se estimó que la concentración era aproximadamente 290 \mug/ml.

La cepa Q8 de M. catarrhalis se dejó crecer en caldo BHI como se describe en el Ejemplo 1. Las células se redujeron a un sedimento a partir de 50 ml de cultivo por centrifugación a 5.000 rpm durante 20 minutos, a 4ºC. El sedimento de células se resuspendió en 10 ml de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) y se añadieron proteinasa K y SDS a concentraciones finales de 500 \mug/ml y 1%, respectivamente. La muestra se incubó a 37ºC durante 4 horas hasta que se obtuvo un lisado claro. El lisado se extrajo dos veces con fenol/cloroformo (1:1) saturado con Tris, y dos veces con cloroformo. La fase acuosa final se dializó durante 24 horas contra 2 x 1000 ml de NaCl 1 M a 4ºC, cambiando el tampón una sola vez, y durante 24 horas contra 2 x 1000 ml de TE a 4ºC, cambiando el tampón una sola vez. El dializado final se precipitó con dos volúmenes de etanol al 100%. El DNA se devanó, se secó y se resuspendió en 5 a 10 ml de tampón TE.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la construcción de genotecas cromosómicas de M. catarrhalis en EMBL 3.

Una serie de digestiones de restricción de DNA cromosómico, en volúmenes finales de 10 \mul cada uno, se llevaron a cabo a fin de optimizar las condiciones necesarias para generar cantidades máximas de fragmentos de restricción dentro de un intervalo de tamaños de 15 a 23 kb. Utilizando las condiciones de digestión optimizadas, se estableció una digestión en gran escala en un volumen de 100 \mul, que contenía lo siguiente: 50 \mul de DNA cromosómico (290 \mug/ml), 33 \mul de agua, 10 \mul de tampón 10 X Sau3A (New England Biolabs), 1,0 \mul de BSA (10 mg/ml, New England Biolabs), y 6,3 \mul de Sau3A (0,04 U/\mul). Después de una incubación de 15 min a 37ºC, se terminó la digestión por adición de 10 \mul de Tris-HCl 100 mM (pH 8,0)-EDTA 10 mM-azul de bromofenol al 0,1%, glicerol al 50% (tampón de carga). El DNA digerido se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al 0,5% en Tris acetato 40 mM-Na_{2}EDTA.2H_{2}O 2 mM (pH 8,5) (tampón TAE) a 50 V durante 6 h. La región que contenía los fragmentos de restricción dentro un intervalo de tamaño molecular de 15 a 23 kb se escindió del gel, y se dispuso en tubo de diálisis que contenía 3,0 ml de tampón TAE. El DNA se sometió a electroelución del fragmento de gel por aplicación de una intensidad de campo de 00 V/cm durante 18 h. El DNA sometido a electroelución se extrajo una sola vez con cada uno de fenol y fenol:cloroformo (1:1), y se precipitó con etanol. El DNA secado se disolvió en 5,0 \mul de agua.

El DNA cromosómico relacionado por tamaños se ligó con ramas de EMBL3 digeridas con BamHI (Promega), utilizando DNA-ligasa T4 en un volumen final de 9 \mul. la mezcla de ligación entera se empaquetó en fago lambda utilizando un kit de empaquetado comercial (Amersham), siguiendo instrucciones del fabricante.

La genoteca de DNA empaquetada se amplificó en medios sólidos: se incubaron partes alícuotas de 0,1 ml de la cepa NM539 de Escherichia coli en MgSO_{4} 10 mM (DO_{260} = 0,5) a 37ºC durante 15 min, con 15 a 25 \mul de la genoteca de DNA empaquetado. Se mezclaron muestras con 3 ml de agarosa al 0,6% que contenía 1,0% de tripticasa-peptona BBL-0,5% NaCl (agarosa superior BBL), y se extendieron las mezclas sobre placas de agarosa al 1,5% que contenían 1,0% de tripticasa-peptona BBL-0,5% de NaCl, y se incubaron a 37ºC durante 18 horas. Se añadieron a cada placa cantidades de 3 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)-8 mM de sulfato de magnesio heptahidratado-NaCl 100 mM, gelatina al 0,01% (p/v) (tampón SM), y se dejaron las placas a 4ºC durante 7 horas. El tampón SM que contenía el fago se recogió de las placas, se agrupó, y se guardó en un tubo con tampón roscado a 4ºC, con
cloroformo.

El DNA cromosómico de la cepa Q8 de M. catarrhalis se digirió con Sau3A I (0,1 unidad/30 \mug de DNA) a 37ºC durante 30 minutos y se fraccionó por tamaños en un gel de garosa de punto de fusión bajo. Fragmentos de DNA de 15-23 kb se cortaron y se sometió el DNA a electroelución durante 25 minutos en un tubo de diálisis que contenía TAE (Tris-acetato de 40 mM de pH 8,5, EDTA 2 mM) a 150 V. El DNA se extrajo una sola vez con fenol/cloroformo (1:1), se precipitó, y se resuspendió en agua. El DNA se ligó durante una noche con ramas BamHI de EMBL3 (Promega) y la mezcla de ligación se empaquetó utilizando el kit de empaquetado lambda in vitro (Stratagene) y se extendió sobre células de E. coli LE392. La genoteca se trituró y se guardó a 4ºC en presencia de cloroformo al
0,3%.

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Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la exploración de las genotecas de M. catarrhalis.

Se combinaron partes alícuotas de 10 \mul de stock de fago procedente de la muestra EMBL3/4223 preparada en el Ejemplo 3 anterior, cada una con 100 \mul de la cepa de E. coli LE392 en MgSO_{4} de 10 mM (DO_{260} = 0,5) (células de recubrimiento), y se incubaron a 37ºC durante 15 min.

Las muestras se mezclaron con 3 ml cada una de agarosa superior BBL, y las mezclas se vertieron en placas de agarosa al 1,5% que contenían 1% de bacto-triptona-0,5% extracto de bacto-levadura (LB agarosa, Difco) y se complementaron con 200 \mum de EDDA. Las placas se incubaron a 37ºC durante 18 h. Las placas se levantaron sobre filtros de nitrocelulosa (Amersham Hyvonc-extra) utilizando un protocolo estándar, y los filtros se sumergieron en seroalbúmina bovina al 5% (BSA; Boehringer) en Tris-HCl 20 mM (pH 7,5)-NaCl 150 mM (PBS) durante 30 min a la temperatura ambiente, o 4ºC durante una noche. Los filtros se incubaron durante al menos una hora a la temperatura ambiente, o 18 horas a 4ºC, en TBS que contenía una dilución 1/1.000 de antisuero TBP1 4223 de TBS- M. catarrhalis. Después de 4 lavados secuenciales de 10 min e TBS con 0,05% Tween 20 (TBS-Tween) los filtros se incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente en TBS-Tween que contenía una dilución 1/4.000 de proteína G recombinante marcada con peroxidasa de rábano picante (r proteína G; Zymed). Los filtros se lavaron como anteriormente, y se sumergieron en solución sustrato CN/DAB (Pierce). El desarrollo del color se detuvo por inmersión de los filtros en agua. Las calvas positivas se extrajeron como núcleo central de las placas, y cada una se puso en 0,5 ml de tampón SN que contenía unas cuantas gotas de cloroformo. El procedimiento de exploración se repitió dos veces más, hasta que el 100% de las calvas levantadas eran positivas utilizando el antisuero Tbp1 4223 de cobayo
anti-M. catarrhalis.

La genoteca EMBL3/Q8 se extendió sobre células LE392 en placas YT utilizando agar superior al 0,7% en YT como capa de superposición. Las calvas se levantaron sobre filtros de nitrocelulosa y los filtros se sondaron con sondas oligonucleotídicas marcadas con ^{32}P\alpha-dCPT (kit de marcación de DNA Random Primed, Boehringer Mannheim). La pre-hibridación se realizó en tampón de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) (ref. 27) a 37ºC durante una hora y la hibridación se realizó a 42ºC durante una noche. Las sondas estaban basadas en una secuencia interna de 4223 tbpA:

I R D L T R Y D P G

(Seq ID No. 31)

4236-RD 5' ATTCGAGACTTAACACGCTATGACCCTGGC 3'

(Seq ID No 32)

4237-RD 5' ATTCGTGATTTAACTCGCTATGACCCTGGT 3'

(Seq ID No 33).

Las calvas supuestas se extendieron nuevamente en placas y se sometieron a segunda y tercera tandas de exploración utilizando los mismos procedimientos. Se utilizó el clon de fago SLRD-A para subclonar los genes Tfr para análisis de la secuencia.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra análisis por inmunotransferencia de los lisados de fago utilizando antisueros Tbp1 y Tbp2 anti-M. catarrhalis 4223.

Las proteínas expresadas por los eluyentes de fago seleccionados en el Ejemplo 4 anterior se precipitaron como sigue. Se combinaron 60 \mul de cada eluyente de fago con 200 \mul de células de recubrimiento de E. coli LE392, y se incubaron a 37ºC durante 15 min. La mezcla se inoculó en 10 ml de 1,0% NZamineA-0,5% NaCl-0,1% casamino-ácidos-0,5% extracto de levadura-0,2% sulfato de magnesio heptahidratado (caldo NZCYM), se complementó con EDDA 200 mM, y se dejó crecer a 37ºC durante 18 horas, con agitación mediante sacudidas. Se añadió DNAsa a 1,0 ml del cultivo, hasta una concentración final de 50 \mug/ml, y la muestra se incubó a 37ºC durante 30 min. Se añadió ácido tricloroacético a una concentración final de 12,5%, y la mezcla se dejó sobre hielo durante 15 min. Las proteínas se sedimentaron por centrifugación a 13.000 x g durante 15 min, y el sedimento se lavó con 1,0 ml de acetona. El sedimento se secó al aire y se resuspendió en 50 \mul de 4% SDS-Tris-HCl 20 mM-(pH 8,0)-EDTA 0,2 mM (tampón de lisis).

Después de electroforesis con SDS-PAGE a través de un gel al 11,5%, las proteínas se transfirieron a filtros Immobilon-P (Millipore) a un voltaje constante de 20 V durante 18 h, en Tris-HCl 25 mM, glicina 220 mM-20% metanol (tampón de transferencia). Las membranas se bloquearon en BSA al 5% en TBS durante 30 min a la temperatura ambiente. Las transferencias se expusieron a Tbp1 de cobayo anti-M. catarrhalis 4223, o a antisuero Tbp2 de cobayo anti-M. catarrhalis 4223, diluido en relación 1/500 en TBS-Tween, durante 2 h a la temperatura ambiente. Después de 3 lavados secuenciales de 10 min en TBS-Tween, las membranas se incubaron en TBS-Tween que contenía una dilución 1/4.000 de proteína G-HRP durante 30 min a la temperatura ambiente. Las membranas se lavaron como se ha descrito arriba, y se sumergieron en solución sustrato CN/DAB. El ensayo del color se detuvo por inmersión de las transferencias en agua.

Tres clones de fago EMBL3 expresaban a la vez una proteína de 115 kDa que reaccionaba con antisuero anti-Tbp1, y una proteína de 80 kDa que reaccionaba con antisuero anti-Tbp2 en transferencias Western y se dedujo por tanto que contenían genes codificantes de las proteínas receptoras de transferrina de Moraxella catarrhalis.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la subclonación del gen de la proteína Tbp1 de M. catarrhalis 4223, tbpA.

Se prepararon cultivos de lisados en placas del fago recombinante descrito en el Ejemplo 5 por combinación de eluyente de fago y células de extensión en placa E. coli LE392, para producir lisis confluente en placas de agar LB. Se extrajo el DNA del fago de los lisados de placas utilizando un Sistema de Purificación de DNA Wizard Lambda Preps (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se encontró que el clon LM3-24 de EMBL3 contenía una inserción de 13,2 KB, flanqueada por dos sitios SalI. Se preparó una sonda para un gen tbpA y estaba constituida por un producto amplificado de 300 pares de bases generado por PCR utilizando dos iniciadores oligonucleotídicos degenerados correspondientes a una secuencia de aminoácidos de parte de la proteína Tbp1 (Figura 1). Las secuencias iniciadoras estaban basadas en las secuencias de aminoácidos NEVTGLG (SEQ ID No: 17) y GAINEIE (SEQ ID No: 18), que se había encontrado están conservadas entre las secuencias de aminoácidos deducidas de varios genes diferentes tbpA de N. meningitidis y Haemophilus influenzae. El producto amplificado se clonó en pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) y se secuenció. La secuencia de aminoácidos deducida compartía homología con otras secuencias de aminoácidos supuestas derivadas de genes tbpA de N. meningitidis y H. influenzae (Figura 12). El subclón se linealizó con NotI (New England Biolabs), y se marcó utilizando un kit de digoxigenina de marcación aleatoria (Boehringer Mannheim), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se estimó que la concentración de la sonda era 2 ng/\mul.

El DNA procedente del clon de fago se digirió con HindIII, AvrII, SalI/SphI, o SalI/AvrII, y se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al 0,8%. El DNA se transfirió a una membrana de nailon (Genescreen Plus, DuPont) utilizando un aparato de transferencia a vacío LKB VacuGene XL (Pharmacia). Después de la transferencia, el resultado de la misma se secó al aire, y se pre-hibridó en 5X SSC-N-lauroilsarcosina 0,1%-0,02% de dodecilsulfato de sodio-1,0% de reactivo de bloqueo (Boehringer Mannheim) en ácido maleico 10 mM-NaCl 15 mM (pH 7,5) (solución de pre-hibridación). La sonda marcada se añadió a la solución de pre-hibridación hasta una concentración final de 6 ng/ml, y la transferencia se incubó en la solución de sonda a 42ºC durante 18 h. La transferencia se lavó dos veces en 2X SSC-0,1% SDS, durante 5 min cada vez a la temperatura ambiente, y luego dos veces en 0,1X SSC-0,1% SDS durante 15 min cada vez a 60ºC. Después de los lavados, la membrana se equilibró en ácido maleico 100 mM-NaCl 150 mM (pH 7,5) (tampón 1) durante 1 min, y se dejó luego en reactivo de bloqueo al 1,0% (Boehringer Mannheim) en tampón 1 (tampón 2) durante 60 min, a la temperatura ambiente. La transferencia se expuso a fosfatasa alcalina anti-DIG (Boehringer Mannheim) diluida en relación 1/5.000 en tampón 2, durante 30 min a la temperatura ambiente. Después de dos lavados de 15 min en tampón 1, la transferencia se equilibró en Tris-HCl 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 50 mM (tampón 3) durante 2 min. La transferencia se humedeció con sustrato Lumigen PPD (Boehringer Mannheim), se diluyó en relación 1/100 en tampón 3, se envolvió luego en envoltura de Saran, y se expuso a película de rayos X durante 30 min. La sonda se hibridaba a un fragmento HindIII-HindIII de 3,8 kb, un fragmento AvrII-AvII de 2,0 kb, y un fragmento SalI-SphI de 4,2 kb.

Con objeto de subclonar el fragmento de 3,8 kb HindIII-HindIII en pACYC- 177, el DNA de fago del clon EMBL3, y el DNA plasmídico del vector pACYC177 (New England Biolabs) se digirieron con HindIII, y se fraccionaron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. El fragmento de DNA de fago de 3,8 kb, HindIII-HindIII, y el fragmento de 3,9 kb HindIII-HindIII pACYC177, se escindieron del gel y se purificaron utilizando un kit Geneclean (Bio 101, Inc. LaJolla, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La inserción purificada y el vector se ligaron utilizando DNA-ligasa T4 (New England Biolabs), y se transformaron en E. coli HB101 (Gibco BRL). Se utilizó un kit Qiagen Plasmid Midi (Qiagen) para extraer y purificar DNA de calidad para secuenciación a partir de uno de los transformantes resistentes a ampicilina y sensibles a kanamicina, que se encontró llevaba una inserción de 3,8 kb HindIII-HindIII. El subclón se designó pLEM3. Como se describe más adelante en el Ejemplo 7, la secuenciación subsiguiente reveló que pLEM3 contenía la primera secuencia de aproximadamente 2,0 kb de tbpA (Figuras 2 y 5).

Con objeto de subclonar el 1 kb restante del gen tbpA, se subclonó un fragmento de 1,6 kb HindIII-HindIII en pACYC177 como se ha descrito arriba, y se transformó por electroporación en E. coli HB101 (Gibco BRL). Se utilizó un kit Midi-Plasmid DNA (Qiagen) para extraer el DNA plasmídico de un transformante supuesto sensible a la kanamicina que llevaba un plásmido con una inserción HindIII-HindIII de 1,6 kb. El subclón se designó pLEM25. Como se describe en el Ejemplo 7 más adelante, la secuenciación reveló que pLEM25 contenía el 1 kb restante del gen tbpA (Figura 2 y 5).

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la subclonación del gen tbpB de M. catarrhalis 4223.

Como se ha descrito arriba, en todas las especies de Neisseriae y Haemophilus examinadas antes de la presente invención, se han encontrado genes tbpB inmediatamente aguas arriba de los genes tbpA que comparten homología con el gen tbpA de M. catarrhalis 4223. Sin embargo, la secuencia aguas arriba de M. catarrhalis 4223 no se correspondía con otras secuencias codificantes de tbpB.

Con objeto de localizar el gen tbpB dentro del clon de fago EMBL3, se realizó una transferencia Southern utilizando una sonda degenerada procedente de una región de aminoácidos altamente conservada dentro de la proteína Tbp2. Se diseñó una sonda oligonucleotidica degenerada correspondiente a la secuencia codificante de EGGFYGP (SEQ ID No: 30), que se conserva dentro de la proteína Tbp2 en una diversidad de especies de Neisseriae y Haemophilus. La sonda se marcó con digoxigenina utilizando un estuche de adición de colas oligonucleotídicas (Boehringer Mannheim), siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA del clon EMBL3 digerido con HindIII se fraccionó a través de un gel de agarosa al 0,8%, y se transfirió a una membrana de nailon Geneclean Plus como se describe en el Ejemplo 6. Después de la hibridación como se ha descrito arriba, la membrana se lavó dos veces en 2X SSC-0,1% SDS, durante 5 min cada vez a la temperatura ambiente, y luego dos veces en 0,1 X SSC-0,1% SDS durante 15 min cada vez, a 50ºC. La detección de la sonda marcada se llevó a cabo como se ha descrito arriba. La sonda se hibridaba a un fragmento NheI-SalI de 5,5 kb.

El fragmento NheI-SalI de 5,5 kb se subclonó en pBR328 como sigue. Se digirieron DNA de LEM3-24, y DNA de pBR328 con NheI-SalI, y se sometieron a electroforesis a través de agarosa al 0,8%. El fragmento NheI-SalI de 5,5 kb, y los fragmentos de 4,9 kb pBR328 NheI-SalI se escindieron del gel, y se purificaron utilizando un kit Geneclean como se describe en el Ejemplo 6. Los fragmentos se ligaron utilizando DNA-ligasa T4, y se transformaron en E coli DH5. Se utilizó un kit de DNA Midi-Plasmid (Qiagen) para extraer el DNA de un clon resistente a la ampicilina/sensible a la tetraciclina que contenía una inserción NheI-SalI de 5,5 kb. Este subclón se designó pLEM23. La secuenciación reveló que pLEM23 contenía 2 kb del gen tbpB de M. catarrhalis 4223 (Figura 2).

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra la subclonación de genes tfr de M. catarrhalis Q8.

Los genes tfr de M. catarrhalis Q8 se subclonaron como sigue. Se preparó DNA de fago a partir de placas. Resumidamente, la capa de agarosa superior de 3 placas confluentes se pasó por raspado a 9 ml de tampón SM (NaCl 0,1 M, MgSO_{4} al 0,2%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, 0,01% de gelatina) y se añadieron 100 \mul de cloroformo. La mezcla se agitó tumultuosamente durante 10 s, y se incubó luego a la temperatura ambiente durante 2 h. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación a 8.000 rpm durante 15 min a 4ºC en un rotor SS34 (Sorvall, modelo RC5C). El fago se redujo a un sedimento por centrifugación a 35.000 rpm en un rotor Ti 70.1 a 10ºC durante 2 h (Beckman, modelo L8-80) y se resuspendió en 500 \mul de tampón SM. La muestra se incubó a 4ºC durante una noche, se añadieron luego RNAsa y DNAsa a concentraciones finales de 40 \mug/ml y 10 \mug/ml respectivamente, y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 h. Se añadieron a la mezcla 10 \mul de EDTA 0,5 M y 5 \mul de SDS al 10%, y la muestra se incubó a 6ºC durante 15 min. La mezcla se extrajo dos veces con fenol/cloroformo (1:1) y dos veces con cloroformo, y el DNA se precipitó por la adición de 2,5 volúmenes de etanol absoluto.

Se generó un mapa de restricción parcial y se subclonaron fragmentos utilizando los sitios externos SalI de EMBL3 y sitios internos AvrII o EcoR I como se indica en la Figura 4. Con objeto de facilitar la subclonación, se construyó el plásmido pSKMA, que introduce un nuevo sitio de clonación múltiple en pBluescript.SK (Stratagene). Se utilizaron oligonucleótidos para introducir sitios de restricción para MstII, SfiI, y AvrII entre los sitios Sal I y HindIII de pBluescript.SK:

500

El plásmido pSLRD1 contiene un fragmento de -1,5 kb SalI-AvrII clonado en pSKMA; los plásmidos pSLRD2 y pSLRD4 contienen fragmentos de -2 kb y 4 kb AvrII-AvrII clonados en pSFQKA, respectivamente y contienen el gen tbpA completo. El plásmido pSLRD3 contiene un fragmento de \sim 2,3 kb AvrII-EcoR I clonado en pSKMA, y el plásmido SLRD5 es un fragmento de 22,7 kb EcoRI-EcoRI clonado en pSKMA. Estos dos clones contienen el gen tbpB completo (Figura 7).

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra la secuenciación de los genes Tbp de M. catarrhalis.

Ambas cadenas de los genes Tbp subclonadas de acuerdo con los Ejemplos 6 a 8 se secuenciaron utilizando un secuenciador de DNA Applied Biosystems. Las secuencias de los genes tbpA de M. catarrhalis 4223 y Q8 se muestran en las Figuras 5 y 10 respectivamente. Se comparó una secuencia de aminoácidos derivada con otras secuencias de aminoácidos TbpI, con inclusión de las de Neisseria meningitidis, Neisseriae gonorrhoeae, y Haemophilus influenzae (Figura 12). Las secuencias de los genes tbpB de M. catarrhalis 4223 y Q8 se muestran en las Figuras 6 y 11 respectivamente. Con objeto de obtener la secuencia del comienzo supuesto del gen tbpB de M. catarrhalis 4223, se obtuvieron datos de secuencia directamente del DNA del clon LEM3-24.

Esta secuencia se comprobó por exploración del clon DS-1754-1. La secuencia de los genes tbpB traducidos de M. catarrhalis 4223 y Q8 compartía homología con las secuencias de aminoácidos Tbp2 deducidas de Neisseria meningitidis, Neisseriae gonorrhoeae, y Haemophilus influenzae (Figura 13).

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la generación de un vector de expresión para producir proteína Tbp1 recombinante. El esquema de construcción se muestra en la Figura 14.

El DNA plasmídico del subclón pLEM3, preparado como se describe en el Ejemplo 6, se digirió con HindIII y BglI para generar un fragmento de 1,84 kb BglI-HindIII, que contenía aproximadamente dos tercios del gen tbpA. Se añadió BamHI al material digerido para eliminar un fragmento de vector comigrante BglI-HindIII de 1.89 kb. Adicionalmente, el DNA plasmídico del vector pT7-7 se digirió con NdeI y HindIII. Para crear el comienzo del gen tbpA, se sintetizó un oligonucleótido basado en las primeras 61 bases del gen tbpA hasta el sitio BglI; se incorporó un sitio NdeI en el extremo 5'. La inserción purificada, el vector y el oligonucleótido se ligaron utilizando ligasa T4 (New England Biolabs), y se transformaron en E. coli DH5\alpha. El DNA se purificó a partir de uno de los transformantes de 4,4B resistentes a la ampicilina que contenían sitios de restricción correctos pLEM27).

El DNA purificado de pLEM27 se digirió con HindIII, se ligó al fragmento de inserción de 1,6 kb HindIII-HindIII de pLEM25 preparado como se describe en el Ejemplo 6, y se transformó en E. coli DH5\alpha. Se purificó el DNA de un transformante resistente a la ampicilina que contenía los sitios de restricción correctos (pLEM29), y se transformó por electroporación en BL21 (DE3) (Novagen, Madison, WI) para producir E. coli pLEM29B-1.

Se utilizó una sola colonia transformada y aislada para inocular 100 ml de caldo YT que contenían 100 \mug/ml de ampicilina, y el cultivo se dejó crecer a 37ºC durante una noche, agitando con sacudidas a 200 rpm. Se inocularon 200 \mul del cultivo nocturno en 10 ml de caldo YT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, y el cultivo se dejó crecer a 37ºC hasta una DO_{578} de 0,35. El cultivo se introdujo por la adición de 30 \mul de IPTG 100 mM, y el cultivo se dejó crecer a 37ºC durante 3 horas más. Se retiró 1 ml del cultivo en el momento de la inducción (t = 0), y a t = 1 hora y t = 3 horas. Se redujeron a un sedimento muestras de 1 ml por centrifugación, y se resuspendieron en 4% SDS-Tris.Cl 20 mM, pH 8-EDTA 200 \muM (tampón de lisis). Las muestras se fraccionaron en un gel de SDS-PAGE al 11,5%, y se transfirieron a filtros Immobilon (Amersham). Las transferencias se desarrollaron utilizando antisuero anti-Tbp1 (M. catarrhalis 4223), diluido en relación 1:1.000, como el anticuerpo primario, y rproteína G conjugada con peroxidasa de rábano picante (Zymed) como el anticuerpo secundario. Se utilizó para detección un sustrato quimioluminiscente (Lumiglo; Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Las proteínas recombinantes inducidas eran visibles en los geles teñidos con Coomassie (Fig. 15). El antisuero anti-Tbp1 (4223) reconocía las proteínas recombinantes en transferencias Western.

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra la extracción y purificación de Tbp1 recombinante de M. catarrhalis 4223.

La proteína Tbp1 recombinante, que está contenida en cuerpos de inclusión, se purificó a partir de células E. coli que expresaban el gen tbpA (Ejemplo 10), por un procedimiento como se muestra en la Figura 16. Las células de E. coli procedentes de un cultivo de 500 ml, preparadas como se describe en el Ejemplo 10, se resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 0,1 mM y AEBSF 5 mM (inhibidor de proteasa), y se disgregaron por tratamiento con ultrasonidos (3 x 10 min, ciclo de severidad 70%). El extracto se centrifugó a 20.000 x g durante 30 min y el sobrenadante resultante que contenía > 85% de las proteínas solubles de E. coli se desechó.

El sedimento remanente (Figura 16, PPT_{1}) se extrajo ulteriormente en 50 ml de Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía 0,5% de Triton X-100 y EDTA 10 mM. Después de centrifugación a 20.000 x g durante 30 min, el sobrenadante que contenía las proteínas solubles residuales y la mayoría de las proteínas de membrana se desechó.

El sedimento remanente (Figura 16, PPT_{2}) se extrajo ulteriormente en 50 ml de Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía urea 2 M y ditiotreitol (DTT) 5 mM. Después de centrifugación a 20.000 x g durante 30 min, el sedimento resultante (Figura 16, PPT_{3}) obtenido después de la extracción anterior contenía los cuerpos de inclusión purificados.

La proteína Tbp1 se solubilizó a partir de PPT_{3} en Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía hidrocloruro de guanidina 6 M y DTT 5 mM. Después de centrifugación, el sobrenadante resultante se purificó ulteriormente en una columna de filtración con gel Superdex 200 equilibrada en Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía hidrocloruro de guanidina 2 M y DTT 5 mM. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y se agruparon aquéllas que contenían Tbp1 purificada. Se añadió Triton X-100 a la fracción agrupada Tbp1 hasta una concentración final de 0,1%. La fracción se dializó luego durante una noche a 4ºC contra Tris 50 mM, pH 8,0 y se centrifugó luego a 20.000 x g durante 30 min. La proteína se mantenía soluble en estas condiciones y la Tbp1 purificada se guardó a -20ºC. El procedimiento de purificación que se muestra en la Figura 16 produjo proteína Tbp1 que tenía al menos una pureza de 70% como se determinó por análisis SDS-PAGE (Figura 17).

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Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra la construcción de un plásmido de expresión para rTbp2 de M. catarrhalis 4223 sin una secuencia conductora.

El esquema de construcción para el plásmido que expresaba rTbp2 se muestra en la Figura 18. Se utilizaron oligonucleótidos para construir los primeros aproximadamente 58 pb del gen tbpB de M. catarrhalis 4223 codificante de la proteína madura. Se incorporó un sitio NdeI en el extremo 5' de los oligonucleótidos:

501

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502

Un fragmento NheI-ClaI, que contenía aproximadamente 1 kb del gen tbpB de pLEM23, preparada como se describe en el Ejemplo 7, se ligó a los oligonucleótidos anteriores y se insertó en pT7-7 cortado con NdeI-ClaI, generando pLEM31, que contiene por tanto la mitad 5' de tbpB. Se utilizaron también oligonucleótidos para construir los últimos aproximadamente 104 pb del gen tbpB, desde el sitio AvaI hasta el final del gen. Se incorporó un sitio BamHI en el extremo 3' de los oligonucleótidos:

3

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4

Un fragmento ClaI-AvaII de pLEM23, que contenía aproximadamente 0,9 kb del extremo 3' del gen tbpB, se ligó a los oligonucleótidos AvaII-BamHI y se insertó en pT7-7 cortado con ClaII-BamHI, generando pLEM32. La inserción de 1,0 kb NdeI-ClaI de pLEM31 y la inserción de 1,0 kb ClaI-BamHI de pLEM32 se insertaron luego en pT7-7 cortado con NdeI-BamHI, generando pLEM33 que tiene un gen tbpB de longitud total bajo la dirección del promotor T7.

Se purificó DNA a partir de pLEM33 y se transformó por electroporación en células electrocompetentes BL21 (DE3) (Novagen; Madison, WI), para generar la cepa pLEM33B-1. La cepa pLEM33B-1 se dejó crecer, y se indujo utilizando IPTG, como se ha descrito arriba en el Ejemplo 10. Las proteínas expresadas se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas adecuadas para inmunotransferencia. Se desarrollaron las transferencias utilizando antisuero Tbp2 anti-4223, diluido en relación 1:4.000, como el anticuerpo primario, y rproteína G conjugada con peroxidasa de rábano picante (Zymed) como el anticuerpo secundario. Se utilizó para la detección un sustrato quimioluminiscente (Lumiglo; Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Las proteínas recombinantes inducidas eran visibles en los geles teñidos con azul Coomassie (Fig. 19). El antisuero Tbp2 anti-4223 reconocía las proteínas recombinantes en transferencias Western.

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra la generación de un plásmido de expresión para rTbp2 de M. catarrhalis 4223 con una secuencia conductora.

El esquema de construcción se muestra en la Figura 18. Los oligonucleótidos que contenían la secuencia conductora natural del gen tbpB de M. catarrhalis 4223 se utilizaron para construir los primeros aproximadamente 115 pares de bases del gen tbpB hasta el sitio NheI. Se incorporó un sitio NdeI en el extremo 5' de los oligonucleótidos:

5

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6

Los oligonucleótidos NdeI-NheI se ligaron a pLEM33 cortado con NdeI-NheI, generando pLEM37, que contiene así un gen tbpB 4223 de longitud total codificante de la proteína Tbp2 con su secuencia conductora, impulsada por el promotor T7.

El DNA de pLEM37 se purificó y se transformó por electroporación en células electrocompetentes BL21 (DE3) (Novagen, Madison, WI) para generar la cepa pLEM37B-2. Se dejó crecer pLM37B-2, y se indujo utilizando IPTG, como se ha descrito arriba en el Ejemplo 10. Las proteínas expresadas se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas adecuadas para inmunotransferencia. Las transferencias se desarrollaron utilizando antisuero Tbp2 anti-4223, diluido en relación 1:4.000, como el anticuerpo primario, y rproteína G conjugada con peroxidasa de rábano picante (Zymed) como el anticuerpo secundario. Se utilizó para detección un sustrato quimioluminiscente (Lumiglo; Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Las proteínas recombinantes inducidas eran visibles en geles teñidos con azul Coomassie (Fig. 21).

El antisuero Tbp2 anti-4223 reconocía las proteínas recombinantes en transferencias Western.

Ejemplo 14

Este ejemplo ilustra la construcción de un plásmido de expresión para rTbp2 de M. catarrhalis Q8 sin una secuencia conductora.

El esquema de construcción para rTbp2 se muestra en la Figura 20. El extremo 5' del gen tbpB de M. catarrhalis Q8 se amplificó por PCR desde el codón Cys^{1} de la proteína madura hasta el sitio de restricción Bam I. Se introdujo un sitio de restricción NdeI en el extremo 5', para clonación final en pT7-7, y el fragmento PCR final tenía una longitud de 238 pb. Los iniciadores PCR se indican a continuación:

503

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504

El gen tbpB Q8 se subclonó en dos fragmentos contenidos en los plásmidos SLRD3 y SLRD5, preparados como se describe en el Ejemplo 8. Se construyó el plásmido SLRD3-5 que contenía el gen tbpB de longitud total por digestión de SLRD5 con EcoR I y DraI, que libera el extremo 3' de tbpB, e inserción de este fragmento de - 619 pb en SLRD3 que se había digerido con EcoR I y SmaI. El fragmento de 1,85 kb BsmI-BamH I de SLRD3-5 se ligó con el fragmento PCR de 238 pb y se insertó en pT7-7 que se había digerido con NdeI y BamH I, generando el plásmido SLRD35B. Este plásmido contiene por tanto el gen tbpB de longitud total sin su secuencia conductora, bajo la dirección del promotor T7. El DNA de SLRD35B se purificó y se transformó por electroporación en células electrocompetentes BL21 (DE3) para generar la cepa SLRD35BD que se dejó crecer y se indujo utilizando IPTG, como se ha descrito arriba en el Ejemplo 10. Las proteínas expresadas se resolvieron por SDS-PAGE y la proteína Tbp2 inducida era claramente visible por tinción con azul Coomassie (Fig. 19).

Ejemplo 15

Este ejemplo ilustra la generación de un plásmido de expresión para rTbp2 de M. catarrhalis Q8 con una secuencia conductora.

El esquema de construcción para el rTbp2 se muestra en la Figura 20. El extremo 5' del gen tbpB Q8 se amplificó por PCR desde el codón inicial ATG hasta el sitio de restricción Bsm I. Se incorporó por ingeniería genética un sitio Nde I en el extremo 5', para facilitar la clonación en el vector de expresión pT7-7, y el fragmento PCR final tenía una longitud de 295 pb. Los iniciadores PCR se indican a continuación:

505

Se digirió SLRD3-5 (Ejemplo 14) con BsmI y BamH I, generando un fragmento de 1,85 kb, que se ligó con el fragmento PCR de 295 pb y se ligó a pT7-7 que se había digerido con Nde I y BamH I. El plásmido resultante SLRD35A contiene por tanto el gen tbpB Q8 de longitud total con su secuencia conductora endógena bajo el control del promotor T7. Se purificó DNA de SLRD35A y se transformó por electroporación en células electrocompetentes BL21 (DE3) para generar la cepa SLRD35AD que se dejó crecer y se indujo utilizando IPTG, como se ha descrito arriba en el Ejemplo 10. Las proteínas expresadas se resolvieron por SDS-PAGE y la proteína Tbp2 inducida era claramente visible por tinción con azul Coomassie (Figura 19).

Ejemplo 16

Este ejemplo ilustra la extracción y purificación de rTbp2 de M. catarrhalis 4223 y Q8 de E. coli.

Los transformantes pLEM37B (4223) y SLRD 35AD (Q8) se dejaron crecer para producir Tbp2 en cuerpos de inclusión y a continuación se purificó Tbp2 de acuerdo con el esquema de la Figura 22. Las células E. coli de un cultivo de 500 ml se resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía AEBSF 5 mM (inhibidor de proteasa), y se disgregaron por tratamiento con ultrasonidos (3 x 10 min), ciclo de 70% de severidad). El extracto se centrifugó a 20.000 x g durante 30 min y el sobrenadante resultante que contenía > 95% de las proteínas solubles de E. coli se desechó.

El sedimento remanente (PPT_{1}) se extrajo ulteriormente en 50 ml de Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía 0,5% de Triton X-100 y EDTA 10 mM. La mezcla se agitó a 4ºC durante al menos 2 horas y se centrifugó luego a 20.000 x g durante 30 min, después de lo cual el sobrenadante que contenía las proteínas solubles residuales y la mayoría de las proteínas de membrana se desechó.

El sedimento resultante (PPT_{2}) obtenido después de la extracción anterior contenía los cuerpos de inclusión. La proteína Tbp2 se solubilizó en Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina 6 M y DTT 5 mM. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultante se purificó ulteriormente en una columna de filtración con gel Superdex 200, equilibrada en Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina 2 M y DTT 5 mM. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y aquéllas que contenían Tbp2 purificada se agruparon. Se añadió Triton X-100 a la fracción Tbp2 agrupada hasta una concentración final de 0,1%. La fracción se dializó luego durante una noche a 4ºC con PBS, y se centrifugó después a 20.000 x g durante 30 min. La proteína se mantenía soluble en estas condiciones y la Tbp2 purificada se guardó a -20ºC. La Figura 22 muestra el análisis SDS-PAGE de las fracciones del proceso de purificación para rTbp2 de la cepa 4223 (panel A) y la cepa Q8 (panel B). La rTbp2 tenía una pureza de al menos 70%.

Se inyectaron grupos de cinco ratones Balb/c 3 veces subcutáneamente (s.c.) los días 1, 29 y 43 con rTbp2 purificado (0,3 mg a 10 mg) de las cepas 4223 y Q8 de M. catarrhalis en presencia o ausencia de AlPO_{4} (1,5 mg por dosis). Se tomaron muestras de sangre los días 14, 28, 42 y 56 para análisis de los títulos de anticuerpos anti-rTbp2 por EIAs.

Grupos de dos conejos y dos cobayos (Charles Rives, Quebec) se inmunizaron intramuscularmente (i.m.) el día 1 con una dosis de 5 mg de proteína rTbp2 purificada emulsionada en adyuvante completo de Freund (CFA). Los animales se reforzaron los días 14 y 29 con la misma dosis de proteína emulsionada en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Se tomaron muestras de sangre el día 42 para analizar los títulos de anticuerpos anti-rTbp2 y la actividad bactericida. La Tabla 2 siguiente muestra la actividad bactericida de los anticuerpos generados para las proteínas de fijación de transferrina recombinantes rTbp1 (4223), rTbp2 (4223) y rTbp2 (Q8), preparadas como se describe en estos ejemplos, contra las cepas 4223 y Q8 de M. catarrhalis.

Ejemplo 17

Este ejemplo ilustra la fijación de Tbp2 a transferrina humana in vitro.

Se evaluó la actividad de fijación de transferrina de Tbp2 de acuerdo con los procedimientos de Schryvers y Lee (ref. 28) con modificaciones. Resumidamente, se sometió rTbp2 purificada a electroforesis discontinua a través de geles de SDS-PAGE al 12,5%. Las proteínas se transfirieron por electroforesis a membrana de PVDF y se incubaron con transferrina humana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP-transferrina humana, dilución 1:50) (Jackson ImmunoResearch Labs Inc., Mississauga, Ontario) a 4ºC durante una noche. Se utilizó sustrato LumiGLO (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) para detección quimioluminiscente de la actividad de HRP de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tanto 4223 rTbp2 como Q8 rTbp2 se fijan a la transferrina humana en estas condiciones, como se muestra en la Figura 24.

Ejemplo 18

Este ejemplo ilustra la conservación antigénica de Tbp2 contra cepas de M. catarrhalis.

Se separaron por SDS-PAGE lisados de células enteras de cepas de M. catarrhalis y cepas de E. coli que expresaban proteínas Tbp2 recombinantes y se transfirieron por electroforesis a membrana de PVDF. Se utilizaron antisueros de cobayo anti-4223 rTbp2 o anti-Q8 rTbp2 como primer anticuerpo y se utilizó anticuerpo de cabra anti-cobayo conjugado con fosfatasa alcalina como segundo anticuerpo para detectar Tbp2. Se ensayaron las cepas de M. catarrhalis 3, 56, 135, 585, 4223, 5191, 8185 y ATCC 25240 y todas ellas exhibían reactividad específica con el anticuerpo anti-4223 rTbp2 o el anticuerpo anti-Q8 rTbp2 (Figura 25).

La Tabla 3 ilustra la capacidad de los anticuerpos anti-rTbp2 procedentes de una cepa de M. catarrhalis para reconocer proteína nativa o recombinante de una cepa homóloga o heteróloga de M. catarrhalis.

Ejemplo 19

Este ejemplo ilustra la amplificación por PCR del gen tbpB de la cepa R1 de M. catarrhalis y la caracterización del gen tbpB R1 amplificado.

Se preparó DNA cromosómico de la cepa R1 de M. catarrhalis utilizando técnicas estándar. El diseño del iniciador oligonucleotídico de sentido se basó en una región situada aproximadamente 274 bases aguas arriba del gen tbpB de M. catarrhalis 4223, y el iniciador antisentido se basó en una región situada aproximadamente 11 bases aguas abajo del final de tbpB 4223. Se utilizaron los iniciadores siguientes:

506

Cada tubo de reacción contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,85), KCl 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM, MgSO_{4} 2 mM, dNTPs 800 mM, 1,0 mg de cada uno de los iniciadores 4940 y 4967, 10 ng de DNA R1, y 2,5 U de DNA-polimerasa Pwo (Boehringer Mannheim) en un volumen total de 100 \mul. El termociclador se programó durante 5 minutos a 95ºC, seguido por 25 ciclos de 95ºC durante 30 s, 50ºC durante 45 s, y 72ºC durante 2 min, y una prolongación final de 10 min a 72ºC. El producto amplificado se purificó utilizando un Geneclean (BIO 101) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se secuenció.

Un mapa de restricción parcial de tbpB de la cepa R1 de M. catarrhalis preparado como acaba de describirse se muestra en la Figura 26. Las secuencias de nucleótidos y la de aminoácidos deducida del gen tbpB de R1 amplificado por PCR se muestran en la Figura 27. El gen tbpB R^{1} codifica una proteína de 714 aminoácidos con un peso molecular de 76,8 kDa. La secuencia conductora de la proteína Tbp2 de R1 es idéntica a la de las proteínas Tbp2 de 4223 y Q8. Cuando la secuencia Tbp2 de R1 deducida se alineó con la secuencia Tbp2 de 4223, se encontró que era idéntica en un 83% y homóloga en un 88% (Fig. 28). El epítope conservado LEGGFYG (SEQ ID No: 50) estaba presente, como se encontró en Tbp2 de otras cepas de M. catarrhalis así como en las proteínas Tbp2 de H. influenzae y N. meningitidis.

TABLA I

7

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TABLA II

8

TABLA III

9

Referencias

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<110> Myers, Lisa E.

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Schryvres, Anthony B.

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Harkness, Robin E.

\hskip1cm

Loosmore, Sheena M.

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Du, Run-Pan

\hskip1cm

Yang, Yan-Ping

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Klein, Michel H.

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<120> GENES RECEPTORES DE TRANSFERRINA DE MORAXELLA

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<130> 1038-833 MIS

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<140> 09/142,628

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<141> 1998-09-03

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<150> 08/613,009

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<151> 1996-03-08

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<150> 08/778,570

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<151> 1997-01-03

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<150> PCT/CA97/00163

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<151> 1997-03-07

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<160> 50

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 3438

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<212> DNA

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 1

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10

11

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<210> 2

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<211> 3222

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<212> DNA

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 2

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12

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<210> 3

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<211> 2247

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<212> DNA

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 3

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13

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<210> 4

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<211> 2106

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<212> DNA

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 4

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14

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<210> 5

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<211> 3660

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<212> DNA

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 5

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15

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<210> 6

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<211> 3210

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<212> DNA

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 6

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16

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<210> 7

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<211> 3435

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<212> DNA

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 7

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17

18

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<210> 8

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<211> 2127

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<212> DNA

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 8

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19

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<210> 9

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<211> 1074

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 1053

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 10

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24

25

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 702

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 682

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1070

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 709

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 689

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatcaatcaa aacaaaacaa caaatccaaa aaatccaaac aagtattaaa acttagtgcc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaacacattc ctttaaccac actgtgtgtg gcaatctctg ccgtcttatt aaccgct

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 912

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

48

49

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 908

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 911

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

55

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 915

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 657

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 601

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

64

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 711

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

67

68

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 708

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

70

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attcgagact taacacgcta tgaccctggc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attcgtgatt taactcgcta tgaccctggt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgacggtat cgatggcctt aggggcctag ga

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccatagcta ccggaatccc cggatccttc ga

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgtgtggt ggcagtggtg gttcaaatcc acctgctcct acgcccattc caaatg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacaccacc gtcaccacca agtttaggtg gacgaggatg cgggtaaggt ttacgatc

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaattccata tgtgtggtgg gagctctggt ggtttcaatc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccatggcag gttcttgaat gcctgaaact

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaattccata tgaaacacat tcctttaacc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2287

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 713

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

84

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatataagca cgccctactt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccatcagcc aaacaaacat tgtgt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

86

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico purificada y aislada que codifica una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella.

2. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual la proteína receptora de transferrina es la proteína 1 de fijación de transferrina (Tbp1) de la cepa de Moraxella.

3. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la proteína receptora de transferrina es la proteína 2 de fijación de transferrina (Tbp2) de la cepa de Moraxella.

4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual la cepa de Moraxella es una cepa de Moraxella catarrhalis.

5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, en la cual la cepa de Moraxella catarrhalis es Moraxella catarrhalis 4223, Q8 o R1.

6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una secuencia de DNA seleccionada del grupo constituido por:

(a): una secuencia de DNA como se representa en Figura 5, 6, 10, 11 ó 27 (SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45 ó 46) o la secuencia de DNA complementaria de la misma;

(b): una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos como se representa en Figura 5, 6, 10, 11 ó 27 (SEQ ID Nos: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 47) o la secuencia de DNA complementaria de la misma; y

(c): una secuencia de DNA que codifica una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella que se hibrida en condiciones severas a una cualquiera de las secuencias de DNA definidas en (a) o (b).

7. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, en la cual la secuencia de DNA definida en (c) tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias de DNA definidas en (a)
o (b).

8. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en la cual la secuencia de DNA definida en (c) es la que codifica la proteína receptora de transferrina equivalente de otra cepa de Moraxella.

9. Un vector adaptado para transformación de un hospedador, conteniendo dicho vector la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. El vector de acuerdo con la reivindicación 9 caracterizado adicionalmente por medios de expresión acoplados operativamente a la molécula de ácido nucleico para expresión por el hospedador de dicha proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella.

11. El vector de la reivindicación 10 que es un plásmido seleccionado del grupo constituido por pLEM-29 (Depósito ATCC No. 97.461), pLEM-37 (Depósito ATCC No. 97.834), y SLRD35-A (Depósito ATCC No. 97.833).

12. Una célula hospedadora transformada que contiene un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

13. Un método de formación de una proteína receptora de transferrina recombinante sustancialmente pura de una cepa de Moraxella caracterizado por:

: cultivar el hospedador transformado de la reivindicación 12 para expresar una proteína receptora de transferrina como cuerpos de inclusión,

: purificar los cuerpos de inclusión liberándolos de material celular y proteínas solubles, solubilizar la proteína receptora de transferrina de los cuerpos de inclusión purificados, y

: purificar la proteína receptora de transferrina liberándola de otros materiales solubilizados.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el cual dicha proteína receptora de transferrina es Tbp1 sola, Tbp2 sola o una mezcla de Tbp1 y Tbp2.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en el cual dicha proteína receptora de transferrina tiene una pureza de al menos 70%.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual dicha proteína receptora de transferrina tiene una pureza de al menos 90%.

17. Una composición inmunógena, caracterizada por al menos un componente activo seleccionado del grupo constituido por:

(A): una molécula de ácido nucleico purificada y aislada que codifica una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella;

(B): una molécula de ácido nucleico purificada y aislada que codifica una proteína receptora de transferrina de Moraxella y que tiene una secuencia de DNA seleccionada del grupo constituido por:

(c): una secuencia de DNA que codifica una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella que se hibrida en condiciones severas a una cualquiera de las secuencias de DNA definidas en (a) o (b);

: y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma, produciendo dicho al menos un componente activo una respuesta inmune cuando se administra a un hospedador.

18. Un método de determinación de la presencia, en una muestra, de ácido nucleico codificante de una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella, caracterizado por los pasos de:

(a): poner en contacto la muestra con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para producir dúplex que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico codificante de la proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella presente en la muestra e hibridable específicamente con la misma; y

(b): determinar la producción de los dúplex.

19. Un kit de diagnóstico para determinar la presencia, en una muestra, de ácido nucleico codificante de una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella, caracterizado por:

(a): la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8:

(b): medios para poner en contacto la molécula de ácido nucleico con la muestra a fin de producir dúplex que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquiera de dichos ácidos nucleicos presentes en la muestra e hibridables con la molécula de ácido nucleico; y

(c): medios para determinar la producción de los dúplex.