BR112020010790A2

BR112020010790A2 - purificação da saponina

Info

Publication number: BR112020010790A2
Application number: BR112020010790-5A
Authority: BR
Inventors: Ahmad Taimour BAIG; Felicie Georgette Colette Denet; Juan Jose Diaz Garcia; Chad Austin FARRENBURG; Lora Lea LAWRENCE; Kent Raymond MYERS; Jeri Kay SANDVICK; Jeb Yeatts VANDENBURG
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2020-11-10
Also published as: EP3717001A1; CL2020001440A1; MX2020005481A; US20230272000A1; US20200317719A1; CA3083078A1; WO2019106192A1; JP2021504424A; US11591364B2; JP2024001012A; CN111670044A

Abstract

A presente invenção refere-se aos extratos de saponina contendo pelo menos 93% de pico principal de QS-21 e 0,25-3% de componente 2018 por absorbância UV a 214 nm, métodos para preparar os ditos extratos, seu uso como adjuvantes de vacina e aspectos relacionados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PURIFICAÇÃO DA SAPONINA". Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se, em geral, aos extratos de saponina, em particular extratos de Quillaja saponaria Molina, métodos para a sua fabricação e a aspectos associados. Antecedentes

[002] Os adjuvantes são incluídos nas vacinas para melhorar as respostas imunológicas humorais e celulares, particularmente no caso das vacinas de subunidades deficientemente imunogênicas. Semelhantes às infecções naturais por patógenos, os adjuvantes valem-se da ativação do sistema imunológico inato para promover uma imunidade adaptativa duradoura.

[003] O Adjuvant System 01 (AS01) é um adjuvante à base de lipossoma que contém dois imunoestimulantes, o 3-O-desacil-4'- monofosforil lipídio A (3D-MPL) e o QS-21 (Garcon e Van Mechelen, 2011; Didierlaurent et al. 2017). O 3D-MPL é um derivado não tóxico do lipopolissacarídeo de Salmonella minnesota, que é um agonista do TLR4, e o QS-21 é um extrato natural de saponina da casca da árvore sul-americana Quillaja saponaria Molina (Kensil et al., 1991; Ragupathi et al., 2011). O AS01 está incluído nas vacinas recentemente desenvolvidas para malária (RTS,S - Mosquirix®) e Herpes zoster (HZ/su - Shingrix®), e em múltiplas vacinas candidatas em desenvolvimento contra patógenos como o vírus da imunodeficiência humana e a Mycobacterium tuberculosis.

[004] A injeção de AS01 resulta na ativação rápida e temporária da imunidade inata em modelos animais. Os neutrófilos e os monócitos são rapidamente recrutados para o linfonodo de drenagem (dLN) após a imunização. Além disso, o AS01 induz o recrutamento e a ativação das células dendríticas (DC) MHCIIhigh, que são necessárias para a ativação das células T (Didierlaurent A.M. et al., 2014). Alguns dados também estão disponíveis sobre o mecanismo de ação dos componentes do AS01. Os sinais de 3D-MPL por meio do TLR4, estimulando a atividade transcricional do NF-ĸB e a produção de citocinas, ativam diretamente as células apresentadoras de antígenos (APCs), tanto em humanos quanto em camundongos (De Becker et al., 2000; Ismaili et al., 2002; Martin et al. al., 2003; Mata-Haro et al., 2007). O QS-21 promove altas respostas de anticorpos específicos para antígenos e respostas de células T CD8+ em camundongos (Kensil e Kammer, 1998; Newman et al., 1992; Soltysik et al., 1995) e respostas de anticorpos específicos para antígenos em seres humanos (Livingston et al., 1994). Devido às suas propriedades físicas, acredita-se que o QS- 21 possa atuar como um sinal de perigo in vivo (Lambrecht et al., 2009; Li et al., 2008). Embora tenha sido mostrado que o QS-21 ativa o inflamassoma ASC-NLRP3 e a subsequente liberação de IL-1β/IL-18 (Marty-Roix, R. et al., 2016), as vias moleculares exatas envolvidas no efeito adjuvante das saponinas ainda têm de ser claramente definidas.

[005] Como com qualquer componente de um produto que seja aprovado como um medicamento humano, a produção de QS-21 requer o uso de processos de fabricação aprovados e um controle cuidadoso da composição final para garantir que atenda à especificação exigida. A modificação dos processos existentes requer uma revalidação dispendiosa e demorada, porém os desvios da especificação também resultam em desperdício. Há uma necessidade contínua por métodos eficazes para a fabricação de QS-21 e pelo material QS-21 de composição definida. Sumário da Invenção

[006] A presente invenção proporciona um extrato de saponina contendo pelo menos 93% de pico principal de QS-21 e 0,25-3% de componente 2018, por absorbância UV a 214 nm.

[007] Também é proporcionado um extrato de saponina contendo pelo menos 93%, por absorbância UV a 214 nm, de glicosídeos triterpenoides tendo, por espectrometria de massa por eletropulverização de íons negativos, uma m/z de 1855,9, 1987,9 ou 2001,9 e 0,25-3%, por absorbância UV a 214 nm, de glicosídeos triterpenoides, tendo uma m/z de 2017.9.

[008] Além disso, é proporcionado um extrato de saponina contendo pelo menos 93% de: , ,

ou , e 0,25-3% de:

O O O O O OH O OH OH O HO O O HO O O HO O O OH HO O HO O OH H O OH O O O OHOH HO OH O O HO O O HO OH OH OH OH HO HO

OH por absorbância UV a 214 nm.

[009] Além disso, é proporcionado um método para a fabricação de um extrato de saponina, compreendendo as etapas de: selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada;

purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno; e purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila.

[0010] É proporcionado o uso de um extrato de saponina da presente invenção na fabricação de um medicamento.

[0011] Também são proporcionadas composições de adjuvantes e composições de vacinas compreendendo um extrato de saponina da presente invenção. Breve Descrição das Figuras

[0012] Figura 1 Cromatograma de HPLC de um extrato aquoso bruto da casca de Quillaja saponaria Molina

[0013] Figura 2 Cromatograma de HPLC-UV de um extrato aquoso bruto da casca de Quillaja saponaria Molina

[0014] Figura 3 Cromatograma de UPLC-UV de um extrato aquoso bruto da casca de Quillaja saponaria Molina

[0015] Figura 4 Cromatograma de UPLC-UV de um extrato de saponina purificado por poliestireno

[0016] Figura 5 Cromatograma de UPLC-UV/MS de um extrato de saponina Quillaja saponaria Molina purificado

[0017] Figura 6 Detalhe do cromatograma de UPLC-UV/MS de um extrato de saponina Quillaja saponaria Molina purificado

[0018] Figura 7 Cromatogramas de massa extraídos para os íons de peso molecular de 1988 e 2002 de um extrato de saponina Quillaja saponaria Molina purificado

[0019] Figura 8 Espectro de centroides combinados do extrato de saponina Quillaja saponaria Molina purificado

[0020] Figura 9 Respostas das células T CD4 no dia 21 em camundongos vacinados com gE AS01

[0021] Figura 10 Respostas dos anticorpos no dia 21 em camundongos vacinados com gE AS01

[0022] Figura 11 Respostas dos anticorpos no dia 28 em camundongos vacinados com gE AS01 Breve Descrição dos Identificadores de Sequências

[0023] SEQ ID Nº. 1: sequência de polipeptídeos de RTS

[0024] SEQ ID Nº. 2: sequência de polipeptídeos de Rv1196 da cepa de M. tuberculosis H37Rv

[0025] SEQ ID Nº. 3: sequência de polipeptídeos de Rv0125 da cepa de M. tuberculosis H37Rv

[0026] SEQ ID Nº. 4: sequência de polipeptídeos da fusão M72

[0027] SEQ ID Nº. 5: sequência de polipeptídeos da fusão M72-2his

[0028] SEQ ID Nº. 6: sequência de polipeptídeos de gE truncada do vírus varicela zoster

[0029] SEQ ID Nº. 7: Sequência de polipeptídeo do antígeno de PreF do RSV com restrição conformacional

[0030] SEQ ID Nº. 8: sequência de polipeptídeos do TV1 gp120 do HIV

[0031] SEQ ID Nº. 9: sequência de polipeptídeos do 1086.C gp120 do HIV Descrição Detalhada da Invenção

[0032] Como mencionado anteriormente, qualquer componente de um produto que seja autorizado como um medicamento humano requer o uso de processos de fabricação aprovados e um controle cuidadoso da composição final, para garantir que atenda à especificação exigida. Os desvios da especificação resultam em desperdício. No entanto, a investigação de segurança e eficácia vale-se do teste de composições definidas, portanto, a adaptação das especificações dos componentes apresenta riscos. A modificação dos processos existentes requer uma revalidação dispendiosa e demorada.

[0033] Os presentes inventores descobriram que o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina varia na composição, em particular no que diz respeito a um componente referido neste documento como o componente 2018, e que é difícil separar o componente 2018 em excesso aplicando os processos de fabricação aprovados existentes. Consequentemente, a presente invenção proporciona métodos para obter um extrato purificado consistente pelo uso de um extrato aquoso bruto de uma composição definida.

[0034] A presente invenção proporciona um extrato de saponina contendo pelo menos 93% de pico principal de QS-21 e 0,25-3% de componente 2018, por absorbância UV a 214 nm, em particular, em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9. Adequadamente, o extrato de saponina contém pelo menos 98% do grupo QS-21, por absorbância UV a 214 nm. Tipicamente, o extrato de saponina contém 1% ou menos da impureza de lio, especialmente 1% ou menos do maior pico fora do grupo QS-21, por absorbância UV a 214 nm.

[0035] De particular interesse são os extratos de saponina que contêm pelo menos 98% do grupo QS-21, pelo menos 93% do pico principal de QS-21, 0,25-3% do componente 2018, 1% ou menos do maior pico fora do grupo QS-21, por absorbância UV a 214 nm, e em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9.

[0036] Também é proporcionado um extrato de saponina contendo pelo menos 93% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1855,9, 1987,9 ou 2001,9 e 0,25-3% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 2017,9, por absorção UV a 214 nm, em particular, em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9. Desejavelmente, o extrato de saponina contém pelo menos 93% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1855,9, 1987,9 ou 2001,9, excluindo o isômero B e a impureza de lio, e 0,25-3% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 2017,9, por absorbância UV a 214 nm, em particular, em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9. Adequadamente, o extrato de saponina contém pelo menos 98% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1517,7, 1711,8, 1855,9, 1987,9, 2001,9, 2017,9 ou 2118, por absorbância UV a 214 nm. Desejavelmente, o extrato de saponina contém pelo menos 98% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1517,7, 1711,8, 1855,9, 1987,9, 2001,9, 2017,9 ou 2118, excluindo a impureza de lio, por absorbância UV a 214 nm. Tipicamente, o extrato de saponina contém 1% ou menos de impureza de lio, por absorbância UV a 214 nm. Adequadamente, o extrato de saponina contém 1% ou menos de qualquer outro pico por absorbância UV a 214 nm.

[0037] De particular interesse são os extratos de saponina contendo pelo menos 98% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1517,7, 1711,8, 1855,9, 1987,9, 2001,9, 2017,9 ou 2118, pelo menos 93% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1855,9, 1987,9 ou 2001,9, 0,25- 3% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 2017,9, 1% ou menos de qualquer outro pico por absorbância UV a 214 nm e em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9, especialmente em que o extrato de saponina contém pelo menos 98% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1517,7, 1711,8, 1855,9, 1987,9, 2001,9, 2017,9 ou 2118, excluindo a impureza de lio, e pelo menos 93% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1855,9, 1987,9 ou 2001,9, excluindo o isômero B e a impureza de lio, 0,25-3% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 2017,9, 1% ou menos de qualquer outro pico por absorbância UV a 214 nm e em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9.

[0038] Além disso, é proporcionado um extrato de saponina contendo pelo menos 93% de:

,

ou

, e 0,25-3% de:

OH por absorbância UV a 214 nm, em particular, em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9. Adequadamente, o extrato de saponina contém pelo menos 98% de: ,

,

OH , , , ou .

[0039] Adequadamente, o extrato de saponina contém 98% dos componentes acima mencionados e o componente 2118. Tipicamente, o extrato de saponina contém 1% ou menos de:

O O O O O OH O OH O OH HO O O HO O O HO O O OH HO O HO O OH H O OH HO O O OH OH O O HO HO O OH HO OH OH

OH , especialmente 1% ou menos de qualquer outro pico por absorbância UV a 214 nm.

[0040] De particular interesse são os extratos de saponina que contêm pelo menos 98% de: ,

,

OH , , ou , pelo menos 93% de:

,

ou

, 0,25-3% de:

OH , 1% ou menos de qualquer outro pico por absorbância UV a 214 nm e em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9. Especialmente de interesse são os extratos de saponina que contêm pelo menos 98% de: ,

,

OH , , , , ou componente 2118, pelo menos 93% de:

,

ou

, 0,25-3% de:

OH , 1% ou menos de qualquer outro pico por absorbância UV a 214 nm e em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9.

[0041] Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, de componente 1988, conforme determinado por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa. Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm 85% ou menos, tal como 80% ou menos, de componente 1988, conforme determinado por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

[0042] Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm 30% ou menos, tal como 25% ou menos, de componente 1856, por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa. Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, especialmente pelo menos 15% de componente 1856, por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

[0043] Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm 6% ou menos, tal como 4% ou menos, de componente 2002, por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa. Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm pelo menos 0,5%, tal como pelo menos 1%, de componente 2002, por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

[0044] Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm pelo menos 0,5%, tal como pelo menos 1% ou pelo menos 2% de componente 2018, por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

[0045] Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm pelo menos 65%, tal como pelo menos 70% de: ou ,

por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

[0046] Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm 30% ou menos, tal como 25% ou menos de: , por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa. Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, especialmente pelo menos 15% de: , por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

[0047] Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm 10% ou menos, tal como 5% ou menos de:

, por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa. Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm pelo menos 0,5%, tal como pelo menos 1% de, , por abundância de íons, por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

[0048] Em certas modalidades, os extratos de saponina contêm pelo menos 0,5%, tal como pelo menos 1% ou pelo menos 2% de,

OH , por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

[0049] Quil A é uma preparação de saponina isolada da árvore sul- americana Quillaja saponaria Molina e foi primeiramente descrita como tendo atividade de adjuvante por Dalsgaard et al. em 1974 ('Saponin adjuvants', Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlim, p243-254). As frações purificadas de Quil A foram isoladas por HPLC, que retêm a atividade de adjuvante sem a toxicidade associada à Quil A (ver, por exemplo, a EP03622789). Verificou-se que várias frações possuem atividade de adjuvante, como QS-7, QS-17, QS- 18 e QS-21, embora a sua toxicidade varie consideravelmente.

[0050] Pelo termo 'extrato de saponina', conforme usado neste documento, pretende-se um extrato de Quillaja saponaria Molina.

[0051] Pelo termo 'glicosídeos triterpenoides', conforme usado neste documento, pretende-se uma entidade ou entidades tendo um núcleo triterpenoide derivado por açúcares que são ligados por meio de ligações glicosídicas.

[0052] Certas estruturas aqui contidas foram determinadas por MS/MS, limitações da técnica na diferenciação de certas espécies de açúcar de ramificação, de estereoquímica e isoméricas (por exemplo, apiose e xilose) significa que algumas estruturas são supostas e baseadas em um núcleo conservado assumido. As estruturas supostas devem, portanto, ser consideradas significar a estrutura real do componente que foi, de outra forma, identificado, no caso da estrutura suposta estar incorreta por qualquer motivo.

[0053] Pelo termo 'componente 2018' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como 'Pico 2018' na Figura 6. Adequadamente, o componente 2018 nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,5 min, o componente principal do pico tendo um peso molecular monoisotópico de 2017.9. O componente 2018 também pode ser identificado nos métodos de UPLC-UV descritos neste documento com um tempo de retenção de aproximadamente 5,8 min. O componente 2018 principal foi identificado como tendo a estrutura suposta.

OH por MS/MS.

[0054] Pelo termo 'componente 1988' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como parte do pico principal de QS-21 na Figura 6 e tendo um peso molecular monoisotópico de 1987.9. Adequadamente, o componente 1988 nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,4 min e um peso molecular monoisotópico de 1987,9. O componente 1988 pode consistir em QS-21A V1:

e QS-21A V2 .

[0055] Pelo termo 'componente 1856' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como parte do pico principal de QS-21 na Figura 6 e tendo um peso molecular monoisotópico de 1855,9. Adequadamente, o componente 1856 nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,4 min e um peso molecular monoisotópico de 1855,9. O componente 1856 pode consistir em:

.

[0056] Pelo termo 'componente 2002' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como parte do pico principal de QS-21 na Figura 6 e tendo um peso molecular monoisotópico de 2001,9. Adequadamente, o componente 2002 nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,4 min e um peso molecular monoisotópico de 2001,9. O componente 2002 foi identificado como tendo a estrutura suposta: por MS/MS.

[0057] Pelo termo 'impureza de lio' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como 'Pico de Liofilização' na Figura 6. Adequadamente, a impureza de lio nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,7 min e o componente principal do pico tendo um peso molecular monoisotópico de 1855,9. A impureza de lio principal foi identificada como tendo a estrutura suposta:

OH por MS/MS.

[0058] Pelo termo 'isômero B' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como 'isômero B' na Figura 6. Adequadamente, o isômero B nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,0 min e o componente principal do pico tendo um peso molecular monoisotópico de 1987,9. O componente de isômero B principal foi identificado como tendo a estrutura suposta: por MS/MS.

[0059] Pelo termo 'componente 1518' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como 'Pico 1518' na Figura 6. Adequadamente, o componente 1518 nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,2 min e o componente principal do pico tendo um peso molecular monoisotópico de 1517,7. O componente 1518 principal foi identificado como tendo a estrutura suposta: por MS/MS.

[0060] Pelo termo 'componente 1712' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como ‘Pico 1712' na Figura 6. Adequadamente, o componente 1712 nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,6 min e o componente principal do pico tendo um peso molecular monoisotópico de 1711,8. O componente 1712 principal foi identificado como tendo a estrutura suposta: por MS/MS.

[0061] Pelo termo 'componente 2118' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como '4.607' na Figura 6. Adequadamente, o componente 2118 nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,6 e o componente principal do pico tendo um peso molecular monoisotópico de 2118.

[0062] Pelo termo 'pico principal de QS-21' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados como 'QS-21' na Figura 6. Adequadamente, o pico principal de QS-21 nos métodos de UPLC-

UV/MS descritos neste documento tem um tempo de retenção de aproximadamente 4,4 min e componentes de peso molecular de m/z de 1855,9, 1987,9 e 2001,9. O pico principal de QS-21 pode consistir em QS-21A V1:

, QS-21A V2:

, componente 1856:

e componente 2002:

.

[0063] Pelo termo 'grupo QS-21' pretende-se os glicosídeos triterpenoides identificados a partir do isômero B até o pico que precede a impureza de lio, nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento, como tendo um tempo de retenção de aproximadamente 4,0 min a aproximadamente 4,7 min e tendo pesos moleculares monoisotópicos principais de 1517.7, 1711.8, 1855.9, 1987.9, 2001.9,

2017.9 ou 2118. O grupo QS-21 pode consistir em QS-21A V1: , QS-21A V2:

, componente 1856:

, componente 2002:

, componente 2018:

OH , isômero B: , componente 1518: , componente 1712:

, e componente 2118.

[0064] Pelo termo 'maior pico fora do grupo QS-21' pretende-se o maior pico por UV, detectável nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento, que não é parte do grupo QS-21.

[0065] Pelo termo 'Pico precedente' pretende-se o pico que precede imediatamente o pico principal de QS-21 nos métodos de HPLC-UV descritos neste documento (ver a Figura 2).

[0066] Pelo termo 'm/z' pretende-se a razão de massa para carga do pico do monoisótopo. A menos que especificado de outra forma, a 'm/z' é determinada por espectrometria de massa por eletropulverização de íons negativos.

[0067] Pelo termo 'abundância de íons' pretende-se a quantidade de uma m/z especificada medida na amostra ou em um dado pico, conforme exigido pelo contexto. O cromatograma de massa para a m/z especificada pode ser extraído do cromatograma de íons totais da MS nos métodos de UPLC-UV/MS descritos neste documento. O cromatograma de massa representa graficamente a intensidade do sinal versus o tempo. A abundância de íons é medida como a área do pico integrado. A área para uma m/z especificada / a área para uma m/z de referência relativa = abundância relativa.

[0068] Pelo termo 'absorbância UV a 214 nm' pretende-se a área de um pico integrado no cromatograma de absorbância UV. A (área para um pico especificado)/(área de todos os picos integrados no cromatograma) x 100 = porcentagem da área para o pico especificado.

[0069] Pelo termo 'absorbância UV a 214 nm e abundância de íons relativa' pretende-se uma estimativa para a porcentagem de uma dada m/z para espécies que eluem em conjunto. (Porcentagem da área para um dado pico de UV) x (abundância de íons relativa para a m/z de interesse em um dado pico)/(soma de todas as abundâncias de íons relativas para um dado pico) = porcentagem da m/z de interesse no dado pico de UV, assume a abundância de íons relativa incluída para todas as espécies que eluem em conjunto.

[0070] Pelo termo 'em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1988' pretende-se o monoisótopo da espécie mais abundante, o primeiro pico no grupo isotópico com maior resposta por m/z deve ser uma m/z de 1987.9. A espécie mais abundante pode ser determinada por criação de um espectro combinado sobre todo o cromatograma de íons totais, usando o método de UPLC-UV/MS (eletropulverização de íons negativos) como descrito aqui.

[0071] Pelo termo 'seco' pretende-se que substancialmente todo o solvente foi removido. Um extrato seco tipicamente contém menos que 5% de solvente p/p (tal como menos que 5% de água p/p). Adequadamente, o extrato seco conterá 100 ppm ou menos de acetonitrila (p/p).

[0072] Além disso, é proporcionado um método para a fabricação de um extrato de saponina, compreendendo as etapas de: selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno; e purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila.

[0073] Desejavelmente, o processo compreende as etapas de:

selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada; purificar o extrato por adsorção em polivinilpirolidona; purificar o extrato por diafiltração, ultrafiltração ou diálise; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno; e purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila; em que as etapas (ii) e (iii) podem opcionalmente ser na ordem inversa ou realizadas simultaneamente, embora sejam tipicamente na ordem mostrada.

[0074] O extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é obtido por extração aquosa (porém não precisa estar na forma aquosa, por exemplo, pode ter sido subsequentemente seco, submetido à troca do solvente ou reconstituído em um solvente diferente). Pelo termo 'extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada' pretende-se um extrato tendo uma razão de componente 2018 para pico principal de QS-21 de 0,075 ou inferior, em particular 0,064 ou inferior (conforme determinada por UPLC- absorbância UV a 214 nm). Desejavelmente, a razão de componente 2018/pico principal de QS-21 é pelo menos 0,005, como pelo menos 0,01, conforme medida por absorbância UV a 214 nm.

[0075] Adequadamente, a razão de Pico precedente para pico principal de QS-21 é 0,45 ou inferior, em particular 0,4 ou inferior (conforme determinada por HPLC-absorbância UV a 214 nm). A razão de Pico precedente para pico principal de QS-21 pode ser 0,05 ou superior, em particular 0,1 ou superior (conforme determinada por HPLC-absorbância UV a 214 nm).

[0076] Tipicamente, o extrato aquoso bruto é um extrato de casca. Adequadamente, o teor de pico principal de QS-21 em uma solução aquosa de extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é pelo menos 1 g/L, como pelo menos 2 g/L, especialmente pelo menos 2,5 g/L e, em particular, pelo menos 2,8 g/L (por exemplo, conforme determinado por absorbância UV em relação a uma amostra de controle de concentração conhecida).

[0077] Adequadamente, a etapa de selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada inclui testar a composição para determinar o teor de componente 2018.

[0078] A etapa de purificar o extrato por adsorção em polivinilpirolidona envolve o tratamento do extrato com a resina de polivinilpirolidona. Tipicamente, o extrato é agitado com a resina de polivinilpirolidona. O extrato pode subsequentemente ser separado da resina de polivinilpirolidona com impurezas adsorvidas por filtração. Essa etapa do processo, em geral, remove as impurezas polifenólicas, como as taninas.

[0079] A etapa de purificar o extrato por diafiltração, ultrafiltração ou diálise é adequadamente a purificação por diafiltração, tipicamente usando fluxo tangencial. Um exemplo apropriado de uma membrana é um corte de 30 kDa. Esta etapa do processo, em geral, remove sais, açúcares e outros materiais de baixo peso molecular.

[0080] A etapa de purificar o extrato por cromatografia em fase reversa, usando uma resina de poliestireno, tipicamente usa acetonitrila e água como solvente, normalmente acidificada com um ácido adequado, como o ácido acético. Um exemplo de uma resina adequada é a Amberchrom XT20. A cromatografia pode ser realizada usando condições isocráticas, embora seja tipicamente operada sob um gradiente de solvente (contínuo, como linear ou escalonado), como os proporcionados nos Exemplos. Esta etapa do processo, em geral, remove material que não seja saponina e enriquece as saponinas desejadas. As frações selecionadas podem ser combinadas para maximizar o rendimento do material que corresponde aos critérios exigidos (tipicamente % de QS-21 ≥ 18%, conforme determinada por absorbância UV após HPLC-UV, e razão de 2018/QS-21 ≤ 0,054, conforme determinada por absorbância UV após UPLC-UV). Cada corrida da cromatografia com poliestireno é tipicamente em uma escala de entre 25-200 g de QS-21, como entre 50-150 g e, em particular, entre 70-110 g (as quantidades sendo baseadas no teor de pico principal de QS-21 no material por UV).

[0081] A purificação do extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila tipicamente usa acetonitrila e água como solvente, normalmente acidificada com um ácido adequado, como o ácido acético. A cromatografia pode ser realizada usando um gradiente de solvente (contínuo, como linear ou escalonado), embora tipicamente seja operada sob condições isocráticas. Esta etapa do processo proporciona a purificação final das saponinas desejadas. As frações selecionadas podem ser combinadas para maximizar o rendimento do material que corresponde aos critérios exigidos (tipicamente % de grupo QS-21 ≥ 98,5, % de pico principal de QS-21 ≥ 94,5, 2002/1988 ≤ 0,027, % de 2018 ≤ 2,7%, pico principal fora do grupo QS-21 ≤ 1%, conforme determinado por UPLC-UV/MS). Cada corrida da cromatografia com fenila é tipicamente em uma escala de entre 4-40 g de QS-21, como entre 10-30 g e, em particular, entre 13-21 g (as quantidades sendo baseadas no teor de pico principal de QS-21 no material por UV).

[0082] O método pode compreender a etapa adicional de remover o solvente para proporcionar um extrato de saponina seco. Consequentemente, a invenção proporciona um método para a fabricação de um extrato de saponina, compreendendo as etapas de: selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada;

purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila; e remover o solvente para proporcionar um extrato de saponina seco.

[0083] A invenção também proporciona um método para a fabricação de um extrato de saponina, compreendendo as etapas de:

[0084] selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada; purificar o extrato por adsorção em polivinilpirolidona; purificar o extrato por diafiltração, ultrafiltração ou diálise; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila; e remover o solvente para proporcionar um extrato de saponina seco. em que as etapas (ii) e (iii) podem opcionalmente ser na ordem inversa ou realizadas simultaneamente, embora estejam tipicamente na ordem mostrada.

[0085] Para melhorar a eficiência da secagem, pode ser desejável realizar outras etapas de concentrar o extrato, como por captura e liberação usando uma técnica apropriada, por exemplo, cromatografia em fase reversa (por exemplo, usando uma resina C8), e/ou troca do solvente antes da etapa de secagem.

[0086] Também é proporcionado um método para a fabricação de um extrato de saponina, compreendendo as etapas: selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada;

purificar o extrato por adsorção em polivinilpirolidona; purificar o extrato por diafiltração, ultrafiltração ou diálise; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila; concentrar opcionalmente o extrato; trocar opcionalmente o solvente; e remover o solvente restante para proporcionar um extrato de saponina seco; em que as etapas (vi) e (vii) podem ser opcionalmente na ordem inversa ou realizadas simultaneamente, embora estejam tipicamente na ordem mostrada.

[0087] Também é proporcionado um método para a fabricação de um extrato de saponina, compreendendo as etapas:

[0088] selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma composição do componente 2018 adequada; purificar o extrato por adsorção em polivinilpirolidona; purificar o extrato por diafiltração, ultrafiltração ou diálise; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno; purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila; concentrar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina C8; trocar o solvente; e remover o solvente restante para proporcionar um extrato de saponina seco.

[0089] A concentração do extrato pode ser realizada usando qualquer técnica adequada. Por exemplo, a concentração pode ser realizada usando uma metodologia de captura e liberação, como a cromatografia em fase reversa, em particular usando uma resina C8. A cromatografia em fase reversa utiliza tipicamente acetonitrila e água como solvente, normalmente acidificadas com um ácido adequado, como o ácido acético. A cromatografia é tipicamente operada sob um gradiente de solvente, com o extrato de saponina capturado em baixa quantidade de solvente orgânico e eluído em alta quantidade de solvente orgânico, em particular um gradiente de solvente escalonado.

[0090] A troca do solvente pode ser realizada utilizando qualquer técnica adequada, em particular diafiltração, ultrafiltração ou diálise, especialmente a diafiltração. A troca do solvente pode ser útil, por exemplo, na redução do teor de acetonitrila, como descrito no WO2014016374. Uma membrana adequada pode ser selecionada para permitir a troca do solvente, enquanto retém o extrato de saponina, como uma membrana de 1 kDa.

[0091] A secagem, por remoção do solvente, pode ser realizada por qualquer meio adequado, em particular por liofilização. Durante a secagem, pode ocorrer a degradação do extrato de saponina, levando à formação de impureza de lio. Consequentemente, é desejável secar sob condições que limitem a formação de impureza de lio, tal como limitando a temperatura de secagem e/ou o tempo de secagem. Adequadamente, a remoção do solvente é realizada por um único processo de liofilização. A extensão da secagem necessária dependerá da natureza do solvente, por exemplo, os solventes não farmaceuticamente aceitáveis serão desejavelmente removidos até um alto grau, enquanto alguns solventes farmaceuticamente aceitáveis (como a água) podem ser removidos até um menor grau.

[0092] Adequadamente, os métodos da presente invenção são realizados em uma escala de entre 25-1000 g de QS-21, como entre 50-

500 g e, em particular, entre 100-500 g (as quantidades sendo baseadas no teor de pico principal de QS-21 no material por UV).

[0093] Também é proporcionado um método para identificar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina para uso na fabricação de um extrato de saponina purificado, como os extratos de saponina da invenção, o dito método compreendendo as etapas de: determinar a razão de componente 2018 para pico principal de QS-21 por UPLC-absorbância UV a 214 nm; selecionar um extrato bruto tendo uma razão de componente 2018 para pico principal de QS-21 de 0,075 ou menos.

[0094] Em uma modalidade, o extrato aquoso bruto selecionado na etapa (ii) tem uma razão de componente 2018 para pico principal de QS-21 de 0,064 ou menos.

[0095] A invenção também proporciona um método para a determinação da razão de componente 2018 para pico principal de QS- 21 em um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, o dito método compreendendo as etapas de:

[0096] determinar o teor de componente 2018 no extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina por UPLC-absorbância UV a 214 nm; determinar o teor de pico principal de QS-21 no extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina por UPLC-absorbância UV a 214 nm; e comparar o teor de componente 2018 com o teor de pico principal de QS-21 para determinar a razão de componente 2018 para pico principal de QS-21.

[0097] É proporcionado o uso de um extrato de saponina da presente invenção na fabricação de um medicamento. É proporcionado adicionalmente um extrato de saponina da presente invenção para uso como medicamento, em particular como um adjuvante. Também é proporcionada uma composição adjuvante compreendendo um extrato de saponina da presente invenção.

[0098] Os extratos de saponina da presente invenção podem ser combinados com outros adjuvantes, como um agonista de TLR4, em particular agonistas de TLR4 de lipopolissacarídeo, como derivados de lipídio A, especialmente um monofosforil lipídio A, por exemplo, o monofosforil-lipídio A 3-des-O-acilado (3D-MPL). monofosforil lipídio A (3D-MPL). O 3D-MPL é vendido sob o nome 'MPL' pela GlaxoSmithKline Biologicals N.A. e é referido por todo o documento como 3D-MPL. Ver, por exemplo, as Patentes US Nos. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 e

4.912.094. O 3D-MPL pode ser produzido de acordo com os métodos descritos na GB 2 220 211 A. Quimicamente, ele é uma mistura de monofosforil lipídio A 3-desacilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas.

[0099] Outros agonistas de TLR4 que podem ser de uso na presente invenção incluem o Adjuvante de Glicopiranosil Lipídeo (GLA), como descrito no WO2008/153541 ou no WO2009/143457 ou nos artigos da literatura Coler RN et al. (2011) Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi:10.1371/journal.pone.0016333 e Arias MA et al. (2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144. O WO2008/153541 ou o WO2009/143457 são incorporados neste documento por referência para o propósito de definir agonistas de TLR4 que possam ser de uso na presente invenção.

[00100] Uma dose humana adulta típica de adjuvante compreenderá um extrato de saponina em quantidades entre 1 e 100 ug por dose humana. O extrato de saponina pode ser utilizado a um nível de cerca de 50 ug. Os exemplos de faixas adequadas são 40-60 µg, adequadamente 45-55 µg ou 49-51 µg, como 50 µg. Em uma outra modalidade, a dose humana compreende extrato de saponina a um nível de cerca de 25 ug. Os exemplos de faixas menores incluem 20-30 ug, adequadamente 22-28 ug ou 24-26 ug, como 25 ug. As doses humanas destinadas a crianças podem ser reduzidas em comparação com as destinadas a um adulto (por exemplo, redução de 50%).

[00101] Os agonistas de TLR4, como um lipopolissacarídeo, como o 3D-MPL, podem ser utilizados em quantidades entre 1 e 100 ug por dose humana. O 3D-MPL pode ser usado a um nível de cerca de 50 ug. Os exemplos de faixas adequadas são 40-60 ug, adequadamente 45- 55 ug ou 49-51 ug, como 50 ug. Em uma outra modalidade, a dose humana compreende o 3D-MPL a um nível de cerca de 25 ug. Os exemplos de faixas menores incluem 20-30 ug, adequadamente 22-28 ug ou 24-26 ug, como 25 ug. As doses humanas destinadas a crianças podem ser reduzidas em comparação com as destinadas a um adulto (por exemplo, redução de 50%).

[00102] Quando tanto um agonista de TLR4 quanto um extrato de saponina estiverem presentes no adjuvante, então a razão em peso de agonista de TLR4 para saponina é adequadamente entre 1:5 e 5:1, adequadamente 1:1. Por exemplo, onde o 3D-MPL estiver presente em uma quantidade de 50 ug ou 25 ug, então adequadamente o QS-21 também pode estar presente em uma quantidade de 50 ug ou 25 ug por dose humana.

[00103] Os adjuvantes também podem compreender um veículo adequado, tal como uma emulsão (por exemplo, uma emulsão de óleo em água) ou lipossomas. Lipossomas

[00104] O termo 'lipossoma' é bem conhecido na técnica e define uma categoria geral de vesículas que compreendem uma ou mais bicamadas lipídicas em torno de um espaço aquoso. Os lipossomas consistem assim em uma ou mais bicamadas lipídicas e/ou fosfolipídicas e podem conter outras moléculas, como proteínas ou carboidratos, em sua estrutura. Como as fases lipídica e aquosa estão presentes, os lipossomas podem encapsular ou capturar material solúvel em água, material solúvel em lipídios e/ou compostos anfifílicos.

[00105] O tamanho do lipossoma pode variar de 30 nm a vários um, dependendo da composição fosfolipídica e do método utilizado para a sua preparação.

[00106] Os lipossomas de uso na presente invenção contêm adequadamente DOPC, ou consistem essencialmente em DOPC e esterol (com saponina e opcionalmente agonista de TLR4).

[00107] Na presente invenção, o tamanho do lipossoma estará na faixa de 50 nm a 200 nm, especialmente 60 nm a 180 nm, tal como 70- 165 nm. Idealmente, os lipossomas devem ser estáveis e ter um diâmetro de ~100 nm para permitir a esterilização conveniente por filtração.

[00108] A integridade estrutural dos lipossomas pode ser avaliada por métodos como a dispersão dinâmica de luz (DLS), que mede o tamanho (diâmetro médio Z, Zav) e a polidispersidade dos lipossomas, ou por microscopia eletrônica, para a análise da estrutura dos lipossomas. Em uma modalidade, o tamanho médio de partícula está entre 95 e 120 nm e/ou o índice de polidispersidade (PdI) não é mais que 0,3 (tal como não mais que 0,2). Excipientes adicionais

[00109] Em uma outra modalidade, um tampão é adicionado à composição. O pH de uma preparação líquida é ajustado em vista dos componentes da composição e da adequação necessária para a administração ao paciente. Adequadamente, o pH de uma mistura líquida é pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 5,5, pelo menos 5,8,

pelo menos 6. O pH da mistura líquida pode ser menos que 9, menos que 8, menos que 7,5 ou menos que 7. Em outras modalidades, o pH da mistura líquida está entre 4 e 9, entre 5 e 8, tal como entre 5,5 e 8. Consequentemente, o pH estará adequadamente entre 6-9, tal como 6,5-8,5. Em uma modalidade particularmente preferida, o pH está entre 5,8 e 6,4. Um tampão apropriado pode ser selecionado a partir de acetato, citrato, histidina, maleato, fosfato, succinato, tartarato e TRIS. Em uma modalidade, o tampão é um tampão fosfato, tal como Na/Na2PO4, Na/K2PO4 ou K/K2PO4.

[00110] O tampão pode estar presente na mistura líquida em uma quantidade de pelo menos 6 mM, pelo menos 10 mM ou pelo menos 40 mM. O tampão pode estar presente na mistura líquida em uma quantidade de menos que 100 mM, menos que 60 mM ou menos que 40 mM.

[00111] É bem sabido que, para a administração parenteral, as soluções devem ter uma osmolalidade farmaceuticamente aceitável para evitar a distorção ou a lise celular. Uma osmolalidade farmaceuticamente aceitável, em geral, significará que as soluções terão uma osmolalidade que é aproximadamente isotônica ou levemente hipertônica. Adequadamente, as composições (quando reconstituídas, se apresentadas na forma seca) terão uma osmolalidade na faixa de 250 a 750 mOsm/kg, por exemplo, a osmolalidade pode estar na faixa de 250 a 550 mOsm/kg, tal como na faixa de 280 a 500 mOsm/kg. Em uma modalidade particularmente preferida, a osmolalidade pode estar na faixa de 280 a 310 mOsm/kg. A osmolalidade pode ser medida de acordo com práticas conhecidas na técnica, como pelo uso de um osmômetro disponível comercialmente, por exemplo, o Advanced® Model 2020, disponível da Advanced Instruments Inc. (EUA).

[00112] Um 'agente de isotonicidade' é um composto que é fisiologicamente tolerado e confere uma tonicidade adequada a uma formulação, para impedir o fluxo líquido de água através das membranas celulares que estão em contato com a formulação. Em algumas modalidades, o agente de isotonicidade usado para a composição é um sal (ou misturas de sais), convenientemente o sal é o cloreto de sódio, adequadamente a uma concentração de aproximadamente 150 nM. Em outras modalidades, no entanto, a composição compreende um agente de isotonicidade não iônico e a concentração de cloreto de sódio na composição é menos que 100 mM, tal como menos que 80 mM, por exemplo, menos que 50 mM, tal como menos que 40 mM, menos que 30 mM e especialmente menos que 20 mM. A concentração iônica na composição pode ser menos que 100 mM, tal como menos que 80 mM, por exemplo, menos que 50 mM, tal como menos que 40 mM ou menos que 30 mM.

[00113] Em uma modalidade particular, o agente de isotonicidade não iônico é um poliol, como a sacarose e/ou o sorbitol. A concentração de sorbitol pode estar, por exemplo, entre cerca de 3% e cerca de 15% (p/v), tal como entre cerca de 4% e cerca de 10% (p/v). Os adjuvantes compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa e um agonista de TLR4, em que o agente de isotonicidade é o sal ou um poliol, foram descritos no WO2012/080369.

[00114] Adequadamente, um volume de dose humana é entre 0,05 ml e 1 ml, tal como entre 0,1 e 0,5 ml, em particular um volume de dose de cerca de 0,5 ml ou 0,7 ml. Os volumes das composições utilizadas podem depender da rota de liberação e da localização, com as doses menores sendo dadas pela rota intradérmica. Um recipiente de dose unitária pode conter um excesso para permitir a manipulação adequada dos materiais durante a administração da dose unitária.

[00115] A razão de saponina:DOPC estará tipicamente na ordem de 1:50 a 1:10 (p/p), adequadamente entre 1:25 e 1:15 (p/p) e, de preferência, 1:22 a 1:18 (p/p), tal como 1:20 (p/p).

[00116] Adequadamente, a saponina é apresentada em uma composição menos reatogênica, onde é finalizada com um esterol exógeno, como o colesterol. O colesterol é divulgado no Merck Index, 13ª Ed., página 381, como um esterol que ocorre naturalmente, encontrado na gordura animal. O colesterol tem a fórmula (C 27H46O) e é também conhecido como (3β)-colest-5-en-3-ol.

[00117] A razão de saponina:esterol estará tipicamente na ordem de 1:100 a 1:1 (p/p), adequadamente entre 1:10 e 1:1 (p/p) e, de preferência, 1:5 a 1:1 (p/p). Adequadamente, o esterol em excesso está presente, sendo a razão de saponina:esterol pelo menos 1:2 (p/p). Em uma modalidade, a razão de saponina:esterol é 1:5 (p/p). Em uma modalidade, o esterol é o colesterol.

[00118] A quantidade de lipossoma (peso de lipídio e esterol) estará tipicamente na faixa de 0,1 mg a 10 mg por dose humana de uma composição, em particular 0,5 mg a 2 mg por dose humana de uma composição.

[00119] Em uma modalidade particularmente adequada, os lipossomas utilizados na invenção compreendem DOPC e um esterol, em particular o colesterol. Assim, em uma modalidade particular, uma composição usada na invenção compreende extrato de saponina na forma de um lipossoma, em que o dito lipossoma compreende DOPC e um esterol, em particular o colesterol. Antígenos

[00120] Os adjuvantes preparados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em combinação com um imunógeno ou antígeno. Em algumas modalidades, é proporcionado um polinucleotídeo que codifica o imunógeno ou o antígeno.

[00121] O adjuvante pode ser administrado separadamente de um imunógeno ou o antígeno pode ser combinado, durante a fabricação ou extemporaneamente, com um imunógeno ou antígeno como uma composição imunogênica para a administração combinada.

[00122] Consequentemente, é proporcionado um método para a preparação de uma composição imunogênica compreendendo um imunógeno ou antígeno, ou um polinucleotídeo que codifica o imunógeno ou o antígeno, o dito método compreendendo as etapas de: preparar uma composição adjuvante compreendendo um extrato de saponina da presente invenção; misturar o adjuvante com um imunógeno ou antígeno, ou um polinucleotídeo que codifica o imunógeno ou o antígeno.

[00123] Também é proporcionado o uso de um adjuvante compreendendo um extrato de saponina da presente invenção na fabricação de um medicamento. Adequadamente, o medicamento compreende um imunógeno ou antígeno, ou um polinucleotídeo que codifica o imunógeno ou o antígeno. É ainda proporcionado um adjuvante compreendendo um extrato de saponina da presente invenção, para uso como um medicamento. Adequadamente, o medicamento compreende um imunógeno ou antígeno, ou um polinucleotídeo que codifica o imunógeno ou o antígeno.

[00124] Pelo termo imunógeno pretende-se um polipeptídeo que seja capaz de provocar uma resposta imune. Adequadamente, o imunógeno é um antígeno que compreende pelo menos um epítopo de célula B ou T. A resposta imune provocada pode ser uma resposta de célula B específica para o antígeno, que produz os anticorpos neutralizantes. A resposta imune provocada pode ser uma resposta de célula T específica para o antígeno, que pode ser uma resposta sistêmica e/ou local. A resposta de célula T específica para o antígeno pode compreender uma resposta de célula T CD4+, tal como uma resposta envolvendo as células T CD4+ que expressam uma pluralidade de citocinas, por exemplo, IFNgama, TNFalfa e/ou IL2. Alternativa ou adicionalmente, a resposta de célula T específica para o antígeno compreende uma resposta de célula T CD8+, tal como uma resposta envolvendo as células T CD8+ que expressam uma pluralidade de citocinas, por exemplo, IFNgama, TNFalfa e/ou IL2.

[00125] O antígeno pode ser derivado de (tal como obtido de) um patógeno humano ou não humano, incluindo, por exemplo, as bactérias, os fungos, os microrganismos parasíticos ou os parasitas multicelulares que infectam os vertebrados humanos e não humanos, ou de uma célula cancerígena ou célula tumoral.

[00126] Em uma modalidade, o antígeno é uma proteína recombinante, como uma proteína procariótica recombinante.

[00127] Em uma modalidade, o antígeno é derivado de Plasmodium spp. (como Plasmodium falciparum), Mycobacterium spp. (como Mycobacterium tuberculosis (TB)), Vírus Varicela Zoster (VZV), vírus sincicial respiratório humano, Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), Moraxella spp. (como Moraxella catarrhalis) ou Haemophilus influenzae não tipificável (ntHi). O antígeno pode compreender ou consistir em preparações derivadas de parasitas que causam a malária, como Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax.

[00128] Em uma modalidade, o antígeno pode ser a proteína circunsporozoíta (CS) de Plasmodium falciparum ou uma variante dela. Uma variante adequada da proteína CS pode ser uma variante em que partes da proteína CS estão na forma de uma proteína híbrida com o antígeno de superfície S da hepatite B (HBsAg). O antígeno da variante CS pode, por exemplo, estar na forma de uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a parte C terminal da proteína CS, quatro ou mais repetições em série da região imunodominante da proteína CS e o HBsAg. A proteína híbrida pode compreender uma sequência que contém pelo menos 160 aminoácidos e que é substancialmente homóloga à parte C terminal da proteína CS, porém desprovida da sequência de apoio hidrofóbica. A proteína CS pode ser desprovida dos últimos 12 aminoácidos do C terminal. Além disso, ela pode conter 4 ou mais, por exemplo, 10 ou mais motivos de repetição de tetrapeptídeo de Asn-Ala-Asn-Pro (NANP).

[00129] A proteína híbrida para uso na invenção pode ser uma proteína que compreenda uma parte da proteína CS de P. falciparum substancialmente como correspondendo aos aminoácidos 207-395 do clone 3D7 de P. falciparum, derivada da cepa NF54 fundida em quadro, por meio de um ligador linear, à extremidade de N do HBsAg. O ligador pode compreender uma parte de preS2 a partir do HBsAg. As construções CS adequadas para uso na presente invenção estão resumidas no WO93/10152, que foi concedido nos EUA como Pats. US Nos. 5.928.902 e 6.169.171, ambas as quais são incorporados por referência para descrever as proteínas adequadas para uso na presente invenção.

[00130] Uma proteína híbrida particular para uso na invenção é a proteína híbrida conhecida como RTS (SEQ ID Nº. 1, também descrita em WO2015/150568, WO93/10152 (em que é indicada RTS*) e em WO98/05355, que consiste em: - um resíduo de metionina - três resíduos de aminoácidos, Met Ala Pro - um trecho de 189 aminoácidos representando os aminoácidos 207 a 395 da proteína CS da cepa 3D7 de P. falciparum - um resíduo de glicina - quatro resíduos de aminoácidos, Pro VaI Thr Asn, representando os quatro resíduos carbóxi terminais da proteína preS2 do vírus da hepatite B (sorotipo adw), e

- um trecho de 226 aminoácidos, codificados pelos nucleotídeos 1653 a 2330, e especificando a proteína S do vírus da hepatite B (sorotipo adw).

[00131] A RTS pode estar na forma de partículas misturadas de RTS,S. As partículas de RTS,S compreendem dois polipeptídeos, RTS e S, que podem ser sintetizados simultânea e espontaneamente a partir de estruturas particuladas compósitas (RTS,S).

[00132] O antígeno pode compreender ou consistir em preparações derivadas de Mycobacterium spp., tal como Mycobacterium bovis ou Mycobacterium tuberculosis, em particular Mycobacterium tuberculosis.

[00133] Os antígenos de interesse no campo da tuberculose incluem Rv1196 e Rv0125. O Rv1196 (descrito, por exemplo, pelo nome Mtb39a em Dillon et al. Infection and Immunity 1999 67(6): 2941-2950) é altamente conservado, com 100% de identidade de sequência sobre as cepas H37Rv, C, Haarlem, CDC1551, 94-M4241A, 98-R604INH-RIF- EM, KZN605, KZN1435, KZN4207, KZNR506, a cepa F11 tendo uma única mutação pontual Q30K (a maioria dos outros isolados clínicos tem mais de 90% de identidade com H37Rv). O Rv0125 (descrito, por exemplo, pelo nome Mtb32a em Skeiky et al. Infection and Immunity 1999 67(8): 3998-4007) também é altamente conservado, com 100% de identidade de sequência sobre muitas cepas. Rv0125 de tamanho natural inclui uma sequência de sinal N terminal que é clivada para proporcionar a proteína madura.

[00134] Em uma modalidade, o antígeno é derivado de Rv1196, tal como compreende, tal como consiste em, uma sequência tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID Nº: 2, tal como pelo menos 80%, em particular pelo menos 90%, especialmente pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%. Os antígenos típicos relacionados ao Rv1196 compreenderão (tal como consistirão em) um derivado de SEQ ID Nº: 2 tendo um pequeno número de remoções, inserções e/ou substituições. Os exemplos são aqueles tendo remoções de até 5 resíduos em 0-5 locais, inserções de até 5 resíduos em 0-5 locais e substituição de até 20 resíduos. Os outros derivados de Rv1196 são aqueles que compreendem (tal como que consistem em) um fragmento de SEQ ID Nº: 2 que tem pelo menos 200 aminoácidos de comprimento, tal como pelo menos 250 aminoácidos de comprimento, em particular pelo menos 300 aminoácidos de comprimento, especialmente pelo menos 350 aminoácidos de comprimento.

[00135] Em uma modalidade, o antígeno é derivado de Rv0125, tal como compreende, tal como consiste em, uma sequência tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID Nº: 3, tal como pelo menos 80%, em particular pelo menos 90%, especialmente pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%. Os antígenos típicos relacionados ao Rv0125 compreenderão (tal como consistirão em) um derivado de SEQ ID Nº.: 3 tendo um pequeno número de remoções, inserções e/ou substituições. Os exemplos são aqueles tendo remoções de até 5 resíduos em 0-5 locais, inserções de até 5 resíduos em 0-5 locais e substituição de até 20 resíduos. Os outros derivados de Rv0125 são aqueles que compreendem (tal como que consistem em) um fragmento de SEQ ID Nº: 3, que tem pelo menos 150 aminoácidos de comprimento, tal como pelo menos 200 aminoácidos de comprimento, em particular pelo menos 250 aminoácidos de comprimento, especialmente pelo menos 300 aminoácidos de comprimento. Os derivados particulares de Rv0125 são aqueles que compreendem o (tal como que consistem no) fragmento de SEQ ID Nº: 3 correspondendo aos resíduos 1-195 de SEQ ID Nº.: 3. Os outros derivados imunogênicos de Rv0125 são aqueles que compreendem o (tal como que consistem no) fragmento da SEQ ID Nº: 3 correspondendo aos resíduos 192-323 de SEQ ID Nº: 3. Os antígenos relacionados ao Rv0125 particularmente preferidos são os derivados de SEQ ID Nº: 3, em que pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mesmo todas as três) da tríade catalítica tenha sido substituída ou removida, de modo que a atividade da protease tenha sido reduzida e a proteína mais facilmente produzida - o resíduo de serina catalítico pode ser removido ou substituído (por exemplo, substituído por alanina) e/ou o resíduo de histidina catalítico pode ser removido ou substituído e/ou o resíduo de ácido aspártico catalítico pode ser removido ou substituído.

Especialmente de interesse são os derivados de SEQ ID Nº: 3, em que o resíduo de serina catalítico tenha sido substituído (por exemplo, substituído por alanina). Também de interesse são os antígenos relacionados ao Rv0125 que compreendem, tal como consistem em, uma sequência tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID Nº: 3, tal como pelo menos 80%, em particular pelo menos 90%, especialmente pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, e em que pelo menos uma das tríades catalíticas tenha sido substituída ou removida, ou aqueles que compreendem, tal como que consistem em, um fragmento de SEQ ID Nº: 3 que tem pelo menos 150 amino ácidos de comprimento, tal como pelo menos 200 aminoácidos de comprimento, em particular pelo menos 250 aminoácidos de comprimento, especialmente pelo menos 300 aminoácidos de comprimento e em que pelo menos uma da tríade catalítica tenha sido substituída ou removida.

Os outros derivados imunogênicos de Rv0125 são aqueles que compreendem o (tal como que consistem no) fragmento de SEQ ID Nº: 3 correspondendo aos resíduos 192-323 da SEQ ID Nº: 3, em que pelo menos uma (por exemplo, uma, duas ou mesmo todas as três) da tríade catalítica tenha sido substituída ou removida.

Os derivados imunogênicos particulares de Rv0125 são aqueles que compreendem o (tal como que consistem no) fragmento de SEQ ID Nº: 3 correspondendo aos resíduos 1-195 da

SEQ ID Nº: 3, em que o resíduo de serina catalítico (posição 176 da SEQ ID Nº: 3) tenha sido substituído (por exemplo, substituído por alanina).

[00136] Adequadamente, o antígeno compreenderá, tal como consistirá em, uma sequência tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID Nº. 4, tal como pelo menos 80%, em particular pelo menos 90%, especialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, por exemplo pelo menos 99%. Os antígenos típicos relacionados à M72 compreenderão, tal como consistirão em, um derivado de SEQ ID Nº: 4 tendo um pequeno número de remoções, inserções e/ou substituições. Os exemplos são aqueles tendo remoções de até 5 resíduos em 0-5 locais, inserções de até 5 resíduos em 0-5 locais e substituição de até 20 resíduos. Os outros derivados de M72 são aqueles que compreendem, tal como que consistem em, um fragmento de SEQ ID Nº: 4, que tem pelo menos 450 aminoácidos de comprimento, tal como pelo menos 500 aminoácidos de comprimento, tal como pelo menos 550 aminoácidos de comprimento, tal como pelo menos 600 aminoácidos de comprimento, tal como pelo menos 650 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 700 aminoácidos de comprimento. Como M72 é uma proteína de fusão derivada dos dois antígenos individuais Rv0125 e Rv1196, qualquer fragmento de pelo menos 450 resíduos compreenderá uma pluralidade de epítopos a partir da sequência de tamanho natural (Skeiky et al J. Immunol. 2004 172:7618-7628; Skeiky Infect. Immun. 1999 67(8):3998-4007; Dillon Infect. Immun. 1999 67(6):2941-2950).

[00137] O antígeno relacionado à M72 compreenderá, tal como consistirá em, uma sequência tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID Nº. 4, tal como pelo menos 80%, em particular pelo menos 90%, especialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, por exemplo, pelo menos 99%.

[00138] Os antígenos típicos relacionados à M72 compreenderão, tal como consistirão em, um derivado de SEQ ID Nº: 4 tendo um pequeno número de remoções, inserções e/ou substituições. Os exemplos são aqueles tendo remoções de até 5 resíduos em 0-5 locais, inserções de até 5 resíduos em 0-5 locais e substituição de até 20 resíduos.

[00139] Nas modalidades particulares, o antígeno relacionado à M72 compreenderá os resíduos 2-723 da SEQ ID Nº. 4, por exemplo, compreenderá a (ou consistirá na) SEQ ID Nº. 4 ou compreenderá a (ou consistirá na) SEQ ID Nº. 5.

[00140] Um outro antígeno que pode ser empregado de acordo com a presente invenção é o antígeno da tuberculose Rv1753 e as suas variantes, como descrito em WO2010010180, por exemplo, uma sequência de Rv1753 selecionada a partir das Seq ID Nºs: 1 e 2-7 do WO2010010180, em particular a Seq ID Nº: 1. Outro antígeno de interesse no campo da tuberculose é o Rv2386 e as suas variantes, como descrito no WO2010010179, por exemplo, uma sequência de Rv2386 selecionada a partir das Seq ID Nºs: 1 e 2-7 do WO2010010179, em particular a Seq ID Nº: 1. Os outros antígenos de interesse no campo da tuberculose incluem o Rv3616 e as suas variantes, como descrito no WO2011092253, por exemplo, uma sequência de Rv3616 natural selecionada a partir das Seq ID Nºs: 1 e 2-7 do WO2011092253 ou uma sequência de Rv3616 modificada, como aquelas selecionadas a partir das Seq ID Nºs: 161 a 169, 179 e 180 do WO2011092253, em particular a Seq ID Nº: 167. Um antígeno adicional de interesse é o HBHA, como descrito em WO97044463, WO03044048 e WO2010149657. Os pedidos de patentes acima mencionados WO2010010180, WO2010010179, WO2011092253, WO97044463, WO03044048 e WO2010149657 são incorporados neste documento por referência na sua totalidade para definir os antígenos que podem ser de uso na presente invenção.

[00141] Os outros antígenos de interesse são aqueles compreendendo (ou consistindo em): Rv1174, também conhecido como DPV, como descrito na SEQ ID Nº 8 do WO2010010177; Rv1793, também conhecido como MTI ou Mtb9.9, como descrito na SEQ ID Nº 10 do WO2010010177; Rv2087, também conhecido como MSL ou Mtb9.8, como descrito na SEQ ID Nº 9 do WO2010010177; Rv3616, também conhecido como HTCC1 ou Mtb40, como descrito nas SEQ ID Nºs: 1 e 2-7 do WO2010010177 ou nas SEQ ID Nºs: 161-169, 179 ou 180 do WO2011092253; e/ou Rv3874, também conhecido como CFP10 ou Tb38.1, como descrito na SEQ ID Nº 9 do WO2010010177; ou uma parte imunogênica (tal como pelo menos 20, 50, 75 ou 100 resíduos delas) ou variante delas (tal como tendo pelo menos 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade com elas). (O WO2010010177 e o WO2011092253 são incorporados neste documento por referência na sua totalidade, para definir os antígenos que podem ser de uso na presente invenção).

[00142] Os antígenos da tuberculose são mais adequadamente utilizados na forma de um polipeptídeo, mas podem ser alternativamente proporcionados na forma de um polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo. Um outro antígeno que pode ser empregado de acordo com a presente invenção é derivado do vírus Varicella zoster (VZV). O antígeno do VZV para uso na invenção pode ser qualquer antígeno do VZV adequado ou seu derivado imunogênico, sendo adequadamente um antígeno do VZV purificado. Em uma modalidade, o antígeno do VZV é a glicoproteína do VZV gE (também conhecida como gp1) ou o seu derivado imunogênico. A proteína gE do tipo selvagem ou de tamanho natural consiste em 623 aminoácidos compreendendo um peptídeo de sinal, a parte principal da proteína, uma região de apoio hidrofóbica (resíduos 546-558) e uma extremidade C terminal. Em um aspecto, é usado um truncado de gE C terminal (também referido como gE truncada ou truncado de gE), pelo que o truncamento remove 4 a 20 por cento dos resíduos de aminoácidos totais na extremidade carbóxi terminal. Em um aspecto adicional, a gE truncada não possui a região de apoio carbóxi terminal (de modo adeqeuado, aproximadamente os aminoácidos 547-623 da sequência do tipo selvagem). Em um outro aspecto, a gE é uma gE truncada tendo a sequência de SEQ ID Nº. 6.

[00143] O antígeno de gE, os seus derivados sem apoio (que também são derivados imunogênicos) e a sua produção são descritos na EP0405867 e nas suas referências [ver também Vafai A., Antibody binding sites on truncated forms of varicalla-zoster virus gpI(gE) glycoprotein, Vaccine 1994 12:1265-9). A EP192902 também descreve a gE e a sua produção. A gE truncada também é descrita por Haumont et al. Virus Research (1996) vol 40, p199 -204, incorporado neste documento integralmente por referência. Uma composição de gE do VZV com adjuvante, adequada para uso de acordo com a presente invenção, é descrita no WO2006/094756, isto é, uma gE do VZV truncada carbóxi terminal em combinação com adjuvante compreendendo QS-21, 3D-MPL e lipossomas contendo ainda colesterol. Leroux-Roels I. et al. (J. Infect. Dis. 2012,206: 1280-1290) relataram um ensaio clínico de fase I/II avaliando a vacina de subunidade gE truncada do VZV com adjuvante.

[00144] O antígeno pode compreender ou consistir em preparações derivadas do vírus sincicial respiratório humano (RSV). Em certas modalidades favoráveis, um antígeno polipeptídico é um antígeno polipeptídico da proteína F do RSV. Particularmente adequados como um componente de antígeno polipeptídico no contexto são os antígenos polipeptídicos F com restrição conformacional. As proteínas F com restrição conformacional foram descritas anteriormente nas conformações tanto de pré-fusão (PreF) quanto de pós-fusão (PostF). Tais proteínas F com restrição conformacional compreendem tipicamente um ectodomínio da proteína F do RSV engenheirado. Um polipeptídeo do ectodomínio da proteína F é uma parte da proteína F do RSV que inclui todo ou uma parte do domínio extracelular da proteína F do RSV e não possui um domínio transmembrana funcional (por exemplo, por remoção ou substituição), que possa ser expresso, por exemplo, na forma solúvel (não ligada a uma membrana) na cultura de células.

[00145] Os antígenos de proteína F ilustrativos com restrição conformacional na conformação de pré-fusão foram descritos na técnica e são divulgados em detalhes, por exemplo, na Patente US Nº.

8.563002 (WO2009079796); nos Pedidos de patentes publicados US Nos. US2012/0093847 (WO2010/149745); US2011/0305727 (WO2011/008974); US2014/0141037, WO2012/158613 e WO2014/160463, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência para ilustrar os polipeptídeos F de pré-fusão (e os ácidos nucleicos) e os métodos de sua produção. Tipicamente, o antígeno está na forma de um trímero de polipeptídeos. As publicações adicionais que proporcionam exemplos das proteínas F na conformação de pré-fusão incluem: McLellan et al., Science, vol. 340: 1113-1117; McLellan et al., Science, Vol. 342: 592-598, e Rigter et al., PLOS One, Vol. 8: e71072, cada um dos quais também pode ser usado no contexto das combinações imunogênicas divulgadas neste documento.

[00146] Por exemplo, um polipeptídeo de proteína F estabilizado na conformação de pré-fusão inclui tipicamente um ectodomínio de uma proteína F (por exemplo, um polipeptídeo de proteína F solúvel) compreendendo pelo menos uma modificação que estabilizou a conformação de pré-fusão da proteína F. Por exemplo, a modificação pode ser selecionada a partir de uma adição de um domínio de trimerização (tipicamente à extremidade C terminal), uma remoção de um ou mais dos sítios de clivagem da furina (nos aminoácidos ~105-109 e ~133-136), uma remoção do domínio de pep27, uma substituição ou adição de um aminoácido hidrofílico em um domínio hidrofóbico (por exemplo, HRA e/ou HRB). Em uma modalidade, o antígeno de PreF com restrição conformacional compreende um domínio de F2 (por exemplo, os aminoácidos 1-105) e um domínio de F1 (por exemplo, os aminoácidos 137-516) de um polipeptídeo da proteína F do RSV sem qualquer sítio de clivagem da furina, em que o polipeptídeo compreende ainda um domínio de trimerização heterólogo posicionado no C terminal em relação ao domínio F1. Opcionalmente, o antígeno de PreF também compreende uma modificação que altera a glicosilação (por exemplo, aumenta a glicosilação), como uma substituição de um ou mais aminoácidos nas posições correspondendo aos aminoácidos ~500-502 de uma proteína F do RSV.

Quando uma sequência de oligomerização estiver presente, ela é preferivelmente uma sequência de trimerização.

As sequências de oligomerização adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, a espiral enrolada da proteína zipper de leucina GCN4 de levedura, a sequência de trimerização da fibritina do bacteriófago T4 ('foldon') e o domínio trimérico da HA da influenza.

Adicional ou alternativamente, o polipeptídeo F com restrição conformacional na conformação de pré-fusão pode incluir pelo menos dois resíduos de cisteína introduzidos, que estão muito próximos um do outro e formam uma ligação dissulfeto que estabiliza o polipeptídeo F do RSV na pré-fusão.

Por exemplo, as duas cisteínas podem estar a cerca de 10 Å uma da outra.

Por exemplo, as cisteínas podem ser introduzidas nas posições 165 e 296 ou nas posições 155 e 290. Um antígeno de PreF ilustrativo é representado pela SEQ ID Nº: 7. O antígeno pode compreender ou consistir em preparações derivadas do HIV.

O antígeno pode ser uma proteína do HIV, como uma proteína do envoltório do HIV.

Por exemplo, o antígeno pode ser um polipeptídeo gp120 do envoltório do HIV ou um seu fragmento imunogênico.

[00147] Um antígeno adequado é o polipeptídeo gp120 do clado B do HIV de SEQ ID Nº: 8 do pedido publicado WO 2008/107370 (ou um fragmento imunogênico deste polipeptídeo). A SEQ ID Nº: 8 do WO 2008/107370 é incorporada por referência neste pedido. Os antígenos adequados também incluem um polipeptídeo compreendendo a região V1V2 de SEQ ID Nº: 1 do pedido publicado WO 2015/036061, ou um derivado ou fragmento imunogênico da região V1V2 de SEQ ID Nº: 1. Além disso, um polipeptídeo compreendendo a região V1V2 de SEQ ID Nº: 5 do WO 2015/036061 ou um derivado ou fragmento imunogênico da região V1V2 de SEQ ID Nº: 5 pode ser usado como um antígeno adequado. A SEQ ID Nº: 1 e a SEQ ID Nº: 5 do WO2015/036061 são incorporadas por referência.

[00148] Em outra modalidade, o antígeno pode compreender dois ou mais antígenos diferentes do polipeptídeo gp120 do envoltório do HIV (ou fragmentos imunogênicos desses polipeptídeos). Os antígenos adequados incluem os antígenos do polipeptídeo gp120 do clado C do HIV, incluindo o TV1 gp120 (SEQ ID Nº: 8) e 1086.C gp120 (SEQ ID Nº: 9).

[00149] Os outros antígenos do HIV adequados incluem as proteínas Nef, Gag e Pol HIV e os seus fragmentos imunogênicos.

[00150] A composição pode compreender antígeno(s) de Haemophilus influenzae não tipificável, por exemplo, selecionado(s) a partir de: Proteína fimbrina [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] e fusões compreendendo peptídeos a partir dela [por exemplo, Fusões peptídicas de LB1 (f); US 5843464 (OSU) ou WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (Universidade Estadual de Nova York)]; TbpA e/ou TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); proteína D (EP 594610); P2; e P5 (WO 94/26304); proteína E (WO07/084053) e/ou PilA (WO05/063802). A composição pode compreender antígeno(s) da proteína de Moraxella catarrhalis, por exemplo, selecionado(s) a partir de: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) e WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA e/ou LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA e/ou TbpB [WO 97/13785 e WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 612003-2010]; UspA1 e/ou UspA2 [WO 93/03761 (Universidade do Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); e OmpE.

[00151] Em uma modalidade, a composição pode compreender antígeno(s) da proteína de H. influenzae não tipificável (NTHi) e/ou antígeno(s) da proteína de M. catarrhalis. A composição pode compreender a Proteína D (PD) de H. influenzae. A Proteína D pode ser como descrita no WO91/18926. A composição pode ainda compreender a Proteína E (PE) e/ou a Pilina A (PilA) de H. Influenzae. A Proteína E e a Pilina A podem ser como descritas no WO2012/139225. A Proteína E e a Pilina A podem ser apresentadas como uma proteína de fusão; por exemplo, LVL735, como descrito no WO2012/139225. Por exemplo, a composição pode compreender três antígenos de NTHi (PD, PE e PilA, com os dois últimos combinados como uma proteína de fusão PEPilA). A composição pode ainda compreender o UspA2 de M. catarrhalis. O UspA2 pode ser como descrito no WO2015125118, por exemplo, o MC- 009 ((M)(UspA2 31-564)(HH)) descrito no WO2015125118. Por exemplo, a composição pode compreender três antígenos de NTHi (PD, PE e PilA, com os dois últimos combinados como uma proteína de fusão PEPilA) e um antígeno de M. catarrhalis (UspA2).

[00152] Uma pluralidade de antígenos pode ser proporcionada. Por exemplo, uma pluralidade de antígenos pode ser proporcionada para fortalecer a resposta imune provocada (por exemplo, para garantir uma proteção forte), uma pluralidade de antígenos pode ser proporcionada para ampliar a resposta imune (por exemplo, para garantir a proteção contra uma série de cepas de patógenos ou em uma grande proporção de uma população de indivíduos) ou uma pluralidade de antígenos pode ser proporcionada para atualmente provocar respostas imunes em relação a vários distúrbios (pelo que simplificando os protocolos de administração). Onde uma pluralidade de antígenos for proporcionada, estes podem ser como proteínas distintas ou podem estar na forma de uma ou mais proteínas de fusão.

[00153] O antígeno pode ser proporcionado em uma quantidade de 0,1 a 100 ug por dose humana.

[00154] A presente invenção pode ser aplicada para uso no tratamento ou na profilaxia de uma doença ou distúrbio associado a um ou mais antígenos descritos acima. Em uma modalidade, a doença ou o distúrbio é selecionado a partir de malária, tuberculose, DPOC, HIV e herpes.

[00155] O adjuvante pode ser administrado separadamente de um imunógeno ou antígeno, ou pode ser combinado, durante a fabricação ou extemporaneamente), com um imunógeno ou antígeno como uma composição imunogênica para administração combinada. Esterilização

[00156] Para administração parenteral em particular, as composições devem ser estéreis. A esterilização pode ser realizada por vários métodos, embora seja convenientemente realizada por filtração através de um filtro de grau estéril. A esterilização pode ser realizada várias vezes durante a preparação de uma composição adjuvante ou imunogênica, mas é tipicamente realizada pelo menos no final da fabricação.

[00157] Por 'filtro de grau estéril' entende-se um filtro que produz um efluente estéril após ser desafiado por microrganismos em um nível de desafio de mais que ou igual a 1x107/cm2 de área de filtração efetiva. Os filtros de grau estéril são bem conhecidos do especialista na técnica da invenção para a finalidade da presente invenção, os filtros de grau estéril têm um tamanho de poro entre 0,15 e 0,25 um, adequadamente 0,18-0,22 um, tal como 0,2 ou 0,22 um.

[00158] As membranas do filtro de grau estéril podem ser feitas de qualquer material adequado, conhecido pelo especialista, por exemplo, mas não limitado ao, acetato de celulose, polietersulfona (PES), poli(fluoreto de vinilideno) (PVDF), politetrafluoretileno (PTFE). Em uma modalidade particular da invenção, uma ou mais ou todas as membranas do filtro da presente invenção compreendem a polietersulfona (PES), em particular a polietersulfona hidrofílica. Em uma modalidade particular da invenção, os filtros usados nos processos descritos neste documento são um filtro de camada dupla, em particular um filtro estéril com um pré-filtro incorporado tendo um tamanho de poro maior que o tamanho de poro do filtro final. Em uma modalidade, o filtro de esterilização é um filtro de camada dupla, em que a camada de membrana do pré-filtro tem um tamanho de poro entre 0,3 e 0,5 nm, tal como 0,35 ou 0,45 nm. De acordo com outras modalidades, os filtros compreendem membrana(s) do filtro assimétrica(s), como membrana(s) do filtro de PES hidrofílica assimétric(s). Alternativamente, a camada de filtro de esterilização pode ser feita de PVDF, por exemplo, em combinação com uma camada de membrana do pré-filtro de PES hidrofílica assimétrica.

[00159] Considerando os usos médicos pretendidos, os materiais devem ser de grau farmacêutico (tal como grau parenteral).

[00160] O ensinamento de todas as referências no presente pedido, incluindo os pedidos de patentes e as patentes concedidas, é totalmente incorporado neste documento por referência. Uma composição ou método ou processo definido como 'compreendendo' certos elementos é entendido incluir uma composição, método ou processo (respectivamente) consistindo nesses elementos. Conforme usado neste documento, 'consistindo essencialmente em' significa que componentes adicionais podem estar presentes, desde que eles não alterem as propriedades ou funções gerais.

[00161] A invenção será ainda descrita por referência aos seguintes exemplos não limitativos:

EXEMPLOS Exemplo 1 - HPLC de um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina

[00162] O extrato bruto da casca foi separado por HPLC em fase reversa, utilizando uma coluna C4 e eluição com gradiente: fase móvel A - água/acetonitrila, 7/3 v/v com ácido trifluoracético a 0,15%; fase móvel B - acetonitrila com ácido trifluoracético a 0,15%. A detecção por UV foi a 214 nm.

[00163] As amostras de extrato bruto da casca são diluídas, conforme necessário, com água purificada. A PVPP (60 mg/mL) foi adicionada, a mistura agitada por aproximadamente 30 minutos e depois centrifugada para separar a resina de PVPP do sobrenadante.

[00164] O sobrenadante foi então analisado para proporcionar um cromatograma de HPLC UV.

[00165] A Figura 1 proporciona um exemplo representativo de um cromatograma de HPLC UV. O pico correspondendo à fração de QS-21 é indicado. Exemplo 2 - Métodos Analíticos HPLC-UV Equipamento Módulo de separações 2690/2695 da Waters Alliance

Detector de UV 2487 ou Detector de PDA 2996 da Waters Coluna de Proteína C4, 4,6 x 250 mm, 5 um, Vydac Fase Móvel A (MPA) - ácido trifluoracético a 0,15% em água/acetonitrila (70:30 v/v) Fase Móvel B (MPB) - ácido trifluoracético a 0,15% em acetonitrila Condições do gradiente linear: Tempo Vazão(ml/min) % de MPA % de MPB 0 1 100 0 30 1 78,6 21,4 33 1 14,3 85,7

[00166] 10 ul da amostra são injetados. A detecção por UV é ajustada em 214 nM.

[00167] Usando uma injeção em branco para referência, a integração dos picos no cromatograma proporciona uma absorbância total. O pico de interesse (por exemplo, pico principal de QS-21) é comparado à absorbância total para determinar o teor do pico como uma porcentagem. UPLC-UV Equipamento UPLC Acquity da Waters Detector de UV Sintonizável Acquity da Waters Coluna BEH C18, 2,1x100 mm 1,7 um, Acquity da Waters Fase Móvel A (MPA) - ácido acético a 0,025% em água/acetonitrila (70:30 v/v) Fase Móvel B (MPB) - ácido trifluoracético a 0,025% em água/acetonitrila (30:70 v/v) Condições do gradiente linear:

Tempo Vazão(ml/min) % de MPA % de MPB 0 0,5 88 12 10,2 0,5 65,7 34,3 11,2 0,5 10 90 13,2 0,5 10 90

[00168] Temperatura da coluna 28 graus C. 10 µl da amostra são injetados. A detecção por UV é ajustada em 214 nM.

[00169] Usando uma injeção em branco para referência, a integração dos picos no cromatograma proporciona uma absorbância total. O pico de interesse (por exemplo, pico principal de QS-21) é comparado à absorbância total para determinar o teor do pico como uma porcentagem. UPLC-UV/MS Equipamento UPLC Acquity da Waters Detector de UV Sintonizável Acquity da Waters Detector de Massa Único-Quadrupolo da Waters Coluna BEH C18, 2,1x100 mm, 1,7 um, Acquity da Waters Fase Móvel A (MPA) - ácido trifluoracético a 0,025% em água/acetonitrila/álcool isopropílico (75:20:5 v/v) Fase Móvel B (MPB) - ácido trifluoracético a 0,025% em água/acetonitrila/álcool isopropílico (10:72:18 v/v) Condições do gradiente linear: Tempo Vazão(ml/min) % de MPA % de MPB 0 0,6 100 0 6,23 0,6 23 77

[00170] A amostra de teste é preparada em ácido acético a 0,2% em água/acetonitrila (70:30 v/v). Temperatura da coluna 55 graus C. 10 µl da amostra são injetados. A detecção por UV é ajustada em 214 nM.

[00171] Embora os tempos de retenção variem ligeiramente entre as corridas, o grupo QS-21 está localizado em aproximadamente 3,8 min (isômero B) até aproximadamente 4,5 minutos (antes da impureza de lio).

[00172] Utilizando uma injeção em branco para referência, é realizada a integração dos picos no cromatograma que eluem após a frente do solvente entre 0,5 e cerca de 5,50 minutos e não aparecem no branco.

[00173] O monoisótopo da espécie mais abundante é identificado pela combinação de TIC sobre todo o cromatograma, para criar um espectro combinado.

[00174] A razão de componente 2002 para componente 1988 é calculada comparando a corrente de íons associada ao componente 2002 com a corrente de íons associada ao componente 1988, no pico principal de QS-21.

[00175] A Figura 5 proporciona um cromatograma ilustrativo de um extrato de saponina de acordo com a presente invenção. A Figura 6 mostra detalhes expandidos da região, incluindo o grupo QS-21 e o componente de lyo.

[00176] A Figura 7 proporciona um cromatograma de massa extraído ilustrativo para os íons de peso molecular de 1988 e 2002 de um extrato de saponina Quillaja saponaria Molina purificado. Exemplo 3 - Purificação de um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina

[00177] O extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina, tendo uma razão de componente 2018 para pico principal de QS-21 de 0,064 ou inferior e uma razão de Pico precedente para pico principal de QS-

21 de 0,4 ou inferior, foi tratado com PVPP (1 kg de PVPP por litro de extrato aquoso bruto). Após a adsorção, a mistura foi filtrada para separar a PVPP e as impurezas ligadas do licor.

[00178] A Figura 2 proporciona um cromatograma de HPLC-UV de exemplo para o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina (usado para a determinação da razão de Pico precedente para pico principal de QS-21).

[00179] A Figura 3 proporciona um cromatograma de UPLC-UV de exemplo para o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina (usado para a determinação da razão de componente 2018 para pico principal de QS-21).

[00180] O licor filtrado foi concentrado e posteriormente purificado por ultrafiltração/diafiltração usando uma membrana Hellicon de 30 kD.

[00181] O permeado resultante foi purificado por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno (Amberchrom XT20) e as seguintes condições: Inicial Final Duração Etapa % de % de % de % de (min) Eluente A Eluente B Eluente A Eluente B Injeção + Enxague 11,3 100% 0% 100% 0% Eluição de Gradiente 1 3,0 100% 0% 71% 29% Eluição de Gradiente 2 50,0 71% 29% 53% 47% Eluição de Gradiente 3 3,0 53% 47% 0% 100% Regeneração 10 0% 100% 0% 100% Gradiente 3,0 0% 100% 100% 0% Equilíbrio 13,0 100% 0% 100% 0% Eluente A: Acetonitrila a 5% e ácido acético a 0,25% Eluente B: Acetonitrila a 90% e ácido acético a 0,25% Coluna: DI de 30 cm Carga: 50-110 g por injeção

[00182] As frações foram ajuntadas para proporcionar o extrato de saponina purificado por poliestireno com uma composição:

[00183] % de pico principal de QS-21 ≥ 18% (por HPLC)

[00184] e

[00185] razão de componente 2018/pico principal de QS-21 ≤ 0,054 (por UPLC-UV).

[00186] A Figura 4 proporciona um cromatograma de UPLC-UV de exemplo para um ajuntamento de extratos de saponina purificados por poliestireno.

[00187] O ajuntamento das frações purificadas por poliestireno combinadas foi ainda purificado por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila (EPDM) e as seguintes condições: Duração % de Eluente % de Eluente Etapa (min) C B Injeção + Enxague 2,0 100% 0% Eluição Isocrática 58,0 100% 0% Regeneração 5,0 0% 100% Equilíbrio 10,0 100% 0% Eluente B: Acetonitrila a 90% e ácido acético a 0,25% Eluente C: Acetonitrila a 35,2% e ácido acético a 0,25% Coluna: DI de 45 cm Carga: 13-21 g por injeção

[00188] As frações foram reunidas para proporcionar um extrato de saponina purificado por fenila com uma composição:

[00189] % de grupo QS-21 ≥ 98,5

[00190] % de pico principal de QS-21 ≥ 94,5

[00191] % de componente 2018 ≤ 2,7%

[00192] Pico principal fora do grupo QS-21 ≤ 1% (por UPLC-UV/MS).

[00193] O extrato de saponina purificada por fenila combinado foi concentrado por captura e liberação com cromatografia em fase reversa, usando uma resina C8 (Lichroprep RP8) e as seguintes condições: Carregado para a coluna condicionada a 24% de acetonitrila e 0,20% de ácido acético. Eluiu com acetonitrila a 60% e ácido acético a 0,20% Coluna de 11 cm Carga: 50-142 g por injeção

[00194] O extrato de saponina concentrado com C8 foi submetido à troca de solvente usando ultrafiltração/diafiltração e uma membrana Pellicon de 1 kDa para reduzir o teor de acetonitrila abaixo de 21%.

[00195] O extrato de saponina trocado de solvente resultante foi então liofilizado em uma única etapa, para proporcionar o produto final.

[00196] Verificou-se que uma série de corridas de processos que proporcionam um extrato de saponina fora da especificação surgiu do uso do extrato bruto da casca com um teor excessivo de componente

2018.

[00197] Uma pluralidade de corridas de acordo com a presente invenção, começando com um extrato bruto tendo uma composição do componente 2018 adequada, foi realizada e, em cada ocasião, o produto final estava dentro da especificação.

[00198] A utilização do processo, conforme descrito no Exemplo 3, pode proporcionar consistentemente um extrato de saponina purificado de Quillaja Saponaria Molina tendo um teor definido em termos de pico principal de QS-21 e componente de 2018, tal como consistentemente pelo menos 93% de pico principal de QS-21 e 0,25-3% de 2018 e apresentando um perfil cromatográfico comparável aos cromatogramas mostrados na Figura 5, na Figura 6 e na Figura 7.

Exemplo 4 - Respostas Imunes

[00199] Os camundongos C57BL6 fêmeos com 6-8 semanas de idade (5/grupo) foram injetados duas vezes intramuscularmente, com um intervalo de 14 dias, com antígeno gE formulado com o sistema adjuvante AS01, uma formulação lipossômica compreendendo 3D-MPL e extrato de saponina preparado de acordo com a presente intenção. Um grupo de controle de 5 camundongos recebeu gE apenas com tampão.

[00200] A vacina foi preparada a partir de três lotes diferentes de extrato de saponina e os resultados são proporcionados para dois níveis de dosagem diferentes (0,4 e 0,1 ug de 3D-MPL/QS-21 por animal, correspondendo a 1/125 e 1/500 da dose humana, respectivamente).

[00201] Os baços foram coletados em D21 e os soros em D21 e D28 e analisados quanto às respostas das células T e B, respectivamente.

[00202] - ICS (Coloração Intracelular de Citocinas)

[00203] Os baços foram coletados em meio RPMI e dissociados usando um moedor de tecidos de oleiro (homogeneizador) usando dois movimentos para cima e para baixo. As amostras homogeneizadas foram transferidas para tubos de 50 ml de polipropileno. O material fibroso foi removido por filtração através de um filtro de células de nylon de 100 uM. As células foram então lavadas, contadas e suspensas novamente a 107 células por ml.

[00204] A ICS é a tecnologia que permite a quantificação de linfócitos T específicos para o antígeno com base na produção de citocinas.

[00205] As células linfoides são reestimuladas durante a noite (O.N) in vitro com peptídeos gE ou meio, na presença de um inibidor de transporte de proteínas (brefeldina A). Essas células são então processadas pelo procedimento imunofluorescente convencional, usando anticorpos fluorescentes (coloração extracelular: CD4, CD8; coloração intracelular: TNF-alfa, IFN-gama e IL2).

[00206] Os resultados são expressos como uma frequência de células positivas para citocinas nas populações de células CD4 após subtração da condição do meio para cada camundongo. Os dados são apresentados para a população que mostrou expressão de pelo menos duas citocinas (IL2, IFN-alfa ou TNF-alfa). Os resultados são mostrados na Figura 9. - ELISA

[00207] A IgG total anti-gE foi medida por ELISA. As placas de 96 poços foram revestidas com antígeno durante a noite, a 4°C. As placas foram então lavadas e saturadas com tampão de saturação, por uma hora, a 37°C. Depois, 100 ul de soro de camundongo diluído ou padrão ou controle foram adicionados e incubados por 1h 30, a 37°C. Após a lavagem, as placas foram incubadas durante uma hora, a 37°C, com 100 µl de IgG-Biotinilada anti-camundongo. Após a lavagem, as placas foram incubadas por 30 min, a 37°C, com 100 ul de conjugado de Estreptavidina-POD. Após a lavagem, 100 ul de TMB por poço foram adicionados e as placas foram mantidas no escuro, à temperatura ambiente, por 15 minutos. Para parar a reação, 100 ul de H2SO4 0,4 N foram adicionados por poço. A absorbância foi lida em um comprimento de ondas de 450/630 nm por uma leitora de placas Elisa. Os resultados foram calculados usando o software Softmax-Pro. Os resultados são mostrados na Figura 10 (D21) e na Figura 11 (D28). Conclusões

[00208] Uma composição consistente de extrato de saponina em diferentes lotes de produção resultou em respostas imunológicas com um grau limitado de variação. Bibliografia Dalsgaard et al. em 1974 ('Saponin adjuvants', Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlim, p243-254)

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Extrato de saponina, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 93% de pico principal de QS-21 e 0,25-3% de componente 2018 por absorbância UV a 214 nm.

2. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9.

3. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 98% do grupo QS- 21 por absorbância UV a 214 nm.

4. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 98% do grupo QS- 21, pelo menos 93% do pico principal de QS-21, 0,25-3% do componente 2018, 1% ou menos do maior pico fora do grupo QS-21 por absorbância UV a 214 nm e em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9.

5. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, de componente 1988 por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

6. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, de componente 1856 por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

7. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 0,5%, tal como pelo menos 1%, de componente 2002 por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

8. Extrato de saponina, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 93% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de

1855,9, 1987,9 ou 2001,9 e 0,25-3% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 2017,9 por absorbância UV a 214 nm.

9. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9.

10. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 98% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1517,7, 1711,8, 1855,9, 1987,9, 2001,9, 2017.9 ou 2118 por absorbância UV a 214 nm.

11. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 98% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1517,7, 1711,8, 1855,9, 1987,9, 2001,9, 2017,9 ou 2118, pelo menos 93% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 1855,9, 1987.9 ou 2001.9, 0,25-3% de glicosídeos triterpenoides tendo m/z de 2017,9, 1% ou menos de qualquer outro pico por absorbância UV a 214 nm e em que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9

12. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, de componente 1988 por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

13. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, de componente 1856 por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

14. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 0,5%, tal como pelo menos 1%, de componente 2002 por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

15. Extrato de saponina, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 93% de:

,

ou

, e 0,25-3% de:

O O

O

O O

OH O OH

OH O

HO O

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O HO O O OH

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O O OHOH

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O

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OH

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OH por absorbância UV a 214 nm.

16. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o monoisótopo da espécie mais abundante é uma m/z de 1987,9.

17. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 98% de ,

,

O O

O

O O

OH O OH

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O HO O O OH

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O O OHOH

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O

HO

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OH

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OH , , , ou .

18. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 98% de

,

O O

O

O O

OH O OH

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O HO O O OH

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OH

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OH , , , ou e componente

2118.

19. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 98% de , ,

, ,

O O

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O O

OH O OH

OH O

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O HO O O OH

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,

ou

, pelo menos 93% de:

,

ou

, 0,25-3% de:

O O

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OH

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20. Extrato de saponina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 98% de , ,

, ,

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, ou componente 2118, pelo menos 93% de:

,

ou , 0,25-3% de:

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21. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, de e por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

22. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, de por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

23. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos 0,5%, tal como pelo menos 1%, de , por absorbância UV a 214 nm e por abundância de íons relativa.

24. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 1% de

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OH por absorbância UV a 214 nm.

25. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é seco.

26. Método para identificar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina para uso na fabricação de um extrato de saponina purificado, caracterizado pelo fato de o dito método compreender as etapas de:

(i) determinar a razão de componente 2018/pico principal de QS-21 por UPLC-absorbância UV a 214 nm; e (ii) selecionar um extrato aquoso bruto tendo uma razão de componente 2018/pico principal de QS-21 que seja ≤ 0,075.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é para uso na fabricação do extrato de saponina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

28. Método para a fabricação de um extrato de saponina purificado, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (i) selecionar um extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina tendo uma razão de componente 2018 para pico principal de QS-21 de 0,075 ou menor; (ii) purificar o extrato por adsorção em polivinilpirolidona; (iii) purificar o extrato por diafiltração, ultrafiltração ou diálise; (iv) purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de poliestireno; e (v) purificar o extrato por cromatografia em fase reversa usando uma resina de fenila.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é uma solução aquosa que contém pelo menos 1 g/L, tal como pelo menos 2 g/L, especialmente pelo menos 2,5 g/L e em particularmente pelo menos 2,8 g/L de pico principal de QS-21.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que o extrato aquoso bruto de Quillaja saponaria Molina é um extrato da casca.

31. Extrato de saponina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que é para uso como um adjuvante.

32. Composição adjuvante, caracterizada pelo fato de que compreende um extrato de saponina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

33. Extrato de saponina ou composição adjuvante, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizados pelo fato de que o adjuvante é uma formulação lipossômica.

34. Extrato de saponina ou composição adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizados pelo fato de que o adjuvante compreende um agonista de TLR4.

35. Extrato de saponina ou composição adjuvante, de acordo com a reivindicação 34, caracterizados pelo fato de que o agonista de TLR4 é o 3D-MPL.

36. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição adjuvante como definida em qualquer uma das reivindicações 32 a 35 e um imunógeno ou antígeno, ou um polinucleotídeo que codifica o imunógeno ou o antígeno.

37. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o antígeno é derivado do Vírus varicella zoster, tal como o antígeno de SEQ ID Nº 6.

38. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o antígeno é derivado do vírus sincicial respiratório humano, tal como o antígeno de SEQ ID Nº 7.