EA021393B1

EA021393B1 - Рекомбинантные антигены rsv

Info

Publication number: EA021393B1
Application number: EA201070794A
Authority: EA
Inventors: Ги Жан Мари Фернан Пьер Боду; Норман Бле; Патрик Ро; Жан-Луи Рюэль
Original assignee: Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date: 2007-12-24
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2015-06-30
Also published as: EP3109258A1; HRP20161353T1; SI2222710T1; JP5711972B2; EP3109258B1; SG188813A1; KR20100109933A; EP4206231A1; EP4108687A1; EP4108688A1; EP4219566A2; KR101617895B1; HUE029258T2; BRPI0821532A2; MX2010007107A; PT2222710T; EP3508505A1; ZA201004289B; CY1118090T1; EP2222710B8

Abstract

Изобретение предоставляет рекомбинантные антигены респираторно-синцитиального вируса (RSV) и способы их получения и применения, в том числе иммуногенные композиции (например, вакцины) для лечения и/или предупреждения RSV инфекции.

Description

Описание этого изобретения касается области иммунологии. Конкретнее, описание этого изобретения относится к композициям и способам, вызывающим иммунный ответ, специфичный для респираторно-синцитиального вируса (К8У).

Респираторно-синцитиальный вирус (К8У) является самой частой в мировом масштабе причиной инфекций нижних дыхательных путей (ЬК1) у младенцев возрастом менее 6 месяцев и недоношенных детей, родившихся на сроке беременности, равном 35 неделям, или до этого срока. Характеристика вызываемого К8У заболевания включает широкий набор респираторных симптомов от ринита и отита до пневмонии и бронхиолита, при этом два последних из названных заболеваний сопровождаются значительными клиническими проявлениями и смертностью. Люди являются единственным известным резервуаром К8У. Распространение вируса из зараженных выделений в носовой полости происходит через большие респираторные капельки, значит, для передачи необходим близкий контакт с инфицированным индивидуумом или зараженной поверхностью. К8У может сохраняться в течение нескольких часов на игрушках или других предметах, что объясняет высокую степень внутрибольничных К8У инфекций, особенно в педиатрический палатах.

По оценкам цифры для инфицирования и смертности ежегодно по всему миру для К8У составляют 64 миллионов и 160000 соответственно. По оценкам только в США К8У является виновником 1800075000 госпитализаций и 90-1900 смертей ежегодно. Достаточно подтверждено документально, что в умеренных климатах К8У является причиной ежегодных зимних эпидемий острой ЬК1, включающей бронхиолит и пневмонию. В США почти все дети инфицированы К8У к возрасту, составляющему два года. По расчетам коэффициент заболеваемости связанной с К8У ЬК1 у здоровых в других отношениях детей составляет 37 на 1000 детей/год в первые два года жизни (45 на 1000 детей/год у младенцев возрастом менее 6 месяцев), а риск госпитализации составляет 6 на 1000 детей/год (на 1000 детей/год в первые шесть месяцев жизни). Заболеваемость выше у детей с сердечно-легочным заболеванием и у недоношенных детей, которые составляют почти половину связанных с К8У госпитализаций в США. Дети, подвергающиеся более тяжелой ЬК1, вызванной К8У, позже имеют повышенную заболеваемость астмой. Эти исследования демонстрируют широко распространенную потребность в вакцинах против К8У, а также в их применении в промышленно развитых странах, в которых затраты на уход за пациентами с тяжелой ЬК1 и осложнениями у них являются значительными. Во все большей мере подтверждается, что К8У также является важной причиной заболеваемости гриппоподобной болезнью у пожилого.

Различные подходы были проверены в попытках получить безопасную и эффективную вакцину против К8У, которая вызывает долговременные и защитные иммунные ответы в здоровых и подверженных риску популяциях. Однако ни один из проверенных до настоящего времени кандидатов не признан безопасным и эффективным в качестве вакцины с целью предупреждения К8У инфекции и/или ослабления или предупреждения К8У заболевания, включающего инфекции нижних дыхательных путей (ЬК1).

Краткое изложение сущности изобретения

Описание этого изобретения касается рекомбинантных антигенов респираторно-синцитиального вируса (К8У). Конкретнее, раскрытие этого изобретения имеет отношение к антигенам, включающим рекомбинантный белок Р, который был модифицирован для стабилизации трехмерной конформации до его слияния. Описываемые в настоящем описании рекомбинантные антигены проявляют более высокую иммуногенность и особенно предпочтительно используются в качестве компонентов иммуногенных композиций (например, вакцин) для защиты от К8У инфекции и/или заболевания. Также раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантные антигены, иммуногенные композиции, содержащие антигены, и способы продуцирования и применения антигенов.

Краткое описание фигур

Фиг. 1А является схематической иллюстрацией, указывающей на структурные признаки белка Р К8У. Фиг. 1В является схематической иллюстрацией приводимых в качестве примеров антигенов на основе белка Р до слияния (РгеР) К8У.

Фиг. 2 является графиком в виде ломаной, иллюстрирующей репрезентативные результаты анализа РгеР с помощью фракционирования потоков асимметричных полей (АРР-МАЬ8).

Фиг. 3 является столбчатой диаграммой, демонстрирующей подавление нейтрализующей активно- 1 021393 сти сыворотки человека с помощью РгеР антигена.

Фиг. 4А и В являются столбчатыми диаграммами, демонстрирующими титры 1§О в сыворотках, индуцированные у мышей в ответ на РгеР антиген.

Фиг. 5А и В являются столбчатыми диаграммами, иллюстрирующими титры нейтрализующих антител, специфичных для К8У, индуцированные в ответ на РгеР антиген.

Фиг. 6А и В являются графиками, на которых показана защита от заражения, обеспечиваемая РгеР антигеном К8У, у мышей.

Фиг. 7 является графиком, оценивающим лейкоциты при ВЛЬ после иммунизации и заражения. Подробное описание изобретения

Введение

Разработка вакцин для предупреждения Р8У инфекции затруднялась тем фактом, что иммунные ответы хозяина, по-видимому, играют роль в патогенезе заболевания. В результате ранних исследований в 1960 годах установлено, что дети, вакцинированные вакциной на основе инактивированного формалином К8У, страдают более тяжелым заболеванием вследствие последующего воздействия вируса по сравнению с невакцинированными контрольными субъектами. Результатом этих начальных испытаний явились госпитализация 80% вакцинированных пациентов и две смерти. Увеличенная тяжесть заболевания была воспроизведена в моделях на животных и, как полагают, является следствием неадекватных уровней нейтрализующих антител в сыворотке, отсутствия локального иммунитета и чрезмерной индукции, характерного для Т-клеток-хелперов типа 2 (ТЬ2), иммунного ответа с легочной эозинофилией и увеличенной продукцией цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-5. В противоположность, результативная вакцина, защищающая от Р8У инфекции, вызывает иммунный ответ со сдвигом в направлении ТН1-типа. характеризующегося продукцией 1Ь-2 и γ-интерферона (ΙΡΝ).

Раскрытие настоящего изобретения имеет отношение к рекомбинантным антигенам респираторносинцитиального вируса (К8У), которые разрешают проблемы, обнаруженные с антигенами К8У, используемыми ранее в вакцинах, и улучшают иммунологические, а также относящиеся к производству свойства антигена. Описываемые в настоящем описании рекомбинантные антигены Р8У включают аналог белка слияния (Р), который включает растворимый полипептид белка Р, который был модифицирован для стабилизации конформации белка Р до его слияния, т.е. конформации зрелого собранного белка Р до слияния с мембраной клетки-хозяина. Эти аналоги белка Р названы РтеР или РтеР антигены с целью ясности и упрощения. Описываемые в настоящем описании РгеР антигены основаны на непредвиденном открытии того, что растворимые аналоги белка Р, которые были модифицированы путем включения гетерологичного домена тримеризации, проявляют улучшенные иммуногенные характеристики и являются безопасными и высокопротективными после введения субъекту ίη νίνο.

Детали структуры белка Р Р8У предоставлены в настоящем описании с учетом терминологии и обозначений, широко распространенных в данной области техники, и схематически иллюстрируются на фиг. 1А. Схематическая иллюстрация приводимых в качестве примеров РгеР антигенов представлена на фиг. 1В. Квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что любой белок Р Р8У может быть модифицирован для стабилизации конформации до его слияния в соответствии с предоставленными в настоящем описании идеями. Поэтому для облегчения понимания принципов, определяющих продукцию РгеР антигенов, индивидуальные структурные компоненты будут указываться с учетом приводимого в качестве примера белка Р, полинуклеотидная и аминокислотная последовательности которого представлены в 8ЕО ГО N0: 1 и 2 соответственно. Подобным образом, когда это применимо, Обелковые антигены описываются с учетом приводимого в качестве примера белка О, полинуклеотидная и аминокислотная последовательности которого представлены в 8Е0 ГО N0: 3 и 4 соответственно.

С учетом первичной аминокислотной последовательности полипептида белка Р (фиг. 1А) следующие термины используются для описания структурных признаков РгеР антигенов.

Термин Р0 относится к полноразмерному транслированному предшественнику белка Р. Полипептид Р0 можно разбить на Р2- и Р1-домены, разделенные находящимся между ними пептидом, названным рер27. Во время созревания полипептид Р0 подвергается протеолитическому расщеплению в двух сайтах для фурина, расположенных между Р2 и Р1 и фланкирующих рер27. Для цели последующего обсуждения Р2-домен включает по крайней мере часть, и вплоть до всех, аминокислот 1-109, а растворимая часть Р1-домена включает по крайней мере часть, и вплоть до всех, аминокислот 137-526 белка Р. Как обсуждалось выше, эти положения аминокислот (и все последующие положения аминокислот, названные в настоящем описании) даны с учетом приводимого в качестве примера полипептида-предшественника белка Р (Р0) 8ЕО ГО N0: 2.

Антиген на основе белка Р до его слияния (или РгеР) является растворимым (т.е. не связанным с мембраной) аналогом белка Р, который включает по крайней мере одну модификацию, которая стабилизирует конформацию белка Р до его слияния, из условия, чтобы антиген Р8У сохранял по крайней мере один иммунодоминантный эпитоп конформации белка Р до его слияния. Растворимый полипептид белка Р включает Р2-домен и Р1-домен белка Р Р8У (но не включает трансмембранный домен белка Р Р8У). В приводимых в качестве примеров вариантах осуществления Р2-домен включает аминокислоты 26-105, а

- 2 021393

Р1-домен включает аминокислоты 137-516 белка Р. Однако можно использовать меньшие части, если сохраняется трехмерная конформация стабилизированного РгеР антигена. Подобным образом, полипептиды, которые включают дополнительные структурные компоненты (например, слитые полипептиды), могут также использоваться вместо приводимых в качестве примеров Р2- и Р1-доменов, если дополнительные компоненты не нарушают трехмерную конформацию или иначе не оказывают неблагоприятное воздействие на стабильность, продукцию или процессирование или не снижают иммуногенность антигена. Р2- и Р1-Домены находятся в ориентации от Ν-конца к С-концу, предназначенной для воспроизведения укладки и сборки аналога белка Р в зрелую конформацию до его слияния. Для усиления продукции Р2-домену может предшествовать секреторный сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид встречающего в природе белка Р или гетерологичный сигнальный пептид, выбранный для усиления продукции и секреции в клетках-хозяинах, в которых экспрессируется рекомбинантный РгеР антиген.

РгеР антигены стабилизируют (в трехмерной конформации до слияния) путем введения одной или нескольких модификаций, например, добавления, делеции или замены одной или нескольких аминокислот. Одной такой стабилизирующей модификацией является добавление аминокислотной последовательности, включающей гетерологичный стабилизирующий домен. В приводимых в качестве примеров вариантах осуществления гетерологичным стабилизирующим доменом является домен мультимеризации белков. Одним особенно предпочтительным примером такого домена мультимеризации белков является биспиральный домен, такой как домен, богатый остатками изолейцина (изолейциновая молния), который активирует тримеризацию множества полипептидов, имеющих такой домен. Приводимый в качестве примера домен изолейциновая молния представлен в 8ЕО ГО N0: 11. Как правило, гетерологичный стабилизирующий домен находится на С-конце Р1-домена.

Необязательно домен мультимеризации соединен с Р1-доменом через короткую аминокислотную линкерную последовательность, такую как последовательность 00. Линкером может также быть более длинный линкер (например, включающий последовательность 00, такой как аминокислотная последовательность 008008008; 8Е0 ГО N0: 14). В данной области техники известны многочисленные конформационно нейтральные линкеры, которые могут использоваться в этой связи без нарушения конформации РгеР антигена.

Другой стабилизирующей модификацией является исключение сайта распознавания и расщепления фурином, находящегося между Р2- и Р1-доменами в природном белке Р0. Один или оба сайта распознавания фурином, находящиеся в положениях 105-109 и положениях 133-136, могут быть исключены путем делеции или замены одной или нескольких аминокислот в сайтах распознавания фурином из условия, чтобы протеаза не была способна к расщеплению полипептида РгеР в составляющих его доменах. Необязательно находящийся между ними пептид рер27 может также быть удален или заменен, например, линкерным пептидом. Дополнительно или необязательно, сайт расщепления не фурином (например, сайт для металлопротеиназы в положениях 112-113) вблизи от пептида слияния может быть удален или заменен.

Другим примером стабилизирующей мутации является добавление гидрофильной аминокислоты или замена не нее в гидрофобный(ом) домен(е) белка Р. Как правило, заряженную аминокислоту, такую как лизин, будут добавлять, или ее будет замещать нейтральный остаток, такой как лейцин, в гидрофобном районе. Например, гидрофильную аминокислоту можно добавить, или ее можно заместить гидрофобной или нейтральной аминокислотой в биспиральном НКВ-домене экстраклеточного домена белка Р. В качестве примера, заряженным аминокислотным остатком, таким как лизин, можно заместить лейцин, присутствующий в положении 512 белка Р. Альтернативно или дополнительно, гидрофильную аминокислоту можно добавить, или ее можно заместить гидрофобной или нейтральной аминокислотой в НКАдомене белка Р. Например, одну или несколько заряженных аминокислот, таких как лизин, можно вставить в положение 105-106 или вблизи этого положения (например, после аминокислоты, соответствующей остатку 105 ссылочной 8Е0 ГО N0: 2, например, между аминокислотами 105 и 106) РгеР антигена. Необязательно гидрофильные аминокислоты можно добавить или ими заместить аминокислоты как в НКА-домене, так и НКБ-домене. Альтернативно, один или несколько гидрофобных остатков можно делетировать, если на общую конформацию РгеР антигена не оказывается неблагоприятное воздействие.

Любые и/или все стабилизирующие модификации могут использоваться отдельно и/или в комбинации с любой из других стабилизирующих модификаций, описываемых в настоящем описании, для получения РгеР антигена. В приводимых в качестве примеров вариантах осуществления белок РгеР включает полипептид, включающий Р2-домен и Р1-домен без находящегося между Р2- и Р1-доменами сайта расщепления фурином и с гетерологичным стабилизирующим доменом (например, доменом тримеризации), находящимся на С-конце Р1-домена. В определенных вариантах осуществления РгеР антиген также включает одно или несколько добавлений гидрофильных остатков и/или замен на них в гидрофобном НКА- и/или НКВ-домене. Необязательно РгеР антиген имеет модификацию по крайней мере одного сайта расщепления не фурином, например, сайта для металлопротеиназы.

РгеР антиген может необязательно включать дополнительный полипептидный компонент, который включает, по крайней мере, иммуногенную часть белка 0 К8У. Т.е. в определенных вариантах осущест- 3 021393 вления РгеР антиген является химерным белком, который включает как компонент белка Р, так и компонент белка О. Компонент белка Р может быть любым из РгеР антигенов, описанных выше, а компонент белка О выбирают из иммунологически активной части белка О К8У (вплоть до и/или в том числе полноразмерный О-белок). В приводимых в качестве примеров вариантах осуществления полипептид белка О включает аминокислоты 149-229 белка О (где положения аминокислот указаны с учетом последовательности белка О, представленной в 8ЕО ГО N0: 4). Квалифицированный в данной области техники специалист определит, что можно использовать меньшую часть или фрагмент белка О, если выбранная часть сохраняет доминантные иммунологические признаки более большого фрагмента белка О. В частности, выбранный фрагмент сохраняет иммунологически доминантный эпитоп между приблизительно положениями аминокислот 184-198 (например, аминокислотами 180-220) и является достаточно длинным для укладки и сборки в стабильную конформацию, которая демонстрирует иммунодоминантный эпитоп. Могут также использоваться более длинные фрагменты, например, от приблизительно аминокислоты 128 до приблизительно аминокислоты 229, вплоть до полноразмерного белка О, если выбранный фрагмент укладывается в стабильную конформацию в условиях химерного белка и не вносит помехи в продукцию, процессирование или стабильность после продуцирования рекомбинантно в клеткаххозяинах. Необязательно, компонент белка О соединен с компонентом белка Р через короткую аминокислотную линкерную последовательность, такую как последовательность ОО. Линкером может также быть более длинный линкер (такой как аминокислотная последовательность ОО8ОО8ОО8; 8Е0 ГО N0: 14). В данной области техники известны многочисленные конформационно нейтральные линкеры, которые могут использоваться в этой связи без нарушения конформации РгеР антигена.

Необязательно компонент белка О может включать одну или несколько аминокислотных замен, которые ослабляют или предотвращают усиленное вирусное заболевание в модели вызванного К8У заболевания на животном. Т.е. белок О может включать аминокислотную замену из условия, чтобы при введении субъекту, выбираемому из принятой модели на животном (например, модели К8У на мышах), иммуногенной композиции, включающей химерный РгеР-О антиген, субъект не демонстрировал или демонстрировал ослабленные симптомы вирусного заболевания, в отношении которого вакцина является активной, (например, эозинофилию, нейтрофилию) по сравнению с контрольным животным, которому вводят вакцину, которая содержит немодифицированный белок О. Ослабление и/или предотвращение вирусного заболевания, в отношении которого вакцина является активной, может наблюдаться, когда иммуногенные композиции вводятся в отсутствие адъюванта (но не когда, например, антигены вводятся в присутствии сильного ТЬ1-индуцирующего адъюванта). Дополнительно аминокислотная замена может ослабить или предотвратить вирусное заболевание, в отношении которого вакцина является активной, после введения являющемуся человеком субъекту. Примером подходящей аминокислотной замены является замена аспарагина в положении 191 аланином (Аки А1а в положении аминокислоты 191: Ν191Α).

Необязательно описываемый в настоящем описании РгеР антиген может включать дополнительную последовательность, которая служит в качестве вспомогательного средства для очистки. Одним примером является полигистидиновая метка. Такую метку можно удалить из конечного продукта, при желании.

После экспрессии РгеР антигены подвергаются внутримолекулярной укладке и сборке в зрелый белок, который включает мультимер полипептидов. Предпочтительно, когда полипептиды РгеР антигена собираются в триммер, который имеет сходство с конформацией зрелого, подвергнутого процессированию белка Р К8У до его слияния.

Любой из описываемых в настоящем описании РгеР антигенов (в том числе РгеР-О антигены) может предпочтительно использоваться в иммуногенных композициях с целью вызова защитного иммунного ответа против К8У. Такие иммуногенные композиции обычно включают фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент, такой как буфер. Для усиления иммунного ответа, вызываемого после введения, иммуногенная композиция обычно также включает адъювант. В случае иммуногенных композиций для вызова защитного иммунного ответа против К8У (например, вакцин) композиция предпочтительно включает адъювант, который преимущественно вызывает иммунный ответ ТЬ1-типа (адъювант со сдвигом в направлении ТЬ1-типа). Как правило, адъювант выбирают так, чтобы он подходил для введения целевой популяции, которой должна вводиться композиция. Следовательно, в зависимости от применения адъювант выбирают так, чтобы он подходил для введения, например, новорожденным или пожилым.

Описываемые в настоящем описании иммуногенные композиции предпочтительно используют в качестве вакцин для уменьшения или предотвращения инфицирования К8У, без вызова патологической ответной реакции (такой как вирусное заболевание, в отношении которого вакцина является активной) после введения или воздействия К8У.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция включает РгеР антиген (такой как приводимый в качестве примера вариант, иллюстрируемый 8Е0 ГО N0: 6) и второй полипептид, который включает компонент белка О. Компонент О-белка обычно включает, по крайней мере, аминокислоты 149-229 белка О. Хотя могут использоваться меньшие части белка О, такие фрагменты должны включать, как минимум, иммунологически доминантный эпитоп из аминокислот 184-198. Альтернатив- 4 021393 но, белок О может включать большую часть белка О, например аминокислоты 128-229 или 130-230, необязательно в виде элемента большего белка, например, полноразмерного белка О, или химерного полипептида.

В других вариантах осуществления иммуногенная композиция включает РгеР антиген, являющийся химерным белком, который также включает компонент белка О (такой как приводимые в качестве примеров варианты, иллюстрируемые δΕΟ ГО N0: 8 и 10). Компонент белка О такого химерного РгеР (или РгеР-О) антигена обычно включает, по крайней мере, аминокислоты 149-229 белка О. Как отмечено выше, могут также использоваться меньшие или большие фрагменты (например, аминокислоты 129-229 или 130-230) белка О, если сохраняются иммунодоминантные эпитопы, и не оказывается неблагоприятное воздействие на конформацию РгеР-О антигена.

Необязательно иммуногенные композиции могут также включать по крайней мере один дополнительный антиген патогенного организма, отличного от К§У. Например, патогенным организмом является вирус, отличный от К§У, такой как вирус парагриппа (Р1У), кори, гепатита В, полиовирус или вирус гриппа. Альтернативно, патогенным организмом может быть бактерия, такая как возбудитель дифтерии, столбняка, коклюша, ИаеторЫ1и8 тПиеп/ае и Риеитососсик.

Рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из РгеР антигенов (в том числе РгеР-О антигены), являются также отличительным признаком описания этого изобретения. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей РгеР антиген, оптимизирована для экспрессии в выбранном хозяине (таком как клетки СНО, другие клетки млекопитающих или клетки насекомых). Соответственно векторы, в том числе экспрессионные векторы (в том числе векторы для экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках), являются отличительным признаком описания этого изобретения. Подобным образом, клетки-хозяины, включающие такие нуклеиновые кислоты и векторы, являются отличительным признаком описания этого изобретения. Такие нуклеиновые кислоты могут также использоваться в связи с иммуногенными композициями для введения субъекту для вызова иммунного ответа, специфичного для К8У.

РгеР антигены предпочтительно используют для предупреждения и/или лечения К8У инфекции. Таким образом, другой аспект описания этого изобретения имеет отношение к способу вызова иммунного ответа против К8У. Способ включает введение иммунологически эффективного количества композиции, содержащей РгеР антиген, субъекту (такому как являющийся человеком или животным субъект). Введение иммунологически эффективного количества композиции вызывает иммунный ответ, специфичный для эпитопов, присутствующих в РгеР антигене. Такой иммунный ответ может включать гуморальные иммунные ответы (например, продукцию нейтрализующих антител) и/или Т-клеточные иммунные реакции (например, продукцию цитокинов). Предпочтительно, когда иммунный ответ, вызванный РгеР антигеном, включает элементы, которые являются специфичными для по крайней мере одного конформационного эпитопа, присутствующего в конформации белка Р К8У до его слияния. РгеР антигены и композиции могут вводиться субъекту без усиления вирусного заболевания после контактирования с К8У. Предпочтительно, когда описываемые в настоящем описании РгеР антигены и соответственно составленные иммуногенные композиции вызывают иммунный ответ со сдвигом в направлении ТЫ-типа. который уменьшает или предотвращает инфицирование К8У и/или ослабляет или предотвращает патологическую ответную реакцию после инфицирования К8У.

Иммуногенные композиции можно вводить рядом путей, включающих такие пути, как интраназальный, при котором РгеР антиген непосредственно приводится в контакт со слизистой оболочной верхних дыхательных путей. Альтернативно, можно использовать более традиционные пути введения, такие как внутримышечный путь введения.

Таким образом, также предусматривается применение любого из описываемых в настоящем описании антигенов К8У (или нуклеиновых кислот) для приготовления лекарственного средства для лечения К8У инфекции (например, профилактического лечения или предупреждения К8У инфекции). Соответственно, в описании этого изобретения предоставляются описываемые в настоящем описании рекомбинантные антигены К8У или иммуногенные композиции для применения в медицине, а также их применение для предупреждения или лечения связанных с К8У заболеваний.

Дополнительные детали в отношении РгеР антигенов и способы их применения представлены ниже в описании и примерах.

Термины

Для облегчения рассмотрения различных вариантов осуществления этого изобретения предоставляются следующие объяснения терминов. Дополнительные термины и объяснения могут быть предоставлены в контексте описания этого изобретения.

Если не приведено иных объяснений, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значение, одинаковое со значением, в котором они обычно понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в области техники, к которой относится описание этого изобретения. Определения общепринятых в молекулярной биологии терминов можно найти (см. Вефатт Бе\ут в книге Оеиек У, изданной Οχ&τά Итуегейу Рге88, 1994 (ΙδΒΝ 0-19-854287-9); у КеиДгете и др. (еД§) в ТНе Еисус1ореД1а οί Мо1еси1аг Вю1о§у, изданной В1асктее11 8аеисе ЫД., 1994 (ΙδΒΝ 0-632-02182- 5 021393

9), и у КоЬсй А. Меуегк (еб.) в Мо1еси1аг Вю1о§у апб Вю1ссйпо1о§у: а Сотргскспбус Эекк КсГсгспсс. изданной УСН РиЬБкйсгк, 1пс., 1995 (Ι8ΒΝ 1-56081-569-8)).

Термины в единственном числе включают объекты во множественном числе, кроме случаев, когда контекст говорит об ином. Подобным образом, предполагается, что слово или включает и, кроме случаев, когда контекст говорит об ином. Термин множество относится к двум или более. Кроме того, должно быть понятно, что все размеры в основаниях или размеры в аминокислотах и все значения молекулярных масс, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предоставлены для описания. Кроме того, предполагается, что численные ограничения, приведенные по отношению к концентрациям или уровням вещества, например, антигена, являются приблизительными. Таким образом, если указано, что концентрация составляет, по крайней мере, (например) 200 пг, предполагается, что концентрация составляет по крайней мере приблизительно (или ~) 200 пг.

Хотя способы и материалы, схожие или эквивалентные способам или материалам, описанным в настоящем описании, могут использоваться при осуществлении на практике или проверке этого изобретения, подходящие способы и материалы описываются ниже. Термин включает означает включать. Таким образом, если контекст не диктует иное, будет подразумеваться, что слово включает и такие варианты, как включают и включающий, означают включение указанного соединения или композиции (например, нуклеиновой кислоты, полипептида, антигена) или стадии, или группы соединений или стадий, а не исключение любых других соединений, композиций, стадий или их групп. Сокращение т.е происходит от латинского выражения схстрП дгаба и используется в настоящем описании для обозначения не ограничивающего примера. Следовательно, сокращение т.е. является синонимом термина например.

Респираторно-синцитиальный вирус (К8У) является патогенным вирусом семейства Рагатухоушбас, подсемейства Рпситоутпас, рода Рпситоу1ги5. Геном К8У является молекулой отрицательносмысловой РНК, которая кодирует 11 белков. Тесная связь РНК-генома с вирусным белком N образует нуклеокапсид, упакованный внутри оболочки вируса. Были описаны две группы штаммов К8У человека, группы А и В, на основе различий в антигенности гликопротеина С. На данное число выделены многочисленные штаммы К8У. Приводимые в качестве примеров штаммы, обозначенные с помощью входящих номеров в СепВапк и/или ЕМВЬ, можно найти в заявке νθ 2008114149, которая включена в данное описание посредством ссылки с целью описания последовательностей нуклеиновых кислот и полипептидных последовательностей белков Р и С, подходящих для использования в РгеР антигенах (в том числе химерных РгсР-С антигенах). Дополнительные штаммы К8У надеются выделить и включить в род Р8У. Так же род Р8У включает варианты, возникающие из встречающихся в природе (например, ранее или впоследствии идентифицированных) штаммов с помощью генетического дрейфа или искусственного синтеза и/или рекомбинации.

Термин белок Р или белок слияния, или полипептид белка Р или полипептид белка слияния относится к полипептиду или белку, имеющему всю или часть аминокислотной последовательности полипептида белка слияния К8У. Подобным образом, термин белок С или полипептид белка С относится к полипептиду или белку, имеющему всю или часть аминокислотной последовательности полипептида белка прикрепления К8У. Многочисленные белки слияния и прикрепления К8У были описаны и известны квалифицированным в данной области техники специалистам. В νθ 2008114149 изложены приводимые в качестве примеров варианты белков Р и С (например, встречающие в природе варианты), общедоступные на дату подачи этой заявки.

Вариант со ссылкой на нуклеиновую кислоту или полипептид (например, нуклеиновую кислоту или полипептид белка Р или С К8У или нуклеиновую кислоту или полипептид РгсР) является нуклеиновой кислотой или полипептидом, который отличается от ссылочной нуклеиновой кислоты или полипептида. Обычно различие(я) между вариантом и ссылочной нуклеиновой кислотой или полипептидом составляет пропорционально небольшое число различий по сравнению с референтом.

Доменом полипептида или белка является структурно определенный элемент внутри полипептида или белка. Например, домен тримеризации является аминокислотной последовательностью внутри полипептида, который активирует сборку полипептида в тримеры. Например, домен тримеризации может активировать сборку в тримеры через объединения с другими доменами тримеризации (дополнительных полипептидов с одинаковыми или различными аминокислотными последовательностями). Термин также используется для ссылки на полинуклеотид, который кодирует такой пептид или полипептид.

Термины природный или встречающийся в природе относятся к такому элементу, как белок, полипептид или нуклеиновая кислота, который присутствует в таком же состоянии, в котором он находится в природе. Т.е. элемент не был модифицирован искусственно. Будет понятно, что в контексте описания этого изобретения существуют многочисленные природные/встречающиеся в природе варианты белков или полипептидов К8У, например, полученных из различных встречающихся в природе штаммов или изолятов К8У.

Термин полипептид относится к полимеру, в котором мономерами являются аминокислотные остатки, соединенные вместе благодаря амидным связям. Предполагается, что используемые в настоящем

- 6 021393 описании термины полипептид или белок охватывают любую аминокислотную последовательность и включают модифицированные последовательности, такие как гликопротеины. В частности, предполагается, что термин полипептид охватывает встречающиеся в природе белки, а также белки, которые продуцированы рекомбинантно или синтетически. Термин фрагмент со ссылкой на полипептид относится к части (т.е. подпоследовательности) полипептида. Термин иммуногенный фрагмент относится ко всем фрагментам полипептида, которые сохраняют по крайней мере один предоминантный иммуногенный эпитоп полноразмерного ссылочного белка или полипептида. Ориентацию внутри полипептида обычно представляют в направлении от Ν-конца к С-концу, определяемом ориентацией амино-составляющей и карбоксильной составляющей индивидуальных аминокислот. Полипептиды транслируются от Ν- или амино-конца в направлении к С-концу или карбоксильному концу.

Сигнальный пептид является короткой аминокислотной последовательностью (например, длиной приблизительно 18-25 аминокислот), которая направляет вновь синтезированные секреторные или мембранные белки в мембраны или через них, например, мембраны эндоплазматического ретикулума. Сигнальные пептиды часто, но не везде находятся на Ν-конце полипептида и часто отщепляются сигнальными пептидазами после пересечения белком мембраны. Сигнальные последовательности обычно имеют три общих структурных признака: Ν-концевой полярный основной район (η-район), гидрофобный центральный район и гидрофильный с-район.

Термины полинуклеотид и последовательность нуклеиновой кислоты относятся к полимерной форме нуклеотидов длиной по крайней мере 10 оснований. Нуклеотиды могут быть рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами или модифицированными формами того или другого нуклеотида. Термин включает одно- и двухцепочечные формы ДНК. Под выделенным полинуклеотидом подразумевается полинуклеотид, который не граничит непосредственно с обеими из кодирующих последовательностей, с которыми он непосредственно граничит (одной на 5'-конце и другой на З'-конце) во встречающемся в природе геноме организма, из которого он происходит. В одном варианте осуществления полинуклеотид кодирует полипептид. 5' и 3' Направление нуклеиновой кислоты определяется относительно связности индивидуальных нуклеотидных единиц и присваивается в соответствии с положениями атомов углеродов сахарного (дезоксирибозного или рибозного) кольца. Информационный (кодирующий) объем полинуклеотидной последовательности читают в направлении от 5' к 3'.

Рекомбинантная нуклеиновая кислота является нуклеиновой кислотой, которая имеет последовательность, которая не встречается в природе, или имеет последовательность, которая получена путем искусственного объединения двух в остальных случаях разделенных сегментов последовательности. Это искусственное объединение может быть осуществлено с помощью химического синтеза или чаще с помощью искусственной манипуляции с выделенными сегментами нуклеиновых кислот, например, с использованием методов генной инженерии. Рекомбинантный белок является белком, который кодируется гетерологичной (например, рекомбинантной) нуклеиновой кислотой, которая была введена в клеткухозяина, такую как бактериальная или эукариотическая клетка. Нуклеиновую кислоту можно ввести в составе экспрессионного вектора, имеющего сигналы, допускающие экспрессию белка, кодируемого введенной нуклеиновой кислотой, или нуклеиновая кислота может интегрироваться в хромосому клеткихозяина.

Термин гетерологичная(ый) в отношении нуклеиновой кислоты, полипептида или другого клеточного компонента означает, что компонент встречается там, где он обычно не обнаруживается в природе, и/или что он происходит из отличного источника или вида.

Термин очистка (например, в отношении патогена или содержащей патоген композиции) относится к процессу удаления из композиции компонентов, присутствие которых является нежелательным. Очистка является относительным термином и не подразумевает удаление из композиции всех остатков нежелательного компонента. В условиях получения вакцины очистка включает такие способы, как центрифугирование, диализ, ионообменную хроматографию и гель-хроматографию, аффинную очистку или преципитацию. Таким образом, термин очищенный не подразумевает абсолютную чистоту, скорее, как предполагается, он является относительным термином. Следовательно, например, очищенный препарат нуклеиновой кислоты представляет собой препарат, в котором определенного белка больше, чем в случае, когда нуклеиновая кислота находится в ее репродуцирующем окружении, например, внутри клетки или в рабочем пространстве биохимических реакций. Препарат в значительной степени чистой нуклеиновой кислоты или белка может быть получен из условия, чтобы требуемая нуклеиновая кислота представляла по крайней мере 50% от общего содержания нуклеиновых кислот препарата. В определенных вариантах осуществления в значительной степени чистая нуклеиновая кислота будет представлять по крайней мере 60%, по крайней мере 70%, по крайней мере 80%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90% или по крайней мере 95% или больше от общего содержания нуклеиновых кислот или белков препарата.

Выделенный биологический компонент (такой как молекула нуклеиновой кислоты, белок или органелла) был в значительной степени отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в которой компонент встречается в природе, таких как другие хромосомные или внехромо- 7 021393 сомные ДНК и РНК, белки и органеллы. Нуклеиновые кислоты и белки, которые были выделены, включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Термином также охватываются нуклеиновые кислоты и белки, приготовленные с помощью рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты и белки.

Антигеном является соединение, композиция или вещество, в том числе композиции, инъецируемые, абсорбируемые или иначе вводимые животному, которые могут стимулировать продукцию антител и/или Т-клеточную иммунную реакцию у животного. Термин антиген включает все связанные с ним антигенные детерминанты. Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к месту на антигене, на которое реагируют В- и/или Т-клетки. Доминантными антигенными детерминантами или доминантным эпитопом являются такие эпитопы, против которых создается функционально значимый иммунный ответ хозяина, например, продукция антител или Т-клеточная иммунная реакция. Таким образом, относительно защитного иммунного ответа против патогена, доминантными антигенными детерминантами являются такие составляющие антигена, которые после распознавания иммунной системой хозяина приводят к защите от заболевания, вызываемого патогеном. Термин Т-клеточный эпитоп относится к эпитопу, который после связывания с соответствующей молекулой МНС специфически связывается Т-клеткой (через рецептор Т-клетки). В-клеточный эпитоп является эпитопом, который специфически связывается антителом (или молекулой рецептора В-клетки).

Адъювантом является агент, который усиливает создание иммунного ответа неспецифическим образом. Обычные адъюванты включают суспензию минеральных веществ (квасцов, алюминия гидроокиси, алюминия фосфата), на которых адсорбируется антиген; эмульсии, включающие эмульсии типа вода-в-масле и масло-в-воде (и их варианты, включающие двойные эмульсии и обратимые эмульсии), липосахариды, липополисахариды, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты (такие как олигонуклеотиды СрО), липосомы, агонисты То11-подобных рецепторов (в частности, агонисты ТЬК2, ТЬК4, ТЬК7/8 и ТЬК9) и различные комбинации таких компонентов.

Иммуногенной композицией является рассматриваемая композиция, подходящая для введения субъекту, являющемуся человеком или животным (например, в экспериментальном исследовании), которая способна к вызову специфического иммунного ответа, например, против патогена, такого как К8У. Как таковая иммуногенная композиция включает один или несколько антигенов (например, полипептидных антигенов) или антигенных детерминант. Иммуногенная композиция может также включать один или несколько дополнительных компонентов, способных к вызову или усилению иммунного ответа, таких как эксципиент, носитель и/или адъювант. В определенных случаях иммуногенные композиции вводят для вызова иммунного ответа, который защищает субъекта от симптомов или состояний, вызываемых патогеном. В некоторых случаях вызываемые патогеном симптомы или заболевание предотвращаются (или уменьшаются, или ослабляются) путем ингибирования репликации патогена (например, К8У) после подвергания субъекта воздействию патогена. В контексте описания этого изобретения будет подразумеваться, что термин иммуногенная композиция охватывает композиции, которые предназначены для введения субъекту или популяции субъектов с целью вызова защитного или паллиативного иммунного ответа против К8У (т.е. вакцинные композиции или вакцины).

Иммунный ответ представляет собой реакцию клетки иммунной системы, такой как В-клетка, Тклетка или моноцит, на стимул. Иммунный ответ может быть гуморальным ответом, который приводит к продукции специфичных антител, таких как антигенспецифичные нейтрализующие антитела. Иммунный ответ может также быть Т-клеточной иммунной реакцией, такой как С.Н4+ или С.Н8+ Т-клеточная иммунная реакция. В некоторых случаях ответ является специфичным для конкретного антигена (т.е. антигенспецифичным ответом). Если антиген происходит из патогена, антигенспецифичный ответ является патогенспецифичным ответом. Защитным иммунным ответом является иммунный ответ, который подавляет наносящую вред функцию или активность патогена, уменьшает инфицирование патогеном или ослабляет симптомы (в том числе смерть), которые являются следствием инфицирования патогеном. Защитный иммунный ответ можно измерить, например, по ингибированию репликации вирусов или бляшкообразования в анализе уменьшения количества бляшек или анализе нейтрализации с использованием ЕЫ§Л, или с помощью измерения устойчивости к заражению патогеном ίη νίνο.

Иммунный ответ со сдвигом в направлении ТН1-типа характеризуется присутствием Т-клетокхелперов С.Н4+. которые продуцируют 1Ь-2 и ΙΡΝ-γ, и, следовательно, секрецией или присутствием 1Ь-2 и ΙΡΝ-γ. Напротив, иммунный ответ со сдвигом в направлении ТЪ2-типа характеризуется преобладанием Т-клеток-хелперов СИ4+, которые продуцируют 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Ь-13.

Иммунологически эффективное количество представляет собой количество композиции (обычно иммуногенной композиции), используемое для вызова иммунного ответа у субъекта на композицию или антиген в композиции. Обычно желаемым результатом является продукция специфичного для антигена (например, патогена) иммунного ответа, который способен к защите или вносит вклад в защиту субъекта от патогена. Однако для создания защитного иммунного ответа против патогена могут потребоваться многократные введения иммуногенной композиции. Таким образом, в контексте описания этого изобре- 8 021393 тения термин иммунологически эффективное количество охватывает дробную дозу, которая в сочетании с предшествующими или последующими введениями вносит вклад в достижение защитного иммунного ответа.

Прилагательное фармацевтически приемлемый означает, что референт подходит для введения субъекту (например, являющемуся человеком или животным субъекту). В КепипдЮп'², РЬагтасеийса1 8с1еисе8 (Ьу Е.^. Магйп, Маск РиЫЫипд Со., ЕаЧоп. РА, 15*Εάίΐίοη (1975)) описываются композиции и составы (в том числе разбавители), подходящие для фармацевтической доставки терапевтических и/или профилактических композиций, в том числе иммуногенных композиций.

Термин модулировать со ссылкой на ответ, такой как иммунный ответ, означает изменять или регулировать начало, величину, продолжительность или характеристики ответа. Агент, модулирующий иммунный ответ, изменяет по крайней мере одно из следующего: начала, величины, продолжительности или характеристик иммунного ответа - после его введения, или изменяет по крайней мере одно из следующего: начала, величины, продолжительности или характеристик - по сравнению с контрольным агентом.

Термин уменьшает (ослабляет) является относительным термином, так что агент ослабляет ответную реакцию или состояние, если ответная реакция или состояние уменьшается количественно после введения агента, или она ослабляется после введения агента по сравнению с контрольным агентом. Подобным образом, термин предотвращает не означает обязательно, что агент полностью исключает ответную реакцию или состояние при условии, что исключается по крайней мере одна характеристика ответа. Таким образом, иммуногенная композиция, которая уменьшает или предотвращает инфекцию или ответную реакцию, такую как патологическая реакция, например, вирусное заболевание, в отношении которого вакцина является активной, может, но необязательно, полностью исключить такую инфекцию или ответную реакцию, лишь бы инфекция или ответная реакция заметно уменьшалась, например, на по крайней мере приблизительно 50%, например, на по крайней мере приблизительно 70% или приблизительно 80%, или даже на приблизительно 90% (т.е. составляла 10% или меньше) от инфекции или ответной реакции в отсутствие агента или по сравнению с контрольным агентом.

Субъектом является живой многоклеточный организм позвоночного. В контексте описания этого изобретения субъект может быть экспериментальным субъектом, таким как не являющееся человеком животное, например, мышь, хлопковая крыса или не являющийся человеком примат. Альтернативно, субъектом может быть являющийся человеком субъект.

РтеР антигены

В природе белок Р К8У экспрессируется в виде одного полипептида-предшественника длиной 574 аминокислот, названного Р0. Ιη νίνο Р0 подвергается олигомеризации в эндоплазматическом ретикулуме и протеолически расщепляется протеазой фурином в двух консервативных консенсусных последовательностях для фурина (сайтах расщепления фурином), КАКК¹⁰⁹ (5>Еф ГО N0: 15) и КККК¹³⁶ (5>Еф ГО N0: 16), с созданием олигомера, состоящего из двух связанных дисульфидной связью фрагментов. Меньший из этих фрагментов называют Р2, и он происходит из Ν-концевой части предшественника Р0. Квалифицированные в данной области техники специалисты определят, что сокращения Р0, Р1 и Р2 являются часто обозначаемыми в научной литературе Р₀, Р₁ и Р₂. Более большой С-концевой Р^фрагмент закрепляет белок Р в мембране благодаря последовательности из гидрофобных аминокислот, которая примыкает к 24-аминокислотнотному цитоплазматическому хвосту. Три димера Р2-Р1 объединяются с образованием зрелого белка Р, который принимает нестабильную конформацию до его слияния, которая начинает подвергаться конформационному изменению после контактирования с мембраной клеткимишени. Это конформационное изменение экспонирует гидрофобную последовательность, известную как пептид слияния, которая объединяется с мембраной клетки-хозяина и активирует слияние мембраны вируса, или инфицированной клетки, с клеточной мембраной клетки-мишени.

Р1-фрагмент содержит по крайней мере два домена из семи повторов, названных НКА и НКВ и находящихся вблизи от пептида слияния и трансмембранных якорных доменов соответственно. В конформации до слияния димер Р2-Р1 образует глобулярную головку и структуру ножки, при этом НКАдомены находятся в сегментированной (растянутой) конформации в глобулярной головке. Напротив, НКВ-домены образуют трехспиральную ножку, протягивающуюся от района головки. Во время перехода конформации до слияния в конформацию после слияния НКА-домены разрушаются и сближают НКВ-домены с образованием узла в виде антипараллельных шестерных спиралей. В последующей за слиянием фазе пептид слияния и трансмембранные домены сближены для облегчения слияния с мембраной.

Хотя предоставленное выше описание конформации основывается на молекулярном моделировании данных кристаллографии, структурные различия между конформациями до и после слияния можно наблюдать без обращения к кристаллографии. Например, электронную микроскопию можно использовать для проведения различий между конформациями до и после слияния, как продемонстрировано Са1бег и др. (У1то1о§у, 271: 122-131 (2000)) и Мойоп и др. (Упо1о§у, 311: 275-288), которые включены в данное описание посредством ссылки с целью технологических уроков. Конформацию до слияния можно

- 9 021393 также отличить от конформации после слияния с помощью анализов объединения липосом (см. Соппо11у е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δει. υδΆ, 103: 17903-17908 (2006), который также включен в данное описание посредством ссылки с целью технологических уроков). Кроме того, между конформациями до и после слияния можно провести различия, используя антитела (например, моноклональные антитела), которые специфически распознают конформационные эпитопы, присутствующие в одной или другой форме конформации до слияния или после слияния белка Р Κδν, но не в другой форме. Такие конформационные эпитопы могут быть обусловлены предпочтительным экспонированием антигенной детерминанты на поверхности молекулы. Альтернативно, конформационные эпитопы могут возникнуть в результате сближения аминокислот, которые являются несмежными в линейном полипептиде.

Описываемые в настоящем описании РгеР антигены предназначены для стабилизации и поддержания конформации белка Р Κδν до его слияния, так что в количестве экспрессированного белка значительная часть количества экспрессированного белка находится в конформации до слияния (например, по предсказанию с помощью структурного и/или термодинамического моделирования или по оценке с помощью одного или нескольких способов, описанных выше). Стабилизирующие модификации вводят в природный (не синтетический) белок Р, такой как приводимый в качестве примера белок Р δΕΟ ΙΌ N0: 2, из условия, чтобы основные иммуногенные эпитопы конформации белка Р до его слияния сохранялись после введения РгеР антигена в клеточное или внеклеточное окружение (например, ίη νίνο, например, после введения субъекту).

Во-первых, гетерологичный стабилизирующий домен можно поместить на С-конце конструкции для того, чтобы заменить домен закрепления в мембране полипептида Р0. Теоретически найдено, что этот стабилизирующий домен компенсирует нестабильность НКВ, что помогает стабилизировать конформацию до слияния. В приводимых в качестве примеров вариантах осуществления гетерологичным стабилизирующим доменом является домен мультимеризации белков. Одним особенно предпочтительным примером такого домена мультимеризации белков является домен тримеризации. Приводимые в качестве примеров домены тримеризации сворачиваются в биспираль, которая активирует сборку в тримеры множества полипептидов, имеющих такие биспиральные домены. Одним предпочтительным примером домена тримеризации является изолейциновая молния. Приводимым в качестве примера доменом изолейциновая молния является сконструированный вариант изолейциновой молнии ΟΟΝ4 дрожжей (см. НаГЬигу е! а1. δ^ηχ 262: 1401-1407 (1993)). Последовательность одного подходящего домена изолейциновая молния представлена δΕΟ ΙΌ N0: 11, хотя в равной степени подходят варианты этой последовательности, которые сохраняют способность к образованию биспирального стабилизирующего домена. Альтернативные стабилизирующие биспиральные домены тримеризации включают ТКАР2 (входящий № в ΟΕΝΒΑΝΚ® - 012933 [§ί:23503103]; аминокислоты 299-348), тромбоспондин 1 (входящий № РО7996 [§ί:135717]; аминокислоты 291-314), матрилин-4 (входящий № 095460 [§ϊ:14548117]; аминокислоты 594-618), СМР (матрилин-1) (входящий № ΝΡ 002370 [§ί:4505111]; аминокислоты 463-496), ΗδΡ1 (входящий № ААХ42211 [§ί:61362386]; аминокислоты 165-191) и кубилин (входящий № ΝΡ_001072 [§ί:4557503]; аминокислоты 104-138). Ожидается, что подходящий домен тримеризации приведет к сборке значительной части экспрессированного белка в тримеры. Например, по крайней мере 50% рекомбинантного полипептида РгеР, имеющего домен тримеризации, будет собираться в триммер (например, по оценке с помощью рассеяния света под множеством углов при использовании фракционирования потоков асимметричных полей (АРР-ΜΆΕδ)). Как правило, по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 70% и наиболее желательно по крайней мере приблизительно 75% или более экспрессированного полипептида существует в виде тримера.

Для еще большей стабилизации НКВ остаток лейцина, находящийся в положении 512 (относительно природного белка Р0) РгеР замещают лизином (Ь4 82К приводимого в качестве примера полипептида РгеР антигена с δΕΟ ΙΌ N0: 6). Эта замена улучшает периодичность гидрофобных остатков в биспирали. Подобным образом, после аминокислоты в положении 105 можно добавить лизин.

Во-вторых, можно исключить рер27. Анализ структурной модели белка Р Κδν в предшествующей слиянию фазе наводит на мысль, что рер27 создает большую не ограниченную связями петлю между Р1 и Р2. Эта петля не способствует стабилизации предшествующей слиянию фазы и удаляется после расщепления природного белка фурином.

В-третьих, можно делетировать один или оба мотива расщепления фурином. При таком конструировании пептид слияния не отщепляется от Р2, что предотвращает освобождение от глобулярной головки предшествующего слиянию конформационного варианта структуры и доступ в расположенные поблизости мембраны. Теоретически найдено, что взаимодействие между пептидом слияния и мембранной поверхностью является основной предпосылкой нестабильности предшествующей слиянию фазы. Во время процесса слияния взаимодействие между пептидом слияния и мембраной-мишенью приводит к экспонированию пептида слияния на поверхности структуры глобулярной головки, усиливая нестабильность предшествующей слиянию фазы и укладку в последующий за слиянием конформационный вариант структуры. Конформационное изменение делает возможным процесс слияния с мембраной. Ожидается, что удаление одного или обоих сайтов расщепления фурином предотвратит доступ мембраны к Νконцевой части пептида слияния, стабилизируя предшествующую слиянию фазу.

- 10 021393

Необязательно может быть также исключен по крайней мере один сайт расщепления не фурином, например, путем замены одной или нескольких аминокислот. Например, экспериментальные данные говорят о том, что в условиях, благоприятных для расщепления определенными металлопротеиназами, РгеР антиген может быть расщеплен вблизи аминокислот 110-118 (например, с расщеплением, происходящим между аминокислотами 112 и 113 РгеР антигена; между лейцином в положении 142 и глицином в положении 143 ссылочного полипептида белка Р 8ЕЦ ГО N0: 2). Соответственно, модификация одной или нескольких аминокислот в пределах этого района может уменьшить расщепление РгеР антигена. Например, лейцин в положении 112 можно заменить отличной аминокислотой, такой как изолейцин или триптофан. Альтернативно или дополнительно, глицин в положении 113 можно заменить серином или аланином.

Полипептид природного белка Р может быть выбран из любого белка Р штамма А К8У или штамма В К8У или их вариантов (определенных в настоящем описании). В определенных, приводимых в качестве примеров вариантах осуществления полипептидом белка Р является белок Р, представленный 8ЕЦ ГО N0: 2. Для облегчения понимания описания этого изобретения все положения аминокислотных остатков, независимо от штамма, приведены относительно положения (т.е. положение аминокислотного остатка соответствует положению) аминокислоты приводимого в качестве примера белка Р. Сопоставимые положения аминокислот любого штамма, отличного от штамма А или В К8У, могут быть без труда определены специалистами со средним уровнем компетентности в данной области техники путем совмещения аминокислотной последовательности выбранного штамма К8У с приводимой в качестве примера последовательностью, используя легкодоступные и широко известные алгоритмы для совмещения (такие как ВЬА8Т, например, используя параметры по умолчанию). Многочисленные дополнительные примеры полипептидов белка Р из различных штаммов К8У описываются в заявке АО 2008114149 (которая включена в данное описание посредством ссылки с целью предоставления дополнительных примеров последовательностей белков Р и С К8У). Дополнительные варианты могут возникнуть благодаря генетическому дрейфу или могут быть получены искусственно, используя сайт-направленный или неспецифический мутагенез, или с помощью рекомбинации двух или более предсуществующих вариантов. Такие дополнительные варианты также подходят в связи с описываемыми в настоящем описании РгеР (и РгеРС) антигенами.

При выборе Р2- и Р1-доменов белка Р квалифицированный в данной области техники специалист определит, что включение целого Р2- и/или Р1-домена не является строго обязательным. Как правило, конформационные соображения имеют важное значение при выборе подпоследовательности (или фрагмента) Р2-домена. Поэтому Р2-домен обычно включает часть Р2-домена, которая способствует сборке и стабильности полипептида. В определенных, приводимых в качестве примеров вариантах Р2-домен включает аминокислоты 26-105. Однако также возможны варианты, имеющие минорные модификации по длине (путем добавления или делеции одной или нескольких аминокислот).

Как правило, по крайней мере, подпоследовательность (или фрагмент) Р1-домена выбирают и конструируют так, чтобы она поддерживала стабильную конформацию, которая включает иммунодоминатные эпитопы белка Р. Например, обычно желательным является выбор подпоследовательности полипептида Р1-домена, которая включает эпитопы, распознаваемые нейтрализующими антителами, в районах аминокислот 262-275 (при нейтрализации паливизумабом) и 423-436 (мАв СЙ101Р Сейосог). Кроме того, желательным является включение Т-клеточных эпитопов, например, в районе аминокислот 328-355. Чаще всего, когда одна непрерывная часть Р1-субъединицы (например, охватывающая аминокислоты 262436), за исключение эпитопов, могла бы сохраняться в синтетической последовательности, которая включает эти иммунодоминантные эпитопы в виде дискретных элементов, собираемой в стабильную конформацию. Следовательно, полипептид Р1-домена включает, по крайней мере, приблизительно аминокислоты 262-436 полипептида белка Р К8У. В одном не ограничивающем примере, предоставленном в настоящем описании, Р1-домен включает аминокислоты 137-516 полипептида природного белка Р. Квалифицированный в данной области техники специалист определит, что дополнительные более короткие подпоследовательности могут использоваться по усмотрению практикующего специалиста.

При выборе подпоследовательности Р2- или Р1-домена (или, как будет обсуждаться ниже, компонента белка С некоторых РгеР-С антигенов), помимо конформационного соображения, может быть желательным выбор последовательностей (например, вариантов, подпоследовательностей и подобных) на основе включения дополнительных иммуногенных эпитопов. Например, дополнительные Т-клеточные эпитопы можно идентифицировать, используя якорные мотивы или другие способы, такие как определения с использованием разветвленной компьютерной сети или полиноминальных определений, известные в данной области техники (см., например, ΚАNΚРЕР (имеющийся во Всемирной паутине на сайте тгГ.йГсьйагуагй.ейи/Тоок/гапкрер.НтЦ РгоРгеД (имеющийся в Интернете на сайте 1ш1есЬ.ге5.ш/гадйауа/ргоргей1/шйех.Ыт1); Вшак (имеющийся в Интернете на сайте

Ъ1такДсг1.тЬ.§оу/то1Ъ1/Ыа_Ъшй/тйех.Ыт1) и 8УРРЕ1ТН (имеющийся в Интернете на сайте 5уГрейЙ1.Ът1Ье1Йе1Ьегд.сот/ксг1р15/МНС8егуег/й11/Ьоте.Ыт)). Например, для определения порога связывания пептидов и выбора пептидов с показателями, которые дают им высокую вероятность связывания с МНС или антителом

- 11 021393 при определенной аффинности, используют алгоритмы. Алгоритмы основаны или на эффектах на связывание с МНС конкретной аминокислоты в конкретном положении, эффектах на связывание с антителом конкретной аминокислоты в конкретном положении, или на эффектах на связывание конкретной замены в содержащем мотив пептиде. В контексте иммуногенного пептида консервативным остатком является остаток, который обнаруживается значительно чаще, чем можно было бы ожидать при случайном распределении в конкретном положении в пептиде. Якорные остатки являются консервативными остатки, которые обеспечивают точку контакта с молекулой МНС. Т-клеточные эпитопы, идентифицированные с помощью таких прогнозирующих способов, можно подтвердить с помощью измерения их связывания со специфическим белком МНС и по его способности к стимулированию Т-клеток после представления в области белка МНС.

Предпочтительно, когда РгеР антигены (в том числе обсуждаемые ниже РтеР-С антигены) включают сигнальный пептид, соответствующий системе экспрессии, например, сигнальный пептид млекопитающего или вируса, такой как природная сигнальная последовательность Р0 Κδν (например, аминокислоты 1-25 §ЕЦ ГО N0: 2 или аминокислоты 1-25 §ЕЦ ГО N0: 6). Как правило, сигнальный пептид выбирают так, чтобы он был совместим с клетками, выбранными для рекомбинантной экспрессии. Например, для экспрессии в клетках насекомых замененным может быть сигнальный пептид (например, бакуловирусный сигнальный пептид или сигнальный пептид мелиттина). Если предпочтительной является система экспрессии в растениях, подходящие сигнальные пептиды растений известны в данной области техники. Многочисленные, приводимые в качестве примеров сигнальные пептиды известны в данной области техники (см., например, Ζΐκπίβ & Неп/е1. Рто1еш δοΐ., 13: 2819-2824 (2004), которые описывают многочисленные сигнальные пептиды человека) и каталогизируются, например, в базе данных, касающихся сигнальных пептидов, δΡάό, которая включает сигнальные последовательности архебактерий, прокариот и эукариот (Ьйр://ргойпе.Ыс.пи8.е0и.8д/8р0Ь/). Необязательно любой из предшествующих антигенов может включать дополнительную последовательность или метку, такую как Ηίδ-метка, для облегчения очистки.

Необязательно РгеР антиген может включать дополнительные иммуногенные компоненты. В определенных особенно предпочтительных вариантах осуществления РгеР антиген включает антигенный компонент белка С Κδν. Приводимые в качестве примеров химерные белки, имеющие РгеР и компонент С, включают следующие белки: РтеР_У1 (представленный δΕρ ΙΌ N0: 7 и 8) и РтеР_У2 (представленный δΕρ ΙΌ N0: 9 и 10).

В РгеР-С антигенах антигенная часть белка С (например, усеченный белок С, например, аминокислоты 149-229) добавлена к С-концу конструкции. Как правило, компонент белка С соединен с компонентом белка Р через гибкую линкерную последовательность. Например, в приводимой в качестве примера конструкции РтеР_У1 белок С соединен с компонентом РгеР с помощью линкера -ССδССδССδ- (δΕρ ΙΌ N0: 14). В конструкции РтеР_У2 линкер короче. Вместо линкера -ССδССδССδ- (δΕρ ΙΌ N0: 14) РтеР_У2 имеет 2 глицина (-СС-) в качестве линкера.

Если присутствует, полипептидный домен белка С может включать всю или часть белка С, выбираемого из любого штамма А или В Κδν. В определенных, приводимых в качестве примеров вариантах осуществления белок С является (или является идентичным ему на 95%) белком С, представленным δΕρ ГО N0: 4. Дополнительные примеры подходящих последовательностей белка С можно найти в заявке \У0 2008114149 (которая включена в данное описание посредством ссылки).

Компонент в виде полипептида белка С выбирают так, чтобы он включал, по крайней мере, подпоследовательность (или фрагмент) белка С, которая сохраняет иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп(ы), например, в районе аминокислот 183-197, такую как фрагменты белка С, которые включают аминокислоты 151-229, 149-229 или 128-229 природного белка С. В одном приводимом в качестве примера варианте осуществления полипептидом белка С является подпоследовательность (или фрагмент) полипептида природного белка С, которая включает все или часть аминокислотных остатков 149-229 полипептида природного белка С. Квалифицированный в данной области техники специалист без труда определит, что могут также использоваться более длинные или более короткие части белка С, если выбранная часть конформационно не дестабилизирует или не нарушает экспрессию, укладку или процессирование РгеР-С антигена. Необязательно домен белка С включает аминокислотную замену в положении 191, которое, как ранее было установлено, вовлечено в ослабление и/или предотвращение усиленного заболевания, характеризующегося эозинофилией, связанного с вакцинами на основе инактивированных формалином Κδν. Через описание признаков встречающиеся в природе и замещенные (N191А) белки С можно найти, например, в публикации заявки на патент США № 2005/0042230, которая включена в данное описание посредством ссылки.

Например, что касается выбора последовательностей, соответствующих встречающимся в природе штаммам, один или несколько доменов могут соответствовать по последовательности штамму А или В Κδν, например, обычным лабораторным изолятам, названным А2 или Ьоп§, или любому другому встречающемуся в природе штамму или изоляту (описанному в вышеупомянутой заявке \У0 2008114149). Помимо таких встречающихся в природе и изолированных вариантов, сконструированные варианты, которые имеют схожесть последовательностей с вышеупомянутыми последовательностями, могут также использоваться в связи с РгеР (в том числе РгеР-С) антигенами. Квалифицированным в данной области

- 12 021393 техники специалистам будет понятно, что схожесть между полипептидами (и описываемыми ниже полинуклеотидными последовательностями) РгеР антигенов, что касается полипептида (и нуклеотидных последовательностей в общем), можно выразить через схожесть между последовательностями, в остальных случаях именуемую идентичностью последовательностей. Идентичность последовательностей часто определяют через процент идентичности (или схожести); чем выше процент, тем более схожими являются первичные структуры двух последовательностей. В общем, чем более схожими являются первичные структуры двух аминокислотных (или полинуклеотидных) последовательностей, тем более схожими являются структуры более высокого порядка, происходящие в результате укладки и сборки. Варианты полипептидных (и полинуклеотидных) последовательностей РгеР обычно имеют одну или небольшое число делеций, добавлений или замен аминокислот, но, тем не менее, будут иметь очень высокий процент идентичных аминокислот и обычно идентичности их полинуклеотидных последовательностей. Более важно, чтобы варианты сохраняли структурные и, следовательно, конформационные признаки ссылочных последовательностей, описываемых в настоящем описании.

Способы определения идентичности последовательностей широко известны в данной области техники и применимы к полипептидам РгеР антигенов, а также нуклеиновым кислотам, кодирующим их (например, описываемым ниже). Различные программы и алгоритмы для совмещения описаны (см. 8ιηί11ι аиб Ха1егтап, Α6ν. Арр1. Мабт 2: 482, 1981; №еб1етаи аиб ХииксЬ, 1. Μοί. ΒίοΙ. 48: 443, 1970; Н1§§1И5 аиб 8Нагр, 0епе 73: 237, 1988; Нщдшк апб 8Нагр, САВ108 5: 151, 1989; Согре! е! а1., №.1с1ею Ас1б§ КекеагсЬ 16: 10881, 1998; и Реагкоп апб Ыртап, Ргос. №41. Асаб. 8с1. И8А 85: 2444, 1988). АЙ8сЬи1 и др. (№-1!иге Сепе! 6: 119, 1994) представляют детальное рассмотрение способов совмещения последовательностей и расчетов гомологии. Основное средство поиска, основанное на локальных совмещениях, (ВЬА8Т) NСΒI (АНзсШ е! а1., ί. Мо1. Βίο1. 215: 403, 1990) доступно из нескольких источников, включающих Национальный центр биотехнологической информации ^СВ1, ВеЫекба, МИ), и в Интернете, для применения в соединении с программами анализа последовательностей Шайр, ЫаЧп, ЫаЧх, (ЫаЧп и (ЫаЧх. Описание того, каким образом определить идентичность последовательностей, используя эту программу, имеется на ХеЬ-сайте NСΒI в Интернете.

В некоторых случаях РгеР антигены имеют одну или несколько модификаций аминокислот относительно аминокислотной последовательности встречающегося в природе штамма, из которого она происходит (например, помимо вышеупомянутых стабилизирующих модификаций). Такими различиями могут быть добавление, делеция или замена одной или нескольких аминокислот. Вариант обычно отличается, но не более чем приблизительно 1%, или 2%, или 5%, или 10%, или 15%, или 20% аминокислотных остатков. Например, полипептидная последовательность варианта РгеР антигена (в том числе РгеР-0) может включать 1, или 2, или до 5, или до приблизительно 10, или до приблизительно 15, или до приблизительно 50, или до приблизительно 100 различий в аминокислотах по сравнению с приводимыми в качестве примеров полипептидными последовательностями РгеР антигенов - 8ЕО ГО N0: 6, 8 и/или 10. Таким образом, вариант белка Р или 0 К8У или РгеР антигена (в том числе РгеР-0) обычно идентичен по последовательности на по крайней мере 80 или 85%, чаще на по крайней мере приблизительно 90% или более, например, 95% или даже 98% или 99% ссылочному белку, например, ссылочным последовательностям, проиллюстрированным в 8ЕО ГО N0: 2, 4, 6, 8 и/или 10, или любому из приводимых в качестве примеров РгеР антигенов, описываемых в настоящем описании. Дополнительными вариантами, включенными в качестве характерного признака описания этого изобретения, являются РгеР антигены (в том числе РгеР-0 антигены), которые включают всю или часть нуклеотидной или аминокислотной последовательности, выбираемой из встречающихся в природе вариантов, описанных в Х0 2008114149.

Дополнительные варианты могут возникнуть благодаря генетическому дрейфу или могут быть получены искусственно, используя сайт-направленный или неспецифический мутагенез, или с помощью рекомбинации двух или более предсуществующих вариантов. Такие дополнительные варианты также подходят в связи с описываемыми в настоящем описании РгеР (и РгеР-0) антигенами. Например, модификацией может быть замена одной или нескольких аминокислот (например, двух аминокислот, трех аминокислот, четырех аминокислот, пяти аминокислот, вплоть до приблизительно десяти аминокислот или более), которые не изменяют конформацию или иммуногенные эпитопы результирующего РгеР антигена.

Альтернативно или дополнительно, модификация может включать делецию одной или нескольких аминокислот и/или добавление одной или нескольких аминокислот. Действительно, если желательно, одним или несколькими полипептидными доменами может быть синтетический полипептид, который не соответствует какому-либо одному штамму, а включает составные подпоследовательности из множества штаммов или даже из консенсусной последовательности, полученной при совмещении полипептидов множества штаммов вируса К8У. В определенных вариантах осуществления один или несколько полипептидных доменов модифицированы путем добавления аминокислотной последовательности, которая является меткой, которая облегчает последующее процессирование или очистку. Такая метка может быть антигенной или эпитопной меткой, ферментной меткой или полигистидиновой меткой. Обычно метка находится на одном или другом конце белка, например, на С-конце или №конце антигена или слитого белка.

- 13 021393

Нуклеиновые кислоты, кодирующие РгеР антигены

Другой аспект описания этого изобретения имеет отношение к рекомбинантным нуклеиновым кислотам, которые кодируют описанные выше РгеР антигены. В определенных вариантах осуществления рекомбинатные нуклеиновые кислоты оптимизированы в отношении частот использования кодонов для экспрессии в выбранной прокариотической или эукариотической клетке-хозяине. Например, 8Е0 ГО N0: 5 и 12 являются двумя иллюстративными, не ограничивающими, примерами последовательностей, кодирующих РгеР антиген, которые были оптимизированы в отношении частот использования кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих, например, клетках СНО. Для способствования репликации и экспрессии нуклеиновые кислоты могут быть встроены в вектор, такой как вектор для экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках. Клетки-хозяины, включающие рекомбинантные, кодирующие РгеР антигены нуклеиновые кислоты, также являются отличительным признаком описания этого изобретения. Предпочтительные клетки-хозяины включают прокариотические (т.е. бактериальные) клетки-хозяины, такие как Е.сой, а также многочисленные эукариотические клетки-хозяины, включающие клетки грибов (например, дрожжей), клетки насекомых и клетки млекопитающих (такие как клетки СНО, УЕК0 и НЕК293).

Для способствования репликации и экспрессии нуклеиновые кислоты могут быть встроены в вектор, такой как вектор для экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках. Хотя описываемые в настоящем описании нуклеиновые кислоты могут быть встроены в любой из ряда векторов (включающих, например, бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, являющиеся результатом комбинаций плазмид и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как вирус коровьей оспы, аденовирус, поксвирус птиц, вирус псевдобешенства, аденовирус, аденоассоциированный вирус, ретровирус и многие другие), чаще всего вектором будет экспрессионный вектор, подходящий для образования полипептидных продуктов экспрессии. В экспрессионном векторе нуклеиновая кислота, кодирующая РгеР антиген, обычно располагается близко и ориентирована относительно соответствующей контролирующей транскрипцию последовательности (промотора и необязательно одного или нескольких энхансеров) для управления синтезом мРНК. Т.е. представляющая интерес полинуклеотидная последовательность функционально связана с соответствующей контролирующей транскрипцию последовательностью. Примеры таких промоторов включают непосредственно ранний промотор СМУ, ЬТК или промотор 8У40, промотор полиэдрина бакуловируса, промотор 1ас или 1гр Е.сой, промотор фага Т7 и лямбда Р[, и другие промоторы, которые, которые, как известно, контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или других вирусах. Экспрессионный вектор обычно также содержит сайт связывания рибосом для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор необязательно включает соответствующие для усиления экспрессии последовательности. Кроме того, экспрессионные векторы необязательно включают один или несколько генов маркеров селекции для обеспечения фенотипического признака для отбора трансформированных клеток-хозяинов, таких как дигидрофолатредуктаза, или устойчивость к неомицину для культивирования эукариотических клеток или таких как устойчивость к канамицину, тетрациклину или ампициллину в Е.сой.

Экспрессионный вектор может также включать дополнительные экспрессионные элементы, например, для увеличения эффективности трансляции. Эти сигналы могут включать, например, инициирующий кодон АТО и примыкающие последовательности. В некоторых случаях, например, инициирующий трансляцию кодон и связанные элементы последовательности (например, природный кодон начала трансляции) встраивают в соответствующий экспрессионный вектор одновременно с представляющей интерес полинуклеотидной последовательностью. В таких случаях дополнительные, контролирующие трансляцию сигналы не требуются. Однако в тех случаях, когда встраивают только кодирующую полипептид последовательность или ее часть, экзогенные контролирующие трансляцию сигналы, включающие инициирующий кодон АТО, обеспечивают для трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей РгеР антиген. Инициирующий кодон располагают в правильной рамке считывания для обеспечения трансляции, представляющей интерес полинуклеотидной последовательности. Экзогенные транскрипционные элементы и инициирующие кодоны могут иметь различные происхождения, как природное, так и синтетическое. При желании, эффективность экспрессии можно дополнительно увеличить с помощью включения энхансеров, подходящих для используемой клеточной системы (АсйагГ еЬ а1. (1994) КекиЙк РгоЫ. Се11 ΌίίϊθΓ 20: 125-162; БШег е1 а1. (1987) МеЬйойк ίη Еп2уто1. 153: 516-544).

В некоторых случаях нуклеиновая кислота (такая как вектор), которая кодирует РгеР антиген, включает один или несколько дополнительных элементов-последовательностей, выбираемых для увеличения и/или оптимизации экспрессии кодирующей РгеР нуклеиновой кислоты после введения в клеткухозяина. Например, в определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие РгеР антиген, включают последовательность интрона, такую как последовательность интрона герпесвируса 5 человека (см., например, 8Е0 ГО N0: 13). Неоднократно было продемонстрировано, что интроны усиливают экспрессию гомологичных и гетерологичных нуклеиновых кислоты после их размещения соответствующим образом в рекомбинантной конструкции. Другой класс усиливающих экспрессию последовательностей включает связанные с эпигенезом элементы, такие как район прикрепления к матриксу (или МАК) или схожий, связанный с эпигенезом элемент, например, элементы §ТАК (например, такие как

- 14 021393 элементы БТАК, описанные в 011с е! а1., Вю!есЬио1. Ргод. 23: 801-807, 2007). Без ограничения какой-либо теорией полагают, что МАК опосредуют прикрепление целевой последовательности ДНК к ядерному матриксу, создавая домены в виде петлевых участков хроматина, которые ответвляются от ядер гетерохроматина. Несмотря на то что МАК не содержат какой-либо явной консенсусной или распознаваемой последовательности, их самым стойким признаком, по-видимому, является общее высокое содержание А/Т и основания С, преобладающие на одной цепи. Эти районы, по-видимому, образуют изогнутые вторичные структуры, которые могут быть склонны к разделению цепей, и могут включать раскручивающий ядро элемент (СИЕ), который может служить в качестве точки в образовании ядра для разделения цепей. С последовательностями МАК было связано несколько простых АТ-богатых последовательностей-мотивов, например, А-бокс, Т-бокс, ДНК-раскручивающие мотивы, сайты связывания БАТВ1 (Нбокс, А/Т/С25) и консенсусные сайты для топоизомеразы II для позвоночных и дрозофилы. Приводимые в качестве примеров последовательности МАК описываются в публикации заявки на патент США № 20070178469 и в международной заявке на патент № \У0 02/074969 (которые включены в данное описание посредством ссылки). Дополнительные последовательности МАК, которые могут использоваться для усиления экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей РтеР антиген, включают МАК лизоцима цыпленка, МАКр1-42, МАКр1-6, МАКр1-68 и МАКрх-29, описанные в Оиоб е! а1., Ма1ите Ме1йоб8, 4: 747753, 2007 (с входящими № в ОепВапк ЕА423306, ΌΙ107030, ΌΙ106196, ΌΙ107561 и ΌΙ106512 соответственно). Квалифицированный специалист определит, что экспрессию можно, кроме того, модулировать путем выбора МАК, которая создает промежуточный уровень усиления, как это сообщено для МАК 1-9. Если желательно, альтернативные последовательности МАК для увеличения экспрессии РгеР антигена можно идентифицировать путем перебора базы данных, касающихся последовательностей, например, используя такое программное обеспечение, как МАК-Ршбет (имеющееся на ^еЬ-сайте: !иШтекой.огд/МагРшбег), БМАКТез! (имеющееся на ^еЬ-сайте: депотайх.бе) или БМАКБсап I (Ьеубьку е! а1., Вюш&ттайсз 15: 582-592, 1992). В некоторых вариантах осуществления МАК вводится (например, подвергается трансфекции) в клетку-хозяина на той же нуклеиновой кислоте (например, векторе), что и кодирующая РгеР антиген последовательность. В альтернативном варианте осуществления МАК вводится на отдельной нуклеиновой кислоте (например, при передаче) и может необязательно коинтегрироваться с кодирующей антиген РгеР полинуклеотидной последовательностью.

Приводимые в качестве примеров методики, надлежащие для того, чтобы служить ориентиром для специалиста со средним уровнем компетентности в данной области техники на протяжении получения рекомбинантных нуклеиновых кислот РгеР антигенов, можно найти (см. БатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1опшд: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 2б еб., Со1б Брппд НагЬог ЬаЬота!огу Ргезз, 1989; БатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 3б еб., Со1б Брппд НагЬог Ргезз, 2001; Аи8иЬе1 е! а1., Сштеп! Рто!осок ш Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬИзЫпд А^оааЮх 1992 (и дополнительные материалы 2003 г.) и Аи8иЬе1 е! а1., Б1юг1 Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду: А Сотрепбшт о! Ме!йоб8 йот Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг В1о1оду, 4'¹' еб., \Убеу & Бопз, 1992).

Приводимые в качестве примеров нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды РгеР антигенов, представлены БЕЭ ГО N0: 5, 7, 9, 12 и 13. Дополнительные варианты можно получить путем компоновки аналогичных полипептидных последовательностей белков Р и О, выбираемых из любого из известных (или впоследствии) обнаруженных штаммов КБУ, например, описанных в \У0 2008114149. Квалифицированные в данной области техники специалисты могут получить дополнительные варианты последовательностей, имеющие некую идентичность с приводимыми в качестве примеров вариантами. Как правило, варианты нуклеиновых кислот будут кодировать полипептиды, которые отличаются но не более чем 1%, или 2%, или 5%, или 10%, или 15%, или 20% аминокислотных остатков. Т.е. последовательности кодируемых полипептидов идентичны на по крайней мере 80 или 85%, чаще на по крайней мере приблизительно 90% или более, например, 95% или даже 98% или 99%. Квалифицированным в данной области техники специалистам будет сразу же понятно, что полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды РгеР, могут сами иметь меньшую идентичность вследствие избыточности генетического кода. В некоторых случаях РгеР антигены имеют одну или несколько модификаций аминокислот относительно аминокислотной последовательности встречающегося в природе штамма, из которого она происходит (например, помимо вышеупомянутых стабилизирующих модификаций). Такими различиями могут быть добавление, делеция или замена одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот соответственно. Вариант обычно отличается, но не более чем приблизительно 1%, или 2%, или 5%, или 10%, или 15%, или 20% нуклеотидных остатков. Например, нуклеиновая кислота варианта РгеР антигена (в том числе РгеР-О) может включать 1, или 2, или до 5, или до приблизительно 10, или до приблизительно 15, или до приблизительно 50, или до приблизительно 100 различий в нуклеотидах по сравнению с приводимыми в качестве примеров нуклеиновыми кислотами РгеР антигена - БЕЭ ГО N0: 5, 7, 9, 12 и/или 13. Таким образом, вариант нуклеиновой кислоты белка Р или О КБУ или РгеР антигена (в том числе РгеРО) обычно идентичен по последовательности на по крайней мере 80 или 85%, чаще на по крайней мере приблизительно 90% или более, например, 95% или даже 98% или 99% ссылочной последовательности, например, ссылочным последовательностям, проиллюстрированным в БЕЭ ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 12 и/или 13, или любой из приводимых в качестве примеров нуклеиновых кислот РгеР антигенов, описываемых в

- 15 021393 настоящем описании. Дополнительными вариантами, включенными в качестве характерного признака описания этого изобретения, являются РгеР антигены (в том числе РгеР-О антигены), которые включают всю или часть нуклеотидной последовательности, выбираемой из встречающихся в природе вариантов, описанных в Ш0 2008114149. Дополнительные варианты могут возникнуть благодаря генетическому дрейфу или могут быть получены искусственно, используя сайт-направленный или неспецифический мутагенез, или с помощью рекомбинации двух или более предсуществующих вариантов. Такие дополнительные варианты также подходят в связи с описываемыми в настоящем описании РгеР (и РгеР-О) антигенами. Помимо ранее описанных вариантов нуклеиновых кислот нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с одной или несколькими из приводимых в качестве примеров нуклеиновых кислот, представленных 8ЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 12 и 13, можно использовать для кодирования РгеР антигенов. Квалифицированный в данной области техники специалист определит, что помимо обсуждавшегося выше показателя идентичности последовательностей в % другим показателем схожести по последовательностям между нуклеиновыми кислотами является способность к гибридизации. Чем более схожими являются последовательности двух нуклеиновых кислот, тем более жесткими являются условиями, при которых они будут гибридизоваться. Жесткость условий гибридизации зависит от последовательностей и является различной при различных параметрах окружающей среды. Таким образом, условия гибридизации, дающие в результате конкретные степени жесткости, будут меняться в зависимости от природы выбранного способа гибридизации и состава и длины последовательностей гибридизующихся нуклеиновых кислот. Как правило, температура гибридизации и ионная сила (особенно концентрация №ί и/или Мд) буфера для гибридизации будут определять жесткость гибридизации, хотя время отмывки также оказывает влияние на жесткость. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была на приблизительно 5-20°С ниже температуры плавления (Т_т) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Т_т является температурой (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательностей-мишеней гибридизуется с полностью соответствующим зондом. Условия для гибридизации нуклеиновых кислот и расчет жесткостей можно найти (см., например, в 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8рйпд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рйпд НагЬог, NΥ, 2001; Туккеп, НуЬпШ/аОоп \νί11ι ШсЮс Ааб РгоЬек, Рай I: Тйеогу апб Шйею Ас1б Ргерагайоп, ЬаЬогаЮгу Тес1тк|иек ш ВюсНетЫгу апб Мо1еси1аг Вю1оду, Е1кеу1ег 8с1епсе Иб.. NΥ, NΥ, 1993, и АикиЬе1 е1 а1., 8йой Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду, 4'¹' еб., 1оЬп Шйеу & 8опк, 1пс., 1999).

С целью раскрытия настоящего изобретения жесткие условия охватывают условия, при которых гибридизация будет происходить только, если между гибридизационной молекулой или последовательностью мишени существует менее 25% несоответствий. Для более точного определения жесткие условия можно подразделить на конкретные уровни жесткости. Таким образом, условия умеренной жесткости, как в настоящем описании используются, являются условиями, при которых молекулы с более 25% несоответствий в последовательностях не будут гибридизоваться; условия средней жесткости являются условиями, при которых молекулы с более 15% несоответствий в последовательностях не будут гибридизоваться; и условия высокой жесткости являются условиями, при которых последовательности с более 10% несоответствий не будут гибридизоваться. Условиями очень высокой жесткости являются условия, при которых последовательности с более 6% несоответствий не будут гибридизоваться. Напротив, нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в условиях низкой жесткости, включают нуклеиновые кислоты с гораздо меньшей идентичностью последовательностей или с идентичностью последовательностей в пределах только коротких подпоследовательностей нуклеиновой кислоты. Поэтому будет понятно, что различные варианты нуклеиновых кислот, которые охватываются этим изобретением, способны к гибридизации с по крайней мере одной из 8ЕЦ ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9 и/или 12, по существу, по всей их длине.

Способы продуцирования полипептидных антигенов К8У

Описываемые в настоящем описании РгеР антигены (в том числе РгеР-О антигены и также, если применимо, О антигены) продуцируют, используя прочно установившиеся методики для экспрессии и очистки рекомбинантных белков. Методики, надлежащие для того, чтобы служить ориентиром для квалифицированного в данной области техники специалиста, можно найти в следующих ссылочных документах (см. 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рйпд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рйпд НагЬог, NΥ, 2001; и АикиЬе1 е! а1., 8йой Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду, 4'¹' еб., 1оНп Шйеу & 8опк, 1992). Дополнительные и конкретные детали предоставлены ниже.

Рекомбинантные нуклеиновые кислоты, которые кодируют РгеР антигены, вводят в клетки-хозяины с помощью любого из ряда широко известных способов, таких как электропорация, трансфекция с использованием липосом (например, с использованием имеющегося в продаже липосомного реагента для трансфекции, такого как ЫР0РЕСТАМ1№™ 2000 или ТВАЖРЕСТГО'¹™)· преципитация фосфатом кальция, инфекция, трансфекция и подобные, в зависимости от выбора векторов и клеток-хозяинов. Приводимые в качестве примеров нуклеиновые кислоты, которые кодируют РгеР антигены (в том числе РгеР-О антигены), приведены в 8ЕЦ ГО N0: 5, 7, 9, 12 и 13. Квалифицированный в данной области техники специалист определит, что 8ЕЦ ГО N0: 5, 7, 9, 12 и 13 являются иллюстративными и, как предпола- 16 021393 гается, не ограничивающими. Например, полинуклеотидные последовательности, кодирующие такие же белки, как и 8Е0 ГО N0: 5, 7 и 9 (например, белки, представленные 8Е0 ГО N0: 6, 8 и 10), но отличающиеся только согласно избыточности генетического кода (например, согласно оптимизации частот использования альтернативных кодонов, как представлено в 8Е0 ГО N0: 12), могут беспрепятственно использоваться вместо приводимых в качестве примеров последовательностей 8Е0 ГО N0: 5, 7 и 9. Подобным образом, могут использоваться полинуклеотидные последовательности, которые включают усиливающие экспрессию элементы, такие как внутренне размещенные интроны (или при добавлении промотора, энхансера, интрона или других подобных элементов), как проиллюстрировано в 8Е0 ГО N0: 13. Специалист со средним уровнем компетентности в данной области техники определит, что также подходят комбинации таких модификаций. Подобным образом, для экспрессии РгеР антигенов могут также использоваться гомологичные последовательности, выбираемые из штамма А или В К8У, и/или другие последовательности со значительной идентичностью последовательностей, как обсуждалось выше. Действительно, любой из ранее описанных вариантов нуклеиновых кислот можно соответственно ввести в клетки-хозяины и использовать для продукции РгеР антигенов (в том числе РгеР-С антигенов) и, если применимо, полипептидов С.

Клетки-хозяины, которые включают рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие РгеР антигены, являются, следовательно, также отличительным признаком описания этого изобретения. Предпочтительные клетки-хозяины включают прокариотические (т.е. бактериальные) клетки-хозяины, такие как Е.соП, а также многочисленные эукариотические клетки-хозяины, включающие клетки грибов (например, дрожжей, таких как 8ассНаготусек сегеуыае и РюсЫа раЦогР), клетки насекомых, клетки растений и клетки млекопитающих (такие как клетки СНО и НЕК293). Рекомбинантные нуклеиновые кислоты РгеР антигенов вводят (например, подвергают трансдукции, трансформации или трансфекции) в клеткихозяины, например, посредством вектора, такого как экспрессионный вектор. Как обсуждалось выше, вектором чаще всего является плазмида, но такими векторами может также быть, например, вирусная частица, фаг и т.п. Примеры подходящих для экспрессии хозяинов включают бактериальные клетки, такие как Е.соП, 81гер1отусе5 и 8а1топе11а ЕрЫтипит, клетки грибов, такие как 8ассбаготусек сегеуыае, РюсЫа ракЩнк и №игокрога сгакка, клетки насекомых, таких как ЭгокорНПа и 8робор1ега Ггид1регба, клетки млекопитающих, такие как клетки 3Т3, С08, СН0, ВНК, НЕК293 или меланомы Воуек, клетки растений, включающие клетки водорослей и т.п.

Клетки-хозяины можно культивировать в общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации введенных полинуклеотидных последовательностей. Условия культивирования, такие как температура, рН и подобные, являются обычно такими, которые ранее использовались с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидны специалистам, квалифицированным в данной области техники, и в приведенных в настоящем описании ссылках, включающих (см., например, РгекНиеу (1994) Сибиге оГ Атта1 Се11к, а Мапиа1 оГ Вакю ТесНЫцие, ΙΗιγΗ еббюп, ^Пеу-Пкк, Пет Уогк и приведенные там ссылки). Продукты экспрессии, соответствующие нуклеиновым кислотам настоящего изобретения, можно также продуцировать в клетках не животных, таких как растения, дрожжи, грибы, бактерии и подобные. Помимо 8атЬгоок, Вегдег и АикиЬе1, подробности в отношении культивирования клеток можно найти (см. Раупе е1 а1. (1992) Р1ай Се11 апб Т15кие Сибиге ш Пцшб 8у51етк, 1оНп \УПеу & 8опк, 1пс., №у Уогк, NΥ; СатЬогд апб РНППрк (ебк.) (1995) Р1ай Се11, Т15кие апб 0гдап Сибиге; Рипбатейа1 Ме!бобк 8рбпдег ЬаЬ Мапиа1. 8ргшдег-Уег1ад (Вегбп Не1бе1Ьегд №у Уогк) и Абак апб Рагкк (ебк.) ТНе НапбЬоок оГ МюгоЬю1одюа1 Меб1а (1993) СКС Ргекк, Воса РаЮп, РЬ).

В бактериальных системах ряд экспрессионных векторов можно выбрать в зависимости от предполагаемого для экспрессированного продукта применения. Например, когда большие количества полипептида или его фрагментов необходимы для продукции антител, предпочтительно используют векторы, которые управляют экспрессией на высоком уровне слитых белков, которые легко очищаются. Такие векторы включают, но без ограничения, многофункциональные векторы для клонирования и экспрессии в Е.соб, такие как ВЬИЕ8СК1РТ (8!га!адепе), в которых представляющая интерес кодирующая последовательность, например, описанный выше полинуклеотид настоящего изобретения, может быть лигирована в вектор в рамке считывания с последовательностями для амино-концевого метионина, инициирующего трансляцию, и последующих 7 остатков бета-галактозидазы, продуцируя каталитически активный, слитый с бета-галактозидазой белок; векторы рГО (Уап Нееке & 8сбик!ег (1989) I. Вю1. СНет. 264: 55035509), векторы рЕТ (№уадеп, Маб1коп XVI), в которых амино-концевой метионин лигирован в рамке с гистидиновой меткой, и подобные.

Подобным образом, в дрожжах, таких как 8ассНаготусек сегеу1К1ае, ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, например, альфа-фактора, алкогольоксиды и РСН, могут использоваться для продукции желаемых продуктов экспрессии (см. Вегдег, АикиЬе1 и, например, Сгай е1 а1. (1987; Ме!бобк ш Еп/уто1оду 153: 516-544)). В клетках-хозяинах млекопитающих можно использовать ряд систем экспрессии, включающих и плазмиды, и системы на основе вирусов.

Клетку-хозяина необязательно выбирают по ее способности модулировать экспрессию введенных последовательностей или подвергать процессированию экспрессированный белок желательным образом.

- 17 021393

Такие модификации белка включают, но без ограничения, гликозилирование (а также, например, ацетилирование, карбоксилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацетилирование). Посттрансляционное процессирование, например, при котором форма предшественника превращается в результате расщепления (например, под действием протеазы фурина) в зрелую форму белка, необязательно осуществляется в условиях клетки-хозяина. Различные клетки-хозяины, такие как 3Т3, С08, СНО, НеЬа, ВНК, МОСК, 293, ^У138 и т.п., имеют специфический клеточный аппарат и характерные механизмы для таких посттрансляционных активностей и могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессирования введенного, чужеродного белка.

Для длительной продукции с высоким выходом рекомбинантных РгеР антигенов, описываемых в настоящем описании, обычно используют устойчивые системы экспрессии. Например, нуклеиновые кислоты, которые стабильно экспрессируют полипептид РгеР антигена, вводят в клетку-хозяина, используя экспрессионные векторы, содержащие вирусные начала репликации или эндогенные экспрессионные элементы и ген маркера селекции. После введения вектора клеткам предоставляют возможность расти в течение 1-2 дней в богатых питательных средах до их перевода на селективные среды. Назначением маркера селекции является придание устойчивости к отбору, и его присутствие делает возможным рост и извлечение клеток, которые с успехом экспрессируют введенные последовательности. Например, устойчивые группы или колонии устойчиво трансформированных клеток можно подвергнуть пролиферации, используя методы для культуры тканей, соответствующие типу клеток. Клетки-хозяины, трансформированные нуклеиновой кислотой, кодирующей РгеР антиген, необязательно культивируют в условиях, подходящих для экспрессии и извлечения кодируемого белка из клеточной культуры.

После трансдукции подходящей линии клеток-хозяинов и роста клеток-хозяинов до соответствующей плотности клеток индуцируют соответствующим образом (например, с помощью температурного сдвига или химической индукции) выбранный промотор, и клетки культивируют в течение дополнительного периода времени. Необязательно среда включает компоненты и/или добавки, которые уменьшают деструкцию экспрессированных белков протеазами. Например, среда, используемая для культивирования клеток для продукции РгеР антигена, может включать ингибитор протеаз, такой как хелатообразующий агент или ингибитор в виде небольшой молекулы (например, ΑΖ11557272, Л8111793 и т.п.), для уменьшения или исключения нежелательного расщепления клеточными и экстраклеточными (например, матриксными) протеазами.

Секретированный полипептидный продукт затем извлекают из культуральной среды. Альтернативно, клетки можно собрать с помощью центрифугирования, разрушить физическим или химическим способом, и результирующий неочищенный экстракт сохранить для дальнейшей очистки. Эукариотические или микробные клетки, используемые для экспрессии белков, можно разрушить с помощью любого общепринятого способа, включающего повторение последовательности замораживание-оттаивание, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или использование агентов для лизиса клеток, или других способов, которые хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам.

Экспрессированные РгеР антигены можно извлечь и очистить из культур рекомбинантных клеток с помощью любого из ряда способов, широко известных в данной области техники, включающих осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, фильтрацию, ультрафильтрацию, центрифугирование, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию (например, используя любую из систем мечения, отмеченных выше), хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Если желательно, можно использовать стадии рефолдинга белка для довершения конфигурации зрелого белка. Наконец, на конечных стадиях очистки можно использовать жидкостную хроматографию высокого разрешения (НРЬС). Помимо отмеченных выше ссылок, в данной области техники хорошо известен ряд способов очистки, включающих, например, способы, изложенные в 8апбапа ((1997) Вюкерагаΐίοη οί Рго1ешк, Лсабетю Ргекк, 1пс.; Во11ад е1 а1. (1996) Рго1еи1 Мебюбк, 2'¹ Ε6ί6οη, ^беу-Ыкк, ΝΥ; \Уа1кег (1996) Тбе Рго1еш РтоЮ^^ НаηбЬοοк, Нитапа Ргекк, Νί, Натк апб Лпда1 (1990) Рго1еш Ри^^ί^сабοη Лрр1^сабοηк: Л Ргасбса1 Лрргоасб, ШЬ Ргекк а! 0\Γογ6, 0\Γογ6, и.К.; 8торек (1993) Рго1еи1 Рибйсабοη: Рбпар1ек апб Ргасбсе, 3^гб Ε6ίΙίοπ, 8рппдег Уег1ад, ΝΥ; .^п^п апб Кубеп (1998) Рго1еи1 Ри^^ί^сабοη: РппсЬ р1ек, Нщб Κекο1ибοη Мебюбк апб Лрр1^сабοηк, 8етопб Εб^бοη, ХУПеу-УСН, ΝΥ; и \Уа1кег (1998) РгоШп РтоГО^^ οη СН-К0М, Нитапа Ргекк, Νί).

В некоторых примерах нуклеиновые кислоты вводят в клетки посредством векторов, подходящих для введения и экспрессии в прокариотических клетках, например, клетках Е.тоб. Например, нуклеиновую кислоту, включающую полинуклеотидную последовательность, кодирующую РгеР антиген, можно встроить в любой из ряда имеющихся в продаже или запатентованных векторов, таких как серия экспрессионных векторов рЕТ (например, рЕТ9Ь и рЕТ2б). Экспрессию кодирующей последовательности индуцируют с помощью 1РТО, что приводит к высоким уровням экспрессии белка. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая РгеР антиген, транскрибируется под контролем промотора фага Т7. Также подходят альтернативные векторы, такие как рНКУ22, которые включают индуцируемый при увеличении температуры промотор лямбда рЬ.

- 18 021393

Экспрессионный вектор вводят (например, путем электропорации) в подходящий бактериальный хозяин. Многочисленные подходящие штаммы Е.соН имеются в наличии и могут быть выбраны квалифицированным в данной области техники специалистом, например, доказано, что штаммы КокеИа и ВЬ21 (ИЕ3) являются предпочтительными для экспрессии рекомбинантных векторов, содержащих полинуклеотидные последовательности, кодирующие РгеР антигены.

Чаще полинуклеотиды, кодирующие РгеР антигены, встраивают в экспрессионные векторы, которые подходят для введения и экспрессии в эукариотах (например, клетках насекомых или млекопитающих). Предпочтительно такие нуклеиновые кислоты оптимизированы в отношении частот использования кодонов для экспрессии в выбранном векторе/клетке-хозяине (например, проиллюстрированные в 8ЕЦ ГО N0: 5, 7, 9 и 12 последовательности оптимизированы в отношении частот использования кодонов для экспрессии в клетках СНО). В одном приводимом в качестве примера варианте осуществления полинуклеотидную последовательность, которая кодирует РгеР антиген, встраивают в вектор, такой как вектор рЕЕ14, разработанный фирмой Ьон/а В1о1од1са1к. Полипептид экспрессируется под контролем конститутивного промотора, такого как непосредственно ранний промотор СМУ (цитомегаловируса). Отбор устойчиво трансфецированных клеток, экспрессирующих полипептид, осуществляют на основе способности трансфецированных клеток к росту в отсутствие источника глютамина. Клетки, которые успешно интегрировали рЕЕ14, способы к росту в отсутствие экзогенного глютамина, поскольку вектор рЕЕ14 экпрессирует фермент 08 (глютаминсинтетазу). Отобранные клетки можно клонально размножить и охарактеризовать на экспрессию желаемого полипептида РгеР.

В другом примере полинуклеотидную последовательность, которая кодирует РгеР антиген, вводят в клетки насекомых, используя систему экспрессионного вектора в виде бакуловируса (ВЕУ8). Рекомбинантный бакуловирус, способный к инфицированию клеток насекомых, можно создать, используя имеющиеся в продаже векторы, наборы и/или системы, такие как система ВИ Васи1о0о1й от ВИ Вю8с1еисе. Вкратце, полинуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, встраивают в вектор для трансфекции рАс802. Затем клетки-хозяины 8Р9 (8ройор1ега Ггидрегйа) подвергают котрансфекции рАс802химерной плазмидой и ВИ Васи1о0о1й, содержащей линеаризованную геномную ДНК бакуловируса вируса ядерного подиэдроза Аи1одгарйа саПГописа (АсОТУ). После трансфекции происходит гомологичная рекомбинация между плазмидой рАс802 и геном бакуловируса с созданием рекомбинантного вируса. В одном примере РгеР антиген экспрессируется под регуляторным контролем промотора полиэдрина (рН). Схожие векторы для трансфекции можно получить, используя другие промоторы, такие как основной (Ва) промотор и промотор р10. Также можно использовать альтернативные клетки насекомых, такие как 8Р21, которые являются близкородственными 8Г9, и линию клеток Шдй Рще, происходящую из совки ни, Тпсйор1и51а ηί.

После трансфекции и индукции экспрессии (в соответствии с выбранным промотором и/или энхансерами или другими регуляторными элементами) экспрессированные полипептиды извлекают (например, очищают или обогащают) и ренатурируют для обеспечения укладки в антигенно активную конформацию до слияния.

Иммуногенные композиции и способы

Также предоставляются иммуногенные композиции, включающие любой из описываемых выше РгеР антигенов (такие как те, которые представлены в качестве примеров 8ЕЦ ГО N0: 6, 8 и 10) и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

В определенных вариантах осуществления, обычно вариантах осуществления, в которых РгеР антиген не включает компонент белка 0 (например, 8ЕЦ ГО N0: 6), иммуногенная композиция может включать выделенный, рекомбинантный и/или очищенный белок 0. Многочисленные подходящие белки 0 описаны в данной области техники и включают полноразмерные рекомбинатные белки 0 и химерные белки, составленные из части белка 0 (например, аминокислот 128-229 или 130-230) и партнера по слиянию (такого как тиоредоксин) или сигнальной и/или лидерной последовательности, которая облегчает экспрессию и/или очистку. Приводимые в качестве примеров белки 0 для применения в смеси с РгеР антигеном можно найти в \У0 2008114149, патенте США № 5149650, патенте США № 6113911, опубликованной заявке на патент США № 20080300382 и патенте США № 7368537, все из которых включены в данное описание посредством ссылки. Как указано в отношении химерных РгеР-0 белков, меньший фрагмент белка 0, такой как часть между аминокислотами 149-229 или часть между аминокислотой в приблизительно 128 положении и аминокислотой в приблизительно 229 положении, можно предпочтительно использоваться в условиях смесей, включающих РгеР (без 0) и 0. Как обсуждалось выше, важным соображением является присутствие иммунодоминантных эпитопов, например, включенных в район аминокислот 183-197. Альтернативно, в таких композициях может использоваться полноразмерный белок 0.

Фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны и могут быть выбраны квалифицированными в данной области техники специалистами. Например, носитель или эксципиент может предпочтительно включать буфер. Необязательно носитель или эксципиент также содержит по крайней мере один компонент, который делает растворимость и/или стабильность устойчивой. Примеры солюбилизаторов/стабилизирующих агентов включают детергенты, например, лаурилсаркозин и/или

- 19 021393

Твин. Альтернативные солюбилизаторы/стабилизирующие агенты включают аргинин и стеклообразующие полиолы (такие как сахароза, трегалоза и подобные). Многочисленные фармацевтически приемлемые носители и/или фармацевтически приемлемые эксципиенты известны в данной области техники и описываются (см., например, в КетшдШи'к РЬаттасеиЬса1 8аеисе8, Ьу Е.'ЭД'. МагЪи, Маск РиЬЬкШид Со., ЕазШи, РА, 5^4Ь ЕДШои (1975)).

Соответственно, подходящие эксципиенты и носители могут быть выбраны квалифицированными в данной области техники специалистами для получения композиции, подходящей для доставки субъекту с использованием выбранного пути введения.

Подходящие эксципиенты включают, без ограничения глицерин, полиэтиленгликоль (РЕО), сорбит, трегалозу, Ν-лауроилсаркозин натрий, Ь-пролин, не являющийся детергентом сульфобетаин, гуанидина гидрохлорид, мочевину, триметиламиноксид, КС1, родственные соли Са²+, Мд²⁴, Ми²+, 2и²+ и других двухвалентных катионов, дитиотрейтол, дитиоэритрол и β-меркаптоэтанол. Другие эксципиенты могут быть детергентами (включающими Твин-80, Твин-20, Тритон Х-00, ΝΈ-40, эмпиген ВВ, октилглюкозид, лауроилмальтозид, цвиттергент 3-0, цвиттергент 3-2, цвиттергент 3-4, цвиттергент 3-6, СНАР8, натрия дезоксихолат, натрия додецилсульфат, цетилтриметиламмония бромид).

Необязательно иммуногенные композиции также включают адъювант. Для иммуногенной композиции, подходящей для введения субъекту с целью вызова защитного иммунного ответа против КЗУ, адъювант выбирают так, чтобы он вызывал иммунный ответ со сдвигом в направлении ТЬ1-типа.

Адъювант обычно выбирают для усиления иммунного ответа со сдвигом в направлении ТЬ1-типа у субъекта или популяции субъектов, которым вводится композиция. Например, когда иммуногенная композиция должна вводиться субъекту конкретной возрастной группы, восприимчивому (или подверженному повышенному риску) к КЗУ инфекции, адъювант выбирают так, чтобы он был безопасным и эффективным для субъекта или популяции субъектов. Таким образом, при составлении иммуногенной композиции, содержащей РгеР антиген КЗУ, для введения пожилому субъекту (такому как субъект возрастом больше 65 лет) адъювант выбирают так, чтобы он был безопасным и эффективным для пожилых субъектов. Подобным образом, когда иммуногенная композиция, содержащая РгеР антиген КЗУ, предназначена для введения являющемуся новорожденным или младенцем субъекту (такому как субъекты от рождения до возраста двух лет), адъювант выбирают так, чтобы он был безопасным и эффективным для новорожденных или младенцев.

Кроме того, адъювант обычно выбирают так, чтобы он усиливал иммунный ответ ТЬ1-типа после введения путем введения, с помощью которого вводится иммуногенная композиция. Например, при составлении иммуногенной композиции, содержащей РгеР антиген КЗУ, для введения в нос предпочтительными сдвигающими в направлении ТЬ1-типа адъювантами являются протеосома и протоллин. Напротив, при составлении иммуногенной композиции для внутримышечного введения предпочтительно выбирают адъюванты, включающие один или несколько из 30-МРБ, сквалена (например, Οδ21), липосом и/или эмульсий масло-в-воде.

Одним адъювантом, подходящим для применении в комбинации с РгеР антигенами, является нетоксичное производное бактериального липополисахарида. Примером подходящего нетоксичного производного липида А является монофосфориллипид А или конкретнее 3-деацилированый монофосфориллипид А (30-МРБ). 30-МРБ продается под названием МРЬ О1ахо8тЪЬК1ше Вю1одюак Ν.Α. и упоминается по всему документу как МРЬ или 3И-МРЬ (см., например, патенты США № 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094). 30-МРБ, главным образом, активирует СИ4+ Т-клеточную реакцию ΙΝΡ-γ (ТЬ1)-фенотипа. 3ΌМРЬ можно получить в соответствии со способами, описанными в ОВ222 0211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированого монофосфориллипида А с 3-, 4-, 5-или 6-ацилированными цепями. В композициях настоящего изобретения можно использовать 30-МРБ с меньшим размером частицы. 30-МРБ с меньшим размером частицы имеют такой размер частицы, что она может проходить при стерилизации фильтрованием через 0,22-мкм фильтр. Такие препараты описываются в \У0 94/21292.

Липополисахарид, такой как 30-МРБ, можно использовать в количествах между 1 и 50 мкг в каждой дозе иммуногенной композиции для человека. Такой 30-МРБ можно использовать на уровне, составляющем приблизительно 25 мкг, например, между 20 и 30 мкг, соответственно между 21 и 29 мкг, или между 22 и 28 мкг, или между 23 и 27 мкг, или между 24 и 26 мкг, или 25 мкг. В другом варианте осуществления доза иммуногенной композиции для человека включает 30-МРБ на уровне, составляющем приблизительно 10 мкг, например, между 5 и 15 мкг, соответственно между 6 и 14 мкг, например, между 7 и 13 мкг, или между 8 и 12 мкг, или между 9 и 11 мкг, или 10 мкг. В дальнейшем варианте осуществления доза иммуногенной композиции для человека включает 30-МРБ на уровне, составляющем приблизительно 5 мкг, например, между 1 и 9 мкг, или между 2 и 8 мкг, или соответственно между 3 и 7 мкг, или 4 мкг, или 5 мкг.

В других вариантах осуществления липополисахаридом может быть дисахарид β (1-6)глюкозамин, описанный в патенте США № 6005099 и Европейском патенте № 0729473 В1. Квалифицированный в данной области техники специалист сможет без труда получить различные липополисахариды, такие как 30-МРБ, основываясь на идеях, приведенных в этих ссылках. Тем не менее, каждая из этих ссылок

- 20 021393 включена в данное описание посредством ссылки. Помимо вышеупомянутых иммуностимулирующих средств (которые схожи по структуре с ЬР8 или МРЬ или 3Э-МРЬ) подходящими адъювантами также являются ацилированные производные моносахаридов и дисахаридов, которые являются субфрагментом указанной выше структуры МРЬ. В других вариантах осуществления адъювантом являются синтетические производные липида А, некоторые из которых описываются как агонисты ТЬК-4 и включают, но без ограничения, ОМ174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетра-деканоиламино]-4-офосфоно-в-О-глюкопиранозил]-2-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-О-глюкопиранозилдигидрогенфосфат) (νθ 95/14026); ОМ 294 ЭР (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза9(К)-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1,10-бис(дигидрогенфосфат) (νθ 99/64301 и νθ 00/0462) и ОМ 197 МР-Ас ЭР (38,9К)-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1-дигидрогенфосфат 10-(6-аминогексаноат) (νθ 01/46127).

Другими лигандами ТЬК-4, которые могут использоваться, являются алкилированные глюкокозаминиды фосфаты (АСР), такие как те, которые описаны в νθ 98/50399 или патенте США № 6303347 (также описываются способы приготовления АСР), соответственно КС527 или КС529 или фармацевтически приемлемые соли АСР, описанные в патенте США № 6764840. Некоторые АСР являются агонистами ТЬК-4, а некоторые - антагонистами ТЬК4. Полагают, что и те, и другие применимы в качестве адъювантов.

Другими подходящими лигандами ТЬК-4, способными к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-4 (8аЬгос с! а1., Л 2003, р1630-5), являются, например, липополисахарид из грамотрицательных бактерий и его производные, или его фрагменты, в частности, нетоксичные производные ЬР8 (такие как 3ΌМРЬ). Другими подходящими агонистами ТЬК являются белок теплового шока (Н8Р) 10, 60, 65, 70, 75 или 90, поверхностно-активный белок А, олигосахариды в виде гуалуроновой кислоты, фрагменты гепарансульфата, фрагменты фибронектина, пептиды фибриногена и в-дефенсин-2, и мурамил-дипептид (МОР). В одном варианте осуществления агонистом ТЬК является Н8Р 60, 70 или 90. Другие подходящие лиганды ТЬК-4 описаны в νθ 2003/011223 и в νθ 2003/099195, такие как соединение I, соединение II и соединение III, описанные на с. 4-5 νθ 2003/011223 или на с. 3-4 νθ 2003/099195, и особенно такие соединения, описанные в νθ 2003/011223, как ЕК803022, ЕК803058, ЕК803732, ЕК804053, ЕК804057, ЕК804058, ЕК804059, ЕК804442, ЕК804680 и ЕК804764. Например, одним подходящим лигандом ТЬК-4 является ЕК804057.

В качестве адъювантов также применимы дополнительные агонисты ТЬК. Термин агонист ТЬК относится к агенту, который способен к вызову ответа сигнальной системы через путь передачи сигналов с участием ТЬК, или в качестве прямого лиганда, или опосредованно через образование эндогенного или экзогенного лиганда. Такие природные или синтетические агонисты ТЬК можно использовать в качестве альтернативных или дополнительных адъювантов. Краткий обзор роли ТЬК в качестве рецепторов адъювантов представлен в КаЫю & Акгга, ВюсЫтка с! Вюркукюа Ас!а 1589: 1-13, 2002. Эти возможные адъюванты включают, но без ограничения, агонисты ТЬК2, ТЬК3, ТЬК7, ТЬК8 и ТЬК9. Соответственно, в одном варианте осуществления адъювант и иммуногенная композиция дополнительно включает адъювант, который выбран из группы, состоящей из агониста ТЬК-1, агониста ТЬК-2, агониста ТЬК-3, агониста ТЬК-4, агониста ТЬК-5, агониста ТЬК-6, агониста ТЬК-7, агониста ТЬК-8, агониста ТЬК-9 или их комбинации.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения используют агонист ТЬК, который способен к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-1. Соответственно, когда агонист ТЬК, способный к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-1, выбирают из триацилированных липопептидов (ЬР), фенол-растворимого модулина, ЬР МусоЬас!сгшт 1иЬсгси1о515, 8-(2,3-бис(пальмитоилокси)-(2-К8)пропил)-^пальмитоил-(К)-Су5-(8)-8сг-(8)-Ьу5(4)-ОН, тригидрохлорида (Рат3Сук) ЬР, который воспроизводит ацетилированный амино-конец бактериального липопротеина и ЬР Окр из ВоггсПа ЬшдбогГсгг

В альтернативном варианте осуществления используют агонист ТЬК, который способен к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-2. Соответственно, когда агонистом ТЬК, способным к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-2, является один или несколько из липопротеина, пептидогликана, бактериального липопептида из М. 1иЬсгси1о515, В. ЬигдбогГсп или Т. раШбит, пептидогликанов из видов, включающий 81арПу1ососсик аигсик, липотейхоевых кислот, маннуроновых кислот, поринов №155спа, бактериальных пилусов, факторов вирулентности Усгапа, вирионов СМУ, коревого гемагглютинина и зимозана из дрожжей.

В альтернативном варианте осуществления используют агонист ТЬК, который способен к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-3. Соответственно, когда агонистом ТЬК, способным к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-3, является двухцепочечная РНК или полиинозиноваяполицитидиловая кислота (поли ГС), молекулярный тип нуклеиновых кислот связан с вирусной инфекцией.

В альтернативном варианте осуществления используют агонист ТЬК, который способен к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-5. Соответственно, когда агонистом ТЬК, способным к вызову

- 21 021393 ответа сигнальной системы через ТЬК-5, является бактериальный флагеллин.

В альтернативном варианте осуществления используют агонист ТЬК, который способен к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-6. Соответственно, когда агонистом ТЬК, способным к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-6, является микобактериальный липопротеин, диацилированный ЬР и фенол-растворимый модулин. Дополнительные агонисты ТЬК-6 описаны в У0 2003/043572.

В альтернативном варианте осуществления используют агонист ТЬК, который способен к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-7. Соответственно, когда агонистом ТЬК, способным к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-7, является одноцепочечная РНК, локсорибин, аналог гуанозина по положениям N7 и С8 или соединение имидазохинолин или его производное. В одном варианте осуществления агонистом ТЬК является имиквимод. Дополнительные агонисты ТЬК-7 описаны в У0 2002/085905.

В альтернативном варианте осуществления используют агонист ТЬК, который способен к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-8. Соответственно, когда агонистом ТЬК, способным к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-8, является одноцепочечная РНК, молекула имидазохинолина с противовирусной активностью, например, резиквимод (К849); резиквимод также может распознаваться ТЬК-7. Другие агонисты ТЬК-8, которые могут использоваться, включают те, которые описаны в У0 2004/071459.

В альтернативном варианте осуществления используют агонист ТЬК, который способен к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-9. В одном варианте осуществления агонистом ТЬК, способным к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-9, является НЗР90. Альтернативно, агонистом ТЬК, способным к вызову ответа сигнальной системы через ТЬК-9, является бактериальная или вирусная ДНК, ДНК, содержащая неметилированные нуклеотиды СрС, в частности, случаи последовательностей, известные как СрС-мотивы. СрС-содержащие олигонуклеотиды индуцируют преимущественно ответ ТН1типа. Такие олигонуклеотиды широко известны и описаны, например, в У0 96/02555, У0 99/33488 и патентах США № 6008200 и 5856462. Соответственно, когда нуклеотиды СрС являются СрСолигонуклеотидами.

Олигонуклеотидами, подходящими для применения в иммуногенных композициях настоящего изобретения, являются СрС-содержащие олигонуклеотиды, необязательно содержащие два или более динуклеотидных СрС мотивов, разделенных по крайней мере тремя, соответственно по крайней мере шестью или более нуклеотидами. СрС-мотив представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. СрС-олигонуклеотиды настоящего изобретения обычно представляют собой дезоксинуклеотиды. В конкретном варианте осуществления межнуклеотидной связью в олигонуклеотиде является фосфородитиоат или соответственно фосфоротиоатная связь, хотя в объеме настоящего изобретения находятся фосфодиэфирные и другие межнуклеотидные связи. В объем настоящего изобретения также включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения олигонуклеотидов с фосфоротиоатными связями или фосфородитиота описаны в патентах США № 5666153, 5278302 и У0 95/26204.

Другими адъювантами, которые могут использоваться в иммуногенных композициях с РгеР антигенами, сами по себе или в комбинации с 3Ь-МРЬ или другим адъювантом, описанным в настоящем описании, являются сапонины, такие как ОЗ21.

О сапонинах сообщают Ьасаб1е-ОиЬо18 М. и Уадпег Н. (1996. А Ке\ае\у о£ (Не Ью1одюа1 апб рНаттасо1ощса1 асПуЮек о£ карошпк. РНуФтебюше, νο1. 2, рр. 363-386). Сапонины являются стероидными или тритерпеновыми гликозидами, широко распространенными в царствах растений и морских животных. Замечено, что сапонины образуют коллоидные растворы в воде, которые пенятся при встряхивании и вызывают преципитацию холестерина. Когда сапонины находятся вблизи клеточных мембран, они создают пороподобные структуры в мембране, которые вызывают разрыв мембраны. Гемолиз эритроцитов является примером этого явления, которое является свойством некоторых, но не всех сапонинов.

Сапонины известны в качестве адъювантов в вакцинах для системного введения. Адъювантная и гемолитическая активность отдельных сапонинов была тщательно изучена в данной области техники (Ьасаб1е-ПиЬо18 и Уадпег, выше). Например, Квил А (Оиб А) (полученный из коры дерева Южной Америки Ош11а)а Заропапа МоНпа) и его фракции описываются в патенте США № 5057540 и в Зарошпк ак уассше абщуапЦ (см. Кепкб С.К., Стб. Кем. ТНет. Огид Сатег ЗукЬ, 1996, 12 (1-2): 1-55), и ЕР 0362279 В1. Корпускулярные структуры, названные иммуностимулирующими комплексами (1ЗС0МЗ), включающие фракции Квил А, являются гемолитическими и использовались при производстве вакцин (Мотет, В., ЕР 0109942 В1; У0 96/11711; У0 96/33739). Гемолитические сапонины ОЗ21 и ОЗ17 (очищенные с помощью НРЬС фракции Квил А) были описаны как сильные адъюванты при системном введении, и способ их получения описан в патенте США № 5057540 и ЕР 0362279 В1, которые включены в данное описание посредством ссылки. Другие сапонины, которые использовались в исследованиях вакцинации с помощью системного введения, включают те, которые получают из других видов растений, таких как СуркорНба и Заропапа (ВошГогб е( а1., Уассше. 10(9): 572-577, 1992).

ОЗ21 представляет собой очищенную с помощью НРЬС, нетоксичную фракцию, полученную из

- 22 021393 коры Рш11а)а 8аропапа МоНпа. Способ получения 0821 описан в патенте США № 5057540. Нереактогенные адъювантные композиции, содержащие 0821, описаны в \УО 96/33739. Вышеупомянутые ссылки включены в данное описание посредством ссылки. Указанный иммунологически активный сапонин, такой как 0821, можно использовать в количествах между 1 и 50 мкг в каждой дозе иммуногенной композиции для человека. Преимущественно 0821 используют на уровне, составляющем приблизительно 25 мкг, например, между 20 и 30 мкг, соответственно между 21 и 29 мкг, или между 22 и 28 мкг, или между 23 и 27 мкг, или между 24 и 26 мкг, или 25 мкг. В другом варианте осуществления доза иммуногенной композиции для человека включает 0821 на уровне, составляющем приблизительно 10 мкг, например, между 5 и 15 мкг, соответственно между 6 и 14 мкг, например, между 7 и 13 мкг, или между 8 и 12 мкг, или между 9 и 11 мкг, или 10 мкг. В дальнейшем варианте осуществления доза иммуногенной композиции для человека включает 0821 на уровне, составляющем приблизительно 5 мкг, например, между 1 и 9 мкг, или между 2 и 8 мкг, или соответственно между 3 и 7 мкг, или между 4 и 6 мкг, или 5 мкг. Установлено, что такие композиции, включающие 0821 и холестерин, являются результативными, ТН1стимулирующими адъювантами после составления вместе с антигеном. Таким образом, например, полипептиды РгеР можно предпочтительно использовать в иммуногенных композициях с адъювантом, включающим комбинацию 0821 и холестерина.

Необязательно адъювант может также включать минеральные соли, такие как соли алюминия или кальция, в частности, алюминия гидроокись, алюминия фосфат и кальция фосфат. Например, адъювант, содержащий 3О-МРЬ в комбинации с солью алюминия (например, алюминия гидроокисью или квасцами), подходит для включения в состав иммуногенной композиции, содержащей РгеР антиген, для введения являющемуся человеком субъекту.

Другой класс сдвигающих в направлении ТЫ-типа адъювантов, подходящих для применения в композициях с РгеР антигенами, включает иммуностимулирующие композиции на основе ОМР. Иммуностимулирующие композиции на основе ОМР особенно подходят в качестве адъювантов для введения через слизистую оболочку, например, для интраназального введения. Иммуностимулирующие композиции на основе ОМР являются классом препаратов внешних мембранных белков (ОМР, в том числе некоторых поринов) из грамотрицательных бактерий, таких как, но без ограничения, видов №188епа (см., например, ЬотеП е! а1., 1. Ехр. МеФ 167: 658, 1988; Ьо\уе11 е! а1., 8Фепсе 240: 800, 1988; Ьупск е! а1., Βίορίινδ. 1. 45: 104, 1984; Ьо^еИ, ίη Νον ОепегаОоп Уассшез 2¹¹'¹ ей., Магсе1 Эеккег, 1пс., Νον Уогк, ВазП, Нопд Копд, раде 193, 1997; патент США № 5726292, патент США № 4707543), которые применимы в качестве носителей или в композициях для иммуногенов, таких как бактериальные или вирусные антигены. Некоторые иммуностимулирующие композиции на основе ОМР называют протеосомами, которые являются гидрофобными и безопасными для применения для человека. Протеосомы обладают способностью к самосборке в везикулярные или подобные везикулам скопления ОМР диаметром от приблизительно 20 нм до приблизительно 800 нм и к нековалентному включению, координированию, связи (например, электростатической или гидрофобной) или иному взаимодействию с белковыми антигенами (Аг), особенно антигенами, имеющими гидрофобную составляющую. Любой способ приготовления, который дает в результате компонент внешних мембранных белков в везикулярной или подобной везикулам форме, включающей многомолекулярные, напоминающие мембрану структуры или жидкие композиции шаровидных ОМР из одного или нескольких ОМР, включен в определение протеосома. Протеосомы можно приготовить, например, как описано в данной области техники (см., например, патент США № 5726292 или патент США № 5985284). Протеосомы могут также содержать эндогенный липополисахарид или липоолигосахарид (ЬР8 или ЬО8 соответственно), происходящие из бактерий, используемых для получения поринов в качестве ОМР (например, видов №188епа), которые обычно будут составлять менее 2% общего препарата ОМР.

Протеосомы состоят, главным образом, из химически выделенных внешних мембранных белков (ОМР) из №188епа тетпдШФ8 (главным образом, поринов А и В, а также ОМР класса 4), сохраняемых в растворе с помощью детергента (Ьо^еИ О.Н. Рго!ео8оте8 £от Пнргоуей №-18а1, Ога1, ог 1п_)ес!аЫе Уассше8. 1п: Ьеу1пе М.М., \УооФо\у О.С., Карег ΙΒ., СоЬоп О.8., еЙ8., Νον Оепета!юп8 Уассше8. №\ν Уогк: Магсе1 Эеккег, 1пс. 1997; 193-206). Протеосомы можно приготовить с использованием ряда антигенов, таких как очищенные или рекомбинантные белки, происходящие из вирусных источников, в том числе полипептидов РгеР, описываемых в настоящем описании, например, с помощью диафильтрации или обычных способов диализа. Постепенное удаление детергента делает возможным образование корпускулярных гидрофобных комплексов диаметром приблизительно 100-200 нм (Ъо\уе11 О.Н. Рго!ео8оте8 £от Опргоуей №-18а1, Ога1, ог 1п)ес1аЬ1е Уассше8. 1п: Ьеуше М.М., \УооФо\у О.С., Карег ΙΒ, СоЬоп О.8., ей8., Νον Оепега!юп8 Уассше8. Νον Уогк: Магсе1 Эеккег, 1пс. 1997; 193-206).

Как используют в настоящем описании, протеосомы:ЬР8 или протоллин относятся к препаратам протеосом, смешанных, например, при экзогенном добавлении, с по крайней мере одним видом липополисахарида для получения композиции ОМР-ЬР8 (которая может функционировать в качестве иммуностимулирующей композиции). Таким образом, композиция ОМР-ЬР8 может состоять из по крайней мере двух основных компонентов протоллина, которые включают (1) протеосомный препарат внешних

- 23 021393 мембранных белков (например, проювант), приготовленный из грамотрицательных бактерий, таких как №188епа тетпдШФз, и (2) препарат одного или нескольких липосахаридов.

Липоолигосахарид может быть эндогенным (например, природно содержащимся вместе с протеосомным препаратом ОМР), может быть смешан или объединен с препаратом ОМР, исходя из экзогенно приготовленных липоолигосахаридов (например, приготовленных из культуры или микроорганизма, отличных от таковых для препарата ОМР), или может быть их комбинацией. Такие экзогенно добавляемые ΕΕδ могут происходить из грамотрицательной бактерии, одинаковой с бактерией, их которой получен препарат ОМР, или происходить из отличной грамотрицательной бактерии. Должно быть также понятно, что протоллин необязательно включает липиды, гликолипиды, гликопротеины, небольшие молекулы или подобные, и их комбинации. Протоллин можно приготовить, например, как описано в публикации заявки на патент США № 2003/0044425.

В композициях с РгеР антигенами могут также использоваться комбинации различных адъювантов, таких как те, которые упоминались выше. Например, как уже отмечалось, φδ21 можно составить вместе с 3О-МРЬ. Отношение ^δ21:3^-ΜΡ^ будет обычно на уровне от 1:10 до 10:1, например, от 1:5 до 5:1, и часто, по существу, 1:1. Как правило, отношение находится на уровне от 2,5:1 до 1:1 3^-ΜΡ^:^δ21. Другая комбинированная адъювантная композиция включает 3Э-МРЕ и соль алюминия, такую как алюминия гидроокись. После составления в комбинацию эта комбинация может усиливать антигенспецифический иммунный ответ ТЫ-типа.

В некоторых случаях адъювантная композиция включает эмульсию типа масло-в-воде или минеральные соли, такие как соли кальция или алюминия, например, кальция фосфат, алюминия фосфат или алюминия гидроокись.

Один пример эмульсии типа масло-в-воде включает преобразующееся в ходе метаболизма масло, такое как сквален, токол, такой как токоферол, например, альфа-токоферол, и поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80 или Твин 90, в водном носителе или не содержит какое-либо дополнительное иммуностимулирующее средство (а), в частности, он не содержит нетоксичное производное липида А (такое как 3Э-МРЕ) или сапонин (такой как φδ21). Водным носителем может быть, например, забуференный фосфатом физиологический раствор. Кроме того, эмульсия типа масло-в-воде может содержать Спан 85 и/или лецитин и/или трикаприлин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предоставляется вакцинная композиция, включающая антиген или композицию антигенов и адъювантную композицию, включающую эмульсию типа масло-в-воде и необязательно один или несколько дополнительных иммуностимулирующих средств, причем указанная эмульсия типа масло-в-воде включает 0,5-10 мг преобразующегося в ходе метаболизма масла (соответственно сквалена), 0,5-11 мг токола (соответственно токоферола, такого как альфа-токоферол) и 0,4-4 мг эмульгатора.

В одном конкретном варианте осуществления адъювантная композиция включает 3Э-МЕР. приготовленный в форме эмульсии, такой как эмульсия типа масло-в-воде. В некоторых случаях эмульсия имеет маленький размер частиц, составляющий менее 0,2 мкм в диаметре, как описывается в \УР 94/21292. Например, частицы 3Э-МРЕ могут быть достаточно маленькими, чтобы проходить при стерилизации фильтрованием через 0,22-мкм мембрану (как описано в Европейском патенте № 0689454). Альтернативно, 3Э-МРЕ могут быть приготовлены в липосомной композиции. Необязательно адъювант, содержащий 3Э-МРЕ (или его производное), также включает дополнительный иммуностимулирующий компонент.

Например, когда иммуногенную композицию с полипептидным РгеР антигеном составляют для введения младенцам, дозу адъюванта устанавливают так, чтобы она была эффективной и относительно нереактогенной для являющегося младенцем субъекта. Как правило, доза адъюванта в композиции для введения младенцу ниже дозы, используемой в композициях, предназначенных для введения взрослому (например, взрослым возрастом 65 лет или старше). Например, количество 3Э-МРЕ обычно находится в диапазоне 1-200 мкг, например, 10-100 мкг или 10-50 мкг в каждой дозе. Доза для младенца обычно находится в нижнем конце этого диапазона, например, составляет от приблизительно 1 мкг до приблизительно 50 мкг, например, от приблизительно 2 мкг, или приблизительно 5 мкг, или приблизительно 10 мкг до приблизительно 25 мкг или до приблизительно 50 мкг. Как правило, если в композиции используется Οδ21, диапазоны являются аналогичными (и находятся в соответствии с указанными выше отношениями). Для популяций взрослых и пожилых композиции обычно включают больше адъювантного компонента, чем обычно находится в композиции для младенцев. В конкретных композициях, в которых используется эмульсия типа масло-в-воде, такая эмульсия может включать дополнительные компоненты, например, такие как холестерин, сквален, альфа-токоферол и/или детергенты, такие как Твин 80 или Спан 85. В приводимых в качестве примеров композициях такие компоненты обычно присутствуют в следующих количествах: от приблизительно 1 до 50 мг холестерина, от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% альфа-токоферола и от 0,3 до 3% Твин 80. Как правило, отношение сквалена к альфа-токоферолу равно или меньше 1, поскольку это дает более стабильную эмульсию. В некоторых случаях композиция может также содержать стабилизатор. Если присутствуют квасцы, например, в комбинации с 3П-МРЬ, количе- 24 021393 ство обычно находится между приблизительно 100 мкг и 1 мг, например, от приблизительно 100 мкг или приблизительно 200 мкг до приблизительно 750 мкг, например, приблизительно 500 мкг в каждой дозе.

Иммуногенная композиция обычно содержит иммунопротективное количество (или его дробную дозу) антигена и может быть приготовлена с помощью общепринятых методов. Приготовление иммуногенных композиций, в том числе композиций для введения являющимся людьми субъектам, в общих чертах описано в РЬагтасеийса1 Вю1есЬпо1оду, уо1. 61, Уассше ОекщгИНе киЪипй апй айщуат арргоасЬ, еййей Ьу Роуе11 апй №\утап. Р1епит Ргекк, 1995, №у Тгепйк апй Оеуе1ортеп1к ίη Уассшек, еййей Ьу Уо11ег е1 а1., Итуегкйу Рагк Ргекк, ВаШтоге, Магу1апй, И.8.А. 1978. Инкапсуляция в липосомы описана, например, Ри11ег1оп в патенте США № 4235877. Конъюгирование белков с макромолекулами описано, например, ЫкЬйе в патенте США № 4372945 и Агтог и др. в патенте США № 4474757.

Как правило, количество белка в каждой дозе иммуногенной композиции выбирают так, чтобы оно было количеством, которое вызывает иммунопротективный ответ без значительных, неблагоприятных побочных эффектов у обычного субъекта. Иммунопротективный в этом контексте не означает обязательно полностью защитный от инфекции; этот термин подразумевает защиту от симптомов или заболевания, особенно тяжелого заболевания, связанного с вирусом. Количество антигена может меняться в зависимости от того, какой конкретный иммуноген используется. Как правило, предполагается, что каждая доза для введения человеку будет включать 1-1000 мкг белка, например, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мкг, например, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 50 мкг, например, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 40 мкг или приблизительно 50 мкг. Количество, используемое в иммуногенной композиции, выбирают, основываясь на популяции субъектов (например, младенцев или пожилых). Оптимальное количество для конкретной композиции может быть установлено с помощью стандартных исследований, включающих измерение титров антител и других ответных реакций у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получить бустер-инъекцию через приблизительно 4 недели.

Следует отметить, что независимо от выбранного адъюванта концентрацию в конечной композиции рассчитывают так, чтобы она была безопасной и эффективной для целевой популяции. Например, иммуногенные композиции для вызова иммунного ответа против К8У у людей предпочтительно вводят младенцам (например, младенцам возрастом от рождения до 1 года, например, между 0 и 6 месяцами, для первоначальной дозы). Иммуногенные композиции для вызова иммунного ответа против К8У также предпочтительно вводят пожилым людям (например, отдельно или в комбинации с антигенами других патогенов, связанных с СОРЭ). Будет понятно, что выбор адъюванта может быть различным для этих различных применений, и квалифицированные в данной области техники специалисты могут эмпирически определить оптимальные для каждой ситуации адъювант и концентрацию.

В определенных вариантах осуществления иммуногенные композиции представляют собой вакцины, которые уменьшают или предотвращают инфицирование К8У. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции представляют собой вакцины, которые ослабляют или предотвращают патологическую ответную реакцию после инфицирования К8У. Необязательно иммуногенные композиции, содержащие РгеР антиген, составляют с по крайней мере одним дополнительным антигеном патологического организма, отличного от К8У. Например, патогенным организмом может быть патоген дыхательных путей (такой как вирус или бактерия, которые вызывают инфекцию дыхательных путей). В определенных случаях иммуногенная композиция содержит антиген, происходящий из патогенного вируса, отличного от К8У, такого как вирус, который вызывает инфекцию дыхательных путей, такую как грипп или парагрипп. В других вариантах осуществления дополнительные антигены выбирают для способствования введению или уменьшения числа иммунизации, требуемого для защиты субъекта от множества инфекционных организмов. Например, антиген может происходить из любого одного или нескольких следующих организмов: вируса гриппа, гепатита В, возбудителя дифтерии, столбняка, коклюша, НаеторШ1ик тЛиеп/ае, полиовируса, 81гер1ососсик или Рпеишососсик, среди прочих.

Соответственно, применение РгеР антигенов или кодирующих их нуклеиновых кислот для приготовления лекарственного средства для лечения от воздействия или инфицирования К8У (или терапевтически после него или профилактически перед ним) является также отличительным признаком описания этого изобретения. Так же способы вызова иммунного ответа против К8У у субъекта являются отличительным признаком описания этого изобретения. Такие способы включает введение иммунологически эффективного количества композиции, включающей РгеР антиген, субъекту, такому как являющийся человеком субъект. Обычно композиция включает адъювант, который вызывает иммунный ответ со сдвигом в направлении ТЫ-типа. Композицию составляют так, чтобы она вызывала иммунный ответ, специфичный для К8У, без усиления вирусного заболевания после контактирования с К8У. Т.е. композиция приводит к иммунному ответу со сдвигом в направлении ТЫ-типа, который уменьшает или предотвращает инфицирование К8У и/или ослабляет или предотвращает патологическую ответную реакции после инфицирования К8У. Хотя композицию можно вводить с использованием ряда различных путей, чаще всего иммуногенные композиции доставляют с использованием внутримышечного или интраназального пути введения.

- 25 021393

Иммуногенная композиция обычно содержит иммунопротективное количество (или его дробную дозу) антигена и может быть приготовлена с помощью общепринятых методов. Приготовление иммуногенных композиций, в том числе композиций для введения являющимся людьми субъектам, в общих чертах описано в Рйаттасеийса1 Вю!есЬпо1о§у, νοί. 61, Упссн^ Ие81дп-1йе киЬипй апй айщ\'ап1 арргоасй, еййей Ьу Ро\уе11 апй №\утап, Р1епит Рге88, 1995, №\у Тгепйк апй Ое\'е1ортеп15 ш Vасс^пеδ, еййей Ьу Уо11ег е1 а1., ИпТОегейу Рагк Рге55, ВаШтоге, Магу1апй, υ.δ.Α. 1978. Инкапсуляция в липосомы описана, например, РиНейоп в патенте США № 4235877. Конъюгирование белков с макромолекулами описано, например, Ыкййе в патенте США № 4372 945 и Агтог и др. в патенте США № 4474757.

Как правило, количество белка в каждой дозе иммуногенной композиции выбирают так, чтобы оно было количеством, которое вызывает иммунопротективный ответ без значительных, неблагоприятных побочных эффектов у обычного субъекта. Иммунопротективный в этом контексте не означает обязательно полностью защитный от инфекции; этот термин подразумевает защиту от симптомов или заболевания, особенно тяжелого заболевания, связанного с вирусом. Количество антигена может меняться в зависимости от того, какой конкретный иммуноген используется. Как правило, предполагается, что каждая доза для введения человеку будет включать 1-1000 мкг белка, например, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мкг, например, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 50 мкг, например, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 40 мкг или приблизительно 50 мкг. Количество, используемое в иммуногенной композиции, выбирают, основываясь на популяции субъектов (например, младенцев или пожилых). Оптимальное количество для конкретной композиции может быть установлено с помощью стандартных исследований, включающих измерение титров антител и других ответных реакций у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получить бустер-инъекцию через приблизительно 4-12 недель.

Например, при введении иммуногенной композиции, содержащей РгеР антиген, являющемуся младенцем субъекту, первоначальная и последующие иммунизации могут осуществляться с совмещением с другими вакцинами, вводимыми во время этого периода времени.

Следующие примеры предоставлены для иллюстрации некоторых конкретных отличительных признаков и/или вариантов осуществления. Не следует истолковывать, что эти примеры ограничивают настоящее изобретение описанными конкретными признаками или вариантами осуществления.

Примеры

Пример 1. Приводимые в качестве примеров РгеР антигены

РгеР антиген был модифицирован по сравнению с природным белком Р Κδν для стабилизации белка в его конформации до слияния, основываясь на предсказании того, что иммунный ответ, созданный против конформации белка Р до его слияния, будет, возможно, предпочтительно включать антитела, которые могли бы предотвратить связывание, конформационный переход и/или другие события, вовлеченные в слияние с мембранной, увеличивая, тем самым, эффективность защитного ответа.

На фиг. 1А и В схематически иллюстрируются отличительные признаки Р0 Κδν и приводимых в качестве примеров РгеР антигенов. Фиг. 1А является представлением белка Р0 Κδν. Р0 является пребелком, состоящим из 574 аминокислот. Пребелок Р0 подвергается протеолическому расщеплению и гликозилированию после трансляции. Сигнальный пептид, который впоследствии удаляется с помощью сигнальной пептидазы, задает трансляцию пребелка Р0 в эндоплазматическом ретикулуме (ΚΕ). Возникающий в ΚΕ пептид затем ^гликозилируется во множестве сайтов (представленных треугольниками). В результате расщепления Р0 фурином образуются Р2- и Р1-пептидные домены, которые укладываются и собираются вместе в тримеры гетеродимеров Р2-Р1 (т.е. 3 раза Р2-Р1). В этом природном состоянии белок Р закрепляется в мембране с помощью трансмембранной спирали в С-концевой области. Дополнительные отличительные признаки полипептида Р0 включают 15 остатков цистеина, 4 характерных нейтрализующих эпитопа, 2 биспиральных района и мотив липидизации. На фиг. 1В иллюстрируются отличительные признаки приводимых в качестве примеров РгеР антигенов. Для конструирования РгеР антигена полипептид Р0 был модифицирован для стабилизации конформации белка Р до его слияния, сохраняя в связи с этим предоминантные иммуногенные эпитопы белка Р, презентируемые вирусом Κδν до связывания и слияния с клетками-хозяинами. Следующие стабилизирующие мутации были введены в РгеР антиген относительно полипептида Р0. Во-первых, стабилизирующий биспиральный домен был размещен на С-конце экстраклеточного домена полипептида Р0, заменяя домен закрепления в мембране Р0. Во-вторых, был удален пептид р27 (находящийся между Р2- и Р1-доменами в природном белке). Втретьих, были исключены оба мотива для фурина. В альтернативных вариантах осуществления (названных РгсР_У1 и РгеР_У2) к С-концевому домену добавлена иммунологически активная часть (например, аминокислоты 149-229) белка С Κδν.

Пример 2. Продукция и очистка рекомбинанного белка РгеР из клеток СНО

Рекомбинантная полинуклеотидная последовательность, кодирующая приводимый в качестве примера РгеР антиген, была введена в клетки СНО-хозяины для продукции РгеР антигена. Транзиторно трансфецированные клетки-хозяины или размноженные устойчивые популяции, включающие введенную полинуклеотидную последовательность, выращивали в питательной среде и в условиях, подходящих для

- 26 021393 роста в масштабе, подходящем для желаемой цели (например, как в общих чертах описано в Ргекйпеу (1994) СиЙиге оГ Ашта1 Се1к, а Мапиа1 оГ Ват Тесйтцие, 1ййй еййюп, ^йеу-Ыкк, №\у Уогк и в приведенных там ссылках). Обычно клетки выращивали в бессывороточной среде во встряхиваемых колбах при 37°С с 5% С0₂ и пассировали с интервалами в 2-3 дня, или в биореакторах при 29°С с поддержанием р0₂ на уровне 20%.

Для извлечения рекомбинантного РгеР антигена культуру клеток подвергали центрифугированию, и супернатант культуры клеток хранили при -80°С до дальнейшего использования. Для дальнейшего анализа двухлитровые аликвоты супернатанта культуры клеток разводили в 2 раза очищенной водой и доводили до рН 9,5 с помощью Ыа0Н. Супернатант загружали со скоростью 14 мл/мин на колонку для ионообменной хроматографии О Зерйагоке РР (60 мл, 11,3 см), уравновешенную 20 мМ пиперазином, рН 9,5. После промывки колонки начальным буфером проводили элюцию с использованием 0-0,5 М градиента ЫаС1 в 20 объемах колонки (с размером фракций - 10 мл). Фракции анализировали в геле после электрофореза в δΌδ-ПААГ с помощью окрашивания серебром и вестерн-блоттинга. Фракции, содержащие значительные количества белка РгеР, затем объединяли до дальнейшей обработки.

Объединенный смыв стадии О (~130 мл) подвергали обмену буфера на 10 мМ фосфат, рН 7,0, используя лабораторную систему ТРР от Мййроге с мембранной кассетой РеШсоп ХЬ РЕδ Вютах 100 (с номинальным отсечением по молекулярной массе - 10000 Да). Получаемый в результате материал имел рН 7,0 и электропроводность 1,8 мСм/см. 100 мл Этого образца загружали со скоростью 5 мл/мин на 10 мл геля гидроксиапатита типа II (НА Т11) (ХК 16, высотой = 5 см), уравновешенного 10 мМ РО₄ (Ыа) буфером, рН 7,0. После промывки колонки начальным буфером проводили элюцию с использованием 10-200 мМ градиента Р0₄ (Ыа) в 20 объемах колонки. Фракции снова анализировали с помощью электрофореза в δΌδ-ПААГ с окрашиванием серебром и кумасси синим, и положительные фракции объединяли.

После аффинной хроматографии объединенные фракции концентрировали и подвергали обмену буфера на ΌΓΒδ (рН ~7,4), используя концентрационную единицу Укакрш 20, с номинальным отсечением по молекулярной массе - 10000 Да. Объем конечного продукта составлял приблизительно 13 мл. Концентрация белка составляла 195 мкг/мл, по оценке с помощью способа Лоури. Чистота составляла более 95%. Этот препарат очищенного РгеР антигена стерилизовали фильтрованием и хранили при -20°С до использования.

Пример 3. Характеристика рекомбинанного белка РгеР, продуцированного в клетках СНО

Рекомбинантный белок РгеР, продуцированный в клетках СНО, характеризовали с помощью фракционирования потоков асимметричных полей (АРР-МАРБ) и сравнивали с химерным антигеном, включающим компоненты белков Р и О КБУ. АРР-МАЕБ позволяет разделить ряд белков в соответствии с их молекулярными массами в жидком потоке с минимальным взаимодействием с матрицей и в дальнейшем проанализировать с помощью рассеяния света под множеством углов для точного определения молекулярных масс. На фиг. 2А демонстрируется, что более 65% очищенного материала РБ, как установлено, является высокомолекулярными олигомерами (1000-100000 кДа) в конечном буфере РВБ, в то время как 3% остается в мономерной форме.

На фиг. 2В демонстрируется, что очищенный белок РгеР уложен в свою трехмерную форму в доле, составляющей 73%, в буфере РВБ. Установлено, что 10% материала является олигомерами с М.м. 100020000 кДа. Эти результаты означают, что рекомбинантный белок РгеР, экспрессированный в клетках СНО, уложен в тример, предсказанный для природного состояния.

Очищенный белок РгеР также подвергли сшиванию с помощью глутаральдегида с двойной целью подтверждения растворимой природы белка в фосфатном буферном растворе и создания агрегатов для сравнительной ш νί\Ό оценки с белком РО (см. пример 7 ниже). Сшивание с помощью глутаральдегида, как известно, обеспечивает достаточно хорошее определение четвертичной структуры белка и описывается в ВюсйетМгу, 36: 10230-10239 (1997); Еиг. I. Вюсйет. 271: 4284-4292 (2004)).

Белок инкубировали с 1, 2 и 5% сшивающего агента глутаральдегида в течение 4 ч при 4°С, и реакцию блокировали добавлением ЫаВН₄. Избыточный глутаральдегид удаляли с помощью обессоливания на колонке в буфере РВБ. Получаемый в результате белок количественно определяли по оптической плотности при 280 нм и оценивали с помощью электрофореза в δΌδ-ПААГ в денатурирующих и не денатурирующих условиях. Определено, что большая часть очищенного рекомбинантного белка РгеР мигрирует как триммер в растворе РВБ. Увеличение температуры инкубации до 23°С требовалось для превращения большей части трехмерных белков в высокомолекулярные агрегаты, что подтверждено с помощью электрофореза в δΌδ-ПААГ.

Пример 4. 1п уйго подавление РгеР антигеном нейтрализующей активности

Полученные от добровольцев-людей сыворотки скринировали на реакционную способность против штамма А Κδν с помощью ЕЬ1БА и использовали в анализе подавления нейтрализующей активности (N1) при соответствующем разведении, основанном на предварительном титровании способности к нейтрализации Κδν, устанавливаемой для каждого образца сыворотки. Вкратце, сыворотку смешивали с белками-ингибиторами (РгеР или контрольным белком, соответствующим, по существу, химерному РС,

- 27 021393 описанному в патенте США № 5194595, названному К1хР0) в концентрации 25 мкг/мл в ИМЕМ с 50% среды 199-Н с 0,5% РВ8, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл генамицина (все от 1^йгодеп) и инкубировали в течение 1,5-2 ч при 37°С на вращающемся механизме. 20 мкл Серийных разведений сывороток и белков смешивали в планшете с 96 круглодоными лунками со штаммом А К8У, подвергнутом титрованию для оптимизации диапазона подавления для каждого образца сыворотки. Получаемые в результате смеси инкубировали в течение 20 мин при 33 °С при 5% СО₂ для поддержания рН.

Смеси сыворотка-ингибитор-вирус затем помещали в предварительно засеянные клетками Уего планшеты с 96 плоскодонными лунками и инкубировали в течение 2 ч при 33 °С перед добавлением 160 мкл питательной среды. Планшеты далее инкубировали в течение 5-6 дней при 33°С с 5% СО₂ до иммунофлуоресцентного анализа для определения титра N1. После фиксации в течение 1 ч с использованием 1% параформальдегида в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8) планшеты блокировали с использованием буфера для блокирования - 2% молока/РВ8. Козье антитело против К8У (В1обекщп Шегпайоп; 1:400) добавляли в каждую лунку без промывки и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Образцы разводили в 2 раза РВ8 и в лунки добавляли конъюгированное с Р1Т8 антитело против 1д0 козы (81дта, 1:400) в буфере для блокирования. Планшеты снова инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и промывали дважды, как указано выше, перед считыванием. Лунка считалась положительной, когда определялось >1 флуоресцентного синцития. Расчеты дозы заражения 50% культуры тканей (ТСГО50) проводили, используя способ Спирмана-Карбера (8К), и проценты N1 рассчитали следующим образом: [ (Титр N1 при 0 мкг/мл ингибитора - Титр N1 при 25 мкг/мл ингибитора)/Титр N1 при 0 мкг/мл] х 100. Приводимые в качестве примеров результаты, продемонстрированные на фиг. 3, означают, что РгеР лучше Р0 по N1 у 16/21 проверенных доноров.

Пример 5. РгеР антиген является иммуногенным

Для демонстрации иммуногенности РгеР антигена мышей иммунизировали внутримышечно дважды с двухнедельным интервалом РгеР (6,5, 3,1, 0,63, 0,13 и 0,025 мкг/мл) и ТЬ1-стимулирующим адъювантом, содержащим 3И МРЬ и 0821, из расчета 1/20 от дозы для человека (А801Е), или РгеР (1, 0,2 и 0,04 мкг/мл) и ТЬ1-стимулирующим адъювантом, содержащим 3И МРЬ и квасцы, из расчета 1/10 от дозы для человека (А804С), и сыворотку собирали спустя три недели.

Титры антигенспецифических антител 1д0 определяли в образцах объединенных сывороток с помощью ЕЫ8А в соответствии со стандартными методиками. Коротко, 96-луночные планшеты покрывали очищенным, инактивированным штаммов А К8У, штаммом В К8У и гомологичным белком РгеР и инкубировали в течение ночи при 4°С. Образцы сыворотки серийно разводили в буфере для блокирования, начиная с исходной концентрации 1:50, вместе с очищенными мышиными 1д0 (81дта, 0№) в начальной концентрации 200 нг/мл, и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Связанное антитело выявляли с использованием конъюгированных с пероксидазой хрена (НКР) антител против 1д мыши (81дта, 0№). В качестве субстрата для НКР использовали 3,3А,5,5А-тетраметилбензидин (ТМВ, ВИ 0р! Е1АТМ, ВИ Вюкшепсек, 0№). 50 мкл 1М Н₂80₄ Добавляли в каждую лунку для остановки реакции. Значения оптических плотностей для каждой лунки определяли при 450 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов Мо1еси1аг Иеэюек (Мо1еси1аг Иеэзсек, США).

Репрезентативные результаты, детализированные на фиг. 4А и 4В, показывают, что высокие титры были индуцированы против как штамма А К8У, так штамма В К8У после иммунизации РгеР антигеном.

Пример 6. РгеР индуцирует нейтрализующие антитела

Наличие и количество нейтрализующих антител определяли в образцах сывороток мышей, иммунизированных, как описано выше в примере 5. Объединенные сыворотки от иммунизированных животных серийно разводили, начиная с начального разведения 1:8, в среде для К8У в 96-луночных планшетах (20 мкл/лунку). Контрольные лунки содержали только среду для К8У или козье антитело против К8У в разведении 1:50 (Вюбекщп 1п1егпайопа1). В лунки добавляли 500-1000 инфекционных доз репрезентативного штамма А или В К8У и планшеты инкубировали в течение 20 мин при 33 °С, 5% СО₂, прежде чем смесь переносили в планшеты с 96 плоскодонными лунками, предварительно засеянными клетками Уего 1х10⁵ клеток/мл. Клетки инкубировали в течение приблизительно 2 ч при 33°С, 5% СО₂ и повторно обеспечивались питательной средой перед инкубацией в течение 5-6 дней при той же температуре. Супернатанты удаляли, планшеты промывали РВ8 и прикрепившиеся клетки фиксировали с использованием 1% параформальдегида в РВ8 в течение 1 ч с последующим непрямым иммунофлуоресцентным анализом (1РА), используя первые антитела в виде козьих антител против К8У и конъюгированные с Р1ТС антитела против 1д0 козы для выявления.

Репрезентативные результаты, детализированные на фиг. 5А и 5В соответственно, показывают, что значительное количество нейтрализующих антител против обоих штаммов К8У выявляется в сыворотках животных, иммунизированных РгеР.

- 28 021393

Пример 7. РгеР защищает от заражения К8У

Мышей иммунизировали дважды внутримышечно с двухнедельным интервалом, как описано выше, и заражали спустя три недели от второй инъекции штаммом А К8У. Защиту против К8У оценивали с помощью измерения вируса, присутствующего в легких после заражения. Вкратце, легкие иммунизированных животных асептически извлекали после эвтаназии и промывали в среде для К8У, используя 2 объема 10 мл/легкое в 15-мл пробирках. Легкие затем взвешивали и гомогенизировали по отдельности в среде для К8У с использованием автоматического гомогенизатора Ройег (ИкНег, №реап 0Ν) и центрифугировали при 2655/д в течение 2 мин при 4°С. Присутствующий в супернатантах вирус подвергали титрованию с помощью серийного разведения (восемь двойных разведений, начиная с 1:10) на монослое предварительно засеянных клеток Уего (АТСС # ССЬ-81) в 96-луночных планшетах и инкубировали в течение 6 дней. К8У выявляли с помощью непрямого 1РА после фиксации в 1% параформальдегида/РВ8, рН 7,2, используя первое антитело в виде козьих антител против К8У и второе антитело в виде меченных Р1Т8 антител против 1§0 козы.

Репрезентативные результаты, продемонстрированные на фиг. 6А и 6В, показывают, что дозы, равные или превышающие 0,04 мкг, после введения в присутствии адъюванта индуцируют сильную защиту от К8У.

Пример 8. РгеР не индуцирует привлечение эозинофилов в легкие после заражения

Для оценки способности РгеР антигена вызывать ухудшение болезни после иммунизации и последующего заражения группы мышей (5 мышей/группу) иммунизировали дважды каждую (а) 10 мкг обработанного глутаральдегидом РгеР, (Ь) 10 мкг РгеР или (с) 10 мкг Р0 без адъюванта. Мышей заражали штаммом А К8У спустя 3 недели после бустер-иммунизации, и бронхоальвеолярный лаваж (ВАР) проводили спустя 4 дня после заражения. Для каждой мыши были осуществлены подсчеты инфильтратов всех лейкоцитов при ВАР, а также дифференциальные подсчеты (300 клеток) на основе морфологии клеток: макрофагов/моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов и лимфоцитов.

Числа всех клеток умножали на различные проценты эозинофилов для каждого животного. Представлены средние геометрические для группы с 95% доверительными интервалами. Репрезентативные результаты, продемонстрированные на фиг. 7, показывают, что эозинофилы не привлекаются в легкие после иммунизации РгеР и заражения. Более того, эти результаты говорят о том, что растворимая природа РгеР антигена, по сравнению с преднамеренно агрегированной формой РгеР (в результате обработки глутаральдегидом) или Р0 антигена (природно-агрегированного), не является предпочтительной для эозинофилов.

- 29 021393

Перечень последовательностей <110> ГЛАКСОСМИТКЛАЙН БАЙОЛОДЖИКАЛС С.А.

АйДи БАЙОМБДИКАЛ КОРПОРЕЙШН ОФ КВЕБЕК БОДУ, Ги Жан Мари Фернан Пьер БЛЕ, Норман

Ро, Патрик РЮОЛЬ, Жан-Луи <120> Рекомбинантные антигены Κ5ν <130> νϋ62788-1 РСТ <150> 61/219,964 <151> 2009-06-24 <150> 61/334,568 <151> 2010-05-13 <160> 22 <170> РаСепЫп νβτβίοη 3.5 <210> 1 <211> 1697 <212> ДНК <213> респираторно-синцитиальный вирус

<400> 1 арддадррдс	саасссссаа	адсааардса	аррассасаа	рссрсасрдс	адРсасаРРР	60
дррррдсррс	рддрсаааас	аРсасРдаад	ааРРРРаРса	аРсаасаРдс	адрдсадрад	120
саааддсРаР	сссадрдсрс	рдадаасРдд	ррддрарасс	адРдРРаРаа	срарадарра	180
адрааРаеса	аддааааРаа	дсдраардда	асадаРдсРа	аддРааааРР	дарааасаад	240
ааРРадаРаа	асасааааар	дсРдРаасад	ааррдсадрр	дсРсаРдсаа	адсасссадс	300
аасааасаас	сдадссадаа	дадаасРасс	ааддрррард	ааррагасас	рсаааардсс	360
ааааааасса	аРдсаасаРР	аадсаадааа	аддаааадаа	даРРРсРРдд	ррррсдррад	420
дрдррддаСс	СдсааРсдсс	адрддсдррд	срдраРсРаа	ддРссРдсас	сРдаадддда	480
адсдаасаад	аРсаааадСд	сРсРасРаРС	сасааасаад	дсРдРадРса	дРРаРсаааР	540
ддадрсадрд	ессеаассад	сааадрдрра	дассРсаааа	асРараРада	ааасааРРдР	600
СассСаРРдР	даасаадсаа	адсРдсадса	РаРсаааРаР	адсаасРдРа	РададРРсса	660
асаааадаас	аасадассас	РададаРРас	садддааРРР	адрдрраадс	аддрдрааср	720
асассРдРаа	дсасССасаС	дРСаасРааР	адрдааРРаР	рдРсаРРаРС	ааРдаРаРдс	780
сСаРаасааа	РдаРсадааа	аадРРааРдР	ссаасааРдР	РсаааРдРРа	дасадсааад	840
ссасрсрасс	ардрссараа	Раааададда	адрсррадса	рардрдраса	аРРассасРа	900
сасддрдрра	Радасасасс	срдррддааа	сРасасасаР	сссссрардр	асаассааса	960
саааадаадд	дрссаасасс	РдРРРаасаа	даасрдасад	аддрддраср	дрдасаардс	1020
аддаСсадРа	РСРРРСРРСС	сасаадсрда	аасардрааа	дРсааРсааа	РсдадРаРРР	1080
рдрдасасаа	рдаасадррр	аасаРРасса	адрдаадРаа	асРсРдсааР	дРРдасаРаР	1140
рсаассссаа	асасдаррдс	ааааррарда	сррсааааас	дардраадса	дсрссдррар	1200
сасассРсРа	ддадссаерд	рдрсардсра	Рддсааааса	ааРдРасадс	аРссааРааа	1260
ааРсдСддаа	ссасааадас	аррррсраас	дддрдсдаРа	рдрарсааар	аааддддрдд	1320
асасРдРдРс	СдСаддСаас	асаррарарр	ардрааааад	саадааддРа	ааадРсРсРа	1380
сдрааааддс	даассаараа	РаааРРРсРа	РдасссРРад	РаРРссссРс	РдаРдааРРР	1440
даРдсаРсаа	РаРсСсаадр	саасдадаад	арраасадад	ссрадсаррр	аРРсдраааР	1500
ссдардааСР	аСРасаСааР	дРаааРдсРд	дРааРссасс	аРаааРаРса	РдаРаасРас	1560
саРаассаса	дрдаРРаРад	РааРаРРдРР	аРсРРааРРд	срдррддаср	дсРсРРаРас	1620
сдрааддсса	даадсасасс	адРсасасРа	адааадаРса	асрдадрддр	аРаааРааРа	1680
срдсасссад	РаасРаа					1697

Агд РЬе МеС Аеп Туг ТЬг Ьеи Аеп

Азп А1а Ьуз

Ьуз

ТЬг 125

Азп

Уа1

ТЬг

115

120

Ьеи

Зег

Ьуз

Агд

Ьуз

Агд

РЬе

Ьеи

СЯу

РЬе

Ьеи

С1у

Уа1

130

135

140

СЯу

Зег

А1а

Не

А1а

Зег

<31у

Уа1

А1а

Уа1

Зег

Ьуз

Уа1

Ьеи

Ηίβ

Ьеи

145

150

155

160

С1и

СЯу

<31и

Уа1

Азп

Ьуз

Не

Ьуз

Зег

А1а

Ьеи

Зег

ТЬг

Азп

Ьуз

165

170

175

А1а

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Азп

С1у

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Зег

Ьув

νβΐ

180

185

190

Ьеи

Азр

Ьеи

Ьуз

Азп

Туг

Не

Азр

Ьуз

С1п

Ьеи

Рго

Не

Уа1

Азп

195

200

205

Ьуз

СЯп

Зег

Суз

Зег

Не

Зег

Азп

Не

А1а

ТЬг

Уа1

Не

СЯи

РЬе

О1п

210

215

220

СЯп

Ьуз

Азп

Агд

Ьеи

<31и

Не

ТЬг

Агд

СЯи

РЬе

Зег

Уа1

Азп

225

230

235

240

А1а

СЯу

\Га1

ТЬг

Рго

Уа1

Зег

ТЬг

туг

МеС

ьеи

ТЬг

АЗП

Зег

О1и

245

250

255

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Азп

Азр

Мес

Рго

Не

ТЬг

АЗП

Азр

СЯп

Ьуз

260

265

270

Ьеи

Мес

Зег

Азп

Уа1

С1п

Не

Уа1

Агд

СЯп

01п

Зег

Туг

Зег

Не

275

280

285

МеС

Зег

Не

Ьуз

<31и

С1и

Уа1

Ьеи

А1а

Туг

Уа1

СЯп

Ьеи

Рго

290

295

300

Ьеи

Туг

СЯу

Уа1

Не

Азр

ТЬг

Рго

Суз

Тгр

Ьуз

Ьеи

ΗΪ3

ТЬг

Зег

Рго

305

310

315

320

Ьеи

Суз

ТЬг

АЗП

ТЬг

Ьуз

СЯи

С1у

зег

Азп

Не

Суз

Ьеи

ТЬг

Агд

325

330

335

ТЬг

Азр

Агд

СЯу

Тгр

Туг

Суз

Азр

Азп

А1а

СЯу

Зег

Уа1

Зег

РЬе

340

345

350

Рго

С1п

А1а

О1и

ТЬг

Суз

Ьуз

Уа1

<31п

Зег

Азп

Агд

Уа1

РЬе

Суз

Азр

355

360

365

ТЬг

Мес

Азп

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

С1и

Уа1

Азп

Ьеи

Суз

Азп

Уа1

370

375

380

Азр

Не

РЬе

Азп

Рго

Ьуз

Туг

Азр

Суз

Ьуз

Не

Мес

ТЬг

Зег

Ьуз

ТЬг

385

390

395

400

Азр

Уа1

Зег

Уа1

Не

ТЬг

Зег

Ьеи

С1у

А1а

Не

Уа1

Зег

Суз

405

410

415

Туг

С1у

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Азп

Ьуз

Азп

Агд

С1у

Не

420

425

430

Ьуз

ТЬг

РЬе

Зег

Азп

С1у

Суз

Азр

Туг

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

СЯу

Уа1

Азр

435

440

445

ТЬг

Уа1

Зег

Уа1

С1у

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

Уа1

Азп

Ьуз

С1п

С1и

СЯу

450

455

460

Ьуз

Зег

Ьеи

Туг

Уа1

Ьуз

<31у

<31и

Рго

Не

Азп

РЬе

Туг

Аер

Рго

465

470

475

480

ьеи

Уа1

РЬе

Рго

Зег

Азр

С1и

РЬе

Азр

А1а

Зег

Не

Зег

С1п

Уа1

Азп

485

490

495

<31и

Ьуз

Не

Азп

С1п

Зег

Ьеи

А1а

РЬе

Не

Агд

Ьуз

Зег

Азр

С1и

Ьеи

500

505

510

ьеи

НЬз

Азп

Уа1

Азп

А1а

О1у

Ьуз

Зег

ТЬг

Не

Азп

Не

Мес

Не

ТЬг

515

520

525

ТЬг

Не

Уа1

Не

Уа1

Не

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

А1а

Уа1

530

535

£40

О1у

Ьеи

Туг

Суз

Ьуз

А1а

Агд

Зег

ТЬг

Рго

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

545

550

555

560

Ьуз

Азр

О1п

Ьеи

Зег

СЯу

Не

Азп

Не

А1а

РЬе

Зег

Азп

565 570 <210> 3 <211> 897 <212> ДНК <213> респираторно-синцитиальный вирус <400> 3 аСдСссаааа асааддасса асдсассдсС аадасассад аааадасссд ддасасСсСс аассасксас сасссасабс аьсдддссса ьасаадссаа ассссааасс Ьасадсасаа аСсасаССаС ссаССсСддс ааЬдаЪааСс СсаасСЬсас ЬСаСааЬЬас адссаСсаба сссасадссс сддсааасса сааадСсаса ссаасаассд сааСсаСаса адаСдсааса адссадасса адаасасаас сссаасаСас сСсасСсадд аСссСсадсС СддааСсадс

ССсСссааСс СдСсСдаааС СасаСсасаа ассассасса СасСадсССс аасаасасса ддадссаадс сааассСдса асссасааса дссаадасса аааасасаас аасаасссаа асасаассса дсаадсссас Сасаааасаа сдссааааса аассассааа сааасссаас ааСдаССССс асССсдаадь дСССаасССС дСасссСдса дсаСаЬдсад саасааСсса асссдссддд сЪасссдсаа аадааСасса аасаааааас саддааадаа аассассасс аадссСасаа ааааассаас сССсаадаса ассаааааад аСсСсааасс ссааассасС ааассааадд аадсасссас сассаадссс асадаададс саассаСсаа сассассааа асааасасса саасСасасС дсссассаас аасассасад дааасссааа асссасаадс сааасддааа ссссссассс аасссссссс дааддсаасс саадсссссс ссаадссссс асаасаСссд адсасссасс асаасссСса Сссссассса гсасаасасд ссадсад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

897 <210> 4 <211> 298 <212> Белок <213> респираторно-синцитиальный вирус <400> 4

Мес Зег Ьуз Азп Ьуз Азр СЬп Агд ТЫ А1а Ьуз ТНг Ьеи СЬи Ьуз ТЬг

Тгр Азр ТЬг Ьеи Азп Ньз Ьеи Ьеи РЬе Не Зег Зег СЬу Ьеи Туг Ьуз

Ьеи Азп Ьеи Ьуз Зег 11е А1а СЬп ТЬе ТЬг Ьеи Зег Не Ьеи А1а МеС

11е 11е Зег ТЬг Зег Ьеи 11е Не ТЬг А1а 11е 11е РЬе Не АЬа Зег

АЬа Азп Ηίβ Ьуз УаЬ ТЬг Ьеи ТЬг ТЬг А1а 11е Не СЬп Азр АЬа ТЬг

Зег СЬп Не Ьуз Азп ТЬг ТЬг Рго ТЬг Туг Ьеи ТЬг С1п Азр Рго СЬп

Ьеи СЬу Ые Зег РЬе Зег Азп Ьеи Зег СЬи 1Ье ТЬг Зег СЬп ТЬг ТЬг 100 105 110

ТЬг Не Ьеи АЬа Зег ТЬг ТЬг Рго СЬу УаЬ Ьуз Зег Азп Ьеи СЬп Рго 115 120 125

ТЬг ТЬг УаЬ Ьуз ТЬг Ьуз Азп ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг СЬп ТЬг С1п Рго Зег 130 135 140

Ьуз Рго ТЬг ТЬг Ьуз СЬп Агд СЬп Азп Ьуз Рго Рго Азп Ьуз Рго Азп 145 150 155 160

Азп Азр РЬе Ηίε РЬе СЬи УаЬ РЬе Азп РЬе УаЬ Рго Суз Зег Не Суз 165 170 175

Зег Азп Азп Рго ТЬг Суз Тгр АЬа Не Суз Ьуз Агд 11е Рго Азп Ьуз 180 185 190

Ьуз Рго СЬу Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг ТЬг Ьуз Рго ТЬг Ьуз Ьуз Рго ТЬг РЬе 195 200 205

Ьуз ТЬг ТЬг Ьуз Ьуз Азр Ьеи Ьуз Рго СЬп тЬг ТЬг Ьуз Рго Ьуз СЬи 210 215 220

УаЬ Рго ТЬг ТЬг Ьуз Рго ТЬг СЬи СЬи Рго ТЬг 11е Азп ТЬг ТЬг Ьуз 225 230 235 240

ТЬг Азп Не ТЬг ТЬг ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг Азп Азп ТЬг ТЬг СЬу Азп Рго 245 250 255

Ьуз Ьеи ТЬг Зег СЬп МеС СЬи ТЬг РЬе ΗΪ3 Зег ТЬг Зег Зег СЬи СЬу 260 265 270

Азп Ьеи Зег Рго Зег СЬп УаЬ Зег ТЬг ТЬг Зег СЬи Ηίβ Рго Зег СЬп

Рго Зег Зег Рго Рго Азп ТЬг ТЬг Агд СЬп 290 295 <210> 5 <211> 1566 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Рекомбинантный полинуклеотид РгеР

<400> 5 аадсссдсса	ссасддадсс	дссдассссд	аааассаасд	ссаСсассдс	сассссддсс	60
дссдСдассс	сдсдссссдс	сСссесссад	аасаСсассд	аддадсСсЬа	ссадСссасс	120
сдссссдссд	СдСссааддд	сСассСдСсс	дсссхдсдда	ссддсСддса	сассСссдСд	180
аЕсассаСсд	адсСдСссаа	саСсааддаа	аасаадедса	асддсассда	сдссааддсд	240
аадссдасса	адсаддадсС	ддасаадСас	аададсдссд	СдассдаасС	ссадссдсъд	300
асдсадСсса	ссссхдссас	саасаасаад	сссссдддсс	ссссдсСддд	сдсдддсссс	360
дссассдссС	ссддсаСсдс	сдсдадсаад	дСдсбдсасс	Сддадддсда	ддСдаасаад	420
ассаададсд	сссхдсСдсс	сассаасаад	дссдСддСдС	сссСдСссаа	сддсдСдСсс	480
дСдсСдассС	ссааддСдсС	ддаСсЬдаад	аасСасаСсд	асаадсадсС	дсСдссСаСс	540
дсдаасаадс	адСссСдсСс	сасссссаас	ассдадассд	СдаСсдадСС	ссадсадаад	600
аасаассддс	СдсСддадаС	сасссдсдад	ССсСссдСда	асдссддсдС	дассассссС	660
дСдСссассС	асасдссдас	саасСссдад	ссдсСдьссс	сдаСсаасда	сасдсссасс	720
ассаасдасс	адаааааасС	даСдСссаас	аасдСдсада	СсдСдсддса	дсадЬссСас	780
адсаЬсаСда	дсаСсаСсаа	ддаададдсд	сСддссСасд	СддСдсадсС	дссСсСдСас	840
ддсдсдассд	асассссссд	сСддаадссд	сасасссссс	сссСдедсас	сассаасасс	900
ааддадддсС	ссаасасссд	сссдасссдд	ассдассддд	десддсассд	сдасаасдсс	960
ддсСссдСдС	СССССССССС	СсСддссдад	ассСдсаадд	СдсадСссаа	есдддсдссс	1020
Сдсдасасса	СдаасссссС	дассссдссС	сссдаддсда	ассСдСдсаа	саСсдасаСс	1080
СЕсаасссса	адСасдасСд	саадаСсаСд	ассадсаада	ссдасдСдСс	ссссадсдсд	1140
аСсассСссс	СдддсдссаС	сдсдСссСдс	сасддсаада	ссаадСдсас	сдссСссаас	1200
аадаассддд	дааСсаСсаа	дассССсСсс	аасддссдсд	асСасдСдСс	саасаадддс	1260
дсддасассд	сдсссдСддд	саасасасхд	сассасдсда	аСаадсадда	дддсаададс	1320
сСдсасдсда	адддсдадсс	сассассаас	сссСасдасс	ссссддсдсс	сссссссдас	1380
дадССсдасд	ссСссассад	ссаддсдаас	дадаадаСса	ассадСсссС	ддссССсаСС	1440
сддаадсссд	асдадаадсС	дсаСаасдСд	даддасаада	ссдаддадаС	сссдсссааа	1500
асссассаса	ссдадаасда	дассдсссдд	аСсаадаадс	СдаСсддсда	ддссСдаеаа	1560

СсСада 1566 <210> б <211> 514 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

с223> Рекомбинантный антиген РгеГ <400> 6

Мес О1и Ьеи Ьеи Не Ьеи Ьуз ТЬг Азп А1а 11е ТЬг А1а 11е Ьеи А1а 15 10 15

А1а Уа1 ТЬг Ьеи Суз РЬе А1а Зег Зег С1п Азп Пе ТЬг С1и С1и РЬе 20 25 30

Туг <31п Зег ТЬг Суз Зег А1а ν&1 Бег Ьуз <31у Тух Ьеи Зех А1а Ьеи 35 40 45

Агд ТЬг С1у Тгр Туг ТЬг Зег Уа1 Х1е ТЬг 11е С1и Ьеи Бег Азп Пе 50 55 60

Ьуз С1и Азп Ьуз Суз Азп С1у ТЬг Азр А1а Ьуз Уа1 Ьуз Ьеи 11е Ьуз

70 75 80

С1п С1и Ьеи Азр Ьуз Туг Ьуз 8ех А1а Уа1 ТЬг <31и Ьеи С1п Ьеи Ьеи

90 95

Мес <Э1п Зег ТЬг РГО А1а ТЬг Азп Азп Ьуз РЬе ьеи <31у РЬе Ьеи Ьеи 100 105 ПО <31у Уа1 О1у Зег А1а Пе А1а Зег С1у 11е А1а Уа1 Зег Ьуз Уа1 Ьеи 115 120 125

Нхз Ьеи С1и С1у С1и Уа1 Азп Ьуз 11е Ьуз Зег А1а Ьеи Ьеи Зег ТЬг 130 135 140

Азп Ьуз А1а Уа1 Уа1 Зег Ьеи Зег Αδη. С1у Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Зег

145 150 155 160

Ьуз Уа1 Ьеи Азр Ьеи Ьуз Азп Туг Пе Азр Ьуз <3ΐη Ьеи Ьеи Рго Пе

165 170 175

Уа1 Азп Ьуз <31п Зег Суз Зег Пе Зег Азп Пе <31и ТЬг Уа1 Пе <31и 180 185 190

РЬе С1п С1п Ьуз Азп Азп Агд Ьеи Ьеи С1и Пе ТЬг Агд С1и РЬе Зег 195 200 205

Уа1 Азп А1а 01у Уа1 ТЬг ТЬг Рхо Уа1 $ег ТЬг Туг МеС Ьеи ТЬг Азп 210 215 220

<210> 7 <211> 1855 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерная полинуклеотидная последовательность антигена РгеЕ-С <400> 7 аадсссдсса ссаСддадсС дссдаосссс аадассаасд ссаьсассдс саьсссддсс дссдсдассс сдсдссссдс ссссссссад аасассассд аададССсСа ссадсссасс сдссссдссд сдсссааддд ссасссдссс дсссСдсдда ссддссддса сасссссддд аСсассаСсд адсСдСссаа саСсааадаа аасаадСдса асддсассда сдссааддСс аадссдасса адсаддаасС ддасаадСас аададсдссд СдассдаасС ссадсСдсСд аСдсадСсса ссссСдссас саасаасаад аадСССсСдд дсССссСдсС дддсдСдддс

СссдссаСсд ссСссддсаС сдссдсдадс ааддСдссдс ассСддаддд сдаддСдаас аадассаада дсдссссдсС дсссассаас ааддссдсдд сдсссссдсс саасддсдсд

Сссдсдссда сссссааддс дсСддассСд аадаасСаса Ссдасаадса дсСдсСдссС ассдСдааса адсадсссСд ссссаСсссс аасассдада ссдСдаСсда дссссадсад аадаасаасс ддсСдсСдда даСсасссдс дадсссСссд Сдаасдссдд сдСдассасс сссдСдСсса ссСасасдсС дасааасСсс дадсСдсСсс ссссдассаа сдасаСдссс аСсассаасд ассааааааа дссдасдссс аасаасдСдс адаСсдСдсд дсадсадСсс сасадсасса сдадсассас сааддаадаа дСссСддссс асдссдСдса дсСдссСсСд

СасддсдСда Ссдасасссс ссдсСддаад сСдсасассС ссссссСдсд сассассаас ассааададд дсСссаасаС ссдсссдасс сддассдасс ддддссддса ссдсдасаас дссддсСссд сдсссссссс сссСссддсс дадассСдса аддСдсадсс саассдддсд

ССсСдсдаса ссаСдаасСс сссдассссд ссССссдадд СдаассСдСд саасаСсдас

120

180

240

300

360

420

480

0

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

- 34 021393

аРсРРсаасс	ссаадРасда	ссдсаадарс	асдассадса	адассдасдр	дрсссссадс	1140
дрдарсасср	сссРдддсдс	сарсдрдрсс	РдсРасддса	адассаадрд	сассдссРсс	1200
аасаадаасс	ддддааРсаР	саадассРРс	РссаасддсР	дсдасРасдР	дРссаараад	1260
ддсдрддаса	ссдрдрссдр	дддсаасаса	сРдРасРасд	рдааРаадса	ддааддсаад	1320
адссрдрасд	сдаадддсда	дссРаРсаРс	аасРРсРасд	асссРсСддР	дРРсссРРсс	1380
дасдадррсд	асдссРссаР	садссаддрс	аасдадаада	ссаассадсс	ссрддссСРс	1440
аРссддаадР	ссдасдадаа	дссдсаРаас	дрддаддаса	адассдаада	дасссРдСсс	1500
ааааРсРасс	асаРсдадаа	сдадаРсдсс	сддаРсаада	адсРдаРсдд	сдаддсРддс	1560
ддсрсрддсд	дсадсддсдд	сРссаадсад	сддсадааса	адссРссРаа	саадсссаас	1620
аасдасРРсс	асРРсдаддР	дррсаасррс	дСдсссрдсС	ссаРсрдсРс	саасаассср	1680
ассРдсРддд	ссаРсРдсаа	дадааСсссс	аасаадаадс	сРддсаадаа	аассассасс	1740
аадссРасса	адаадссРас	сррсаадасс	ассаадаадд	ассасаадсс	Рсадассаса	1800
аадссРаадд	аадрдссаас	сассаадсас	сассассаРс	ассасрдаРа	аРсРа	1855

<210> 8 <211> 605 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный полипептид РгеР-С <400> 8

МеР С1и Ьеи Ьеи Не Ьеи Ьуэ ТЬг Азп А1а Не ТЬг А1а Не Ьеи А1а 15 10 15

АЬа УаЬ ТЬг Ьеи Суз РЬе А1а Зег Зег СЬп Азп Ие ТЬг СЬи СЬи РЬе 20 25 30

Туг СЬп Зег ТЬг Суз Зег А1а УаЬ Зег Ьуз СЬу Туг Ьеи Зег А1а Ьеи 35 40 45

Агд ТЬг СЬу Тгр Туг ТЬг Зег УаЬ Не ТЬг Не СЬи Ьеи Зег Азп Не 50 55 60

Ьуз СЬи Азп Ьуз Суз Азп СЬу ТЬг Азр А1а Ьуз УаЬ Ьуэ Ьеи Не Ьуз 65 70 75 80

С1п СЬи Ьеи Азр Ьуз Туг Ьуз Зег АЬа УаЬ ТЬг СЬи Ьеи СЬп Ьеи Ьеи 85 90 95

Мес СЬп Зег ТЬг Рго А1а ТЬг Азп Азп Ьуз Ьуз РЬе Ьеи СЬу РЬе Ьеи 100 105 110

Ьеи СЬу УаЬ СЬу Вег АЬа Не А1а Зег СЬу Не А1а УаЬ Зег Ьуз УаЬ 115 120 125

Ьеи Ηίβ Ьеи СЬи СЬу СЬи УаЬ Азп Ьуз Пе Ьуз Зег АЬа Ьеи Ьеи Зег 130 135 140

ТЬг Азп Ьуз А1а УаЬ УаЬ Зег Ьеи Зег Азп СЬу УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг 145 150 155 160

Зег Ьуз УаЬ Ьеи Азр Ьеи Ьуз Азп Туг Пе Азр Ьуз СЬп Ьеи Ьеи Рго 165 170 175

Пе УаЬ Азп Ьуз СЬп Зег Суз Зег Пе Зег Азп Пе СЬи ТЬг УаЬ Пе 180 185 190

СЬи РЬе СЬп СЬп Ьуз Азп Азп Агд Ьеи Ьеи СЬи Пе ТЬг Агд СЬи РЬе 195 200 205

Зег УаЬ Азп АЬа СЬу УаЬ ТЬг ТЬг Рго УаЬ Зег ТЬг Туг Мер Ьеи ТЫ 210 215 220

Азп Зег СЬи Ьеи Ьеи Зег Ьеи Пе Азп Азр МеР Рго Пе ТЬг Азп Азр 225 230 235 240

С1п Ьуз Ьуз Ьеи Мер Зег Азп Азп УаЬ СЬп Пе УаЬ Агд С1п СЬп Зег 245 250 255

Туг Зег 11е МеР Зег Пе Пе Ьуз СЬи СЬи УаЬ Ьеи АЬа Туг УаЬ УаЬ 260 265 270

СЬп Ьеи Рго Ьеи Туг СЬу Уа1 Пе Азр ТЫ Рго Суз Тгр Ьуз Ьеи НЬз 275 280 285

ТЫ Зег Рго Ьеи Суз ТЬг ТЬг Азп ТЬг Ьуэ СЬи СЬу Зег Азп Пе Суз 290 295 300

Ьеи ТЫ Агд ТЫ Азр Агд СЬу Тгр Туг Суз Азр Азп АЬа СЬу Зег УаЬ 305 310 315 320

Зег РЬе РЬе Рго Ьеи АЬа СЬи ТЫ Суз Ьуз УаЬ СЬп Зег Азп Агд УаЬ 325 330 335

Ьеи

ТЬг

Не

Агд

400

Ьуэ

Ьув

РЬе

Зег

4&0

Зег

Не

61п

РЬе

А1а

560

ТЬг <210> 9 <211> 1834 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный полинуклеотид РгеГ-0 <400> 9 аадсссдсса ссаеддадсс дсьдассссс аадассаасд ссайсассдс саСссЕддсс дссдСдассс сдсдссссдс ссссссссад аасассассд аададсссса ссадСссасс

Сдссссдссд сдсссааддд ссассСдСсс дссссдсдда ссддссддСа сассСссдСд аСсассаСсд адсСдСссаа саСсааадаа аасаадСдса асддсассда сдссааддСс аадсСдаСса адсаддаасс ддасаадСас аададсдссд сдассдаасс ссадссдсСд асдсадСсса сссссдссас саасаасаад аадсссссдд дссссссдсС дддсдСдддс сссдссаъсд ссСссддсаС сдссдСдадс ааддСдсСдс ассСддаддд сдаддСдаас аадассаада дсдсссСдсс дСссассаас ааддссдСдд СдСсссСдСс саасддсдСд

СссдСдсСда ссСссааддС дссддасссд аадаасСаса ссдасаадса дссдссдссс аСсдСдааса адсадСссСд сСссаСсСсс аасаесдада ссдСдаСсда дссссадсад аадаасаасс ддссдссдда дассасссдс дадссссссд сдаасдссдд сдсдассасс сссдсдссса ссСасаСдсС дасааасСсс дадсСдсСсС сссСдаСсаа сдасасдссС ассассаасд ассааааааа дсСдаСдссс аасаасдСдс адаСсдСдсд дсадсадСсс

СасадсаСса сдадсаСсаС сааддаадаа дсссСддссС асдссдсдса дсСдссСсСд сасддсдСда ссдасасссс ССдсСддаад сСдсасассС сссссссдСд сассассаас ассааададд дссссаасас сСдссСдасс сддассдасс ддддссддса сСдсдасаас дссддссссд сдсссссссс сссСссддсс дадасссдса аддСдсадСс саассдддСд сссСдсдаса ссасдаассс ссСдасссСд ссССссдадд СдаассСдСд саасаСсдас аСсССсаасс ссаадСасда ссдсаадаСс асдассадса адассдасдс дссссссадс дСдаСсассС ссссдддсдс сассдсдссс Ьдссасддса адассаадсд сассдссссс аасаадаасс ддддаассас саадассссс сссаасддсс дсдассасдс дсссаасаад ддсдСддаса ссдсдсссдС дддсаасаса ссдсассасд сдаасаадса ддааддсаад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

- 36 021393 адссСдСасд сдаадддсда дссСассасс аассссСасд асссСсСддС дссссссссс 1380 дасдадССсд асдссСссаС садссаддсс аасдадаада СсаассадСс сссддссССс 1440 аСссддаадС ссдасдадаа дсСдсаСаас дсддаддаса адаСсдаада даСссСдСсс 1500 ааааСсСасс асаСсдадаа сдадаСсдсс сддаСсаада адсСдаСсдд сдаддссддс 1560 ддсаадсадс ддсадаасаа дссСссСаас аадсссааса асдассссса сЪСсдаддСд 1620

ССсаассссд сдссссдсСс сассСдсссс аасаасссеа сссдссдддс сасссдсаад 1680 адааСсссса асаадаадсс сддсаадааа ассассасса адсссассаа даадссСасс 1740

ССсаадасса ссаадаадда ссасаадссС садассасаа адсссаадда адсдссаасс 1800 ассаадсасс ассассасса ссасСдасаа ссса 1834 <210> 10 <211> 598 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Химерный полинуклеотид РгеГ-С <400> 10

Мес СЬи Ьеи Ьеи Не Ьеи Ьуз ТЬг Азп А1а Не ТЬг А1а Не Ьеи А1а

А1а Уа1 ТЬг Ьеи Суз РЬе А1а Зег Вег ΘΙη Азп Не ТЬг С1и С1и РЬе

Туг С1п Зег ТЬг Суз Зег А1а Уа1 Зег Ьуз О1у Туг Ьеи Зег А1а Ьеи

Агд ТЬг С1у Тгр Туг ТЬг Зег УаЬ Не ТЬг Не Θΐυ Ьеи Зег Азп Не

Ьуз О1и Азп Ьуз Суз Азп С1у ТЬг Азр А1а Ьуз Уа1 Ьуз Ьеи Не Ьуз

С1п С1и Ьеи Азр Ьуз Туг Ьуз Зег А1а УаЬ ТЬг С1и Ьеи ΘΙη Ьеи Ьеи

МеС ΘΙη Зег ТЬг Рго А1а ТЬг Азп Азп Ьув Ьуз РЬе Ьеи О1у РЬе Ьеи 100 105 110

Ьеи С1у Уа1 С1у Зег АЬа Не А1а Зег С1у Не А1а УаЬ Зег Ьуз Уа1 115 120 125

Ьеи Н15 Ьеи СЬи СЬу СЬи УаЬ Азп Ьуз Не Ьуз 5ег АЬа Ьеи Ьеи Зег 130 135 140

ТЬг Азп Ьуз А1а УаЬ Уа! Зег Ьеи Зег Азп СЬу УаЬ Зег Уа1 Ьеи ТЬг 145 150 155 160

Зег Ьуз Уа1 Ьеи Азр Ьеи Ьуз Азп Туг 11е Азр Ьуз С1п Ьеи Ьеи Рго 165 170 175

Не УаЬ Азп Ьуз СЬп Зег Суз Зег Не Зег Азп Не СЬи ТЬг Уа1 Не 180 185 190 <31и РЬе СЬп СЬп Ьуз Азп Азп Агд Ьеи Ьеи СЬи Не ТЬг Агд СЬи РЬе 195 200 205

Зег УаЬ Азп АЬа О1у Уа1 ТЬг ТЬг Рго УаЬ Зег ТЬг Туг Мес Ьеи ТЬг 210 215 220

Азп Зег СЬи Ьеи Ьеи Зег Ьеи Не Азп Азр МеЬ Рго Не ТЬг Азп. Азр 225 230 235 240

СЬп Ьуз Ьуз Ьеи Мег Зег Азп Азп УаЬ СЬп Не УаЬ Агд ОЬп Οίη Зег 245 250 255

Туг Зег Не Мес 8ег Не Не Ьуз СЬи СЬи УаЬ Ьеи А1а Туг УаЬ УаЬ

260 265 270

СЬп Ьеи Рго Ьеи Туг СЬу УаЬ Пе Азр ТЬг Рго Суз Тгр Ьуз Ьеи нЬз 275 280 285

ТЬг Зег Рго Ьеи Суз ТЬг ТЬг Азп ТЬг Ьуз С1и СЬу Зег Азп Пе Суз 290 295 300

Ьеи ТЬг Агд ТЬг Азр Агд СЬу Тгр Туг Суз Азр Азп А1а СЬу Зег УаЬ 305 310 315 320

Зег РЬе РЬе Рго ьеи АЬа СЬи ТЬг Суз Ьуз УаЬ ОЬп Бег Азп Агд УаЬ 325 330 335

РЬе Суз Азр ТЬг МеЬ Азп Зег Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег СЬи УаЬ Азп Ьеи 340 345 350

Суз Азп Не Аэр Не РЬе Азп Рго Ьуз Туг Азр Суз Ьуз Пе Мес ТЬг 355 360 365

- 37 021393

5ег Ьуз ТЬг Азр Уа1 Зег Зег Зег УаЬ Не ТЬг Зег Ьеи СЬу АЬа 11е 370 375 380

УаЬ Зег Су® Туг СЬу Ьуз ТЬг Ьуз Суз ТЬг АЬа Зег Азп Ьув Азп Агд 385 390 395 400

СЬу 11е Не Ьуз ТЬг РЬе Зег Азп СЬу Суэ Азр Туг УаЬ Зег Азп Ьуз 405 410 415

СЬу УаЬ Аар ТЬг УаЬ Зег УаЬ СЬу Аап ТЬг Ьеи Туг Туг УаЬ Азп Ьуз 420 425 430

СЬп СЬи СЬу Ьуз Зег Ьеи Туг УаЬ Ьуз СЬу СЬи Рго ЬЬе Не Аеп РЬе 435 440 445

Туг Азр Рго Ьеи УаЬ РЬе Рго ЗеГ Аер СЬи РЬе Азр АЬа Зег 1Ье Зег 450 455 460

СЬп УаЬ Аэп СЬи Ьуз 11е Азп СЬп Зег Ьеи АЬа РЬе Ые Агд Ьуз Зег 465 470 475 480

Азр СЬи Ьуз Ьеи НЬз Азп УаЬ СЬи Азр Ьуз Не СЬи СЬи Не Ьеи Зег 485 490 495

Ьуз Не Туг Нхз ЬЬе СЬи Азп СЬи ЬЬе АЬа Агд Ые Ьуз Ьуз Ьеи ЬЬе 500 505 510

СЬу СЬи АЬа СЬу С1у Ьуз СЬп Агд СЬп Азп Ьуз Рго Рго Аеп Ьуз Рго 515 520 525

Азп Азп Азр РЬе Нхз РЬе СЬи УаЬ РЬе Азп РЬе УаЬ Рго Суз бег ЬЬе 530 535 540

Суз Зег Азп Азп Рго ТЬг Суз Тгр АЬа Ые Суз Ьуз Агд Ые Рго Азп 545 550 555 560

Ьуз Ьуз Рго СЬу Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг ТЬг Ьуз Рго ТЬг Ьуз Ьуз Рго ТЬг 565 570 575

РЬе Ьуз ТЬг ТЬг Ьуз Ьуз Азр Ηΐ3 Ьуз Рго СЬп ТЬг ТЬг Ьуз Рго Ьуз 580 585 590

СЬи УаЬ Рго ТЬг ТЬг Ьув 595 <210> 11 <211> 28 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Замещенная иэолейиином ССИ4 лейциновая молния <400> 11

С1и Азр Ьуз 11е С1и С1и 11е Ьеи Зег Ьуз 11е Туг Нхз Ые 01и Аэп 15 10 15

С1и Не А1а Агд Ые Ьуз Ьуз Ьеи Ые С1у С1и А1а 20 25 <210> 12 <211> 1563 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Кодон оптимизированная нуклеотидная последовательность РгеР <400> 12

аСддадсСдс	ссассссдаа	дассаасдсс	ассассасса	сссссдссдс	сдсдасссСд	60
сдссссдсса	дсадссадаа	сассасддад	дадссссасс	ададсасдсд	садсдссдсд	120
адсаадддсС	ассЬдадсдс	дсСдсдсасд	ддсСддСаса	сдадсдСдаС	сасдаСсдад	180
сьдадсааса	ССааддадаа	саадСдсаас	ддсасддаод	едааддсдаа	дсСдаСсаад	240
саддадссдд	асаадСасаа	дадсдсддСд	асддадсСдс	адсСдссдаС	дсададсасд	300
ссддсдасда	асаасаадСС	ссссддсссс	сСдссдддсд	Сдддсадсдс	дассдсдадс	360
ддсаСсдсод	СдадсааддС	дсСдсассСд	дадддсдадд	СдаасаадаС	саадСссдсд	420
сСдсСдадса	сдаасааддс	ддссдсдадс	ссдадсаасд	дсдСдадсдС	дсСдасдадс	480
ааддсдсссд	асссдаадаа	сСасаСсдас	аадсадссдс	СдссдассдС	даасаадсад	540
адсСдсадса	СсадсаасаС	сдадассдСд	ассдадсссс	адсадаадаа	саассдссСд	600
ссддадасса	сдсдддадсс	сСссдСдаас	дсаддсдСда	сдасдсссдЬ	дСсСасдЬас	660
асдсСдасда	асадсдадсС	дсссадссСд	ассаасдаса	сдссдассас	даасдассад	720
аадаадсСда	сдадсаасаа	сдсдсадасс	дсдсдссадс	ададсСасад	сассасдадс	780
аСсаСсаадд	аддаддСдсС	ддсакасдСд	дСдсадсСдс	сдсЬдСасдд	сдСсаСсдас	840
асдсссСдсС	ддаадсСдса	еасдадсссд	сСдСдсасда	ссаасасдаа	ддадддсадс	900
аасасссдсс	сдасдсддас	ддассддддс	сддсассдсд	асаасдсддд	садсдСдадс	960
сссССсссдс	ссдсддадас	дсдсааддсд	сададсаасс	дедссссссд	сдасасдаСд	1020
аасадссСда	сдсЬдосдад	сдаддСдаас	сСдСдсааса	СсдасаСосе	сааооодаад	1080

басдасбдса	адабсабдас	дадсаадасс	дабдбсадса	деадедбдаб	сасдадссбс	1140
ддсдсдабсд	бдадсбдсба	сддсаадасд	аадбдсасдд	сдадсаасаа	даассдсддс	1200
абсабсаада	сдсссадсаа	сддсбдсдас	бабдбдадса	асаадддсдб	ддасасбдбд	1260
адсдбсддса	асасдсбдба	сбасдбдаас	аадсаддадд	дсаададссб	дбаедбдаад	1320
ддсдадссда	бсабсаасбб	сбасдасссд	сбсдбдббсс	сдадсдасда	дббсдасдсд	1380
адсабсадсс	аадбдаасда	даадабсаас	сададссбдд	сдббсабссд	саададсдас	1440
дадаадсбдс	асаасдбдда	ддасаадабс	даддадабсс	бдадсаадаб	сбассасабс	1500
дадаасдада	ссдсдсдсаб	саадаадсбд	ассддсдадд	сдсабсабса	ссабсассаС	1560

бда 1563 <210> 13 <211> 1685

<212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность РгеР с интроном
<400> 13 абддадсбдс	бдабссбдаа	аассаасдсс	абсассдсса	бссбддссдс	сдбдасссбд	60
бдсббсдссб	ссбсссадаа	сабсассдад	дадббсбасс	адбссассбд	сбссдссдбд	120
бссаадддсб	ассбдбссдс	ссбдсддасс	ддсбддбаса	ссбссдбдаб	сассабсдад	180
сбдбссааса	бсааддаааа	саадбдсаас	ддсассдасд	ссааддбдаа	дсбдабсаад	240
саддадсбдд	асаадбасаа	дадсдссдбд	ассдаасбсс	адсбдсбдаб	дсадбссасс	300
ссбдссасса	асаасаадбб	бсбдддсббс	сбдебдддед	бдддсбссдс	сабсдссбсс	360
ддсабсдссд	бдадсааддб	аедбдбеддд	асббдбдббс	сссббббббб	аабааааадб	420
бабабеббба	абдббабаба	сабабббссб	дбабдбдабс	сабдбдсбба	бдаебббдбб	480
сабсабдбдб	ббаддбдебд	сассбддадд	дсдаддбдаа	саадабсаад	адсдсссбдс	540
бдбссассаа	сааддссдбд	дбдбсссбдб	ссаасддсдб	дбеедбдебд	ассбссаадд	600
бдсбддабсб	даадаасбас	абсдасаадс	адсбдсбдсс	бабсдбдаас	аадсадбссб	660
дсбссабсбс	саасабсдад	ассдбдабсд	адббссадса	даадаасаас	сддсбдсбдд	720
адабсасссд	сдадббсбсс	дбдаасдссд	дсдбдассас	сссбдбдбсс	ассбасабдс	780
бдассаасбс	сдадсбдсбд	бсссбдабса	асдасабдсс	бабсассаас	дассадаааа	840
аасбдабдес	саасаасдбд	садабсдбдс	ддсадсадбс	сбасадсабс	абдадсабса	900
бсааддаада	ддбдсбддсс	баедбддбде	адсбдссбсб	дбаеддедбд	ассдасассс	960
еббдебддаа	дсбдсасасс	бссссссбдб	дсассассаа	сассааддад	ддсбссааса	1020
бсбдссбдас	ссддассдас	сддддсбддб	асбдсдасаа	сдссддсбсс	дбдбссббсб	1080
бсссбсбддс	сдадассбдс	ааддбдеадб	ссаассдддб	дббсбдсдас	ассабдаасб	1140
сссбдасссб	дссббссдад	дбдаассбдб	дсаасабсда	сабсббсаас	сссаадбасд	1200
асбдсаадаб	сабдассадс	аадассдасд	бдбссбссад	сдбдабсасс	бсссбдддсд	1260
ссабсдбдбс	сбдсбасддс	аадассаадб	дсассдссбс	саасаадаас	сддддаабса	1320
бсаадассбб	сбссаасддс	бдсдасбасд	бдбссаабаа	дддсдбддас	ассдбдбссд	1380
бдддсаасас	асбдбасбас	дбдаабаадс	аддадддсаа	дадссбдбас	дбдаадддсд	1440
адссбабсаб	саасббсбас	дасссбсбдд	бдббсссббс	сдасдадббс	дасдссбсса	1500
бсадссаддб	даасдадаад	абсаассадб	сссбддссбб	сабссддаад	бссдасдада	1560
адсбдсабаа	сдбддаддас	аадабедадд	адабссбдбс	саааабсбас	сасабсдада	1620
асдадабсдс	ссддабсаад	аадсбдабсд	дсдаддссдд	аддбсассас	сассабсасс	1680

асбда 1685 <210> 14 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид синтетического линкера <400> 14

С1у С1у Зег С1у <31у Зег С1у С1у Зег

5 <210> 15 <211> 4 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Консенсусный повтор сайта отщепления фурином <400> 15

Агд А1а Агд Агд <210> 16 <211> 4 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

- 39 021393 <223> Консенсусный повтор сайта отщепления фурином <400> 16

Агд Ьуз Агд Агд <210» 17 <211» 1542 <212> ДНК <213» Искусственная последовательность <220» <223> Синтетический полинуклеотид РгеР <400» 17

аСддадсСдс	ЬдаСссСдаа	аассаасдсс	аЬсассдсса	СссСддссдс	сдСдасссСд	60
СдсССсдссЬ	ссСсссадаа	саСсассдад	дадССсЬасС	адСссассьд	сЬссдседьд	120
сссаадддсс	ассСдсссдс	сссдсддасс	ддссддьаса	ссьссдьдаь	сассаьсдад	190
сСдСсоааса	Ссааддаааа	саадсдсаас	ддсассдасд	осааддьдаа	дссдассаад	240
саддадседд	асаадсасаа	дадсдссдСд	ассдаасЬсс	адсСдсЬдаС	дсадСссасс	300
ссСдссасса	асаасаадСС	СсСдддсССс	сЬдсСдддсд	ЬдддсСссдс	саСсдссЬсс	360
ддсаСсдссд	ьдадсааддс	дссдсасссд	дадддсдадд	ьдаасаадас	саададсдсс	420
сьдссдссса	ссаасааддс	сдсддсдссс	сьдьссаасд	дсдьдьссдс	дсСдассЬсс	430
ааддсдсСдд	асссдаадаа	сьасассдас	аадсадссдс	сдссСаЬсдс	даасаадсад	540
СссСдсссса	СсСссаасас	сдадассдСд	аьсдадьссс	адсадаадаа	саассддсьд	600
сСддадаСса	сссдсдадСС	сСссдСдаас	дссддсдЬда	ссассссСдС	дЬссассЬас	660
асдссдаоса	ассссдадос	дсьдсссссд	аЬсаасдаса	ЬдссЬаЬсас	саасдаооад	720
аааааассда	СдСссаасаа	сдСдсадаСс	дьдсддсадс	адСссСасад	саСсасдадс	790
асоассаадд	аададдрдсС	ддсссасдод	дрдсадсСдс	сьссдсасдд	сдСдассдас	840
ассосссдсс	ддаадсСдса	сассСссссс	сЬдСдсасса	ссаасассаа	ддадддсЬсс	900
аасаСсСдсс	Сдасссддас	сдассддддс	СддСасЬдсд	асаасдссдд	сЬссдсдЬсс	960

СЛССОсссОС ьддссдадас сЬдсааддОд садОссаасс дддОдОЬсЬд сдасассаОд аасссссьда есссдссссс сдаддодаас сьдодсааса ъсдасаессе саассссаад

Сасдаседса адабсаЬдас садсаадасс дасдрдЪссС ссадсдЬдаО сассрсссрд ддсдссаОсд ЬдЬссРдсСа сддсаадасс аадСдсассд ссоссаасаа даассдддда аСсаСсаада ссООсьссаа сддсодсдас СасдСдесса асаадддсдс ддасассдСд

ОссдОдддса асасассдОа сЬасдОдааС аадсаддадд дсаададссс дСасдСдаад ддсдадссЬа ссаЬсаасЬС ссасдасссс ссддСдССсс сссассадсс аддсдаасда даадассаас дддасссСдд дадаадсСдс аСаасдедда ддасаадаСс даддадаСсс дадаасдада СсдсссддаС саадаадсСд аСсддсдадд

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1542 сссссдасда дССсдасдсс ссССсаСссд даадСссдас сдЬссааааС сСассасаСс сс <210» 18 <211» 514 <212» Белок <213» Искусственная последовательность полипептид РгеР <400» 18

Мес С1и Ьеи Ьеи Не Ьеи Ьуз ТЬг А8П А1а Не ТЬг А1а Не Ьеи А1а

А1а Уа1 ТЬг Ьеи Суз РЬе А1а Зег Зег С1п Азп Не ТЬг О1и <31и РЬе

Агд ТЬг С1у Тгр Туг ТЬг Зег Уа1 Не ТЬг Не <31и Ьеи Зег Азп Не

С1п С1и Ьеи Азр Ьуз Ту^г Ьуз Зег А1а Уа! ТЬг <51и Ьеи С1п Ьеи Ьеи

Шз Ьеи <31и С1у С1и Уа1 Авп Ьуз Не Ьуз Зег А1а Ьеи Ьеи Зег ТЬг 130 135 140

Ьуз Уа1 Ьеи Азр Ьеи Ьуэ Азп Туг Не Азр Ьуз С1п Ьеи Ьеи Рго Не 165 170 175

- 40 021393

О1и

Зег

А8П

Οίη

240

Туг

Οίη

ТЬг

Ьеи

Зег

320

РЬе

Суе

Зег νβΐ

С1у

400

О1у <210> 19 <211? 1542 <212? ДНК <213? Искусственная последовательность <220?

<223> Синтетический полинуклеотид РгеР <400? 19 асддадссдс сдасссСдаа аассаасдсс аЬсассдсса Сссьддссдс сдсдасссСд 60

ЬдсЪЪсдссС ссЬсссадаа саЬсассдад дадЬЬсЬасс адЬссассЬд сЬссдссдЬд 120 иссаадддсС ассС-дСссдс сссдсддасс ддсСддСаса сссссдСдае сассассдад 180 ссдСссааса ссааддаааа саадЬдсаас ддсассдасд ссааддсдаа дссдассаад 240

саддадсСдд	асаадСасаа	дадсдссдСд	ассдаасСсс	адсСдсСдаС	дсадСссасс	300
сссдссасса	асаасаадСС	сссдддсссс	ссдсадддсд	СдддсСссдс	саесдссСсс	360
ддсаСсдссд	сдадсааддс	дссдсасссд	дадддсдадд	сдаасаадас	саададсдсс	420
ссдссдссса	ссаасааддс	сдСддСдСсс	сСдСссаасд	дсдСдСссдС	дсСдассСсс	480
ааддсдсСдд	асссдаадаа	ссасассдас	аадсадссдс	сдсссассдс	даасаадсад	540
СссСдсСсса	СсСссаасаС	сдадассдСд	аСсдадССсс	адсадаадаа	саассддсСд	600
сСддадаСса	сссдсдадьс	ссссдСдаас	дссддсдСда	ссассссСдС	дСссассСас	660
аСдссдасса	асСссдадсС	дссдсссссд	ассаасдаса	сдссСаСсас	саасдассад	720

аааааассда	сдсссаасаа	сдсдсадасс	дьдсддсадс	адссссасад	сассасдадс	780
ассассаадд	аададдсдес	ддсссасдсд	дсдсадссдс	ссссдсасдд	сдсдаСсдас	¢40
ассссссдсс	ддаадсСдса	сассСссссс	сЬдСдсасса	ссаасассаа	ддадддсСсс	900
аасаЬсСдсс	Сдассоддас	сдассддддс	сддсассдсд	асаасдссдд	ссссдсдссс	960
СССССССССС	сддссдадас	сСдсааддсд	садсссаасс	дддсдссссд	сдасассасд	1020
аасСссссда	ссссдссссс	сдаддсдаас	ссдсдсааса	ьсдасасссс	саассссаад	1080
СасдасСдса	адассаСдас	садсаадасс	дасдСдСссС	ссадсдСдаС	сасссссссд	1140
ддсдссассд	СдСссСдсса	сддсаадасс	аадСдсассд	ссСссаасаа	даассдддда	1200
абсаСсаада	ссССсСссаа	сддсСдсдас	СасдСдСсса	аСаадддсдС	ддасассдСд	1260
Сссдсдддса	асасассдса	есасдсдаас	аадсаддадд	дсаададссС	дСасдСдаад	1320
ддсдадссСа	ссассаассс	сСасдасссс	ссддсдССсс	сССссдасда	дсссдасдсс	1380
СссаСсадсс	аддСдаасда	даадаСсаас	садЬсссСдд	ссССсаСссд	даадСссдас	1440
дадаадсСдс	аСаасдСдда	ддасаадаСс	даддадаССС	сдсссаааас	сбассасасс	1500
дадаасдада	ссдсссддас	саадаадссд	ассддсдадд	сс		1542

<210? 20 <211? 514 <212? Белок <213? Искусственная последовательность <220>

<223? Синтетический полипептид РгеГ

Мес С1и Ьеи Ьеи Не Ьеи Ьуе ТЬг Аеп А1а 11е ТЬг А1а 11е Ьеи А1а 15 10 15

А1а Уа1 ТЬг Ьеи Суз РЬе А1а Зег Зег С1п Азп Не ТЬг С1и С1и РЬе

Туг 01п Зег ТЬг Суз Зег А1а Уа1 Зег Ьуз <31у Туг Ьеи Зег А1а ьеи 35 40 45

Агд ТЬг С1у Тгр Туг ТЬг Зег Уа1 11е ТЬг 11е С1и Ьеи Зег Азп Не

Ьуз С1и Азп Ьуз Суз Азп С1у ТЬг Азр А1а Ьуз Уа1 Ьуз Ьеи Не Ьуз

О1п С1и Ьеи Авр Ьуз Туг Ьув 5ег А1а Уа1 ТЬг С1и Ьеи <31п Ьеи Ьеи

Меб <31п Зег ТЬг Рго А1а ТЬг Авп. Авп Ьув РЬе Ьеи С1у РЬе Ьеи О1п 100 105 110

О1у Уа1 О1у Зег А1а Не А1а Зег С1у Ые А1а Уа1 Зег Ьув Уа1 Ьеи 115 120 125

Ηίβ Ьеи С31и С1у С1и Уа1 Авп Ьуз 11е Ьув Зег А1а Ьеи Ьеи Бег ТЬг 130 135 140

Авп Ьуз А1а Уа1 Уа1 Зег Ьеи Зег Авп О1у Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬх Зег 145 150 155 160

Ьуз Уа1 Ьеи Авр Ьеи Ьуз Азп Туг Ые Азр Ьуз О1п Ьеи Ьеи Рго 11е 165 170 175

РЬе Οίη <31п Ьуз Азп Азп Агд Ьеи Ьеи С1и Ые ТЬг Агд С1и РЬе Зег 195 200 205

Ьуз Ьув Ьеи Меб Зег Авп Авп Уа1 С31п Ые \Га1 Агд <31п С1п Зег Туг 245 250 255

Ьеи Рго Ьеи Туг <31у Уа1 Ые Азр ТЬг Рго Суз Тгр Ьуз Ьеи Ηίβ ТЬг 275 280 285

ТЬг Агд ТЬг Азр Агд <31у Тгр Туг Сув Азр Азп А1а С1у Зег Уа1 Зег 305 310 315 320

- 42 021393

РЬе РЬе	Рго	Ьеи А1а СЬи ТЬг Суз Ьуз УаЬ СЬп Зег Азп Агд Уа1 РЬе
325	330	335
Суз Азр	ТЬг	МеД Азп Зег 340	Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег 345	СЬи УаЬ Азп Ьеи Суз 350
Азп Не	Азр 355	I1е РЬе Азп	Рго Ьуз Туг Аер Суз 360	Ьуз Пе МеД ТЬг Зег 365
Ьуз ТЬг 370	Азр	УаЬ Зег Зег	Зег УаЬ Пе ТЬг Зег 375	Ьеи СЬу АЬа Пе УаЬ 380
Зег Суз 385	Туг	СЬу Ьуз ТЬг 390	Ьуз Суз ТЬг АЬа Зег 395	Азп Ьуз Азп Агд СЬу 400
Пе 11е	Ьуз	ТЬг РЬе Зег 405	Азп СЬу Сув Азр Туг 410	УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу 415
УаЬ Азр	ТЬг	УаЬ Зег УаЬ 420	<31у Азп ТЬг Ьеи Туг 425	Туг УаЬ Азп Ьуз СЬп 430
СЬи СЬу	Ьуз 435	Зег Ьеи Туг	Уа1 Ьуз СЬу СЬи Рго 440	11е Пе Азп РЬе Туг 445
Азр Рго 450	Ьеи	Уа1 РЬе Рго	Зег Азр СЬи РЬе Азр 455	АЬа Зег Пе Зег СЬп 460
Уа1 Азп 465	СЬи	Ьуз Пе Азп 470	<31п Зег Ьеи АЬа РЬе 475	Пе Агд Ьуз Зег Азр 480
С1и Ьуз	Ьеи	Нхз Азп УаЬ 485	СЬи Азр Ьуз Пе СЬи 490	СЬи 11е Ьеи Зег Ьуз 495
Г1е Туг Нхз 11е С1и Азп СЬи 11е А1а Агд Пе 500 505 СЬи А1а <210> 21 <211> 1542 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Синтетический полинуклеотид РгеР	Ьуз Ьуз Ьеи 11е СЬу 510

<400> 21

адддадсддс	ддадссбдаа	аассаасдсс	адсассдсса	ДссДддссдс	сдддасссдд	60
ддсдссдссс	ссдсссадаа	саДсассдад	дадДДсДасс	адДссасссд	сдссдссддд	120
ДссаадддсД	ассДдДссдс	сседсддасс	ддсДддДаса	сссссдддад	сассадсдад	180
сДдДссааса	Дсааддаааа	саадсдсаас	ддсассдасд	ссааддДдаа	дсДдадсаад	240
саддадсддд	асааддасаа	дадсдссдДд	ассдаасСсс	адсддсддад	дсадбссасс	300
ссДдссасса	асаасаадДД	дсддддсддс	сддсадддсд	ДдддсДссдс	сабсдссдсс	360
ддсассдссд	ддадсааддД	дсддсассдд	дадддсдадд	ДдаасаадаД	саададсдсс	420
сДдсДдСсса	ссаасааддс	сдДддДдДсс	сДддссаасд	дсдСдДссдД	дсддассДсс	480
ааддбдсддд	адсддаадаа	сдасадсдас	аадсадсДдс	ддссдадсдд	даасаадсад	540
дссДдсДсса	ДсДссаасаД	сдадассдДд	аДсдадДДсс	адсадаадаа	саассддсДд	600
сДддадаДса	сссдсдаддд	сДссдддаас	дссддсдДда	ссассссддс	ддссассдас	660
асдсддасса	асСссдадсд	дсДдссссДд	адсаасдаса	ДдссдаДсас	саасдассад	720
аааааасДда	дддссаасаа	сдедсадаДс	дДдсддсадс	г.дсссдасад	саДсаДдадс	780
аДсаДсаадд	аададдДдсД	ддссДасдДд	дДдсадсДдс	сдсдддасдд	едДдаесдас	840
асесссддоД	ддаадсддса	сасссссссс	сДдДдсасса	ссаасассаа	ддадддсДсс	900
аасадсддсс	Ддасссддас	сдассддддс	ЬддДасДдсд	асаасдссдд	сДссддддсе	960
ддссдсссдс	дддссдадае	сДдсааддсд	саддссаасс	дддддддсДд	сдасассадд	1020
аасДсссДда	сссДдссДДс	сдаддДдаас	сДдДдсааса	ДсдасаДсДД	саассссаад	1080
ДасдасДдса	адаДсаДдас	садсаадасс	дасдДдДссД	ссадсдДдаД	сассЬсссДд	1140
ддсдссаДсд	ДдДссддсДа	сддсаадасс	аадддсассд	ссдссаасаа	даассдддда	1200
аДсаДсаада	ссДДсДссаа	сддсСдсдас	ДасдДдДсса	аДаадддсдД	ддасассдДд	1260
дссдДдддса	асасасддДа	сДасдддаад	аадсаддадд	дсаададссд	ддасдддаад	1320
ддсдадссДа	ДсаДсаасдД	сДасдасссД	сДддДдДДсе	сЬДссдасда	дддсдасдсс	1330
дссаДсадсс	аддДдаасда	даадаДсаас	дддасссДдд	ссДДсаДссд	даадДссдас	1440
дадаадсДдс	аДаасдДдда	ддасаадаДс	даддадаДсс	ДдДссааааД	сДассасаДс	1500
дадаасдада	ДсдсссддаД	саадаадсдд	аДсддсдадд	сс		1542

<210> 22 <211> 514 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический полипептид РгеР

Ьуз Ьуз Ьеи Мее Зег Аэп Азп Уа1 С1п Не Уа1 Агд С1п <31п Зег Туг 245 250 255 ег Не Мее Зег 11е Не Ьуз СХи С1и Уа1 Ьеи А1а Туг Уа! Уа1 СХп 280 265 270

Ьеи Рго Ьеи Туг <31у Уа! Не Азр ТЬг Рго Суз Тгр Ьуз Ьеи Нхэ ТЬг 275 280 285

Зег Рго Ьеи Суз ТЬг ТЬг Азп ТЬг Ьуз СХи О1у Зег Азп Не Суз Ьеи 290 295 300

ТЬг Агд ТЬг Азр Агд СХу Тгр Туг Суз Азр Азп А1а СХу Зег Уа1 Зег 305 310 315 320

РЬе РЬе Рго Ьеи А1а СХи ТЬг Суз Ьуз Уа1 СЬп Зег Азп Агд Уа1 РЬе 325 330 335

Суз Азр ТЬг Мее Азп Зег Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег СЯи Уа1 Азп Ьеи Суз 340 345 350

Азп Не Азр Не РЬе Азп Рго Ьуз Туг Азр Суз Ьуз Не МеС ТЬг Зег 355 360 365

Ьуз ТЬг Азр Уа1 Зег Зег 5ег Уа1 Не ТЬг Зег Ьеи СХу АХа Пе Уа1 370 375 380

Зег Суз Туг СХу Ьуз ТЬг Ьуз Суз ТЬг А1а Зег Азп Ьуз Азп Агд СХу 385 390 395 400

Не Не Ьуз ТЬг РЬе Зег Азп <31у Суз Азр Туг Уа1 Зег Азп Ьуз С1у 405 410 415

УаХ Азр ТЬг УаХ Зег Уа1 СХу Азп ТЬг Ьеи Туг Туг УаХ Азп Ьуз СХп 420 425 430

С1и СХу Ьуз Зег Ьеи Туг Уа1 Ьуз СХу СЛи Рго Не Не Азп РЬе Туг 435 440 445

Азр Рго Ьеи УаХ РЬе Рго Зег Азр СЛи РЬе Азр А1а Зег Не Зег О1п 450 455 460

УаХ Азп С1и Ьуз Не Азп СЛу ТЬг Ьеи А1а РЬе Не Агд Ьуз Зег Азр 465 470 475 480

С1и Ьуз Ьеи ΗΪ3 Азп Уа1 С1и Азр Ьуз Не С1и С1и 11е Ьеи Зег Ьуз 485 490 495

11е Туг Ηίβ Не О1и Азп <31и 11е А1а Агд 11е Ьуз Ьуз Ьеи 11е О1у 500 505 510

О1и А1а

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантный антиген респираторно-синцитиального вируса (КБУ), содержащий полипептид, который содержит Р₂-домен белка Р К5У, содержащий полипептидную последовательность, соответствующую аминокислотам 26-105 ссылочного полипептида-предшественника (Р₀) белка Р с последовательностью 5ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, соединенный с Р^доменом белка Р К8У, содержащим полипептидную последовательность, соответствующую аминокислотам 137-516 ссылочного полипептида-предшественника (Р₀) белка Р с последовательностью 5ЕО ГО ΝΟ: 2, где между Р₂-доменом и Р^доменом нет сайта расщепления фурином и где рекомбинантный антиген К8У дополнительно содержит гетерологичный домен тримеризации, находящийся на С-конце Р^домена, где антиген стабилизирован в конформации белка Р К8У до его слияния с клеткой-хозяином.
2. Рекомбинантный антиген К8У по п.1, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

a) полипептида, содержащего 8ЕО ГО ΝΟ: 6;

b) полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, содержащей полинуклеотидную последовательность 5ЕО ГО ΝΟ: 5, или нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в жестких условиях, по существу, по всей длине с нуклеиновой кислотой, содержащей полинуклеотидную последовательность 8ЕГ) ГО ΝΟ: 5; и

c) полипептида с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной 5ЕО ГО ΝΟ: 6.
3. Рекомбинантный антиген К5У по п.1 или 2, дополнительно содержащий сигнальный пептид.
4. Рекомбинантный антиген К5У по любому из пп.1-3, в котором гетерологичный домен тримеризации содержит биспиральный домен.
5. Рекомбинантный антиген К5У по п.4, в котором гетерологичный домен тримеризации содержит изолейциновую молнию.
6. Рекомбинантный антиген К5У по п.5, который содержит тример полипептидов.
7. Иммуногенная композиция, содержащая эффективное количество рекомбинантного антигена К8У по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, где иммуногенная композиция снижает или предотвращает инфекцию, вызванную респираторно-синцитиальным вирусом (К8У).
8. Иммуногенная композиция по п.7, в которой носитель или эксципиент содержат буфер.
9. Иммуногенная композиция по п.8, дополнительно содержащая адъювант.
10. Иммуногенная композиция по любому из пп.7-9, в которой адъювант выбран из группы, состоящей из 30-МРБ, Οδ21, эмульсии типа масло-в-воде, квасцов или комбинации указанного.
11. Иммуногенная композиция по любому из пп.7-10, дополнительно содержащая по меньшей мере один дополнительный антиген патогенного организма, отличного от К8У, где патогенным организмом является вирус или бактерия, которая инфицирует респираторный тракт.
12. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующая рекомбинантный антиген К5У по любому из пп.1-6.
13. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.12, в которой полинуклеотидная последовательность, которая кодирует антиген К8У, оптимизирована в отношении кодонов для экспрессии в выбранной клетке-хозяине.
14. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.12 или 13.
15. Применение антигена К8У по любому из пп.1-6 для получения лекарственного средства для применения в лечении К8У инфекции.
16. Применение антигена К8У по п.15 в профилактическом лечении К8У инфекции.
17. Иммуногенная композиция по любому из пп.7-10 для профилактики или лечения связанных с К8У заболеваний.