UA123584C2 - Імуноглобулін з одним варіабельним доменом проти f-білка pcb - Google Patents
Імуноглобулін з одним варіабельним доменом проти f-білка pcb Download PDFInfo
- Publication number
- UA123584C2 UA123584C2 UAA201800478A UAA201800478A UA123584C2 UA 123584 C2 UA123584 C2 UA 123584C2 UA A201800478 A UAA201800478 A UA A201800478A UA A201800478 A UAA201800478 A UA A201800478A UA 123584 C2 UA123584 C2 UA 123584C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- rsv
- protein
- sam1
- fusion
- binding
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 21
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims abstract description 147
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 76
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 70
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 68
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 24
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 101150060303 SOK2 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims 2
- RGHMISIYKIHAJW-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxymandelic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 RGHMISIYKIHAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 244000005894 Albizia lebbeck Species 0.000 claims 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 claims 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 claims 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 claims 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 claims 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims 1
- 241000767301 Gaussia attenuata Species 0.000 claims 1
- 102100029054 Homeobox protein notochord Human genes 0.000 claims 1
- 101000634521 Homo sapiens Homeobox protein notochord Proteins 0.000 claims 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 claims 1
- 101000731004 Rattus norvegicus Membrane-associated progesterone receptor component 1 Proteins 0.000 claims 1
- 241000159610 Roya <green alga> Species 0.000 claims 1
- 241001627203 Vema Species 0.000 claims 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims 1
- WWVKQTNONPWVEL-UHFFFAOYSA-N caffeic acid phenethyl ester Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C=CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 WWVKQTNONPWVEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 claims 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 claims 1
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SWUARLUWKZWEBQ-UHFFFAOYSA-N phenylethyl ester of caffeic acid Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C=CC(=O)OCCC1=CC=CC=C1 SWUARLUWKZWEBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 79
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 79
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 18
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 18
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 9
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 229960001521 motavizumab Drugs 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 3
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229940072673 ismo Drugs 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N isosorbide mononitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@@H](O)CO[C@@H]21 YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100184477 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) MNN2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101150042047 MNN5 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101100018424 Mus musculus Ids gene Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101000628693 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase 25 Proteins 0.000 description 1
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712890 Junin mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000271569 Rhea Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100026737 Serine/threonine-protein kinase 25 Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000012883 Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 14 Human genes 0.000 description 1
- 108010065158 Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 14 Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 101150094313 XPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940124389 anti-rsv drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- -1 that is Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
(54) ІМУНОГЛОБУЛІН З ОДНИМ ВАРІАБЕЛЬНИМ ДОМЕНОМ ПРОТИ ЕБ-БІЛКА РСВ (57) Реферат:
Винахід належить до імуноглобуліну з одним варіабельним доменом (ІЗМО), які зв'язуються з формою "до злиття" білка злиття (ЕР) РСВ, до застосування цих ІЗМО для профілактики і/або лікування інфекцій РСВ і до фармацевтичних композицій, що містять ці ІЗМО.
Галузь винаходу
Даний винахід належить до імуноглобулінів з одним варіабельним доменом (ІЗМО), які спрямовані проти респіраторно-синцитіального вірусу (РСВ). Більш конкретно, винахід належить до ІЗМО, які зв'язуються з формою "до злиття" білка злиття (Б) РСВ. Винахід додатково належить до застосування цих ІЗМО для профілактики і/або лікування інфекцій РСВ і до фармацевтичних композицій, що містять ці І5МО.
Рівень техніки
Респіраторно-синцитіальний вірус є найбільш важливою причиною гострих інфекцій дихальних шляхів у дітей грудного віку і дітей молодшого віку. До дворічного віку практично всі діти перенесуть щонайменше одну інфекцію, пов'язану з респіраторно-синцитіальним вірусом.
Хоча, як правило, інфекція РСВ викликає тільки легке захворювання, у частини пацієнтів (1-2 95) вона призводить до серйозного бронхіоліту з необхідністю госпіталізації. За оцінками, щороку 160000 дітей вмирають через інфекцію РСВ. У цей час немає клінічних досліджень ефективної профілактичної вакцини і терапевтичної низькомолекулярної сполуки, специфічної для РСВ.
Єдиний спосіб, за допомогою якого грудні діти з високим ризиком можуть бути частково захищені від важкого захворювання, викликаного інфекцією РСВ, що припускається, - це щомісячні ін'єкції гуманізованого мишиного моноклонального антитіла, спрямованого проти конформації Е-білка РСВ до і після злиття (палівізумабу). Однак лікування цим антитілом є дорогим і використовується тільки з метою профілактики. Розробляються декілька інших засобів, що зв'язуються з Е-білююм РСВ, включаючи специфічні моноклональні антитіла для форми "до злиття" (Сіїтапвз еї аї., 2015; Мо еДап еї аї., 2013), і ІЗМО, що зв'язуються з Е-білком
РСВ. Однак, описані ІЗМО мають слабку нейтралізуючу активність проти серотипу В РСВ, і/або необхідно полівалентне форматування для того щоб зробити ІЗМО сильним (М/О2009147248;
МО2010139808; МО2011064382; 5сперепз єї аі., 2011; Ниїбего евї а!., 2011).
Нещодавно було показано, що стандартні антитіла, які специфічно зв'язуються з конформацією "до злиття" Е-білка РСВ, є набагато більш сильними нейтралізаторами РУСВ іп міїго, ніж антитіла, які зв'язуються з обома конформаціями Е-білка, "до злиття" і "після злиття" (М О2008147196, О052012070446, Мсі еїПап еї аї., 2013). Однак стандартні антитіла можуть бути обтяжливими для виробництва, і їх стабільність може бути обмеженою. Крім того, через
Зо відносно великий розмір стандартні антитіла можуть зазнавати просторових труднощів з розпізнаванням свого епітопу в складних зразках або коли інші антитіла і ліганди займають ділянки поблизу їх епітопів.
Тому, і оскільки відсутнє універсальне лікування, існує незадоволена потреба у потужному лікарському засобі проти РСВ, який можна використовувати для ефективного лікування і/або профілактики інфекцій РСВ.
Суть
В даному винаході несподівано показано, що моновалентні ІЄМО можуть мати сильну нейтралізуючу активність проти обох серотипів РСВ (А і В). Це несподівано, оскільки літературні дані дозволяють припустити, що для потужного інгібування обох серотипів РСВ необхідні полівалентні конструкції. Таким чином, метою винаходу є створення ІЗМО, спрямованих проти епітопів Е-білка РСВ, які є специфічними для конформації "до злиття", і, таким чином, створення високоактивних ІЗМО для лікування і/або профілактики інфекцій РСВ.
Аспектом даного винаходу є створення ІЗМО, який специфічно зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РСВ і відрізняється тим, що вказаний ІЗМО у моновалентному форматі показує подібну нейтралізуючу активність для серотипів А і В РСВ.
В одному з варіантів здійснення винахід передбачає І5МО, який містить послідовність СОМ, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 1 і ЗЕО ІЮ МО: 2, послідовність СОК2, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: З і БЕО ІЮ МО: 4 послідовність СОКЗ, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 5 і 5ЕО ІО МО: 6, і де СОК1, СОВ2 і/або СОРЗ мають відмінність по
БО одній, двом або трьом амінокислотам з будь-якої з вищевказаних відповідних ЗЕО ІЮ МО.
По іншому аспекту, винахід також належить до РСВ-зв'язувальної конструкції, яка містить щонайменше один ІЗМО, описаний вище.
По іншому аспекту, винахід передбачає нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше один
ІЗМО, описаний вище.
Згідно з ще одним аспектом, даний винахід належить до клітини-хазяїна, яка трансформована або трансфікована нуклеїновою кислотою, описаною вище. Також винахід передбачає застосування вищеописаної клітини-хазяїна для одержання ІЗМО, описаного вище.
Також винахід передбачає вищеописаний ІЗМО або вищеописану РСВ-зв'язувальну конструкцію для застосування як лікарський засіб, зокрема, для застосування для бо терапевтичного лікування або профілактики інфекції РСВ.
По іншому аспекту, винахід передбачає фармацевтичну композицію, яка містить щонайменше один вищеописаний ІЗМО. Додатково винахід передбачає застосування вказаної фармацевтичної композиції як лікарський засіб, зокрема, для терапевтичного лікування або профілактики інфекції РСВ.
Цілі за даним винаходом будуть зрозумілі з наступного опису.
Короткий опис креслень
Фігура 1: Нейтралізуюча активність у плазмі лами, імунізованої О5-Сам1. Нейтралізуючу активність проти РСВ А?2 (А) і РСОВ В49 (В) тестували в плазмі, одержаної після різних імунізацій ре-Самі. Моношари клітин Мего, посіяних на 96-ямкові планшети, були інфіковані РСВ А2 або
РСВ В49 у присутності плазми лами, яку розводили у три рази, як вказано на осі Х, починаючи з восьмикратного розведення. Число бляшок в кожній ямці було підраховано і позначено на осі У.
Ргер5-Сам! відповідає неімунній сироватці імунізованої лами.
Фігура 2: Відбір УНН, які зв'язуються з очищеним рекомбінантним білком злиття РСВ (Р).
Планшети для ЕГІЗА покривали ЮО5-Сам! (сірі стовпчики, Е "до злиття"), Е "після злиття" (чорні стовпчики) або В5А. Планшети інкубували з екстрактами периплазматичного простору бактерій, приготовленими з клітин ТО1 Е. Соїї, трансформованих РНЕМ4-УНН, які були одержані після одного раунду "пенінгу" проти 05-Сам! з МНН-експонуючою фаговою бібліотекою, одержаною з
РВМС від О5-Сам1-імунізованої лами. На графіку, зв'язування Е-білка показано як Іод2 співвідношення значень 00450 більше зв'язування з ВА.
Фігура 3: Виявлення нейтралізуючої активності відносно РСВ у супернатантах Ріспіа разіогіз. Трансформанти рКаїб1-МНН Р. равіогі5 попередньо культивували в 2 мл середовища
УРМО в 24-ямковому форматі протягом 24 годин. Потім, клітини поміщали в середовище УРММ протягом 48 годин для індукції експресії МНН. Тестували розведення 1:60, 1:600 ї 1:6000 очищеного культурального супернатанту на нейтралізуючу активність шляхом змішування з
РСВ А2 (30 БУО/ямку), який використовували для зараження моношару клітин Мего. Рамки вказують клони Р. равзіогі5 з нейтралізуючою активністю. (А) Клони Р. равзіогі5, одержані після трансформації вибраним набором унікальних плазмід рКаїб1-УНН, вказаних числами. (В) Клони
Р. равіогі5, одержані після трансформації рКаїб1, в які клонували бібліотеку кандидатних Е- специфічних МНН. 13, 113, і т.д. належать до окремих трансформантів Р. равіогіз. Ямки в
Зо рамках вказують на зразки з РСВ-нейтралізуючою активністю.
Фігура 4: Очищення МНН, одержаних у Ріспіа равіогіз. Середовище для культивування клітин Р. Равіогі5, які були трансформовані рКаі-УНН-О5-Сам1-4, рКаі-УНН-О5-Сам1-І 66, рКаї-
МНН-БЕ2 або рКаї-МНН-Е58, збирали після індукції метанолом протягом 96 годин. Повторно розчинений у сульфаті амонію осад безклітинного середовища наносили на колонку НігхТгар і після промивання колонки елюювали градієнтом імідазолу з концентрацією, що підвищується (ліворуч). Пікову фракцію, яку елюювали з колонки НізТгар, потім наносили на колонку для гель- фільтрації Зирегдех 75 (праворуч). Хроматограми показані для МНН-О5-Сам1-4 (А), МНН-О5-
Сам1-І 66 (В), МНН-Е2 (С) і МНН-Е58 (0).
Фігура 5: Нуклеотидні послідовності МНН-О5-Сам1-4 (А) ії МНН-О5-Сам1-І 66 (В) і передбачені амінокислотні послідовності рекомбінантних МНН-О5-Сам1-4 ії МНН-О5-Сам1-І 66, одержаних у
Р. равіогіз (С). Визначаючі комплементарність ділянки (СОК) і Нібв-мітка (бхНІ5) вказані підписаними рамками.
Фігура 6: МНН-О5-Сам1-4 і МНН-О5-Сам1-і66 мають потужну нейтралізуючу активність відносно до РСВ. Клітини Мего заражали РСВ А?2 (А) або РСВ В49 (В) у присутності очищених
МНН (УНН-0О5-Сам1-4, УНН-0О5-Сам1-І 66 або негативного контролю МВ 1.14), моноклонального антитіла 025 або моноклонального антитіла АМ22. МНН і моноклональні антитіла використовували в серії трикратних розведень, починаючи з концентрації 3000 нг/мл.
Розраховували 50 95 інгібуючу концентрацію (ІС50) на підставі зменшення бляшок, показаного на А і В, і наносили на графік (С). Величини ІСво для Е-МНН-4 (05-Сам1-4) ії Е-МНН-І 66 (05-
Сам1-І 66) порівнювали з СІІ-УНН і МАТ проти НМРУ-А1-СЕР, НМРУ-В1-СЕР і РСВ А2-СЕР (0).
Попередньо визначені кількості зЕР-експресуючих рекомбінантних вірусів АМРУ (сублінія
МІ/1/00 АТ або сублінія МІ /1/99 В1, люб'язний подарунок Бернадетти ван ден Хуген і Рона
Фуше, Роттердам, Нідерланди) або СЕР-ПРСВ (штам А2, люб'язний подарунок Марка Піплса,
Колумбус, Огайо, США) (МОЇ 0,3 БУО/клітину) змішували з серійними розведеннями УНН або
МАТ і додавали в культури клітин Мего-118 (ПМРУ), або клітин НЕр-2, що ростуть в 96-ямкових планшетах. Через тридцять шість годин вилучали середовище, додавали РВЗ і вимірювали флуоресценцію СЕР в кожній ямці за допомогою мікроспектрофотометра для зчитування планшетів М200 Тесап. Значення флуоресценції були нанесені на графік у вигляді відсотка від контролю з вірусом без антитіла і використані для розрахунку відповідних значень ІСво.
Фігура 7: МНН-0О5-Сам!1-4 і МУНН-О5-Сам1-І 66 зв'язуються з О5-Сам'і, але не з Е після злиття. (А) Планшети ЕГІ5ЗА покривали О05-Сам!1 (верхня панель) або Е "після злиття" (нижня панель).
Планшети інкубували з серіями розведення 1:3 очищених МНН-О5-Сам1-4, МНН-О5-Сам1-І 66 і
УНН-Е58, починаючи з 30000 нг/мл. Показані величини 00450. (В) Сенсограми поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) для зв'язування МНН-О5-Самі-4 і МНН-О5-Сам1-і66 з іммобілізованим Е-білком "до злиття" або "після злиття". На верхній панелі, що показує сенсограми 5РЕ для Е "до злиття", зразок, що містить тільки буфер, ін'єкували поверх проточної комірки з 05-Сам1! (Е до злиття) і референсної проточної комірки, з подальшим 2-кратними серійними розведеннями УНН-05-Сам1-4 або МНН-0О5-Сам!1-І 66 в діапазоні від 5 НМ до 39,1 пМ, з дублюванням концентрації 1,25 нМ. З даних віднімали подвійну величину референсу і підганяли під модель зв'язування 1:1 (червоні лінії). Нижні панелі показують сенсограми ЗРК для зв'язування МНН-О5-Сам1-4 і МНН-О5-Сам1-І 66 з іммобілізованим Е "після злиття". Зразок, що містить тільки буфер, ін'єкували поверх проточної комірки з Е "після злиття" і референсної проточної комірки, з подальшими 1 мкМ і 500 нМ концентраціями О5-Сам1-4 або О5-Сам1-І 66. З даних віднімали подвійну величину референсу, але не підганяли під модель зв'язування, оскільки не було виявлено зв'язування з Е після злиття.
Фігура 8: МНН-О5-Сам1-4 і МНН-О5-Сам1-І 66 зв'язуються з Е на поверхні клітин ссавців.
Клітини НЕК-293Т трансфікували вектором, що експресує Е-білок РОВ А2 (рСАссо5-Е5уп) у комбінації з ЗЕР-МІ 5-експресуючим вектором (ресЕР-МІ 5) або трансфікували тільки СЕР-МІ 5- експресуючим вектором. Графік показує середню інтенсивність флуоресценції (РІ) вказаних
МНН ї мишиного моноклонального антитіла, специфічного до Є РСВ (МАВ858-1, МиіПрогеє) відносно до СЕР-позитивних клітин, що експресують Е-білок РСОВ (верхній графік) або не експресують Е-білок РСВ (графік знизу).
Фігура 9: Перехресне конкурентне зв'язування антитіл з 0О5-Сам!, досліджене з використанням інтерферометрії біошарів. 05-Сам! був іммобілізований на біосенсорах АК2О за допомогою реакції зв'язування амінів в ацетатному буфері. Реакцію гасили 1М етаноламіном, і біосенсори з іммобілізованим О5-Сам1- потім врівноважували буфером для аналізу (РВЗ з 1 95
ВЗА). Біосенсори занурювали в конкуруючі антитілал/Нн, а потім в аналізовані антитіла/имНН з короткою фоновою стадією між двома стадіями антитіло//НнН. Відсоток інгібувань визначали
Зо шляхом порівняння максимуму зв'язування аналізованого антитіла/уНн під час відсутності і у присутності кожного конкурента. МВ: відсутність зв'язування.
Фігура 10: Профілактичне введення Ю5З-Сам1-4 і Ю5-Сам1-І 66 знижує реплікацію РСВ іп мімо. мкг 05-Сам1-4, 05-Сам1-І66 або Г2, і 30 мкг палівізумабу вводили інтраназально мишам
ВА! В/с за чотири години до зараження РСВ А2. Через двадцять чотири години після зараження усі миші одержували 30 мкг 2 інтраназально. Мишей умертвляли через п'ять діб після зараження і визначали вірусне навантаження в легенях шляхом аналізу бляшкоутворення (А) і шляхом 48Т-ПЛР (В). Кожна точка на графіку відображає одну мишу, і горизонтальні лінії показують медіану. Ж: Миша з титром вірусу в гомогенаті легені нижче границі детекції. Графік (В) відображає відносну експресію РНК РСВ, нормалізовану за рівнями мРНК тВРІ 13А, що є присутньою в зразках кожної миші у вказаних групах.
Фігура 11: МНН-О5-Сам1-4 і МНН-О5-Сам1-І 66 зв'язуються з тим самим епітопом на Е РСВ з високою консервативністю структури. (А) Площа прихованої поверхні і залишки на Е-білку РСВ, стабілізованому в конформації "до злиття" (5ЕО ІЮ МО: 16), з якими контактує УНН-О5-Сам1-4 (показані жирним). (В) Площа прихованої поверхні і залишки на Е-білку РСВ, стабілізованому в конформації "до злиття" (ЗЕО ІЮ МО: 16), з якими контактує МНН-О5-Сам1-І 66 (показані жирним). (С) амінокислотні залишки Е-білка РСВ, стабілізованого в конформації "до злиття", повної відкритої рамки зчитування, до процесингу іп мімо (ЗЕО ІЮО МО: 17), з якими контактує і
МНН-05-Сам1-4, і МНН-О5-Сам1-І 66, підкреслені. (Ю) Спільна кристалічна структура обох ІЗМО
Е-білком РСВ "до злиття" показує високу консервативність структури ІЗМО і зв'язування з тим самим епітопом.
Фігура 12: Особливості зв'язування УМНН-О5-Самі-4. (АХ Петля СОКЗ УнНН-05-Сам1-4 зв'язується з кишенею, утвореною двома протомерами Е РСВ. (В) Петля СОК2 УНН-05-Сам1-4 взаємодіє з ділянкою ІІ і приєднується до СОКЗ через дисульфідний зв'язок. Р1і-протомер 1;
Р2-протомер 2.
Фігура 13: Особливості зв'язування МНН-О5-Сам1-І 66. (А) Петля СОКЗ МНН-О5-Сам1-І 66 зв'язується з кишенею, утвореною двома протомерами Е РСВ. (В) Петля СОК2 УНН-05-Сам1-
І 66 взаємодіє з ділянкою ІІ і приєднується до СОКЗ через дисульфідний зв'язок. Р1-протомер 1; Р2-протомер 2.
Фігура 14. Структура Е-білка в конформації "до злиття" у комплексі з мотавізумабом, АМ14, 60 101Е ї 05-Сам1-4. Модель Е-білка в конформації "до злиття" у комплексі з мотавізумабом, АМ14,
101 ї 05-Сам1-4. Структуру АМ14-Моїа-Е-білок "до злиття" (47УР) і структуру зв'язаного з пептидом Раб 101Е (3041) вирівнювали відносно Е зі структури О5-Сам1-4, зв'язаного з Е "до злиття". Епітоп О5-Сам1-4, а також епітоп О5-Сам1-І 66, розташований між епітопами для АМ14, мотавізумабу і 101Е і частково перекривається з кожним з них.
Докладний опис
Визначення
Даний винахід буде описаний відносно конкретних варіантів здійснення і з посиланням на визначені креслення, але винахід ними не обмежений, а обмежений тільки формулою винаходу.
Будь-які посилальні позиції у формулі винаходу не повинні тлумачитися як обмежуючі обсяг винаходу. Описані креслення є тільки схематичними і необмежуючими. На кресленнях розмір деяких елементів може бути перебільшений і не намальований у масштабі для ілюстративних цілей. Коли використовують термін "що містить" у даному описі або формулі винаходу, це не виключає інших елементів або етапів. Коли використовують форму однини іменника, вона включає множинну форму цього іменника, якщо конкретно не вказано інше.
Крім того, терміни "перший", "другий", "третій" і т.п. в описі і формулі винаходу, використовують для розрізнення подібних елементів і не обов'язково для опису послідовного або хронологічного порядку. Слід розуміти, що терміни, використані таким чином, є взаємозамінними при відповідних обставинах, і що варіанти здійснення винаходу, що описуються в даному описі, здатні працювати в інших послідовностях, ніж описані або проілюстровані в даному описі.
Подальші терміни або визначення надані винятково для того, щоб допомогти розумінню винаходу. Якщо в даному описі конкретно не визначено інше, усі терміни, застосовувані в даному описі, мають те ж саме значення, що і для фахівця в даній галузі за даним винаходом.
Фахівці-практики, зокрема, адресуються до ЗатюогоокК еї аїЇ., МоїІесшіаг Сіопіпд: А Гарогагу
Мапиаї, 24 ейд., Соїй бргіпд Нагброг Ргез5, Ріаіпомієму, Мем Могк (1989); і Айзибеї еї а!., Сштепі
РгоїосоЇ5 іп МоїІесшаг Віоіоду (Зирріетепі 47), допйп УМіеу 5 Боп5, Мем/ МогкК (1999), для визначень і термінів в даній галузі. Визначення, використовувані в даному описі, не повинні тлумачитися, як такі, що мають обсяг, менший, ніж його розуміє фахівець в даній галузі. "Імуноглобулін з одним варіабельним доменом" або "ІЗМО" являє собою фрагмент антитіла, що складається з одного варібельного домена антитіла. Як і ціле антитіло, він здатний вибірково зв'язуватися зі специфічним антигеном. З молекулярною масою всього лише 12-18 кДа, ІЗМО набагато менший за розміром, ніж стандартні антитіла (150-160 кДа), які складаються з двох важких і двох легких білкових ланцюгів, і навіть менший, ніж Раб-фрагменти (-50 кДа, один легкий ланцюг і половина важкого ланцюга) і одноланцюжкові варіабельні фрагменти (-25 кДа, два варіабельні домени, один з легкого і один з важкого ланцюга). В основному, ІЗМО будуть мати амінокислотну послідовність, що містить 4 каркасних ділянки (від ЕКІ до ЕК4) і З визначаючі комплементарність ділянки (від СОК! до СОКЗ), переважно у відповідності з наступною формулою: ЕК1-СОВ1-ЕН2-СОВ2-ЕВ3-СО83-ЕКА4. Як застосовують в даному описі, термін "ІЗМО", включає, як необмежуючі приклади, варіабельні домени важкого ланцюга антитіла верблюда (МНН5), що також позначаються як Нанотіла"м, доменні антитіла (аАБ), і
ІЗМО, одержані від акули (домени ІЧМАВ).
Як застосовують в даному описі, термін "специфічно зв'язується з формою "до злиття" Е- білка РСВ" належить до здатності РСВ-зв'язувального поліпептиду (наприклад, антитіла, ІБМО) вимірно зв'язуватися з формою "до злиття" Е-білка РСВ, а не з формою "після злиття" Е-білка
РСВ. "Форма "до злиття" Е-білка РСВ" належить до нестійкої конформації "до злиття" Е-білка РСВ, яка приймається перед взаємодією вірус-клітина, як описано в Мсі еМап еї аї., 2013. Вона відрізняється від високостабільної форми після злиття або конформації "після злиття", яка приймається після злиття вірусної і клітинної мембран. "Моновалентний формат" антитіла, як застосовують в даному описі, належить до формату антитіла, яке може розпізнавати тільки одну антигенну детермінанту. Він виключає формати полівалентних антитіл, які можуть розпізнавати більше однієї антигенної детермінанти, такі як (але не обмежуючись ними) бівалентні, тривалентні або тетравалентні формати.
У рамках винаходу, термін "нейтралізуюча активність" належить до того факту, що ІЗМО може інгібувати зараження вірусом, як виміряно в аналізі нейтралізації вірусу іп міго, такому як (але не обмежуючись ним) аналіз приглушення бляшкоутворення. Нейтралізація, що також позначається як інгібування, може означати повну нейтралізацію (не спостерігається зараження вірусом) або може означати часткову нейтралізацію. Наприклад, нейтралізація може означати 1095 нейтралізацію, 20 90 нейтралізацію, 25905 нейтралізацію, 30905 нейтралізацію, 40 95 60 нейтралізацію або більше. Зокрема, нейтралізація може бути, щонайменше 50 95, наприклад,
50 95 нейтралізацією, 60 до нейтралізацією, 70 9о нейтралізацією, 75 90 нейтралізацією, 80 95 нейтралізацією, 9095 нейтралізацією, 9595 нейтралізацією або більше. Нейтралізуючу активність, як правило, оцінюють у порівнянні з придатним контролем (наприклад, лікування невідповідним ІЗМО), який може бути легко вибраний фахівцем. Для ІЗМО з відомою концентрацією нейтралізуючу активність можна виражати у вигляді 50 95 інгібуючої концентрації (С50). ІС5О являє собою концентрацію ІЗМО, при якій досягається 50 95 інгібування (або нейтралізація). Це показник інгібуючого потенціалу ІЗМО, що також позначається як активність. "Подібна нейтралізуюча активність", в рамках винаходу, належить до нейтралізуючої активності, вираженої у вигляді ІС50О, яка, як правило, відрізняється у 10 разів або менше від нейтралізуючої активності, з якою її порівнюють. Більш конкретно, вона відрізняється у п'ять разів або менше, або навіть у два рази або менше.
Термін "визначаюча комплементарність ділянка" або "СОР" належить до варіабельної петлі всередині варіабельних ділянок або Н (важкого), або | (легкого) ланцюгів імуноглобулінів і містить амінокислотні послідовності, здатні специфічно зв'язуватися з антигенними мішенями.
Ці ділянки СОК забезпечують основну специфічність антитіла або фрагмента антитіла відносно до конкретної структури антигенної детермінанти.
Термін "епітоп" належить до ділянки специфічного зв'язування на антигені або на антигенній структурі, до якої поліпептид, такий як ІЗМО, має специфічність і афінність.
Термін "конформаційний епітоп" належить до епітопу з ознаками тривимірної поверхні антигену, яка дозволяє точно відповідати і зв'язуватися з поліпептидом, таким як ІЗМО.
Напроти, лінійні епітопи визначаються амінокислотною послідовністю (первинною структурою), а не ЗО-формою (третинною структурою) білка. "Терапевтичне лікування інфекції РСВ", в рамках винаходу, означає будь-яку форму лікування інфекції РСВ, яке вводять індивідууму після зараження вказаного індивідуума інфекцією РСВ. "Профілактика інфекції РСВ", в рамках винаходу, означає профілактичне лікування інфекції
РСВ, яке вводять індивідууму до зараження вказаного індивідуума інфекцією РСВ.
Профілактичне лікування може включати застосування за даним винаходом у вигляді вакцини. "Фармацевтична композиція", в рамках винаходу, може бути будь-якою фармацевтичною
Зо композицією, відомою фахівцю в даній галузі, включаючи як необмежуючі приклади композиції для системного, перорального і інтраназального введення. "РОВ-зв'язувальна конструкція, яка містить щонайменше один ІЗМО", в рамках винаходу, належить до будь-якої зв'язувальної конструкції, яка зв'язується з РСВ і містить один або декілька ІЗМО. "Клітина-хазяїн", в рамках винаходу, може бути будь-якою клітиною, яка підходить для одержання ІЗМО або РСВ-зв'язувальних конструкцій.
Згідно з першим аспектом, завданням за винаходом є створення ІЗМО, які спрямовані проти форми "до злиття" Е-білка РОСВ і/або специфічно зв'язуються з формою "до злиття" Е-білка РСВ.
Специфічне зв'язування з формою "до злиття" Е-білю»а РСВ означає, що ІЗМО вимірно зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РСВ, а не з формою "після злиття" Е-білка РСВ. На специфічне зв'язування може впливати, наприклад, афінність ІБМО і концентрація ІЗМО.
Фахівець в даній галузі може визначити придатні умови, при яких можна оцінити зв'язувальну здатність ІЗМО, що описується в даному описі, такі як титрування ІЗМО в придатному аналізі зв'язування, такому як (але не обмежуючись цим) твердофазний імуноферментний аналіз (ЕПІЗА), або аналіз зв'язування на основі поверхневого плазмонного резонансу (5РЕК) або інтерферометрія біошарів (ВІЇ). Як правило, зв'язування з формою "до злиття" Е-білка РОВ означає, що ІЗМО зв'язується з формою Е-білка дикого типу, а також з будь-якою мутантною формою РЕ-білка, за умови, що Е-білок знаходиться в конформації "до злиття". Також включені зв'язування з БЕ-білюом обох підтипів (А і В) РСВ. У конкретному варіанті здійснення вищеописаний ІЗМО зв'язується з консенсусною послідовністю Е-білка РСВ А, вказаною в 5ЕО
ІЮО МО: 18. Консенсусну послідовність, вказану в ЗЕО ІЮ МО: 18, розраховували способами, відомими фахівцям в даній галузі, на підставі 92 повнорозмірних послідовностей Е-білка РСВ А, перерахованих в базі даних білків МСВІ. Таким чином, вищеописаний ІЗМО зв'язується з будь- якою з 92 типових послідовностей Е-білка РСОВ А, включених для одержання консенсусної послідовності 5ЕО ІО МО: 18. У конкретному варіанті здійснення вищеописаний І5МО зв'язується з консенсусною послідовністю Е-білка РСВ В, вказаною в ЗЕО ІЮО МО: 19.
Консенсусну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮО МО: 19, розраховували способами, відомими фахівцям в даній галузі, на підставі 114 повнорозмірних послідовностей Е-білка РСВ В, перерахованих в базі даних білків МСВІ. Таким чином, вищеописаний ІЗМО зв'язується з будь- 60 якою з 114 типових послідовностей Е-білю»а РСВ В, включених для одержання консенсусної послідовності 5ЕО ІО МО: 19. У конкретному варіанті здійснення вищеописаний І5МО зв'язується з обома, Е-білком РСВ А, вказаним в 5ЕО ІЮО МО: 18 і Е-білюком РСВ В, вказаним в
ЗЕО ІЮ МО: 19. У конкретному варіанті здійснення вищеописані ІЗМО зв'язуються винятково з формою "до злиття" Е-білка. Відповідно до додаткових конкретних варіантів здійснення, вищезгадані ІЗМО зв'язуються винятково з формою "до злиття" Е-білка і не зв'язуються з формою "після злиття" Е-білка. У конкретному варіанті здійснення вищеописані ІЗМО зв'язуються зі стабілізованим "до злиття" Е-білком РСВ з БЕО ІЮО МО: 16. У конкретному варіанті здійснення ІЗМО може бути злитий з додатковими компонентами.
Згідно з конкретними варіантами здійснення, вищеописані ІЗМО зв'язуються з епітопом Е- білка РСВ "до злиття". Зокрема, вони зв'язуються з конформаційним епітопом Е-білка РСВ "до злиття". У конкретному варіанті здійснення вищеописані ІЗМО зв'язуються з конформаційним епітопом Е-білка РСВ "до злиття", що містить амінокислотні залишки Т50, (51, МуУ52, 5180,
Сс184, М185, Р2б5, І266, Т267, М268, 0269, 0270, 1305, 1307, М308, М345, АЗ46, 1347, Ка21, 5425, К427, М428, 429, 430, І431, 5451, 5453, М454, І 456, 458. Зокрема, вони зв'язуються з конформаційним епітопом Е-білка РОСВ "до злиття", що містить амінокислотні залишки Т50, (351,
МуУ52, 5180, 2184, М185, Р2б5, І266, Т267, М268, 0269, 0270, 1305, 1307, М308, М345, АЗ46, 347, К421, 5425, К427, М428, К429, 5430, І431, 5451, 5453, М454, 1456, 458 з Е-білка РСВ "до злиття", вказаного в БХЕО ІЮ МО: 17.
Згідно з конкретними варіантами здійснення, ІБМО у моновалентному форматі показує подібну нейтралізуючу активність для серотипів РСВ А і В. Як правило, це означає, що ІЗМО перешкоджає/інгібує/відвертає/повертає назад або уповільнює здатність вірусу заражати клітину. Згідно З дими конкретними варіантами здійснення, ІЗМО перешкоджає/інгібує/відвертає/повертає назад або уповільнює здатність вірусу заражати клітину у подібному ступені для серотипів А і В РСВ.
Згідно з конкретними варіантами здійснення, ІЗМО містить послідовність СОКІ, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 1 і ЗЕО ІЮ МО: 2, послідовність СОК2, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: З ї 5ЕО ІЮО МО: 4 і послідовність СОКЗ, вибрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 5 і 5ЕО ІЮО МО: 6, де СОК1, СОК2 і/або СОБЗ мають відмінність по одній, двом або трьом амінокислотам з будь-якою з вищевказаних відповідних 5ЕО ІЮ МО. Для
Ко) ІБМО 05-Сам1-4 послідовності СОЕБ являють собою 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: З і 5ЕО І МО: 5.
Для ІЗМО 05-Сам1-І 66 послідовності СОЕ являють собою ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 4 і 5ЕО ІЮ
МО: 6.
Згідно 3 додатковим аспектом, пропонується РСВ-зв'язувальна конструкція, що характеризується тим, що вказана РСВ-зв'язувальна конструкція містить щонайменше один
ІЗМО. Щонайменше один ІЗМО означає, що РСВ-зв'язувальна конструкція може містити більше ніж один ІЗМО. Разом з одним або декількома ІЗМО, РСВ-зв'язувальна конструкція може містити інші компоненти, зв'язані з ІЗМО. Вказані додаткові компоненти можуть зв'язуватися або не зв'язуватися з РСВ. Як необмежуючий приклад, вказана РСВ-зв'язувальна конструкція може містити ІЗМО, який зв'язується з Е-білююм РСВ, і може бути зв'язаний (хімічно або іншим способом) з однією або декількома групами або компонентами, які збільшують напіввиведення (такими як, але без обмежень, поліеєтиленгліколь (ПЕГ) або сироватковий альбумін, що зв'язує
МНН), таким чином, щоб одержати похідне ІЗМО за винаходом зі збільшеним напіввиведенням.
Як правило, вказана РСВ-зв'язувальна конструкція зв'язується з Е-білюом РСВ "до злиття". У конкретному варіанті здійснення вищеописана РСВ-зв'язувальна конструкція зв'язується з зЗЕО
ІО МО: 17 і/або ЗЕО ІО МО: 18 і/або ЗЕО ІЮ МО: 19. Вказана РСВ-зв'язувальна конструкція може бути будь-якою конструкцією, що містить один або більше ніж один РСВ-зв'язувальний ІЗМО.
Згідно з додатковим аспектом, не пропонуються ІЗМО як такі, а пропонуються у вигляді нуклеїнової кислоти, тобто молекул нуклеїнової кислоти, що кодують ІЗМО проти Е-білка РСВ, описаного в даному описі, зокрема, проти форми "до злиття" Е-білка. Також пропонуються вектори, що містять такі нуклеїнові кислоти або молекули нуклеїнової кислоти. Згідно з ще одним аспектом, пропонуються клітини-хазяї, що містять такі нуклеїнові кислоти або такі вектори. Як правило, нуклеїнові кислоти будуть введені в клітину-хазяїна шляхом трансфекції або трансформації, хоча шлях, яким нуклеїнову кислоту вводять в клітину-хазяїна, не обмежує винахід.
Згідно з ще одним варіантом здійснення, пропонуються клітини-хазяї, що містять такі нуклеїнові кислоти. Як правило, такі клітини-хазяї будуть трансформовані або трансфіковані нуклеїновими кислотами. Конкретне застосування, яке передбачено для цих клітин-хазяїв, - це вироблення ІЗМО. Таким чином, таке застосування для вироблення явно передбачено в даному описі. Це означає, що клітини-хазяї, трансформовані або трансфіковані молекулами нуклеїнової 60 кислоти, що кодують ІЗМО, можна використовувати для одержання ІЗМО.
Згідно з додатковим аспектом, в даному описі пропонуються ІЗМО для застосування в медицині. Тобто, пропонуються ІЗМО проти Е-білка РСВ для застосування як лікарський засіб.
Те ж саме стосується нуклеїнової кислоти, що кодує ІЗМО, або векторів, що містять такі нуклеїнові кислоти, тобто передбачається, що молекули нуклеїнової кислоти або вектори, що кодують ІЗМО, пропонуються для застосування як лікарській засіб. Також пропонуються РСВ- зв'язувальні конструкції, що містять щонайменше один ІЗМО, який зв'язується з Е-білком РСВ, для застосування як лікарський засіб. Згідно з конкретними варіантами здійснення, пропонуються ІЗМО (або РСОСВ-зв'язувальні конструкції, що містять їх, або фармацевтичні композиції, що містять їх, або нуклеїнові кислоти, що кодують їх, або вектори, що містять такі нуклеїнові кислоти) для застосування для лікування або профілактики інфекції РСВ. Це еквівалентно тому, що пропонуються способи для лікування або профілактики інфекції РСВ для індивідуума, що потребує цього, що включають введення вказаному індивідууму ІЗМО проти Е- білка РСВ. Також ІЗМО може бути запропонований у вигляді білка (у вигляді однодоменного білка, у вигляді частини РСВ-зв'язувальної конструкції або фармацевтичної композиції) або його можна вводити у вигляді молекули нуклеїнової кислоти, що кодує ІЗМО проти Е-білка РСВ, або у вигляді вектора, що містить таку молекулу нуклеїнової кислоти. Якщо ІЗМО (або РСОСВ- зв'язувальну конструкцію) вводять у вигляді білка, можуть бути передбачені різні шляхи введення. Як необмежуючі приклади, ІБМО можна вводити системно, перорально або інтраназально, так як, наприклад, шляхом назальної інгаляції. У випадку, якщо ІЗМО пропонується у вигляді нуклеїнової кислоти або вектора, конкретно передбачається, що ІЗМО вводять шляхом генотерапії.
Згідно з додатковим аспектом, пропонуються фармацевтичні композиції, що містять щонайменше один ІЗМО, спрямований на Б-білок РСВ "до злиття". Як правило, такі фармацевтичні композиції містять щонайменше один ІЗМО, спрямований на форму "до злиття"
Е-білка РСВ. Вказані фармацевтичні композиції можуть містити додаткові компоненти. Вказані додаткові компоненти можуть зв'язуватися або не зв'язуватися з РСВ. Передбачено в даному описі, що фармацевтичні композиції пропонуються для застосування як лікарський засіб.
Зокрема, вони пропонуються для застосування в терапевтичному лікуванні або профілактиці інфекцій РСОВ. Це еквівалентно твердженню, що пропонуються способи для терапевтичного
Зо лікування або профілактики інфекцій РСВ для індивідуума, що потребує цього, що включають введення вказаному індивідууму фармацевтичної композиції, описаної в даному описі.
Згідно з додатковими варіантами здійснення, пропонується спосіб терапевтичного лікування або профілактики інфекції РСВ, спосіб, що включає введення індивідууму, що потребує цього,
ІБМО, як описано вище, РСВ-зв'язувальної конструкції, як описано вище, або фармацевтичної композиції, як описано вище. Вказаний спосіб включає введення вказаному індивідууму ІЗМО проти Е-білка РСВ "до злиття". Такі способи, як правило, будуть призводити до покращення або відвертання симптомів інфекції у вказаного індивідуума. Також ІЗМО може бути запропонований у вигляді білка (у вигляді однодоменного білка, у вигляді частини РСВ-зв'язувальної конструкції або фармацевтичної композиції) або його можна вводити у вигляді молекули нуклеїнової кислоти, що кодує ІЗМО проти Е-білка РСВ, або у вигляді вектора, що містить таку молекулу нуклеїнової кислоти, або у вигляді фармацевтичної композиції, що містить таке антитіло. Також,
РСОСВ-зв'язувальні конструкції, описані в даному описі, передбачені для введення індивідууму, що потребує цього, в способах для терапевтичного лікування або профілактики інфекцій РСВ.
Слід розуміти, що хоча в даному описі обговорюються конкретні варіанти здійснення, конкретні конфігурації, а також матеріали і/або молекули для клітин і способів за даним винаходом, можна робити різні зміни або модифікації за формою і деталями в межах обсягу і суті даного винаходу. Наступні приклади надані для кращого ілюстрування конкретних варіантів здійснення, і їх не слід розглядати як такі, що обмежують винахід. Заявка обмежена тільки формулою винаходу.
Приклади
Матеріали і способи для прикладів
Імунізація і створення бібліотеки МНН
Ламу ін'єкували підшкірно на добу 0, 7, 14, 21, 28 і 35, кожного разу по 167 мкг очищеного Е- білла РОВО5-Сам!. 05-Сам! являє собою рекомбінантний Е-білок РСВ, стабілізований у конформації "до злиття" (Меої! еПап еї аї., 2013). Перші дві ін'єкції проводили з полі-ІС (375 мкг на ін'єкцію) як ад'ювант, у той час як для останніх чотирьох ін'єкцій використовували як ад'ювант
Сегри ГО Ж 3000. Перед кожною імунізацією забирали кров і одержували плазму для оцінки сіркоконверсії. На добу 40 збирали 100 мл крові з антикоагулянтами для одержання лімфоцитів.
Тотальну РНК з лімфоцитів периферичної крові використовували як матрицю для синтезу бо першого ланцюга кДНК з праймером олігоат. З використанням цієї КДНК ампліфікували шляхом
ПЛР послідовності, що кодують УНН, розщеплювали РЇЇ і Мої! і клонували в ділянки Реї! і Мої! фагмідного вектора рНЕМ4. Електрокомпетентні клітини ТО1 БЕ. соїї трансформували рекомбінантним вектором РНЕМ4, що призводило до одержання бібліотеки МНН приблизно з
Бх108 незалежних трансформантів. 87 96 трансформантів несли вектор з правильним розміром вставки, що було підтверджено ПЛР-аналізом дев'яносто п'яти незалежних трансформантів. 500 мкл стоку бібліотеки заражали фагом-помічником МСЗ М13 для того щоб розташувати послідовності УНН (у злитті з М13 РІЇ) на поверхні фагу, який використовували для біопенінгу.
Клітини
Клітини Нер-2 (АТОС, СС -23), клітини Мего (АТСС, СС -81) і клітини НЕК-293Т (подарунок від Ог М. Наїї) вирощували в середовищі ОМЕМ, доповненому 10 9о інактивованої нагріванням ембріональної телячої сироватки (ЕТС), 2 мМ І-глутаміну, амінокислотами, що не належать до незамінних (Іпмігодеп, Сагізрайд, Саїйогпіа) і 1 мМ піруватом натрію.
Віруси
РСВ А2 (МК-1540, АТСС, КоскКміЇПе), підтип А РСВ, і РСВ В49, підтип В РСВ (клінічний штам
ВЕ/5649/08 одержаний від Ргої М. Мап Капзві, Тап еї аІ., 2013) вирощували, заражаючи моношари клітин Нер-2, з 0,1 МОЇ у присутності середовища для вирощування, що містить 1 Фо
ЕТС. Через п'ять діб після зараження збирали клітини і середовище, поєднували і очищали за допомогою центрифугування (450х9). Для того щоб сконцентрувати вірус, очищений супернатант інкубували протягом чотирьох годин при 42С у присутності 10 95 поліетиленгліколю (ПЕГбО0О0О). Після центрифугування (30 хвилин при 3000х9), осад ресуспендували у збалансованому сольовому розчині Хенка (НВБЗ5), що містить 20 95 сахарози, ділили на аліквоти, швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали при -8020.
Аналіз РСВ-нейтралізуючої активності
Плазму лами тестували на нейтралізуючу активність проти РСВ А2 і РСОВ В49 шляхом аналізу бляшкоутворення. Клітини Мего висівали в 96-ямковий планшет (15000 клітин/ямку). На наступну добу, одержували серійні розведення зразків плазми в Орії-МЕМ (сіврсо), доповненої 195 пеніциліном і 1 95 стрептоміцином (серії розведень 1:3, починаючи з розведення 1:4).
Додавали до зразків плазми однаковий об'єм суспензії РСВ А?2 (розведеної до 1,4 БУО/мкл) або
РСВ В49 (розведеної до 2,8 БУО/мкл) і інкубували одержані суміші протягом 30 хвилин при 372С. Потім, 50 мкл сумішей додавали до клітин Мего, які були відмиті Орії-МЕМ, і клітини інкубували при 372С протягом трьох годин. Потім, додавали в кожну ямку 50 мкл 1,2 95 авіцелу в середовищі ЮОМЕМ, доповненому 2 95 інактивованої нагріванням ЕТС, 2 мМ І-глутаміну, амінокислотами, що не належать до незамінних, і 1 мМ пірувату натрію, і залишали інфекцію розвиватися при 372С протягом трьох діб. Клітини фіксували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, додаючи в ямки 50 мкл 2 956 розчину параформальдегіду. Після фіксації, клітини відмивали двічі фосфатно-сольовим буфером (РВ5), пермеабілізували 50 мкл РВ5 з 0,2 95
Тиійоп Х-100 протягом 10 хвилин і блокували РВ5, що містить 1 95 БСА. Потім, додавали поліклональну козину сироватку проти РСВ (АВ1125, Спетісоп Іпіегпайіопа!) (1:2000 в РВ5, що містить 0,5 96 БСА ії 0,001 95 Тийоп Хх-100 (РВЗ/БСА)). Після трьох відмивань РВЗ/БСА клітини інкубували з анти-козлиними ІдСї, кон'юЮгованими з пероксидазою хріну (502020, ЗБапіа Стгил) протягом 30 хвилин. Ямки потім промивали чотири рази РВБЗ/БСА і один раз РВ5. Нарешті, візуалізували бляшки, додаючи субстрат пероксидази ТгиеВіше (КРІ, Сайпегеригд). РОСВ- нейтралізуючу активність в неочищеному супернатанті Ріспіа равіогі5 і в очищених УНН (див. нижче) також визначали за допомогою цього аналізу.
Виділення О5-Сам!і-зв'язувальних УНН
Ми проводили один раунд пенінгу для збагачення фагами, що зв'язують Е "до злиття" (05-
Сам1). Одну ямку (ямка АТ) на планшеті для мікротитрування (тип ІІ, Б9б Махізогр, Мипс) покривали протягом ночі 20 мкг 05-Сам! в РВ5. Цю ямку разом з ямкою негативного контролю без покриття (ямка А12) блокували блокувальним буфером 5ЕА ВІОСК (Тпегто 5сіепійіс) протягом однієї години. Потім, до цих двох ямок додавали 1012 фагів в об'ємі 100 мкл блокувального буфера 5ЕА ВІОСК. Через одну годину вилучали фагові частинки, що не зв'язалися, і відмивали ямки десять разів РВ5Т (РВ5З 0,5 95 Тмееп20). Фаги, що залишилися, потім елюювали, додаючи лужний розчин, що складається з 100 мкл розчину ТЕА (14 95 триетиламін (Зідта) рН 10), в ямки точно на 10 хвилин. Фаги, що дисоціювали, потім переносили у стерильну пробірку з 100 мкл 1М ТКІ5-НСІ рН 8,0. З елюйованих фагів одержували десятикратні серійні розведення в РВ5, і використовували 10 мкл цих серійних розведень для зараження 90 мкл клітин ТО1 (клітини Е. Соїї, компетентні до фагового дисплею).
Зараження проводили протягом 30 хвилин при 372С, після чого бактерії висівали на чашки з
ЇВ/агаром з 100 мкг/мл ампіциліну і 195 глюкози. Збагачення антиген-специфічних фагів бо шляхом цієї процедури пенінгу оцінювали, порівнюючи число фагмідних частинок, елюйованих з ямки, покритої антигеном, з числом фагмідних частинок, елюйованих з ямки з негативним контролем.
Дев'яносто колоній, резистентних до ампіциліну, були вибрані випадковим чином для подальшого аналізу шляхом ЕГІЗА на наявність Е-специфічних МНН в їх периплазмі. Ці колонії спочатку переносили на чашки зі свіжим І В/агаром з ампіциліном, а потім використовували для посіву в 1 мл середовища Тегтгіїс Вгоїй (ТВ) з 100 мкг/мл ампіциліну в планшет з 24 глибокими ямками. Засіяні планшети інкубували при 37С з одночасним струшуванням протягом п'яти годин. Експресію МНН індукували, додаючи ізопропіл В-0-1-тіогалактопіранозид (ІРТО) до концентрації 1 мМ. Планшети потім інкубували протягом ночі при 379С з одночасним струшуванням. На наступну добу, бактеріальні клітини оосаджували за допомогою центрифугування (12 хвилин при 3200 об./хв.) і вилучали супернатант. Клітинний осад ресуспендували в 200 мкл буфера ТЕЗ (0,2 М ТКІ5-НСЇІ рН 8, 0,5 мМ ЕДТА, 0,5 М сахарози) і струшували планшети при 42С протягом 30 хвилин. Потім у ресуспендовані клітини додавали воду для того щоб індукувати осмотичний шок, який призводить до вивільнення периплазматичних білків, що включають МНН. Планшети з глибокими ямками інкубували протягом однієї години при 49 з одночасним струшуванням, центрифугували і збирали супернатант, що містить периплазматичний екстракт. Чотири планшети для мікротитрування покривали протягом ночі 100 нг білка на ямку в РВ5, два з поперемінними рядами з Е у конформації "після злиття" (Мсі еПап еї аї., 2011) і БСА, два інших з поперемінними рядами з 05-Сам! і БСА. Покриті планшети для мікротитрування потім відмивали і блокували 1 95 порошковим молоком в РВ5. Після відмивання планшетів для мікротитрування у ямки додавали 100 мкл периплазматичного екстракту, і потім інкубували протягом однієї години при 420.
Планшети відмивали і додавали 50 мкл анти-НА моноклонального антитіла (ММ5-101Р
Віоіедепа) в РВ5 у розведенні 1:2000 на одну годину при кімнатній температурі. Після відмивання додавали антимишиний Ідсї у розведенні 1:2000 в РВ5, зв'язаний з пероксидазою хріну (НКР) (МХАЗ9З1, СЕ Неайвсаге), і інкубували планшети протягом однієї години. Потім, планшети відмивали і додавали у кожну ямку 50 мкл субстрату ТМВ (тетраметилбензидин, ВО
ОрІЕЇА"М). Реакцію зупиняли, додаючи 50 мкл 1М Н25О», після чого вимірювали оптичну щільність при 450 нМ за допомогою рідера оптичної щільності для мікропланшетів іМагкК (Віо
Зо Кад). Усі периплазматичні фракції, для яких значення 00450, одержані для Ю5З-Самі або ЕЕ "після злиття", були, щонайменше, у два рази вище, ніж значення 00450, одержані для БСА, вибирали для подальшого аналізу. Відповідні бактерії вирощували в З мл середовища І В з 1:2000 ампіциліну для виділення плазмід з використанням набору ОІАргер бріп Міпіргер (Сіадеп). Послідовність КДНК клонованих УНН визначали шляхом секвенування за Сенгером з використанням праймера МІЗК5 (Б'сСАСсАААСАасСтТАТОАСОЗІ).
Клонування УНН у експресуюий вектор для Ріспіа разіогіз і трансформація Ріспіа равіогіб
Послідовності МНН, а також послідовності МНН, які збереглися після пенінгу, були ампліфіковані шляхом ПЛР з відповідних плазмід РНЕМА з використанням наступних прямих і зворотних праймерів (всаеаСсоаатАТСТоТОЧАаААААлаасАасатасаастасСсаацАатстасав;
БСтТААСТАСТСТАСТаАТОСТОАТаСТвЩатаасСставАвАСа,аатаАСсСтТацЗ и. Одержані продукти ПЛР розщеплювали Хпої і 5реї і лігували в кістяк рКаїб1, розщеплений Хпо1/5реї.
Вихідний вектор рКаїб1 описаний в Зспоопоодне еї аї., 2009. Послідовності МНН клонують в рамку зі злегка зміненою версією сигнальної послідовності «-фактора спарювання 5. сегемівзіає.
Ця сигнальна послідовність спрямовує білки до секреторної системи дріжджів, потім процесується в ЕР і апараті Гольджи і повністю вилучається перед секрецією у позаклітинне середовище. На відміну від пре-про-сигнальної послідовності дикого типу, ця модифікована версія не містить послідовності, які кодують повтори СіІшАПа (у цьому місці сигнальний пептид ефективно розщеплюється ендопептидазою Кех2 без необхідності у цьому повторі). Гени, що кодуються, містять С-кінцеву мітку бхНіз і знаходяться під контролем промотору АОХ1, що індукується метанолом. Плазміда містить маркер стійкості до зеоцину для відбору в бактеріальних, а також у дріжджових клітинах. Вектори були лінеаризовані в промоторі АОХ1 (за допомогою Рітеї) перед трансформацією Р. равіогі5, для того щоб сприяти гомологічній рекомбінації в ендогенному локусі АОХІ1 для стабільної інтеграції в геном. Одержані вектори були названі рКаї-0О5-Сам1і-4, рКаії-О5-Сам1-Її6б, рКаї-МНН-Е2 їі рКаЇї-МНН-Е58 («4 використовувалися для трансформації штаму 55115 Ріспіа разіогіз за допомогою короткого протоколу трансформації, описаного І іп-Сегедніпо єї а!., 2005.
Очищення МНН, вироблених Ріспіа равіогі5
Експресію МНН в клонах трансформованих Ріспіа разіогі5 спочатку аналізували в культурах бо по 2 мл. На першу добу використовували окремих трансформантів для засіву 2 мл середовища
УРМа (2 95 пептону, 1 95 бактодріжджового екстракту, 1,34 95 МВ, 0,1М фосфату калію рнН 6, 0,00004 95 біотину, 1 95 гліцерину) з 100 мкг/мл зеоцину (Ге Тесппоіодіеб5) і інкубували з одночасним струшуванням при 282С протягом 24 годин. На наступну добу, клітини осаджували за допомогою центрифугування (8 хвилин при 500 9) і заміняли середовище УРМО на середовище УРММ (2 95 пептону, 1 95 бактодріжджового екстракту, 1,34 95 МВ, 0,1М фосфату калію рН 6, 0,00004 95 біотину, 1 96 метанолу) для індукування експресії УНН і інкубували культури при 282С з одночасним струшуванням протягом 72 годин. 50 мкл 50 95 метанолу додавали до культур через 72 години, 80 годин і 96 годин. Через сто годин після перенесення у середовище, що містить метанол, дріжджові клітини осаджували за допомогою центрифугування (8 хвилин при 500 д) і зберігали супернатант для оцінювання присутності
МНН. Неочищене середовище (25 мкл) наносили на 15 95 гель 5О5-РАСЕ, після чого наявність білка аналізували, забарвлюючи кумасі брильянтовим синім. Для відбору МНН з РСВ- нейтралізуючою активністю, ми визначали таку активність у неочищеному супернатанті ХРММ від окремих трансформантів Ріспіа разіогі5, застосовуючи серійні розведення супернатанту в аналізі бляшкоутворення, як описано вище.
Трансформанти Ріспіа рабвіогіх5, які виробили високі рівні МНН у середовище або з високою
РСВ-нейтралізуючою активністю, вибирали для виробництва у збільшеному масштабі з використанням культур Ріспіа по 100 або 300 мл. Умови росту і індукції метанолом, і збір середовища були аналогічними до умов зазначених вище для культур по 2 мл. Очищене середовище осаджували сульфатом амонію (80 95 насичення) протягом чотирьох годин при 426. Нерозчинну фракцію осаджували за допомогою центрифугування при 20000 4д і розчиняли в 10 мл зв'язувального буфера Ніх Тгар (20 мМ фосфату натрію, 0,5 М Масі, 20 мМ імідазолу, рН 7,4), центрифугували протягом 10 хвилин при 42С, після чого наносили супернатант на 1 мл колонку НіхТгар НР (СЕ НеайпПсаге), попередньо врівноважену зв'язувальним буфером НіхТгар.
Після відмивання колонки зв'язувальним буфером НіхТгар у кількості, щонайменше, десяти об'ємів колонки (доти, поки оптична щільність не досягне стабільної базової лінії) білки, що зв'язалися, елюювали лінійним градієнтом імідазолу, починаючи з 20 мМ і закінчуючи 500 мМ імідазолу у зв'язувальному буфері Ніх Тгар до загального об'єму 20 мл. Фракції, що містять УНН, як було визначено аналізом 505-РАСЕ, поєднували і концентрували до 2 мл за допомогою
Зо центрифужної колонки Міма (поріг 5 кДа, СЕ Неайсаге). Ці концентровані фракції потім наносили на колонку Зирегаех 75 (160 мл, 0,8 мл/хв) в РВЗ5 і поєднували пікові фракції, і концентрували на центрифужній колонці Міма з порогом 5 кДа. Концентрацію білка об'єднаної фракції визначали за вимірюванням А280 за допомогою МапоЮОгор 1000 з коефіцієнтом екстинкції для розрахунку відсотковості розчину, індивідуальним для кожного МНН. Об'єднану і концентровану фракції розділяли на аліквоти і зберігали при -802С перед подальшим використанням.
Розрахунок 50 95 інгібуючої концентрації (ІС50) очищених УНН
Для визначення ІС50 очищених УНН, вироблених Ріспіа равіогі5 оцінювали трикратні серійні розведення цих УНН, приготовлені в Оріі-Мет, в аналізі нейтралізації РСВ, як описано вище.
Моноклональні Ідс, 025 і АМ22 (Веаитопі еї аї., 2012, 5рії5 еї аї., 2013), обидва специфічно спрямовані на конформацію Е-білка "до злиття", використовували як позитивні контролі. МВ 1.12, МНН, спрямований проти са-макроглобуліну, використовували як негативний контроль.
Значення ІС5О розраховували вручну.
Зв'язування УНН з О5-Сам!1 і Е-білком "після злиття" іп міго
Зв'язування очищених УНН з О5-Сам!і і Е-білком "після злиття" тестували в прямому аналізі
ЕГІЗА. Планшети для мікротитрування (тип ІІ, Е96 Махізогр, Мипс) покривали 100 мкл 1 мкг/мл розчину Ю5-Самі або 1 мкг/мл розчину Е-білка "після злиття" в РВ5. Після відмивання, планшети блокували протягом однієї години 200 мкл 4 95 молока в РВ5, після чого відмивали знову тільки РВ5. Потім наносили серії розведень 1:3 УНН (починаючи від ЗО мкг/мл) в ямки, покриті білком. Через годину планшети відмивали і додавали розведення 1:2000 антитіла до гістидинової мітки (АО1.1.10 АБО Зегоїес) в РВЗ на одну годину. Після відмивання і додавання антимишиного ІдСї, зв'язаного з НЕР, на одну годину (у розведенні 1:2000), проводили ЕГІЗА тим же самим способом, що і РЕ-ЕГІ5А, описаний вище. Для визначення афінності очищений ро-Самі з 5ігертТаод ІІ ії міткою бхНів був іммобілізований на сенсорному чипі МТА приблизно до 537 одиниць відповіді (РЕ) для кожного циклу з використанням Віасоге Х100 (СЕ). Сенсорний чип МТА відновлювали між циклами з використанням 0,25М ЕДТА, а потім 0,5 мМ Місі». Зразок, що містить тільки буфер, ін'єкували поверх проточної комірки з О5-Самі!і і референсної проточної комірки, а потім двократні розведення МБ4 або МБбб від 5 нМ до 39,1 пМ в НВЗ-Р., з дублюванням концентрації 1,25 НМ. З даних віднімали подвійну величину референсу і підганяли бо під модель зв'язування 1:1 з використанням програми Зсгирбег.
Зв'язування МНН з Е-білком, що експресується на поверхні клітин, які були трансфіковані експресуючим вектором з кКДНК Е-білка РОСВ, оцінювали шляхом протокової цитометрії. Клітини
НЕК293Т висівали у кількості 4000000 клітин на 150 мм планшет для культивування тканин і трансфікували 6,4 мкг рСАСіа5-Езуп, який кодує кодон-оптимізовану КДНК Е-білка РСВ, з використанням реагенту для трансфекції ЕиСЕМЕ НО (Рготеда). Для того щоб відстежити трансфіковані клітини, трансфекції проводили у присутності 6,4 мкг ресЕР-МІ 5. Контрольні трансфекції проводили тільки з ресЕР-МІ 5. Через 18 годин після трансфекції відокремлювали клітини за допомогою 15 мл розчину трипсин-ЕДТА (0,05 95 трипсину, 0,5 мм ЕДТА (рН 8,0)), відмивали один раз РВЗ і інкубували протягом 30 хвилин в РВ5З, що містить 195 ВБА (РВЗ/БСА). Потім клітини інкубували з вказаним МНН або з мишиним моноклональним антитілом, специфічним для РСВ-Е (МАВ858-1, Спетісоп Іпіегпайопаї) у різних концентраціях, як вказано на фігурі 8). Через 1 годину клітини відмивали один раз РВБЗ/БСА і інкубували з антитілом до гістидинової мітки, розведеним 1:3000 в РВЗ/БСА, протягом однієї години. Потім, клітини відмивали один раз РВБ/БСА і додавали антимишиний Ідсі АІеха 633 на 30 хвилин.
Після відмивання клітин три рази РВ5, клітини аналізували за допомогою протокового цитометра ЕАСЗСаїїйбиг. Окремі клітини, що експресують СЕР, вибирали на підставі поверхні піків сигналу бічного світлорозсіювання, поверхні піків і висоти піків сигналу прямого світлорозсіювання і поверхні піків сигналу зеленої флуоресценції. Нарешті у цих СЕР- позитивних окремих клітин вимірювали інтенсивність сигналу флуоресценції АІеха 633.
Миші
Специфічних, вільних від патогенної флори, самок мишей ВАГ В/с одержували від Чарльза
Рівера (Спагіез5 Кімег Уміда, зці27теїд, Септапу). Тварин утримували при контролі температури з 12-годинними циклами день-ніч; їжу і воду надавали без обмежень. Відділ для тварин працює по ліцензії фламандського уряду з номером ГА1400536. Усі експерименти проводили в умовах, встановлених законом і дозволених Інституціональним етичним комітетом з експериментальних тварин (Заявка для етичного комітету ЕС2015-019).
Введення МНН і моноклональних антитіл, і стимуляція мишей РСВ
Мишей злегка знеболювали ізофлураном перед інтраназальним введенням УНН, палівізумабу або вірусним зараженням РСВ. УНН, палівізумаб (Зупадіх, Медіттипе) і вірус
РСВ вводили у загальному об'ємі 50 мкл в РВ5, який так само розподіляли між двома ніздрями.
Кожна група з п'яти мишей одержувала 30 мкг О5-Сам1-4, 30 мкг МНН О5-Сам!1-І 66, 30 мкг МНН-
Е2 (як негативний контроль) або 30 мкг палівізумабу (як позитивний контроль) за чотири години до зараження 1000000 БУО РСВ А2. Всі групи також одержали 30 мкг негативного контролю
УНН-РЕ2 через 24 години після зараження.
Визначення вірусних титрів в легені шляхом аналізу бляшкоутворення
Через п'ять діб після стимуляції мишей умертвляли, зміщуючи шийні хребці. Легені мишей вилучали асептичним шляхом і гомогенізували за допомогою енергійного струшування в міксері
МІ! ММ 2000 (Кеїзсі) у присутності стерильної металевої кульки в 1 мл НВБ55, що містить 20 Фо сахарози і доповненого 1 95 пеніциліну і 1 96 стрептоміцину. Гомогенати легені потім очищали за допомогою центрифугування (10 хвилин при 2500 об./хв.) при 42С і використовували у двох повтореннях для титрування вірусу на клітинах Мего. Моношари клітин Мего заражали 50 мкл серійними розведеннями 1:3 гомогенатів легені в 9б6-ямковому планшеті в безсироватковому середовищі Орії-МЕМ (Іпмігодеп), доповненого пеніциліном і стрептоміцином. Аналіз бляшкоутворення далі проводили, як описано вище. Підраховували бляшки в кожній ямці і розраховували для кожного розведення число БУО на легеню (1 мл) наступним чином: число бляшок, що є присутніми в розведенні х розведення х 20 (- 1000 мкл загального об'єму супернатанту/50 мкл супернатанту, використаного для зараження першої ямки з серії розведень). Число БУО в кожній легені потім розраховували у вигляді середнього від двох повторень.
Визначення вірусного титру в легені за допомогою ФЗАТ-ПЛР
Для визначення навантаження РСВ в легені за допомогою ЗАТ-ПЛР одержували тотальну
РНК з очищених гомогенатів легені з використанням набору Нідчй Риге ЕМА ТІЗБИОЕ (Коспе,
Мапппеїйт) за інструкціями виробника. кКДНК одержували з використанням випадкових гексамерних праймерів і набору для синтезу першого ланцюга кКДНК Тгапзосгіріог (Косне,
Мапппеїт). Відносні рівні геномної КДНК РСВ М визначали шляхом ДАТ-ПЛР з використанням праймерів, специфічних для гена М РСВ А? (КТСАСОААдпасСТоСАСАТАСАЗ і вра,асдаспаТСАТСаТтстТТТТтс3) і нуклеотидного зонда (2150 Опімегза! Ргоре І ібгагу, Коспе), міченого флуоресцеїном (БАМ) на 5'-кінці і з темною фарбою-гасником поряд з 3'-кінцем. Дані
ЯАТ-ПЛР нормалізували за рівнями мРНК тЕРІЇЗА миші, що є присутньою в зразках кожної. бо Перехресна конкуренція антитіл за зв'язування з О5-Сам
Білок 05-Сам'!1 (10 мкг/мл) був іммобілізований на біосенсорах АК2О за допомогою реакції зв'язування амінів в ацетатному буфері (рн 5,0). Реакцію гасили 1М етаноламіном, і біосенсори з іммобілізованим Ю5-Самі потім врівноважували буфером для аналізу (РВ5 з 1 95 БСА).
Біосенсори занурювали у конкуруючі антитіла (35 мкг/мл в буфері для аналізу), а потім в аналізовані антитіла (35 мкг/мл в буфері для аналізу) з короткою фоновою стадією між двома стадіями з антитілами.
Приклад 1: РСВ-нейтралізуюча активність в плазмі лами
Для того щоб оцінити індукцію гуморальних відповідей проти РСВ у лами після імунізації О5-
Сам1, зразки плазми, одержані до і після імунізації, тестували в аналізі нейтралізації РСВ.
Зразки тестували на нейтралізуючу активність проти РСВ-А2 і клінічного штаму РСВ В, РСВ
В49. Фігура 1 показує, що всі зразки плазми, одержані після четвертої імунізації, мають високу нейтралізуючу активність проти РСВ А?2 і РСВ В49.
Приклад 2: Виділення О5-Сам1-специфічних УНН
Проводили один раунд пенінгу для фагової бібліотеки УНН по білку О5-Сам!. Збагачення по ре-Сам1-специфічним фагам оцінювали, порівнюючи число фагів, елюйованих з ямок, покритих ре-Сам! з числом фагів, елюйованих з непокритих ямок. Число елюйованих фагів визначали опосередковано шляхом визначення трансдукуючих одиниць зі стійкістю до ампіциліну, тобто числа колоній ТО1, які були трансдуковані фагами, елюйованими на стадії пенінгу. Цей експеримент вказує на те, що популяція фагів була приблизно у 140 разів збагачена О5-Сам1- специфічними фагами. Дев'яносто колоній були вибрані випадковим чином і проаналізовані
ЕГІЗА на наявність МНН, специфічних для конформації Е-білка "до злиття" (05-Сам!) у порівнянні з конформацією Е-білка "після злиття" в їх периплазматичних екстрактах. Результат
ЕГІЗА показаний на фігурі 2. З 90 колоній, 37 колоній одержали позитивну оцінку (10 одержали позитивну оцінку за зв'язування з Е-білком і "до злиття" і "після злиття", 19 одержали позитивну оцінку за зв'язування з Е-білком тільки "до злиття" і 8 одержали позитивну оцінку за зв'язування 3 Е-білком тільки "після злиття"). Визначали послідовність МНН з усіх колоній, які приблизно зв'язувалися з Е-білком "до злиття" і "після злиття". Двадцять вісім клонів з 37 мали унікальну послідовність МНН і були вибрані для подальшого використання. Послідовності МНН цих клонів клонували у експресуючий вектор Ріспіа равзіогі5 і одержані плазміди потім використовували для
Зо трансформації Ріснпіа равіогів.
Приклад 3: Дослідження нейтралізуючої активності в супернатантах Ріспіа равіогіб
Автори також зробили спробу клонувати бібліотеку КДНК МНН, одержану після одного раунду пенінгу по 0О5-Самі, в експресуючий вектор рКаїб! Ріспіа рабвіогії5. Автори використовували цю стратегію для того, щоб спробувати відібрати біологічно придатних кандидатів МНН на ппідставі РОСВ-нейтралізуючої активності в супернатанті окремих трансформантів Ріспіа равіогіх. З 20 окремих трансформантів Ріспіа рабвіогі5, вибраних на підставі зв'язування з Е-білком, п'ять мали нейтралізуючу активність проти РОВ А2 (найбільш потужну відносно О5-Сам1-4), у той час як з 18 клонів, одержаних з бібліотеки, клонованої в рКаїб1, тільки один (МНН О5-Сам1-І 66) показав нейтралізуючу активність (фігура 3).
Послідовність КДНК Ю5-Сам1-4 і Ю5-Сам1-ї66 визначали секвенуванням за Сенгером, і нуклеотидна послідовність, а також виведена амінокислотна послідовність показані на фігурі 5.
Приклад 4: Одержання очищених УНН і визначення ІС5О
Перед очищенням, МНН О5-Самі-4 і МНН О05-Сам1-ї166 мали найбільш потужні РСВ- нейтралізуючі УНН, ії ці два УНН, а також негативний контроль МНН БГа2 ії Е58, одержували в культурах Ріспіа равіогіз по 300 мл і очищали за допомогою очищення на НізТгар з подальшою гель-фільтраційною хроматографією з зирегаєх 75 (фігура 4). МНН Е2 і МНН Е58 являють собою невідповідні контрольні МНН, одержані з бібліотеки УНН від іншої лами, яка була імунізована інактивованим вірусом Джунін. МНН О5-Сам1-4 і МНН 05-Сам1-І 66 нейтралізували РСВ АЗ2 іп міго з ІС50 0,021 нМ і 0,032 нМ, відповідно. Відносно нейтралізації РОВ В49 МНН О05-Сам1-4 і
БО МНН 05-Сам1-1 66 показали ІС5О 0,015 нМ і 0,032 нМ, відповідно. Щоб оцінити, чи можуть УНН р5-Сам1-4 і МНН 05-Сам1-І 66 нейтралізувати серотипи А і/або В метапневмовірусу людини, попередньо визначені кількості СЕР-експресуючих рекомбінантних вірусів ПМРУ (сублінія
МІ/1/00 АТ або сублінія МІ /1/99 В1, люб'язний подарунок Бернадетти ван ден Хуген і Рона
Фуше, Роттердам, Нідерланди) або СЕР-ПРСВ (штам А2, люб'язний подарунок Марка Піплса,
Колумбус, Огайо, США) (МОЇ 0,3 БУО/клітину) змішували з серійними розведеннями УНН або
МАТ і додавали в культури клітин Мего-118 (ПМРУ) або клітин НЕр-2, що ростуть в 96-ямкових планшетах. Через тридцять шість годин вилучали середовище, додавали РВЗ і вимірювали інтенсивність флуоресценції СЕР на ямку за допомогою мікроспектрофотометра для зчитування планшетів М200 Тесап. Значення флуоресценції були нанесені на графік у вигляді відсотка від контролю з вірусом без антитіла і використані для розрахунку відповідних значень
ІСво.
Приклад 5: О5-Сам1-4 і О5-Сам1-І 66 зв'язуються з Е-білюом РСВ у стані "до злиття", але не зв'язуються з Е-білком РСВ у стані "після злиття".
Для оцінювання зв'язувальної здатності О5-Сам1!-4 і 05-Сам1-Ї66б відносно Е-білка "до злиття" і "після злиття", автори провели ЕГІ5А, в якому Е-білок в кожній конформації наносили безпосередньо на планшет для мікротитрування і додавали на цей планшет серії трикратних розведень МНН (фігура 7А). Автори виявили, що МНН О5-Сам1-4 і МНН О5-Сам1-І 66 специфічно зв'язуються з нанесеним Е-білком у конформації "до злиття" і не зв'язуються з нанесеним Е- білком у конформації "після злиття". Для того щоб додатково охарактеризувати афінність зв'язування з Е-білком "до злиття", автори провели експерименти по зв'язуванню на основі 5РЕ.
Автори виявили, що обидва ІЗМО зв'язуються з Е-білююм РСВ "до злиття" з пікомолярною афінністю. Несподіваним був той факт, що ІЗМО демонструють таку високу афінність для своєї мішені, оскільки вони є моновалентними, на відміну від стандартних моноклональних антитіл, таких як палівізумаб або АМ14 (Сіїтап еї аї., 2015), які бівалентні по своїй природі. Зокрема, швидкість дисоціації О5-Сам1-4 дуже низька.
Також оцінювали зв'язування МНН О5-Самі-4 і МНН О5-Сам1-і66 з Б-білком, що експресується клітинами ссавців. Клітини НЕК293Т ко-трансфікували рСАс(о5-Езуп, що кодує кодон-оптимізовану кКДНК РЕ, і ресЕР-МІ 5. Клітини збирали через 18 годин після трансфекції і забарвлювали МНН О5-Сам1-4, МНН О05-Сам1-І66, негативний контроль МНН5 Е58 і 2 і моноклональне мишине антитіло Ідс, специфічне до РСВ-ЕБ. Зв'язування МНН з СЕР- позитивними клітинами в умовах ко-трансфекції порівнювали зі зв'язуванням з ОсЕР- позитивними клітинами, які були трансфіковані тільки вектором, що експресує СЕР.
Зв'язування, що не викликає сумнівів, спостерігали для всіх розведень МНН О5-Сам1-4 і УНН 05-Сам1-ї6б і для трьох найбільш високих концентрацій позитивного контролю з моноклональним антитілом, спрямованим проти Е РСВ (фігура 8).
Приклад 6: О5-Сам1-4 і Ю5-Сам1-І 66 зв'язуються з новим епітопом Е РСВ
Для того щоб дослідити, чи зв'язуються Ю5-Сам1-4 і Ю5-Сам1і-Ї66 з недавно описаним специфічним епітопом 2 Е-білка "до злиття" автори досліджували за допомогою
Зо інтерферометрії шарів, чи можуть ці УНН конкурувати з антитілом 025, специфічним до епітопу
ФО, за зв'язування з Е-білком РСВ "до злиття" (фігура 9). Конкурентний аналіз показує, що жоден 3 МНН не конкурує з 025. Напроти, обидва МНН конкурують один з одним. Ці результати вказують на те, що МНН зв'язуються з епітопами, що перекриваються, але ці епітопи відрізняються від епітопу Є від 025.
Додаткове дослідження епітопів для ІЗМО підтвердило, що ЮО5-Сам1і-4 і 05-Сам1-І 66 зв'язуються з тим самим епітопом на Е РСВ, з високою консервативністю структури (фігура 11А- р). На фігурі 11С підкреслені залишки стабілізованого в конформації "до злиття" Е-білка РСВ (повна відкрита рамка зчитування до процесингу іп мімо, ЗЕО ІЮ МО: 17), які контактують з обома, О5-Самі-4 і О05-Сам1-ії 66. Зокрема, наступні амінокислотні залишки Е-білка РСВ утворюють частину епітопу для Ю5-Сам1-4 і 05-Сам1-І 66: 150, 251, М/52, 5180, 2184, М185,
Р2б5, 266, Т267, М268, 0269, 0270, 1305, (307, М308, М345, АЗ46, (1347, К421, 5425, Ка27,
М428, К429, 5430, І431, 5451, (3453, М454, І 456, у458. Ці залишки представляють епітоп і для р5-Сам1-4, і для О5-Сам1-І 66. Додаткові деталі зв'язування петель СОК2 і СОКЗ показані на фігурі 12 (для О5-Сам1-4) і фігурі 13 (для О5-Сам1-І 66).
Структура Е-білка в конформації "до злиття" у комплексі з мотавізумабом, АМ14, 101Е і Ю5-
Сам1-4 виявила новий епітоп для зв'язування (фігура 14). Всі інші антитіла, для яких відома спільна кристалічна структура з Е РСВ, зв'язуються з цим епітопом, який відрізняється від того, з яким зв'язуються О5-Сам1-4 і Ю5-Сам1-І 66. Навіть антитіла, які конкурують за зв'язування з Е- білком РСВ, стабілізованим у конформації "до злиття", з 05-Сам1-4 (тобто АМ14 і палівізумаб) і р5-Сам1-І 66 (тобто АМ14, палівізумаб і 101) і для яких епітоп був однозначно визначений шляхом аналізу спільної кристалічної структури, зв'язуються з іншим епітопом в Е РСВ. Це показано на фігурі 14. Відзначимо, що палівізумаб і мотавізумаб зв'язуються з тим самим епітопом в Е РСВ, і що цей епітоп є присутнім і в стані "до злиття", і в стані "після злиття" Е-білка
РСВ.
Приклад 7: Дослідження профілактичної активності МНН проти РСВ іп мімо
Для дослідження того, чи може введення МНН О5-Сам1-4 або О5-Сам1-І 66 захистити від зараження РСВ іп мімо, самки мишей ВАГ В/с (п'ять мишей на групу) одержували 30 мкг УНН 05-
Сам1-4, МНН 05-Сам1-Ї66, Б2 МНН або палівізумаб інтраназально за чотири години до зараження 1106 БУО РСВ А2. Через двадцять чотири години після зараження, всі миші бо одержали 30 мкг Е2 УНН інтраназально. Через п'ять діб після зараження мишей умертвляли і гомогенізували легені в 1 мл НВБЗ5, доповненого 2095 сахарозою, пеніциліном (|і стрептоміцином. У мишей, яких лікували О5-Сам1-4, 05-Сам1-І| 66 або палівізумабом, не було реплікації вірусу, що виявляється, в легенях (за винятком однієї миші, яку лікували палівізумабом) (фігура 10 А) на відміну від групи, яку лікували Б2 УНН ії яка демонструвала високі рівні вірусу, що реплікується, в легенях (приблизно 1(105 БУС). Оскільки на аналізи бляшкоутворення, які використовували для кількісного оцінювання рівня вірусу, шо реплікується, в легенях, може впливати присутність нейтралізуючих антитіл або МНН, ми додатково кількісно оцінювали рівень РНК РСВ у гомогенатах легені шляхом ЗАТ-ПЛР. Миші, яких лікували Ю5-Сам1-4 і 05-Сам1-І 66, демонстрували в середньому більше ніж у 3000 разів менше вірусної РНК у порівнянні з контрольними мишами, яких лікували Е2. Миші, яких лікували палівізумабом, демонстрували в середньому приблизно у 100 разів менше вірусної РНК у порівнянні з контрольними мишами, яких лікували Е2.
Посилання 1. Сітап, М.5.А., єї аЇ. СНагасієгігайоп ої а ргейшвіоп-зресіїс апіїбоду їШаї гесодпіге5з а адиаїетагу, сівгахаде-дерепдепі ерйоре оп Ше ВАМ Твіоп аіусоргоїєїп. Ріоз Раїйод, 11, 1-17 (2015). 2. Ниїбегу, А., вії ам. Пата-адегімейа 5іпдіеє дотаїп апіїбодієз то рий тиймаїепі, зирегроїепі апа ргоадепеа пецігаїїгіпу апії-міга! тоїесшціев. Ріо5 Опе, 6, е17665 (2011).
З. МПи-Сегедніпо, у., еї ам. Сопдепзеєдй ргоїосої! ог сотреїепі сеї! ргерагайоп апа ігапзтоптаїоп ої Ше теїпуіоїорпіс уєаві Ріспіа равіогів5. Віотесппідиев, 38, 44, 46, 48 (2005). 4. Ме еап, 9.5., еї аІ. Зігисіиге ої гезрігаюгу зупсуйаї! мігив Тивіоп аіІусоргоївіп іп їйе роз'ив5іоп сопіотта!йоп гемеаїЇ5 ргезегмайоп ої пешігаїїгіпд ерпорезв. / Мігої, 85, 7788-96 (2011). 5. Мсі еїап, 4.5., еї аі. біписішге ої ВМ Тивіоп діусоргоївїп Мітег роипа ю а ргепвзіоп-5ресіїіс пецігаїїгіпуд апіїбоду. 5Зсієпсе 340, 1113-1117 (2013). б. Мсі еїІап, у.5., еї аІ. Зігисіште-разейд девзідп ої а тивіоп діусоргоївїп массіпе ог гезрігайгу зупсуїйаї! мігив. Зсіепсе 342, 592-598 (2013). 7. Зсперрепзв, В., єї арІ. Мапободієз зресіїїс тог гтезрігаюгу зупсуйаї! мігив Тивіоп ргоївїіп ргоїесі адаїпві іптесіоп Бу іппірйіоп ої Тивіоп. У. Іптесі Оів., 11, 1692-701(2011). 8. Зспоопоодне, 5., еї а). ЕПісіеєпі ргодисійїоп ої питап бБімаїепі апа імаІепі апіі-тисі Рар-5сім апіїродієв іп Ріспіа разіюогіз. ВМО Віоїеснпо)!., 9, 70 (2009). 9. Тап, Г.., еї аі. Те сотрагаїме депотісв ої питап гезрігаїюгу зупсуїйа! мігиз зибдгоирз А апа
В: депеїйс магіаріїйу апа тоіІесшіаг емоішіопагу дупатісв. у Мікої. 87, 8213-26 (2013).
Claims (6)
1. Імуноглобулін з одним варіабельним доменом (ІЗМО)), який винятково зв'язується з формою "до злиття" білка злиття (ГЕ) респіраторно-синцитіального вірусу (РСВ), який відрізняється тим, що вказаний ІЗМО у моновалентному форматі показує подібну нейтралізуючу активність для серотипів А і В РСВ, та тим, що вказаний ІЗМО містить послідовність СОКІ 5ЕО ІЮ МО: 1, послідовність СОМ2 5ЕО ІЮО МО: З та послідовність СОКЗ ЗЕО ІО МО: 5, або послідовність СОРК 1 ЗЕО ІЮ МО: 2, послідовність СОК2 5ЕО ІЮ МО: 4 та послідовність СОКЗ 5ЕО ІЮО МО: 6.
2. РОСВ-зв'язувальна конструкція, яка відрізняється тим, що вказана РеВ-зв'язувальна конструкція містить щонайменше один ІЗМО за п. 1.
З. Нуклеїнова кислота, яка відрізняється тим, що вказана нуклеїнова кислота кодує щонайменше один ІЗМО за п. 1.
4. Клітина-хазяїн, яка відрізняється тим, що вказана клітина-хазяїн трансформована або трансфікована нуклеїновою кислотою за п. 3.
5. Застосування клітини-хазяїна за п. 4 для одержання вказаного ІЗМО.
6. ІБМО за п. 1 або РСВ-зв'язувальна конструкція за п. 2 для застосування як лікарського засобу.
7. ІБМО за п. 1 або РСВ-зв'язувальна конструкція за п. 2 для застосування для терапевтичного лікування або профілактики інфекції РСВ.
8. Фармацевтична композиція, яка відрізняється тим, що вказана фармацевтична композиція містить щонайменше один ІЗМО за п. 1.
9. Фармацевтична композиція за п. 8 для застосування як лікарського засобу.
10. Фармацевтична композиція за п. 8 для застосування для терапевтичного лікування або профілактики інфекції РСВ.
В з Мет рація МЕМ ме. я : зе в ОВ ав к «ак Прп й Влукаааців Не де фон д те Пл З пак я сур жк Пет З івееьнаВЙ Ко бжоож ле, ча Піюпя 5 неученнцій С т й с К. ен т. г. то, шо те зак Мінхля В. вах некцій р І Ж в ща це : 4 зе Е й рак ж ше меннтрнтету В АСУ ще М ОК КОКОС я вже Бозвадорчаи пидами Я В зе вехипааніжями ВМО Бе ах ! ! Н зако Для КВК зі А р ж Геемя 2 пиунехацій ВК жо веж нія оку зе кла Я веун кацій гу хі р их ШУ те ечя я виуненШЯ хх ні - ж Во бакц я ші на Тксив В веунккцв Що / Е М ета о науноацій Ї ла о кове в В сеть Зоджойк сю я КООаа око, ІС Ся СИ: я коджвтадевнкя ЗУ щі пт ше ІТРГТТТРТТРИТе Ким вес он М кат не генних Ви Уже ання ФТРПКТРТІТСТТОТОТе ре еререереих и рн тях о Мерорннє. ення Ей еетюй Кос шю па що яжою фею от Модем пи Бесу їх оефгтМІМмсттттттх о Й Ж О0ожне яв Віпок після пиття» х сек ; нн тор ВО НИМ ЗЕ Ж Я мети БУ ши МДедТТМТМИ щЩ же. ДНО й дк Я. ен нпу Диннннннининнинниннининн ЕК МУ МааМмммм мм ккикиьмм щ нн иипкинкрнпте пенею пити х зпевпнт ее стіни ІЛЛЛЛИМЛИМММ ЛИ ЛИИИИМх, Ж Ки сеюююю Е й в конвой ПИВНИИ кіски п: щу г ОВО феееееееееех тости ме Зефоприс ие и КУ поле "Конт т тн нен он осссоваосввосовокккннннк хх "водінні НЕ СД КТ тот ПИВ КК Гея ж пе -К з ВВ, ТЕдЕ ак.
їх КАК СХ З АХ МИХ АХ ЩЕ ОК Я ММ М М НН ОО М В В КО ж ОМ В С ЗЕ В В В КК В В ки я 5 ОХ С. жо ОК З ЗЕ КОХ о о ВОВК ОК ОО В М о МО ПММ в М В В п КО ОО ПК КМ В кВ ОКО ЗБК З ОВ ВО ВВ С ВАВ 5 ОВ ОВ ПО УК КК Он В м в в ПВ КО ОО КК ОК ПО М В НК В В ПОБКОКВК ОО СОКОХ КО ще Ух з КВ ОВ Я МЕККА Ку В А В ЕВ М ОО с ОО МОН С о о Ве о. З КО ОК КМ КО ОККО ОО В В В С С ОО о о . що ОБО М 5. ОМС ОК ККУ с МК у Є хе ЗЕ В А че . 0. нн КК В с, В КО Ох о С . МОХ ОО шо У ява З У СОМ КК ОК КК КК КК ВК я Є З ОО Б ОО ВО В КО В ОК ЕК о. я КК Бона МК ОО КК КК КВ ува Б ОО ОВ Б Б В КО В В Ве В КН ЕВ КЕ В о.» Ох КК А ВК Я о ЗУ здко БК КОХ КК КО В М ОК й ще І 5 Кгй З х З 5 ОКХ С КК Ж ТУ ОХ 5 ПММ ХУ ОМ хг. З « хх : з З пово г зіва КУ КО КК: МК Ки ВАК ВАК КВ ше пев п В Б В В ща Ж КК В В В оо. ЗУ
55. що ВК М В В В МВВ я ее Я МКУ Коня ОВ х УМХ С ОО КК ВО І ж ОО ко о о. В - ВХ СО КО КО ОА В о 0. КО о У мав а ее по Пенн нн ОК ФЖО Ю пдррдевквеюю 8 Й но й Гелі Кенія сх. ення НЕ ТО МН сх в Ем лжй пт ї і й й ди х Й п Ез й і ІЙ х хи : ї Кі ж : НІ ї 7 І луки ; ц і її. хе г ще й он й ще ЩЕ й Е щк С хх о Ж їх Мк хе хх хе ж о І Я
Б. м 2 -е схе Сзиження Нія Та Плесо Галь амльтовців поса ей хх К тен и: т Й і ГУ хх х шк ЖЕ ; т- УНІЯ С: х їй 5 ї і і хе : хе 5 1. й у х -ї га Що І.
хи. Н З й Я і ї ш КУ пес, МроленнннюмАк, У ндтннмиляняя пелелттьтелильлии т кЕ п - -к тя а їх Ко хе сю БУ - 2 лих Сухакуюня Не Ка Гальвльтоція БЕ рацннкех пю хх ї их Ух ї УК їх Н шен: а хо Кі ті 2 ле і З о. 7 і І і Хе. ; ск : у 1 Х х хе х Ук І г чис В х Її ху; 1ї нн Б Я Шо |! ї аа КІ Б хз Варни х ей аж нн жжнтннюююттня р: У хе Ух хи хо х чу хе хе У ки са «о щ галь лімивткняа КВ ке - й Гальуклюття ЕВ 7 смшщенни Мр КА уко: Соч Я г: х. ШЕ ! Ї І : сх ! им оз 1 в вне | че ув і 87 с де ДЕ Н ке ї ее З Я й хм В М Боже ї -ї | й жі й з і . спекти. Й сн КОНЯ 7 КО КІ с Б ах. ше Ко ше ВХ т я жа
ЯК. В іпрадеюеюєююи!
А бкесСяо У МКС УЛОИМ УМ МНН ТЕ ОН ОТО АМАСТ МТК ОМА МАС ТЕ ТОДАТТАТІАТТЕЮВ МУКА ТИХ АЛУНСК ММАКЯ УЗА САТ В МИТА ЗТ АКВА ТК ОК КТ АВАХ ТУТ АКАИААТО ВО АДЮ КИ АЗК ХАТА ПЕКААК КТ МИКИТА ТК КАСАХ ВАТА МЕ КК КО АТАО ОС АМО МТМ ОВК МК ПОВИ СИ МКК КО КК Е МТА а ОБ х Мах ПИМОНЕНКА ЕНИХХ КК АТТ АСТМИ АТІАТ ТТ ОК КОМ К КАК КВК АКОТ АТГАТТАНТ А ТОНН КК КАК АЮ А ТАНКИ У ПИВА МУЧИТИ МАМИ КАСА МІМІКА ВОМУ АРКТИКИ ЗАМКА АМІ ХАТІ ЗИМИ КАН КАТКИ ВАМИ ККУ ОДУ ОІВ КК ТК ПК КА ВАМ МИХ ТАКА АЛ ТАКУТ ЕК г у Ж. т ІОЬеКь щу КИ, КІ ВІ ВИВАЖЕНИХ Я ДЕК МЕ ЛЕМ УВІ ВО ААВИЕТУЮТ У УДК ЗЕ ОДЖИЦІ Я БУКЕВЕАХЦИ ЗО ОВК ТУТ УМОВ ВДОМА ВЕ ДОМОВУРІІЕ МЕКЕЕВОУКО ЕН АВЕХХОВЕ РІ ВМО МАКНУХХ ДЕ тити тину 22 хх Б «ка ся Фея З ИУДЕКЕВХ КТ ИІ Я ВЕ КККОНО У Му ЕК ТВ ЇСТЕ ОБОХ КеЕДІ ХХ САМУВ ВМ ВИВИХ дитя У УНН ЗМ Еодеож УХУКОМННННМ ех. 3 їк 14 5ууч зу сх а
«. НЕнтемнціВ ВЕУ АХ «ке БО Сахі Я й 5 х ля КК В Ка Яд, - зе пи З КАК оонов Е се І і ей дою У ги тк АМОХ їх - їй ж , | ії й клад Аллрклдраукклдклуя де о шк а ок ка яю М Й Си я С С о ЗМ их В КО ша о ь ; ТЯ МНЕ І3- Кс Ментраніація КУ еВ : К тре СИВУ Я Е Й х ж СеРН пе яю НЕОН зо Ж / Ше АТЛЬЬ сявача де їз чі зе ІД КЗ г у Я « С Ша: - і зе ПД хх. Ех Її; КУ во сн ВМХЕ Ж і Кк А її Ї ї Г.Й, ж їі ; ой и пре оф С К хусттнукккюююкуюх. уд ий та кос ан й НІшИ
ФЕМ. Ж
« їх невинна: її Вч ВОЮ І: Н і і ТТ ви Я ї ОТВАНМИ ям ВЕМА Е й я Ки а ВИНК литих Н ОВЕН НЕ она ЕКОН КВН І паю Б БО Бал рН : ї Н : Я ! : : ов и зви по ЛВ мов ВНТ ГМО Ка СТО ВОВК ЖІ Не пил Еф вт орденів нннніннн нн Енн ин Н м пам ни Іа ТЛЯБ Ра РА ОО щОВх І і : В ї Н ї Н Н Н М ПИ ук вв Е пе о Кк о В В КИ в нн п а о а о ооо по НЕМ КР АСВУВ ЕВ УВУ ПАБ АаКВ. сен АК, ллчютоют т ок ккал жнджкажна А у ТАК рик а А я нАЖчяж нях УНН "ВНУ БЕ я ЕХ Ще БКШЖНЯ тота СУКИ на: ХОНКХ КК КВа. щівЕЕ ще зна ЩІ КЕ Ме 855 ща заЕрщех ща ща за Мотавізумен Ве СХ а рова ПО МН МКК вод ку о и куки ЧЕ» зе вима чається "ДЕ леляк соєю момоклованнк ЗМТяТМо, хатами нудне да гляну НКУ
ЗК. в Здирсдодювнихі КЗ ву уУ тн - с у сте ТінтозкВ Се ев наунмя я ГЯХлкОВ до ами» дрож це сан. ПУБ Е й за ПІНУ КВ ах БК ее. ча о и шк Мн й -к с ща т . (Ох і а и ух р С и АК и и і В «вх не ше ХК Сас нь НЯ ВМ ВВ ясувиннява Б юю яиНолВ ВУР ун Зах ЩЕ «ее ТЮрУ Я. я зак МОВ нів а З НК , Н 7 З Ь, Н 4 Н Ї ЯКІ ороонююютрнмровюююрк ую умювртнуюх с и о ех а я нещя ФКО в Зе язування СКСЕУТЕ я Зеагакування ВО света Еосілякма кою зпиттях Бойка ке ЗВИиТІНе Хил ув УМ Ха ВМ р шо дз ЛЛУМЕ орасй - щу ВК М ЖЖ паж р дика дО ув пад Он " оон фак Вуду Ко шк | га ж тя Доттеккж ктоеет нка. І же ще; ви Снане НИ БИ Шо хщ ран ак В і х. пої В КУ ш т кон кскютннкннннннннн - че й Я ожкожи кіннихию шо за ЯН Ки ОК коти 5 в.о «5 и 5 5- ; х ОХ. ЖЕО Бреченчркухюдктьсхчеу її нний по ожа мхжо с5; Ж я БО БЖЮ ЖЖ СжКО Мас Мав За язування ОМ В Зв'язування МИСУ ЦК а ЕЕ спе вя З ЯХ ЕВ кивок зе ко з Ж т ві ЖЕ пк 3 не чі Н ї ЛК а щ Ж Я ло лк Ж ру Код итютттт с квккккккКККАВКАМАККККККККА що в. ХУ од днини жккКАкККАКК КК ок Бо Ек осот восавсвь о ЕНА вав са соте вн ще ж а же ово що ЧвсеЯсі чао ЗУ З іфімродовженкку В ж, Зв'язування з клітинами ІКЕЕ КЗ З хх ж з о х ре Аг у ех З вв. ХНУ МИ а ОБО ав ЗЕ ВАК МИ ї | а що огни СІ ж зі мкомя шо Ї : з х : ; З стр ухуеди шо. СОКИ вами : ее з У у Н ТС щ Фо 6. І Ж пу ЗВУ н ма ж де зе сх Я й Як Ж й ще 0ОЯЖ щ я Фе в ож у КЕ Б я я Со р У хз : Фе В щВ що Вас чаду свання іт ще ГК з. : М ККУ ККУ МУХ КУ ЕЕ визраання укатинами КУ ме а СЕ ЖЕ : ос соя ОХ сту шо 10 меми 5 як тв БО я мами о МВ ці сік ОО СОМ векгяму Ж «я г тро ЯаКНТІ у ВОК ОХ ЖУКИ ВІККЕТ., кі кН Кк СТЗНШеЯ У і а ме Й БОБ І Сей де -е Ка й са ЕЕ а К- р до ре роя ат. В
Ладу й ! п виалюНННУа х ди как АЖ ОК В ї В. Боня ні Во соя ни о о по не : ї25 : ОоБшаяе СОБй БО ЇООБВ В с нн ШЕ 08 й о вина В / ш ше ов іо Мемх Ворон нині а ! т ЖЕНЯ ораєвжвь МБО ше. те шо ин ке БЕК а й ша 1 КК : я ї Ж х ш с СЯ В рою «й соя з а - х з 5, ЖЕ хх и Е: й Ж Ум, Ух. пдчатесстноніпріннетнстіпротончонентесртеснос Які в : я -й я а як З КО й я Ш и З ; с ві а В с б КІ Е є шо щ Е В - я кова щі АК З З хх -й- ж ня Е бо - хх «ВХ сееутуєннння -ї поптееоезеетессесаттоссо і ту дреннокінвооостодпесосокя ре ши «й - сік Я
ВЕК. В к Тілазж лвлицивні чу оочіх зак ІВ ГІлошЄ пИвХоНВНОМ как: Непроаїюмеві З Ме 36 А Налекитнарі Я Ки ВА Напротоман я Би Вовчи наБА Завншжи на БУ КК, вих контактують хкнанопном МІТКУ УА МНК ВМ У ХНА Ки МИЛИХ КА КЕ Ве ВЕ ТНК ВАК а и и М КЕ о и НН ОК ОН Уа и в В С о а нау ЕК а Я І ИН БАЗУ КОМ Си у ІМТ Меп ВИХ ОКХ ТЕ УК УТА ВНИМ КТ ВН ВИМ УЮ ТИЖНІ ТУ Е УНІ АПК ОеБАРІВКИКОЮ В Кіирьн: злуки» запа ЗО НОТО бек имх ее У КК ей пПлазра прихованої поаеиені Ма вреоамер і БАН АХ На протоме З бе НАХ Натриннлері я Ко ОА Вила: тА Зимтищи на МУ КЕ хна контек унуєь З нанегилом хни вагу му Кона нє З ном о Я и З ИН ВК КН жна КА о ой Не З Кене мон ПДВ ВІ ММК ВОВК КІМ У МЕ В ЗКЕМИХ БЕМУШО НИКОМ ІІ И Во ШТ ВЕК ЗНАВ о не В и КЕ в НАВ В ев КЕКСІВ ВІ ММ ВІДТІК КІМ ТЕ ОВО МАЧеУІВВОВ Ву ІНКІВ ХІКВОИ ВУ ЕТ ВК Ат УКВ КК ЖК Ю вика ни и о и н К и я ШКІВ ЗшИ ЦІ
ВЕНИ ТИ МОЖЕШ ЛаМХ ЕТУТІАУТЕ СБ ІВЕ ВЕДИ ЖАХ ШУМЖТВАСЮІ ЩеХТУЧИТІВ шо МЕМТКЕКИЄМ ДРОДКІКЦТКО ДЮКА КМ ТЕРИ КАТОНВВЕЖЮЕ ПВЕК ШТ оЖКИК ВУ МЕВМВИКЦОЮ дІУЄА КВ ПТО МУМНе ШУ ТКНиІКий СИШТМЕАУМУЕ ЗА БЕК МООКИКИХТХ БОМІРХ ММК ДФ ОПОКУЄ ТЕТ ОУКНЕВІ МЕКТВКТЮТХ ЯР ОЛОТУТЕТАЖХ МУЩИМНЛЯасМх ХМОМБІШОУ НЕЕМЕЗЧУДХ ЗИМІ ЯХКЕЕЧОЕХ ппдОМЦ ли ЕС ЛЕМ ВМ МОП КІМИХ В КЕЛИХ ЛЯШЕ УТОМИ КВУ ВОЗА ДОМЕННЕ ДИТИНИ. ШУНШИЮТНЬ ПОФУМИ ОКУ, ІЕА МУЛКЛНКЦЄМ ДІМЖЕЩК УПМ ИДт ДеДМІБЕЕИК БуЖЧКаКУХЕ ШЕМУВНИЖХУЄ ЯКЕ Ме УКИО ВІМОУКЖКІК ДЕДеМОУЖИЕУ. БЛОКА ТНЕЖТ БУЛВЕМОЮТХ УМЕЛКЦИ ТМ. пд ВУ КНТК шинах иаю каное х пкт му КОКО вх ящ ВХ, «ее кВ В Я З КК ОКУ ИЙ с ВХ Є ВКА ЗК У ККУ я ж оди ОКОМ З М Ух ХУ В КВ КК КК В Є КК КХ з ЗО ж КеХ ОКО за УЗ С ЗИ Ж МО КК А КК КУ М хх ВМО м М ш М МВА КМ у ОН М АНЯ М ОХ Я ОО В ВВ БОБММММОМН Її ОО ЗО ан Іа А В ІА Кох ЯК ЖЕК КВ Зх Сх а й Оки о жа ОМ КА а В. ВК Ку УНК ОВУ жу ЗМО МВ КК М Й В У КО АОНО ЗОИ МОМ КК Я еВ ХК КО З МО о В ОК Я І МС СО ЗАЙ У ко Й МОЖ ОК У МО мк х СІ ков х Се вс 14 їх Б ОК Ме М ке Ж їж ХУ Ка ММК вУ ОК ви ОХ гер че, чи сеяю. МК КдУ НЕ
Ь. а СК а щх зхкккюю ЖЕ пи
ЖЕ. Я. (зумодевжхкиозухі
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562181522P | 2015-06-18 | 2015-06-18 | |
| EP15178653.0A EP3124042A1 (en) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | Immunoglobulin single variable domain antibody against rsv prefusion f protein |
| EP15191868 | 2015-10-28 | ||
| PCT/EP2016/064218 WO2016203052A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-06-20 | Immunoglobulin single variable domain antibody against rsv prefusion f protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA123584C2 true UA123584C2 (uk) | 2021-04-28 |
Family
ID=57545045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201800478A UA123584C2 (uk) | 2015-06-18 | 2016-06-20 | Імуноглобулін з одним варіабельним доменом проти f-білка pcb |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10501528B2 (uk) |
| EP (1) | EP3313432A1 (uk) |
| JP (1) | JP6836760B2 (uk) |
| KR (1) | KR20180056631A (uk) |
| CN (1) | CN108472343B (uk) |
| AU (1) | AU2016277887B2 (uk) |
| BR (1) | BR112017027303A2 (uk) |
| CA (1) | CA2989378A1 (uk) |
| CL (1) | CL2017003260A1 (uk) |
| HK (1) | HK1254779A1 (uk) |
| IL (1) | IL256315B2 (uk) |
| MA (1) | MA42246A (uk) |
| MX (1) | MX2017016590A (uk) |
| MY (1) | MY192870A (uk) |
| PH (1) | PH12017502356B1 (uk) |
| RU (1) | RU2730671C2 (uk) |
| UA (1) | UA123584C2 (uk) |
| WO (1) | WO2016203052A1 (uk) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180056631A (ko) * | 2015-06-18 | 2018-05-29 | 브이아이비 브이지더블유 | Rsv 프리퓨전 f 단백질에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체 |
| CN111808187B (zh) * | 2019-08-02 | 2022-05-17 | 苏州高泓利康生物科技有限公司 | 针对呼吸道合胞病毒的蛋白结合分子 |
| CN116063468A (zh) * | 2022-08-30 | 2023-05-05 | 武汉班科生物技术有限公司 | 中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体及应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1997830A1 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-03 | AIMM Therapeutics B.V. | RSV specific binding molecules and means for producing them |
| EP3508505A1 (en) * | 2007-12-24 | 2019-07-10 | ID Biomedical Corporation of Quebec | Recombinant rsv antigens |
| DK2285408T3 (en) | 2008-06-05 | 2019-02-04 | Ablynx Nv | AMINO ACID SEQUENCES AGAINST COATING PROTEINS IN A VIRUS AND POLYPEPTIDES INCLUDING THESE FOR TREATMENT OF VIRUSAL DISEASES |
| SG176095A1 (en) * | 2009-06-05 | 2011-12-29 | Ablynx Nv | Monovalent, bivalent and trivalent anti human respiratory syncytial virus (hrsv) nanobody constructs for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections |
| US8568726B2 (en) | 2009-10-06 | 2013-10-29 | Medimmune Limited | RSV specific binding molecule |
| EP2507262A1 (en) * | 2009-11-30 | 2012-10-10 | Ablynx N.V. | Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections |
| KR20180056631A (ko) * | 2015-06-18 | 2018-05-29 | 브이아이비 브이지더블유 | Rsv 프리퓨전 f 단백질에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체 |
-
2016
- 2016-06-20 KR KR1020187001595A patent/KR20180056631A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-06-20 MA MA042246A patent/MA42246A/fr unknown
- 2016-06-20 EP EP16736013.0A patent/EP3313432A1/en active Pending
- 2016-06-20 JP JP2017565829A patent/JP6836760B2/ja active Active
- 2016-06-20 MX MX2017016590A patent/MX2017016590A/es unknown
- 2016-06-20 UA UAA201800478A patent/UA123584C2/uk unknown
- 2016-06-20 CN CN201680046838.1A patent/CN108472343B/zh active Active
- 2016-06-20 RU RU2018101662A patent/RU2730671C2/ru active
- 2016-06-20 MY MYPI2017001883A patent/MY192870A/en unknown
- 2016-06-20 AU AU2016277887A patent/AU2016277887B2/en active Active
- 2016-06-20 CA CA2989378A patent/CA2989378A1/en active Pending
- 2016-06-20 IL IL256315A patent/IL256315B2/en unknown
- 2016-06-20 US US15/736,663 patent/US10501528B2/en active Active
- 2016-06-20 BR BR112017027303A patent/BR112017027303A2/pt active Search and Examination
- 2016-06-20 WO PCT/EP2016/064218 patent/WO2016203052A1/en active Application Filing
-
2017
- 2017-12-18 PH PH12017502356A patent/PH12017502356B1/en unknown
- 2017-12-18 CL CL2017003260A patent/CL2017003260A1/es unknown
-
2018
- 2018-10-30 HK HK18113825.4A patent/HK1254779A1/zh unknown
-
2019
- 2019-09-10 US US16/566,542 patent/US11248039B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20200102374A1 (en) | 2020-04-02 |
| PH12017502356A1 (en) | 2018-06-25 |
| KR20180056631A (ko) | 2018-05-29 |
| US10501528B2 (en) | 2019-12-10 |
| CN108472343A (zh) | 2018-08-31 |
| IL256315B1 (en) | 2023-08-01 |
| MA42246A (fr) | 2018-05-02 |
| CL2017003260A1 (es) | 2018-05-11 |
| RU2018101662A3 (uk) | 2019-11-06 |
| RU2018101662A (ru) | 2019-07-22 |
| WO2016203052A1 (en) | 2016-12-22 |
| JP2018524979A (ja) | 2018-09-06 |
| MY192870A (en) | 2022-09-13 |
| US11248039B2 (en) | 2022-02-15 |
| AU2016277887B2 (en) | 2022-06-09 |
| CA2989378A1 (en) | 2016-12-22 |
| BR112017027303A2 (pt) | 2018-09-04 |
| IL256315A (en) | 2018-02-28 |
| RU2730671C2 (ru) | 2020-08-24 |
| HK1254779A1 (zh) | 2019-07-26 |
| IL256315B2 (en) | 2023-12-01 |
| PH12017502356B1 (en) | 2018-06-25 |
| AU2016277887A1 (en) | 2018-01-18 |
| MX2017016590A (es) | 2018-11-09 |
| CN108472343B (zh) | 2021-12-10 |
| US20180179266A1 (en) | 2018-06-28 |
| JP6836760B2 (ja) | 2021-03-03 |
| EP3313432A1 (en) | 2018-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10723786B2 (en) | RSV-specific binding molecule | |
| CN113874394B (zh) | 抗体 | |
| KR101671452B1 (ko) | 항ｒｓｖ ｇ 단백질 항체 | |
| CN102712692B (zh) | Rsv-特异性结合分子 | |
| US20080241162A1 (en) | Human monoclonal antibody fab fragments directed against hcv e2 glycoprotein and endowed with in vitro neutralizing activity | |
| US20160130336A1 (en) | Anti-vegf antibodies and use thereof | |
| KR20110047193A (ko) | 중화 항-인플루엔자 ａ 바이러스 항체 및 이의 용도 | |
| KR102122618B1 (ko) | 인플루엔자 중화를 위한 작용제 | |
| KR20160119806A (ko) | 신규한 온전한 범위의 항-뎅기 항체 | |
| US20170158753A1 (en) | Monoclonal antibodies directed against envelope glycoproteins from multiple filovirus species | |
| EP3992205A1 (en) | Sars coronavirus-2 spike protein binding compounds | |
| CN116693673B (zh) | 广谱抗SARS和SARS-CoV-2的纳米抗体、多价纳米抗体及其应用 | |
| UA123584C2 (uk) | Імуноглобулін з одним варіабельним доменом проти f-білка pcb | |
| CN114174331A (zh) | 结合人类偏肺病毒融合蛋白的抗体及其用途 | |
| US20230312689A1 (en) | Human antibody or antigen-binding fragment thereof against coronavirus spike protein | |
| WO2022140422A1 (en) | Llama-derived nanobodies binding the spike protein of novel coronavirus sars-cov-2 with neutralizing activity | |
| KR20140116416A (ko) | Ｈ１ｎ１―감염된 환자들로부터 유도된 매우 잠재력 있는 넓은-스펙트럼 중화 단일클론 항체 및 이를 포함하는 바이러스의 치료용 조성물 | |
| WO2021197340A1 (zh) | 用于治疗冠状病毒的抗体、融合蛋白及其应用 | |
| WO2022023292A2 (en) | Corona virus spike protein-targeting antibodies and use thereof | |
| Li et al. | N-terminal residues of an HIV-1 gp41 membrane-proximal external region antigen influence broadly neutralizing 2F5-like antibodies | |
| US10435463B2 (en) | Hepatitis C virus specific antibody | |
| US20240002477A1 (en) | Polypeptides for detection and treatment of coronavirus infection | |
| CN104628850A (zh) | Rsv-特异性结合分子 | |
| WO2022106205A1 (en) | Corona virus spike protein binding compounds | |
| WO2018106712A1 (en) | Arenavirus monoclonal antibodies and uses |