KR20180056631A

KR20180056631A - Rsv 프리퓨전 f 단백질에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체

Info

Publication number: KR20180056631A
Application number: KR1020187001595A
Authority: KR
Inventors: 사비에르 세렌스; 베르트 쉐펀스; 이베 로세이; 바니 그레이엄; 제이슨 맥레런; 모건 길먼
Original assignee: 브이아이비 브이지더블유; 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈; 우니베르지타이트 겐트; 트러스티스 오브 다트마우스 칼리지
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2018-05-29
Also published as: CN108472343A; PH12017502356B1; AU2016277887A1; HK1254779A1; AU2016277887B2; US11248039B2; IL256315B2; RU2018101662A; WO2016203052A1; US10501528B2; IL256315A; US20180179266A1; JP6836760B2; CN108472343B; US20200102374A1; RU2018101662A3; JP2018524979A; EP3313432A1; CA2989378A1; BR112017027303A2

Abstract

본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 에 대항되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 에 관한 것이다. 더 구체적으로, 이는 RSV 의 융합 (F) 단백질의 프리퓨전 폼 (prefusion form) 에 결합하는 ISVD 에 관한 것이다. 본 발명은 또한 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 이러한 ISVD 의 용도, 및 이러한 ISVD 를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

RSV 프리퓨전 F 단백질에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인 항체 {IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAIN ANTIBODY AGAINST RSV PREFUSION F PROTEIN}

본 발명은, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV: respiratory syncytial virus) 에 대항되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD: immunoglobulin single variable domain) 에 관한 것이다. 더 특이적으로, 이는 RSV 의 융합 (F) 단백질의 프리퓨전 폼 (prefusion form) 에 결합하는 ISVD 에 관한 것이다. 본 발명은 또한 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 이러한 ISVD 의 용도, 및 이러한 ISVD 를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

호흡기 세포융합 바이러스는 영유아 및 소아에서의 급성 기도 감염의 가장 중요한 원인이다. 2 세까지 거의 모든 어린이는 하나 이상의 호흡기 세포융합 바이러스 감염을 겪을 것이다. 비록 일반적으로 오로지 가벼운 질환만을 야기하기는 하지만, 환자의 일부 (1-2%) 에서 RSV 감염은 입원이 요구되는 심각한 세기관지염을 야기한다. 매 해 160.000 명의 어린이가 RSV 감염으로 인해 사망하는 것으로 추정되고 있다. 효과적인 예방적 (prophylactic) 백신 및 RSV-특이적 치료적 소분자가 임상적으로 개발되지 않았다. 고위험 영유아가 예상된 RSV 감염에 의해 야기된 심각한 질환으로부터 일부 보호될 수 있는 유일한 방법은, RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 (prefusion) 및 포스트퓨전 (postfusion) 형태에 대항되는 인간화 마우스 단일클론성 항체 (팔리비주마브 (palivizumab)) 를 사용한 한 달에 한 번의 주사하는 것에 의한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 항체를 사용한 치료는 비싸고, 오로지 예방적 세팅에서 사용된다. 여러 기타 RSV F 단백질 결합 작용제, 예컨대 프리퓨전 특이적 단일클론성 항체 (Gilmans 등, 2015; McLellan 등, 2013), 및 RSV F 단백질 결합 ISVD 가 개발되고 있다. 그러나, 기재된 ISVD 는 RSV 혈청형 B 에 대항해 약한 중화 (neutralization) 활성을 갖고/갖거나 다가 포맷화 (formatting) 가 ISVD 를 강력하게 만드는데 요구된다 (WO2009147248; WO2010139808; WO2011064382; Schepens 등, 2011; Hultberg 등, 2011).

최근에, RSV F 단백질의 프리퓨전 형태에 특이적으로 결합하는 통상적인 항체가 F 의 포스트퓨전 및 프리퓨전 형태 모두를 결합시키는 항체보다 훨신 더 강력한 시험관내 RSV 중화제라는 사실이 밝혀졌다 (WO2008147196, US2012070446, McLellan 등, 2013). 그러나, 통상적인 항체는 생성하기 번거로울 수 있고, 이의 안정성이 제한될 수 있다. 또한, 이의 비교적 큰 크기로 인해, 통상적인 항체는 착물 샘플에서의 이의 동족성 에피토프 (cognate epitope) 인식에 있어서, 또는 기타 항체 및 리간드가 이의 에피토프의 부근에서의 부위를 차지하는 경우에 장애가 될 수 있다.

이에 따라, 및 이용가능한 폭넓게 허용되는 치료가 없으므로, RSV 감염의 효과적인 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있는 강력한 항-RSV 약물에 대한 미충족된 요구가 존재한다.

놀랍게도, 1가 ISVD 는 두 RSV 혈청형 (A 및 B) 모두에 대항해 강한 중화 활성을 가질 수 있음이 밝혀졌다. 문헌은 다가 구조체가 RSV 의 혈청형 모두의 강력한 억제에 요구된다는 것을 제안하므로, 이는 예상치 못한 결과이다. 따라서 본 발명의 목적은, 프리퓨전 형태에 대해 독특한 RSV F 단백질의 에피토프에 대항되는 ISVD 를 제공하고, 이에 따라 RSV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 매우 강력한 ISVD 를 제공하는 것이다.

본 발명의 양상은 RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 폼에 특이적으로 결합하는 ISVD 를 제공하는 것으로서, 상기 ISVD 가 RSV 혈청형 A 및 B 의 유사한 중화 활성을 1가 포맷에서 나타내는 것을 특징으로 한다.

한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR2 서열, 및 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하고, 여기서 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 은 상기 각각의 SEQ ID NO 중 임의의 것과 1-, 2- 또는 3-아미노산 차이를 갖는 ISVD 를 구상한다.

또다른 양상에 따르면, 본 발명은 또한 상기 기재된 하나 이상의 ISVD 를 포함하는 RSV 결합 구조체에 관한 것이다.

또다른 양상에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 하나 이상의 ISVD 를 인코딩하는 핵산을 구상한다.

보다 또다른 양상에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 핵산으로 형질전환 또는 트랜스펙션 (transfection) 되는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 구상되는 것은, 상기 기재된 ISVD 의 제조를 위한 상기 기재된 숙주 세포의 용도이다.

또한 구상되는 것은, 약제로서 사용하기 위한, 특히 RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방에서 사용하기 위한, 상기 기재된 RSV 결합 구조체 또는 상기 기재된 ISVD 이다.

또다른 양상에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 하나 이상의 ISVD 를 포함하는 약학 조성물을 구상한다. 또한 구상되는 것은 특히 RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방에서, 약제로서의 상기 약학 조성물의 용도이다.

본 발명의 목적은 뒤따르는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

도 1: DS-Cav1 로 면역화된 라마 (llama) 로부터의 혈장 중 중화 활성. RSV A2 (A) 및 RSV B49 (B) 에 대항하는 중화 활성은, DS-Cav1 에 의한 상이한 면역화 이후 수득된 혈장에서 시험되었다. 96-웰 플레이트에 파종된 Vero 세포의 단층은, X-축에 나타낸 바와 같이 3 배 희석된 및 8 배 희석으로 출발하는, 라마 혈장의 존재 하에, RSV A2 또는 RSV B49 로 감염되었다. 각각의 웰에서 플라크의 수를 계수하고, Y-축에 나타내었다. Pre DS-Cav 1 은 면역화된 라마의 면역전 (pre-immune) 혈청에 해당한다.
도 2: 정제된 재조합 RSV 융합 단백질 (F) 에 결합하는 VHH 의 선택. ELISA 플레이트는 DS-Cav1 (회색 막대, 프리퓨전 F), 포스트퓨전 F (검정색 막대) 또는 BSA 에 의해 코팅되었다. 플레이트는, DS-Cav1 면역화된 라마의 PBMC 로부터 생성된 VHH-디스플레잉 파지 라이브러리 (VHH-displaying phage library) 에 의한 DS-Cav1 에 대항하는 패닝 (panning) 1 라운드 이후 수득된 pHEN4-VHH 형질전환된 TG1 이. 콜라이 (E. coli) 세포로부터 제조된 박테리아 원형질막 주위 공간 추출물과 함께 인큐베이션되었다. 그래프에서, F 단백질에 대한 결합은 BSA 에의 결합에 대한 OD450 값의 log2 비율로 나타내어진다.
도 3: 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 상청액에서 RSV 중화 활성의 검출. pKai61-VHH 피. 파스토리스 (P. pastoris) 형질전환물은, 24 시간 동안 24-웰 포맷에서 2 ml YPNG 배지 중에서 예비 배양되었다. 이후, 세포를 48 시간 동안 YPNM 배지 중에 두어, VHH 발현을 유도하였다. 맑아진 배양 상청액의 1/60, 1/600 및 1/6000 희석액은, Vero 세포의 단층을 접종하는데 사용된, RSV A2 (30 PFU/웰) 와 혼합함으로써 중화 활성에 대해 시험되었다. 박스들은 중화 활성을 갖는 피. 파스토리스 클론을 나타낸다. (A) 숫자로 나타내어지는, 특유의 pKai61-VHH 플라스미드의 선택 세트에 의한 형질전환 이후 수득된 피.파스토리스 클론. (B) 후보 F-특이적 VHH 의 라이브러리가 클로닝된 pKai61 로 형질전환된 이후 수득된 피. 파스토리스 클론. L3, L13, 등은 개별적 피. 파스토리스 형질전환물을 나타낸다. 박스표시된 웰은 RSV-중화 활성을 갖는 샘플을 나타낸다.
도 4: 피치아 파스토리스에서 생성된 VHH 의 정제. pKai-VHH-DS-Cav1-4, pKai-VHH-DS-Cav1-L66, pKai-VHH-F2 또는 pKai-VHH-F58 로 형질전환된 피.파스토리스 세포의 배양 배지는, 96 h 동안 메탄올에 의한 유도 이후에 수확되었다. 무(無)-세포 배지의 재용해된 암모늄 술페이트 침전물은, HisTrap 컬럼 상에 로딩되었고, 세척 이후 컬럼은 이미다졸의 증가되는 농도 구배에 의해 용리되었다 (좌측). HisTrap 컬럼으로부터 용리된 피크 분획은 이후 Superdex 75 겔여과 컬럼 (gelfiltration column) 에 로딩되었다 (우측). 크로마토그래피는 VHH-DS-Cav1-4 (A), VHH-DS-Cav1-L66 (B), VHH-F2 (C) 및 VHH-F58 (D) 에 대해 나타내어진다.
도 5: VHH-DS-Cav1-4 (A) 및 VHH-DS-Cav1-L66 (B) 의 뉴클레오티드 서열 및 피. 파스토리스에서 생성된 재조합 VHH-DS-Cav1-4 및 VHH-DS-Cav1-L66 의 예상된 아미노산 서열 (C). 상보성 결정 영역 (CDR: Complementarity Determining Region) 및 His tag (6xHIS) 는 라벨링된 박스로 나타내어진다.
도 6: VHH-DS-Cav1-4 및 VHH-DS-Cav1-L66 은 강력한 RSV 중화 활성을 갖는다. Vero 세포는 정제된 VHH (VHH-DS-Cav1-4, VHH-DS-Cav1-L66 또는 네거티브 (negative) 대조군 NB 1.14), 단일클론성 항체 D25 또는 단일클론성 항체 AM22 의 존재 하에 RSV A2 (A) 또는 RSV B49 (B) 로 감염되었다. VHH 및 단일클론성 항체는 3,000 ng/ml 의 농도로 출발하여 3배 희석 시리즈 (dilution series) 로 적용되었다. 50% 억제 농도 (IC50) 은 A 및 B 에 나타낸 바와 같은 플라크 감소를 기준으로 계산되었고, (C) 에 나타내어져 있다. F-VHH-4 (DS-Cav1-4) 및 F-VHH-L66 (DS-Cav1-L66) 에 대한 IC₅₀ 값을 HMPV-A1-GFP, hMPV-B1-GFP 및 RSV A2-GFP 에 대항하는 Ctrl-VHH 및 mAbs 에 대해 비교하였다 (D). 사전-결정된 양의 GFP-발현 hMPV 재조합 바이러스 (NL/1/00 A1 하위계통 (sublineage) 또는 NL/1/99 B1 하위계통, 네덜란드, 로테르담 (Rotterdam) 의 Bernadette van den Hoogen 및 Ron Fouchier 의 제공) 또는 GFP-hRSV (A2 스트레인 (strain), 미국, 오하이오, 콜럼부스 (Columbus) 의 Mark Peeples 의 제공) (MOI 0.3 ffu/세포) 는 VHH 또는 mAb 의 연속 희석액 (serial dilution) 과 혼합되었고, 96-웰 플레이트에서 성장되는 Vero-118 (hMPV) 또는 HEp-2 세포의 배양액에 첨가되었다. 36 시간 이후, 배지가 제거되었고, PBS 가 첨가되고, 각각의 웰에서 GFP 형광이 Tecan 마이크로플레이트 판독기 M200 에 의해 측정되었다. 형광 값은 항체 없는 바이러스 대조군의 백분율로서 플롯팅 (plotting) 되었고, 상응하는 IC₅₀ 값을 계산하는데 사용되었다.
도 7: VHH-DS-Cav1-4 및 VHH-DS-Cav1-L66 은 DS-Cav1 에 결합하지만 포스트퓨전 F 에는 결합하지 않는다. (A) ELISA 플레이트는 DS-Cav1 (상부 패널) 또는 포스트퓨전 F (하부 패널) 로 코팅되었다. 플레이트는 30,000 ng/ml 로부터 출발하여 정제된 VHH-DS-Cav1-4, VHH-DS-Cav1-L66 및 VHH-F58 의 1/3 희석 시리즈로 인큐베이션되었다. OD450 값이 나타내어진다. (B) 고정화 프리퓨전 또는 포스트퓨전 F 단백질에 대한 VHH-DS-Cav1-4 및 VHH-DS-Cav1-L66 의 결합의 표면 플라스몬 공명 (SPR: Surface plasmon resonance) 센서그램 (sensorgram). 프리퓨전 F 에 대한 SPR 센서그램을 나타내는 상부 패널에서, 완충액만 있는 샘플은 DS-Cav1 (프리퓨전 F) 및 참조 플로우 세포 (flow cell) 위에 주입되었고, 이후 이어서 1.25 nM 농도의 중복과 함께 5 nM 내지 39.1 pM 범위의 VHH-DS-Cav1-4 또는 VHH-DS-Cav1-L66 의 2-배 연속 희석액이 주입되었다. 데이터는 이중-참조 차감 (double-reference subtract) 되고, 1:1 결합 모델 (적색 선) 에 피팅되었다. 하부 패널은 고정화 포스트퓨전 F 에 대한 VHH-DS-Cav1-4 및 VHH-DS-Cav1-L66 의 결합에 대한 SPR 센서그램을 나타낸다. 완충액만 있는 샘플은 포스트퓨전 F 및 참조 플로우 세포 위에 주입되었고, 이후 이어서 1 μM 및 500 nM 농도의 DS-Cav1-4 또는 DS-Cav1-L66 가 주입되었다. 데이터는 이중-참조 차감되었지만, 포스트퓨전 F 에 대한 결합이 검출되지 않았기 때문에 결합 모델에 피팅되지 않았다.
도 8: VHH-DS-Cav1-4 및 VHH-DS-Cav1-L66 은 포유동물 세포의 표면 상의 F 에 결합한다. HEK-293T 세포는, 오로지 GFP-NLS 발현 벡터만으로 트랜스펙션되거나, GFP-NLS 발현 벡터 (peGFP-NLS) 와의 조합으로 RSV A2 F 단백질 발현 벡터 (pCAGGS-Fsyn) 로 트랜스펙션되었다. 그래프는, RSV F 단백질 (상부 그래프) 을 발현하거나 발현하지 않는 (하부 그래프) GFP 포지티브 (positive) 세포에 대해 나타낸 VHH 및 RSV F 특이적 마우스 단일클론성 항체 (MAB858-1, Millipore) 의 중간 형광 강도 (FI: fluorescence intensity) 를 나타낸다.
도 9: 바이오레이어 간섭계 (biolayer interferometry) 를 사용하여 분석된 DS-Cav1-결합에서의 항체 교차-경쟁 (cross-competition). DS-Cav1 은 아세테이트 완충액 중에서 아민 커플링 반응을 통해 AR2G 바이오센서 상에 고정화되었다. 반응은 1M 에탄올아민에 의해 켄칭되었고, DS-Cav1-고정화 바이오센서는 이후 검정 완충액 (1 % BSA 를 갖는 PBS) 으로 평형화되었다. 바이오센서는 경쟁자 항체/VHH 이후 이어서 분석물 항체/VHH 에, 두 항체/VHH 단계 사이의 짧은 베이스라인 단계와 함께 침지되었다. 백분율 억제는 각각의 경쟁자의 부재 및 존재 하에 분석물 항체/VHH 의 결합 최대치를 비교함으로써 정의되었다. NB: 결합 없음.
도 10: DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 의 예방적 투여는 생체내 (in vivo) 에서 RSV 복제를 감소시킨다. 30 ㎍ 의 DS-Cav1-4, DS-Cav1-L66 또는 F2, 및 30 ㎍ 의 팔리비주마브 (palivizumab) 는, RSV A2 를 사용한 챌린지 (challenge) 4 시간 이전에 BALB/c 마우스에 대해 비강내로 투여되었다. 감염 24 h 이후에, 모든 마우스는 30 ㎍ 의 F2 를 비강내로 수여받았다. 마우스는 챌린지 이후 5 일째에 희생되었고, 폐에서의 바이러스 로드 (load) 는 플라크 검정 (A) 및 qRT-PCR (B) 에 의해 측정되었다. 각각의 데이터 지점은 한 마리의 마우스를 나타내고, 수평 선은 중간값을 나타낸다. #: 검출 한계 미만의 폐 균질물 중 바이러스 역가가 있는 마우스. 그래프 (B) 는 나타낸 군에서 각각의 마우스의 샘플에 존재하는 mRPL13A mRNA 수준에 대해 정규화된 RSV RNA 의 상대적 발현을 나타낸다.
도 11: VHH-DS-Cav1-4 및 VHH-DS-Cav1-L66 은, 높은 구조적 보존과 함께 RSV F 상의 동일한 에피토프를 결합한다. (A) VHH-DS-Cav1-4 에 의해 접촉되는 프리퓨전-안정화 RSV F (SEQ ID NO: 16) 상의 잔기 및 매립 표면적 (Buried Surface Area) (굵게 나타냄). (B) VHH-DS-Cav1-L66 에 의해 접촉되는 프리퓨전-안정화 RSV F (SEQ ID NO: 16) 상의 잔기 및 매립 표면적 (굵게 나타냄). (C) VHH-DS-Cav1-4 및 VHH-DS-Cav1-L66 모두에 의해 접촉되는, 생체내 프로세싱 이전의, 프리퓨전-안정화 RSV F 단백질 풀 오픈-리딩 프레임 (full open-reading frame) 의 아미노산 잔기 (SEQ ID NO: 17) 는 밑줄로 나타내어진다. (D) RSV 프리퓨전 F 단백질과 모든 ISVD 의 공동-결정 구조는, ISVD 의 높은 구조적 보존 및 동일한 에피토프에 대한 결합을 나타낸다.
도 12: VHH-DS-Cav1-4 의 결합 세부사항. (A) VHH-DS-Cav1-4 의 CDR3 루프는 RSV F 의 2 개의 프로토머 (protomer) 에 의해 형성된 포켓에 결합한다. (B) VHH-DS-Cav1-4 의 CDR2 루프는 부위 II 와 상호작용하고, 디술파이드 결합을 통해 CDR3 에 연결된다. P1 = 프로토머 1; P2 = 프로토머 2.
도 13: VHH-DS-Cav1-L66 의 결합 세부사항. (A) VHH-DS-Cav1-L66 의 CDR3 루프는 RSV F 의 2 개의 프로토머에 의해 형성된 포켓에 결합한다. (B) VHH-DS-Cav1-L66 의 CDR2 루프는 부위 II 와 상호작용하고, 디술파이드 결합을 통해 CDR3 에 연결된다. P1 = 프로토머 1; P2 = 프로토머 2.
도 14. 모타비주마브 (motavizumab), AM14, 101F 및 DS-Cav1-4 와의 착물에서 프리퓨전 형태의 F 단백질의 구조. 모타비주마브, AM14, 101F 및 DS-Cav1-4 와의 착물에서 프리퓨전 형태의 F 단백질의 모델. AM14-Mota-프리퓨전 F 구조 (4ZYP) 및 펩티드 결합된 101F Fab 구조 (3O41) 는 DS-Cav1-4 결합된 프리퓨전 F 구조의 F 에 대해 정렬되었다. DS-Cav1-4 의 에피토프, 및 DS-Cav1-L66 의 에피토프는, AM14, 모타비주마브 및 101F 의 것 사이에 위치되고, 이들 각각과 일부 오버랩된다.

정의

본 발명은 특정 구현예에 대하여 및 특정 도면을 참조로 하여 기재될 것이나, 본 발명은 이에 제한되지 않고 오로지 청구항에 의해 제한된다. 청구항에서 임의의 참조 기호는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 기재된 도면은 오로지 개략적이고, 비제한적이다. 도면에서, 구성요소 중 일부의 크기는 과장될 수 있고, 예시적 목적을 위해 스케일로 그려지지 않는다. 용어 "포함하는" 이 본 발명의 상세한 설명 및 청구항에서 사용되는 경우, 이는 기타 구성요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 단수 명사를 나타낼 때 부정관사 또는 정관사, 예를 들어 "한" 또는 "그" 가 사용되면, 이는 달리 구체적으로 나타내어지지 않는 한, 그 명사의 복수를 포함한다.

또한, 상세한 설명 및 청구항에서 용어 제 1, 제 2, 제 3 등은, 유사한 구성요소 사이의 구별을 위해 사용되고, 순차적 또는 연대순 순서로 기재하는 것은 아니다. 이에 따라 사용된 용어는 적절한 상황 하에 상호교환될 수 있고, 본원에 기재된 본 발명의 구현예가 본원에 기재된 또는 예시된 것과 다른 순서로 구동될 수 있음이 이해된다.

하기 용어 또는 정의는 오로지 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 당업자에게 그러한 것과 동일한 의미를 갖는다. 실시자는 특히 당업계의 정의 및 용어에 관하여, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999) 를 참조한다. 본원에 제공된 정의는 당업자에 의해 이해되는 것보다 적은 범주를 갖는 것으로 해석되지 않아야 한다.

"면역글로불린 단일 가변 도메인" 또는 "ISVD" 는 단일 가변 항체 도메인으로 이루어지는 항체 분절이다. 전체 항체와 같이, 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 오로지 12-18 kDa 의 분자량으로, ISVD 는 2 개의 중질 및 2 개의 경질 단백질 사슬로 구성되는 통상적인 항체 (150-160 kDa) 보다 훨씬 더 작고, 심지어 Fab 분절 (~50 kDa, 하나의 경질 사슬 및 절반의 중질 사슬) 및 단일 사슬 가변 분절 (~25 kDa, 2 개의 가변 도메인, 하나는 경질 사슬로부터 및 하나는 중질 사슬로부터임) 보다 더 작다. 일반적으로, ISVD 는 바람직하게는 하기 식: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 에 따르는, 4 개의 프레임워크 영역 (FR1 내지 FR4) 및 3 개의 상보성 결정 영역 (CDR1 내지 CDR3) 을 포함하는 아미노산 서열을 가질 것이다. 본원에서 사용된 용어 "ISVD" 는 (이에 제한됨 없이) 낙타과 (camelid) 중질 사슬 항체 (VHH) 의 가변 도메인 (또한 Nanobodies^TM 으로 나타냄), 도메인 항체 (dAbs), 및 상어로부터 유래된 ISVD (IgNAR 도메인) 을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 폼에 특이적으로 결합한다" 는, RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 폼에 측정가능하게 결합하고 RSV 의 F 단백질의 포스트퓨전 형태에는 결합하지 않는, RSV 결합 폴리펩티드 (예를 들어 항체, ISVD) 의 능력을 나타낸다.

"RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 폼" 은, McLellan et al., 2013 에 기재된 바와 같이 바이러스-세포 상호작용 전에 채택되는, RSV F 단백질의 준안정성 프리퓨전 형태를 나타낸다. 이는 바이러스 및 세포 막의 융합시에 채택되는 매우 안정한 포스트퓨전 폼 (postfusion form) 또는 포스트퓨전 형태 (postfusion conformation) 와 구별된다.

본원에서 사용된 항체의 "1가 포맷" 은 오로지 하나의 항원 결정자 (antigenic determinant) 만을 인식할 수 있는 항체 포맷을 나타낸다. 이는 하나 초과의 항원 결정자를 인식할 수 있는 다가 항체 포맷 예컨대 (이에 제한됨 없이) 2가, 3가 또는 4가 포맷을 배제한다.

본원에서 사용된 용어 "중화 활성" 은 ISVD 가 시험관내 바이러스 중화 검정, 예컨대 (이에 제한됨 없이) 플라크 감소 검정에서 측정된 바이러스 감염을 억제할 수 있다는 사실을 나타낸다. 또한 억제로서 나타내어지는 중화는, 전체 중화 (바이러스 감염이 관찰될 수 없음) 를 의미할 수 있거나, 일부 중화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 중화는 10% 중화, 20% 중화, 25% 중화, 30% 중화, 40% 중화 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 특히, 중화는 적어도 50%, 예를 들어 50% 중화, 60% 중화, 70% 중화, 75% 중화, 80% 중화, 90% 중화, 95% 중화 또는 그 이상일 것이다. 중화 활성은 전형적으로 당업자에 의해 쉽게 선택될 바와 같은, 적합한 대조군 (예를 들어, 무관한 ISVD 에 의한 처리) 에 비해 평가될 것이다. 공지된 농도를 사용한 ISVD 의 경우, 중화 활성은 50% 억제 농도 (IC50) 로서 표현될 수 있다. IC50 은 50% 억제 (또는 중화) 가 달성되는 ISVD 농도이다. 이는 ISVD 의 억제 전위 (또한 역능 (potency) 으로서 나타냄) 의 측정값이다.

본원에 사용된 "유사한 중화 활성" 은, IC50 으로 표현되는 중화 활성을 나타내고, 이는 전형적으로 이것이 비교되는 중화 활성과 10-배 또는 그 이하로 상이하다. 더욱 특히, 이는 5-배 또는 그 이하, 또는 심지어 2-배 또는 그 이하로 상이하다.

용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 은 면역글로불린의 H (중질) 또는 L (경질) 사슬의 가변 영역 내의 가변 루프를 나타내고, 항원 타겟에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유한다. 이러한 CDR 영역은 특정 항원 결정자 구조에 대한 항체 또는 항체 분절의 기본 특이성의 이유이다.

용어 "에피토프" 는 폴리펩티드, 예컨대 ISVD 가 특이성 및 친화성을 갖는 항원 구조물 또는 항원 상의 특이적 결합 부위를 나타낸다.

용어 "형태 에피토프 (conformational epitope)" 는, ISVD 와 같은 폴리펩티드를 정확하게 피팅시키고 결합되게 하는, 항원의 3-차원 표면 특징을 갖는 에피토프를 나타낸다. 대조적으로, 선형 에피토프는 단백질의 3D 형상 (3차 구조) 에 의해서보다는 아미노산 서열 (1차 구조) 에 의해 결정된다.

본원에서 사용되는 "RSV 감염의 치료적 처리" 는 대상체가 RSV 감염에 걸린 이후 대상체에 투여되는 RSV 감염의 임의의 치료 형태를 의미한다.

본원에서 사용되는 "RSV 감염의 예방" 은 대상체가 RSV 감염에 걸리기 전에 대상체에 투여되는 RSV 감염의 예방적 치료를 의미한다. 예방적 치료는 백신으로서 본 발명의 용도를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "약학 조성물" 은 당업자에 공지된 임의의 약학 조성물, 예컨대 이에 제한됨 없이 전신, 구강 및 비강내 전달을 위한 조성물일 수 있다.

본원에 사용된 "하나 이상의 ISVD 를 포함하는 RSV 결합 구조체" 는 RSV 에 결합하고 하나 이상의 ISVD 를 포함하는 임의의 결합 구조체를 나타낸다.

본원에서 사용된 "숙주 세포" 는 ISVD 또는 RSV 결합 구조체의 생성에 적합한 임의의 세포일 수 있다.

제 1 양상에 따르면, 본 발명의 목적은 RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 폼에 특이적으로 결합하고/하거나 이에 대항되는 ISVD 를 제공하는 것이다. RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 폼에 대한 특이적 결합은, ISVD 가 RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 폼에 측정가능하게 결합하고, RSV 의 F 단백질의 포스트퓨전 폼에는 결합하지 않음을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어 ISVD 의 친화성 및 ISVD 의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 당업자는, (이에 제한됨 없이) 효소 결합 면역흡착 측정법 (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 또는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 또는 바이오레이어 간섭계 (BLI: biolayer interferometry) 를 기반으로 하는 결합 검정과 같은 적합한 결합 검정에서의 ISVD 의 적정과 같은, 그 아래에서 본원에 기재된 ISVD 의 결합 능력이 평가될 수 있는 적절한 조건을 결정할 수 있다. 전형적으로, RSV 의 F 단백질의 프리퓨전 폼에 대한 결합은, F 단백질이 프리퓨전 형태인 한, ISVD 가 F 단백질의 야생형 형태 뿐만 아니라 F 단백질의 임의의 돌연변이 형태에 결합함을 의미한다. 이는 또한 RSV 의 두 아형 (A 및 B) 의 F 단백질에 대한 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 ISVD 는 SEQ ID NO: 18 에 제시된 RSV A F 단백질 컨센서스 서열 (consensus sequence) 에 결합한다. SEQ ID NO: 18 에 제시된 컨센서스 서열은, NCBI 단백질 데이터베이스에 열거된 92 개의 RSV A F 단백질 전장 (full length) 서열을 기반으로 당업자에 공지된 방법에 따라 계산되었다. 따라서, 상기 기재된 ISVD 는 SEQ ID NO: 18 의 컨센서스 서열로 유도하기 위해 포함된 92 개의 대표적 RSV A F 단백질 서열 중 임의의 것에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 ISVD 는 SEQ ID NO: 19 에 제시된 RSV B F 단백질 컨센서스 서열에 결합한다. SEQ ID NO: 19 에 제시된 컨센서스 서열은, NCBI 단백질 데이터베이스에 열거된 114 개의 RSV B F 단백질 전장 서열을 기반으로 당업자에 공지된 방법에 따라 계산되었다. 따라서, 상기 기재된 ISVD 는 SEQ ID NO: 19 의 컨센서스 서열로 유도하기 위해 포함된 114 개의 대표적 RSV B F 단백질 서열 중 임의의 것에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 ISVD 는 SEQ ID NO: 18 에 제시된 RSV A F 단백질 및 SEQ ID NO: 19 에 제시된 RSV B F 단백질 모두에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 ISVD 는 F 단백질의 프리퓨전 폼에 배타적으로 결합한다. 추가 특정 구현예에 따르면, 상기 언급된 ISVD 는 F 단백질의 프리퓨전 폼에 배타적으로 결합하고, F 단백질의 포스트퓨전 폼에는 결합하지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 ISVD 는 SEQ ID NO: 16 의 프리퓨전-안정화된 RSV F 단백질에 결합한다. 특정 구현예에서, ISVD 는 추가 모이어티 (moiety) 에 융합될 수 있다.

특정 구현예에 따르면, 상기 기재된 ISVD 는 RSV 프리퓨전 F 단백질의 에피토프에 결합한다. 특히, 이는 RSV 프리퓨전 F 단백질의 형태 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 ISVD 는 아미노산 잔기 T50, G51, W52, S180, G184, V185, P265, I266, T267, N268, D269, Q270, L305, G307, V308, N345, A346, G347, K421, S425, K427, N428, R429, G430, I431, S451, G453, N454, L456, Y458 을 포함하는 RSV 프리퓨전 F 형태 에피토프를 결합한다. 특히 이는 SEQ ID NO: 17 에 제시된 RSV 프리퓨전 F 의 아미노산 잔기 T50, G51, W52, S180, G184, V185, P265, I266, T267, N268, D269, Q270, L305, G307, V308, N345, A346, G347, K421, S425, K427, N428, R429, G430, I431, S451, G453, N454, L456, Y458 을 포함하는 RSV 프리퓨전 F 형태 에피토프를 결합한다.

특정 구현예에 따르면, ISVD 는 RSV 혈청형 A 및 B 의 유사한 중화 활성을 1가 포맷에서 나타낸다. 전형적으로, 이는 ISVD 가 바이러스의 세포를 감염시키는 능력을 방해/억제/예방/역전시키거나 늦추는 것을 의미한다. 이러한 특정 구현예에 따르면, ISVD 는 바이러스가 A 및 B RSV 혈청형 모두에 대해 유사한 정도로 세포를 감염시키는 능력을 방해/억제/예방/역전시키거나 늦춘다.

특정 구현예에 따르면, ISVD 는 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR2 서열, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하고, 여기서 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 은 상기 각각의 SEQ ID NO 중 임의의 것과 상이한 1-, 2- 또는 3-아미노산을 갖는다. ISVD DS-Cav1-4 의 경우, CDR 의 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 5 이다. ISVD DS-Cav1-L66 의 경우, CDR 의 서열은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 6 이다.

추가 양상에 따르면, 상기 RSV 결합 구조체가 하나 이상의 ISVD 를 포함하는 것을 특징으로 하는 RSV 결합 구조체가 제공된다. 하나 이상의 ISVD 는, RSV 결합 구조체가 하나 초과의 ISVD 를 함유할 수 있음을 의미한다. 하나 이상의 ISVD 다음에, RSV 결합 구조체는 ISVD 에 연결된 기타 모이어티를 함유할 수 있다. 상기 추가 모이어티는 RSV 에 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있다. 비제한적 예로서, 상기 RSV 결합 구조체는 RSV F 단백질에 결합하는 ISVD 를 포함할 수 있고, 반감기를 연장하는 하나 이상의 기 또는 모이어티 (예컨대 (이에 제한됨 없이) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 혈청 알부민 결합 VHH) 에 (화학적으로 또는 다르게) 연결되어, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 ISVD의 유도체를 제공할 수 있다. 전형적으로, 상기 RSV 결합 구조체는 RSV 프리퓨전 F 단백질에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 RSV 결합 구조체는 SEQ ID NO: 17 및/또는 SEQ ID NO: 18 및/또는 SEQ ID NO: 19 에 결합한다. 상기 RSV 결합 구조체는 하나 또는 하나 초과의 RSV 결합 ISVD 를 포함하는 임의의 구조체일 수 있다.

추가 양상에 따르면, ISVD 는 상기와 같이 제공되지 않지만, 핵산, 즉 본원에 기재된 RSV F 단백질에 대항하는, 특히 F 단백질의 프리퓨전 폼에 대항하는 ISVD 를 인코딩하는 핵산 분자로서 제공된다. 또한 제공되는 것은 상기 핵산 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터이다. 보다 추가 양상에 따르면, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 전형적으로, 핵산은 비록 핵산이 숙주 세포에 도입되는 방식이 본 발명을 제한하지 않기는 하지만, 트랜스펙션 또는 형질전환에 의해 숙주 세포에 도입될 것이다.

보다 추가 구현예에 따르면, 상기 핵산을 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 전형적으로, 상기 숙주 세포는 핵산에 의해 형질전환되거나 트랜스펙션될 것이다. 이러한 숙주 세포에 대해 구상된 특정 용도는 ISVD 의 제조이다. 따라서, 제조를 위한 상기 용도는 본원에서 명백하게 구상된다. 이는 ISVD 를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포가 ISVD 의 제조에 사용될 수 있음을 의미한다.

추가 양상에 따르면, 본원에 제공된 ISVD 는 약제에서 사용하기 위한 것이다. 즉, RSV F 단백질에 대항하는 ISVD 는 약제로서의 용도로 제공된다. ISVD 를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 핵산을 함유하는 벡터에 대해서도 마찬가지인데, 즉 ISVD 를 인코딩하는 핵산 분자 또는 벡터가 약제로서의 용도로 제공된다는 것이 구상된다. 또한 RSV F 단백질에 결합하는 하나 이상의 ISVD 를 포함하는 RSV 결합 구조체는 약제로서의 용도로 제공된다. 특정 구현예에 따르면, ISVD (또는 이를 포함하는 RSV 결합 구조체 또는 이를 포함하는 약학 조성물 또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터) 는 RSV 감염의 치료 또는 예방에서의 사용을 위해 제공된다. 이는 RSV F 단백질에 대항하는 ISVD 를, RSV 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 위한 RSV 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공됨을 말하는 것과 동등하다. 여기서 또한, ISVD 는 단백질로서 (단일 도메인 단백질, RSV 결합 구조체의 일부 또는 약학 조성물로서) 제공될 수 있거나, 또는 RSV F 단백질에 대항하는 ISVD 를 인코딩하는 핵산 단백질로서 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로서 투여될 수 있다. ISVD (또는 RSV 결합 구조체) 가 단백질로서 투여되는 경우, 상이한 투여 경로가 구상될 수 있다. 비제한적 예로서, ISVD 는 전신적으로, 경구로 또는 비강내로, 예컨대 예를 들어 비강 흡입을 통해 투여될 수 있다. ISVD 가 핵산 또는 벡터로서 제공되는 경우, 특히 ISVD 가 유전자 요법을 통해 투여되는 것이 구상된다.

추가 양상에 따르면, RSV 프리퓨전 F 단백질에 대한 하나 이상의 ISVD 를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 전형적으로, 상기 약학 조성물은 RSV F 단백질의 프리퓨전 폼에 대한 하나 이상의 ISVD 를 포함한다. 상기 약학 조성물은 추가 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 추가 모이어티는 RSV 에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 본원에서 약학 조성물이 약제로서 사용하기 위해 제공됨이 구상된다. 특히, 이는 RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방에서의 사용을 위해 제공된다. 이는 RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 위한 RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방을 위한 방법이 제공됨을 나타내는 것과 동등하다.

추가 구현예에 따르면, RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방의 방법이 제공되고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 기재된 ISVD, 상기 기재된 RSV 결합 구조체 또는 상기 기재된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 RSV 프리퓨전 F 단백질에 대항하는 ISVD 를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 전형적으로 상기 대상체에서의 감염 증상의 개선 또는 예방을 야기할 것이다. 여기서 또한, ISVD 는 단백질로서 (단일 도메인 단백질로서, RSV 결합 구조체의 일부로서 또는 약학 조성물로서) 제공될 수 있거나, RSV F 단백질에 대항하는 ISVD 를 인코딩하는 핵산 분자로서, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 또는 상기 항체를 함유하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 RSV 결합 구조체는, RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방을 위한 방법에 있어서 이를 필요로 하는 대상체에 대한 투여를 위해 구상된다.

비록 특정 구현예, 특이적 배치 뿐만 아니라 물질 및/또는 분자가 본 발명에 따른 세포 및 방법에 관하여 본원에서 논의되었기는 하지만, 형태 및 상세한 사항의 변화 또는 변형이 본 발명의 범주 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음이 이해된다. 하기 실시예는 특정 구현예를 더 잘 예시하기 위해 제공되고, 이는 본 출원을 제한하는 것으로 여겨지지 않아야 한다. 본 출원은 오로지 청구항에 의해서 제한된다.

실시예

실시예를 위한 물질 및 방법

면역화 및 VHH 라이브러리 생성

매 회 167 ㎍ 의 정제된 RSV F 단백질 DS-Cav1 로, 제 0, 7, 14, 21, 28 및 35 일 째에 라마를 피하로 주사하였다. DS-Cav1 은 프리퓨전 형태로 안정화된 재조합 RSV F 단백질이다 (McLellan et al., 2013). 처음 2 회의 주사는 아쥬반트로서 poly-IC (주사 당 375 ㎍) 에 의해 수행한 한편, 마지막 4 회의 주사에 대해서는 아쥬반트로서 Gerbu LQ # 3000 을 사용하였다. 모든 면역화 전에, 혈액을 취하고, 혈청전환 (seroconversion) 을 평가하기 위해 혈장을 준비하였다. 40 일째에, 100 ml 의 항응고된 혈액을 림프구의 제조를 위해 수집하였다.

말초 혈액 림프구로부터의 총 RNA 를, oligodT 프라이머로의 제 1 가닥 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 이러한 cDNA 를 사용하여, VHH 인코딩 서열을 PCR 에 의해 증폭시키고, PstI 및 NotI 로 다이제스트 (digest) 시키고, 파지미드 (phagemid) 벡터 pHEN4 의 PstI 및 NotI 부위로 클로닝하였다. 일렉트로-컴피턴트 (Electro-competent) 이. 콜라이 (E. coli) TG1 세포를 재조합 pHEN4 벡터로 형질전환하여, 약 5 × 108 독립적 형질전환체의 VHH 라이브러리를 야기하였다. 형질전환체 중 87 % 는 95 개의 독립적 형질전환체의 PCR 분석에 의해 입증되는 바와 같이, 정확한 삽입 크기를 갖는 벡터를 가졌다.

500 ㎕ 의 라이브러리 스톡을 VCS M13 헬퍼 파지 (helper phage) 로 감염시켜, 파지 표면 상에 VHH 서열 (M13 PIII 와 융합) 이 전시되었고, 이를 바이오-패닝 (bio-panning) 에 사용하였다.

세포

Hep-2 세포 (ATCC, CCL-23), Vero 세포 (ATCC, CCL-81) 및 HEK-293T 세포 (Dr M. Hall 제공) 를, 10% 가열-불활성화 소 태아 혈청 (FCS), 2mM L-글루타민, 비필수 아미노산 (Invitrogen, Carlsbad, California) 및 1 mM 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM 배지에서 성장시켰다.

바이러스

RSV A2 (VR-1540, ATCC, Rockville), RSV 의 A 아형, 및 RSV B49, RSV 의 B 아형 (BE/5649/08 임상적 스트레인, Prof M. Van Ranst 로부터 입수, Tan et al., 2013) 을, 1% FCS 를 함유하는 성장 배지의 존재 하에 0.1 MOI 로, Hep-2 세포의 단층을 감염시킴으로써 증식시켰다. 감염 5 일 이후, 세포 및 성장 배지를 수집하고, 풀링 (pooling) 하고, 원심분리 (450 x g) 에 의해 정화하였다. 바이러스를 농축시키기 위해, 정화된 상청액을 10 % 폴리에틸렌 글리콜 (PEG6000) 의 존재 하에 4 ℃ 에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 (3000 x g 에서 30 분) 이후, 펠릿 (pellet) 을 20% 수크로오스를 함유하는 행크 평형 염액 (Hank's balanced salt solution) (HBSS) 에 재현탁시키고, 분취 (aliquot) 하고, 액체 질소 중에서 스냅-동결 (snap-frozen) 시키고, -80 ℃ 에서 저장하였다.

RSV-중화 활성 검정

플라크 검정에 의해 RSV A2 및 RSV B49 에 대항하는 중화 활성에 관하여 라마 혈장을 시험하였다. Vero 세포를 96-웰 플레이트에 파종하였다 (15000 세포/웰). 다음날, 혈장 샘플의 희석 시리즈를 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신으로 보충된 Opti-MEM (Gibco) 중에서 제조하였다 (1/3 희석 시리즈, 1/4 희석으로부터 출발). 동일한 부피의 RSV A2 현탁액 (1.4 PFU/㎕ 로 희석됨) 또는 RSV B49 (2.8 PFU/㎕ 로 희석됨) 를 혈장 샘플에 첨가하고, 수득된 혼합물을 30 분 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 이후, 50 ㎕ 의 혼합물을 Vero 세포에 첨가하고, 이를 Opti-MEM 으로 세척하고, 세포를 3 시간 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 2% 가열-불활성화 FCS, 2mM L-글루타민, 비필수 아미노산 및 1 mM 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM 배지 중 1.2 % 아비셀 50 ㎕ 를 각각의 웰에 첨가하고, 감염시켜, 3 일 동안 37 ℃ 에서 유지되게 하였다. 웰에 50 ㎕ 의 2 % 파라포름알데히드 용액을 첨가하여 실온에서 30 분 동안 세포를 고정화하였다. 고정화 이후, 세포를 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 로 2 회 세척하고, 10 분 동안 0.2% 트리톤 X-100 을 갖는 50 ㎕ PBS 로 침투성화 (permeabilize) 시키고, 1% BSA 를 함유하는 PBS 로 블로킹 (blocking) 하였다. 이후, 다클론성 염소 항 RSV 혈청 (AB1125, Chemicon International) 을 첨가하였다 (0.5% BSA 및 0.001% 트리톤 X-100 을 함유하는 PBS 중 1/2000 (PBS/BSA)). PBS/BSA 를 사용한 3 회 세척 이후, 세포를 서양고추냉이 과산화효소 (horseradish peroxidase)-공액된 항-염소 (IgG SC2020, Santa Cruz) 와 함께 30 분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 이후 PBS/BSA 로 4 회 세척하고, PBS 로 1 회 세척하였다. 마지막으로, 플라크를 TrueBlue 과산화효소 기질 (KPL, Gaithersburg) 을 적용함으로써 시각화하였다. 미정제 피치아 파스토리스 상청액 중 RSV 중화 활성 및 정제된 VHH 의 것 (아래 참조) 을 또한 이러한 검정에 의해 측정하였다.

DS-Cav1 결합 VHH 의 단리

본 출원인은 프리퓨전 F (DS-Cav1) 결합 파지에 대해 강화 (enrich) 하기 위한 패닝 1 라운드를 수행하였다. 마이크로타이터 플레이트 (II 형, F96 Maxisorp, Nunc) 상의 하나의 웰 (웰 A1) 을 PBS 중 20 ㎍ DS-Cav1 로 밤새 코팅하였다. 이러한 웰과 함께 비코팅된, 네거티브 대조군 웰 (웰 A12) 을 1 시간 동안 SEA BLOCK 블로킹 완충액 (Thermo Scientific) 으로 블로킹하였다. 다음으로, 100 ㎕ SEA BLOCK 블로킹 완충액의 부피 중 1012 개의 파지를 이러한 2 개의 웰에 첨가하였다. 1 시간 이후, 비결합된 파지 입자를 제거하고, 웰을 PBST (PBS + 0.5% Tween20) 로 10 회 세척하였다. 이후 보유된 파지를, 정확히 10 분 동안 웰에 100 ㎕ 의 TEA-용액 (14% 트리에틸아민 (Sigma) pH 10) 으로 이루어지는 알칼리성 용액을 적용하여 용리시켰다. 해리된 파지를 이후 100 ㎕ 1M TRIS-HCl pH 8.0 을 갖는 멸균 튜브에 수송하였다. 용리된 파지로 PBS 중 10배 연속 희석액을 제조하였고, 10 ㎕ 의 이러한 희석 시리즈를 사용하여 90 ㎕ 의 TG1 세포 (파지 디스플레이 컴피턴트 (phage display competent) 이. 콜라이 세포) 를 감염시켰다. 37 ℃ 에서 30 분 동안 감염되게 하고, 이후 박테리아를 100 ㎍/ml 앰피실린 및 1% 글루코오스를 갖는 LB/아가 플레이트 상에 플레이팅 (plate) 하였다. 이러한 패닝 과정에 의한 항원-특이적 파지에 대한 강화를, 네거티브 대조군 웰로부터 용리된 파지미드 (phagemid) 입자의 수와 항원-코팅된 웰로부터 용리된 파지미드 입자의 수를 비교하여 평가하였다.

90 개의 앰피실린 저항성 콜로니를, 이의 주변 세포질 중의 F-특이적 VHH 의 존재에 관한 ELISA 에 의한 추가 분석을 위하여 무작위로 선택하였다. 이러한 콜로니를 먼저 앰피실린을 갖는 새로운 LB 아가 (agar) 플레이트에 수송하고, 이후 24 딥 웰 플레이트에서 100 ㎍/ml 앰피실린을 갖는 1 ml 의 Terrific Broth (TB) 배지를 접종하는데 사용하였다. 접종된 플레이트를 37 ℃ 에서 인큐베이션하면서 5 시간 동안 진탕시켰다. 1 mM 의 농도일 때까지 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG) 를 첨가하여 VHH 발현을 유도하였다. 플레이트를 이후 37 ℃ 에서 진탕시키면서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 박테리아 세포를 원심 분리 (3200 rpm 에서 12 분) 에 의해 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 세포 펠릿을 200 ㎕ TES 완충액 (0.2 M TRIS-HCl pH 8, 0.5 mM EDTA, 0.5 M 수크로오스) 에 재현탁시키고, 플레이트를 30 분 동안 4 ℃ 에서 진탕시켰다. 다음으로, 물을 재현탁 세포에 첨가하여, 삼투압 충격을 유도하였고, 이는 VHH 를 포함하는 주변세포질 단백질의 방출을 야기하였다. 딥 웰 플레이트를 4 ℃ 에서 1 시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션하였고, 원심 분리하고, 주변세포질 추출물을 함유하는 상청액을 회수하였다. 4 개의 마이크로타이터 플레이트를, PBS (둘은 포스트퓨전 형태의 F (McLellan et al., 2011) 및 BSA 의 교대 열 (alternating row) 을 갖고, 다른 둘은 DS-Cav1 및 BSA 의 교대 열을 가짐) 중에서 웰 당 100 ng 의 단백질로 밤새 코팅하였다. 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 이후 세척하고, PBS 중 1 % 우유 분말로 블로킹하였다. 마이크로타이터 플레이터의 세척 이후, 100 ㎕ 의 주변 세포질 추출물을 웰에 첨가하고, 이후 이어서 1 시간 동안 4 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, PBS 중 항-HA (MMS-101P Biolegend) 단일클론성 항체의 1/2000 희석액 50 ㎕ 를 실온에서 1 시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 세척 이후, 서양고추냉이 과산화효소 (HRP)-연결된 항-마우스 IgG (NXA931, GE Healthcare) 의 PBS 중 1/2000 희석액을 첨가하고, 플레이트를 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 플레이트를 세척하고, 50 ㎕ 의 TMB 기질 (테트라메틸벤지딘, BD OptEIA^TM) 을 웰 마다 첨가하였다. 50 ㎕ 의 1M H2SO4 의 첨가에 의해 반응을 중단시키고, 그 후 iMark Microplate Absorbance Reader (Bio Rad) 를 사용하여 450 nM 에서의 흡광도를 측정하였다. DS-Cav1 또는 포스트퓨전 F 에 대해 수득된 OD450 값이 BSA 에 대해 수득된 OD450 값보다 적어도 2 배 더 높은 모든 주변 세포질 분획을 추가 분석을 위해 선택하였다. QIAprep Spin Miniprep 키트 (Qiagen) 를 사용한 플라스미드 단리를 위해 1/2000 앰피실린을 갖는 LB 배지 3 ml 에서, 상응하는 박테리아를 성장시켰다. 클로닝된 VHH 의 cDNA 서열을 M13RS 프라이머 (5'CAGGAAACAGCTATGACC3') 를 사용한 Sanger 시퀀싱에 의해 측정하였다.

피치아 파스토리스 발현 벡터에의 VHH 의 클로닝 및 피치아 파스토리스의 형질전환

VHH 서열, 뿐만 아니라 패닝 이후 보유되는 VHH 서열은, 하기 정방향 및 역방향 프라이머 (5'GGCGGGTATCTCTCGAGAAAAGGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGG3'; 5'CTAACTAGTCTAGTGATGGTGATGGTGGTGGCTGGAGACGGTGACCTGG3') 를 사용하여 각각의 pHEN4 플라스미드로부터 PCR 증폭되었다. 생성된 PCR 생성물을 XhoI 및 SpeI 로 다이제스트시키고, XhoI/SpeI 다이제스트된 pKai61 백본에 결찰 (ligate) 시켰다. pKai61 벡터의 기원은 Schoonooghe et al., 2009 에 기재되어 있다. VHH 서열은, 에스. 세레비시아에 (S. cerevisiae) a-교배 인자 (mating factor) 신호 서열의 약간 변형된 버전을 갖는 프레임에서 클로닝된다. 이러한 신호 서열은 단백질을 이스트 분비 시스템으로 향하도록 하고, ER 및 골지에서 추가 처리되고, 세포외 배지에의 분비 전에 완전히 제거될 것이다. 야생형 prepro 신호와 대조적으로, 이러한 변형된 버전은 GluAla 반복에 대해 코딩하는 서열을 함유하지 않는다 (여기서 신호 펩티드는 이러한 반복 필요 없이 Kex2 엔도펩티다아제에 의해 효과적으로 절단됨). 인코딩된 유전자는 C-말단 6xHis 태그를 함유하고, 메탄올 유도성 AOX1 프로모터의 조절 하에 있다. 플라스미드는 박테리아 및 이스트 세포에서의 선택을 위한 Zeocine 저항성 마커를 함유한다. 유전자에의 안정한 통합 (integration) 을 위해 내인성 AOX1 유전자좌 (locus) 에서 상동성 재조합을 촉진시키기 위하여, 피.파스토리스로의 형질전환 전에, AOX1 프로모터 (Pmel 을 가짐) 에서 벡터를 선형화시켰다. 생성된 벡터는 pKai-DS-Cav1-4, pKai-DS-Cav1-L66, pKai-VHH-F2 및 pKai-VHH-F58 로 칭하고, Lin-Cereghino et al., 2005 에 의해 기재된 컨덴싱된 형질전환 프로토콜 (condensed transformation protocol) 을 사용하여 피치아 파스토리스 스트레인 GS115 를 형질전환하는데 사용하였다.

피치아 파스토리스에 의해 생성된 VHH 의 정제

형질전환된 피치아 파스토리스 클론에 의한 VHH 의 발현을 먼저 2 ml 배양액에서 분석하였다. 제 1 일째에 개별적 형질전환물을, 100 ㎍/ml Zeocin (Life Technologies) 을 갖는 2 ml 의 YPNG 배지 (2% 펩톤, 1% Bacto 이스트 추출물, 1.34% YNB, 0.1M 포타슘 포스페이트 pH6, 0.00004% 비오틴, 1% 글리세롤) 를 접종하는데 사용하였고, 24 h 동안 28 ℃ 에서 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 다음 날에, 세포를 원심분리 (500 g 에서 8 분) 에 의해 펠릿화하고, YPNG 배지를 YPNM 배지 (2% 펩톤, 1% Bacto 이스트 추출물, 1.34% YNB, 0.1M 포타슘 포스페이트 pH6, 0.00004% 비오틴, 1% 메탄올) 로 대체하여, VHH 발현을 유도하고, 배양액을 72 h 동안 진탕시키면서 28 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 오십 (50) ㎕ 의 50 % 메탄올을 72 h, 80 h 및 96 h 에 배양액에 첨가하였다. 메탄올 함유 배지에 수송한 100 시간 이후에, 이스트 세포를 원심 분리 (500 g 에서 8 분) 에 의해 펠릿화하고, 상청액을 유지하여, VHH 의 존재를 평가하였다. 미정제 배지 (25 ㎕) 를 15% SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 이후 단백질의 존재를 Coomassie Brilliant Blue 염색에 의해 분석하였다. RSV 중화 활성을 갖는 VHH 를 선택하기 위해, 본 출원인은 상기 기재된 플라크 검정에서 상청액의 역속 희석액을 적용함으로써 개별적 피치아 파스토리스 형질전환물로부터 미정제 YPNM 상청액에서 상기 활성을 측정하였다.

높은 RSV 중화 활성을 갖거나 배지 중 VHH 의 높은 수준을 얻는 피치아 파스토리스 형질전환물을, 100 또는 300ml 피치아 (Pichia) 배양액을 사용하여 스케일업하기 위해 선택하였다. 성장 및 메탄올 유도 조건, 배지의 수확은 2 ml 배양액에 대해 상기 언급된 바와 유사하였다. 맑아진 배지 (cleared medium) 를 4 ℃ 에서 4 시간 동안 암모늄 술페이트 침전 (80 % 포화) 에 적용하였다. 불용성 분획을 20,000 g 에서의 원심분리에 의해 펠릿화하고, 10 ml HisTrap 결합 완충액 (20 mM 나트륨 포스페이트, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.4) 에 용해시키고, 10 분 동안 4 ℃ 에서 원심분리하고, 이후 상청액을 1 ml HisTrap HP 컬럼 (GE Healthcare) 에 로딩하고, HisTrap 결합 완충액을 사용하여 사전-평형화하였다. 적어도 10 컬럼 부피의 HisTrap 결합 완충액으로 컬럼을 세척한 이후 (흡광도가 일정한 베이스라인을 달성할 때까지), 결합된 단백질을, 20 ml 의 총 부피에 걸쳐 HisTrap 결합 완충액 중 20mM 로부터 출발하여 및 500 mM 이미다졸에서 종료되는 선형 이미다졸 구배를 사용해 용리시켰다. SDS-PAGE 분석에 의해 측정된 VHH 를 함유하는 분획을 풀링하고, Vivaspin 컬럼 (5kDa 컷오프 (cutoff), GE Healthcare) 으로 2 ml 로 농축시켰다. 이러한 농축된 분획을 이후 PBS 중에 Superdex 75 컬럼 (160 ml, 0.8 ml/min) 에 로딩하고, 피크 분획을 풀링하고, 5kDa 컷오프를 갖는 Vivaspin 컬럼에서 농축하였다. 풀링된 분획의 단백질 농도를, 각각의 VHH 에 대해 맞춰진 백분율 용액 소광 계수 (extinction coefficient) 를 갖는 NanoDrop 1000 에 의한 A280 측정에 의하여 측정하였다. 풀링되고 농축된 분획을 분취하고, 추가 사용 전에 -80 ℃ 에서 저장하였다.

정제된 VHH 의 50 % 억제 농도 (IC50) 의 계산

피치아 파스토리스에 의해 생성된 정제된 VHH 의 IC50 을 측정하기 위해, 이러한 VHH의 Opti-Mem 중에서 제조된 3배 연속 희석액을 상기 기재된 RSV 중화 검정에서 평가하였다. F 의 프리퓨전 형태에 대해 모두 특이적인 단일클론성 IgGs D25 및 AM22 (Beaumont et al., 2012, Spits et al., 2013) 는, 포지티브 (positive) 대조군으로서 사용되었다. NB 1.12, α-마크로글로불린 (macroglobulin) 에 대항되는 VHH 를 네거티브 대조군으로서 사용하였다. IC50 값을 수동으로 계산하였다.

DS-Cav1 및 포스트퓨전 F 에 대한 VHH의 시험관내 결합

DS-Cav1 및 포스트퓨전 F 에 대한 정제된 VHH 의 결합을 직접적 ELISA 에서 시험하였다. PBS 중 1 ㎍/ml DS-Cav1 용액 또는 1 ㎍/ml 포스트퓨전 F 용액 100 ㎕ 로 마이크로타이터 플레이트 (II 형, F96 Maxisorp, Nunc) 를 코팅하였다. 세척 이후, 플레이트를 PBS 중 4% 우유 200 ㎕ 로 1 시간 동안 블로킹하고, 이후 이를 PBS 로 1 회 또다시 세척하였다. VHH 의 1/3 희석 시리즈 (30 ㎍/ml 로부터 출발) 를 이후 단백질-코팅된 웰에 적용하였다. 1 시간 이후, 플레이트를 세척하고, PBS 중 항-히스티딘 Tag 항체 (AD1.1.10 AbD Serotec) 의 1/2000 희석액을 1 시간 동안 첨가하였다. 세척 및 1 시간 동안의 HRP-연결된 항-마우스 IgG (1/2000 희석) 의 첨가 이후, 상기 기재된 PE-ELISA 와 동일한 방식으로 ELISA 를 전개하였다. 친화성 측정을 위하여, StrepTag II 및 6X HisTag 를 갖는 정제된 DS-Cav1 을, Biacore X100 (GE) 을 사용하여 각각의 사이클에 대해 약 537 응답 단위 (RU) 로 NTA 센서 칩 상에 캡춰하였다. 0.25M EDTA 이후 이어서 0.5 mM NiCl2 를 사용하여 사이클 사이에서 NTA 센서 칩을 재생하였다. DS-Cav1 및 참조 플로우 세포 위에 완충액만 있는 샘플을 주입하고, 이후 이어서 1.25 nM 농도의 중복과 함께, HBS-P+ 중에 5 nM 로부터 39.1 pM 까지 2 배 연속으로 희석된 Nb4 또는 Nb66 을 주입하였다. 데이터를 이중-참조 차감하고, Scrubber 를 사용하여 1:1 결합 모델에 맞추었다.

RSV F cDNA 발현 벡터에 의해 트랜스펙션된 세포의 표면 상에서 발현된 F 에 대한 VHH 의 결합을 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. HEK293T 세포를 150 mm 조직 배양 플레이트 당 4,000,000 개의 세포로 파종하였고, FuGENE HD 트랜스펙션 시약 (Promega) 을 사용하여 코돈-최적화 RSV F cDNA 를 인코딩하는 6.4 ㎍ pCAGGS-Fsyn 로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션된 세포를 추적하기 위해, 6.4 ㎍ 의 peGFP-NLS 의 존재 하에 트랜스펙션을 수행하였다. peGFP-NLS 만을 사용하여 대조군 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 18 시간 이후, 세포를 15 ml 트립신-EDTA 용액 (0.05% 트립신, 0.5 mM EDTA (pH 8.0)) 을 사용하여 탈착시키고, PBS 중에서 1 회 세척하고, 1% BSA 를 함유하는 PBS (PBS/BSA) 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 도 8 에 나타낸 상이한 농도에서, 나타낸 VHH 또는 RSV-F 특이적 마우스 단일클론성 항체 (MAB858-1, Chemicon International) 와 함께 인큐베이션하였다. 1 시간 이후, 세포를 PBS/BSA 로 1 회 세척하고, 1 시간 동안 PBS/BSA 중에 1/3000 희석된 항-히스티딘 Tag 항체와 함께 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 PBS/BSA 로 1 회 세척하고, 항-마우스 IgG Alexa 633 을 30 분 동안 첨가하였다. 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, 세포를 FACSCalibur 유동 세포계측계를 사용하여 분석하였다. 측면 산란 신호 (sideward scatter signal) 의 피크 표면, 전방 산란 신호 (forward scatter signal) 의 피크 표면 및 피크 높이, 및 녹색 형광 신호의 피크 표면을 기준으로, 단일 GFP 발현 세포를 선택하였다. 마지막으로, 이러한 GFP 포지티브 단일 세포의, Alexa 633 형광 세기 신호를 측정하였다.

마우스

특이적 무(無)-병원체, 암컷 BALB/c 마우스를 Charles River (Charles River Wiga, Sulzfeld, Germany) 로부터 입수하였다. 동물을 12 시간 낮/밤 사이클을 갖는 온도-제어 환경에서 수용하고; 식품 및 물을 임의로 (ad libitum) 제공하였다. 동물 시설은 플랑드르 정부 라이센스 번호 (Flemish Government License Number) LA1400536 하에 운영한다. 모든 실험은 법에 의해 지정되고 Institutional Ethical Committee on Experimental Animals (Ethical application EC2015-019) 에 의해 인정된 조건 하에 이루어졌다.

VHH 및 단일클론성 항체의 투여 및 마우스의 RSV 챌린지

VHH, 팔리비주마브 또는 RSV 챌린지 바이러스의 비강내 투여 이전에, 이소플루란에 의해 마우스를 약간 마취시켰다. VHH, 팔리비주마브 (Synagis, Medimmune) 및 RSV 바이러스를, PBS 중에 제형화된 50 ㎕ 의 총 부피로 투여하고, 이를 2 개의 콧구멍을 통해 동일하게 분포시켰다. 5 마리의 마우스의 군 각각은, 1,000,000 PFU 의 RSV A2 로 감염되기 4 시간 전에 30 ㎍ 의 DS-Cav1-4, 30 ㎍ 의 VHH DS-Cav1-L66, 30 ㎍ 의 VHH-F2 (네거티브 대조군으로서) 또는 30 ㎍ 의 팔리비주마브 (포지티브 대조군으로서) 를 수여받았다. 모든 군은 감염 24 h 이후에 30 ㎍ 의 네거티브 대조군 VHH-F2 를 수여받았다.

플라크 검정에 의한 폐 바이러스 역가의 측정

챌린지 5 일 이후, 자궁 전위 (cervical dislocation) 에 의해 마우스를 희생시켰다. 마우스 폐를 무균적으로 제거하고, 20% 수크로오스를 함유하고 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신으로 보충된 1 ml HBSS 중 멸균 금속 비이드의 존재 하에 Mixer Mill MM 2000 (Retsch) 을 사용하여 강한 진탕에 의해 균질화하였다. 폐 균질물을 이후 4 ℃ 에서 원심분리 (2500 rpm 으로 10 분) 하여 맑게 만들고, Vero 세포 상에서 바이러스 적정을 위해 중복하여 사용하였다. Vero 세포의 단층을, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 무혈청 Opti-MEM 배지 (Invitrogen) 중 96-웰 플레이트에서 폐 균질물의 연속 1:3 희석액 50 ㎕ 로 감염시켰다. 플라크 검정을 상기 기재된 바와 같이 추가 처리하였다. 각각의 웰에서 플라크를 계수하고, 각각의 희석액에 대하여 폐 (1 ml) 당 PFU 의 수를 하기와 같이 계산하였다: 희석액에 존재하는 플라크의 수 x 희석액 x 20 (= 1000 ㎕ 총 상청액 부피 / 희석 시리즈의 제 1 웰을 감염시키는데 사용된 50 ㎕ 의 상청액). 각각의 폐에서 PFU의 수를 이후 중복의 평균으로서 계산하였다.

qRT-PCR 에 의한 폐 바이러스 역가의 측정

qRT-PCR 에 의해 폐 RSV 로드를 측정하기 위해, 맑아진 폐 균질물로부터 전체 RNA 를, High Pure RNA 조직 키트 (Roche, Mannheim) 를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 제조하였다. cDNA 를 무작위 헥사머 프라이머 및 Transcriptor First strand cDNA 합성 키트 (Roche, Mannheim) 의 사용에 의해 cDNA 를 제조하였다. 게놈 RSV M cDNA 의 상대적 수준을, 5'-말단에서 플루오레세인 (FAM) 으로 및 3'-말단 근처에서 어두운 켄처 염료 (dark quencher dye) 로 라벨링된 뉴클레오티드 프로브 (#150 Universal Probe Library, Roche) 및 RSV A2 M 유전자에 특이적인 프라이머 (5'TCACGAAGGCTCCACATACA3' 및 5'GCAGGGTCATCGTCTTTTTC3') 를 사용하여 qRT-PCR 에 의해 측정하였다. qRT-PCR 데이터를 각각의 마우스의 샘플에 존재하는 mRPL13A mRNA 수준으로 정규화하였다.

DS-Cav1-결합에 대한 항체 교차-경쟁

아세테이트 완충액 (pH 5.0) 에서 아민 커플링 반응을 통해 AR2G 바이오센서에 DS-Cav1 단백질 (10 ㎍/ml) 을 고정화하였다. 1M 에탄올아민에 의해 반응을 켄칭하고, DS-Cav1-고정화 바이오센서를 이후 검정 완충액 (1% BSA 를 갖는 PBS) 으로 평형화하였다. 바이오센서를 경쟁자 항체 (검정 완충액 중 35 ㎍/ml) 에 침지시키고, 이후 이어서 분석물 항체 (검정 완충액 중 35 ㎍/ml) 에 침지시켰는데, 이때 두 항체 단계 사이에 짧은 베이스라인 단계가 있다.

실시예 1: 라마 혈장에서 RSV 중화 활성

DS-Cav1 에 의한 면역화 이후 라마에서 체액 항-RSV 응답의 유도를 평가하기 위해, 각각의 면역화 이전 및 이후에 수득된 혈장 샘플을 RSV-중화 검정에서 시험하였다. RSV B, RSV B49 의 임상적 스트레인 및 RSV-A2 에 대항하는 이의 중화 활성에 대하여 샘플을 시험하였다. 도 1 은 제 4 면역화 이후 수득된 모든 혈장 샘플이 RSV A2 및 RSV B49 에 대항하는 높은 중화 활성을 가짐을 예시한다.

실시예 2: DS-Cav1-특이적 VHH 의 단리

DS-Cav1 단백질 상의 패닝의 1 라운드에 VHH 파지 라이브러리를 적용하였다. 비코팅된 웰로부터 용리된 파지의 수와 DS-Cav1-코팅된 웰로부터 용리된 파지의 수를 비교함으로써 DS-Cav1-특이적 파지에 대한 강화를 평가하였다. 용리된 파지의 수를, 앰피실린 저항성 형질도입 단위, 즉 패닝 단계에서 용리된 파지로 형질도입된 TG1 콜로니의 수를 측정함으로써 간접적으로 추정하였다. 이러한 실험은 파지 집단 (population) 이 DS-Cav1-특이적 파지에 대해 약 140-배 강화되었음을 제안하였다. 90 개의 콜로니를 무작위로 선택하고, 이의 주변세포질 추출물에서 F 의 포스트퓨전 형태에 비해 F 의 프리퓨전 형태 (DS-Cav1) 에 특이적인 VHH 의 존재에 대하여 ELISA 에 의해 분석하였다. 이러한 ELISA 의 결과를 도 2 에 도시하였다. 90 개의 콜로니 중에서, 37 개의 콜로니는 포지티브 (positive) 점수였다 (프리퓨전 및 포스트퓨전 F 모두에 대한 결합에 관해서는 10 개가 포지티브 점수였고, 오로지 프리퓨전 F 에 대한 결합에 관해서는 19 개가 포지티브 점수였고, 오로지 포스트퓨전 F 에 대한 결합에 관해서는 8 개가 포지티브 점수였음). 프리퓨전 및 또는 포스트퓨전 F 에 대한 결합을 제안한 모든 콜로니의 VHH 서열을 측정하였다. 37 개 중 28 개의 클론은 특유의 VHH 서열을 가졌고, 추가 사용을 위해 선택되었다. 이러한 클론의 VHH 서열은 피치아 파스토리스 발현 벡터에 클로닝되었고, 생성된 플라스미드를 이후 피치아 파스토리스를 형질전환하는데 사용하였다.

실시예 3: 피치아 파스토리스 상청액 중에서 중화 활성의 시험

본 출원인은 또한 피치아 파스토리스 발현 벡터 pKai61 로, DS-Cav1 상의 패닝 1 라운드 이후 수득된 VHH cDNA 라이브러리를 클로닝하고자 시도하였다. 본 출원인은 개별적 피치아 파스토리스 형질전환물의 상청액 중 RSV 중화 활성을 기준으로 생물학적으로 관련된 VHH 후보물을 선택하고자 시도하기 위해 이러한 전략을 사용하였다. F 에 대한 결합을 기준으로 선택된 20 개의 개별적 피치아 파스토리스 형질전환물로부터는, 5 개가 RSV A2 에 대항하는 중화 활성을 가진 한편 (DS-Cav1-4 는 가장 강력한 것임), pKai61 로 클로닝되는 라이브러리로부터 수득된 18 개의 클론으로부터는, 오로지 하나 (VHH DS-Cav1-L66) 가 중화 활성을 나타냈다 (도 3).

DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 의 cDNA 서열은 Sanger 시퀀싱에 의해 측정되었고, 뉴클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열은 도 5 에 나타낸다.

실시예 4: 정제된 VHH 의 IC50 의 생성 및 측정

정제 이전에, VHH DS-Cav1-4 및 VHH DS-Cav1-L66 은 가장 강력한 RSV 중화 VHH 를 가졌고, 이러한 두 VHH 및 네거티브 대조군 VHH F2 및 F58 을 300 ml 피치아 파스토리스 배양액 중에서 생성하고, HisTrap 정제 이후 이어서 superdex 75 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (도 4). VHH F2 및 VHH F58 는 불활성화 Junin 바이러스에 의해 면역화된 상이한 라마로부터 유래된 VHH 라이브러리로부터 수득된 무관한 대조군이다. VHH DS-Cav1-4 및 VHH DS-Cav1-L66 은 시험관내 (in vitro) 에서 각각 0.021 nM 및 0.032 nM 의 IC50 으로 RSV A2 을 중화하였다. RSV B49 의 중화를 위해 VHH DS-Cav1-4 및 VHH DS-Cav1-L66 은 각각 0.015 nM 및 0.032 nM 의 IC50 을 나타냈다. VHH DS-Cav1-4 및 VHH DS-Cav1-L66 이 인간 메타뉴모바이러스 (Metapneumovirus) A 및/또는 B 혈청형을 중화할 수 있는 경우를 평가하기 위해, 사전-결정된 양의 GFP-발현 hMPV 재조합 바이러스 (NL/1/00 A1 하위계통 또는 NL/1/99 B1 하위계통, 네덜란드, 로테르담 (Rotterdam) 의 Bernadette van den Hoogen 및 Ron Fouchier 제공) 또는 GFP-hRSV (A2 스트레인, 미국 오하이오, 콜럼부스의 Mark Peeples 제공) (MOI 0.3 ffu/세포) 를 VHH 또는 mAb 의 연속 희석액과 혼합하고, 96-웰 플레이트에서 성장하는 Vero-118 (hMPV) 또는 HEp-2 세포의 배양액에 첨가하였다. 36 시간 이후, 배지를 제거하고, PBS 를 첨가하고, 웰 당 GFP 의 형광 세기를 Tecan Microplate reader M200 으로 측정하였다. 항제 없는 바이러스 대조군의 백분율로서 형광 값을 플롯팅하고, 상응하는 IC50 값을 계산하는데 사용하였다.

실시예 5: DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 은 프리퓨전 상태의 RSV F 에 결합하고 포스트퓨전 상태의 RSV F 에는 결합하지 않음.

프리퓨전 및 포스트퓨전 F 에 대한 DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 의 결합 능력을 평가하기 위해, 본 출원인은 어느 하나의 형태의 F 가 마이크로타이터 플레이트 상에 직접 코팅되고 VHH 의 3배 희석 시리즈가 이러한 플레이트에 첨가되는 ELISA 를 수행하였다 (도 7A). 본 출원인은 VHH DS-Cav1-4 및 VHH DS-Cav1-L66 이 코팅된 프리퓨전 F 에 특이적으로 결합하고 포스트퓨전 형태의 코팅된 F 에는 결합하지 않았음을 밝혀냈다. 프리퓨전 F 단백질에 대한 결합 친화성을 추가 특징분석하기 위해, 본 출원인은 SPR-기반 결합 실험을 수행하였다. 본 출원인은 모든 ISVD 가 피코몰 (picomolar) 친화성을 갖는 프리퓨전 RSV F 에 결합한다는 것을 밝혀냈다. 선천적으로 2가인 팔리비주마브 또는 AM14 (Gilman et al., 2015) 와 같은 통상적인 단일클론성 항체와 대조적으로, ISVD 는 이들이 1가이므로 그 표적에 대해 높은 친화성을 나타낸다는 것이 놀랍다. 특히, DS-Cav1-4 의 오프-비율 (off-rate) 는 매우 낮다.

포유동물 세포에 의해 발현된 F 에 대한 VHH DS-Cav1-4 및 VHH DS-Cav1-L66 의 결합을 또한 평가하였다. 코돈 최적화 F cDNA 및 peGFP-NLS 를 인코딩하는, pCAGGS-Fsyn 으로 HEK293T 세포를 공동-트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 18 h 이후 세포를 수확하고, VHH DS-Cav1-4, VHH DS-Cav1-L66, 네거티브 대조군 VHHs F58 및 F2 및 RSV-F 에 특이적인 단일클론성 마우스 IgG 항체로 염색하였다. 공동-트랜스펙션 세팅에서 GFP 포지티브 세포에 대한 VHH 의 결합을, GFP 발현 벡터만으로 트랜스펙션된 GFP 포지티브 세포에 대한 결합과 비교하였다. VHH DS-Cav1-4 및 VHH DS-Cav1-L66 의 모든 희석액, 및 RSV F 에 대항되는 포지티브 대조군 단일클론성 항체의 3 개의 최고 농도에 대해 깨끗한 결합이 관찰되었다 (도 8).

실시예 6: DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 은 RSV F 의 신규 에피토프에 결합함

DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 이 최근 기재된 프리퓨전 F 특이적 에피토프

에 결합하는지 여부를 조사하기 위해, 본 출원인은 이러한 VHH 가 바이오레이어 간섭계에 의해 RSV 프리퓨전 F 단백질에 대한 결합을 위한 D25 항체에 특이적인 에피토프

와 경쟁할 수 있는 경우를 조사하였다 (도 9). 경쟁 검정은 두 VHH 가 D25 와 경쟁하지 않음을 보여준다. 대조적으로, 두 VHH 는 서로와 경쟁하였다. 이러한 결과는 두 VHH 가 오버랩핑된 에피토프에 결합하지만, 이러한 에피토프는 D25 에피토프

와 상이함을 나타낸다.

ISVD 에피토프의 추가 특징 분석은, DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 이 RSV F 상의 동일한 에피토프를 높은 구조적 보전과 함께 결합함을 확인하였다 (도 11A-D). 도 11C 에서, DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 모두에 의해 접촉되는 프리퓨전-안정화 RSV F 단백질의 잔기 (풀 오픈 리딩 프레임, 생체내 처리 이전, SEQ ID NO: 17) 는 밑줄 그어져 있다. 특히, 하기 RSV F 단백질의 아미노산 잔기는 DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 의 에피토프의 일부를 형성한다: T50, G51, W52, S180, G184, V185, P265, I266, T267, N268, D269, Q270, L305, G307, V308, N345, A346, G347, K421, S425, K427, N428, R429, G430, I431, S451, G453, N454, L456, Y458. 이러한 잔기는 DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 모두의 에피토프를 나타낸다. CDR2 및 CDR3 루프의 결합의 추가 상세한 사항은 도 12 (DS-Cav1-4 의 경우) 및 도 13 (DS-Cav1-L66 의 경우) 에 나타나 있다.

모타비주마브, AM14, 101F 및 DS-Cav1-4 와의 착물에서 프리퓨전 형태의 F 단백질의 구조는, 신규한 결합 에피토프를 드러냈다 (도 14). RSV F 와의 공동-결정 구조가 공지된 모든 기타 항체는, DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 에 의해 결합되는 것과 상이한 에피토프에 결합한다. 심지어 DS-Cav1-4 (즉, AM14 및 팔리비주마브) 및 DS-Cav1-L66 (즉, AM14, 팔리비주마브 및 101F) 와 프리퓨전-안정화 RSV F 에 대한 결합을 위해 경쟁하고, 결합 에피토프가 공동-결정 구조 분석에 의해 명백하게 측정되는 항체는, RSV F 에서 상이한 에피토프에 결합한다. 이는 도 14 에 나타나 있다. 본 출원인은 팔리비주마브 및 모타비주마브가 RSV F 에서 동일한 에피토프에 결합하고, 이러한 에피토프가 RSV F 의 프리퓨전 및 포스트퓨전 상태로 존재함에 주목하였다.

실시예 7: 생체내에서 VHH 의 예방적 항-RSV 활성 시험

VHH DS-Cav1-4 또는 DS-Cav1-L66 의 예방적 투여가 생체내에서 RSV 챌린지에 대항해 보호할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 암컷 BALB/c 마우스 (군 당 5 마리의 마우스) 는 30 ㎍ 의 VHH DS-Cav1-4, VHH DS-Cav1-L66, F2 VHH 또는 팔리비주마브를 1.106 PFU 의 RSV A2 로의 감염 4 시간 전에 비강으로 수여받았다. 챌린지 24 시간 이후, 모든 마우스는 30 ㎍ 의 F2 VHH 를 비강내로 수여받았다. 챌린지 5 일 이후, 마우스를 희생시키고, 폐를 20% 수크로오스, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 1 ml 의 HBSS 중에 균질화하였다. DS-Cav1-4, DS-Cav1-L66 또는 팔리비주마브로 처리된 마우스는, 그 폐에서 높은 수준의 복제 바이러스 (약 1x105 PFU) 를 나타내는 F2 VHH 로 처리된 군과 대조적으로, 그 폐에 검출가능한 복제 바이러스를 갖지 않았다 (팔리비주마브로 처리된 한 마리의 마우스는 제외) (도 10 A). 폐에서 복제 바이러스의 수준을 정량화하는데 사용된 플라크 검정은 중화 항체 또는 VHH 의 존재에 영향을 받을 수 있으므로, 본 출원인은 또한 qRT-PCR 에 의해 폐 균질물에서 RSV RNA 의 수준을 정량화하였다. DS-Cav1-4 및 DS-Cav1-L66 로 처리된 마우스는 F2 처리된 대조군 마우스에 비해 평균 3000 배 초과의 적은 바이러스 RNA 를 나타냈다. 팔리비주마브로 처리된 마우스는 F2 처리된 대조군 마우스에 비해 평균 약 100 배의 적은 바이러스 RNA 를 나타냈다.

참고 문헌

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240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 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Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125 Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly 450 455 460 Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val 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Claims

호흡기 세포융합 바이러스 (RSV: respiratory syncytial virus) 의 융합 (F) 단백질의 프리퓨전 폼 (prefusion form) 에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD: immunoglobulin single variable domain) 으로서, ISVD 가 1가 포맷에서 RSV 혈청형 A 및 B 의 유사한 중화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 단일 가변 도메인 (ISVD).
제 1 항에 있어서, ISVD 가 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR2 서열, 및 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하고, 여기서 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 이 상기 각각의 SEQ ID NO 중 임의의 것과 1-, 2- 또는 3-아미노산 차이를 갖는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD).
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 RSV 결합 구조체.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 4 항에 따른 핵산으로 형질전환 또는 트랜스펙션 (transfection) 되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
상기 ISVD 의 제조를 위한, 제 5 항에 따른 숙주 세포의 용도.
약제로서 사용하기 위한, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 또는 제 3 항에 따른 RSV 결합 구조체.
RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방에서 사용하기 위한, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 또는 제 3 항에 따른 RSV 결합 구조체.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 9 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 약학 조성물.
제 9 항에 있어서, RSV 감염의 치료적 처리 또는 예방에서 사용하기 위한, 약학 조성물.