CN108472343A - 抗rsv融合前f蛋白的免疫球蛋白单可变结构域抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)。更具体地说，涉及与RSV的融合(F)蛋白的融合前形式结合的ISVD。本发明进一步涉及这些ISVDs用于预防和/或治疗RSV感染的用途，并涉及包含这些ISVD的药物组合物。

Description

抗RSV融合前F蛋白的免疫球蛋白单可变结构域抗体
技术领域
本发明涉及针对呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)。更具体地说，涉及与RSV的融合(F)蛋白的融合前形式(prefusion form)结合的ISVD。本发明进一步涉及这些ISVD用于预防和/或治疗RSV感染的用途，并涉及包含这些ISVD的药物组合物。
背景技术
呼吸道合胞病毒是婴幼儿急性呼吸道感染的重要原因。到二岁时，几乎所有的儿童都会经历至少一次呼吸道合胞病毒感染。尽管通常只引起轻度疾病，但在一小部分患者中(1-2％)，RSV感染导致需要住院治疗的严重细支气管炎。据估计，每年有16万儿童因感染RSV而死亡。尚没有临床开发出有效的预防性疫苗和RSV特异性治疗小分子。在高危婴儿中能够部分预防由预期的RSV感染引起的严重疾病的唯一方式是，每月注射一种人源化小鼠单克隆抗体(帕利珠单抗(palivizumab))，该抗体针对RSV的F蛋白的融合前和融合后构象。尽管如此，用这种抗体治疗很昂贵，且只能用于预防性治疗。目前正在开发几种其他RSV F蛋白结合剂，包括融合前特异性单克隆抗体(Gilmans等，2015；McLellan等，2013)和RSV F蛋白结合性ISVD。然而，所描述的ISVD对RSV血清型B具有弱的中和活性，和/或需要多价形式来使ISVD有效(WO2009147248；WO2010139808；WO2011064382；Schepens等，2011；Hultberg等，2011)。
最近显示，与RSV F蛋白的融合前构象特异性结合的常规抗体，比结合F的融合后和融合前构象的抗体，是有效得多的体外RSV中和剂(WO2008147196，US2012070446，McLellan等，2013)。然而，常规抗体的生产是麻烦的，并且其稳定性可能受到限制。此外，由于其相对较大的尺寸，常规抗体在复杂样品中或在其他抗体和配体正占据其表位附近的位点时在关连表位的识别上可能受到阻碍。
因此，由于目前还没有广泛接受的治疗方法，故仍然需要可用于有效治疗和/或预防RSV感染的强效抗RSV药物。
发明概述
令人惊讶的是，本文证实，单价ISVD对两种RSV血清型(A和B)都能具有强的中和活性。这是出乎意料的，因为文献提出需要多价构建体来强效抑制RSV的两种血清型。因此，本发明的一个目的是，提供针对RSV F蛋白的融合前构象独特表位的ISVD，从而提供用于治疗和/或预防RSV感染的高度有效ISVD。
本发明的一个方面是，提供特异性结合RSV的F蛋白的融合前形式的ISVD，其特征在于所述ISVD以单价形式显示对RSV血清型A和B相似的中和活性。
在一个实施方案中，本发明涉及ISVD，其包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的CDR1序列，选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的CDR2序列，和选自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的CDR3序列，并且其中CDR1，CDR2和/或CDR3与上述相应SEQ ID NOs中的任一个具有1、2或3个氨基酸差异。
根据另一方面，本发明还涉及包含至少一个如上所述的ISVD的RSV结合构建体。
根据另一方面，本发明涉及编码至少一个如上所述的ISVD的核酸。
根据另一方面，本发明涉及用上述核酸转化或转染的宿主细胞。还可以想到的是，上述宿主细胞用于生产如上所述ISVD的用途。
本发明还涉及如上所述的ISVD或如上所述的RSV结合构建体，其用作药物，特别是用于治疗或预防RSV感染。
根据另一方面，本发明涉及包含至少一个如上所述的ISVD的药物组合物。进一步涉及所述药物组合物作为药物的用途，特别是用于治疗或预防RSV感染的用途。
本发明的目的将从以下描述中清楚。
附图简述
图1:在DS-Cav1免疫的美洲驼(llama)血浆中的中和活性。在用DS-Cav1进行不同免疫后，在获得的血浆中测试了针对RSV A2(A)和RSV B49(B)的中和活性。接种在96孔板中的Vero细胞单层在美洲驼血浆存在下用RSV A2或RSV B49感染，其中所述血浆如X轴所示三倍稀释并且开始于8倍稀释物。计数每个孔中蚀斑的数量，并在Y轴中描绘。Pre DS-Cav 1对应于免疫的美洲驼的免疫前血清。
图2:选择与纯化的重组RSV融合蛋白(F)结合的VHH。用DS-Cav1(灰色条，融合前F)、融合后F(黑色条)或BSA包被ELISA板。用由pHEN4-VHH转化的TG1大肠杆菌细胞制备的细菌周质间隙提取物孵育板，其中从DS-Cav1免疫的美洲驼的PBMC生成VHH展示噬菌体文库，使用该噬菌体文库针对DS-Cav1进行一轮淘选后获得所述pHEN4-VHH转化的TG1大肠杆菌细胞。在该图中，与F蛋白的结合被描述为相对于BSA结合而言的OD 450值的log 2比值。
图3:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)上清液中RSV中和活性的检测。将pKai61-VHH巴斯德毕赤酵母转化体在2ml YPNG培养基中以24孔格式预培养24小时。随后，将细胞置于YPNM培养基中48小时以诱导VHH表达。通过与用于接种Vero细胞单层的RSV A2(30PFU/孔)混合，测试澄清的培养上清液的1/60，1/600和1/6000稀释液的中和活性。具有中和活性的巴斯德毕赤酵母克隆用框示出。(A)用选择的一组独特的pKai61-VHH质粒转化后获得的巴斯德毕赤酵母克隆，由数字表示。(B)用克隆了候选F-特异性VHH文库的pKai61转化后获得的巴斯德毕赤酵母克隆。L3，L13等是指单独的巴斯德毕赤酵母转化体。加框的孔表示具有RSV中和活性的样品。
图4:纯化在巴斯德毕赤酵母中产生的VHH。用甲醇诱导96小时后，收获转化了pKai-VHH-DS-Cav1-4、pKai-VHH-DS-Cav1-L66、pKai-VHH-F2或pKai-VHH-F58的巴斯德毕赤酵母细胞的培养基。将无细胞培养基的重溶解的硫酸铵沉淀物加载到HisTrap柱上，洗涤后，用递增浓度梯度的咪唑洗脱柱子(左)。随后将从HisTrap柱洗脱的峰级分加载到Superdex 75凝胶过滤柱上(右)。显示了VHH-DS-Cav1-4(A)、VHH-DS-Cav1-L66(B)、VHH-F2(C)和VHH-F58(D)的色谱图。
图5:VHH-DS-Cav1-4(A)和VHH-DS-Cav1-L66(B)的核苷酸序列以及在巴斯德毕赤酵母中产生的重组VHH-DS-Cav1-4和VHH-DS-Cav1-L66的预测氨基酸序列(C)。互补决定区(CDRs)和His标签(6xHIS)由标记的框示出。
图6:VHH-DS-Cav1-4和VHH-DS-Cav1-L66具有有效的RSV中和活性。在纯化的VHH(VHH-DS-Cav1-4，VHH-DS-Cav1-L66或阴性对照NB1.14)、单克隆抗体D25或单克隆抗体AM22存在下，用RSV A2(A)或RSV B49(B)感染Vero细胞。VHH和单克隆抗体以3,000ng/ml的浓度开始以三倍稀释系列应用。基于A和B中所示的蚀斑减少,计算50％抑制浓度(IC50)，并在(C)中示出。与对照-VHH和抗HMPV-A1-GFP、hMPV-B1-GFP和RSV A2-GFP的mAbs相比，F-VHH-4(DS-Cav1-4)和F-VHH-L66(DS-Cav1-L66)的IC50值(D)。将预定量的表达GFP的hMPV重组病毒(NL/1/00A1亚系或NL/1/99B1亚系，荷兰鹿特丹的Bernadette van den Hoogen和RonFouchier惠赠)或GFP-hRSV(A2株，美国俄亥俄州哥伦布市Mark Peeples公司惠赠)(MOI0.3ffu/细胞)，与系列稀释的VHH或mAb混合，并加入到96孔板中生长的Vero-118(hMPV)或HEp-2细胞培养物中。36小时后，除去培养基，加入PBS，并用Tecan微板读取器M200测量各孔中的GFP荧光。将荧光值绘制为没有抗体的病毒对照的百分比并用于计算相应的IC50值。
图7:VHH-DS-Cav1-4和VHH-DS-Cav1-L66结合DS-Cav1，但不结合融合后F。(A)用DS-Cav1(上图)或融合后F(下图)包被ELISA板。用纯化VHH-DS-Cav1-4、VHH-DS-Cav1-L66和VHH-F58的1/3稀释系列(从30,000ng/ml开始)温育平板。描绘了OD450值。(B)VHH-DS-Cav1-4和VHH-DS-Cav1-L66与固定的融合前或融合后F蛋白结合的表面等离子体共振(SPR)传感图。在上面的图中，描绘了融合前F的SPR传感图，将仅有缓冲液的样品注射到DS-Cav1(融合前F)和参比流动池上，然后注射2倍系列稀释的VHH-DS-Cav1-4或VHH-DS-Cav1-L66(范围从5nM到39.1pM)，其中1.25nM浓度进行重复。数据扣除双重参考并拟合1:1结合模型(红线)。下方图描绘了VHH-DS-Cav1-4和VHH-DS-Cav1-L66与固定的融合后F结合的SPR传感图。将仅有缓冲液的样品注射到融合后F和参比流动池上，接着注射1μM和500nM浓度的DS-Cav1-4或DS-Cav1-L66。数据扣除双重参考，但不拟合结合模型，因为没有检测到与融合后F的结合。
图8:VHH-DS-Cav1-4和VHH-DS-Cav1-L66与哺乳动物细胞表面上的F结合。用RSVA2F蛋白表达载体(pCAGGS-Fsyn)与GFP-NLS表达载体(peGFP-NLS)组合转染HEK-293T细胞，或仅用GFP-NLS表达载体转染HEK-293T细胞。该图显示了所示的VHH和RSV F特异性小鼠单克隆抗体(MAB858-1，Millipore)对于表达(顶部图)或不表达(下图)RSV F蛋白的GFP阳性细胞的中值荧光强度(FI)。
图9:通过使用生物膜层干涉技术(Biolayer Interferometry)分析抗体在DS-Cav1结合上的交叉竞争。通过乙酸盐缓冲液中的胺偶联反应，将DS-Cav1固定在AR2G生物传感器上。用1M乙醇胺淬灭反应，然后用测定缓冲液(含有1％BSA的PBS)平衡固定了DS-Cav1的生物传感器。将生物传感器浸在竞争者抗体/VHH中，然后浸在分析物抗体/VHH中，在两个抗体/VHH步骤之间有一个短基线步骤。通过比较在不存在和存在每种竞争者的情况下分析物抗体/VHH的结合最大值，来定义抑制百分比。NB：没有结合。
图10:DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66的预防性施用减少体内RSV复制。在用RSV A2攻击之前4小时，将30μg DS-Cav1-4、DS-Cav1-L66或F2和30μg帕利珠单抗鼻内施用于BALB/c小鼠。感染后24小时，所有小鼠鼻内接受30μg的F2。攻击后第5天处死小鼠，通过蚀斑测定(A)和qRT-PCR(B)测定肺部病毒负载。每个数据点表示一只小鼠，水平线表示中位数。#：肺匀浆物中病毒滴度低于检测限的小鼠。图(B)表示RSV RNA的相对表达，相对于所示组中每只小鼠的样品中存在的mRPL13A mRNA水平进行标准化。
图11:VHH-DS-Cav1-4和VHH-DS-Cav1-L66与RSV F上的相同表位结合，具有高度的结构保守性。(A)在融合前稳定的RSV F(SEQ ID NO：16)上与VHH-DS-Cav1-4接触的隐蔽表面积和残基(以粗体显示)。(B)在融合前稳定的RSV F(SEQ ID NO：16)上与VHH-DS-Cav1-L66接触的隐蔽表面积和残基(以粗体显示)。(C)在体内加工之前，融合前稳定的RSV F蛋白的全长可读框(SEQ ID NO：17)中与VHH-DS-Cav1-4和VHH-DS-Cav1-L66两者接触的氨基酸残基，以下划线显示。(D)两个ISVD与RSV融合前F蛋白的共晶体结构显示两个ISVD的高度结构保守性以及与相同表位的结合。
图12:VHH-DS-Cav1-4的结合特异性。(A)VHH-DS-Cav1-4的CDR3环与由RSV F的两个原聚体(protomer)形成的口袋结合。(B)VHH-DS-Cav1-4的CDR2环与位点II相互作用并通过二硫键与CDR3连接。P1＝原聚体1；P2＝原聚体2。
图13:VHH-DS-Cav1-L66的结合特异性。(A)VHH-DS-Cav1-L66的CDR3环与由RSV F的两个原聚体形成的口袋结合。(B)VHH-DS-Cav1-L66的CDR2环与位点II相互作用并通过二硫键与CDR3连接。P1＝原聚体1；P2＝原聚体2。
图14.与莫他珠单抗(motavizumab)、AM14、101F和DS-Cav1-4复合的融合前构象中F蛋白的结构。与莫他珠单抗、AM14、101F和DS-Cav1-4复合的融合前构象中F蛋白的模型。将AM14-Mota-融合前F结构(4ZYP)和肽结合的101F Fab结构(3041)，与DS-Cav1-4结合的融合前F结构的F对齐。DS-Cav1-4的表位以及DS-Cav1-L66的表位位于AM14、莫他珠单抗和101F的表位之间，并且与这些表位中的每一个均部分重叠。
发明详述
定义
参考具体实施方案并参考附图来描述本发明，但是本发明不限于此而是仅由权利要求限定。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。所描述的附图仅是示意性的而非限制性的。在附图中，为了举例说明的目的，一些元件的尺寸可能被放大并且没有按比例绘制。在本说明书和权利要求书中使用术语“包含”时，其并不排除其他元件或步骤。当提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一”，“一个”，“该”，这包括该名词的复数，除非另有特别说明。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一，第二，第三等用于区分相似元件，而不一定用于描述顺序或时顺。应该理解的是，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且这里描述的本发明的实施方案能够以不同于在此描述或示出的其他顺序操作。
提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。除非在本文中特别定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解含义相同的含义。有关本领域的定义和术语，实施者尤其可以参考Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York(1989)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，John Wiley&Sons，NewYork(1999)。本文提供的定义不应被解释为具有比本领域普通技术人员所理解的范围更小的范围。
“免疫球蛋白单可变结构域”或“ISVD”是由单个可变抗体结构域组成的抗体片段。像完整抗体一样，它能够选择性结合特定的抗原。ISVD的分子量仅为12-18kDa，比由两个重链和两个轻链蛋白质组成的常规抗体(150-160kDa)小得多，甚至小于Fab片段(一个轻链和一半重链)和单链可变片段(两个可变结构域，一个来自轻链，一个来自重链)。通常，ISVD具有包含4个框架区(FR1至FR4)和3个互补决定区(CDR1至CDR3)的氨基酸序列，优选根据下式：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。如本文所用，术语“ISVD”包括但不限于：驼源重链抗体的可变结构域(VHH)(也称为纳米抗体TM)、域抗体(dAb)和来自鲨鱼的ISVD(IgNAR结构域)。
如本文所用，术语“特异性结合RSV的F蛋白的融合前形式”指的是，RSV结合多肽(例如抗体，ISVD)可测量地结合至RSV的F蛋白的融合前形式而不结合至RSV的F蛋白的融合后形式的能力。
“RSV的F蛋白的融合前形式”是指RSV F蛋白在病毒-细胞相互作用之前采用的亚稳态融合前构象，如McLellan等，2013所述。它不同于在病毒和细胞膜融合时采用的、高度稳定的融合后形式或融合后构象。
如本文所用的抗体的“单价形式”是指仅能识别一个抗原决定簇的抗体形式。它排除可识别一个以上抗原决定簇的多价抗体形式，例如但不限于二价，三价或四价形式。
本文使用的术语“中和活性”是指，如在体外病毒中和测定，例如但不限于蚀斑减少测定中所测量的，ISVD可以抑制病毒感染。中和(也称为抑制)可以意指完全中和(无可见的病毒感染)或可以意指部分中和。例如，中和可意味着10％中和，20％中和，25％中和，30％中和，40％中和或更多。特别地，中和将至少为50％，例如，50％中和，60％中和，70％中和，75％中和，80％中和，90％中和，95％中和或更多。通常相对于合适的对照(例如用无关ISVD处理)来评估中和活性，所述对照可以由本领域技术人员容易地选择。对于已知浓度的ISVD，中和活性可以表示为50％抑制浓度(IC50)。IC50是达到50％抑制(或中和)时的ISVD浓度。它是ISVD抑制潜力(也被称为效力)的一种度量。
本文使用的“类似的中和活性”是指，以IC50表示的中和活性，其与所比较的中和活性通常相差十倍或更少。更特别地，相差五倍或更少，或者甚至两倍或更少。
术语“互补决定区”或“CDR”是指，免疫球蛋白的H(重链)或L(轻链)的可变区内的可变环，含有能够特异性结合抗原靶标的氨基酸序列。这些CDR区域负责抗体或抗体片段对特定抗原决定簇结构的基本特异性。
术语“表位”是指，抗原或抗原结构上的特异性结合位点，多肽例如ISVD对其具有特异性和亲和力。
术语“构象表位”是指，具有抗原的三维表面特征的表位，允许精确匹配并结合多肽，例如ISVD。相反，线性表位由氨基酸序列(一级结构)决定，而不是由蛋白质的3D形状(三级结构)决定。
如本文所用，“治疗RSV感染”是指，在受试者罹患RSV感染后，施用于所述受试者的、针对RSV感染的任何形式治疗。
如本文所用，“预防RSV感染”是指，在受试者罹患RSV感染之前，施用于所述受试者的、针对RSV感染的预防性处理。预防可以包括使用本发明作为疫苗。
如本文所用，“药物组合物”可以是本领域技术人员已知的任何药物组合物，包括但不限于用于全身，口服和鼻内递送的组合物。
如本文所用，“包含至少一个ISVD的RSV结合构建体”是指，与RSV结合并且包含一个或多个ISVD的任何结合构建体。
如本文所用，“宿主细胞”可以是适于生产ISVD或RSV结合构建体的任何细胞。
根据第一方面，本发明的目的是提供针对和/或特异性结合RSV的F蛋白的融合前形式的ISVD。与RSV F蛋白的融合前形式的特异性结合意指，ISVD可测量地结合RSV的F蛋白的融合前形式，但不结合RSV的F蛋白的融合后形式。例如，ISVD的亲和力和ISVD的浓度可以影响特异性结合。本领域的普通技术人员可以确定用于评估本文描述的ISVD的结合能力的合适条件，例如在合适的结合测定试验中滴定ISVD，例如但不限于酶联免疫吸附测定试验(ELISA)或基于表面等离子体共振(SPR)或生物膜层干涉技术(BLI)的结合测定试验。通常，与RSV F蛋白的融合前形式的结合意味着，ISVD与F蛋白的野生型形式以及F蛋白的任何突变形式结合，只要F蛋白处于融合前构象即可。它还可以包括与RSV的两种亚型(A和B)的F蛋白的结合。在一个具体的实施方案中，上述ISVD结合如SEQ ID NO：18中所示的RSV A F蛋白质共有序列。SEQ ID NO：18所示的共有序列是使用本领域技术人员已知的方法，基于NCBI蛋白数据库中列出的92个RSV A F蛋白全长序列计算获得的。因此，上述ISVD将结合用于衍生SEQ ID NO：18共有序列的该92个代表性RSV A F蛋白序列中的任何一个。在一个具体的实施方案中，上述ISVD结合如SEQ ID NO：19所示的RSV B F蛋白共有序列。SEQ ID NO：19所示的共有序列是使用本领域技术人员已知的方法，基于NCBI蛋白数据库中列出的114个RSVB F蛋白全长序列计算获得的。因此，上述ISVD将结合用于衍生SEQ ID NO：19共有序列的该114个代表性RSV B F蛋白序列中的任何一个。在一个具体的实施方案中，上述ISVD结合SEQID NO：18所示的RSV A F蛋白和SEQ ID NO：19所示的RSV B F蛋白两者。在一个具体的实施方案中，上述ISVD仅结合F蛋白的融合前形式。根据进一步的具体实施方案，上述ISVD仅与F蛋白的融合前形式结合，不结合F蛋白的融合后形式。在一个具体的实施方案中，上述ISVD与SEQ ID NO：16的融合前稳定的RSV F蛋白结合。在一个具体的实施方案中，ISVD可以与其他结构部分融合。
根据具体实施方案，上述ISVD与RSV融合前F蛋白的表位结合。特别地，它们与RSV融合前F蛋白的构象表位结合。在一个具体的实施方案中，上述ISVD结合包含如下氨基酸残基的RSV融合前F构象表位：T50，G51，W52，S180，G184，V185，P265，I266，T267，N268，D269，Q270，L305，G307，V308，N345，A346，G347，K421，S425，K427，N428，R429，G430，I431，S451，G453，N454，L456，Y458。特别地，它们结合包含如下氨基酸残基的RSV融合前F构象表位：如SEQ ID NO：17所示的RSV融合前F的T50，G51，W52，S180，G184，V185，P265，I266，T267，N268，D269，Q270，L305，G307，V308，N345，A346，G347，K421，S425，K427，N428，R429，G430，I431，S451，G453，N454，L456，Y458。
根据具体的实施方案，ISVD以单价形式显示对RSV血清型A和B的相似中和活性。通常，这意味着ISVD干扰/抑制/防止/逆转或减慢病毒感染细胞的能力。根据这些具体的实施方案，对于RSV A和B血清型，ISVD干扰/抑制/防止/逆转或减慢病毒感染细胞的能力达到相似的程度。
根据具体的实施方案，ISVD包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的CDR1序列，选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的CDR2序列、和选自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的CDR3序列，其中CDR1，CDR2和/或CDR3可以与任何前述相应的SEQ ID NO具有1，2或3个氨基酸差异。对于ISVD DS-Cav1-4，CDR的序列是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5。对于ISVDDS-Cav1-L66，CDR的序列是SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6。
根据另一方面，本发明提供RSV结合构建体，其特征在于所述RSV结合构建体包含至少一个ISVD。至少一个ISVD意味着，RSV结合构建体可以包含多于一个的ISVD。除了该一个或多个ISVD之外，RSV结合构建体还可以含有与ISVD连接的其他结构部分。所述另外的结构部分可以与RSV结合或不结合。作为非限制性实例，所述RSV结合构建体可以包含与RSV F蛋白结合的ISVD，并且可以(以化学方式或其它方式)与延长半衰期的一个或多个基团或结构部分(例如，但不限于，聚乙二醇(PEG)或血清白蛋白结合性VHH)连接，以提供具有增加的半衰期的本发明ISVD衍生物。通常，所述RSV结合构建体结合RSV融合前F蛋白。在一个具体的实施方案中，上述RSV结合构建体结合SEQ ID NO：17和/或SEQ ID NO：18和/或SEQ IDNO：19。所述RSV结合构建体可以是包含一个或一个以上RSV结合性ISVD的任何构建体。
根据再一方面，ISVD不是如此提供的，而是作为核酸提供的，即提供编码如本文所述的针对RSV F蛋白，特别是针对F蛋白的融合前形式的ISVD的核酸分子。还提供包含此类核酸或核酸分子的载体。根据又一方面，提供包含此类核酸或载体的宿主细胞。通常通过转染或转化将核酸引入宿主细胞中，但是将核酸引入宿主细胞的方式不构成对本发明的限制。
根据另外的实施方案，提供含有此类核酸的宿主细胞。通常，这样的宿主细胞已经被核酸转化或转染。对于这些宿主细胞，可以想到的一个特定用途是生产ISVD。因此，在本文中明确涉及用于生产的该用途。这意味着，采用转化或转染了编码ISVD的核酸分子的宿主细胞生产ISVD。
根据另一方面，本文提供的ISVD用于医药中。换言之，提供针对RSVF蛋白的ISVD用作药物。这同样适用于编码ISVD的核酸或含有该核酸的载体，即涉及提供编码ISVD的核酸分子或载体用作药物。另外，也提供包含至少一个与RSV F蛋白结合的ISVD的RSV结合构建体，用作药物。根据具体的实施方案，提供ISVD(或包含它们的RSV结合构建体或包含它们的药物组合物、或编码它们的核酸、或包含该核酸的载体)用于治疗或预防RSV感染。这等同于，提供在有需要的受试者中治疗或预防RSV感染的方法，包括向所述受试者施用针对RSVF蛋白的ISVD。此处，ISVD可以作为蛋白质(作为单结构域蛋白，作为RSV结合构建体的一部分或药物组合物)提供，或者可以作为编码针对RSV F蛋白的ISVD的核酸分子施用，或作为包含该核酸分子的载体施用。如果ISVD(或RSV结合构建体)作为蛋白质施用，则可以设想不同的施用途径。作为非限制性实例，ISVD可以全身，口服或鼻内给药，例如，通过鼻吸入。在ISVD作为核酸或载体提供的情况下，特别可以考虑，通过基因疗法施用ISVD。
根据另一方面，提供药物组合物，其包含至少一种针对RSV融合前F蛋白的ISVD。通常，这种药物组合物包含至少一种针对RSV F蛋白的融合前形式的ISVD。所述药物组合物可以包含其他结构部分。所述另外的结构部分可以与RSV结合或不结合。本文考虑提供药物组合物用作药物。特别地，它们被提供用于治疗或预防RSV感染。这等同于，提供在有需要的受试者中治疗或预防RSV感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的药物组合物。
根据进一步的实施方案，提供治疗或预防RSV感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如上所述的ISVD、如上所述的RSV结合构建体或如上所述的药物组合物。所述方法可以包括向所述受试者施用抗RSV融合前F蛋白的ISVD。此类方法通常将导致所述受试者中感染症状的改善或预防。在此，ISVD可作为蛋白质(作为单结构域蛋白，作为RSV结合构建体的一部分或药物组合物)提供，或可作为编码针对RSV F蛋白的ISVD的核酸分子、或作为包含此核酸分子的载体、或作为含有此抗体的药物组合物来施用。而且，可以考虑，在治疗或预防RSV感染的方法中向有需要的受试者施用如本文所述的RSV结合构建体。
应该理解的是，虽然在本文中已经针对本发明的细胞和方法讨论了特定的实施方案、具体构造以及材料和/或分子，但是可以在形式和细节上对其进行各种改变或修改而不背离本发明的范围和精神。提供以下实施例以更好地举例说明特定的实施方式，并且它们不应被视为限制本申请。本申请仅受限于权利要求书。
实施例
用于实施例的材料和方法
免疫和VHH文库生成
在第0、7、14、21、28和35天，每次用167μg纯化的RSV F蛋白DS-Cav1皮下注射美洲驼。DS-Cav1是稳定在融合前构象中的重组RSV F蛋白(McLellan等，2013)。前两次注射使用poly-IC(每次注射375μg)作为佐剂，而Gerbu LQ#3000用作后四次注射的佐剂。在每次免疫之前，采集血液并制备血浆以评估血清转化。在第40天，收集100ml抗凝血液用于制备淋巴细胞。
使用来自外周血淋巴细胞的总RNA作为模板，用寡聚dT引物合成第一链cDNA。使用该cDNA，通过PCR扩增了VHH编码序列，用PstI和NotI消化，并克隆到噬菌粒载体pHEN4的PstI和NotI位点中。用重组pHEN4载体转化电感受态大肠杆菌TG1细胞，得到约5×108个独立转化体的VHH文库。如95个独立转化体的PCR分析所证实的，87％的转化体携带有正确插入大小的载体。
用VCS M13辅助噬菌体感染500μl文库原种，以在噬菌体表面展示VHH序列(与M13PIII融合)，用于生物淘选。
细胞
Hep-2细胞(ATCC，CCL-23)、Vero细胞(ATCC，CCL-81)和HEK-293T细胞(M.Hall博士的惠赠)在补充有10％热灭活胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(Invitrogen，Carlsbad，California)和1mM丙酮酸钠的DMEM培养基中生长。
病毒
RSV A亚型RSV A2(VR-1540，ATCC，Rockville)和RSV B亚型RSV B49(BE/5649/08临床株，获自M.Van Ranst，Tan等人，2013)通过在含有1％FCS的生长培养基存在下以0.1MOI感染单层Hep-2细胞而繁殖。感染五天后，收集细胞和生长培养基，汇集并通过离心(450×g)澄清。为了浓缩病毒，将澄清的上清液在4℃在10％聚乙二醇(PEG6000)存在下温育4小时。离心(3000xg，30分钟)后，将沉淀物重新悬浮于含有20％蔗糖的Hank's平衡盐溶液(HBSS)中，等分，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。
RSV中和活性测定试验
通过蚀斑测定试验，测试美洲驼血浆对RSV A2和RSV B49的中和活性。将Vero细胞接种于96孔板(15000个细胞/孔)中。第二天，在补充有1％青霉素和1％链霉素的Opti-MEM(Gibco)中制备系列稀释的血浆样品(1/3稀释系列，从1/4稀释液开始)。将等体积的RSV A2悬浮液(稀释至1.4PFU/μl)或RSV B49(稀释至2.8PFU/μl)加入血浆样品中，并将所得混合物在37℃孵育30分钟。随后，将50μl混合物加入已用Opti-MEM洗涤的Vero细胞中，并将细胞在37℃温育3小时。接下来，向每个孔中加入在补充有2％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠的DMEM培养基中的50μl 1.2％微晶纤维素(avicel)，并使感染在37℃继续三天。通过向孔中加入50μl 2％多聚甲醛溶液,在室温下固定细胞30分钟。固定后，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，用含有0.2％Triton X-100的50μl PBS透化10分钟，并用含有1％BSA的PBS封闭。随后，加入多克隆山羊抗RSV血清(AB1125，ChemiconInternational)(1/2000在含有0.5％BSA和0.001％Triton X-100(PBS/BSA)的PBS中)。用PBS/BSA洗涤三次后，将细胞与辣根过氧化物酶缀合的抗山羊IgG(SC2020，Santa Cruz)温育30分钟。随后用PBS/BSA洗涤孔四次，并用PBS洗涤一次。最后，通过应用TrueBlue过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg)使蚀斑可视化。用该测定试验也测定了巴斯德毕赤酵母粗上清液和纯化的VHH的RSV中和活性(见下文)。
分离DS-Cav1结合性VHH
我们进行了一轮淘选，以富集融合前F(DS-Cav1)结合性噬菌体。微量滴定板(II型，F96Maxisorp，Nunc)上的一个孔(孔A1)用20μg DS-Cav1在PBS中包被过夜。用SEA BLOCK封闭缓冲液(Thermo Scientific)将该孔连同未包被的阴性对照孔(孔A12)一起封闭1小时。接下来，将100μl体积的SEA BLOCK封闭缓冲液中1012个噬菌体加入到这两个孔中。1小时后，除去未结合的噬菌体颗粒，用PBST(PBS+0.5％吐温20)洗涤孔十次。然后通过向孔施加由100μl TEA-溶液(14％三乙胺(Sigma)pH10)组成的碱性溶液精确的十分钟来洗脱保留的噬菌体。然后将解离的噬菌体转移到具有100μl 1M TRIS-HCl pH 8.0的无菌管中。用洗脱的噬菌体制备PBS中的10倍系列稀释液，用10μl这种稀释系列感染90μlTG1细胞(噬菌体展示感受态大肠杆菌细胞)。在37℃感染30分钟，然后将细菌铺在含有100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的LB/琼脂平板上。通过比较从抗原包被孔洗脱的噬菌粒颗粒数目与从阴性对照孔洗脱的噬菌粒颗粒数目，评估通过该淘选程序对抗原特异性噬菌体的富集。
随机选择90个氨苄青霉素抗性菌落用于ELISA，进一步分析其周质中F特异性VHH的存在。首先将这些菌落转移到含有氨苄青霉素的新鲜LB琼脂平板上，然后用于接种24孔深孔板中1ml含100μg/ml氨苄青霉素的Terrific Broth(TB)培养基。将接种的平板在37℃温育，同时摇动5小时。通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导VHH表达，直至浓度为1mM。随后将平板在37℃振荡温育过夜。第二天，通过离心(3200rpm 12分钟)沉淀细菌细胞，除去上清液。将细胞沉淀重新悬浮在200μl TES缓冲液(0.2M TRIS-HCl pH8,0.5mMEDTA，0.5M蔗糖)中，并将平板在4℃振荡30分钟。接下来，将水添加到重新悬浮的细胞中以诱导渗透性休克(osmotic shock)，这导致包括VHH的周质蛋白的释放。将深孔板在4℃振荡孵育1小时，离心并回收含有周质提取物的上清液。四个微量滴定板用100ng蛋白质/孔在PBS中包被过夜，两个板具有交替列的融合后构象F(McLellan等，2011)和BSA，两个板具有交替列的DS-Cav1和BSA。然后洗涤包被的微量滴定板，并用1％的奶粉在PBS中封闭。洗涤微量滴定板后，将100μl周质提取物加入到孔中，然后在4℃孵育1小时。洗涤平板并在室温下向板中加入50μl在PBS中的抗-HA(MMS-101P Biolegend)单克隆抗体的1/2000稀释液1小时。洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)连接的抗小鼠IgG(NXA931，GE Healthcare)在PBS中的1/2000稀释液，并温育平板1小时。接下来，洗涤平板，每孔加入50μlTMB底物(四甲基联苯胺，BD OptEIA TM)。通过加入50μl 1M H2SO4终止反应，然后用iMark Microplate吸光度读取器(Bio Rad)测量450nM的吸光度。选择从DS-Cav1或融合后F得到的OD450值比从BSA获得的OD450值高至少两倍的所有周质级分，用于进一步分析。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)，使相应的细菌在含有1/2000氨苄青霉素的3ml LB培养基中生长以用于质粒分离。使用M13RS引物(5'CAGGAAACAGCTATGACC3')通过Sanger测序，确定克隆的VHH的cDNA序列。
VHH在毕赤酵母表达载体中的克隆及巴斯德毕赤酵母的转化
VHH序列，以及淘选后保留的VHH序列，使用以下正向和反向引物，从相应的pHEN4质粒通过PCR扩增：(5’GGCGGGTATCTCTCGAGAAAAGGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGG3’；5’CTAACTAGTCTAGTGATGGTGATGGTGGTGGCTGGAGACGGTGACCTGG3’)。得到的PCR产物用XhoI和SpeI消化并连接到XhoI/SpeI消化的pKai61主链中。在Schoonooghe等，2009中描述了pKai61载体的来源。将VHH序列与酿酒酵母α-交配因子信号序列的轻微修饰形式克隆在读框内。该信号序列将蛋白质导向酵母分泌系统，在ER和高尔基体中进一步加工，并在分泌到细胞外培养基中之前被完全除去。与野生型前原信号相反，该修饰形式不包含编码GluAla重复的序列(在此，信号肽可以被Kex2内肽酶有效切割而不需要该重复)。编码的基因含有C端6xHis标签，并处于甲醇诱导型AOX1启动子的控制之下。该质粒含有用于在细菌以及酵母细胞中选择的Zeocine抗性标记。载体在转化至巴斯德毕赤酵母之前在AOX1启动子中(用Pmel)线性化，以促进在内源AOX1基因座中的同源重组以稳定整合到基因组中。所得到的载体分别命名为pKai-DS-Cav1-4，pKai-DS-Cav1-L66，pKai-VHH-F2和pKai-VHH-F58，并使用Lin-Cereghino等人，2005所述的凝缩转化(condensed transformation)方案，转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115。
纯化由巴斯德毕赤酵母产生的VHH
首先在2ml培养物中分析转化的巴斯德毕赤酵母克隆的VHH表达。在第1天，用各单个转化体接种具有100μg/ml Zeocin(Life Technologies)的2ml YPNG培养基(2％蛋白胨，1％细菌培养酵母提取物，1.34％YNB，0.1M磷酸钾pH6,0.00004％生物素，1％甘油)，并在28℃振荡孵育24小时。第二天，通过离心(500g，8分钟)将细胞沉淀，并用YPNM培养基(2％蛋白胨，1％细菌酵母提取物，1.34％YNB，0.1M磷酸钾pH6,0.00004％生物素，1％甲醇)替换YPNG培养基以诱导VHH表达，将培养物在28℃振荡温育72小时。在72小时，80小时和96小时向培养物中加入50μl50％的甲醇。在转移到含有甲醇的培养基中100小时后，通过离心(500g，8分钟)沉淀酵母细胞，保留上清以评估VHH的存在。将粗制培养基(25μl)加载到15％SDS-PAGE凝胶上，之后通过考马斯亮蓝染色分析蛋白质的存在。为了选择具有RSV中和活性的VHH，通过如上所述的蚀斑测定试验，应用连续稀释的上清液，测定了在来自各单个巴斯德毕赤酵母转化体的粗制YPNM上清液中的该活性。
选择在培养基中产生高水平VHH或具有高RSV中和活性的巴斯德毕赤酵母转化体进行放大，其中使用100或300ml毕赤酵母培养物。生长和甲醇诱导条件以及培养基的收获与上述用于2ml培养物的类似。将澄清的培养基在4℃下进行硫酸铵沉淀(80％饱和度)4小时。通过20,000g离心沉淀不溶级分，并溶解于10ml HisTrap结合缓冲液(20mM磷酸钠，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH7.4)中，在4℃离心10分钟，然后上清液加载至1ml HisTrap HP柱(GEHealthcare，用HisTrap结合缓冲液预平衡)上。用至少10倍柱体积的HisTrap结合缓冲液洗涤柱子(直到吸光度达到稳定基线)之后，用HisTrap结合缓冲液中的线性咪唑梯度(从20mM开始并终止于500mM咪唑)洗脱结合的蛋白，总体积20ml。汇集通过SDS-PAGE分析确定含有VHH的级分，并用Vivaspin柱(5kDa截留，GE Healthcare)浓缩至2ml。然后将这些浓缩级分在PBS中加载到Superdex 75柱(160ml，0.8ml/min)，汇集峰级分并在具有5kDa截留值的Vivaspin柱上浓缩。该汇集级分的蛋白质浓度通过NanoDrop 1000和A280测量来确定，其中溶液消光系数的百分比针对每个VHH进行定制。将合并和浓缩的级分等分并储存在-80℃备用。
计算纯化的VHH的50％抑制浓度(IC 50)
为了确定由巴斯德毕赤酵母产生的纯化VHH的IC50，在Opti-Mem中制备VHH的三倍系列稀释液，在如上所述的RSV中和测定试验中进行评估。将单克隆IgG D25和AM22(Beaumont等，2012，Spits等，2013)用作阳性对照，两者均特异地针对F的融合前构象。NB1.12(针对α-巨球蛋白的VHH)用作阴性对照。人工计算IC50值。
VHH与DS-Cav1和融合后F的体外结合
纯化的VHH与DS-Cav1和融合后F的结合在直接ELISA中进行测试。用100μl的1μg/ml DS-Cav1溶液或1μg/ml的融合后F溶液在PBS中包被微量滴定板(II型，F96Maxisorp，Nunc)。洗涤后，将平板用200μl含4％牛奶的PBS封闭1小时，然后再用PBS洗涤一次。然后将VHH的1/3稀释系列(从30μg/ml开始)施加到蛋白质包被的孔中。1小时后，洗涤板，加入PBS中的抗组氨酸标签抗体(AD1.1.10AbD Serotec)的1/2000稀释液1小时。洗涤并加入HRP连接的抗小鼠IgG(1/2000稀释)1小时后，以与上述PE-ELISA相同的方式使ELISA显色。为了亲和力测定，使用Biacore X100(GE)，在NTA传感器芯片上捕获具有StrepTag II和6X HisTag的纯化DS-Cav1，至每个循环约537个反应单位(RU)。NTA传感器芯片在循环之间使用0.25MEDTA然后0.5mM NiCl2再生。将仅缓冲液的样品注射到DS-Cav1和参考流动池上，然后注射在HBS-P+中从5nM起2倍连续稀释至39.1pM的Nb4或Nb66，其中重复1.25nM浓度。将数据减去双参考，并使用scrubber进行1:1结合模型拟合。
VHH与RSV F cDNA表达载体转染的细胞表面上表达的F的结合，通过流式细胞术进行评估。HEK293T细胞以每150mm组织培养板4,000,000个细胞接种，并用FuGENE HD转染试剂(Promega)和6.4μg编码密码子优化的RSV F cDNA的pCAGGS-Fsyn进行转染。为了追踪转染的细胞，转染在6.4μg peGFP-NLS存在下进行。对照转染仅用peGFP-NLS进行。转染后18小时，用15ml胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶，0.5mM EDTA(pH8.0))使细胞脱壁，用PBS洗涤一次，并在含有1％BSA的PBS(PBS/BSA)中温育30分钟。随后，将细胞与指定的VHH或RSV-F特异性小鼠单克隆抗体(MAB858-1，Chemicon International)在不同的浓度(如图8所示)温育。1小时后，将细胞用PBS/BSA洗涤一次，并用在PBS/BSA中1/3000稀释的抗组氨酸标签抗体孵育1小时。接下来，细胞用PBS/BSA洗涤一次，加入抗小鼠IgG Alexa 633为期30分钟。用PBS洗涤细胞三次后，使用FACSCalibur流式细胞仪分析细胞。基于侧向散射信号的峰面、前向散射信号的峰面和峰高、以及绿色荧光信号的峰面来选择表达GFP的单细胞。最后，在这些GFP阳性单细胞中，测量Alexa 633荧光强度信号。
小鼠
从Charles River(Charles River Wiga，Sulzfeld，Germany)获得特定无病原体的雌性BALB/c小鼠。将动物笼养在具有12小时光照/黑暗周期的温控环境中；食物和水随意获取。动物设施根据Flemish政府批准文号LA1400536运行。所有实验均在法律规定的条件下进行，并获得实验动物伦理委员会授权(伦理申请EC2015-019)。
VHH和单克隆抗体的施用和小鼠的RSV攻击
在鼻内施用VHH、帕利珠单抗或RSV攻击性病毒之前，通过异氟烷轻度麻醉小鼠。VHH、帕利珠单抗(Synagis，Medimmune)和RSV病毒以配制在PBS中的50μl总体积施用，均等分到两个鼻孔中。每组五只小鼠接受30μg的DS-Cav1-4、30μg的VHH-DS-Cav1-L66、30μg的VHH-F2(作为阴性对照)或30μg的帕利珠单抗(作为阳性对照)，4小时后用1,000,000PFU的RSV A2感染。感染后24小时，所有组还接受30μg阴性对照VHH-F2。
通过蚀斑测定试验确定肺病毒滴度
攻击后五天，脱颈处死小鼠。无菌取出小鼠的肺，并在无菌金属珠存在下、在含有20％蔗糖并补充有1％青霉素和1％链霉素的1ml HBSS中、通过用Mixer Mill MM 2000(Retsch)剧烈振荡，进行匀浆。随后通过在4℃离心(10分钟，2500rpm)澄清肺匀浆物，并一式两份用于在Vero细胞上进行病毒滴定。在补充有青霉素和链霉素的无血清Opti-MEM培养基(Invitrogen)中，在96孔板中，用50μl的1:3系列稀释的肺匀浆物感染Vero细胞单层。如上所述进一步进行蚀斑试验。计数每个孔中的蚀斑，如下所示，针对每个稀释度，计算每个肺中PFU的数量(1ml)：稀释液中存在的蚀斑数×稀释度×20(＝1000μl总上清液体积/50μl用于感染稀释系列第一孔的上清液)。以一式两份重复的平均值计算每个肺中PFU的数量。
通过qRT-PCR确定肺病毒滴度
为了通过qRT-PCR确定肺RSV负荷，根据制造商的说明书使用高纯度RNA组织试剂盒(Roche，Mannheim)，制备来自澄清的肺匀浆物的总RNA。使用随机六聚体引物和Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒(Roche，Mannheim)制备cDNA。使用对RSV A2M基因特异的引物(5'TCACGAAGGCTCCACATACA3'和5'GCAGGGTCATCGTCTTTTTC3')和核苷酸探针(#150Universal Probe Library，Roche)，通过qRT-PCR确定基因组RSV M cDNA的相对水平，其中所述核苷酸探针在5'-末端以荧光素(FAM)标记并在3'-末端附近具有深色猝灭剂染料。将qRT-PCR数据相对于存在于每只小鼠样品中的mRPL13A mRNA水平进行标准化。
在DS-Cav1结合上的抗体交叉竞争
通过乙酸盐缓冲液(pH 5.0)中的胺偶联反应，将DS-Cav1蛋白(10μg/ml)固定在AR2G生物传感器上。用1M乙醇胺淬灭反应，然后用测定缓冲液(含有1％BSA的PBS)平衡固定DS-Cav1的生物传感器。将生物传感器浸入竞争抗体(在测定缓冲液中35μg/ml)，然后浸入分析物抗体(测定缓冲液中35μg/ml)，在两个抗体步骤之间为短基线步骤。
实施例1：美洲驼血浆中的RSV中和活性
为了评估用DS-Cav1免疫后体液抗RSV应答在美洲驼中的诱导情况，在RSV中和测定试验中，测试了在每次免疫之前和之后获得的血浆样品。测试样品对RSV-A2和RSV B临床株RSV B49的中和活性。图1显示，第四次免疫后获得的所有血浆样品对RSV A2和RSV B49均具有高度的中和活性。
实施例2：分离DS-Cav1特异性VHH
将VHH噬菌体文库在DS-Cav1蛋白质上进行一轮淘选。通过比较从DS-Cav1包被的孔洗脱的噬菌体数量和从未包被的孔洗脱的噬菌体数量，评估DS-Cav1特异性噬菌体的富集。通过测定氨苄青霉素抗性转导单位，即用淘选步骤中洗脱的噬菌体转导的TG1菌落的数目，间接估计洗脱的噬菌体的数目。该实验表明，对于DS-Cav1特异性噬菌体，噬菌体群体被富集了约140倍。随机选择90个菌落，通过ELISA分析在其周质提取物中对融合前构象F(DS-Cav1)特异的VHHs与对融合后构象F特异的VHHs的存在。ELISA的结果如图2所示。在90个菌落中，37个菌落评分为阳性(10个评分为对融合前和融合后F两者均为阳性，19个评分为仅对融合前F为阳性，8个评分为仅对融合后F为阳性)。确定所有展示出与融合前和/或融合后F结合的菌落的VHH序列。37个中，28个克隆具有独特的VHH序列，并被选择用于进一步的使用。将这些克隆的VHH序列克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体中，随后所得质粒用于转化巴斯德毕赤酵母。
实施例3：测试巴斯德毕赤酵母上清液中的中和活性
我们也尝试，将在DS-Cav1上一轮淘选后获得的VHH cDNA文库克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体pKai61中。我们使用该策略以尝试基于各个巴斯德毕赤酵母转化体上清液中的RSV中和活性来选择生物学上相关的VHH候选物。从基于与F的结合选择的20个单独的巴斯德毕赤酵母转化体中，5个具有针对RSV A2的中和活性(其中DS-Cav1-4是最强的一个)，而从克隆到pKai61的文库获得的18个克隆中，仅一个(VHHDS-Cav1-L66)显示中和活性(图3)。
通过Sanger测序确定了DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66的cDNA序列，并且核苷酸序列以及推导的氨基酸序列示于图5中。
实施例4：产生纯化的VHH和测定IC50
在纯化之前，VHH DS-Cav1-4和VHH DS-Cav1-L66是具有最强RSV中和性的VHH，在300ml巴斯德毕赤酵母培养物中产生了这两种VHH以及阴性对照VHH F2和F58，并通过HisTrap纯化接着通过superdex 75大小排阻层析进行纯化(图4)。VHH F2和VHH F58是从以下VHH文库获得的无关对照VHH，所述VHH文库衍生自已经用失活的Junin病毒免疫的不同美洲驼。VHH DS-Cav1-4和VHH DS-Cav1-L66体外中和RSV A2，其IC50分别为0.021nM和0.032nM。对于中和RSV B49，VHHDS-Cav1-4和VHH DS-Cav1-L66分别显示0.015nM和0.032nM的IC50。为了评价VHH DS-Cav1-4和VHH DS-Cav1-L66是否可以中和人偏肺病毒(Metapneumovirus)A和/或B血清型，将预定量的表达GFP的hMPV重组病毒(NL/1/00A1亚系或NL/1/99B1亚系，Bernadetter van den Hoogen和Ron Fouchier惠赠，Rotterdam,荷兰)或GFP-hRSV(A2株，Mark Peeples惠赠，Columbus，Ohio，USA)(MOI 0.3ffu/细胞)，与连续稀释的VHH或mAb混合，并加入在96孔板中生长的Vero-118(hMPV)或HEp-2细胞培养物中。36小时后，除去培养基，加入PBS，并用Tecan微板读取器M200测量每孔GFP的荧光强度。将荧光值绘制为没有抗体的病毒对照的百分比并用于计算相应的IC50值。
实施例5：DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66与融合前状态的RSV F结合，但不与融合后状态的RSV F结合。
为了评估DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66对融合前和后F的结合能力，我们进行了ELISA，其中用每一构象的F直接包被微量滴定板，并加入三倍系列稀释的VHHs(图7A)。我们发现，VHH DS-Cav1-4和VHHDS-Cav1-L66特异性地结合包被的融合前F但不结合包被的融合后构象的F。为了进一步表征对融合前F蛋白的结合亲和力，我们进行了基于SPR的结合实验。我们发现，两种ISVD都以皮摩尔亲和力与融合前RSV F结合。与常规单克隆抗体如帕利珠单抗或AM14(Gilman等，2015)本质上是二价的不同，这些ISVD是单价的，故令人惊讶的是，这些ISVD对其靶标表现出如此高的亲和力。特别是，DS-Cav1-4的解离速率非常低。
还评价了VHH DS-Cav1-4和VHH DS-Cav1-L66与哺乳动物细胞表达的F的结合。用编码密码子优化的F cDNA的pCAGGS-Fsyn和peGFP-NLS共转染HEK293T细胞。转染18小时后收获细胞，并用VHHDS-Cav1-4、VHH DS-Cav1-L66、阴性对照VHH F58和F2、以及对RSV-F特异的单克隆小鼠IgG抗体染色。将VHH与共转染中的GFP阳性细胞的结合，与VHH对仅用GFP表达载体转染的GFP阳性细胞的结合，进行比较。对于VHH DS-Cav1-4和VHH DS-Cav1-L66的所有稀释液以及三种最高浓度的阳性抗RSV F对照单克隆抗体，观察到了清楚的结合(图8)。
实施例6：DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66与RSV F的新表位结合
为了研究DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66是否与最近描述的融合前F特异性表位结合，我们通过生物膜层干涉技术研究了这些VHH是否可以与表位特异性D25抗体竞争结合RSV融合前F蛋白(图9)。竞争测定表明这些VHH无一与D25发生竞争。相反，两个VHH相互竞争。这些结果表明两个VHH结合重叠表位，但这些表位与D25表位不同。
对ISVD表位的进一步表征证实，DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66结合RSV F上的相同表位，具有高结构保守性(图11A-D)。在图11C中，下划线标出了融合前稳定的RSV F蛋白(完全开放阅读框，在体内加工之前，SEQ ID NO：17)中与DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66两者接触的残基。具体而言，RSV F蛋白的以下氨基酸残基形成DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66的表位的一部分：T50,G51,W52,S180,G184,V185,P265,I266,T267,N268,D269,Q270,L305,G307,V308,N345,A346,G347,K421,S425,K427,N428,R429,G430,I431,S451,G453,N454,L456,Y458。这些残基是DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66两者的表位。图12(对于DS-Cav1-4)和图13(对于DS-Cav1-L66)显示了CDR2和CDR3环结合的更多细节。.
与莫他珠单抗、AM14、101F和DS-Cav1-4复合的融合前构象F蛋白的结构，揭示了新的结合表位(图14)。与RSV F的共晶结构为已知的所有其他抗体，与DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66结合不同的表位。甚至是结合表位已经明确地通过共晶体结构分析确定的、与DS-Cav1-4(即AM14和帕利珠单抗)和DS-Cav1-L66(即AM14，帕利珠单抗和101F)竞争结合融合前稳定的RSV F的抗体，也结合在RSV F中的不同表位上。这显示在图14中。我们注意到，帕利珠单抗和莫他珠单抗结合RSV F中的相同表位，并且该表位存在于RSV F的融合前和融合后状态中。
实施例7：体内测试VHH的预防性抗RSV活性
为了测试预防性给予VHH DS-Cav1-4或DS-Cav1-L66是否可以在体内抵抗RSV攻击，雌性BALB/c小鼠(每组五只小鼠)鼻内接受30μg VHHDS-Cav1-4、VHH DS-Cav1-L66、F2VHH或帕利珠单抗，四小时后用1.106PFU的RSV A2感染。攻击后24小时，所有小鼠鼻内接受30μg F2VHH。攻击后5天，将小鼠处死，并将肺在1ml补充有20％蔗糖、青霉素和链霉素的HBSS中匀浆。用DS-Cav1-4，DS-Cav1-L66或帕利珠单抗处理过的小鼠在肺部(除用帕利珠单抗处理的一只小鼠外)没有可检测到的复制病毒(图10A)，相对地用F2VHH处理的小鼠组在其肺中显示了高水平的复制病毒(约1x105PFU)。由于用于定量肺中复制病毒水平的蚀斑测定试验可能受中和抗体或VHHs的存在的影响，我们还通过qRT-PCR定量了肺匀浆物中RSVRNA的水平。与F2处理的对照小鼠相比，用DS-Cav1-4和DS-Cav1-L66处理的小鼠平均显示少3000倍以上的病毒RNA。与F2处理的对照小鼠相比，用帕利珠单抗处理的小鼠平均显示出少约100倍的病毒RNA。
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Claims (11)

1.特异性结合呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白的融合前形式的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)，其特征在于，所述ISVD以单价形式显示对RSV血清型A和B的相似中和活性。
2.根据权利要求1的ISVD，其特征在于，所述ISVD包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的CDR1序列，选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的CDR2序列，和选自SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6的CDR3序列，并且其中CDR1，CDR2和/或CDR3与前述相应的SEQ ID NOs中的任何一个具有1，2或3个氨基酸差异。
3.RSV结合构建体，其特征在于所述RSV结合构建体包含至少一个根据权利要求1或2的ISVD。
4.核酸，其特征在于所述核酸编码至少一个根据权利要求1或2的ISVD。
5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转化或转染了根据权利要求4的核酸。
6.根据权利要求5的宿主细胞用于生产所述ISVD的用途。
7.根据权利要求1或2的ISVD或根据权利要求3的RSV结合构建体用作药物。
8.根据权利要求1或2的ISVD或根据权利要求3的RSV结合构建体用于治疗或预防RSV感染。
9.药物组合物，其特征在于所述药物组合物包含至少一个根据权利要求1或2的ISVD。
10.根据权利要求9的药物组合物用作药物。
11.权利要求9的药物组合物用于治疗或预防RSV感染。
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