JP2022060169A - Rsv fタンパク質生産のための細胞培養工程 - Google Patents
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Abstract
【課題】RSV Fタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法を提供すること。【解決手段】方法は、温度を、約30.0℃~約32.0℃の間のより低い温度、好ましくは、約31.0℃に移行させる、温度移行を含む。【選択図】図2
Description
本発明は、RSV Fタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法に関する。
呼吸器合胞体ウイルス、すなわちRSVは、肺および呼吸路に感染する呼吸器系ウイルスである。RSVは、全世界で小児における重篤なウイルス性下気道疾患の主原因であり、高齢者における呼吸器疾患の重要な原因である。しかし、RSV感染の予防用に承認されたワクチンはない。
RSVは、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科の仲間である。そのゲノムは、9種の構造タンパク質(3種の糖タンパク質および6種の内部タンパク質)と2種の非構造タンパク質を含む11種のタンパク質をコードする一本鎖のネガティブセンスRNA分子からなる。構造タンパク質には、3種の膜貫通型表面糖タンパク質、すなわち、付着タンパク質G、融合タンパク質F、および小さい疎水性のSHタンパク質が含まれる。RSVには、AとBの2つのサブタイプが存在する。これらサブタイプは、主としてG糖タンパク質が異なっており、F糖タンパク質の配列は、2つのサブタイプ間で、より保存されている。
成熟F糖タンパク質は、外部ドメイン(ED)、膜貫通ドメイン(TM)、および細胞質側末端(CT)の3つの一般ドメインを有する。CTは、パルミトイル化システイン残基をただ1つ含んでいる。
ヒトRSVのF糖タンパク質は、最初に、mRNAから、N末端にシグナルペプチド配列(アミノ酸1~25)を含んでいる、単独の574アミノ酸のポリペプチド前駆体(「F0」または「F0前駆体」と呼ばれる)として翻訳される。翻訳されると、シグナルペプチドは、小胞体において、シグナルペプチダーゼによって除去される。F0前駆体の残りの部分(すなわち、残基26~574)は、細胞プロテアーゼ(特に、フューリン)によって、2つの多塩基部位(a.a.109/110および136/137)においてさらに切断され、pep27と呼ばれる27アミノ酸の介在配列(アミノ酸110~136)を脱離させ、F1(C末端部分、アミノ酸137~574)およびF2(N末端部分、アミノ酸26~109)と呼ばれる、連結された2つの断片を生じうる。F1は、そのN末端にある疎水性の融合ペプチド、および2つのヘプタッド反復領域(HRAおよびHRB)を含んでいる。HRAは、融合ペプチドに近く、HRBは、TMドメインに近い。F1断片とF2断片は、2つのジスルフィド結合によって連結されている。シグナルペプチド配列なしの切断されていないF0タンパク質、またはF1-F2ヘテロ二量体のいずれもが、RSV Fプロトマーを形成しうる。3つのこうしたプロトマーが集合して、3つのプロトマーのホモ三量体である最終RSV Fタンパク質複合体を形成する。
サブタイプAとBのFタンパク質は、アミノ酸配列の同一性が約90パーセントである。F0前駆体ポリペプチドの、Aサブタイプについての見本配列を、配列番号1(A2株、GenBank GI:138251、Swiss Prot P03420)に示し、Bサブタイプについては、配列番号2(18537株、GenBank GI:138250、Swiss Prot P13843)に示す。配列番号1と配列番号2は、どちらも574アミノ酸の配列である。また、配列番号1および配列番号2のシグナルペプチド配列は、アミノ酸1~25であると報告されている(GenBankおよびUniProt)。両方の配列において、TMドメインは、概ねアミノ酸530~550であるが、他方では、525~548とも報告されている。細胞質側末端領域は、アミノ酸548または550のいずれかにおいて始まり、アミノ酸574で終わり、パルミトイル化システイン残基は、アミノ酸550に位置している。
RSVサブユニットワクチンのために検討される主要な抗原の1つが、Fタンパク質である。RSV Fタンパク質三量体は、ビリオン膜と宿主細胞膜の融合を媒介し、合胞体の形成も促進する。この最も大きいF分子集団は、宿主細胞の膜と融合する前のビリオンでは、TMドメインがウイルスエンベロープに固定された状態で、棒付きキャンディーの形状をした構造をなす[Dormitzer,P.R.、Grandi,G.、Rappuoli,R.、Nature Reviews Microbiol、10、807、2012]。この高次構造は、融合前高次構造と呼ばれる。融合前RSV Fは、オリゴマー状態の区別なしに、モノクローナル抗体(mAb)であるD25、AM22、およびMPE8によって認識される。融合前F三量体は、mAbであるAM14によって特異的に認識される[Gilman MS、Moin SM、Mas Vら、Characterization of a prefusion-specific antibody that recognizes a quaternary,cleavage-dependent epitope on the RSV fusion glycoprotein、PLoS Pathogens、11(7)、2015]。DRSVが細胞に侵入する際、Fタンパク質は、融合前状態(本明細書では「プレF」と呼ぶ場合もある)から、ほぐれた中間構造を経て、融合後状態(「ポストF」)に再編成される。この再編成の間、融合前分子のC末端コイルドコイルが解離して、それを構成していた3本の鎖になり、次いでこれらが、球状の頭部に巻き付き、追加の3つのヘリックスと一緒になって、融合後の6ヘリックスバンドルを形成する。融合前RSV F三量体は、温度上昇などの、苛烈さを増す化学的または物理的条件にさらされた場合、構造の変化を被る。最初に、(分子内で少なくとも局所的に)三量体構造が損なわれ、次いで、融合後形態へと再編成され、次いで、ドメインが変性する。
ウイルス侵入を防ぐためには、ウイルスエンベロープが細胞膜と融合する前に、ビリオン上にあるFの融合前高次構造、または、可能性として、ほぐれた中間体に、F特異的中和抗体が結合しなければならないと推定される。したがって、Fタンパク質の融合前形態は、所望のワクチン抗原として好ましい高次構造であると考えられる[Ngwuta,J.O.、Chen,M.、Modjarrad,K.、Joyce,M.G.、Kanekiyo,M.、Kumar,A.、Yassine,H.M.、Moin,S.M.、Killikelly,A.M.、Chuang,G.Y.、Druz,A.、Georgiev,I.S.、Rundlet,E.J.、Sastry,M.、Stewart-Jones,G.B.、Yang.Y.、Zhang,B.、Nason,M.C.、Capella,C.、Peeples,M.、Ledgerwood,J.E.、Mclellan,J.S.、Kwong,P.D.、Graham,B.S.、Science Translat.Med.、14、7、309(2015)]。F糖タンパク質は、TritonX-100、TritonX-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween20、Tween80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、SDS、CHAPS、CHAPSOなどの界面活性剤による膜の抽出、外部ドメインとしての発現、物理的もしくは化学的ストレス、または貯蔵を経ると、融合後形態に容易に変換される[McLellan JS、Chen M、Leung Sら、Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a pre-fusion-specific neutralizing antibody、Science 340、1113~1117(2013);Chaiwatpongsakorn,S.、Epand,R.F.、Collins,P.L.、Epand R.M.、Peeples,M.E.、J Virol.85(8):3968~77(2011);Yunus,A.S.、Jackson T.P.、Crisafi,K.、Burimski,I.、Kilgore,N.R.、Zoumplis,D.、Allaway,G.P.、Wild,C.T.、Salzwedel,K.、Virology.2010 Jan 20;396(2):226~37]。したがって、融合前Fのワクチン抗原としての調製は、依然として難題となっている。中和および防御抗体は、ウイルス進入を妨害することにより機能するため、融合後特異的抗体だけを惹起するF抗原は、融合前特異的抗体を惹起するF抗原ほど有効になるとは見込まれないと仮定される。したがって、融合前形態(または可能性として、ほぐれた中間形態)のFタンパク質免疫原を含有するFタンパク質ワクチンを利用することがより望ましいと考えられる。タンパク質の融合前形態の安定性を向上させるために、RSV Fタンパク質の突然変異体が提供されており(たとえば、PCT出願第WO2017/109629号を参照されたい)、有望なワクチン候補になっている。
Dormitzer,P.R.、Grandi,G.、Rappuoli,R.、Nature Reviews Microbiol、10、807、2012
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したがって、所望の三量体高次構造をとり、適切な力価を有する、こうした抗原を生産するための工程が必要である。そのような工程はまた、大規模で使用されるように十分に頑強にすべきである。加えて、宿主細胞タンパク質(HCP)または他の不純物の量は、生産された三量体の下流での加工を容易にするために、最小限に抑えるべきである。
本発明は、RSV Fタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法であって、
(i)RSV Fタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
(ii)細胞を、約33.0℃~35.0℃の間の温度で培養するステップと、
(iii)既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法に関する。
(i)RSV Fタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
(ii)細胞を、約33.0℃~35.0℃の間の温度で培養するステップと、
(iii)既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法に関する。
一部の実施形態では、方法は、温度を、約30.0℃~約32.0℃の間のより低い温度、好ましくは、約31.0℃に移行させる、温度移行を含む。
本発明は、RSV Fタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法であって、
(i)RSV Fタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
(ii)細胞を、約33.0℃~約35.0℃の間の温度で培養するステップと、
(iii)既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法に関する。
(i)RSV Fタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
(ii)細胞を、約33.0℃~約35.0℃の間の温度で培養するステップと、
(iii)既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法に関する。
本発明の方法は、免疫原性組成物中に抗原として使用されるRSV Fタンパク質三量体の生産に特に有用である。本発明の方法は、RSV Fタンパク質三量体の、大規模での、たとえば、少なくとも500L、またはなお少なくとも3000Lの細胞培養培地体積での製造に使用することができる。本発明の方法では、三量体の形のRSVタンパク質Fが高い力価および高い百分率で提供され、しかもHCPまたは他の不純物の量が最小限に抑えられ、その結果、さらに下流での加工が容易になる。加えて、タンパク質の加工を最適化する詳細な条件が、特定されており、本発明の方法において使用することができる。
一部の実施形態では、RSV Fタンパク質は、サブタイプAのRSV Fタンパク質である。一部の実施形態では、RSV Fタンパク質は、サブタイプBのRSV Fタンパク質である。一部の実施形態では、RSV Fタンパク質は、野生型RSV Fタンパク質の突然変異体である。一部の実施形態では、RSV Fタンパク質は、サブタイプAの野生型RSV Fタンパク質の突然変異体である。一部の実施形態では、RSV Fタンパク質は、サブタイプBの野生型RSV Fタンパク質の突然変異体である。一部の実施形態では、突然変異体は、対応する野生型RSV Fタンパク質のアミノ酸配列を基準として、アミノ酸配列における導入突然変異を示し、野生型RSV Fタンパク質、または野生型Fタンパク質を含むウイルスに対して免疫原性である。突然変異体におけるアミノ酸突然変異には、野生型RSV Fタンパク質を基準とした、アミノ酸置換、欠失、または付加が含まれる。
一部の実施形態では、本発明の方法によって生産されるRSV Fタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれるWO2017/109629において開示されているとおりのRSVタンパク質突然変異体である。
一部の実施形態では、RSV Fタンパク質は、導入されたアミノ酸突然変異が、野生型RSV Fタンパク質における一対のアミノ酸残基が一対のシステインになる突然変異(「改変ジスルフィド突然変異」)である、野生型RSV Fタンパク質の突然変異体である。システイン残基対が導入されると、タンパク質の高次構造またはオリゴマー状態、たとえば、融合前高次構造を安定化させる、システイン残基間のジスルフィド結合の形成が可能になる。このような突然変異の詳細な対の例としては、S55CとL188C、S155CとS290C、T103CとI148C、L142CとN371Cなどの、55Cと188C、155Cと290C、103Cと148C、および142Cと371Cが挙げられる。
さらに他の実施形態では、RSV Fタンパク質突然変異体は、1つまたは複数の空隙充填突然変異であるアミノ酸突然変異を含む。空隙充填を目標として置き換えることができるアミノ酸の例としては、小さい脂肪族(たとえば、Gly、Ala、Val)または小さい極性アミノ酸(たとえば、Ser、Thr)、および、融合前高次構造の状態では埋まっているが、融合後高次構造の状態では溶媒に曝されるアミノ酸が挙げられる。補充アミノ酸の例としては、大きい脂肪族アミノ酸(Ile、Leu、Met)または大きい芳香族アミノ酸(His、Phe、Tyr、Trp)が挙げられる。一部の詳細な実施形態では、RSV Fタンパク質突然変異体は、
(1)55、62、155、190、または290位にあるSのI、Y、L、H、またはMによる置換、
(2)54、58、189、219、または397位にあるTのI、Y、L、H、またはMによる置換、
(3)151位にあるGのAまたはHによる置換、
(4)147または298位にあるAのI、L、H、またはMによる置換、
(5)164、187、192、207、220、296、300、または495位にあるVのI、Y、Hによる置換、および
(6)106位にあるRのWによる置換
からなる群から選択される空隙充填突然変異を含む。
(1)55、62、155、190、または290位にあるSのI、Y、L、H、またはMによる置換、
(2)54、58、189、219、または397位にあるTのI、Y、L、H、またはMによる置換、
(3)151位にあるGのAまたはHによる置換、
(4)147または298位にあるAのI、L、H、またはMによる置換、
(5)164、187、192、207、220、296、300、または495位にあるVのI、Y、Hによる置換、および
(6)106位にあるRのWによる置換
からなる群から選択される空隙充填突然変異を含む。
一部の特定の実施形態では、RSV Fタンパク質突然変異体は、T54H、S190I、およびV296Iからなる群から選択される少なくとも1つの空隙充填突然変異を含む。
さらに他の実施形態では、RSV Fタンパク質突然変異体は、折り畳み構造において互いに近接するタンパク質中の残基間で、イオン反発を低減する、またはイオン誘引を増大させる、静電突然変異を含む。いくつかの実施形態において、RSV Fタンパク質突然変異体は、RSV F三量体の別のプロトマーからのGlu487およびAsp489の酸性残基との、反発性のイオン相互作用を低減し、または誘引性のイオン相互作用を増強する静電置換を含む。一部の詳細な実施形態では、RSV Fタンパク質突然変異体は、
(1)82、92、または487位にあるEのD、F、Q、T、S、L、またはHによる置換、
(2)315、394、または399位にあるKのF、M、R、S、L、I、Q、またはTによる置換、
(3)392、486、または489位にあるDのH、S、N、T、またはPによる置換、および
(4)106または339位にあるRのF、Q、N、またはWによる置換
からなる群から選択される静電突然変異を含む。
(1)82、92、または487位にあるEのD、F、Q、T、S、L、またはHによる置換、
(2)315、394、または399位にあるKのF、M、R、S、L、I、Q、またはTによる置換、
(3)392、486、または489位にあるDのH、S、N、T、またはPによる置換、および
(4)106または339位にあるRのF、Q、N、またはWによる置換
からなる群から選択される静電突然変異を含む。
さらに他の実施形態では、RSV Fタンパク質突然変異体は、改変ジスルフィド突然変異、空隙充填突然変異、および静電突然変異から選択される、2種以上の異なるタイプの突然変異の組合せを含む。一部の特定の実施形態では、RSV Fタンパク質突然変異体は、
(1)T103C、I148C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(2)T54H、S55C、L188C、およびD486Sの組合せ、
(3)T54H、T103C、I148C、S190I、V296I、およびD486Sの組合せ、
(4)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、およびN371Cの組合せ、
(5)S55C、L188C、およびD486Sの組合せ、
(6)T54H、S55C、L188C、およびS190Iの組合せ、
(7)S55C、L188C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(8)T54H、S55C、L188C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(9)S155C、S190I、S290C、およびD486Sの組合せ、
(10)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q、およびD489Sの組合せ、ならびに
(11)T54H、S155C、S190I、S290C、およびV296Iの組合せ
からなる群から選択される、対応する野生型RSV Fタンパク質に関連する突然変異の組合せを含む。
(1)T103C、I148C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(2)T54H、S55C、L188C、およびD486Sの組合せ、
(3)T54H、T103C、I148C、S190I、V296I、およびD486Sの組合せ、
(4)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、およびN371Cの組合せ、
(5)S55C、L188C、およびD486Sの組合せ、
(6)T54H、S55C、L188C、およびS190Iの組合せ、
(7)S55C、L188C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(8)T54H、S55C、L188C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(9)S155C、S190I、S290C、およびD486Sの組合せ、
(10)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q、およびD489Sの組合せ、ならびに
(11)T54H、S155C、S190I、S290C、およびV296Iの組合せ
からなる群から選択される、対応する野生型RSV Fタンパク質に関連する突然変異の組合せを含む。
一部の実施形態では、RSV Fタンパク質は、サブタイプAのものであり、突然変異T103C、I148C、S190I、およびD486Sを含む。
一部の実施形態では、RSV Fタンパク質は、サブタイプBのものであり、突然変異T103C、I148C、S190I、およびD486Sを含む。
RSV F配列が実質的に保存されていることを考慮すると、当業者により、異なる自然RSV F配列間でアミノ酸位を容易に対照して、異なるRSV株およびサブタイプ間の対応するRSV Fアミノ酸位を見極めることができる。たとえば、確認された、ほぼすべての自然RSV F0前駆体タンパク質において、フューリン切断部位は、同じアミノ酸位にある。したがって、自然RSV Fタンパク質配列の株およびサブタイプ全般にわたる保存により、基準RSV F配列を使用して、RSV Fタンパク質中の特定の位置にあるアミノ酸の対照が可能になる。本開示の目的では(そうでないと文脈から示されない限り)、RSV Fタンパク質アミノ酸位は、GenInfo識別名GI138251およびSwiss Prot識別名P03420に相当する、RSV A2株の全長自然F前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列に準拠して示される。
一部の実施形態では、本発明の方法によって生産されたRSV Fタンパク質は、WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848、およびWO2018/109220において開示されているとおりのRSVタンパク質突然変異体である。これらの参考文献において開示されているRSV Fタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する用語「流加培養法」とは、培養工程を始める時点またはその後の諸時点で、培養物に追加成分が提供される、細胞の培養方法を指す。一部の実施形態では、そうした追加成分は、供給培地としてまとめて提供される。このような、提供される成分は、通常、培養工程の間に枯渇してしまった、細胞のための栄養成分を含む。流加培養法は、通常、ある時点で中断され、培地中の細胞および/または成分が回収され、場合により精製される。一部の実施形態では、流加培養物は、供給培地で補充された基本培地を含む。
一部の実施形態では、細胞は、33.0℃、33.1℃、33.2℃、33.3℃、33.4℃、33.5℃、33.6℃、33.7℃、33.8℃、33.9℃、34.0℃、34.1℃、34.2℃、34.3℃、34.4℃、34.5℃、34.6℃、34.7℃、34.8℃、34.9℃、または35.0℃の温度で培養される。好ましい一実施形態では、細胞は、34.0℃~35.0℃の間の温度で培養される。好ましい一実施形態では、細胞は、34.5℃の温度で培養される。
本発明の方法は、細胞に、制限された形でグルコースを提供するステップであって、グルコースは、既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて細胞に供給される、ステップを含む。pH変化に応じてグルコースを供給するこのような方法は、HiPDOGとも呼ばれ、たとえば、WO2004/104186、およびGagnonら((2011)(Biotechnology and bioengineering 108:1328~1337)において開示されており、これら文献はどちらも、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、pHセンサーを使用して、細胞培養物のpHがモニターされる。
一部の実施形態では、本発明の方法の規定のpH値は、培養物のpH設定点を0.01~0.10、たとえば、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、または0.10超える増加に相当する。一部の実施形態では、既定のpH値は、培養物のpH設定点を0.05超える増加に相当する。
一部の実施形態では、細胞培養物のpH設定点は、6.70~7.30の間である。一部の実施形態では、細胞培養物のpH設定点は、6.90~7.20の間である。一部の実施形態では、細胞培養物のpH設定点は、7.00~7.10の間である。好ましい一実施形態では、細胞培養物のpH設定点は、7.05である。
好ましい一実施形態では、細胞培養物のpH設定点は、7.05であり、既定のpH値は、前記設定点を0.05超える増加に相当する。
一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、細胞培養物のpHは、6.70~7.30の間である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、細胞培養物のpHは、6.90~7.20の間である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、pH設定点は、6.95である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、pH設定点は、7.07である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、pH設定点は、7.01である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、pH設定点は、7.20である。
一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後、pH設定点は、7.20である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後、pH設定点は、7.20であり、pH操作範囲は、7.05~7.35である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後、pH設定点は、6.90である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後、pH設定点は、6.90であり、pH操作範囲は、6.75~7.05である。
一部の実施形態では、既定のpH値を超えたpHの上昇に応じた細胞培養物へのグルコースの供給は、pHが低下して培養物のpH設定点に達するまでグルコースを供給することを含む。
一部の実施形態では、培養物の成長段階の間、グルコースが、制限された形で細胞培養物に提供される。一部の実施形態では、グルコースが、1~6日間、好ましくは、3、4、または5日間、より好ましくは、4または5日間、制限された形で細胞培養物に提供される。
一部の実施形態では、細胞培養物に、制限された形でグルコースを提供するステップは、0日目、1日目、または2日目に始動する。
一部の実施形態では、グルコースは、制限された形で提供されるとき、独立した供給材料として提供される、すなわち、供給培地の他の成分を含まない。
一部の実施形態では、グルコースは、制限された形で提供されるとき、供給培地の一部として提供される。
本明細書において開示する方法の一部の実施形態では、温度は、約30.0℃~約32.0℃の間のより低い温度、好ましくは、約31.0℃に移行される。一部の実施形態では、温度は、3日目~7日目の間(すなわち、培養3日目~培養7日目の間)に、より低い温度に移行される。好ましい一実施形態では、温度は、5日目または6日目に、より低い温度に移行される。好ましい一実施形態では、温度は、制限された形でのグルコースの供給が中断された後、より低い温度に移行される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および/または温度移行なしの方法、および/または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および/または既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、力価が向上する。力価は、当業界で知られているいずれの方法によって求めてもよい。一実施形態では、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって力価が測定される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および/または温度移行なしの方法、および/または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および/または既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、三量体の百分率が増大し、高分子質量種(HMMS)および/または低分子質量種(LMMS)の百分率が低下する。三量体、HMMS、およびLMMSの百分率は、当業界で知られているいずれの方法によって求めてもよい。一部の実施形態では、三量体、HMMS、およびLMMSの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)によって測定される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および/または温度移行なしの方法、および/または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および/または既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、三量体力価が増大する。三量体力価値は、SEC-HPLCによって取得されることが好ましい、三量体の百分率に、RP-HPLCによって取得されることが好ましい、力価を掛けることにより算出される。三量体力価によって、どれだけのタンパク質が三量体型として生産されるかが推定される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および/または温度移行なしの方法、および/または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および/または既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、宿主細胞タンパク質の量が減少する。HCPは、当業界で知られているいずれの方法によって測定してもよい。一部の実施形態では、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)によってHCPが測定された。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および/または温度移行なしの方法、および/または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および/または既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、免疫原性組成物中に抗原として使用することができる三量体の形成に適する形態の加工されたRSV F(A)またはRSV F(B)の量が向上する。適切な形態の加工されたRSV F(A)またはRSV F(B)の量は、当業界で知られているいずれの方法によって求めてもよい。一実施形態では、そのような量は、たとえば実施例3に示すとおりのウエスタンブロットによって測定される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および/または温度移行なしの方法、および/または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および/または既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、力価の向上、および/または三量体の百分率の増大および高分子質量種(HMMS)および/もしくは低分子質量種(LMMS)の百分率の低下、および/または宿主細胞タンパク質の量の減少がもたらされる。
本明細書で使用する用語「培地」、「細胞培養培地」、および「培養培地」とは、成長する哺乳動物細胞を養う栄養素を含有する溶液を指す。通常、そのような溶液は、細胞が最小限の成長および/または生存のために必要とする、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、および微量元素を賄う。一実施形態では、培地は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、ならびにシスチンおよび/またはCysを含む場合がある。
このような溶液は、限定はしないが、ホルモンおよび/もしくは他の成長因子、特定のイオン(ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、リン酸など)、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素(普通は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物)、高い最終濃度で存在する無機化合物(たとえば、鉄)、アミノ酸、脂質、および/またはグルコースもしくは他のエネルギー源を始めとする、最小限の速度より高度に成長および/または生存を増進する補充成分も含有する場合がある。一部の実施形態では、細胞生存および増殖に最適なpHおよび塩濃度に培地を処方することが有利である。たとえば、培地は、概ね7.1~7.3の間のpH、および概ね1000mOsm~1300mOsmの間の最終重量オスモル濃度に処方される場合がある。
本発明の方法において使用することができる既知の基本および/または供給細胞培養培地の例としては、WO2006/026445、WO2008/109410、WO2008/063892、EP2243827、WO2002/066603、WO2015/140708、およびWO2006/050050において開示されているものが挙げられる。
好ましい一実施形態では、本発明の方法において使用される供給培地は、4~10mMのAla、30~60mMのArg、50~90mMのAsn、10~30mMのAsp、2~40mMのGlu、2~15mMのGly、8~20mMのHis、25~32mMのIle、35~60mMのLeu、28~60mMのLys、9~25mMのMet、10~30mMのPhe、15~40mMのPro、44~80mMのSer、20~45mMのThr、2~10mMのTrp、および20~50mMのValを含む。
一部の実施形態では、培地は、培地の成分が既知であり、かつ制御される、化学的限定培地である。一部の実施形態では、培地は、培地の成分すべてが、既知であり、かつ/または制御されるとは限らない、複合培地である。
哺乳動物細胞培養のための化学的に限定された増殖培地は、ここ数十年にかけて、大々的に開発され、公表されている。限定培地の成分はすべて、十分に特徴付けられており、そのため、限定培地は、血清や加水分解物などの複雑な添加物を含有しない。早期の培地処方は、タンパク質生産についての懸念がほとんどまたはまったくない細胞増殖および生存度の維持を可能にするために開発された。より最近では、組換えタンパク質を生産する生産性の高い細胞培養を支えるという明確な目的で、培地処方が開発されている。そのような培地は、本発明の方法における使用に好ましい。そうした培地は、高密度での細胞の増殖および/または維持を支えるために、一般に、高度な量の栄養素、特にアミノ酸を含む。必要なら、本発明の方法において使用するために、こうした培地を当業者が改良してもよい。
複合培地の成分は、すべてが十分に特徴付けられているとは限らず、そのため、複合培地は、数ある中でも、単純および/または複雑な炭素供給源、単純および/または複雑な窒素供給源、血清などの、添加物を含有する場合がある。一部の実施形態では、本発明に適する複合培地は、本明細書に記載するとおりの限定培地の他の成分に加えて、加水分解物などの添加物を含有する。
一部の実施形態では、限定培地は、通常、水中に、既知の濃度の、おおよそ50種の化学的存在物を含む。限定培地のあるものは、十分に特徴付けられた1種または複数のタンパク質、たとえば、インスリン、IGF-1、トランスフェリン、BSAも含有するが、他のものは、タンパク質成分を必要とせず、そのため、無タンパク質限定培地と呼ばれる。培地の典型的な化学成分は、5つの広義のカテゴリー、すなわち、アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、および簡潔に分類しきれない種々雑多なカテゴリーに分けられる。
細胞培養培地は、場合により、補充成分で補充してもよい。本明細書で使用する用語「補充成分」とは、限定はしないが、ホルモンおよび/もしくは他の成長因子、特定のイオン(ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、リン酸など)、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素(普通は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物)、アミノ酸、脂質、および/またはグルコースもしくは他のエネルギー源を始めとする、最小限の速度より高度に成長および/または生存を増進する成分を指す。一部の実施形態では、最初の細胞培養物に補充成分が加えられる場合がある。一部の実施形態では、細胞培養を開始した後に、補充成分が加えられる場合がある。
通常、微量元素とは、マイクロモル濃度以下のレベルで含まれる様々な無機塩を指す。たとえば、一般に含まれる微量元素は、亜鉛、セレン、銅などである。一部の実施形態では、鉄(第一鉄塩または第二鉄塩)を、マイクロモル濃度の濃度で、微量元素として、最初の細胞培養培地中に含めることができる。マンガンも、ナノモル濃度からマイクロモル濃度の濃度範囲で、二価カチオン(MnCl2またはMnSO4)として、微量元素の中に含められることが多い。それほど一般的でない数多くの微量元素が、ナノモル濃度の濃度で加えられるのが普通である。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。
糖質コルチコイド化合物は、細胞増殖、代謝、グリコシル化、多くのタンパク質の分泌などの種々の細胞機能をモジュレートすることが知られており、したがって、特に、大規模製造工程において使用される細胞培養培地に含められることが多い。
細胞培養培地成分として使用される糖質コルチコイド化合物の例には、限定はしないが、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルが含まれる。
以下で実施例3に示すとおり、細胞培養培地中のヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイドの存在は、適正な形態のRSV Fタンパク質の量に好ましくない影響を及ぼす。何らかの理論に囚われるものではないが、この影響は、糖質コルチコイド化合物がRSV Fタンパク質のプロセシングを妨げる結果、回収材料中のプロセシングされていないRSVタンパク質の量が増加するせいであるといえる。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する供給培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地および供給培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する供給培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地および供給培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾンのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾンのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する供給培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾンのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地および供給培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾンのいずれも含まない。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する供給培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地および供給培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する培地は、細胞培養において、たとえば、1×106細胞/mL、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、5×108細胞/mLなどの、高い生細胞密度を支えるのに適する培地である。一部の実施形態では、細胞培養は、CHO細胞流加培養法である。一部の実施形態では、細胞は、1×106細胞/mL、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、または5×108細胞/mLより高い生細胞密度に増殖する。
本明細書で使用する用語「生細胞密度」とは、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を指す。生細胞密度は、当業者に知られているいずれの方法によって測定してもよい。Bioprofile Flex(登録商標)などの自動細胞カウンターを使用して生細胞密度を測定することが好ましい。本明細書で使用する、最大細胞密度という用語は、細胞培養の間に実現される最大の細胞密度を指す。本明細書で使用する用語「細胞生存度」とは、培養物中の細胞が、所与の一式の培養条件または実験バリエーションのもとで生存しうる能力を指す。細胞生存度を求めるための多くの方法の1つが本発明に含まれることは、当業者の理解するところとなる。たとえば、細胞生存度を求めるために、生きている細胞の膜を通過しないが、死んだまたは死にゆく細胞の崩壊した膜は通過しうる色素(たとえば、トリパンブルー)が使用される場合がある。
細胞培養法
本明細書で使用する用語「培養物」および「細胞培養物」とは、細胞集団の生存および/または成長に適する条件下にある培地中に懸濁されている細胞集団を指す。当業者には明白となるように、一部の実施形態では、本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団と、細胞集団が懸濁している培地の組合せを指す。
本明細書で使用する用語「培養物」および「細胞培養物」とは、細胞集団の生存および/または成長に適する条件下にある培地中に懸濁されている細胞集団を指す。当業者には明白となるように、一部の実施形態では、本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団と、細胞集団が懸濁している培地の組合せを指す。
本明細書で使用する用語「流加培養法」または「流加細胞培養法」とは、培養工程を始める時点またはその後の諸時点で、培養物に追加成分が提供される、細胞の培養方法を指す。そうした、提供される成分は、通常、培養工程の間に枯渇してしまった、細胞のための栄養成分を含む。流加培養法は、通常、ある時点で中断され、培地中の細胞および/または成分が回収され、場合により精製される。一部の実施形態では、流加培養物は、供給培地で補充された基本培地を含む。
細胞は、実施者が選択した好都合ないずれの体積で増殖させてもよい。たとえば、体積が2~3ミリリットルから数リットルの範囲にある小規模反応槽において細胞を増殖させる場合がある。別法として、体積が、少なくとも500から、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15000、20000、25000リットルもしくはより大規模、または間にあるいずれかの体積の範囲にある、工業用の大規模バイオリアクターにおいて細胞を増殖させる場合もある。一部の実施形態では、細胞培養物の体積は、少なくとも500Lである。一部の実施形態では、細胞培養物の体積は、少なくとも3000Lである。
一部の実施形態では、細胞は、最初の増殖段階(または増殖段階)の間、実施者の要望および細胞それ自体の要件に応じて、より長いまたはより短い時間をかけて、増殖させることができる。一部の実施形態では、予め定めた細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を増殖させる。一部の実施形態では、約1×106細胞/mL、約5×106細胞/mL、約1×107細胞/mL、約5×107細胞/mL、約1×108細胞/mL、または約5×108細胞/mLという予め定めた細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を増殖させる。一部の実施形態では、細胞が妨害されずに増殖することが許されれば最終的に到達することになる最大細胞密度の所与の百分率である細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を増殖させる。たとえば、最大細胞密度の1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または99パーセントの所望の生細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を増殖させる場合がある。一部の実施形態では、細胞密度が1培養日あたり15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%を超えて増大しなくなるまで、細胞を増殖させる。一部の実施形態では、細胞密度が1培養日あたり5%を超えて増大しなくなるまで、細胞を増殖させる。
一部の実施形態では、細胞は、規定された期間にかけて増殖させることが可能になる。たとえば、細胞培養物の出発濃度および細胞固有の増殖速度に応じて、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20日、またはより多い日数をかけて、好ましくは、4~10日間、細胞を増殖させる場合がある。本発明の実施者は、タンパク質生産要件および細胞それ自体の要求に応じて、最初の増殖段階の継続期間を選択することができる。
細胞への酸素供給および栄養素の分散を増進するために、細胞培養物は、最初の培養段階の間、撹拌または振盪される場合がある。本発明によれば、限定はしないが、pH、温度、酸素供給などを始めとする、バイオリアクターのある特定の内部条件を、最初の増殖段階の間に制御または調節することが有益となりうることは、当業者に理解される。
本発明によれば、細胞を培養する温度が、温度設定点であり、細胞培養の間、設定点前後における温度変動が限定されるように制御されることは、当業者に理解される。
本発明の方法では、より低い温度への温度移行を使用することができる。このような場合では、より低い温度設定点が定められ、温度がより低い設定点に達してしまった後は、前記のより低い設定点前後における温度変動が制限されるように温度が制御されるものであると、当業者には理解される。培養物の温度を移行させるとき、温度移行は、比較的段階的でよい。たとえば、温度変更を完了するのに、数時間または数日かかる場合がある。別法として、温度移行は、比較的急峻でもよい。たとえば、温度変更は、数時間未満で完了する場合がある。ポリペプチドまたはタンパク質の大規模工業生産において標準的であるような、適切な生産および制御設備を考えると、温度変更は、1時間未満のうちに完了する場合さえある。
一部の実施形態では、細胞培養の条件を上で論じたとおりに移行させたなら、後続の生産段階の間、細胞培養物の生存および生存度のためになり、所望のポリペプチドまたはタンパク質の工業的に妥当なレベルでの発現に相応しい条件下で、細胞培養物が維持される。一部の実施形態では、細胞は、所望の細胞密度または生産力価に達するまで、後続の生産段階において維持される場合がある。一部の実施形態では、生産段階の継続期間は、2日~10日の間、すなわち、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日、好ましくは、4日~8日の間、好ましくは、6日からなる。
一部の実施形態では、増殖段階の継続期間は、約6日であり、生産段階の継続期間は、約6日である。
細胞への酸素供給および栄養素の分散を増進するために、細胞培養物は、後続の生産段階の間、撹拌または振盪される場合がある。本発明によれば、限定はしないが、pH、温度、酸素供給などを始めとする、バイオリアクターのある特定の内部条件を、後続の生産段階の間に制御または調節することが有益となりうることは、当業者に理解される。
細胞
細胞培養が可能であるいずれの哺乳動物細胞も、本発明に従って利用することができる。本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、BALB/cマウス骨髄腫系(NSO/l、ECACC番号:85110503)、ヒト網膜芽細胞(PER.C6、CruCell、オランダ国ライデン)、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1系(COS-7、ATCC CRL1651)、ヒト胎児由来腎臓系(293細胞または懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた293細胞、Grahamら、J.Gen Virol.、36:59、1977)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL10)、チャイニーズハムスター卵巣細胞+/-DHFR(CHO、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:4216、1980)、マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol.Reprod.、23:243~251、1980)、サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1 587)、ヒト子宮頚癌細胞(HeLa、ATCC CCL2)、イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL34)、バッファローラット肝臓細胞(BRL3A、ATCC CRL1442)、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL75)、ヒト肝臓細胞(HepG2、HB8065)、マウス乳房腫瘍(MMT060562、ATCC CCL51)、TRI細胞(Matherら、Annals N.Y.Acad.Sci.、383:44~68、1982)、MRC5細胞、FS4細胞、およびヒトヘパトーマ系(HepG2)が挙げられる。好ましい実施形態の一部において、細胞は、CHO細胞である。好ましい実施形態の一部において、細胞は、GS-CHO細胞である。
細胞培養が可能であるいずれの哺乳動物細胞も、本発明に従って利用することができる。本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、BALB/cマウス骨髄腫系(NSO/l、ECACC番号:85110503)、ヒト網膜芽細胞(PER.C6、CruCell、オランダ国ライデン)、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1系(COS-7、ATCC CRL1651)、ヒト胎児由来腎臓系(293細胞または懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた293細胞、Grahamら、J.Gen Virol.、36:59、1977)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL10)、チャイニーズハムスター卵巣細胞+/-DHFR(CHO、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:4216、1980)、マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol.Reprod.、23:243~251、1980)、サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1 587)、ヒト子宮頚癌細胞(HeLa、ATCC CCL2)、イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL34)、バッファローラット肝臓細胞(BRL3A、ATCC CRL1442)、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL75)、ヒト肝臓細胞(HepG2、HB8065)、マウス乳房腫瘍(MMT060562、ATCC CCL51)、TRI細胞(Matherら、Annals N.Y.Acad.Sci.、383:44~68、1982)、MRC5細胞、FS4細胞、およびヒトヘパトーマ系(HepG2)が挙げられる。好ましい実施形態の一部において、細胞は、CHO細胞である。好ましい実施形態の一部において、細胞は、GS-CHO細胞である。
タンパク質の発現
上で指摘したとおり、多くの例において、細胞は、所望の産物を高レベルで産生するように選択または操作される。多くの場合、細胞は、組換えタンパク質を高レベルで産生するように、人間の手によって、たとえば、目的のタンパク質をコードする遺伝子の導入、および/または(内在性もしくは導入のいずれであろうと)その遺伝子の発現を調節する遺伝子制御エレメントの導入により、操作される。
上で指摘したとおり、多くの例において、細胞は、所望の産物を高レベルで産生するように選択または操作される。多くの場合、細胞は、組換えタンパク質を高レベルで産生するように、人間の手によって、たとえば、目的のタンパク質をコードする遺伝子の導入、および/または(内在性もしくは導入のいずれであろうと)その遺伝子の発現を調節する遺伝子制御エレメントの導入により、操作される。
ある決まったタンパク質を発現するように操作された特定の1タイプの細胞の集団の中でさえ、細胞集団内での変動性が存在するため、個々のある特定の細胞が、より良好に増殖し、より多くの目的タンパク質を産生する。ある特定の実施形態では、細胞を培養するために選択された特定の条件下で力強く増殖する細胞株が、実施者によって経験的に選択される。一部の実施形態では、特定のタンパク質を発現するように操作された個々の細胞が、細胞増殖、最終細胞密度、細胞生存度パーセント、発現されたタンパク質の力価、もしくはこれらのいずれかの組合せ、または実施者が重要と考える他のいずれかの条件に基づき、大規模生産向けに選択される。
本明細書で使用する用語「宿主細胞」とは、本明細書に記載するような目的のタンパク質を産生するように操作されている細胞を指す。タンパク質は、細胞にとって内在性である遺伝子から、または細胞に導入されている異種遺伝子から、発現される場合がある。タンパク質は、自然界に存在するものでもよいし、または、別法として、人間の手によって操作もしくは選択された配列を含んでいてもよい。
発現されたタンパク質の単離
一般に、本発明に従って発現させたタンパク質は、単離および/または精製することが通常は望ましい。ある特定の実施形態では、発現されたタンパク質は、培地中に分泌され、したがって、精製工程における最初のステップとして、たとえば、遠心分離や濾過によって、細胞および他の個体が除去される場合がある。
一般に、本発明に従って発現させたタンパク質は、単離および/または精製することが通常は望ましい。ある特定の実施形態では、発現されたタンパク質は、培地中に分泌され、したがって、精製工程における最初のステップとして、たとえば、遠心分離や濾過によって、細胞および他の個体が除去される場合がある。
発現されたタンパク質は、限定はしないが、クロマトグラフィー(たとえば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー)、ゲル濾過、遠心分離、もしくは較差溶解度、エタノール沈殿を始めとする標準の方法によって、ならびに/またはタンパク質精製のための他の利用可能ないずれかの技術によって単離および精製することができる(たとえば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Scopes、Protein Purification Principles and Practice第2版、Springer-Verlag、ニューヨーク、1987;Higgins,S.J.およびHames,B.D.(共編)、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford Univ Press、1999;ならびにDeutscher,M.P.、Simon,M.I.、Abelson,J.N.(共編)、Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series、第182巻)、Academic Press、1997を参照されたい)。特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーについては、タンパク質を、そのタンパク質に対して活性化させ、固定支持体に付着させた抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることにより、単離することができる。別法として、インフルエンザ外被配列、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼなどのアフィニティータグを、標準の組換え技術によってタンパク質に取り付けると、適切なアフィニティーカラムに通すことによる、容易な精製を可能にすることもできる。精製工程の間のタンパク質の分解を低減または排除するために、フッ化フェニルメチルスルフォニル(PMSF)、ロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤を、いずれかまたはすべての段階で加えてもよい。プロテアーゼ阻害剤は、発現されたタンパク質を単離および精製するために細胞を溶解させなければならないとき、特に便利である。
厳密な精製技術は、精製されるタンパク質の特徴、タンパク質の発現元である細胞の特徴、および/または細胞を増殖させた培地の組成に応じて様々となることは、当業者に理解される。
タンパク質発現のための遺伝子の宿主細胞への導入
一般に、細胞に導入された核酸分子は、本開示に従って発現させることが所望されるタンパク質をコードする。
一般に、細胞に導入された核酸分子は、本開示に従って発現させることが所望されるタンパク質をコードする。
目的のタンパク質の発現の実現に十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するのに適する方法は、当業界で知られている。たとえば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Gethingら、Nature、293:620~625、1981;Manteiら、Nature、281:40~46、1979;Levinsonら、EP117,060およびEP117,058を参照されたい。哺乳動物細胞について、遺伝物質を哺乳動物細胞に導入する一般的な方法としては、Grahamおよびvan der Erb(Virology、52:456~457、1978)のリン酸カルシウム沈殿法またはHawley-Nelson(Focus 15:73、1993)のlipofectamine(商標)(Gibco BRL)法が挙げられる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的側面は、1983年8月16日に発行されたAxelによる米国特許第4,399,216号に記載されている。遺伝物質を哺乳動物細胞に導入するための種々の技術については、Keownら、Methods in Enzymology、1989;Keownら、Methods in Enzymology、185:527~537、1990:およびMansourら、Nature、336:348~352、1988を参照されたい。
一部の実施形態では、導入される核酸は、裸の核酸分子の形である。たとえば、細胞に導入された核酸分子は、タンパク質および必要な遺伝子制御エレメントをコードする核酸だけからなる場合がある。別法として、タンパク質(必要な調節エレメントを含む)をコードする核酸が、プラスミドベクター内に含まれている場合もある。哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に適するベクターの非限定的な代表例としては、pCDNA1、pCD(Okayamaら、Mol.Cell Biol.5:1136~1142、1985を参照されたい)、pMClneo Poly-A(Thomasら、Cell 51:503~512、1987を参照されたい)、pAC373やpAC610などのバキュロウイルスベクター、CDM8(Seed,B.、Nature 329:840、1987を参照されたい)、およびpMT2PC(Kaufmanら、EMBO J.6:187~195、1987を参照されたい)が挙げられ、これら文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、細胞に導入される核酸分子は、ウイルスベクター内に含まれている。たとえば、タンパク質をコードする核酸が、ウイルスゲノム(または部分的なウイルスゲノム)に挿入される場合がある。タンパク質の発現を導く調節エレメントは、ウイルスゲノムに挿入された核酸と共に含まれる(すなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結されている)場合もあり、またはウイルスゲノムそれ自体によって提供される場合もある。
裸のDNAは、DNAおよびリン酸カルシウムを含有する沈殿を生成することにより、細胞に導入することができる。別法として、DNAとDEAE-デキストランの混合物を生成し、混合物を細胞と共にインキュベートする、または細胞とDNAを適切な緩衝液中で一緒にインキュベートし、細胞を(たとえば、電気穿孔法によって)高電圧電気パルスに曝すことにより、裸のDNAを細胞に導入することもできる。裸のDNAを細胞に導入するさらなる方法は、DNAを、カチオン脂質を含有するリポソーム懸濁液と混合することによるものである。DNA/リポソーム複合体は、次いで、細胞と共にインキュベートされる。裸のDNAは、たとえば、マイクロインジェクションによって、細胞に直接注入することもできる。
別法として、DNAを、細胞表面受容体のリガンドに結合させてあるポリリシンなどのカチオンと複合体形成させることにより、裸のDNAを細胞に導入することもできる(たとえば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWu,G.およびWu,C.H.、J.Biol.Chem.263:14621、1988;Wilsonら、J.Biol.Chem.267:963~967、1992;および米国特許第5,166,320号を参照されたい)。DNA-リガンド複合体が受容体に結合することで、受容体仲介エンドサイトーシスによるDNAの取込みが促進される。
特定の核酸配列、たとえば、タンパク質をコードするcDNAを含んでいるウイルスベクターの使用は、核酸配列を細胞に導入するための一般的な手法である。ウイルスベクターによる細胞の感染には、細胞の大部分が核酸を受け取るという利点があり、これにより、核酸を受け取った細胞を選択する必要をなくすことができる。加えて、たとえば、ウイルスベクターに収められたcDNAによって、ウイルスベクター内にコードされている分子は、ウイルスベクター核酸が積み込まれている細胞において、一般に効率よく発現される。
欠陥レトロウイルスは、遺伝子治療目的での遺伝子移入における使用のために、十分に特徴付けられている(総説については、Miller,A.D.、Blood 76:271、1990を参照されたい)。目的のタンパク質をコードする核酸がレトロウイルスゲノムに挿入されている、組換えレトロウイルスを構築することができる。加えて、レトロウイルスゲノムの諸部分を除去して、レトロウイルス複製に欠陥を付与することができる。このような複製欠陥レトロウイルスは、次いで、標準技術によって、ヘルパーウイルスを使用して、標的細胞の感染に使用することができるビリオンに詰め込まれる。
アデノウイルスのゲノムは、目的のタンパク質をコードし、発現するが、正常な溶解ウイルス生活環におけるその複製能に関しては不活性化されるように操作することができる。たとえば、Berknerら、BioTechniques 6:616、1988;Rosenfeldら、Science 252:431~434、1991;およびRosenfeldら、Cell 68:143~155、1992を参照されたい。アデノウイルスAd株5型dl324または他のアデノウイルス株(たとえば、Ad2、Ad3、Ad7など)由来の適切なアデノウイルスベクターが、当業者に知られている。組換えアデノウイルスは、有効な遺伝子送達媒体となるために、分裂している細胞を必要とせず、気道上皮(Rosenfeldら、1992、前掲)、内皮細胞(Lemarchandら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6482~6486、1992)、肝細胞(HerzおよびGerard、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2812~2816、1993)、および筋細胞(Quantinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581~2584、1992)を始めとする、多種多様な細胞型の感染に使用することができるという点で有利である。加えて、導入されたアデノウイルスDNA(およびその中に含まれている外来DNA)は、宿主細胞のゲノムには組み込まれないが、エピソームのままとなり、それによって、導入されたDNAが宿主ゲノムに組み込まれていく状況(たとえば、レトロウイルスDNA)において挿入突然変異誘発の結果として生じうる、潜在的な問題が回避される。そのうえ、アデノウイルスゲノムが外来DNAを運搬する能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい(8キロベースまで)(Berknerら、前掲;Haj-AhmandおよびGraham、J.Virol.57:267、1986)。現在使用されているほとんどの複製欠陥アデノウイルスベクターは、ウイルスE1およびE3遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の80%程度を保持している。
アデノ関連ウイルス(AAV)は、効率的な複製および生産的な生活環のために、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどの別のウイルスをヘルパーウイルスとして必要とする、自然界に存在する欠陥ウイルスである(総説については、Muzyczkaら、Curr.Topics in Micro.and Immunol.、158:97~129、1992を参照されたい)。このウイルスは、そのDNAを非分裂細胞に組み込むことができ、高頻度で安定した組み込みを示す、数少ないウイルスの1つでもある(たとえば、Flotteら、Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349~356、1992;Samulskiら、J.Virol.63:3822-3828、1989;およびMcLaughlinら、J.Virol.62:1963~1973、1989を参照されたい)。AAVのわずか300塩基対程度を含んでいるベクターを詰め込むことができ、組み込むことができる。外因性DNAのための空間は、約4.5kbに限定される。Tratschinら(Mol.Cell.Biol.5:3251~3260、1985)に記載されているものなどのAAVベクターを使用して、DNAを細胞に導入することができる。AAVベクターを使用して、様々な核酸が、異なる細胞型に導入されている(たとえば、Hermonatら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466~6470、1984;Tratschinら、Mol.Cell.Biol.4:2072~2081、1985;Wondisfordら、Mol.Endocrinol.2:32~39、1988;Tratschinら、J.Virol.51:611~619、1984;およびFlotteら、J.Biol.Chem.268:3781~3790、1993を参照されたい)。
細胞集団への核酸分子の導入に使用した方法の結果として、大部分の細胞が改変され、細胞によってタンパク質が効率よく発現されるとき、改変された細胞集団を、集団内の個々の細胞のさらなる隔離またはサブクローニングなしで使用することができる。すなわち、細胞集団によってタンパク質が効率よく産生されうるため、細胞のさらなる隔離が必要なく、タンパク質生産のための細胞培養物への播種に、集団を直ちに使用することができる。別法として、タンパク質を効率よく産生する数個の細胞または単一細胞からの均一な集団を隔離し、増殖させることが望ましい場合もある。
場合により、目的のタンパク質をコードする遺伝子を、1つまたは複数の調節性遺伝子制御エレメントに連結させてもよい。ある特定の実施形態では、遺伝子制御エレメントによって、タンパク質の構成的発現が導かれる。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする遺伝子の誘導発現をもたらす遺伝子制御エレメントを使用することができる。誘導性の遺伝子制御エレメント(たとえば、誘導性プロモーター)を使用すると、細胞におけるタンパク質の産生のモジュレーションが可能になる。真核細胞において使用される潜在的に有用な誘導性遺伝子制御エレメントの非限定的な例として、ホルモンによって調節されるエレメント(たとえば、Mader,S.およびWhite,J.H.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603~5607、1993を参照されたい)、合成リガンドによって調節されるエレメント(たとえば、Spencer,D.M.ら、Science 262:1019~1024、1993を参照されたい)、および電離放射線によって調節されるエレメント(たとえば、Manome,Y.ら、Biochemistry 32:10607~10613、1993;Datta,R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10149~10153、1992を参照されたい)が挙げられる。その他の当業界で知られている細胞特異的または他の調節系も、本発明に従って使用することができる。
当業者なら、本発明の教示に従い、細胞に目的のタンパク質を発現させる遺伝子を導入する方法を選択し、場合により適切に改良することができる。
免疫原性組成物
本明細書で開示する方法によって生産されるサブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質は、ワクチンとして使用される免疫原性組成物中に含めることができる。
本明細書で開示する方法によって生産されるサブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質は、ワクチンとして使用される免疫原性組成物中に含めることができる。
ワクチンは、免疫原性成分に加えて、アジュバントなどの免疫調節薬をさらに含む場合がある。適切なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび/またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩;MF59などのスクアレン-水乳濁液を始めとする、油乳濁液組成物(または水中油型組成物)(たとえば、WO90/14837を参照されたい);たとえばQS21や免疫刺激性複合体(ISCOMS)などのサポニン製剤(たとえば、米国特許第5,057,540号、WO90/03184、WO96/11711、WO2004/004762、WO2005/002620を参照されたい);モノホスホリルリピドA(MPL)、3-O-脱アシル化MPL(3dMPL)、CpGモチーフを含んでいるオリゴヌクレオチド、ADPリボシル化細菌毒素またはその突然変異体、たとえば、大腸菌(E.coli)熱不安定性エンテロトキシンLT、コレラ毒素CTなどを例とする、細菌または微生物派生体が挙げられる。C4結合性タンパク質(C4bp)のオリゴマー化ドメインの、目的の抗原との融合物をコードする異種核酸を使用することにより、ベクターによってコードされるアジュバントを使用することも可能である(たとえば、Solabomiら、2008、Infect Immun 76:3817~23)。ある特定の実施形態では、本明細書の組成物は、アジュバントとしてのアルミニウムを、たとえば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム、またはこれらの組合せの形で、1用量あたりのアルミニウム含有量が0.05~5mg、たとえば、0.075~1.0mgという濃度で含む。
サブタイプA(以下ではRSV F(A))またはサブタイプB(以下ではRSV F(B))のRSV Fタンパク質を組換え発現するGS-CHOクローンを、120または140rpm振盪インキュベーターにおいて、36.5℃、5%CO2で維持した。培養物を、それぞれ、0.35×106細胞/mLまたは0.20×106細胞/mLで播種して、シード増殖の間、3日または4日間継代した。すべての実験についてのN-1シード培養を、2LのApplikon(登録商標)バイオリアクターにおいて、1Lの作業体積で実施し、栄養素含有率の高い培地において、0.70×106細胞/mLで4日間継代した。
BioNet(登録商標)コントローラーを備えた2LのApplikon(登録商標)バイオリアクターにおいて、以下ではHiPDOG工程と呼ぶグルコース制限流加工程を使用して、生産実験を行った(Gagnonら(2011)、Biotechnology and bioengineering 108:1328~1337)。詳細な方法およびパラメーターは、後続の実験の部において示す。
回収当日に、細胞培養ブロスを、遠心分離およびデプス濾過によって清澄化する。下流での加工は、結合および溶出モードで操作される陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)カラムである捕捉クロマトグラフィーステップの前に、交換材料を濃縮および緩衝処理するための限外濾過およびダイアフィルトレーション1(UF/DF1)を含む。ポリッシングカラムには、フロースルーモードのセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー(CHA)、および結合および溶出モードの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラムが含まれる。下流の工程は、ウイルス保持する濾過ステップ、限外濾過およびダイアフィルトレーション2(UF/DF2)、ならびに最終濾過ステップで終結する。
以下の実験では、力価、三量体、高分子質量種(HMMS)、低分子質量種(LMMS)、および宿主細胞タンパク質(HCP)が報告される。
力価は、当業界で知られているいずれの方法によって求めてもよい。以下の実験において、力価は、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって測定した。逆相クロマトグラフィーは、極性に基づいて分子を分離する。サブタイプAまたはBのRSV Fタンパク質を含めて、比較的非極性である分子は、カラムに結合するが、極性分子は、結合せずにカラムを通過する。結合した分子は、極性条件から極性のより弱い条件へと進む移動相勾配の適用によって、カラムから溶出される。分子は、極性の強いものから弱いものの順に溶出される。検出は、220nmでの紫外(UV)吸収を使用して行う。力価決定は、サンプルピーク面積を検量線標準のものと比較することで実現される。
三量体、HMMS、およびLMMSは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)によって測定した。SEC-HPLCは、当業者に知られている分析方法であり、本発明の方法によって取得したサブタイプAまたはB RSV Fタンパク質サンプル中の高分子質量種(HMMS)、三量体、および低分子質量種(LMMS)の相対的含有量を求めるのに使用される。SEC-HPLCは、分子を、その流体力学的体積によって分離する。分析物がカラムベッドの上部にアプライされると、充填材料の孔より小さい分子は、孔の中および外へと拡散しうるが、より大きい分子は、孔に入らない。結果として、大きい分子ほど速やかに、小さい分子ほどゆっくりと、カラムを通過する。分子種は、溶出されると、280nmでのUV吸収によって検出される。低分子質量種(LMMS)とは、SEC-HPLCによって測定したとき、見かけの分子質量が三量体より小さいすべての分子種に使用される用語である。こうした分子種は、三量体ピークの後に溶出される。高分子質量種(HMMS)とは、SEC-HPLCによって測定したとき、見かけの分子質量が三量体より大きいすべてのピークに使用される用語である。こうした分子種は、三量体ピークの前に溶出され、凝集塊を含みうる。
HCPは、残存するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)宿主細胞タンパク質(HCP)を、サンドイッチ型ELISA分析を使用して測定する定量アッセイである、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)によって測定した。HCPアッセイにおける主要なステップについては、以下で概略を述べる。
高度に富化されたCHO HCP材料から、一式の標準サンプルを調製する。標準サンプルは、CHO HCPの濃度が2ng/mL~256ng/mLの範囲にある。試験サンプルを、4つの、サブタイプAまたはB RSVタンパク質F濃度に希釈する。最後に、各アッセイプレートにおいて、対照サンプルを試験する。アッセイプレートを、高度に富化されたCHO HCP調製物に対して活性化させたポリクローナル抗体(抗CHO HCPP pAbs)でコートする。コートし終えた後、プレートをブロッキングして、分析物および試薬の非特異的結合を最小限に抑える。ブロッキングした後、標準物質、試験サンプル、および対照サンプルをアッセイプレートに加え、インキュベートして、こうしたサンプル中のHCPが抗CHO HCP抗体によって捕捉されるようにする。次いで、プレートを洗浄して、結合していないタンパク質を除去し、HCP-抗体複合体を残す。各ウェルにおける結合したHCPの量を定量化するために、ビオチンにコンジュゲートさせた抗CHO HCP抗体の調製物をアッセイプレートに加え、捕捉されたHCPに結合するようにする。プレートを洗浄して、結合していないビオチン標識抗体を除去し、ビオチン-抗CHO HCPコンジュゲートに結合するストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートを加える。プレートを洗浄して、結合していないストレプトアビジン-HRPを除去し、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)の溶液をアッセイプレートに加える。TMBは、HRPの存在下で青い色を生じる基質である。アッセイプレートを、TMB試薬と共に一定期間インキュベートして、ウェルのそれぞれにおいて適切なシグナルを生じさせ、硫酸を加えることにより、ペルオキシダーゼ反応を失活させる。最後に、適切なプレートリーダーを使用して、450nmで、各ウェルにおける吸光度を測定し、記録する。生じたシグナルは、アッセイプレートにおいて捕捉されたHCPの量に比例する。標準サンプルウェルにおけるシグナルを、標準HCP濃度に対してプロットする。プロットを、4パラメーターロジスティック(4PL)フィットに適合させて、HCP検量線を作成する。次いで、試験サンプルおよび外部対照サンプルにおけるシグナルを使用して、吸光度シグナルを標準4PL関数の仮の線形部分に内挿することにより、これらのサンプル中のHCP含有量を求める。
全体としての生産性および下流での濾過性の観点から、工程は、力価および三量体が局限まで増加し、HMMS、LMMS、およびHCPが最小限に抑えられるとき、最も至適である。RP-HPLC力価からは、凝集塊および三量体型でないRSVタンパク質を含む、サンプル中に存在するRSVタンパク質の総量が推し量られる。SECによって測定される三量体からは、三量体型のRSV分子がおおよそどれだけ存在するのかが、(いくらかの工程不純物を含む)存在するタンパク質の総量に対する百分率として推定される。増殖温度などの工程パラメーターを操作することで、力価にマイナスの影響を及ぼしながらも、三量体を増加させることができる(または逆も同様である)。力価と三量体両方に対する全体としての影響を示すために、三量体に力価を掛けることにより算出される「三量体力価」を報告する。三量体力価によって、どれだけのタンパク質が三量体型として生産されるかが推定される。
(実施例1)
CHO細胞におけるRSV Fタンパク質生産に対する温度の影響
この一式の実験は、移行前および後の温度ならびに移行のタイミングが、CHO細胞によるサブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質生産の際の力価および三量体生成に及ぼす影響を評価するように設計された。
CHO細胞におけるRSV Fタンパク質生産に対する温度の影響
この一式の実験は、移行前および後の温度ならびに移行のタイミングが、CHO細胞によるサブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質生産の際の力価および三量体生成に及ぼす影響を評価するように設計された。
BioNet(登録商標)コントローラーを備えた2LのApplikon(登録商標)バイオリアクターにおいて、表1に詳述する条件を使用して、生産実験を行った。条件はすべて、細胞に提供されるグルコースの量が制限される段階(RSV F(A)についてはHipDOG 0日目~5日目、RSV F(B)については0日目~4日目)を含み、ヒドロコルチゾンなしの細胞培養培地を使用する流加工程に課された。
1.1 増殖温度の影響
この実験では、細胞を、33℃、34.5℃、または36℃の温度で増殖させて、増殖温度が、力価、三量体の百分率、HMMS、LMMS、三量体力価、および宿主細胞タンパク質(HCP)の量に及ぼす影響を評価した。結果を、表2、ならびに図1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A、および4Bに示す。
この実験では、細胞を、33℃、34.5℃、または36℃の温度で増殖させて、増殖温度が、力価、三量体の百分率、HMMS、LMMS、三量体力価、および宿主細胞タンパク質(HCP)の量に及ぼす影響を評価した。結果を、表2、ならびに図1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A、および4Bに示す。
両方の抗原について、増殖温度は、三量体の百分率とは負に相関し、HMMSおよびLMMSの百分率とは正に相関した(図1Aおよび1Bを参照されたい)。34.5℃の温度で、最も高い力価が一貫して得られた(図2Aおよび2Bを参照されたい)。34℃~35℃の間の増殖温度、好ましくは、34.5℃が、三量体、力価を局限まで増大させ、不純物を最小限に抑えるのに適する。両方の抗原について、HCPレベルは、温度と正に相関した(図3Aおよび3Bを参照されたい)。サブタイプBについては、34.5℃の温度で、最も高い三量体力価が得られ、サブタイプAについては、33℃および34.5℃での三量体力価が、36℃より高かった(図4Aおよび4Bを参照されたい)。
1.2 生産温度の影響
この実験では、増殖温度を34.5℃とし、生産温度を様々にして(28.5℃、31℃、または34℃)、生産温度が、力価、三量体の百分率、HMMS、LMMS、三量体力価、およびHCPの量に及ぼす影響を評価した。結果を、表3、ならびに図5A、5B、6A、6B、7A、7B、8A、および8Bに示す。
この実験では、増殖温度を34.5℃とし、生産温度を様々にして(28.5℃、31℃、または34℃)、生産温度が、力価、三量体の百分率、HMMS、LMMS、三量体力価、およびHCPの量に及ぼす影響を評価した。結果を、表3、ならびに図5A、5B、6A、6B、7A、7B、8A、および8Bに示す。
(温度移行後の)生産温度は、両方の抗原について、三量体との負の線形相関、ならびにLMMSおよびHMMSとの正の線形相関を示した(図5Aおよび5Bを参照されたい)。最も低いHCPレベルおよび最も高い三量体力価レベルが、31℃の生産温度で得られた(図7Aおよび7B、8Aおよび8Bを参照されたい)。
1.3 温度移行のタイミングの影響
この実験では、温度移行のタイミングを様々にして、力価、三量体の百分率、HMMS、LMMS、三量体力価、およびHCPの量に対するその影響を評価した。結果を、表4、ならびに図9A、9B、10A、10B、11A、11B、12A、および12Bに示す。
この実験では、温度移行のタイミングを様々にして、力価、三量体の百分率、HMMS、LMMS、三量体力価、およびHCPの量に対するその影響を評価した。結果を、表4、ならびに図9A、9B、10A、10B、11A、11B、12A、および12Bに示す。
培養開始後144時間の時点での温度移行によって、三量体の量、力価、およびHCPのレベルが、異なる培養継続期間での移行に比べて改善された。これは、培養開始後185.5時間の時点における温度移行で最高となった、RSV F(B)についての三量体は別として、両方の抗原およびすべての属性に当てはまる。RSV F(A)については、144時間の温度移行で最も高い三量体力価が得られた。RSV F(B)についての三量体力価レベルは、144時間と114時間の時点で同様であり、どちらも、185.5時間の時点より低かった。
(実施例2)
CHO細胞におけるRSV Fタンパク質生産に対する温度移行の影響
この実験は、温度移行の存在が、CHO細胞によるサブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質生産の際の工程性能、力価、および三量体生成に及ぼす影響を評価するように設計された。
CHO細胞におけるRSV Fタンパク質生産に対する温度移行の影響
この実験は、温度移行の存在が、CHO細胞によるサブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質生産の際の工程性能、力価、および三量体生成に及ぼす影響を評価するように設計された。
BioNet(登録商標)コントローラーを備えた2LのApplikon(登録商標)バイオリアクターにおいて、表5に詳述する条件を使用して、生産実験を行った。条件はすべて、細胞に提供されるグルコースの量が制限される段階(RSV F(A)についてはHipDOG 0日目~5日目、RSV F(B)については0日目~4日目)を含み、ヒドロコルチゾンなしの細胞培養培地を使用する流加工程に課された。
結果を、表6および7、ならびに図13A、13B、14A、14B、15A、および15Cに示す。
温度移行の存在によって、両方の抗原について、三量体レベルが増大し、HCPが減少し、力価が増大した(図13A、13B、14A、14B、15A、および15Bを参照されたい)。
(実施例3)
CHO細胞におけるRSV Fタンパク質生産に対する糖質コルチコイド化合物の影響
この実験は、ヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイド化合物が、CHO細胞において生産されたサブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質の力価および製品品質に及ぼす影響を理解するために設計された。
CHO細胞におけるRSV Fタンパク質生産に対する糖質コルチコイド化合物の影響
この実験は、ヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイド化合物が、CHO細胞において生産されたサブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質の力価および製品品質に及ぼす影響を理解するために設計された。
BioNet(登録商標)コントローラーを備えた2LのApplikon(登録商標)バイオリアクターにおいて、ヒドロコルチゾンを含むまたは含まない細胞培養培地で表8に詳述する工程を使用して、生産実験を行った。
バイオリアクターはすべて、34.5℃で運転させ、31℃への温度移行を、6日目のバイオリアクター(B08)で行った。RSV F(B)については0日目~4日目、RSV F(A)については0日目~5日目に、制限された形でグルコースを提供した(Hipdog)。
ヒドロコルチゾンは、図16および17に示すウエスタンブロット結果によって示唆されるとおり、RSV Fタンパク質のフューリンプロセシングにマイナスの影響を及ぼした。ウエスタンブロットによって、プロセシングを受けたRSV F(A)またはRSV F(B)単量体および関連種をモニターすることが可能になる。融合前F三量体は、mAbであるAM14によって特異的に認識される(Gilman MSら、PLoS Pathogens、11(7)、2015)。用語「AM14」とは、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する、WO2008/147196A2に記載されている抗体を指す。結果を収集して、工程能力、およびプロセシングを受けたRSV F(A)またはRSV F(B)単量体、部分的にプロセシングを受けたまたはプロセシングを受けていないF+p27または他のサイズの変異体のレベルをモニターする。ヒドロコルチゾンを含有した条件のレーン(図16におけるB-07、B-04、B-03、およびA-01、ならびにA-04、A-05、B-03、B-07)は、AM-14抗体の結合によって確認されるRSVバンド(およそ60kDa)のすぐ上にスミアを示す。スミアの存在は、部分的にプロセシングを受けたRSV変異体を示すものである。
したがって、ワクチン組成物中に、特に三量体の形で使用するのに適する、プロセシングを受けた材料の量を向上させるためには、本発明の方法において使用される細胞培養培地に、ヒドロコルチゾンまたは他の関連した糖質コルチコイド化合物を含めないことが有利である。
(実施例4)
CHO細胞におけるRSV F産生に対するHiPDOGの影響
融合後高次構造は、エネルギー的に優先され、免疫原性がより弱く、融合前から融合後への移り変わりは不可逆的であるため、RSVタンパク質にとって、融合前高次構造の安定化は重要である。サブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質は、融合前高次構造の状態にあるタンパク質を安定化するように操作することができ、ジスルフィド結合が、この安定性に寄与する。したがって、ジスルフィド結合が完全であるかが、所望の高次構造の安定性に影響しうる。RSVにおけるサブユニット内ジスルフィド結合は、初期段階の流加工程において、わずかに不対となることがわかった。対応する2つの不対システインは、システイニル部分で修飾されていることがわかった。この修飾を測定し、QDa質量検出器とつなげたアミノ酸分析によって測定される「システイニル化」として報告する。
CHO細胞におけるRSV F産生に対するHiPDOGの影響
融合後高次構造は、エネルギー的に優先され、免疫原性がより弱く、融合前から融合後への移り変わりは不可逆的であるため、RSVタンパク質にとって、融合前高次構造の安定化は重要である。サブタイプAおよびBのRSV Fタンパク質は、融合前高次構造の状態にあるタンパク質を安定化するように操作することができ、ジスルフィド結合が、この安定性に寄与する。したがって、ジスルフィド結合が完全であるかが、所望の高次構造の安定性に影響しうる。RSVにおけるサブユニット内ジスルフィド結合は、初期段階の流加工程において、わずかに不対となることがわかった。対応する2つの不対システインは、システイニル部分で修飾されていることがわかった。この修飾を測定し、QDa質量検出器とつなげたアミノ酸分析によって測定される「システイニル化」として報告する。
この実験は、CHO細胞において生産されたサブタイプAおよびBのRSV Fにおけるシステイニル化のレベルに対するHiPDOGの影響を理解するために設計された。バイオリアクターパラメーターを表9に示す。
システイニル化のレベルは、HiPDOG対照が用いられたとき、RSV F(A)およびRSV F(B)抗原の両方について低下した(表10)。
加えて、HiPDOGを用いたとき、RSV F(A)およびRSV F(B)抗原両方について、力価が向上した(表11)。報告する力価測定は、第1の精製ステップ(限外濾過)の後である。
(実施例5)
大規模製造工程
本発明の方法が、大規模での使用に適するかを試した。HiPDOG、34.5℃の増殖温度、および31℃の生産温度を使用し、6日目に温度移行を実施する、12日間の流加工程において、サブタイプAまたはサブタイプBのRSVタンパク質Fを発現するCHO細胞を培養した。以下で表12に示すとおり、2500または12500Lのバイオリアクターで実施した場合でも、本発明の方法によって、有利な三量体力価値が得られた。
大規模製造工程
本発明の方法が、大規模での使用に適するかを試した。HiPDOG、34.5℃の増殖温度、および31℃の生産温度を使用し、6日目に温度移行を実施する、12日間の流加工程において、サブタイプAまたはサブタイプBのRSVタンパク質Fを発現するCHO細胞を培養した。以下で表12に示すとおり、2500または12500Lのバイオリアクターで実施した場合でも、本発明の方法によって、有利な三量体力価値が得られた。
配列番号1.自然RSV A2(GenBank GI:138251、Swiss Prot P03420)の全長F0のアミノ酸配列
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE
LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLS LIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
配列番号2.自然RSV B(18537株、GenBank GI:138250、Swiss Prot P13843)の全長F0のアミノ酸配列
MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIE
LSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVN
AGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV
VQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK
配列番号3:抗体AM14の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列:
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS
配列番号4:抗体AM14の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE
LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLS LIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
配列番号2.自然RSV B(18537株、GenBank GI:138250、Swiss Prot P13843)の全長F0のアミノ酸配列
MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIE
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配列番号3:抗体AM14の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列:
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配列番号4:抗体AM14の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV
Claims (44)
- RSV Fタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法であって、
(i)RSV Fタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
(ii)細胞を、約33.0℃~35.0℃の間の温度で培養するステップと、
(iii)既定のpH値を超えたpHの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法。 - 温度が約34.5℃である、請求項1に記載の方法。
- 温度を、より低い温度、好ましくは、約30.0℃~約32.0℃の間に移行させる、請求項1または2に記載の方法。
- より低い温度が、約31.0℃である、請求項3に記載の方法。
- 温度が、3日目と7日目の間に、より低い温度に移行される、請求項3または4に記載の方法。
- 温度が、5日目または6日目に、より低い温度に移行される、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。
- pHセンサーを使用して、細胞培養物のpHがモニターされる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 既定のpH値が、培養物のpH設定点を0.01~0.10超える増加に相当する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 既定のpH値が、培養物のpH設定点を0.05超える増加に相当する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物のpH設定点が、6.70~7.30の間である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物のpH設定点が、6.90~7.20の間である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物のpH設定点が、7.00~7.10の間である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物のpH設定点が、7.05である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- -制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間は、pH設定点が、6.95、7.01、7.05、7.07、または7.20であり、
-制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後は、pH設定点が、6.90または7.20である、
請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。 - 既定のpH値を超えたpHの上昇に応じた細胞培養物へのグルコースの供給が、pHが低下して培養物のpH設定点に達するまでグルコースを供給することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 1日目~6日目に、制限された形でグルコースが提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、糖質コルチコイド化合物を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、ヒドロコルチゾンを含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、無血清である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、無タンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、限定培地である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物に、供給培地がさらに提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 供給培地が、継続して、または複数の間隔をおいて提供される、請求項23に記載の方法。
- 供給培地が、糖質コルチコイド化合物を含まない、請求項23または24に記載の方法。
- 供給培地が、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない、請求項23から25のいずれかに記載の方法。
- 供給培地が、ヒドロコルチゾンを含まない、請求項23から26のいずれかに記載の方法。
- 供給培地が、無血清である、請求項23から27のいずれかに記載の方法。
- 供給培地が、無タンパク質である、請求項23から28のいずれかに記載の方法。
- 供給培地が、限定培地である、請求項23から29のいずれかに記載の方法。
- 細胞培養の間の最大生細胞密度が、1×106細胞/mLを超える、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 最大生細胞密度が、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、または5×108細胞/mLを超える、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地の体積が、少なくとも500Lである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地の体積が、少なくとも3000Lである、請求項33に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、BALB/cマウス骨髄腫系、ヒト網膜芽細胞(PER.C6)、サル腎臓細胞、ヒト胎児由来腎臓系(293)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、マウスセルトリ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76)、ヒト子宮頚癌細胞(HeLa)、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳房腫瘍細胞、TRI細胞、MRC5細胞、FS4細胞、またはヒトヘパトーマ系(HepG2)から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、GS-CHO細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- RSV Fタンパク質が、サブタイプAのものである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- RSV Fタンパク質が、サブタイプBのものである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- RSV Fタンパク質が、融合前高次構造の状態にある三量体を安定化する突然変異を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- RSV Fタンパク質が、
(1)T103C、I148C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(2)T54H、S55C、L188C、およびD486Sの組合せ、
(3)T54H、T103C、I148C、S190I、V296I、およびD486Sの組合せ、
(4)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、およびN371Cの組合せ、
(5)S55C、L188C、およびD486Sの組合せ、
(6)T54H、S55C、L188C、およびS190Iの組合せ、
(7)S55C、L188C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(8)T54H、S55C、L188C、S190I、およびD486Sの組合せ、
(9)S155C、S190I、S290C、およびD486Sの組合せ、
(10)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q、およびD489Sの組合せ、ならびに
(11)T54H、S155C、S190I、S290C、およびV296Iの組合せ
からなる群から選択される突然変異の組合せを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 細胞によって産生されたRSV Fタンパク質三量体を取得するステップをさらに含む、請求項1から41のいずれか一項に記載の方法。
- RSV Fタンパク質三量体を精製するステップをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 請求項43に記載の方法によって得られた精製RSV Fタンパク質三量体を、薬学的に許容できる担体と合わせて含む医薬組成物。
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