JP2022060169A - Ｒｓｖ ｆタンパク質生産のための細胞培養工程 - Google Patents
Ｒｓｖ ｆタンパク質生産のための細胞培養工程 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022060169A JP2022060169A JP2021158607A JP2021158607A JP2022060169A JP 2022060169 A JP2022060169 A JP 2022060169A JP 2021158607 A JP2021158607 A JP 2021158607A JP 2021158607 A JP2021158607 A JP 2021158607A JP 2022060169 A JP2022060169 A JP 2022060169A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell culture
- protein
- cell
- temperature
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 230000014616 translation Effects 0.000 title description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 154
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 49
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000013639 protein trimer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 190
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 167
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 148
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims description 54
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 50
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 48
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 48
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 38
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 26
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 25
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 25
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 claims description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 21
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 claims description 15
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 102220259718 rs34120878 Human genes 0.000 claims description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 13
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 claims description 11
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 11
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 229960004648 betamethasone acetate Drugs 0.000 claims description 7
- 229960003657 dexamethasone acetate Drugs 0.000 claims description 7
- SYWHXTATXSMDSB-GSLJADNHSA-N fludrocortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O SYWHXTATXSMDSB-GSLJADNHSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003336 fluorocortisol acetate Drugs 0.000 claims description 7
- 229960001293 methylprednisolone acetate Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002800 prednisolone acetate Drugs 0.000 claims description 7
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 claims description 7
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 claims description 7
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 claims description 7
- 229940126307 triamcinolone acetate Drugs 0.000 claims description 7
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 claims description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 2
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 claims 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 abstract description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 130
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 45
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 description 23
- 238000000281 laser microprobe mass spectrometry Methods 0.000 description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 19
- 239000000306 component Substances 0.000 description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 10
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 230000007103 stamina Effects 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 6
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 5
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- RKHQGWMMUURILY-UHRZLXHJSA-N cortivazol Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2C[C@H]([C@]([C@@]2(C)C[C@H](O)[C@@H]1[C@@]1(C)C2)(O)C(=O)COC(C)=O)C)=C(C)C1=CC1=C2C=NN1C1=CC=CC=C1 RKHQGWMMUURILY-UHRZLXHJSA-N 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 4
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 4
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 3
- 241000725296 JDV virus Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- -1 aliphatic amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- KVEAILYLMGOETO-UHFFFAOYSA-H dicalcium magnesium diphosphate Chemical compound P(=O)([O-])([O-])[O-].[Mg+2].[Ca+2].[Ca+2].P(=O)([O-])([O-])[O-] KVEAILYLMGOETO-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000013627 low molecular weight specie Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hexadecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCO)C=C1 LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 101000693922 Bos taurus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100037084 C4b-binding protein alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 101710159767 C4b-binding protein alpha chain Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 101100273566 Humulus lupulus CCL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000822667 Mus musculus Something about silencing protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K aluminum;potassium;phosphate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012534 cell culture medium component Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 125000002470 cystinyl group Chemical group O=C([*])C(N([H])[H])([H])C([H])([H])SSC([H])([H])C([H])(C(O[H])=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000013315 hypercross-linked polymer Substances 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 208000030500 lower respiratory tract disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- CGVLVOOFCGWBCS-RGDJUOJXSA-N n-octyl β-d-thioglucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCS[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O CGVLVOOFCGWBCS-RGDJUOJXSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000021049 nutrient content Nutrition 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000035040 seed growth Effects 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18551—Methods of production or purification of viral material
- C12N2760/18552—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
【課題】ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法を提供すること。【解決手段】方法は、温度を、約３０．０℃～約３２．０℃の間のより低い温度、好ましくは、約３１．０℃に移行させる、温度移行を含む。【選択図】図２
Description
本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法に関する。
呼吸器合胞体ウイルス、すなわちＲＳＶは、肺および呼吸路に感染する呼吸器系ウイルスである。ＲＳＶは、全世界で小児における重篤なウイルス性下気道疾患の主原因であり、高齢者における呼吸器疾患の重要な原因である。しかし、ＲＳＶ感染の予防用に承認されたワクチンはない。
ＲＳＶは、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科の仲間である。そのゲノムは、９種の構造タンパク質（３種の糖タンパク質および６種の内部タンパク質）と２種の非構造タンパク質を含む１１種のタンパク質をコードする一本鎖のネガティブセンスＲＮＡ分子からなる。構造タンパク質には、３種の膜貫通型表面糖タンパク質、すなわち、付着タンパク質Ｇ、融合タンパク質Ｆ、および小さい疎水性のＳＨタンパク質が含まれる。ＲＳＶには、ＡとＢの２つのサブタイプが存在する。これらサブタイプは、主としてＧ糖タンパク質が異なっており、Ｆ糖タンパク質の配列は、２つのサブタイプ間で、より保存されている。
成熟Ｆ糖タンパク質は、外部ドメイン（ＥＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および細胞質側末端（ＣＴ）の３つの一般ドメインを有する。ＣＴは、パルミトイル化システイン残基をただ１つ含んでいる。
ヒトＲＳＶのＦ糖タンパク質は、最初に、ｍＲＮＡから、Ｎ末端にシグナルペプチド配列（アミノ酸１～２５）を含んでいる、単独の５７４アミノ酸のポリペプチド前駆体（「Ｆ０」または「Ｆ０前駆体」と呼ばれる）として翻訳される。翻訳されると、シグナルペプチドは、小胞体において、シグナルペプチダーゼによって除去される。Ｆ０前駆体の残りの部分（すなわち、残基２６～５７４）は、細胞プロテアーゼ（特に、フューリン）によって、２つの多塩基部位（ａ．ａ．１０９／１１０および１３６／１３７）においてさらに切断され、ｐｅｐ２７と呼ばれる２７アミノ酸の介在配列（アミノ酸１１０～１３６）を脱離させ、Ｆ１（Ｃ末端部分、アミノ酸１３７～５７４）およびＦ２（Ｎ末端部分、アミノ酸２６～１０９）と呼ばれる、連結された２つの断片を生じうる。Ｆ１は、そのＮ末端にある疎水性の融合ペプチド、および２つのヘプタッド反復領域（ＨＲＡおよびＨＲＢ）を含んでいる。ＨＲＡは、融合ペプチドに近く、ＨＲＢは、ＴＭドメインに近い。Ｆ１断片とＦ２断片は、２つのジスルフィド結合によって連結されている。シグナルペプチド配列なしの切断されていないＦ０タンパク質、またはＦ１－Ｆ２ヘテロ二量体のいずれもが、ＲＳＶ Ｆプロトマーを形成しうる。３つのこうしたプロトマーが集合して、３つのプロトマーのホモ三量体である最終ＲＳＶ Ｆタンパク質複合体を形成する。
サブタイプＡとＢのＦタンパク質は、アミノ酸配列の同一性が約９０パーセントである。Ｆ０前駆体ポリペプチドの、Ａサブタイプについての見本配列を、配列番号１（Ａ２株、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ：１３８２５１、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０３４２０）に示し、Ｂサブタイプについては、配列番号２（１８５３７株、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ：１３８２５０、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ１３８４３）に示す。配列番号１と配列番号２は、どちらも５７４アミノ酸の配列である。また、配列番号１および配列番号２のシグナルペプチド配列は、アミノ酸１～２５であると報告されている（ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉＰｒｏｔ）。両方の配列において、ＴＭドメインは、概ねアミノ酸５３０～５５０であるが、他方では、５２５～５４８とも報告されている。細胞質側末端領域は、アミノ酸５４８または５５０のいずれかにおいて始まり、アミノ酸５７４で終わり、パルミトイル化システイン残基は、アミノ酸５５０に位置している。
ＲＳＶサブユニットワクチンのために検討される主要な抗原の１つが、Ｆタンパク質である。ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体は、ビリオン膜と宿主細胞膜の融合を媒介し、合胞体の形成も促進する。この最も大きいＦ分子集団は、宿主細胞の膜と融合する前のビリオンでは、ＴＭドメインがウイルスエンベロープに固定された状態で、棒付きキャンディーの形状をした構造をなす［Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ，Ｐ．Ｒ．、Ｇｒａｎｄｉ，Ｇ．、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１０、８０７、２０１２］。この高次構造は、融合前高次構造と呼ばれる。融合前ＲＳＶ Ｆは、オリゴマー状態の区別なしに、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＤ２５、ＡＭ２２、およびＭＰＥ８によって認識される。融合前Ｆ三量体は、ｍＡｂであるＡＭ１４によって特異的に認識される［Ｇｉｌｍａｎ ＭＳ、Ｍｏｉｎ ＳＭ、Ｍａｓ Ｖら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ａ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ，ｃｌｅａｖａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ＲＳＶ ｆｕｓｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、１１（７）、２０１５］。ＤＲＳＶが細胞に侵入する際、Ｆタンパク質は、融合前状態（本明細書では「プレＦ」と呼ぶ場合もある）から、ほぐれた中間構造を経て、融合後状態（「ポストＦ」）に再編成される。この再編成の間、融合前分子のＣ末端コイルドコイルが解離して、それを構成していた３本の鎖になり、次いでこれらが、球状の頭部に巻き付き、追加の３つのヘリックスと一緒になって、融合後の６ヘリックスバンドルを形成する。融合前ＲＳＶ Ｆ三量体は、温度上昇などの、苛烈さを増す化学的または物理的条件にさらされた場合、構造の変化を被る。最初に、（分子内で少なくとも局所的に）三量体構造が損なわれ、次いで、融合後形態へと再編成され、次いで、ドメインが変性する。
ウイルス侵入を防ぐためには、ウイルスエンベロープが細胞膜と融合する前に、ビリオン上にあるＦの融合前高次構造、または、可能性として、ほぐれた中間体に、Ｆ特異的中和抗体が結合しなければならないと推定される。したがって、Ｆタンパク質の融合前形態は、所望のワクチン抗原として好ましい高次構造であると考えられる［Ｎｇｗｕｔａ，Ｊ．Ｏ．、Ｃｈｅｎ，Ｍ．、Ｍｏｄｊａｒｒａｄ，Ｋ．、Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｇ．、Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．、Ｋｕｍａｒ，Ａ．、Ｙａｓｓｉｎｅ，Ｈ．Ｍ．、Ｍｏｉｎ，Ｓ．Ｍ．、Ｋｉｌｌｉｋｅｌｌｙ，Ａ．Ｍ．、Ｃｈｕａｎｇ，Ｇ．Ｙ．、Ｄｒｕｚ，Ａ．、Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｉ．Ｓ．、Ｒｕｎｄｌｅｔ，Ｅ．Ｊ．、Ｓａｓｔｒｙ，Ｍ．、Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｂ．、Ｙａｎｇ．Ｙ．、Ｚｈａｎｇ，Ｂ．、Ｎａｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．、Ｃａｐｅｌｌａ，Ｃ．、Ｐｅｅｐｌｅｓ，Ｍ．、Ｌｅｄｇｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｃｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｋｗｏｎｇ，Ｐ．Ｄ．、Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．、１４、７、３０９（２０１５）］。Ｆ糖タンパク質は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ＮＰ－４０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯなどの界面活性剤による膜の抽出、外部ドメインとしての発現、物理的もしくは化学的ストレス、または貯蔵を経ると、融合後形態に容易に変換される［ＭｃＬｅｌｌａｎ ＪＳ、Ｃｈｅｎ Ｍ、Ｌｅｕｎｇ Ｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＳＶ ｆｕｓｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ａ ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０、１１１３～１１１７（２０１３）；Ｃｈａｉｗａｔｐｏｎｇｓａｋｏｒｎ，Ｓ．、Ｅｐａｎｄ，Ｒ．Ｆ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．、Ｅｐａｎｄ Ｒ．Ｍ．、Ｐｅｅｐｌｅｓ，Ｍ．Ｅ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８５（８）：３９６８～７７（２０１１）；Ｙｕｎｕｓ，Ａ．Ｓ．、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｔ．Ｐ．、Ｃｒｉｓａｆｉ，Ｋ．、Ｂｕｒｉｍｓｋｉ，Ｉ．、Ｋｉｌｇｏｒｅ，Ｎ．Ｒ．、Ｚｏｕｍｐｌｉｓ，Ｄ．、Ａｌｌａｗａｙ，Ｇ．Ｐ．、Ｗｉｌｄ，Ｃ．Ｔ．、Ｓａｌｚｗｅｄｅｌ，Ｋ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｊａｎ ２０；３９６（２）：２２６～３７］。したがって、融合前Ｆのワクチン抗原としての調製は、依然として難題となっている。中和および防御抗体は、ウイルス進入を妨害することにより機能するため、融合後特異的抗体だけを惹起するＦ抗原は、融合前特異的抗体を惹起するＦ抗原ほど有効になるとは見込まれないと仮定される。したがって、融合前形態（または可能性として、ほぐれた中間形態）のＦタンパク質免疫原を含有するＦタンパク質ワクチンを利用することがより望ましいと考えられる。タンパク質の融合前形態の安定性を向上させるために、ＲＳＶ Ｆタンパク質の突然変異体が提供されており（たとえば、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／１０９６２９号を参照されたい）、有望なワクチン候補になっている。
Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ，Ｐ．Ｒ．、Ｇｒａｎｄｉ，Ｇ．、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１０、８０７、２０１２
Ｇｉｌｍａｎ ＭＳ、Ｍｏｉｎ ＳＭ、Ｍａｓ Ｖら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ａ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ，ｃｌｅａｖａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ＲＳＶ ｆｕｓｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、１１（７）、２０１５
Ｎｇｗｕｔａ，Ｊ．Ｏ．、Ｃｈｅｎ，Ｍ．、Ｍｏｄｊａｒｒａｄ，Ｋ．、Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｇ．、Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．、Ｋｕｍａｒ，Ａ．、Ｙａｓｓｉｎｅ，Ｈ．Ｍ．、Ｍｏｉｎ，Ｓ．Ｍ．、Ｋｉｌｌｉｋｅｌｌｙ，Ａ．Ｍ．、Ｃｈｕａｎｇ，Ｇ．Ｙ．、Ｄｒｕｚ，Ａ．、Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｉ．Ｓ．、Ｒｕｎｄｌｅｔ，Ｅ．Ｊ．、Ｓａｓｔｒｙ，Ｍ．、Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｂ．、Ｙａｎｇ．Ｙ．、Ｚｈａｎｇ，Ｂ．、Ｎａｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．、Ｃａｐｅｌｌａ，Ｃ．、Ｐｅｅｐｌｅｓ，Ｍ．、Ｌｅｄｇｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｃｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｋｗｏｎｇ，Ｐ．Ｄ．、Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．、１４、７、３０９（２０１５）
ＭｃＬｅｌｌａｎ ＪＳ、Ｃｈｅｎ Ｍ、Ｌｅｕｎｇ Ｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＳＶ ｆｕｓｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ａ ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０、１１１３～１１１７（２０１３）
Ｃｈａｉｗａｔｐｏｎｇｓａｋｏｒｎ，Ｓ．、Ｅｐａｎｄ，Ｒ．Ｆ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．、Ｅｐａｎｄ Ｒ．Ｍ．、Ｐｅｅｐｌｅｓ，Ｍ．Ｅ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８５（８）：３９６８～７７（２０１１）
Ｙｕｎｕｓ，Ａ．Ｓ．、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｔ．Ｐ．、Ｃｒｉｓａｆｉ，Ｋ．、Ｂｕｒｉｍｓｋｉ，Ｉ．、Ｋｉｌｇｏｒｅ，Ｎ．Ｒ．、Ｚｏｕｍｐｌｉｓ，Ｄ．、Ａｌｌａｗａｙ，Ｇ．Ｐ．、Ｗｉｌｄ，Ｃ．Ｔ．、Ｓａｌｚｗｅｄｅｌ，Ｋ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｊａｎ ２０；３９６（２）：２２６～３７
Ｇａｇｎｏｎら（（２０１１）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０８：１３２８～１３３７）
Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７
ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０
Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３～２５１、１９８０
Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４～６８、１９８２
Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８７
Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（共編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ Ｐｒｅｓｓ、１９９９
Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（共編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１８２巻）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７
Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０～６２５、１９８１
Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０～４６、１９７９
Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６～４５７、１９７８）
Ｈａｗｌｅｙ－Ｎｅｌｓｏｎ（Ｆｏｃｕｓ １５：７３、１９９３）
Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９
Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７～５３７、１９９０
Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８～３５２、１９８８
Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６～１１４２、１９８５
Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３～５１２、１９８７
Ｓｅｅｄ，Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０、１９８７
Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７～１９５、１９８７
Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１、１９８８
Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３～９６７、１９９２
Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、１９９０
Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６、１９８８
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１～４３４、１９９１
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４３～１５５、１９９２
Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６４８２～６４８６、１９９２
ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８１２～２８１６、１９９３
Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２５８１～２５８４、１９９２
Ｈａｊ－ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７、１９８６
Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７～１２９、１９９２
Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９～３５６、１９９２
Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８、１９８９
ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３～１９７３、１９８９
Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１～３２６０、１９８５）
Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６～６４７０、１９８４
Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２～２０８１、１９８５
Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２～３９、１９８８
Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１～６１９、１９８４；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１～３７９０、１９９３
Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３～５６０７、１９９３
Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９～１０２４、１９９３
Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０６０７～１０６１３、１９９３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０１４９～１０１５３、１９９２
Ｓｏｌａｂｏｍｉら、２００８、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７６：３８１７～２３
Ｇａｇｎｏｎら（２０１１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０８：１３２８～１３３７
Ｇｉｌｍａｎ ＭＳら、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、１１（７）、２０１５
したがって、所望の三量体高次構造をとり、適切な力価を有する、こうした抗原を生産するための工程が必要である。そのような工程はまた、大規模で使用されるように十分に頑強にすべきである。加えて、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）または他の不純物の量は、生産された三量体の下流での加工を容易にするために、最小限に抑えるべきである。
本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法であって、
（ｉ）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
（ｉｉ）細胞を、約３３．０℃～３５．０℃の間の温度で培養するステップと、
（ｉｉｉ）既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法に関する。
（ｉ）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
（ｉｉ）細胞を、約３３．０℃～３５．０℃の間の温度で培養するステップと、
（ｉｉｉ）既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法に関する。
一部の実施形態では、方法は、温度を、約３０．０℃～約３２．０℃の間のより低い温度、好ましくは、約３１．０℃に移行させる、温度移行を含む。
本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法であって、
（ｉ）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
（ｉｉ）細胞を、約３３．０℃～約３５．０℃の間の温度で培養するステップと、
（ｉｉｉ）既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法に関する。
（ｉ）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
（ｉｉ）細胞を、約３３．０℃～約３５．０℃の間の温度で培養するステップと、
（ｉｉｉ）既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法に関する。
本発明の方法は、免疫原性組成物中に抗原として使用されるＲＳＶ Ｆタンパク質三量体の生産に特に有用である。本発明の方法は、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体の、大規模での、たとえば、少なくとも５００Ｌ、またはなお少なくとも３０００Ｌの細胞培養培地体積での製造に使用することができる。本発明の方法では、三量体の形のＲＳＶタンパク質Ｆが高い力価および高い百分率で提供され、しかもＨＣＰまたは他の不純物の量が最小限に抑えられ、その結果、さらに下流での加工が容易になる。加えて、タンパク質の加工を最適化する詳細な条件が、特定されており、本発明の方法において使用することができる。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブタイプＡのＲＳＶ Ｆタンパク質である。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブタイプＢのＲＳＶ Ｆタンパク質である。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質の突然変異体である。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブタイプＡの野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質の突然変異体である。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブタイプＢの野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質の突然変異体である。一部の実施形態では、突然変異体は、対応する野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列を基準として、アミノ酸配列における導入突然変異を示し、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質、または野生型Ｆタンパク質を含むウイルスに対して免疫原性である。突然変異体におけるアミノ酸突然変異には、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質を基準とした、アミノ酸置換、欠失、または付加が含まれる。
一部の実施形態では、本発明の方法によって生産されるＲＳＶ Ｆタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１０９６２９において開示されているとおりのＲＳＶタンパク質突然変異体である。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、導入されたアミノ酸突然変異が、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質における一対のアミノ酸残基が一対のシステインになる突然変異（「改変ジスルフィド突然変異」）である、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質の突然変異体である。システイン残基対が導入されると、タンパク質の高次構造またはオリゴマー状態、たとえば、融合前高次構造を安定化させる、システイン残基間のジスルフィド結合の形成が可能になる。このような突然変異の詳細な対の例としては、Ｓ５５ＣとＬ１８８Ｃ、Ｓ１５５ＣとＳ２９０Ｃ、Ｔ１０３ＣとＩ１４８Ｃ、Ｌ１４２ＣとＮ３７１Ｃなどの、５５Ｃと１８８Ｃ、１５５Ｃと２９０Ｃ、１０３Ｃと１４８Ｃ、および１４２Ｃと３７１Ｃが挙げられる。
さらに他の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、１つまたは複数の空隙充填突然変異であるアミノ酸突然変異を含む。空隙充填を目標として置き換えることができるアミノ酸の例としては、小さい脂肪族（たとえば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ）または小さい極性アミノ酸（たとえば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、および、融合前高次構造の状態では埋まっているが、融合後高次構造の状態では溶媒に曝されるアミノ酸が挙げられる。補充アミノ酸の例としては、大きい脂肪族アミノ酸（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ）または大きい芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が挙げられる。一部の詳細な実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、
（１）５５、６２、１５５、１９０、または２９０位にあるＳのＩ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
（２）５４、５８、１８９、２１９、または３９７位にあるＴのＩ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
（３）１５１位にあるＧのＡまたはＨによる置換、
（４）１４７または２９８位にあるＡのＩ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
（５）１６４、１８７、１９２、２０７、２２０、２９６、３００、または４９５位にあるＶのＩ、Ｙ、Ｈによる置換、および
（６）１０６位にあるＲのＷによる置換
からなる群から選択される空隙充填突然変異を含む。
（１）５５、６２、１５５、１９０、または２９０位にあるＳのＩ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
（２）５４、５８、１８９、２１９、または３９７位にあるＴのＩ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
（３）１５１位にあるＧのＡまたはＨによる置換、
（４）１４７または２９８位にあるＡのＩ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
（５）１６４、１８７、１９２、２０７、２２０、２９６、３００、または４９５位にあるＶのＩ、Ｙ、Ｈによる置換、および
（６）１０６位にあるＲのＷによる置換
からなる群から選択される空隙充填突然変異を含む。
一部の特定の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、Ｔ５４Ｈ、Ｓ１９０Ｉ、およびＶ２９６Ｉからなる群から選択される少なくとも１つの空隙充填突然変異を含む。
さらに他の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、折り畳み構造において互いに近接するタンパク質中の残基間で、イオン反発を低減する、またはイオン誘引を増大させる、静電突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、ＲＳＶ Ｆ三量体の別のプロトマーからのＧｌｕ４８７およびＡｓｐ４８９の酸性残基との、反発性のイオン相互作用を低減し、または誘引性のイオン相互作用を増強する静電置換を含む。一部の詳細な実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、
（１）８２、９２、または４８７位にあるＥのＤ、Ｆ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、またはＨによる置換、
（２）３１５、３９４、または３９９位にあるＫのＦ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、またはＴによる置換、
（３）３９２、４８６、または４８９位にあるＤのＨ、Ｓ、Ｎ、Ｔ、またはＰによる置換、および
（４）１０６または３３９位にあるＲのＦ、Ｑ、Ｎ、またはＷによる置換
からなる群から選択される静電突然変異を含む。
（１）８２、９２、または４８７位にあるＥのＤ、Ｆ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、またはＨによる置換、
（２）３１５、３９４、または３９９位にあるＫのＦ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、またはＴによる置換、
（３）３９２、４８６、または４８９位にあるＤのＨ、Ｓ、Ｎ、Ｔ、またはＰによる置換、および
（４）１０６または３３９位にあるＲのＦ、Ｑ、Ｎ、またはＷによる置換
からなる群から選択される静電突然変異を含む。
さらに他の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、改変ジスルフィド突然変異、空隙充填突然変異、および静電突然変異から選択される、２種以上の異なるタイプの突然変異の組合せを含む。一部の特定の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、
（１）Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（２）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（３）Ｔ５４Ｈ、Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｖ２９６Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（４）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１４２Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｖ２９６Ｉ、およびＮ３７１Ｃの組合せ、
（５）Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（６）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＳ１９０Ｉの組合せ、
（７）Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（８）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（９）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ２９０Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（１０）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１４２Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｖ２９６Ｉ、Ｎ３７１Ｃ、Ｄ４８６Ｓ、Ｅ４８７Ｑ、およびＤ４８９Ｓの組合せ、ならびに
（１１）Ｔ５４Ｈ、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ２９０Ｃ、およびＶ２９６Ｉの組合せ
からなる群から選択される、対応する野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質に関連する突然変異の組合せを含む。
（１）Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（２）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（３）Ｔ５４Ｈ、Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｖ２９６Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（４）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１４２Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｖ２９６Ｉ、およびＮ３７１Ｃの組合せ、
（５）Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（６）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＳ１９０Ｉの組合せ、
（７）Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（８）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（９）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ２９０Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（１０）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１４２Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｖ２９６Ｉ、Ｎ３７１Ｃ、Ｄ４８６Ｓ、Ｅ４８７Ｑ、およびＤ４８９Ｓの組合せ、ならびに
（１１）Ｔ５４Ｈ、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ２９０Ｃ、およびＶ２９６Ｉの組合せ
からなる群から選択される、対応する野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質に関連する突然変異の組合せを含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブタイプＡのものであり、突然変異Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓを含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブタイプＢのものであり、突然変異Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓを含む。
ＲＳＶ Ｆ配列が実質的に保存されていることを考慮すると、当業者により、異なる自然ＲＳＶ Ｆ配列間でアミノ酸位を容易に対照して、異なるＲＳＶ株およびサブタイプ間の対応するＲＳＶ Ｆアミノ酸位を見極めることができる。たとえば、確認された、ほぼすべての自然ＲＳＶ Ｆ０前駆体タンパク質において、フューリン切断部位は、同じアミノ酸位にある。したがって、自然ＲＳＶ Ｆタンパク質配列の株およびサブタイプ全般にわたる保存により、基準ＲＳＶ Ｆ配列を使用して、ＲＳＶ Ｆタンパク質中の特定の位置にあるアミノ酸の対照が可能になる。本開示の目的では（そうでないと文脈から示されない限り）、ＲＳＶ Ｆタンパク質アミノ酸位は、ＧｅｎＩｎｆｏ識別名ＧＩ１３８２５１およびＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ識別名Ｐ０３４２０に相当する、ＲＳＶ Ａ２株の全長自然Ｆ前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列に準拠して示される。
一部の実施形態では、本発明の方法によって生産されたＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＷＯ２００９／０７９７９６、ＷＯ２０１０／１４９７４５、ＷＯ２０１１／００８９７４、ＷＯ２０１４／１６０４６３、ＷＯ２０１４／１７４０１８、ＷＯ２０１４／２０２５７０、ＷＯ２０１５／０１３５５１、ＷＯ２０１５／１７７３１２、ＷＯ２０１７／００５８４８、およびＷＯ２０１８／１０９２２０において開示されているとおりのＲＳＶタンパク質突然変異体である。これらの参考文献において開示されているＲＳＶ Ｆタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する用語「流加培養法」とは、培養工程を始める時点またはその後の諸時点で、培養物に追加成分が提供される、細胞の培養方法を指す。一部の実施形態では、そうした追加成分は、供給培地としてまとめて提供される。このような、提供される成分は、通常、培養工程の間に枯渇してしまった、細胞のための栄養成分を含む。流加培養法は、通常、ある時点で中断され、培地中の細胞および／または成分が回収され、場合により精製される。一部の実施形態では、流加培養物は、供給培地で補充された基本培地を含む。
一部の実施形態では、細胞は、３３．０℃、３３．１℃、３３．２℃、３３．３℃、３３．４℃、３３．５℃、３３．６℃、３３．７℃、３３．８℃、３３．９℃、３４．０℃、３４．１℃、３４．２℃、３４．３℃、３４．４℃、３４．５℃、３４．６℃、３４．７℃、３４．８℃、３４．９℃、または３５．０℃の温度で培養される。好ましい一実施形態では、細胞は、３４．０℃～３５．０℃の間の温度で培養される。好ましい一実施形態では、細胞は、３４．５℃の温度で培養される。
本発明の方法は、細胞に、制限された形でグルコースを提供するステップであって、グルコースは、既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて細胞に供給される、ステップを含む。ｐＨ変化に応じてグルコースを供給するこのような方法は、ＨｉＰＤＯＧとも呼ばれ、たとえば、ＷＯ２００４／１０４１８６、およびＧａｇｎｏｎら（（２０１１）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０８：１３２８～１３３７）において開示されており、これら文献はどちらも、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ｐＨセンサーを使用して、細胞培養物のｐＨがモニターされる。
一部の実施形態では、本発明の方法の規定のｐＨ値は、培養物のｐＨ設定点を０．０１～０．１０、たとえば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１０超える増加に相当する。一部の実施形態では、既定のｐＨ値は、培養物のｐＨ設定点を０．０５超える増加に相当する。
一部の実施形態では、細胞培養物のｐＨ設定点は、６．７０～７．３０の間である。一部の実施形態では、細胞培養物のｐＨ設定点は、６．９０～７．２０の間である。一部の実施形態では、細胞培養物のｐＨ設定点は、７．００～７．１０の間である。好ましい一実施形態では、細胞培養物のｐＨ設定点は、７．０５である。
好ましい一実施形態では、細胞培養物のｐＨ設定点は、７．０５であり、既定のｐＨ値は、前記設定点を０．０５超える増加に相当する。
一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、細胞培養物のｐＨは、６．７０～７．３０の間である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、細胞培養物のｐＨは、６．９０～７．２０の間である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、ｐＨ設定点は、６．９５である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、ｐＨ設定点は、７．０７である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、ｐＨ設定点は、７．０１である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間、ｐＨ設定点は、７．２０である。
一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後、ｐＨ設定点は、７．２０である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後、ｐＨ設定点は、７．２０であり、ｐＨ操作範囲は、７．０５～７．３５である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後、ｐＨ設定点は、６．９０である。一部の実施形態では、制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後、ｐＨ設定点は、６．９０であり、ｐＨ操作範囲は、６．７５～７．０５である。
一部の実施形態では、既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じた細胞培養物へのグルコースの供給は、ｐＨが低下して培養物のｐＨ設定点に達するまでグルコースを供給することを含む。
一部の実施形態では、培養物の成長段階の間、グルコースが、制限された形で細胞培養物に提供される。一部の実施形態では、グルコースが、１～６日間、好ましくは、３、４、または５日間、より好ましくは、４または５日間、制限された形で細胞培養物に提供される。
一部の実施形態では、細胞培養物に、制限された形でグルコースを提供するステップは、０日目、１日目、または２日目に始動する。
一部の実施形態では、グルコースは、制限された形で提供されるとき、独立した供給材料として提供される、すなわち、供給培地の他の成分を含まない。
一部の実施形態では、グルコースは、制限された形で提供されるとき、供給培地の一部として提供される。
本明細書において開示する方法の一部の実施形態では、温度は、約３０．０℃～約３２．０℃の間のより低い温度、好ましくは、約３１．０℃に移行される。一部の実施形態では、温度は、３日目～７日目の間（すなわち、培養３日目～培養７日目の間）に、より低い温度に移行される。好ましい一実施形態では、温度は、５日目または６日目に、より低い温度に移行される。好ましい一実施形態では、温度は、制限された形でのグルコースの供給が中断された後、より低い温度に移行される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および／または温度移行なしの方法、および／または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および／または既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、力価が向上する。力価は、当業界で知られているいずれの方法によって求めてもよい。一実施形態では、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって力価が測定される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および／または温度移行なしの方法、および／または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および／または既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、三量体の百分率が増大し、高分子質量種（ＨＭＭＳ）および／または低分子質量種（ＬＭＭＳ）の百分率が低下する。三量体、ＨＭＭＳ、およびＬＭＭＳの百分率は、当業界で知られているいずれの方法によって求めてもよい。一部の実施形態では、三量体、ＨＭＭＳ、およびＬＭＭＳの百分率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって測定される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および／または温度移行なしの方法、および／または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および／または既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、三量体力価が増大する。三量体力価値は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって取得されることが好ましい、三量体の百分率に、ＲＰ－ＨＰＬＣによって取得されることが好ましい、力価を掛けることにより算出される。三量体力価によって、どれだけのタンパク質が三量体型として生産されるかが推定される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および／または温度移行なしの方法、および／または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および／または既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、宿主細胞タンパク質の量が減少する。ＨＣＰは、当業界で知られているいずれの方法によって測定してもよい。一部の実施形態では、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＨＣＰが測定された。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および／または温度移行なしの方法、および／または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および／または既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、免疫原性組成物中に抗原として使用することができる三量体の形成に適する形態の加工されたＲＳＶ Ｆ（Ａ）またはＲＳＶ Ｆ（Ｂ）の量が向上する。適切な形態の加工されたＲＳＶ Ｆ（Ａ）またはＲＳＶ Ｆ（Ｂ）の量は、当業界で知られているいずれの方法によって求めてもよい。一実施形態では、そのような量は、たとえば実施例３に示すとおりのウエスタンブロットによって測定される。
一部の実施形態では、本発明の方法の結果として、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法、および／または温度移行なしの方法、および／または糖質コルチコイドを含む培地を使用する方法、および／または既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で細胞培養物にグルコースを提供するステップを含まない方法などの、他の方法に比べて、力価の向上、および／または三量体の百分率の増大および高分子質量種（ＨＭＭＳ）および／もしくは低分子質量種（ＬＭＭＳ）の百分率の低下、および／または宿主細胞タンパク質の量の減少がもたらされる。
本明細書で使用する用語「培地」、「細胞培養培地」、および「培養培地」とは、成長する哺乳動物細胞を養う栄養素を含有する溶液を指す。通常、そのような溶液は、細胞が最小限の成長および／または生存のために必要とする、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、および微量元素を賄う。一実施形態では、培地は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ならびにシスチンおよび／またはＣｙｓを含む場合がある。
このような溶液は、限定はしないが、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子、特定のイオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、リン酸など）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（普通は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物（たとえば、鉄）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースもしくは他のエネルギー源を始めとする、最小限の速度より高度に成長および／または生存を増進する補充成分も含有する場合がある。一部の実施形態では、細胞生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に培地を処方することが有利である。たとえば、培地は、概ね７．１～７．３の間のｐＨ、および概ね１０００ｍＯｓｍ～１３００ｍＯｓｍの間の最終重量オスモル濃度に処方される場合がある。
本発明の方法において使用することができる既知の基本および／または供給細胞培養培地の例としては、ＷＯ２００６／０２６４４５、ＷＯ２００８／１０９４１０、ＷＯ２００８／０６３８９２、ＥＰ２２４３８２７、ＷＯ２００２／０６６６０３、ＷＯ２０１５／１４０７０８、およびＷＯ２００６／０５００５０において開示されているものが挙げられる。
好ましい一実施形態では、本発明の方法において使用される供給培地は、４～１０ｍＭのＡｌａ、３０～６０ｍＭのＡｒｇ、５０～９０ｍＭのＡｓｎ、１０～３０ｍＭのＡｓｐ、２～４０ｍＭのＧｌｕ、２～１５ｍＭのＧｌｙ、８～２０ｍＭのＨｉｓ、２５～３２ｍＭのＩｌｅ、３５～６０ｍＭのＬｅｕ、２８～６０ｍＭのＬｙｓ、９～２５ｍＭのＭｅｔ、１０～３０ｍＭのＰｈｅ、１５～４０ｍＭのＰｒｏ、４４～８０ｍＭのＳｅｒ、２０～４５ｍＭのＴｈｒ、２～１０ｍＭのＴｒｐ、および２０～５０ｍＭのＶａｌを含む。
一部の実施形態では、培地は、培地の成分が既知であり、かつ制御される、化学的限定培地である。一部の実施形態では、培地は、培地の成分すべてが、既知であり、かつ／または制御されるとは限らない、複合培地である。
哺乳動物細胞培養のための化学的に限定された増殖培地は、ここ数十年にかけて、大々的に開発され、公表されている。限定培地の成分はすべて、十分に特徴付けられており、そのため、限定培地は、血清や加水分解物などの複雑な添加物を含有しない。早期の培地処方は、タンパク質生産についての懸念がほとんどまたはまったくない細胞増殖および生存度の維持を可能にするために開発された。より最近では、組換えタンパク質を生産する生産性の高い細胞培養を支えるという明確な目的で、培地処方が開発されている。そのような培地は、本発明の方法における使用に好ましい。そうした培地は、高密度での細胞の増殖および／または維持を支えるために、一般に、高度な量の栄養素、特にアミノ酸を含む。必要なら、本発明の方法において使用するために、こうした培地を当業者が改良してもよい。
複合培地の成分は、すべてが十分に特徴付けられているとは限らず、そのため、複合培地は、数ある中でも、単純および／または複雑な炭素供給源、単純および／または複雑な窒素供給源、血清などの、添加物を含有する場合がある。一部の実施形態では、本発明に適する複合培地は、本明細書に記載するとおりの限定培地の他の成分に加えて、加水分解物などの添加物を含有する。
一部の実施形態では、限定培地は、通常、水中に、既知の濃度の、おおよそ５０種の化学的存在物を含む。限定培地のあるものは、十分に特徴付けられた１種または複数のタンパク質、たとえば、インスリン、ＩＧＦ－１、トランスフェリン、ＢＳＡも含有するが、他のものは、タンパク質成分を必要とせず、そのため、無タンパク質限定培地と呼ばれる。培地の典型的な化学成分は、５つの広義のカテゴリー、すなわち、アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、および簡潔に分類しきれない種々雑多なカテゴリーに分けられる。
細胞培養培地は、場合により、補充成分で補充してもよい。本明細書で使用する用語「補充成分」とは、限定はしないが、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子、特定のイオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、リン酸など）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（普通は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースもしくは他のエネルギー源を始めとする、最小限の速度より高度に成長および／または生存を増進する成分を指す。一部の実施形態では、最初の細胞培養物に補充成分が加えられる場合がある。一部の実施形態では、細胞培養を開始した後に、補充成分が加えられる場合がある。
通常、微量元素とは、マイクロモル濃度以下のレベルで含まれる様々な無機塩を指す。たとえば、一般に含まれる微量元素は、亜鉛、セレン、銅などである。一部の実施形態では、鉄（第一鉄塩または第二鉄塩）を、マイクロモル濃度の濃度で、微量元素として、最初の細胞培養培地中に含めることができる。マンガンも、ナノモル濃度からマイクロモル濃度の濃度範囲で、二価カチオン（ＭｎＣｌ２またはＭｎＳＯ４）として、微量元素の中に含められることが多い。それほど一般的でない数多くの微量元素が、ナノモル濃度の濃度で加えられるのが普通である。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。
糖質コルチコイド化合物は、細胞増殖、代謝、グリコシル化、多くのタンパク質の分泌などの種々の細胞機能をモジュレートすることが知られており、したがって、特に、大規模製造工程において使用される細胞培養培地に含められることが多い。
細胞培養培地成分として使用される糖質コルチコイド化合物の例には、限定はしないが、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルが含まれる。
以下で実施例３に示すとおり、細胞培養培地中のヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイドの存在は、適正な形態のＲＳＶ Ｆタンパク質の量に好ましくない影響を及ぼす。何らかの理論に囚われるものではないが、この影響は、糖質コルチコイド化合物がＲＳＶ Ｆタンパク質のプロセシングを妨げる結果、回収材料中のプロセシングされていないＲＳＶタンパク質の量が増加するせいであるといえる。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する供給培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地および供給培地は、糖質コルチコイド化合物を含まない。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する供給培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地および供給培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾンのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾンのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する供給培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾンのいずれも含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地および供給培地は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾンのいずれも含まない。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する供給培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。一部の実施形態では、本発明の方法において使用する基本培地および供給培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する培地は、細胞培養において、たとえば、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬ、５×１０８細胞／ｍＬなどの、高い生細胞密度を支えるのに適する培地である。一部の実施形態では、細胞培養は、ＣＨＯ細胞流加培養法である。一部の実施形態では、細胞は、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬ、または５×１０８細胞／ｍＬより高い生細胞密度に増殖する。
本明細書で使用する用語「生細胞密度」とは、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を指す。生細胞密度は、当業者に知られているいずれの方法によって測定してもよい。Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ（登録商標）などの自動細胞カウンターを使用して生細胞密度を測定することが好ましい。本明細書で使用する、最大細胞密度という用語は、細胞培養の間に実現される最大の細胞密度を指す。本明細書で使用する用語「細胞生存度」とは、培養物中の細胞が、所与の一式の培養条件または実験バリエーションのもとで生存しうる能力を指す。細胞生存度を求めるための多くの方法の１つが本発明に含まれることは、当業者の理解するところとなる。たとえば、細胞生存度を求めるために、生きている細胞の膜を通過しないが、死んだまたは死にゆく細胞の崩壊した膜は通過しうる色素（たとえば、トリパンブルー）が使用される場合がある。
細胞培養法
本明細書で使用する用語「培養物」および「細胞培養物」とは、細胞集団の生存および／または成長に適する条件下にある培地中に懸濁されている細胞集団を指す。当業者には明白となるように、一部の実施形態では、本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団と、細胞集団が懸濁している培地の組合せを指す。
本明細書で使用する用語「培養物」および「細胞培養物」とは、細胞集団の生存および／または成長に適する条件下にある培地中に懸濁されている細胞集団を指す。当業者には明白となるように、一部の実施形態では、本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団と、細胞集団が懸濁している培地の組合せを指す。
本明細書で使用する用語「流加培養法」または「流加細胞培養法」とは、培養工程を始める時点またはその後の諸時点で、培養物に追加成分が提供される、細胞の培養方法を指す。そうした、提供される成分は、通常、培養工程の間に枯渇してしまった、細胞のための栄養成分を含む。流加培養法は、通常、ある時点で中断され、培地中の細胞および／または成分が回収され、場合により精製される。一部の実施形態では、流加培養物は、供給培地で補充された基本培地を含む。
細胞は、実施者が選択した好都合ないずれの体積で増殖させてもよい。たとえば、体積が２～３ミリリットルから数リットルの範囲にある小規模反応槽において細胞を増殖させる場合がある。別法として、体積が、少なくとも５００から、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５０００、２００００、２５０００リットルもしくはより大規模、または間にあるいずれかの体積の範囲にある、工業用の大規模バイオリアクターにおいて細胞を増殖させる場合もある。一部の実施形態では、細胞培養物の体積は、少なくとも５００Ｌである。一部の実施形態では、細胞培養物の体積は、少なくとも３０００Ｌである。
一部の実施形態では、細胞は、最初の増殖段階（または増殖段階）の間、実施者の要望および細胞それ自体の要件に応じて、より長いまたはより短い時間をかけて、増殖させることができる。一部の実施形態では、予め定めた細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を増殖させる。一部の実施形態では、約１×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０７細胞／ｍＬ、約５×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０８細胞／ｍＬ、または約５×１０８細胞／ｍＬという予め定めた細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を増殖させる。一部の実施形態では、細胞が妨害されずに増殖することが許されれば最終的に到達することになる最大細胞密度の所与の百分率である細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を増殖させる。たとえば、最大細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセントの所望の生細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を増殖させる場合がある。一部の実施形態では、細胞密度が１培養日あたり１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％を超えて増大しなくなるまで、細胞を増殖させる。一部の実施形態では、細胞密度が１培養日あたり５％を超えて増大しなくなるまで、細胞を増殖させる。
一部の実施形態では、細胞は、規定された期間にかけて増殖させることが可能になる。たとえば、細胞培養物の出発濃度および細胞固有の増殖速度に応じて、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日、またはより多い日数をかけて、好ましくは、４～１０日間、細胞を増殖させる場合がある。本発明の実施者は、タンパク質生産要件および細胞それ自体の要求に応じて、最初の増殖段階の継続期間を選択することができる。
細胞への酸素供給および栄養素の分散を増進するために、細胞培養物は、最初の培養段階の間、撹拌または振盪される場合がある。本発明によれば、限定はしないが、ｐＨ、温度、酸素供給などを始めとする、バイオリアクターのある特定の内部条件を、最初の増殖段階の間に制御または調節することが有益となりうることは、当業者に理解される。
本発明によれば、細胞を培養する温度が、温度設定点であり、細胞培養の間、設定点前後における温度変動が限定されるように制御されることは、当業者に理解される。
本発明の方法では、より低い温度への温度移行を使用することができる。このような場合では、より低い温度設定点が定められ、温度がより低い設定点に達してしまった後は、前記のより低い設定点前後における温度変動が制限されるように温度が制御されるものであると、当業者には理解される。培養物の温度を移行させるとき、温度移行は、比較的段階的でよい。たとえば、温度変更を完了するのに、数時間または数日かかる場合がある。別法として、温度移行は、比較的急峻でもよい。たとえば、温度変更は、数時間未満で完了する場合がある。ポリペプチドまたはタンパク質の大規模工業生産において標準的であるような、適切な生産および制御設備を考えると、温度変更は、１時間未満のうちに完了する場合さえある。
一部の実施形態では、細胞培養の条件を上で論じたとおりに移行させたなら、後続の生産段階の間、細胞培養物の生存および生存度のためになり、所望のポリペプチドまたはタンパク質の工業的に妥当なレベルでの発現に相応しい条件下で、細胞培養物が維持される。一部の実施形態では、細胞は、所望の細胞密度または生産力価に達するまで、後続の生産段階において維持される場合がある。一部の実施形態では、生産段階の継続期間は、２日～１０日の間、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日、好ましくは、４日～８日の間、好ましくは、６日からなる。
一部の実施形態では、増殖段階の継続期間は、約６日であり、生産段階の継続期間は、約６日である。
細胞への酸素供給および栄養素の分散を増進するために、細胞培養物は、後続の生産段階の間、撹拌または振盪される場合がある。本発明によれば、限定はしないが、ｐＨ、温度、酸素供給などを始めとする、バイオリアクターのある特定の内部条件を、後続の生産段階の間に制御または調節することが有益となりうることは、当業者に理解される。
細胞
細胞培養が可能であるいずれの哺乳動物細胞も、本発明に従って利用することができる。本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、オランダ国ライデン）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児由来腎臓系（２９３細胞または懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３～２５１、１９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４～６８、１９８２）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒトヘパトーマ系（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。好ましい実施形態の一部において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。好ましい実施形態の一部において、細胞は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞である。
細胞培養が可能であるいずれの哺乳動物細胞も、本発明に従って利用することができる。本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、オランダ国ライデン）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児由来腎臓系（２９３細胞または懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３～２５１、１９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４～６８、１９８２）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒトヘパトーマ系（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。好ましい実施形態の一部において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。好ましい実施形態の一部において、細胞は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞である。
タンパク質の発現
上で指摘したとおり、多くの例において、細胞は、所望の産物を高レベルで産生するように選択または操作される。多くの場合、細胞は、組換えタンパク質を高レベルで産生するように、人間の手によって、たとえば、目的のタンパク質をコードする遺伝子の導入、および／または（内在性もしくは導入のいずれであろうと）その遺伝子の発現を調節する遺伝子制御エレメントの導入により、操作される。
上で指摘したとおり、多くの例において、細胞は、所望の産物を高レベルで産生するように選択または操作される。多くの場合、細胞は、組換えタンパク質を高レベルで産生するように、人間の手によって、たとえば、目的のタンパク質をコードする遺伝子の導入、および／または（内在性もしくは導入のいずれであろうと）その遺伝子の発現を調節する遺伝子制御エレメントの導入により、操作される。
ある決まったタンパク質を発現するように操作された特定の１タイプの細胞の集団の中でさえ、細胞集団内での変動性が存在するため、個々のある特定の細胞が、より良好に増殖し、より多くの目的タンパク質を産生する。ある特定の実施形態では、細胞を培養するために選択された特定の条件下で力強く増殖する細胞株が、実施者によって経験的に選択される。一部の実施形態では、特定のタンパク質を発現するように操作された個々の細胞が、細胞増殖、最終細胞密度、細胞生存度パーセント、発現されたタンパク質の力価、もしくはこれらのいずれかの組合せ、または実施者が重要と考える他のいずれかの条件に基づき、大規模生産向けに選択される。
本明細書で使用する用語「宿主細胞」とは、本明細書に記載するような目的のタンパク質を産生するように操作されている細胞を指す。タンパク質は、細胞にとって内在性である遺伝子から、または細胞に導入されている異種遺伝子から、発現される場合がある。タンパク質は、自然界に存在するものでもよいし、または、別法として、人間の手によって操作もしくは選択された配列を含んでいてもよい。
発現されたタンパク質の単離
一般に、本発明に従って発現させたタンパク質は、単離および／または精製することが通常は望ましい。ある特定の実施形態では、発現されたタンパク質は、培地中に分泌され、したがって、精製工程における最初のステップとして、たとえば、遠心分離や濾過によって、細胞および他の個体が除去される場合がある。
一般に、本発明に従って発現させたタンパク質は、単離および／または精製することが通常は望ましい。ある特定の実施形態では、発現されたタンパク質は、培地中に分泌され、したがって、精製工程における最初のステップとして、たとえば、遠心分離や濾過によって、細胞および他の個体が除去される場合がある。
発現されたタンパク質は、限定はしないが、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、もしくは較差溶解度、エタノール沈殿を始めとする標準の方法によって、ならびに／またはタンパク質精製のための他の利用可能ないずれかの技術によって単離および精製することができる（たとえば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（共編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ Ｐｒｅｓｓ、１９９９；ならびにＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（共編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１８２巻）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい）。特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーについては、タンパク質を、そのタンパク質に対して活性化させ、固定支持体に付着させた抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることにより、単離することができる。別法として、インフルエンザ外被配列、ポリヒスチジン、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼなどのアフィニティータグを、標準の組換え技術によってタンパク質に取り付けると、適切なアフィニティーカラムに通すことによる、容易な精製を可能にすることもできる。精製工程の間のタンパク質の分解を低減または排除するために、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤を、いずれかまたはすべての段階で加えてもよい。プロテアーゼ阻害剤は、発現されたタンパク質を単離および精製するために細胞を溶解させなければならないとき、特に便利である。
厳密な精製技術は、精製されるタンパク質の特徴、タンパク質の発現元である細胞の特徴、および／または細胞を増殖させた培地の組成に応じて様々となることは、当業者に理解される。
タンパク質発現のための遺伝子の宿主細胞への導入
一般に、細胞に導入された核酸分子は、本開示に従って発現させることが所望されるタンパク質をコードする。
一般に、細胞に導入された核酸分子は、本開示に従って発現させることが所望されるタンパク質をコードする。
目的のタンパク質の発現の実現に十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するのに適する方法は、当業界で知られている。たとえば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０～６２５、１９８１；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０～４６、１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ１１７，０６０およびＥＰ１１７，０５８を参照されたい。哺乳動物細胞について、遺伝物質を哺乳動物細胞に導入する一般的な方法としては、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６～４５７、１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法またはＨａｗｌｅｙ－Ｎｅｌｓｏｎ（Ｆｏｃｕｓ １５：７３、１９９３）のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）法が挙げられる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的側面は、１９８３年８月１６日に発行されたＡｘｅｌによる米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。遺伝物質を哺乳動物細胞に導入するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９；Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７～５３７、１９９０：およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８～３５２、１９８８を参照されたい。
一部の実施形態では、導入される核酸は、裸の核酸分子の形である。たとえば、細胞に導入された核酸分子は、タンパク質および必要な遺伝子制御エレメントをコードする核酸だけからなる場合がある。別法として、タンパク質（必要な調節エレメントを含む）をコードする核酸が、プラスミドベクター内に含まれている場合もある。哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に適するベクターの非限定的な代表例としては、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６～１１４２、１９８５を参照されたい）、ｐＭＣｌｎｅｏ Ｐｏｌｙ－Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３～５１２、１９８７を参照されたい）、ｐＡＣ３７３やｐＡＣ６１０などのバキュロウイルスベクター、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０、１９８７を参照されたい）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７～１９５、１９８７を参照されたい）が挙げられ、これら文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、細胞に導入される核酸分子は、ウイルスベクター内に含まれている。たとえば、タンパク質をコードする核酸が、ウイルスゲノム（または部分的なウイルスゲノム）に挿入される場合がある。タンパク質の発現を導く調節エレメントは、ウイルスゲノムに挿入された核酸と共に含まれる（すなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結されている）場合もあり、またはウイルスゲノムそれ自体によって提供される場合もある。
裸のＤＮＡは、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含有する沈殿を生成することにより、細胞に導入することができる。別法として、ＤＮＡとＤＥＡＥ－デキストランの混合物を生成し、混合物を細胞と共にインキュベートする、または細胞とＤＮＡを適切な緩衝液中で一緒にインキュベートし、細胞を（たとえば、電気穿孔法によって）高電圧電気パルスに曝すことにより、裸のＤＮＡを細胞に導入することもできる。裸のＤＮＡを細胞に導入するさらなる方法は、ＤＮＡを、カチオン脂質を含有するリポソーム懸濁液と混合することによるものである。ＤＮＡ／リポソーム複合体は、次いで、細胞と共にインキュベートされる。裸のＤＮＡは、たとえば、マイクロインジェクションによって、細胞に直接注入することもできる。
別法として、ＤＮＡを、細胞表面受容体のリガンドに結合させてあるポリリシンなどのカチオンと複合体形成させることにより、裸のＤＮＡを細胞に導入することもできる（たとえば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１、１９８８；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３～９６７、１９９２；および米国特許第５，１６６，３２０号を参照されたい）。ＤＮＡ－リガンド複合体が受容体に結合することで、受容体仲介エンドサイトーシスによるＤＮＡの取込みが促進される。
特定の核酸配列、たとえば、タンパク質をコードするｃＤＮＡを含んでいるウイルスベクターの使用は、核酸配列を細胞に導入するための一般的な手法である。ウイルスベクターによる細胞の感染には、細胞の大部分が核酸を受け取るという利点があり、これにより、核酸を受け取った細胞を選択する必要をなくすことができる。加えて、たとえば、ウイルスベクターに収められたｃＤＮＡによって、ウイルスベクター内にコードされている分子は、ウイルスベクター核酸が積み込まれている細胞において、一般に効率よく発現される。
欠陥レトロウイルスは、遺伝子治療目的での遺伝子移入における使用のために、十分に特徴付けられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、１９９０を参照されたい）。目的のタンパク質をコードする核酸がレトロウイルスゲノムに挿入されている、組換えレトロウイルスを構築することができる。加えて、レトロウイルスゲノムの諸部分を除去して、レトロウイルス複製に欠陥を付与することができる。このような複製欠陥レトロウイルスは、次いで、標準技術によって、ヘルパーウイルスを使用して、標的細胞の感染に使用することができるビリオンに詰め込まれる。
アデノウイルスのゲノムは、目的のタンパク質をコードし、発現するが、正常な溶解ウイルス生活環におけるその複製能に関しては不活性化されるように操作することができる。たとえば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１～４３４、１９９１；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４３～１５５、１９９２を参照されたい。アデノウイルスＡｄ株５型ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（たとえば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適切なアデノウイルスベクターが、当業者に知られている。組換えアデノウイルスは、有効な遺伝子送達媒体となるために、分裂している細胞を必要とせず、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、前掲）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６４８２～６４８６、１９９２）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８１２～２８１６、１９９３）、および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２５８１～２５８４、１９９２）を始めとする、多種多様な細胞型の感染に使用することができるという点で有利である。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれている外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれないが、エピソームのままとなり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれていく状況（たとえば、レトロウイルスＤＮＡ）において挿入突然変異誘発の結果として生じうる、潜在的な問題が回避される。そのうえ、アデノウイルスゲノムが外来ＤＮＡを運搬する能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前掲；Ｈａｊ－ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７、１９８６）。現在使用されているほとんどの複製欠陥アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％程度を保持している。
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および生産的な生活環のために、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどの別のウイルスをヘルパーウイルスとして必要とする、自然界に存在する欠陥ウイルスである（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７～１２９、１９９２を参照されたい）。このウイルスは、そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込むことができ、高頻度で安定した組み込みを示す、数少ないウイルスの１つでもある（たとえば、Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９～３５６、１９９２；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８、１９８９；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３～１９７３、１９８９を参照されたい）。ＡＡＶのわずか３００塩基対程度を含んでいるベクターを詰め込むことができ、組み込むことができる。外因性ＤＮＡのための空間は、約４．５ｋｂに限定される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１～３２６０、１９８５）に記載されているものなどのＡＡＶベクターを使用して、ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＡＡＶベクターを使用して、様々な核酸が、異なる細胞型に導入されている（たとえば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６～６４７０、１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２～２０８１、１９８５；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２～３９、１９８８；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１～６１９、１９８４；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１～３７９０、１９９３を参照されたい）。
細胞集団への核酸分子の導入に使用した方法の結果として、大部分の細胞が改変され、細胞によってタンパク質が効率よく発現されるとき、改変された細胞集団を、集団内の個々の細胞のさらなる隔離またはサブクローニングなしで使用することができる。すなわち、細胞集団によってタンパク質が効率よく産生されうるため、細胞のさらなる隔離が必要なく、タンパク質生産のための細胞培養物への播種に、集団を直ちに使用することができる。別法として、タンパク質を効率よく産生する数個の細胞または単一細胞からの均一な集団を隔離し、増殖させることが望ましい場合もある。
場合により、目的のタンパク質をコードする遺伝子を、１つまたは複数の調節性遺伝子制御エレメントに連結させてもよい。ある特定の実施形態では、遺伝子制御エレメントによって、タンパク質の構成的発現が導かれる。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする遺伝子の誘導発現をもたらす遺伝子制御エレメントを使用することができる。誘導性の遺伝子制御エレメント（たとえば、誘導性プロモーター）を使用すると、細胞におけるタンパク質の産生のモジュレーションが可能になる。真核細胞において使用される潜在的に有用な誘導性遺伝子制御エレメントの非限定的な例として、ホルモンによって調節されるエレメント（たとえば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３～５６０７、１９９３を参照されたい）、合成リガンドによって調節されるエレメント（たとえば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９～１０２４、１９９３を参照されたい）、および電離放射線によって調節されるエレメント（たとえば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０６０７～１０６１３、１９９３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０１４９～１０１５３、１９９２を参照されたい）が挙げられる。その他の当業界で知られている細胞特異的または他の調節系も、本発明に従って使用することができる。
当業者なら、本発明の教示に従い、細胞に目的のタンパク質を発現させる遺伝子を導入する方法を選択し、場合により適切に改良することができる。
免疫原性組成物
本明細書で開示する方法によって生産されるサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質は、ワクチンとして使用される免疫原性組成物中に含めることができる。
本明細書で開示する方法によって生産されるサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質は、ワクチンとして使用される免疫原性組成物中に含めることができる。
ワクチンは、免疫原性成分に加えて、アジュバントなどの免疫調節薬をさらに含む場合がある。適切なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；ＭＦ５９などのスクアレン－水乳濁液を始めとする、油乳濁液組成物（または水中油型組成物）（たとえば、ＷＯ９０／１４８３７を参照されたい）；たとえばＱＳ２１や免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などのサポニン製剤（たとえば、米国特許第５，０５７，５４０号、ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ２００４／００４７６２、ＷＯ２００５／００２６２０を参照されたい）；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフを含んでいるオリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボシル化細菌毒素またはその突然変異体、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどを例とする、細菌または微生物派生体が挙げられる。Ｃ４結合性タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインの、目的の抗原との融合物をコードする異種核酸を使用することにより、ベクターによってコードされるアジュバントを使用することも可能である（たとえば、Ｓｏｌａｂｏｍｉら、２００８、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７６：３８１７～２３）。ある特定の実施形態では、本明細書の組成物は、アジュバントとしてのアルミニウムを、たとえば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム、またはこれらの組合せの形で、１用量あたりのアルミニウム含有量が０．０５～５ｍｇ、たとえば、０．０７５～１．０ｍｇという濃度で含む。
サブタイプＡ（以下ではＲＳＶ Ｆ（Ａ））またはサブタイプＢ（以下ではＲＳＶ Ｆ（Ｂ））のＲＳＶ Ｆタンパク質を組換え発現するＧＳ－ＣＨＯクローンを、１２０または１４０ｒｐｍ振盪インキュベーターにおいて、３６．５℃、５％ＣＯ２で維持した。培養物を、それぞれ、０．３５×１０６細胞／ｍＬまたは０．２０×１０６細胞／ｍＬで播種して、シード増殖の間、３日または４日間継代した。すべての実験についてのＮ－１シード培養を、２ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）バイオリアクターにおいて、１Ｌの作業体積で実施し、栄養素含有率の高い培地において、０．７０×１０６細胞／ｍＬで４日間継代した。
ＢｉｏＮｅｔ（登録商標）コントローラーを備えた２ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）バイオリアクターにおいて、以下ではＨｉＰＤＯＧ工程と呼ぶグルコース制限流加工程を使用して、生産実験を行った（Ｇａｇｎｏｎら（２０１１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０８：１３２８～１３３７）。詳細な方法およびパラメーターは、後続の実験の部において示す。
回収当日に、細胞培養ブロスを、遠心分離およびデプス濾過によって清澄化する。下流での加工は、結合および溶出モードで操作される陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムである捕捉クロマトグラフィーステップの前に、交換材料を濃縮および緩衝処理するための限外濾過およびダイアフィルトレーション１（ＵＦ／ＤＦ１）を含む。ポリッシングカラムには、フロースルーモードのセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＣＨＡ）、および結合および溶出モードの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムが含まれる。下流の工程は、ウイルス保持する濾過ステップ、限外濾過およびダイアフィルトレーション２（ＵＦ／ＤＦ２）、ならびに最終濾過ステップで終結する。
以下の実験では、力価、三量体、高分子質量種（ＨＭＭＳ）、低分子質量種（ＬＭＭＳ）、および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が報告される。
力価は、当業界で知られているいずれの方法によって求めてもよい。以下の実験において、力価は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって測定した。逆相クロマトグラフィーは、極性に基づいて分子を分離する。サブタイプＡまたはＢのＲＳＶ Ｆタンパク質を含めて、比較的非極性である分子は、カラムに結合するが、極性分子は、結合せずにカラムを通過する。結合した分子は、極性条件から極性のより弱い条件へと進む移動相勾配の適用によって、カラムから溶出される。分子は、極性の強いものから弱いものの順に溶出される。検出は、２２０ｎｍでの紫外（ＵＶ）吸収を使用して行う。力価決定は、サンプルピーク面積を検量線標準のものと比較することで実現される。
三量体、ＨＭＭＳ、およびＬＭＭＳは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって測定した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣは、当業者に知られている分析方法であり、本発明の方法によって取得したサブタイプＡまたはＢ ＲＳＶ Ｆタンパク質サンプル中の高分子質量種（ＨＭＭＳ）、三量体、および低分子質量種（ＬＭＭＳ）の相対的含有量を求めるのに使用される。ＳＥＣ－ＨＰＬＣは、分子を、その流体力学的体積によって分離する。分析物がカラムベッドの上部にアプライされると、充填材料の孔より小さい分子は、孔の中および外へと拡散しうるが、より大きい分子は、孔に入らない。結果として、大きい分子ほど速やかに、小さい分子ほどゆっくりと、カラムを通過する。分子種は、溶出されると、２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出される。低分子質量種（ＬＭＭＳ）とは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定したとき、見かけの分子質量が三量体より小さいすべての分子種に使用される用語である。こうした分子種は、三量体ピークの後に溶出される。高分子質量種（ＨＭＭＳ）とは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定したとき、見かけの分子質量が三量体より大きいすべてのピークに使用される用語である。こうした分子種は、三量体ピークの前に溶出され、凝集塊を含みうる。
ＨＣＰは、残存するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡ分析を使用して測定する定量アッセイである、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。ＨＣＰアッセイにおける主要なステップについては、以下で概略を述べる。
高度に富化されたＣＨＯ ＨＣＰ材料から、一式の標準サンプルを調製する。標準サンプルは、ＣＨＯ ＨＣＰの濃度が２ｎｇ／ｍＬ～２５６ｎｇ／ｍＬの範囲にある。試験サンプルを、４つの、サブタイプＡまたはＢ ＲＳＶタンパク質Ｆ濃度に希釈する。最後に、各アッセイプレートにおいて、対照サンプルを試験する。アッセイプレートを、高度に富化されたＣＨＯ ＨＣＰ調製物に対して活性化させたポリクローナル抗体（抗ＣＨＯ ＨＣＰＰ ｐＡｂｓ）でコートする。コートし終えた後、プレートをブロッキングして、分析物および試薬の非特異的結合を最小限に抑える。ブロッキングした後、標準物質、試験サンプル、および対照サンプルをアッセイプレートに加え、インキュベートして、こうしたサンプル中のＨＣＰが抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体によって捕捉されるようにする。次いで、プレートを洗浄して、結合していないタンパク質を除去し、ＨＣＰ－抗体複合体を残す。各ウェルにおける結合したＨＣＰの量を定量化するために、ビオチンにコンジュゲートさせた抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体の調製物をアッセイプレートに加え、捕捉されたＨＣＰに結合するようにする。プレートを洗浄して、結合していないビオチン標識抗体を除去し、ビオチン－抗ＣＨＯ ＨＣＰコンジュゲートに結合するストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを加える。プレートを洗浄して、結合していないストレプトアビジン－ＨＲＰを除去し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の溶液をアッセイプレートに加える。ＴＭＢは、ＨＲＰの存在下で青い色を生じる基質である。アッセイプレートを、ＴＭＢ試薬と共に一定期間インキュベートして、ウェルのそれぞれにおいて適切なシグナルを生じさせ、硫酸を加えることにより、ペルオキシダーゼ反応を失活させる。最後に、適切なプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで、各ウェルにおける吸光度を測定し、記録する。生じたシグナルは、アッセイプレートにおいて捕捉されたＨＣＰの量に比例する。標準サンプルウェルにおけるシグナルを、標準ＨＣＰ濃度に対してプロットする。プロットを、４パラメーターロジスティック（４ＰＬ）フィットに適合させて、ＨＣＰ検量線を作成する。次いで、試験サンプルおよび外部対照サンプルにおけるシグナルを使用して、吸光度シグナルを標準４ＰＬ関数の仮の線形部分に内挿することにより、これらのサンプル中のＨＣＰ含有量を求める。
全体としての生産性および下流での濾過性の観点から、工程は、力価および三量体が局限まで増加し、ＨＭＭＳ、ＬＭＭＳ、およびＨＣＰが最小限に抑えられるとき、最も至適である。ＲＰ－ＨＰＬＣ力価からは、凝集塊および三量体型でないＲＳＶタンパク質を含む、サンプル中に存在するＲＳＶタンパク質の総量が推し量られる。ＳＥＣによって測定される三量体からは、三量体型のＲＳＶ分子がおおよそどれだけ存在するのかが、（いくらかの工程不純物を含む）存在するタンパク質の総量に対する百分率として推定される。増殖温度などの工程パラメーターを操作することで、力価にマイナスの影響を及ぼしながらも、三量体を増加させることができる（または逆も同様である）。力価と三量体両方に対する全体としての影響を示すために、三量体に力価を掛けることにより算出される「三量体力価」を報告する。三量体力価によって、どれだけのタンパク質が三量体型として生産されるかが推定される。
（実施例１）
ＣＨＯ細胞におけるＲＳＶ Ｆタンパク質生産に対する温度の影響
この一式の実験は、移行前および後の温度ならびに移行のタイミングが、ＣＨＯ細胞によるサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質生産の際の力価および三量体生成に及ぼす影響を評価するように設計された。
ＣＨＯ細胞におけるＲＳＶ Ｆタンパク質生産に対する温度の影響
この一式の実験は、移行前および後の温度ならびに移行のタイミングが、ＣＨＯ細胞によるサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質生産の際の力価および三量体生成に及ぼす影響を評価するように設計された。
ＢｉｏＮｅｔ（登録商標）コントローラーを備えた２ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）バイオリアクターにおいて、表１に詳述する条件を使用して、生産実験を行った。条件はすべて、細胞に提供されるグルコースの量が制限される段階（ＲＳＶ Ｆ（Ａ）についてはＨｉｐＤＯＧ ０日目～５日目、ＲＳＶ Ｆ（Ｂ）については０日目～４日目）を含み、ヒドロコルチゾンなしの細胞培養培地を使用する流加工程に課された。
１．１ 増殖温度の影響
この実験では、細胞を、３３℃、３４．５℃、または３６℃の温度で増殖させて、増殖温度が、力価、三量体の百分率、ＨＭＭＳ、ＬＭＭＳ、三量体力価、および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量に及ぼす影響を評価した。結果を、表２、ならびに図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、および４Ｂに示す。
この実験では、細胞を、３３℃、３４．５℃、または３６℃の温度で増殖させて、増殖温度が、力価、三量体の百分率、ＨＭＭＳ、ＬＭＭＳ、三量体力価、および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量に及ぼす影響を評価した。結果を、表２、ならびに図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、および４Ｂに示す。
両方の抗原について、増殖温度は、三量体の百分率とは負に相関し、ＨＭＭＳおよびＬＭＭＳの百分率とは正に相関した（図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。３４．５℃の温度で、最も高い力価が一貫して得られた（図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。３４℃～３５℃の間の増殖温度、好ましくは、３４．５℃が、三量体、力価を局限まで増大させ、不純物を最小限に抑えるのに適する。両方の抗原について、ＨＣＰレベルは、温度と正に相関した（図３Ａおよび３Ｂを参照されたい）。サブタイプＢについては、３４．５℃の温度で、最も高い三量体力価が得られ、サブタイプＡについては、３３℃および３４．５℃での三量体力価が、３６℃より高かった（図４Ａおよび４Ｂを参照されたい）。
１．２ 生産温度の影響
この実験では、増殖温度を３４．５℃とし、生産温度を様々にして（２８．５℃、３１℃、または３４℃）、生産温度が、力価、三量体の百分率、ＨＭＭＳ、ＬＭＭＳ、三量体力価、およびＨＣＰの量に及ぼす影響を評価した。結果を、表３、ならびに図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、８Ａ、および８Ｂに示す。
この実験では、増殖温度を３４．５℃とし、生産温度を様々にして（２８．５℃、３１℃、または３４℃）、生産温度が、力価、三量体の百分率、ＨＭＭＳ、ＬＭＭＳ、三量体力価、およびＨＣＰの量に及ぼす影響を評価した。結果を、表３、ならびに図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、８Ａ、および８Ｂに示す。
（温度移行後の）生産温度は、両方の抗原について、三量体との負の線形相関、ならびにＬＭＭＳおよびＨＭＭＳとの正の線形相関を示した（図５Ａおよび５Ｂを参照されたい）。最も低いＨＣＰレベルおよび最も高い三量体力価レベルが、３１℃の生産温度で得られた（図７Ａおよび７Ｂ、８Ａおよび８Ｂを参照されたい）。
１．３ 温度移行のタイミングの影響
この実験では、温度移行のタイミングを様々にして、力価、三量体の百分率、ＨＭＭＳ、ＬＭＭＳ、三量体力価、およびＨＣＰの量に対するその影響を評価した。結果を、表４、ならびに図９Ａ、９Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、および１２Ｂに示す。
この実験では、温度移行のタイミングを様々にして、力価、三量体の百分率、ＨＭＭＳ、ＬＭＭＳ、三量体力価、およびＨＣＰの量に対するその影響を評価した。結果を、表４、ならびに図９Ａ、９Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、および１２Ｂに示す。
培養開始後１４４時間の時点での温度移行によって、三量体の量、力価、およびＨＣＰのレベルが、異なる培養継続期間での移行に比べて改善された。これは、培養開始後１８５．５時間の時点における温度移行で最高となった、ＲＳＶ Ｆ（Ｂ）についての三量体は別として、両方の抗原およびすべての属性に当てはまる。ＲＳＶ Ｆ（Ａ）については、１４４時間の温度移行で最も高い三量体力価が得られた。ＲＳＶ Ｆ（Ｂ）についての三量体力価レベルは、１４４時間と１１４時間の時点で同様であり、どちらも、１８５．５時間の時点より低かった。
（実施例２）
ＣＨＯ細胞におけるＲＳＶ Ｆタンパク質生産に対する温度移行の影響
この実験は、温度移行の存在が、ＣＨＯ細胞によるサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質生産の際の工程性能、力価、および三量体生成に及ぼす影響を評価するように設計された。
ＣＨＯ細胞におけるＲＳＶ Ｆタンパク質生産に対する温度移行の影響
この実験は、温度移行の存在が、ＣＨＯ細胞によるサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質生産の際の工程性能、力価、および三量体生成に及ぼす影響を評価するように設計された。
ＢｉｏＮｅｔ（登録商標）コントローラーを備えた２ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）バイオリアクターにおいて、表５に詳述する条件を使用して、生産実験を行った。条件はすべて、細胞に提供されるグルコースの量が制限される段階（ＲＳＶ Ｆ（Ａ）についてはＨｉｐＤＯＧ ０日目～５日目、ＲＳＶ Ｆ（Ｂ）については０日目～４日目）を含み、ヒドロコルチゾンなしの細胞培養培地を使用する流加工程に課された。
結果を、表６および７、ならびに図１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、および１５Ｃに示す。
温度移行の存在によって、両方の抗原について、三量体レベルが増大し、ＨＣＰが減少し、力価が増大した（図１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、および１５Ｂを参照されたい）。
（実施例３）
ＣＨＯ細胞におけるＲＳＶ Ｆタンパク質生産に対する糖質コルチコイド化合物の影響
この実験は、ヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイド化合物が、ＣＨＯ細胞において生産されたサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質の力価および製品品質に及ぼす影響を理解するために設計された。
ＣＨＯ細胞におけるＲＳＶ Ｆタンパク質生産に対する糖質コルチコイド化合物の影響
この実験は、ヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイド化合物が、ＣＨＯ細胞において生産されたサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質の力価および製品品質に及ぼす影響を理解するために設計された。
ＢｉｏＮｅｔ（登録商標）コントローラーを備えた２ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）バイオリアクターにおいて、ヒドロコルチゾンを含むまたは含まない細胞培養培地で表８に詳述する工程を使用して、生産実験を行った。
バイオリアクターはすべて、３４．５℃で運転させ、３１℃への温度移行を、６日目のバイオリアクター（Ｂ０８）で行った。ＲＳＶ Ｆ（Ｂ）については０日目～４日目、ＲＳＶ Ｆ（Ａ）については０日目～５日目に、制限された形でグルコースを提供した（Ｈｉｐｄｏｇ）。
ヒドロコルチゾンは、図１６および１７に示すウエスタンブロット結果によって示唆されるとおり、ＲＳＶ Ｆタンパク質のフューリンプロセシングにマイナスの影響を及ぼした。ウエスタンブロットによって、プロセシングを受けたＲＳＶ Ｆ（Ａ）またはＲＳＶ Ｆ（Ｂ）単量体および関連種をモニターすることが可能になる。融合前Ｆ三量体は、ｍＡｂであるＡＭ１４によって特異的に認識される（Ｇｉｌｍａｎ ＭＳら、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、１１（７）、２０１５）。用語「ＡＭ１４」とは、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する、ＷＯ２００８／１４７１９６Ａ２に記載されている抗体を指す。結果を収集して、工程能力、およびプロセシングを受けたＲＳＶ Ｆ（Ａ）またはＲＳＶ Ｆ（Ｂ）単量体、部分的にプロセシングを受けたまたはプロセシングを受けていないＦ＋ｐ２７または他のサイズの変異体のレベルをモニターする。ヒドロコルチゾンを含有した条件のレーン（図１６におけるＢ－０７、Ｂ－０４、Ｂ－０３、およびＡ－０１、ならびにＡ－０４、Ａ－０５、Ｂ－０３、Ｂ－０７）は、ＡＭ－１４抗体の結合によって確認されるＲＳＶバンド（およそ６０ｋＤａ）のすぐ上にスミアを示す。スミアの存在は、部分的にプロセシングを受けたＲＳＶ変異体を示すものである。
したがって、ワクチン組成物中に、特に三量体の形で使用するのに適する、プロセシングを受けた材料の量を向上させるためには、本発明の方法において使用される細胞培養培地に、ヒドロコルチゾンまたは他の関連した糖質コルチコイド化合物を含めないことが有利である。
（実施例４）
ＣＨＯ細胞におけるＲＳＶ Ｆ産生に対するＨｉＰＤＯＧの影響
融合後高次構造は、エネルギー的に優先され、免疫原性がより弱く、融合前から融合後への移り変わりは不可逆的であるため、ＲＳＶタンパク質にとって、融合前高次構造の安定化は重要である。サブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前高次構造の状態にあるタンパク質を安定化するように操作することができ、ジスルフィド結合が、この安定性に寄与する。したがって、ジスルフィド結合が完全であるかが、所望の高次構造の安定性に影響しうる。ＲＳＶにおけるサブユニット内ジスルフィド結合は、初期段階の流加工程において、わずかに不対となることがわかった。対応する２つの不対システインは、システイニル部分で修飾されていることがわかった。この修飾を測定し、ＱＤａ質量検出器とつなげたアミノ酸分析によって測定される「システイニル化」として報告する。
ＣＨＯ細胞におけるＲＳＶ Ｆ産生に対するＨｉＰＤＯＧの影響
融合後高次構造は、エネルギー的に優先され、免疫原性がより弱く、融合前から融合後への移り変わりは不可逆的であるため、ＲＳＶタンパク質にとって、融合前高次構造の安定化は重要である。サブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前高次構造の状態にあるタンパク質を安定化するように操作することができ、ジスルフィド結合が、この安定性に寄与する。したがって、ジスルフィド結合が完全であるかが、所望の高次構造の安定性に影響しうる。ＲＳＶにおけるサブユニット内ジスルフィド結合は、初期段階の流加工程において、わずかに不対となることがわかった。対応する２つの不対システインは、システイニル部分で修飾されていることがわかった。この修飾を測定し、ＱＤａ質量検出器とつなげたアミノ酸分析によって測定される「システイニル化」として報告する。
この実験は、ＣＨＯ細胞において生産されたサブタイプＡおよびＢのＲＳＶ Ｆにおけるシステイニル化のレベルに対するＨｉＰＤＯＧの影響を理解するために設計された。バイオリアクターパラメーターを表９に示す。
システイニル化のレベルは、ＨｉＰＤＯＧ対照が用いられたとき、ＲＳＶ Ｆ（Ａ）およびＲＳＶ Ｆ（Ｂ）抗原の両方について低下した（表１０）。
加えて、ＨｉＰＤＯＧを用いたとき、ＲＳＶ Ｆ（Ａ）およびＲＳＶ Ｆ（Ｂ）抗原両方について、力価が向上した（表１１）。報告する力価測定は、第１の精製ステップ（限外濾過）の後である。
（実施例５）
大規模製造工程
本発明の方法が、大規模での使用に適するかを試した。ＨｉＰＤＯＧ、３４．５℃の増殖温度、および３１℃の生産温度を使用し、６日目に温度移行を実施する、１２日間の流加工程において、サブタイプＡまたはサブタイプＢのＲＳＶタンパク質Ｆを発現するＣＨＯ細胞を培養した。以下で表１２に示すとおり、２５００または１２５００Ｌのバイオリアクターで実施した場合でも、本発明の方法によって、有利な三量体力価値が得られた。
大規模製造工程
本発明の方法が、大規模での使用に適するかを試した。ＨｉＰＤＯＧ、３４．５℃の増殖温度、および３１℃の生産温度を使用し、６日目に温度移行を実施する、１２日間の流加工程において、サブタイプＡまたはサブタイプＢのＲＳＶタンパク質Ｆを発現するＣＨＯ細胞を培養した。以下で表１２に示すとおり、２５００または１２５００Ｌのバイオリアクターで実施した場合でも、本発明の方法によって、有利な三量体力価値が得られた。
配列番号１．自然ＲＳＶ Ａ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ：１３８２５１、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０３４２０）の全長Ｆ０のアミノ酸配列
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥ
ＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＰＴＮＮＲＡＲＲＥＬＰＲＦＭＮＹＴＬＮＮＡＫＫＴＮＶＴＬＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＩＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＭＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＨＮＶＮＡＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳ ＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ
配列番号２．自然ＲＳＶ Ｂ（１８５３７株、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ：１３８２５０、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ１３８４３）の全長Ｆ０のアミノ酸配列
ＭＥＬＬＩＨＲＳＳＡＩＦＬＴＬＡＶＮＡＬＹＬＴＳＳＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＦＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥ
ＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＩＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＲＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮ
ＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶ
ＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＨＮＶＮＴＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＫ
配列番号３：抗体ＡＭ１４の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＨＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＥＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＳＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＤＲＩＶＤＤＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＡＴＶＴＶＳＳ
配列番号４：抗体ＡＭ１４の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＫＫＹＬＮＷＹＨＱＫＰＧＫＶＰＥＬＬＭＨＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＲＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＧＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥ
ＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＰＴＮＮＲＡＲＲＥＬＰＲＦＭＮＹＴＬＮＮＡＫＫＴＮＶＴＬＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＩＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＭＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＨＮＶＮＡＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳ ＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ
配列番号２．自然ＲＳＶ Ｂ（１８５３７株、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ：１３８２５０、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ１３８４３）の全長Ｆ０のアミノ酸配列
ＭＥＬＬＩＨＲＳＳＡＩＦＬＴＬＡＶＮＡＬＹＬＴＳＳＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＦＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥ
ＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＩＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＲＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮ
ＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶ
ＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＨＮＶＮＴＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＫ
配列番号３：抗体ＡＭ１４の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＨＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＥＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＳＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＤＲＩＶＤＤＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＡＴＶＴＶＳＳ
配列番号４：抗体ＡＭ１４の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＫＫＹＬＮＷＹＨＱＫＰＧＫＶＰＥＬＬＭＨＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＲＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＧＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ
Claims (44)
- ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を流加細胞培養法で生産するための方法であって、
（ｉ）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地中に準備して、細胞培養を開始するステップと、
（ｉｉ）細胞を、約３３．０℃～３５．０℃の間の温度で培養するステップと、
（ｉｉｉ）既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じて、細胞培養物にグルコースを供給することにより、制限された形で、細胞培養物にグルコースを提供するステップと
を含む方法。 - 温度が約３４．５℃である、請求項１に記載の方法。
- 温度を、より低い温度、好ましくは、約３０．０℃～約３２．０℃の間に移行させる、請求項１または２に記載の方法。
- より低い温度が、約３１．０℃である、請求項３に記載の方法。
- 温度が、３日目と７日目の間に、より低い温度に移行される、請求項３または４に記載の方法。
- 温度が、５日目または６日目に、より低い温度に移行される、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
- ｐＨセンサーを使用して、細胞培養物のｐＨがモニターされる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 既定のｐＨ値が、培養物のｐＨ設定点を０．０１～０．１０超える増加に相当する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 既定のｐＨ値が、培養物のｐＨ設定点を０．０５超える増加に相当する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物のｐＨ設定点が、６．７０～７．３０の間である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物のｐＨ設定点が、６．９０～７．２０の間である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物のｐＨ設定点が、７．００～７．１０の間である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物のｐＨ設定点が、７．０５である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- －制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の間は、ｐＨ設定点が、６．９５、７．０１、７．０５、７．０７、または７．２０であり、
－制限された形でグルコースが提供される細胞培養段階の後は、ｐＨ設定点が、６．９０または７．２０である、
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。 - 既定のｐＨ値を超えたｐＨの上昇に応じた細胞培養物へのグルコースの供給が、ｐＨが低下して培養物のｐＨ設定点に達するまでグルコースを供給することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- １日目～６日目に、制限された形でグルコースが提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、糖質コルチコイド化合物を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、ヒドロコルチゾンを含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、無血清である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、無タンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、限定培地である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物に、供給培地がさらに提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 供給培地が、継続して、または複数の間隔をおいて提供される、請求項２３に記載の方法。
- 供給培地が、糖質コルチコイド化合物を含まない、請求項２３または２４に記載の方法。
- 供給培地が、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびフルドロコルチゾン酢酸エステルのいずれも含まない、請求項２３から２５のいずれかに記載の方法。
- 供給培地が、ヒドロコルチゾンを含まない、請求項２３から２６のいずれかに記載の方法。
- 供給培地が、無血清である、請求項２３から２７のいずれかに記載の方法。
- 供給培地が、無タンパク質である、請求項２３から２８のいずれかに記載の方法。
- 供給培地が、限定培地である、請求項２３から２９のいずれかに記載の方法。
- 細胞培養の間の最大生細胞密度が、１×１０６細胞／ｍＬを超える、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 最大生細胞密度が、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬ、または５×１０８細胞／ｍＬを超える、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地の体積が、少なくとも５００Ｌである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地の体積が、少なくとも３０００Ｌである、請求項３３に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、サル腎臓細胞、ヒト胎児由来腎臓系（２９３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳房腫瘍細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、またはヒトヘパトーマ系（ＨｅｐＧ２）から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、ＧＳ－ＣＨＯ細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ＲＳＶ Ｆタンパク質が、サブタイプＡのものである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ＲＳＶ Ｆタンパク質が、サブタイプＢのものである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ＲＳＶ Ｆタンパク質が、融合前高次構造の状態にある三量体を安定化する突然変異を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ＲＳＶ Ｆタンパク質が、
（１）Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（２）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（３）Ｔ５４Ｈ、Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｖ２９６Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（４）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１４２Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｖ２９６Ｉ、およびＮ３７１Ｃの組合せ、
（５）Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（６）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＳ１９０Ｉの組合せ、
（７）Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（８）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（９）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ２９０Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（１０）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１４２Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｖ２９６Ｉ、Ｎ３７１Ｃ、Ｄ４８６Ｓ、Ｅ４８７Ｑ、およびＤ４８９Ｓの組合せ、ならびに
（１１）Ｔ５４Ｈ、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ２９０Ｃ、およびＶ２９６Ｉの組合せ
からなる群から選択される突然変異の組合せを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 細胞によって産生されたＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を取得するステップをさらに含む、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
- ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を精製するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
- 請求項４３に記載の方法によって得られた精製ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を、薬学的に許容できる担体と合わせて含む医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063086702P | 2020-10-02 | 2020-10-02 | |
| US63/086702 | 2020-10-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022060169A true JP2022060169A (ja) | 2022-04-14 |
Family
ID=78333045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021158607A Pending JP2022060169A (ja) | 2020-10-02 | 2021-09-29 | Ｒｓｖ ｆタンパク質生産のための細胞培養工程 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240016915A1 (ja) |
| EP (1) | EP4222275A1 (ja) |
| JP (1) | JP2022060169A (ja) |
| CN (1) | CN116648258A (ja) |
| AU (1) | AU2021351946B2 (ja) |
| CA (1) | CA3197481A1 (ja) |
| IL (1) | IL301624A (ja) |
| MX (1) | MX2023003893A (ja) |
| WO (1) | WO2022070129A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024069420A2 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising an rsv f protein trimer |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| AU2353384A (en) | 1983-01-19 | 1984-07-26 | Genentech Inc. | Amplification in eukaryotic host cells |
| US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
| US5166320A (en) | 1987-04-22 | 1992-11-24 | University Of Connecticut | Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| HU212924B (en) | 1989-05-25 | 1996-12-30 | Chiron Corp | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
| AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| EP2243827B2 (en) | 1996-08-30 | 2017-11-22 | Life Technologies Corporation | Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof |
| ATE420945T1 (de) | 2001-02-15 | 2009-01-15 | Centocor Inc | Chemisch definiertes medium für kultivierte säugerzellen |
| SE0202110D0 (sv) | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
| DK1623019T4 (en) | 2003-05-15 | 2017-03-27 | Wyeth Llc | LIMITED GLUCOSE SUPPLY TO ANIMAL CELL CULTURE |
| SE0301998D0 (sv) | 2003-07-07 | 2003-07-07 | Isconova Ab | Quil A fraction with low toxicity and use thereof |
| US7294484B2 (en) | 2004-08-27 | 2007-11-13 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of polypeptides |
| AU2005302516A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-11 | Centocor, Inc. | Chemically defined media compositions |
| CA2668771C (en) | 2006-11-08 | 2016-03-15 | Wyeth | Rationally designed media for cell culture |
| JP5586235B2 (ja) | 2007-03-02 | 2014-09-10 | ワイス・エルエルシー | ポリペプチドの産生のための細胞培養における銅およびグルタミン酸塩の使用 |
| EP1997830A1 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-03 | AIMM Therapeutics B.V. | RSV specific binding molecules and means for producing them |
| EP3508505A1 (en) | 2007-12-24 | 2019-07-10 | ID Biomedical Corporation of Quebec | Recombinant rsv antigens |
| ES2583257T3 (es) | 2009-06-24 | 2016-09-20 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Antígenos recombinantes del VSR |
| EP3988115A3 (en) | 2009-07-15 | 2022-08-17 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Rsv f protein compositions and methods for making same |
| CN105473604B (zh) | 2013-03-13 | 2021-01-22 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 融合前rsv f蛋白和其用途 |
| CA2910067C (en) | 2013-04-25 | 2023-10-17 | Crucell Holland B.V. | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
| CN105408348B (zh) | 2013-06-17 | 2021-07-06 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| US10125172B2 (en) | 2013-07-25 | 2018-11-13 | Calder Biosciences Inc. | Conformationally stabilized RSV pre-fusion F proteins |
| EP3119876A1 (en) | 2014-03-19 | 2017-01-25 | Pfizer Inc. | Method of cell culture |
| EP2974739A1 (en) | 2014-07-15 | 2016-01-20 | Novartis AG | RSVF trimerization domains |
| CN107847581B (zh) | 2015-07-07 | 2022-03-22 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| MX2018007622A (es) | 2015-12-23 | 2018-11-14 | Pfizer | Mutantes de proteina f de rsv. |
| EP3554538A2 (en) | 2016-12-16 | 2019-10-23 | Institute for Research in Biomedicine | Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof |
-
2021
- 2021-09-29 JP JP2021158607A patent/JP2022060169A/ja active Pending
- 2021-09-30 MX MX2023003893A patent/MX2023003893A/es unknown
- 2021-09-30 IL IL301624A patent/IL301624A/en unknown
- 2021-09-30 CN CN202180078331.5A patent/CN116648258A/zh active Pending
- 2021-09-30 EP EP21798107.5A patent/EP4222275A1/en active Pending
- 2021-09-30 WO PCT/IB2021/058995 patent/WO2022070129A1/en active Application Filing
- 2021-09-30 AU AU2021351946A patent/AU2021351946B2/en active Active
- 2021-09-30 US US18/247,565 patent/US20240016915A1/en active Pending
- 2021-09-30 CA CA3197481A patent/CA3197481A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4222275A1 (en) | 2023-08-09 |
| MX2023003893A (es) | 2023-04-24 |
| US20240016915A1 (en) | 2024-01-18 |
| IL301624A (en) | 2023-05-01 |
| CA3197481A1 (en) | 2022-04-07 |
| AU2021351946A9 (en) | 2023-07-13 |
| WO2022070129A1 (en) | 2022-04-07 |
| AU2021351946A1 (en) | 2023-05-11 |
| AU2021351946B2 (en) | 2024-08-15 |
| CN116648258A (zh) | 2023-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2495307T3 (en) | Preparation of coagulation factor IX with improved glycosylation pattern | |
| JP5117542B2 (ja) | 組換え第ｖｉｉｉ因子を高発現させるためのｂｈｋ細胞 | |
| JP5921910B2 (ja) | ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質の製法 | |
| JP5076084B2 (ja) | 組み換えタンパク質の大量生産のための新規ベクターおよび発現細胞株と、これを用いた組み換えタンパク質の生産方法 | |
| JP4792017B2 (ja) | シグナルペプチド、それをコードするｄｎａ配列、該配列を含む発現構築物、プラスミド及び微生物細胞並びに組み換えタンパク質の発酵的製造方法 | |
| JP4293908B2 (ja) | 組換えヒトエリスロポエチンのクロマトグラフィー精製 | |
| JP2015133980A (ja) | 抗アミロイドベータ抗体の製法 | |
| JP2008511329A (ja) | ポリペプチドの製造 | |
| WO2019140116A2 (en) | Amplifiable rnas for therapeutic cell systems | |
| US20220325235A1 (en) | Cell culture methods | |
| JP2022060169A (ja) | Ｒｓｖ ｆタンパク質生産のための細胞培養工程 | |
| KR20180117189A (ko) | 세포 배양 공정 | |
| WO2019184372A1 (zh) | 高效表达重组人神经生长因子的基因组合 | |
| RU2663794C2 (ru) | Добавление железа для улучшения культивирования клеток | |
| EP2922962B1 (en) | Optimized expression cassette for expressing a polypeptide with high yield | |
| WO2023004784A1 (zh) | 一种重组cho细胞、其构建方法、利用其的检测系统和方法 | |
| JP2022184798A (ja) | ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを生産するための細胞培養方法 | |
| JP2014532401A (ja) | ヒトｈ因子の製造方法 | |
| JP2013055935A (ja) | タンパク質の製造方法 | |
| WO2019097290A1 (en) | Enhancement of biologics production in cell culture systems by fertilin-derived peptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240918 |