ES2583257T3 - Antígenos recombinantes del VSR - Google Patents

Abstract

Un antígeno del virus sincitial respiratorio recombinante (VSR) que comprende un polipéptido de la proteína F del VSR sin un dominio transmembrana, que comprende un dominio F2 y un dominio F1 de un polipéptido de la proteína F del VSR, en el que el polipéptido de la proteína F comprende al menos una modificación que aumenta la glicosilación, dicha al menos una modificación que aumenta la glicosilación comprende una sustitución en la que los aminoácidos que corresponden a las posiciones 500-502 de la SEQ ID NO: 2 se seleccionan entre: NGS; NGT.

Description

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que se ha introducido en una célula hospedadora, tal como una célula bacteriana o eucariota. El ácido nucleico se puede introducir en un vector de expresión que tiene señales capaces de expresar la proteína codificada por el ácido nucleico introducido o el ácido nucleico se puede integrar en el cromosoma de la célula hospedadora.

El término "heterólogo" con respecto a un ácido nucleico, un polipéptido u otro componente celular, indica que el componente se produce cuando no se encuentra normalmente en la naturaleza y/o que se origina a partir de una fuente o especie diferentes.

El término "purificación" (por ejemplo, con respecto a un patógeno o una composición que contiene un patógeno) se refiere al procedimiento para retirar componentes de una composición, cuya presencia no se desea. Purificación es un término relativo, y no requiere que todas las trazas del componente no deseados se retiren de la composición. En el contexto de producción de vacunas, purificación incluye procedimientos tales como centrifugación, diálisis, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de exclusión por tamaño, purificación por afinidad o precipitación. Por tanto, el término "purificado" no requiere una pobreza absoluta; en su lugar, se pretende como un término relativo. Por lo tanto, por ejemplo, una preparación de ácido nucleico purificado es una en la que la proteína especificada está más enriquecida de lo que el ácido nucleico lo está en su entorno generativo, por ejemplo, dentro de una célula o en una cámara de reacción bioquímica. Una preparación de ácido nucleico o proteína sustancialmente puros se debe purificar de modo que el ácido nucleico deseado represente al menos un 50 % del contenido total de ácido nucleico en la preparación. En determinadas realizaciones, un ácido nucleico sustancialmente puro representará al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % o más del contenido total de ácido nucleico o proteína de la preparación.

Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, proteína u orgánulo) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que el componente se produce de forma natural, tal como, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, proteínas y orgánulos. Algunos ácidos nucleicos y proteínas que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos convencionales de purificación. El término también incluye ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula hospedadora así como ácidos nucleicos y proteínas sintetizados químicamente.

Un "antígeno" es un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos y/o una respuesta de linfocitos T en un animal, incluyendo composiciones que se inyectan, absorben o de otro modo se introducen en un animal. El término "antígeno" incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno a qué responden los linfocitos B y/o T. Los "epítopos antigénicos dominantes" o "epítopo dominante" son los epítopos a los que se fabrica una respuesta inmune al hospedador funcionalmente significativa, por ejemplo, una respuesta a anticuerpo o una respuesta a linfocitos T. Por lo tanto, con respecto a una respuesta inmune protectora frente a un patógeno, los epítopos antigénicos dominantes son esos restos antigénicos que cuando son reconocidos por el sistema inmune del hospedador dan como resultado protección de enfermedad causada por el patógeno. La expresión "epítopo de linfocitos T" se refiere a un epítopo que cuando se une a una molécula de MHC apropiada se une de forma específica mediante un linfocito T (mediante un receptor de linfocitos T). Un "epítopo de linfocitos B" es un epítopo que se une de forma específica mediante un anticuerpo (o molécula receptora de linfocitos B).

Un "adyuvante" es un agente que aumenta la producción de una respuesta inmune de una manera no específica. Algunos adyuvantes comunes incluyen suspensiones de minerales (alum, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) en el que se adsorbe el antígeno; emulsiones, incluyendo emulsiones de agua en aceite, y de aceite en agua (y variantes de las mismas, incluyendo emulsiones dobles y emulsiones reversibles), liposacáridos, lipopolisacáridos, ácidos nucleicos inmunoestimuladores (tales como oligonucleótidos CpG), liposomas, agonistas del receptor de tipo Toll (en particular, agonistas TLR2, TLR4, TLR7/8 y TLR9), y diversas combinaciones de tales componentes.

Una "composición inmunogénica" es una composición de materia adecuada para administración a un sujeto humano

o animal (por ejemplo, en un entorno experimental) que es capaz de provocar una respuesta inmune específica, por ejemplo, frente a un patógeno, tal como VSR. Como tal, una composición inmunogénica incluye uno o más antígenos (por ejemplo, antígenos de polipéptido) o epítopos antigénicos. Una composición inmunogénica también puede incluir uno o más componentes adicionales capaces de provocar o aumentar una respuesta inmune, tal como un excipiente, vehículo y/o adyuvante. En ciertos casos, las composiciones inmunogénicas se administran para provocar una respuesta inmune que protege al sujeto frente a síntomas o afecciones inducidas por un patógeno. En algunos casos, los síntomas o enfermedad causados por un patógeno se previenen (o reducen o mejoran) inhibiendo la replicación del patógeno (por ejemplo, VSR) después de exposición del sujeto al patógeno. En el contexto de la presente divulgación, se entenderá que la expresión composición inmunogénica incluye composiciones que están destinadas a administración a un sujeto o población de sujetos con el fin de provocar una respuesta inmune protectora o paliativa frente al VSR (es decir, composiciones de vacuna o vacunas).

Una "respuesta inmune" es una respuesta de una célula del sistema inmune, tal como un linfocito B, linfocito T, o monocito, a un estímulo. Una respuesta inmune puede ser una respuesta de linfocitos B, que da como resultado la producción de anticuerpos específicos, tales como anticuerpos de neutralización específicos de antígeno. Una respuesta inmune también puede ser una respuesta de linfocitos T, tal como una respuesta de CD4+ o una

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conformación segmentada (extendida) en la cabeza globular. Por el contrario, los dominios HRB forman un tallo de bucles superenrollados de tres hebras que se extienden desde la región de la cabeza. Durante la transición de la prefusión a las conformaciones postfusión, los dominios HRA se colapsan y se ponen en proximidad con los HRB para formar un haz de seis hélices anti-paralelas. En el estado de postfusión, el péptido de fusión y dominios transmembrana se yuxtaponen para facilitar la fusión de la membrana. Aunque la descripción conformacional proporcionada anteriormente se basa en el modelado molecular de datos cristalográficos, las distinciones estructurales entre las conformaciones de prefusión y postfusión se pueden controlar sin recurrir a la cristalografía. Por ejemplo, la micrografía electrónica se puede usar para distinguir entre las conformaciones de prefusión y postfusión (como alternativa denominadas prefusogénica y fusogénica), como se demuestra en Calder y col., Virology, 271: 122-131 (2000) y Morton y col., Virology, 311: 275-288. La conformación de prefusión también se puede distinguir de la conformación fusogénica (postfusión) mediante ensayos de asociación de liposomas como se describe en Connolly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 17903-17908 (2006). Además, las conformaciones de prefusión y fusogénica se pueden distinguir usando anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) que reconocen de forma específica epítopos de conformación presentes en una o la otra de la forma de prefusión o fusogénica de la proteína F del VSR, pero no en la otra forma. Tales epítopos de conformación se pueden deber a la exposición preferente de un determinante antigénico en la superficie de la molécula. Como alternativa, los epítopos conformacionales pueden surgir de la yuxtaposición de aminoácidos que no son contiguos en el polipéptido lineal. Los antígenos de PreF desvelados en el presente documento están diseñados para estabilizar y mantener la conformación de prefusión de la proteína F del VSR, tal como en una población de proteínas expresadas, una parte sustancial de la población de proteínas expresadas está en la conformación prefusogénica (prefusión) (por ejemplo, como se predice con el modelado estructural y/o termodinámico o como se evalúa con uno o más de los procedimientos desvelados anteriormente). Las modificaciones de estabilización se introducen en una proteína F nativa (o sintética), tal como la proteína F a modo de ejemplo de la SEQ ID NO: 2, de manera que los epítopos inmunogénicos principales de la conformación de prefusión de la proteína F se mantienen después de la introducción del antígeno PreF en un entorno celular o extracelular (por ejemplo, in vivo, por ejemplo, después de la administración a un sujeto).

En primer lugar, un dominio de estabilización heterólogo se puede colocar en el extremo C-terminal de la construcción para sustituir la membrana ese ancla al dominio del polipéptido F0. Este dominio de estabilización se predice para compensar la inestabilidad de HRB, para ayudar a estabilizar al confórmero de prefusión. En realizaciones a modo de ejemplo, el dominio de estabilización heterólogo es un dominio de multimerización de proteínas. Un ejemplo particularmente favorable de un dominio de multimerización de proteínas de este tipo es un dominio de trimerización. Algunos dominios de trimerización a modo de ejemplo se pliegan en bucles superenrollados que estimulan el ensamblaje en trímeros de múltiples polipéptidos que tienen tales dominios de bucles superenrollados. Un ejemplo favorable de un dominio de trimerización es una cremallera de isoleucina. Un dominio de cremallera de isoleucina a modo de ejemplo es la variante de isoleucina GCN4 de levadura modificada por ingeniería descrita en Harbury y col., Science 262: 1401-1407 (1993). La secuencia de un dominio de cremallera de isoleucina adecuado se representa por la SEQ ID NO: 11, aunque algunas variantes de esta secuencia que retienen la capacidad para formar dominio de estabilización de bucles superenrollados son igualmente adecuadas. Algunos dominios de trimerización de bucles superenrollados de estabilización alternativos incluyen: TRAF2 (N.º de Referencia en GENBANK® Q12933 [gi:23503103]; aminoácidos 299-348); Thrombospondina 1 (N.º de Referencia PO7996 [gi:135717]; aminoácidos 291-314); Matrilina-4 (N.º de Referencia 095460 [gi:14548117]; aminoácidos 594618; CMP (matrilina-1) (N.º de Referencia NP_002370 [gi:4505111]; aminoácidos 463-496; HSF1 (N.º de Referencia AAX42211 [gi:61362386]; aminoácidos 165-191; y Cubilina (N.º de Referencia NP_001072 [gi:4557503]; aminoácidos 104-138. Se espera que un dominio de trimerización adecuado dé como resultado el ensamblaje de una parte sustancial de la proteína expresada en trímeros. Por ejemplo, al menos un 50 % del polipéptido de PreF recombinante que tiene un dominio de trimerización se ensamblará en un trímero (por ejemplo, cómo se evalúa con AFF-MALS). Por lo general, al menos un 60 %, más favorablemente al menos un 70 %, y de forma más deseada al menos un aproximadamente un 75 % o más del polipéptido expresado existe como un trímero. Para estabilizar HRB incluso más, el resto de leucina situado en la posición 512 (con respecto a la proteína F0 nativa) del PreF se puede sustituir con una lisina (L482K del polipéptido del antígeno de PreF de la SEQ ID NO: 6). Esta sustitución mejora la periodicidad del resto hidrófobo de bucle superenrollado. De forma análoga, una lisina se puede añadir después del aminoácido en la posición 105. En segundo lugar, pep27 se puede retirar. El análisis de un modelo estructural de la proteína F del VSR en el estado de prefusión sugiere que pep27 crea un bucle grande sin restricciones entre F1 y F2. este bucle no contribuye a la estabilización del estado de prefusión, y se retira después de escisión de la proteína nativa por la furina. En tercer lugar, una o ambos de los motivos de escisión de furina se pueden suprimir. Con este diseño, el péptido de fusión no se desciende de F2, evitando la liberación de la cabeza globular del confórmero de prefusión y la accesibilidad a membranas cercanas. Se predice que la interacción entre el péptido de fusión y la superficie de contacto de la membrana es una cuestión importante en la inestabilidad del estado de prefusión. Durante el proceso de fusión, la interacción entre el tejido de fusión y la membrana diana da como resultado la exposición del tejido de fusión desde dentro de la estructura de cabeza globular, aumentando la inestabilidad del estado de prefusión y llegándose en confórmero después de la fusión. Este cambio de conformación permite el proceso de fusión de membrana. Se predice que la retirada de uno o ambos de los sitios de escisión de furina evita la accesibilidad de la membrana a la parte N-terminal del péptido de fusión, estabilizando el estado de prefusión. Por lo tanto, en

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realizaciones a modo de ejemplo desveladas en el presente documento, la retirada de los motivos de escisión de furina da como resultado un antígeno de PreF que comprende un péptido de fusión intacto, que no se escinde con la furina durante o después del procesamiento y ensamblaje. Opcionalmente, al menos un sitio de escisión que no es furina también se puede de retirar, por ejemplo mediante sustitución de uno o más aminoácidos. Por ejemplo, las evidencias experimentales sugieren que en condiciones que conducen a escisión con ciertas métalo proteinazas, el antígeno de PreF se puede eximir en las proximidades de los aminoácidos 110-118 (por ejemplo, con la escisión produciéndose entre los aminoácidos 112 y 113 del antígeno de PreF; entre una leucina en la posición 142 y glicina en la posición 143 del polipéptido de la proteína F de referencia de la SEQ ID NO: 2). Por consiguiente, la modificación de uno o más aminoácidos dentro de esta región puede reducir la escisión del antígeno de PreF. Por ejemplo, la leucina en la posición 112 se puede sustituir con un aminoácido diferente, tal como isoleucina, glutamina o triptófano (como se muestra en la SEQ ID NO: 20). Como alternativa o adicionalmente, la glicina en la posición 113 se puede sustituir con una serina o alanina. De acuerdo con la presente invención, un polipéptido de la proteína F del VSR recombinante incluye una o más modificaciones que alteran el patrón o estado de glicosilación (por ejemplo, aumentando la proporción de moléculas glicosiladas en uno de los sitios de glicosilación presentes en un polipéptido de la proteína F nativo. Se predice que el polipéptido de la proteína F nativo de la SEQ ID NO: 2 se va a glicosilada en las posiciones 27, 70 y 500 del aminoácido (correspondientes a las posiciones 27, 70 y 470 del antígeno de PreF de la SEQ ID NO: 6). De acuerdo con la invención, una modificación se introduce en el sitio de glicosilación en la posición 500 del aminoácido (denominado N470)-502 que aumenta la eficacia de la glicosilación en este sitio de glicosilación. Algunos ejemplos de modificaciones adecuadas incluyen las realizadas en las posiciones 500-502, de las siguientes secuencias de aminoácidos: NGS; NGT. De forma interesante, se ha encontrado que algunas modificaciones de este sitio de glicosilación que dan como resultado el aumento de la glicosilación también dan como resultado un aumento sustancial de la producción de PreF. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los antígenos de PreF tienen un sitio de glicosilación modificado en la posición que corresponde al aminoácido 500 de la secuencia de PreF de referencia (SEQ ID NO: 2), por ejemplo, en la posición 470 del antígeno de PreF de la SEQ ID NO: 6). De forma adecuada, las modificaciones incluyen las secuencias: NGS; NGT en los aminoácidos que corresponden a las posiciones 500-502 de la secuencia de polipéptidos de la proteína F de referencia. El aminoácido de una realización a modo de ejemplo que incluye una modificación de "NGT" se proporciona en la SEQ ID NO: 18. Un experto en la materia puede determinar fácilmente algunas modificaciones similares para el NGS correspondiente. Tales modificaciones se combinan de forma favorable con cualquiera de las mutaciones de estabilización desveladas en el presente documento (por ejemplo, un bucle superenrollado heterólogo, tal como una cremallera de isoleucina, dominio y/o una modificación en una región hidrófoba, y/o retirada de pep27, y/o retirada de un sitio de escisión de furina, y/o retirada de un sitio de escisión que no es furina, y/o retirada de un sitio de escisión que no es furina). Por ejemplo, en una realización específica, el antígeno de PreF incluye una sustitución que elimina un sitio de escisión que no es furina y una modificación que aumenta la glicosilación. Una secuencia a modo de ejemplo se proporciona en la SEQ ID NO: 22 (cuya realización a modo de ejemplo incluye una modificación de "NGT” y la sustitución de glutamina en el lugar de la leucina en la posición 112). De forma más general, una cualquiera de las modificaciones de estabilización desveladas en el presente documento, por ejemplo, adición de un dominio de estabilización heterólogo, tal como un bucle superenrollado (por ejemplo, un dominio de cremallera de isoleucina), preferentemente situado en el extremo C-terminal del antígeno de PreF soluble; modificación de un resto, tal como de leucina a lisina, en el dominio HRB hidrófobo; retirada de pep27; retirada de uno o ambos motivos de escisión de furina; retirada de un sitio de escisión que no es furina; y/o modificación de un sitio de glicosilación se puede usar en combinación con una cualquiera o más (o hasta todas en cualquier combinación deseada) de las otras modificaciones de estabilización. Por ejemplo, un bucle superenrollado heterólogo (u otro dominio de estabilización heterólogo) se puede usar solo o en combinación con cualquiera de: una modificación en una región hidrófoba, y/o retirada de pep27, y/o retirada de un sitio de escisión de furina, y/o retirada de un sitio de escisión que no es furina, y/o retirada de un sitio de escisión que no es furina. En ciertas realizaciones específicas, el antígeno de PreF incluye un dominio de bucles superenrollados C-terminal (cremallera de isoleucina), una sustitución de estabilización en el dominio hidrófobo de HRB, y retirada de uno o ambos sitios de escisión de furina. Un antígeno de este tipo incluye el péptido de fusión intacto que no se retira por escisión de furina. En una realización específica, el antígeno de PreF también incluye un sitio de glicosilación modificado en la posición 500 del aminoácido. El polipéptido de la proteína F nativa se puede seleccionar entre cualquier proteína de F de una cepa A del VSR o B del VSR, o de variantes de las mismas (como se ha definido anteriormente). En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, el polipéptido de la proteína F es la proteína F representada por la SEQ ID NO: 2. Para felicitar la comprensión de la presente divulgación, todas las posiciones de los restos de aminoácidos, independientemente de la cepa, se proporcionan con respecto a (es decir, la posición del resto de aminoácido corresponden con) la posición del aminoácido de la proteína F a modo de ejemplo. Algunas posiciones del aminoácido comparables con cualquier otra cepa A o B del VSR las pueden determinar fácilmente los expertos habituales en la materia alineando las secuencias de aminoácidos de la cepa del VSR con la secuencia a modo de ejemplo usando algoritmos de alineamiento rápidamente disponibles y bien conocidos (tales como BLAST, por ejemplo, usando parámetros por defecto). Numerosos ejemplos adicionales de polipéptidos de la proteína F de diferentes cepas del hube de ser se desvelan en el documento WO2008114149. Algunas variantes adicionales pueden surgir a través de deriva genética,

o se pueden producir de forma artificial usando mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria o mediante recombinación de dos o más variantes asistentes previamente. Tales variantes adicionales tales son adecuadas en el contexto de los antígenos de PreF desvelados en el presente documento.

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hibridación de elección y la composición y longitud de las secuencias de ácidos nucleicos de hibridación. por lo general, la temperatura de hibridación y la fuerza iónica (especialmente la concentración de Na+ y/o Mg++) del tampón de hibridación determinará la rigurosidad de la hibridación, aunque los tiempos de lavado también influyen en la rigurosidad. Por lo general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean de aproximadamente 5 ºC a 20 ºC inferiores a las del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la que un 50 % de la secuencia diana se hibridan a una sonda perfectamente emparejada. Las condiciones para la hibridación de ácidos nucleicos y el cálculo de las rigurosidades se puede encontrar, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993. y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 4ª ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

Para fines de la presente divulgación, "condiciones rigurosas" incluye condiciones en las que la hibridación sólo se producirá si hay una falta de coincidencias inferior a un 25 % entre la molécula de hibridación y la secuencia diana. Las "condiciones rigurosas" pueden fracasar en niveles de rigurosidad en particular para definición más precisa. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, las condiciones de "rigurosidad moderada" son aquéllas en las que las moléculas con una falta de coincidencias de secuencias de más de un 25 % no se hibridarán; las condiciones de "rigurosidad media" son aquellas en las que las moléculas con una falta de coincidencias de más de un 15 % no se hibridarán, y las condiciones de "rigurosidad elevada" son aquellas en las que las secuencias con una falta de coincidencias de más de un 10 % no se hibridarán. Las condiciones de "rigurosidad muy elevada" son aquellas en las que las secuencias con una falta de coincidencias de más de un 6 % no se hibridarán. Por el contrario, los ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de " baja rigurosidad” incluyen aquellos con una identidad de secuencias mucho menor, o con identidad de secuencias con respecto a solamente las subsecuencias cortas del ácido nucleico. Por lo tanto, se entenderá que las diversas variantes de ácidos nucleicos que están incluidas en la presente divulgación son capaces de hibridarse con al menos una de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 y/o 21 con respecto a sustancialmente toda su longitud.

PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR POLIPÉPTIDOS ANTIGÉNICOS DEL VSR

Los antígenos de PreF desvelados en el presente documento se producen usando procedimientos bien establecidos para la expresión y purificación de proteínas recombinantes. Algunos procedimientos suficientes para guiar a un experto en la materia se pueden encontrar en las siguientes referencias: Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 200; y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 4ª ed., John Wiley & Sons, Inc., 999. En lo sucesivo en el presente documento se proporcionan algunos detalles adicionales y específicos.

Los ácidos nucleicos recombinantes que codifican los antígenos de PreF se introducen en células hospedadoras mediante cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos, tales como electroporación, transfección mediada por liposoma (por ejemplo, usando un reactivo de transfección liposomal disponible en el mercado, tal como LIPOFECTAMINE™2000 o TRANSFECTIN™), precipitación con fosfato cálcico, infección, transfección y similares, dependiendo de la selección de vectores y células hospedadoras. Los ácidos nucleicos que codifican antígenos de PreF se desvelan en las SEQ ID NOs:5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 y 21. Un experto en la materia observará que las SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 y 21 son ilustrativas y no pretenden ser limitantes. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos que codifican las mismas proteínas que las SEQ ID NOs: 5, 7 y 9, (por ejemplo, representadas por las SEQ ID NOs: 6, 8 y 10), pero que se diferencian solamente en la redundancia del código genético (tal como mediante optimización de codón alternativa, como se muestra en la SEQ ID NO: 12), se pueden usar fácilmente en lugar de las secuencias a modo de ejemplo de las SEQ ID NOs: 5, 7, y 9. Lo mismo es cierto para las SEQ ID NOs: 17, 19 y 21. De forma análoga, se pueden usar secuencias de polinucleótidos que incluyen elementos de potenciación de la expresión, tales como intrones colocados internamente (o mediante la adición de promotor, potenciador, intrón u otros elementos similares), como se ilustra en la SEQ ID NO: 13. Un experto habitual en la materia reconocerá que algunas combinaciones de tales modificaciones son igualmente adecuadas. De forma análoga, las secuencias homólogas seleccionadas entre cualquier cepa de A del VSR o B del VSR, y/u otras secuencias que comparten identidad de secuencias sustancial, como se ha discutido anteriormente también se pueden usar para expresar antígenos de PreF. De hecho, cualquiera de los ácidos nucleicos variantes desvelados anteriormente se pueden introducir de forma adecuada en células hospedadoras y usar para producir antígenos de PreF (incluyendo antígenos PreF-G) y cuando sea aplicable, polipéptidos G.

Los ácidos nucleicos que codifica antígeno recombinante de la presente invención se modifican para alterar el patrón de glicosilación como se ha descrito anteriormente mediante sustitución de uno o más aminoácidos en la proximidad de la posición 500 del aminoácido (con respecto a la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, SEQ ID NO: 17). Se ha encontrado que la modificación del patrón de glicosilación, por ejemplo, en combinación con la modificación de un sitio de reconocimiento de escisión, aumenta la producción del antígeno de PreF en cultivo celular. En tales casos, los procedimientos que se describen en lo sucesivo en el presente documento para expresión y aislamiento de antígenos de PreF recombinantes desvelan un procedimiento para aumentar la producción de un antígeno de PreF mediante la alteración del patrón de glicosilación de un antígeno de PreF mediante la sustitución de uno o más aminoácidos de un sitio de reconocimiento de glicosilación, opcionalmente en combinación con la modificación de

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como el sistema BD BaculoGold de BD BioScience. En resumen, la secuencia de polinucleótidos que codifican el antígeno se inserta en el vector de transferencia de pAcSG2. A continuación, las células hospedadoras SF9 (Spodoptera frugiperda) se cotransfectan mediante plásmido quimérico de pAcSG2 y BD BaculoGold, que contiene el ADN genómico linealizados del baculovirus virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV). Después de la transfección, la recombinación homóloga se produce entre el plásmido de pACSG2 y el genoma del Baculovirus para generar el virus recombinante. En un ejemplo, el antígeno de PreF is se expresaba bajo el control regulador del promotor de polihedrina (pH). Algunos vectores de transferencia similares se pueden producir usando otros promotores, tales como los promotores básicos (Ba) y p10. De forma análoga, se pueden usar células de insecto alternativas, tales como SF21 que está muy relacionada con la línea celular de Sf9, y la línea celular High Five derivada de un gusano falso medidor de la col, Trichoplusia ni.

Más habitualmente, los polinucleótidos que codifican los antígenos de PreF se incorporan en vectores de expresión que son adecuados para introducción y expresión en células eucariotas (por ejemplo, células de insecto o mamífero). De forma favorable. Travesaños nucleicos están optimizados con codón para expresión en el vector/célula hospedadora seleccionados (por ejemplo, las secuencias ilustradas en las SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 12, 13, 17, 19 y 21 están utilizadas con codón para la expresión en células CHO). En una realización a modo de ejemplo, la secuencia de polinucleótidos que codifica el antígeno de PreF se introduce en un vector, tal como vector pEE14 desarrollado por Lonza Biologicals. El polipéptido se expresa bajo un promotor constitutivo, tal como el promotor de CMV temprano inmediato (CitoMegaloVirus). La selección de las células transfectados de forma estable que expresan el polipéptido se realiza basándose en la capacidad de las zonas afectadas para crecer en ausencia de una fuente de glutamina. Las células que han integrado de toma satisfactoria el pEE14 son capaces de crecer en ausencia de glutamina exógena, porque el vector pEE14 expresa la enzima GS (Glutamina Sintetasa). Las células seleccionadas se pueden expandir de forma clonal y caracterizar para expresión del polipéptido PreF deseado.

Una célula hospedadora se elige opcionalmente por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la forma deseada. Tales modificaciones de la proteína incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, (así como, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, lipidación y acilación). El procesamiento después de la traducción que, por ejemplo, escinde una forma precursora en una forma madura de la proteína (por ejemplo, mediante una furina proteasa) se realiza opcionalmente en el contexto de la célula hospedadora. Algunas células hospedadoras diferentes tales como 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38, etc. tienen maquinaria celular y mecanismos característicos específicos para actividades después de la traducción de este tipo y se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña introducida.

Para producción con alto rendimiento, a largo plazo de antígenos de PreF recombinante desvelados en el presente documento, por lo general se usan sistemas de expresión estables. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable polipéptido de antígeno de PreF se introducen en la célula hospedadora usando vectores de expresión que contienen orígenes de replicación viral o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, se permite que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se intercambie por medio selectivo. La finalidad del marcador seleccionables es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan de forma satisfactoria las secuencias introducidas. Por ejemplo, algunos grupos o colonias existentes de células transformadas de forma estable se pueden prolifera usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de célula. Las células hospedadoras transformadas con un ácido nucleico que codifica un antígeno de PreF se cultivan opcionalmente en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada a partir del cultivo celular. Como se ha indicado anteriormente, si se desea, las células hospedadoras se pueden cultivar en medio sin suero (y/o sin producto animal).

Después de la transducción de una línea de células hospedadoras adecuada y crecimiento de las células hospedadoras a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce mediante medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de temperatura o inducción térmica) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Opcionalmente, el medio incluye componentes y/o aditivos que disminuyen la declaración de proteínas expresadas por proteinasas. Por ejemplo, el medio usado para cultivar las células para producir el antígeno PreF pueden incluir un inhibidor de proteasa, tal como un agente de quelación o inhibidor de molécula pequeña (por ejemplo, AZ11557272, AS 111793, etc.), para reducir o eliminar la escisión indeseada mediante proteinasas celulares, o extracelulares (por ejemplo, matriz).

El producto de polipéptido secretado se recupera a continuación del medio de cultivo. Como alternativa, las células se pueden cosechar mediante centrifugación, interrumpir mediante medios físicos o químicos, y el extracto en bruto resultante se puede retener para purificación adicional. Las células eucariotas o microbianos usadas en expresión de proteínas se pueden interrumpir mediante cualquier procedimiento conveniente, incluyendo ciclos de congelacióndescongelación, sonicación, interrupción mecánica, o uso de agentes de lisado celular, u otros procedimientos, que son bien conocidos por los expertos en la materia.

Los antígenos de PreF expresados se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante cualquiera de un número de procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, filtración, ultrafiltración, centrifugación, cromatografía de

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intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad (por ejemplo, usando cualquiera de los sistemas de etiquetados indicados en el presente documento), cromatografía de hidroxilapatita, y cromatografía de lectina. Se pueden usar etapas de replegamiento de proteínas, si se desea, para completar la configuración de la proteína madura. Por último, en las etapas de purificación final se puede usar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Además de las referencias indicadas anteriormente, en la técnica se conoce bien una diversidad de procedimientos de purificación, incluyendo, por ejemplo, los que se exponen en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; y Bollag y col., (1996) Protein Methods, 2ª Edición Wiley-Liss, NY; Walquer (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3ª Edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles High Resolution Methods and Applications, Segunda Edición Wiley-VCH, NY; y Walquer (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

En una realización a modo de ejemplo, las proteínas PreF se recuperan de las células de acuerdo con el siguiente esquema de purificación. Después de la introducción de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido PreF en células CHO hospedadoras, células hospedadoras transfectadas de forma transitoria o poblaciones estables expandidas y comprenden la secuencia de polinucleótidos introducida se cultivan en medio y en condiciones adecuadas para el crecimiento en una escala aceptable para la finalidad deseada (por ejemplo, como se describe por lo general en Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas en ese documento). Por lo general, las células se cultivan en medio sin suero a 37 ºC y se pasan a intervalos de 2-3 días en Matraces de agitación o en biorreactores. Por lo general, los nuevos cultivos establecidos a partir de células expandidas en estas condiciones se realizan en biorreactores en medio sin suero y se incuban a 27 ºC con pO2 mantenido a 20 % de 5 a 7 días para producir el antígeno de preF.

Para recuperar el antígeno de PreF recombinante, el cultivo celular se centrifuga y el sobrenadante del cultivo celular se almacena a menos 70 ºC hasta su uso posterior. Después descongelar los sobrenadantes del cultivo, los sobrenadantes se diluyen 2 x con agua MilliQ y el pH se ajusta a 6,0 con HCl. El sobrenadante diluido se carga a 75 cm/h en una resina CM Ceramic HyperD FF de 3 l empaquetada en una columna BPG 140/500, equilibrada en tampón fosfato 20 mM a pH 6,0. Después de la carga de la muestra, el tampón de equilibrio se procesa a través de la columna para regresar a la medida inicial de UV. Después de lavar con 5 volúmenes de columna (CV) de tampón fosfato 25 mM a pH 7,0, la elución se realiza usando un tampón de fosfato 50 mM a pH 7,0 que contiene NaCl 0,1 M.

El eluato CM Hyper D se diluye 3,3 x con tampón fosfato 20 mM, pH 7,0 para su procesamiento en una columna de a 270 ml de Hidroxiapatita de Tipo II (empaquetada en XK 50), equilibrada con tampón de PO4 (Na) 20 mM a pH 7,0, a 50 ml/min. Después de lavar la columna con el tampón de equilibrado (~3 CV), la elución se realiza usando un tampón de PO4 (Na) 20 mM a pH 7,0 que contiene NaCl 0,5 M.

El eluato de HA se procesa a 15 ml/min (para respetar un tiempo de contacto con la resina de 10 minutos), en una columna Capto Adhere de 150 ml (empaquetada en XK 26), equilibrada en tampón fosfato 20 mM a pH 7,0. Después de lavar con 5 CV de tampón fosfato 10 mM a pH 7,0 que contiene tampón de arginina 0,1 M, la elución se realiza usando un tampón de fosfato 10 mM a pH 7,0 que contiene arginina 0,6 M.

El eluato de Capto Adhere se concentra a continuación aproximadamente 10 x para su procesamiento en una columna de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) preparativa. La concentración se realiza usando una membrana Pellicon de polietersulfona de 50 kD. Antes de su procesamiento en la columna de SEC, el material se filtra a través de un filtro de 100 cm2 PLANOVA 20 N, usado como una etapa de eliminación viral. Esta etapa de nanofiltración se puede colocar después o antes de la concentración en membrana Pellicon.

A continuación, la SEC preparativa se realiza usando una columna Superdex S200 de 500 ml y tampón fosfato 10 mM (Na/K2), NaCl 160 mM, pH 6,5 (que corresponde a tampón final) como fase móvil. Un volumen de PreF concentrado correspondiente a un 5 % del volumen de la columna de SEC se carga en la resina a ~2,6 ml/min. Por lo general, las fracciones de 10 ml se recogen. Las combinaciones analíticas de fracciones se pueden analizar en gel de SDS mediante tinción con plata y transferencia de Western anti HCP (proteínas de célula hospedadora) si se desea para optimizar los rendimientos a la vez que se minimizan los niveles de HCP.

Un volumen purificado se obtiene después de la filtración en filtros Millex de 0,22 µm (como alternativa se puede usar un filtro Sterivex). Si se desea, la preparación de antígeno de PreF purificado se puede almacenar a menos 70 ºC antes de su uso.

Como alternativa, las proteínas PreF pueden incluir una etiqueta de polihistidina (por ejemplo, seis histidinas), que se puede usar para facilitar la purificación. Para polipéptidos de PreF etiquetados con histidina de este tipo, se puede usar el siguiente protocolo de purificación. Antes de la purificación usando cromatografía por afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), el sobrenadante del cultivo celular se diluye dos veces en tampón A (Bicina 20 mm, pH 8,5) y el pH se ajusta a 8,5. La solución resultante se carga en una columna de Q sepharose FF (GE Healthcare), por ejemplo, de 23 ml de volumen de columna, equilibrada previamente con tampón A. Las proteínas PreF se capturan en la columna, junto con algunos contaminantes de la célula hospedadora. Los componentes del medio de cultivo que interferirían con la etapa de purificación con IMAC no se retienen y se eliminan en el flujo continuo. Las

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proteínas se separan y se eluyen mediante una elución en etapas con NaCl 200 mM, 400 mM, 600 mM, 800 mM y 1 M. Las proteínas PreF de interés se eluyen durante la primera etapa con NaCl 200 mM. Opcionalmente, la recuperación se puede controlar usando SDS PAGE y transferencia de Western usando un anticuerpo anti etiqueta de His para detectar la proteína PreF etiquetada. Las fracciones se pueden combinar antes de continuar con la purificación.

La proteína PreF (combinada) que contiene eluato se diluye tres veces en tampón B (Bicina 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,3) y el pH se ajusta a 8,3. La solución resultante se carga en resina de IMAC sepharose FF cargada con cloruro de níquel (GE Healthcare) (por ejemplo, de 5 ml de volumen de columna), equilibrada previamente con tampón B. Las PreF se unen a la resina y la mayoría de los contaminantes de la célula hospedadora se eluyen en el flujo continuo. La columna se lava con Imidazol 20 mM para retirar los contaminantes unidos semanalmente. Las proteínas PreF se eluyente mediante una etapa de elución de Imidazol 250 mM. Para identificar fracciones positivas se pueden realizar SDS PAGE teñido con azul de Coomassie y transferencia de Western anti etiqueta de His.

La combinación de IMAC se puede concentrar a continuación hasta una concentración de al menos 150 µg/ml usando un dispositivo de concentración centricon (Millipore) y la proteína se puede dializar en tampón PBS complementado con L-Arginina 500 mM. La proteína resultante se cuantifica usando el ensayo de proteína RCDC (BioRad) y se almacena a -70 ºC o -80 ºC hasta su uso.

COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS Y PROCEDIMIENTOS

También se proporcionan composiciones inmunogénicas que incluyen cualquiera de los antígenos de PreF desvelados anteriormente (tal como las proporcionadas a modo de ejemplo con la SEQ ID NOs: 18 y 22) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con la divulgación, la composición inmunogénica puede incluir una proteína G aislada, recombinante y/o purificada. En la técnica se han descrito numerosas proteínas G adecuadas, e incluyen proteínas G recombinantes de longitud completa y proteínas quiméricas formadas por una parte de la proteína G (tal como los aminoácidos 128229 o 130-230) y un compañero de fusión (tal como tiorredoxina), o una secuencia señal y/o directora, que facilitan la expresión y/o purificación. Algunas proteínas G a modo de ejemplo para uso en mezcla con un antígeno de PreF se pueden encontrar en el documento WO2008114149, Patente de Estados Unidos n.º 5.149.650, Patente de Estados Unidos n.º 6.113.911, Solicitud Publicada de Estados Unidos n.º 20080300382, y Patente de Estados Unidos n.º 7.368.537. Como se indica con respecto a las proteínas PreF-G quiméricas, un fragmento más pequeño de la proteína G, tal como la parte entre los aminoácidos 149-229, o la parte entre aproximadamente 128 y aproximadamente 229 se puede usar de forma favorable en el contexto de mezclas que implican un PreF (sin G) y

G. Como se ha analizado anteriormente, la consideración importante es la presencia de epítopos inmunodominantes, por ejemplo, incluidos dentro de la región de los aminoácidos 183-197. Como alternativa, en tales composiciones se puede usar una proteína G de longitud completa.

Algunos vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen bien y los pueden seleccionar los expertos en la materia. Por ejemplo, el vehículo o excipiente puede incluir de forma favorable un tampón. Opcionalmente, el vehículo o excipiente también contiene al menos un componente que estabiliza la solubilidad y/o estabilidad. Algunos ejemplos de agentes solubilizantes/estabilizantes incluyen detergentes, por ejemplo, lauril sarcosina y/o tween. Algunos agentes solubilizantes/estabilizantes adecuados incluyen arginina, y polioles que forman vidrio (tales como sacarosa, trehalosa y similares). En la técnica se conocen numerosos vehículos farmacéuticamente aceptables y/o excipientes farmacéuticamente aceptables y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences de Remington, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5ª Edición (975). Por consiguiente, algunos excipientes y vehículos adecuados los pueden seleccionar los expertos en la materia para producir una formulación adecuada para administrar a un sujeto mediante una vía de administración seleccionada.

Algunos excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a: glicerol, Polietilenglicol (PEG), Sorbitol, Trehalosa, San sódica de N-lauroilsarcosina, L-prolina, sulfobetaína no detergente, clorhidrato de Guanidina, Urea, óxido de Trimetilamina, KCl, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ y otras sales relacionadas con cationes divalentes, Ditiotreitol, Ditioeritrol, y β-mercaptoetanol. Otros excipientes pueden ser detergentes (incluyendo: Tween 80, Tween 20, Triton X-00, NP40, Empigen BB, Octilglucósido Lauroil maltósido, Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-0, Zwittergent 3-2, Zwittergent 3-4, Zwittergent 3-6, CHAPS, desoxicolato sódico, dodecil sulfato sódico, bromuro de Cetiltrimetilamonio).

Opcionalmente, las composiciones inmunogénicas también incluyen una adyuvante. En el contexto de una composición inmunogénica adecuada para administración a un sujeto con el fin de provocar una respuesta inmune protectora frente al VSR, el adyuvante se selecciona para provocar una respuesta inmune desviada hacia Th1 o equilibrada para Th1/Th2, caracterizada por la producción de interferón-gamma (IFN-γ).

Por lo general el adyuvante se selecciona para que aumente una respuesta inmune desviada hacia Th1 (o una respuesta inmune equilibrada para Th1/Th2), caracterizada por la producción y secreción de IFN-γ, en el sujeto, o población de sujetos, a los que se administra la composición. Por ejemplo, cuando la composición inmunogénica se va a administrar a un sujeto de un grupo de edades en particular susceptible a (o con un aumento del riesgo de) infección por VSR, el adyuvante se selecciona para que sea seguro y eficaz en el sujeto o población de sujetos. Por

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