CN103204943B - 呼吸道合胞病毒F蛋白与Fc的融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药工程技术领域，公开了一种呼吸道合胞病毒(RSV)抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白(F-Fc)的生产方法，及其作为RSV亚单位疫苗的用途。本发明首先利用分子克隆方法构建了含有RSV F蛋白与人IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体，转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，表达融合蛋白；采用Protein A亲和层析，得到高纯度的融合蛋白；以CpG为佐剂，用融合蛋白滴鼻免疫BABL/c鼠，激起针对RSV的特异性粘膜免疫、体液免疫以及偏向于“Th1型”且“Th1/Th2平衡”的细胞免疫，有效抑制RSV感染。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及呼吸道合胞病毒(RSV)抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白(F-Fc)，及其作为RSV亚单位疫苗的应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是在世界范围内存在并引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体之一，RSV感染可引起一系列的呼吸道疾病，从简单的感冒症状到严重的下呼吸道感染及并发症。RSV的首次感染多发生于2月龄的婴儿，感染率高达83％，而且感染后不会产生持久的免疫力，有50％的婴幼儿会在首次感染后的1～2年内再次感染。同时，RSV在青少年、老年人以及免疫缺陷人群中也是一种常见且严重的病原体。
RSV属于副粘病毒科、肺炎病毒属的单股-负链-非节段性RNA病毒，其核心是核衣壳包裹的RNA，外层包被有出芽时来自宿主的脂质双分子层以及嵌合其中的跨膜蛋白。RSV的RNA共编码10种蛋白质：三个跨膜蛋白(G、F、SH)、两个基质蛋白(M、M2)、三个核衣壳蛋白(N、P、L)和两个非结构蛋白(NS1、NS2)。其中三种跨膜蛋白与免疫保护以及致病毒力密切相关，分别是粘附糖蛋白(G)、膜融合蛋白(F)以及小疏水蛋白(SH)。
抗G蛋白抗体可以阻止RSV向宿主细胞的吸附，抗F蛋白抗体可以阻止RSV与宿主细胞融合，这使得G蛋白和F蛋白被认为是RSV的主要抗原。最新的研究显示，F蛋白是RSV的最重要的保护性抗原，它是保护性中和抗体的重要靶位点，同时也有证据表明，F蛋白还是CD8+T细胞的一个重要靶位点。G蛋白有一个疏水的N末端，通过该N末端把G蛋白锚定在病毒脂质包膜上。同时，G蛋白还存在另外一种分泌型G蛋白，分泌型G蛋白缺少了N末端的65个氨基酸残基，只保留高度糖基化的胞外区，分泌型G蛋白有可能导致免疫应答向Th2方向发展。
众所周知，疫苗是防控传染病的最有效的手段，但至今还没有被批准的疫苗用于RSV免疫防治。在上世纪70年代，美国首次推出福尔马林灭活RSV疫苗(FI-RSV疫苗)，并接种2～7个月的婴幼儿，有80％的婴幼儿出现了病情加重，而且有2例死亡，发现死者肺部出现了大量的嗜酸性粒细胞浸润和炎症因子，使得Th1/Th2平衡紊乱。进一步研究表明FI-RSV引起了过高的Th2免疫应答，造成CD4+T细胞激活和增殖后分泌一些炎症与趋化因子，加速了肺部的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的产生和浸润，并产生低亲和力的针对G蛋白等的保护性抗体。FI-RSV也损伤了CD8+T细胞活性和功能，最终导致RSV清除过程缓慢、肺部损伤及病毒大量传播，FI-RSV疫苗以失败而告终。因此，寻找新的技术策略，是研制安全、有效RSV疫苗的重要任务。
目前，国内外学者开展了温度敏感型RSV弱毒疫苗、携带RSV F蛋白的重组人/牛副流感病毒活载体疫苗、重组RSV F蛋白的亚单位疫苗及佐剂与免疫途径等一系列研究，其目的是诱导更强的保护性中和抗体，改变免疫应答类型。
抗体的新生受体(neonatal Fc receptor，FcRn)广泛分布于上皮细胞、内皮细胞、抗原递呈细胞等细胞表面，其主要作用是：与抗体Fc结合后，保护抗体免于降解、延长抗体半衰期，将抗体从母体通过胎盘转运至胎儿。
本发明将RSV抗原蛋白F与抗体恒定区Fc融合，形成F-Fc融合蛋白，滴鼻免疫后，融合蛋白F-Fc通过Fc与FcRn结合，随FcRn的迁移将融合蛋白转运至体内；通过抗原递呈细胞将抗原F递呈至免疫细胞，从而有效地激活粘膜免疫、体液免疫以及偏向于“Th1型”并且“Th1/Th2平衡”的T细胞免疫，有效抵抗RSV感染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种RSV抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白(F-Fc)的制备方法，及其作为RSV亚单位疫苗的应用，克服福尔马林灭活疫苗(FI-RSV疫苗)免疫后产生低中和活性抗体以及偏向Th2型免疫应答的弊病。
本发明解决技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供的一种融合蛋白F-Fc，是一种呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白，该蛋白含有RSV的F蛋白与人IgG1恒定区Fc片段，其中编码RSV F蛋白的基因序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2；编码抗体IgG1恒定区Fc片段的基因序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
所述编码该蛋白的基因序列为SEQ ID NO：5，氨基酸序列为SEQ ID NO：6。
本发明提供的上述呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白，其通过以下方法得到：首先构建含有SEQ ID NO：5基因序列的真核表达载体，然后转染CHO细胞，表达该融合蛋白，最后采用ProteinA亲和层析，分离得到。
本发明提供的上述呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白，其用作RSV的亚单位疫苗。
所述的亚单位疫苗，是一种滴鼻液药品，该滴鼻液药品可激起针对RSV的特异性粘膜免疫、体液免疫以及偏向于“Th1型”并且“Th1/Th2平衡”的T细胞免疫，用于预防RSV的感染。
术语“融合基因”是指利用DNA重组技术将两个不同的基因拼接起来的组合基因。
术语“融合蛋白”是指利用DNA重组技术得到的两个不同的基因组合后的表达产物，即融合基因的表达产物。
术语“Th1偏爱性免疫应答”特征在于生成IL-2和IFN-γ的CD4+T辅助细胞占优势，分泌或存在IL-2和IFN-γ。比较而言，“Th2偏爱性免疫应答”特征在于生成IL-4、IL-5和IL-13的CD4+T辅助细胞占优势。
本发明与现有技术相比，具有以下的主要突出效果和优点：
本发明的创新在于将RSV抗原蛋白F与抗体效应区Fc融合，构建成融合蛋白F-Fc，形成抗原-抗体复合物。融合蛋白F-Fc含有的抗体效应区Fc与分布于鼻腔粘膜、呼吸道粘膜等处上皮细胞的Fc新生受体(FcRn)结合，利用FcRn将F-Fc转运到体内；随后，Fc与分布在粘膜层下的抗原递呈细胞表面的Fc受体(FcRs)相结合，将抗原F呈递至免疫细胞，激活免疫应答。
本发明提出的这种新型融合蛋白F-Fc，是一种RSV抗原与抗体的复合物，作为RSV的亚单位疫苗应用，具有以下几个优点：首先，因为融合蛋白F-Fc利用分布于鼻腔粘膜、呼吸道粘膜等处上皮细胞的Fc新生受体(FcRn)之间的相互作用而转运至体内，所以可经粘膜途径，进行滴鼻免疫，不需要进行注射，是一种无针疫苗(no-needle vaccine)；其次，融合蛋白F-Fc与抗原递呈细胞表面的Fc受体结合，将抗原F呈递至免疫细胞，刺激机体产生针对RSV的特异性抗体IgA(图2-图4)，激活粘膜免疫；同时，刺激机体产生针对RSV F蛋白的的特异性中和抗体IgG(图5)，激活体液免疫；第三，与福尔马林灭活疫苗相比，最大优势在于融合蛋白F-Fc激活的细胞免疫产生较多的IFN-γ和IL2，较少的IL4(图6)，更偏向于“Th1型”，不引起免疫后病毒感染增强。
附图说明
图1为用免疫印迹(WesternBlot)检测CHO细胞表达的融合蛋白F-Fc和重组蛋白F。
图2为用F-Fc、F和PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，检测小鼠唾液中的IgA抗体滴度(5只小鼠的均值)。
图3为用F-Fc、F和PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，检测小鼠肺洗液中的IgA抗体滴度(5只小鼠的均值)。
图4为用F-Fc、F和PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，检测小鼠鼻洗液中的IgA抗体滴度(5只小鼠的均值)。
图5为用F-Fc、F和PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，检测小鼠血清IgG的滴度(5只小鼠的均值)。
图6为用F-Fc、F和PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，处死小鼠，分离培养脾细胞，用F蛋白刺激，用ELISA检测培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4(5只小鼠的均值)。
图7为用F-Fc、F和PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，用RSV感染小鼠，5天后，用定量PCR测定鼻洗液、肺洗液和肺中RSV滴度。
图8为用F-Fc混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，用RSV感染小鼠，5天后，肺部病理切片。
图9为用F混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，用RSV感染小鼠，5天后，肺部病理切片。
图10为用PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，用RSV感染小鼠，5天后，肺部病理切片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：克隆RSV F蛋白的基因
在培养细胞的6孔板中每孔接种2×106个HEp-2细胞，培养12～14h，细胞长成单层。移除培养基，按照50TCID50接种500ul病毒到孔板中，37℃孵育1h，然后移除病毒液，每孔加入2ml含有2％胎牛血清(FBS)的新鲜MEM培养基，37℃培养48h。用Trizol Reagent(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，得到的细胞总RNA溶解于50ul无RNA酶的水中。然后用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)，采用随机引物，逆转录得到cDNA。
根据RSV的基因序列(GenBank Accession：AY911262.1)，设计F基因的正、反向引物：正向引物GGGGTACCATGGGATCTAAGGTCCTG(横线标注为KpnI酶切位点)；反向引物CCGCTCGAGCTAATTTGTGGTTGAT(横线标注为XhoI酶切位点)。以cDNA为模板，使用KOD DNA聚合酶(MBI公司)，PCR扩增得到F基因片段。
琼脂糖凝胶电泳回收F基因片段，用KpnI和XhoI双酶切F基因和载体pcDNA3.1(+)，回收后将F基因与载体pcDNA3.1(+)连接起来，构建成载体pcDNA3.1(+)-F，测序鉴定载体序列正确。
实施例2.克隆人抗体IgG1恒定区Fc基因
从新鲜的血浆中分离B细胞，用Trizol Reagent(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，得到的细胞总RNA溶解于50ul无RNA酶的水中。然后用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)以oligo(dT)为引物，逆转录得到cDNA。
设计Fc基因的正、反向引物：正向引物GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC；反向引物TTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC。以cDNA为模板，用KOD DNA聚合酶(MBI公司)PCR扩增得到Fc基因片段。
琼脂糖凝胶电泳回收Fc基因片段，连接到pGEM-T-easy载体(Promega公司)上，构建成载体pGEM-T-easy-Fc，测序鉴定载体序列正确。
实施例3.构建RSV F基因与人抗体IgG1恒定区Fc基因的融合基因
设计引物，利用PCR将RSV F基因与人抗体IgG1恒定区Fc基因连接起来，构建成F-Fc融合的形式。具体方法如下：
首先以F基因为模板，用正向引物：GGGGTACCATGGGATCTAAGGTCCTG(描线标注为KpnI酶切位点)和反向引物：CCGCCTCCACCATTTGTGGTTGAT进行PCR扩增，在F基因3’端延伸一段与Fc基因重叠的序列；同时，以Fc基因为模板，用正向引物：GGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCAGAGCCCAAATC和反向引物：CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAG(横线标注为XhoI酶切位点)进行PCR扩增，在Fc基因5’端延伸一段与F基因重叠的序列；回收PCR得到的基因片段，将二者按摩尔比1∶1混合作为模板，用正向引物：GGGGTACCATGGGATCTAAGGTCCTG和反向引物：CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAG进行PCR，将两段基因序列拼接成一个融合基因F-Fc。
回收PCR得到的融合基因F-Fc片段，用KpnI和XhoI双酶切融合基因F-Fc和载体pcDNA3.1(+)，回收后将融合基因F-Fc与载体pcDNA3.1(+)连接起来，构建成载体pcDNA3.1(+)-F-Fc，测序鉴定载体序列正确。
实施例4.构建稳定表达融合蛋白F-Fc的CHO细胞株
将30ml悬浮培养的CHO-S细胞传代，控制细胞密度为5～6×105个/ml，120～135转/分，培养24h，细胞密度达到1.2～1.5×106个/ml，转移至125ml培养瓶中。用OptiProTMSFM(Invitrogen公司)稀释37.5ug质粒至终体积0.6ml，轻轻混匀；用OptiProTMSFM(Invitrogen公司)稀释37.5ul FreeStyleTMMAX转染试剂(Invitrogen公司)至终体积0.6ml，轻轻混匀；将二者混合，室温放置10分钟。将1.2ml的混合液加入含有30ml细胞的培养瓶中，135转/分，培养24小时。将转染后的细胞分至24孔板，加入终浓度为400ug/ml的新霉素，继续培养，每天更换含有新霉素的培养液，观察细胞的存活率，筛选稳定转染的细胞株。收集细胞培养基上清，用免疫印迹(Western Blot)检测F-Fc蛋白的表达量，筛选融合蛋白F-Fc表达量最高的稳定转染细胞株，表达量为1.2mg/L。
实施例5.表达并纯化融合蛋白F-Fc
在筛选得到稳转高表达融合蛋白F-Fc细胞株后，扩大细胞培养规模，使用多个T125细胞培养瓶大量表达F-Fc蛋白。收集培养基上清，用截留分子量为30kDa的超滤离心管(Millipore公司)超滤浓缩融合蛋白F-Fc。随后用Protein A树脂(GE公司)纯化融合蛋白F-Fc，纯化的融合蛋白F-Fc得率为0.41mg/L。
实施例6.动物实验
将融合蛋白F-Fc和重组蛋白F(作为对照)与CpG(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’，Invitrogen公司)混合，蛋白终浓度为2mg/ml。将4～6周龄的雌性BABL/c鼠分为3组，每组10只，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠后，分别用20ul融合蛋白F-Fc和重组蛋白F滴鼻免疫小鼠，PBS做阴性对照。一个月滴鼻免疫一次，共免疫三次。
第三次免疫两周后，分别取小鼠唾液、鼻洗液和肺洗液，用ELISA法(Greiner公司)测定RSV特异的IgA抗体(图2-图4)；同时，分离小鼠血清，用ELISA法(Greiner公司)测定RSV特异性的IgG抗体(图5)。结果显示，用融合蛋白F-Fc免疫的小鼠，可产生针对RSV的特异性抗体IgA和IgG，并且明显高于重组蛋白F免疫的小鼠和对照组。
第三次免疫两周后，无菌取小鼠脾脏，分离培养脾细胞，用重组蛋白F刺激脾细胞，产生特异的细胞因子。用ELISA(Greiner公司)检测培养基上清中细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4(图6)。结果显示，用融合蛋白F-Fc免疫小鼠后主要刺激机体产生IFN-γ和IL-2，基本不产生IL-4，说明，融合蛋白F-Fc激起的CD4+T细胞免疫应答主要是“Th1型”。
第三次免疫两周后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，用20ul1×107pfu/ml的RSV滴鼻感染小鼠。感染5天后，处死小鼠，收集小鼠鼻洗液、肺洗液和左肺。用TRIzol法(Invitrogen公司)提取鼻洗液、肺洗液以及肺部的RNA，用实时定量PCR检测鼻洗液、肺洗液以及肺部RSV的基因拷贝数(图7)，结果显示，用融合蛋白F-Fc免疫的小鼠，用RSV攻毒后，鼻洗液、肺洗液以及肺中病毒量明显低于重组蛋白F免疫的小鼠和对照组；取小鼠右肺，用福尔马林固定，制作HE染色肺部病理切片(武汉谷歌生物科技有限公司)，从病理切片看(图8-图10)，用融合蛋白F-Fc免疫的小鼠肺部的炎症反应和白细胞浸润现象低于重组蛋白F免疫的小鼠和对照组，说明用融合蛋白F-Fc滴鼻免疫小鼠可有效地抵抗RSV的感染。
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 呼吸道合胞病毒 F蛋白与Fc的融合蛋白及其用途
<140>
<141>
<160> 13
<170>
<210> 1
<211> 1110
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:1序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 1
1 TCTAAGGTCCTGCACTTAGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAGTGCTCT
51 ACTATCCACAAACAAGGCCGTAGTCAGCTTATCAAATGGAGTTAGTGTCT
101 TAACCAGCAA AGTGTTAGAC CTCAAAAACT ATATAGATAA ACAATTGTTA
151 CCTATTGTGA ATAAGCAAAG CTGCAGAATA TCAAATATAG AAACTGTGAT
201 AGAGTTCCAA CAAAAGAACA ACAGACTACT AGAGATTACC AGGGAATTTA
251 GTGTTAATGC AGGTGTAACT ACACCTGTAA GCACTTACAT GTTAACTAAT
301 AGTGAATTAT TGTCATTAAT CAATGATATG CCTATAACAA ATGATCAGAA
351 AAAGTTAATG TCCAACAATG TTCAAATAGT TAGACAGCAA AGTTACTCTA
401 TCATGTCCAT AATAAAAGAG GAAGTCTTAG CATATGTAGT ACAATTACCA
451 CTATATGGTG TGATAGATAC ACCTTGTTGG AAATTACACA CATCCCCTCT
501 ATGTACAACC AACACAAAAG AAGGGTCAAA CATCTGTTTA ACAAGAACTG
551 ACAGAGGATG GTACTGTGAC AATGCAGGAT CAGTATCTTT CTTCCCACAA
601 GCTGAAACAT GTAAAGTTCA ATCGAATCGA GTATTTTGTG ACACAATGAA
651 CAGTTTAACA TTACCAAGTG AAGTAAATCT CTGCAATGTT GACATATTCA
701 ATCCCAAATA TGATTGTAAA ATTATGACTT CAAAAACAGA TGTAAGCAGC
751 TCCGTTATCA CATCTCTAGG AGCCATTGTG TCATGCTATG GCAAAACTAA
801 ATGTACAGCA TCCAATAAAA ATCGTGGAAT CATAAAGACA TTTTCTAACG
851 GGTGTGATTA TGTATCAAAT AAAGGGGTGG ACACTGTGTC TGTAGGTAAC
901 ACATTATATT ATGTAAATAA GCAAGAAGGC AAAAGTCTCT ATGTAAAAGG
951 TGAACCAATA ATAAATTTCT ATGACCCATT AGTATTCCCC TCTGATGAAT
1001 TTGATGCATC AATATCTCAA GTCAATGAGA AGATTAACCA GAGTTTAGCA
1051 TTTATTCGTA AATCCGATGA ATTATTACAT CATGTAAATG CTGGTAAATC
1101 AACCACAAAT
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<212> PRT
<213> SEQ ID NO:2序列
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<221>
<222>
<223>
<400> 2
1 SKVLHLEGEV NKIKSALLST NKAVVSLSNG VSVLTSKVLD LKNYIDKQLL
51 PIVNKQSCRI SNIETVIEFQ QKNNRLLEIT REFSVNAGVT TPVSTYMLTN
101 SELLSLINDM PITNDQKKLM SNNVQIVRQQ SYSIMSIIKE EVLAYVVQLP
151 LYGVIDTPCW KLHTSPLCTT NTKEGSNICL TRTDRGWYCD NAGSVSFFPQ
201 AETCKVQSNR VFCDTMNSLT LPSEVNLCNV DIFNPKYDCK IMTSKTDVSS
251 SVITSLGAIV SCYGKTKCTA SNKNRGIIKT FSNGCDYVSN KGVDTVSVGN
301 TLYYVNKQEG KSLYVKGEPI INFYDPLVFP SDEFDASISQ VNEKINQSLA
351 FIRKSDELLH HVNAGKSTTN
<210> 3
<211> 696
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:3序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 3
1 GAGCCCAAAT CTTGTGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC
51 TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG
101 ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC
151 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT
201 GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA
251 CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT
301 GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT
351 CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT
401 ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG
451 ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA
501 GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG
551 ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC
601 AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT
651 GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAA
<210> 4
<211> 232
<212> PRT
<213> SEQ ID NO:4序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 4
1 EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
51 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
101 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL
151 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
201 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
<210> 5
<211> 1851
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:5序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 5
1 TCTAAGGTCC TGCACTTAGA AGGAGAAGTG AACAAGATCA AAAGTGCTCT
51 ACTATCCACA AACAAGGCCG TAGTCAGCTT ATCAAATGGA GTTAGTGTCT
101 TAACCAGCAA AGTGTTAGAC CTCAAAAACT ATATAGATAA ACAATTGTTA
151 CCTATTGTGA ATAAGCAAAG CTGCAGAATA TCAAATATAG AAACTGTGAT
201 AGAGTTCCAA CAAAAGAACA ACAGACTACT AGAGATTACC AGGGAATTTA
251 GTGTTAATGC AGGTGTAACT ACACCTGTAA GCACTTACAT GTTAACTAAT
301 AGTGAATTAT TGTCATTAAT CAATGATATG CCTATAACAA ATGATCAGAA
351 AAAGTTAATG TCCAACAATG TTCAAATAGT TAGACAGCAA AGTTACTCTA
401 TCATGTCCAT AATAAAAGAG GAAGTCTTAG CATATGTAGT ACAATTACCA
451 CTATATGGTG TGATAGATAC ACCTTGTTGG AAATTACACA CATCCCCTCT
501 ATGTACAACC AACACAAAAG AAGGGTCAAA CATCTGTTTA ACAAGAACTG
551 ACAGAGGATG GTACTGTGAC AATGCAGGAT CAGTATCTTT CTTCCCACAA
601 GCTGAAACAT GTAAAGTTCA ATCGAATCGA GTATTTTGTG ACACAATGAA
651 CAGTTTAACA TTACCAAGTG AAGTAAATCT CTGCAATGTT GACATATTCA
701 ATCCCAAATA TGATTGTAAA ATTATGACTT CAAAAACAGA TGTAAGCAGC
751 TCCGTTATCA CATCTCTAGG AGCCATTGTG TCATGCTATG GCAAAACTAA
801 ATGTACAGCA TCCAATAAAA ATCGTGGAAT CATAAAGACA TTTTCTAACG
851 GGTGTGATTA TGTATCAAAT AAAGGGGTGG ACACTGTGTC TGTAGGTAAC
901 ACATTATATT ATGTAAATAA GCAAGAAGGC AAAAGTCTCT ATGTAAAAGG
951 TGAACCAATA ATAAATTTCT ATGACCCATT AGTATTCCCC TCTGATGAAT
1001 TTGATGCATC AATATCTCAA GTCAATGAGA AGATTAACCA GAGTTTAGCA
1051 TTTATTCGTA AATCCGATGA ATTATTACAT CATGTAAATG CTGGTAAATC
1101 AACCACAAAT GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCTCT GGCGGTGGCG
1151 GATCAGAGCC CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA
1201 GCACCTGAAC TCCTGGGGGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC
1251 CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG
1301 TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG GTACGTGGAC
1351 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA
1401 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC
1451 TGAATGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC
1501 CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA
1551 GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGATGA GCTGACCAAG AACCAGGTCA
1601 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG
1651 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT
1701 GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA
1751 AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG
1801 GCTCTGCACA ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA
1851 A
<210> 6
<211> 617
<212> PRT
<213> SEQ ID NO:6序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 6
1 SKVLHLEGEV NKIKSALLST NKAVVSLSNG VSVLTSKVLD LKNYIDKQLL
51 PIVNKQSCRI SNIETVIEFQ QKNNRLLEIT REFSVNAGVT TPVSTYMLTN
101 SELLSLINDM PITNDQKKLM SNNVQIVRQQ SYSIMSIIKE EVLAYVVQLP
151 LYGVIDTPCW KLHTSPLCTT NTKEGSNICL TRTDRGWYCD NAGSVSFFPQ
201 AETCKVQSNR VFCDTMNSLT LPSEVNLCNV DIFNPKYDCK IMTSKTDVSS
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 用于F基因的正向引物
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<223>
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GGGGTACCATGGGATCTAAGGTCCTG
<210> 8
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<212> DNA
<213> 用于F基因的反向引物
<220>
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<222>
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CCGCTCGAGCTAATTTGTGGTTGAT
<210> 9
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<213> 用于Fc基因的正向引物
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<222>
<223>
<400> 9
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC
<210> 10
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<212> DNA
<213> 用于Fc基因的反向引物
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 10
TTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC
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<212> DNA
<213> 用于融合基因F-Fc的反向引物
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 11
CCGCCTCCACCATTTGTGGTTGAT
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<212> DNA
<213> 用于融合基因F-Fc的正向引物
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 12
GGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCAGAGCCCAAATC
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<212> DNA
<213> CpG
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 13
TCCATGACGTTCCTGACGTT
Claims (5)
1. 一种融合蛋白F-Fc，其特征是一种呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白，该蛋白含有RSV的F蛋白与人IgG1恒定区Fc片段，其中编码RSV F蛋白的基因序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2；编码抗体IgG1恒定区Fc片段的基因序列为SEQ ID NO:3，氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白F-Fc，其特征在于编码该蛋白的基因序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
3. 一种融合蛋白F-Fc，该融合蛋白是通过以下方法得到的：首先构建含有SEQ ID NO:5基因序列的真核表达载体，转染CHO细胞，表达融合蛋白F-Fc，采用Protein A亲和层析，分离纯化得到融合蛋白F-Fc。
4. 一种融合蛋白F-Fc，其特征是融合了呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与人抗体IgG1恒定区Fc，氨基酸序列为SEQ ID NO:6，用作RSV的亚单位疫苗。
5. 根据权利要求4所述的融合蛋白F-Fc，其特征在于所述的亚单位疫苗是一种滴鼻液药品，该滴鼻液药品可激起针对RSV的特异性粘膜免疫、体液免疫以及偏向于“Th1型”并且“Th1/Th2平衡”的T细胞免疫，用于预防RSV的感染。
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